專利名稱：使用經丙烯酸水溶液洗滌的微生物催化劑生產丙烯酰胺的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過微生物來源的酶——腈水合酶的作用而從丙烯腈生產丙烯酰胺的方法。丙烯酰胺作為工業(yè)上重要的物質用于多個領域。例如丙烯酰胺聚合物被廣泛地使用，如用作用于處理廢水的凝結劑、紙強化劑、油收集劑等。
背景技術：
工業(yè)上傳統(tǒng)的生產丙烯酰胺的方法是通過用還原狀態(tài)的銅作為催化劑對與其相應的丙烯腈進行水合。最近，已經開發(fā)了一種使用微生物催化劑而不是用銅催化劑的方法，且該方法的一部分已經得到實際應用。使用微生物催化劑等的生物催化方法有望成為工業(yè)生產方法，因為這種方法的反應條件溫和且?guī)缀鯖]有副產物，因此可以為該方法設計非常簡單的工藝。因此，到目前為止已經發(fā)現(xiàn)了很多具有通過水合可催化(轉化)丙烯腈生成丙烯酰胺的酶(酶名稱腈水合酶)的微生物。
這些微生物的例子包括屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、芽孢不動菌屬(Bacteridium)、微球菌屬(Micrococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)[以上微生物參見日本專利公告(Kokoku)No.62-21519 B(1987)]，棒桿菌屬(Corynebacterium)和諾卡氏菌屬(Nocardia)[以上微生物參見日本專利公告(Kokoku)No.56-17918B(1981)]，假單孢菌屬(Pseudomonas)[參見日本專利公告(Kokoku)No.59-37951 B(1984)]，紅球菌屬(Rhodococcus)和微桿菌屬(Microbacterium)[以上微生物參見日本專利公告(Kokoku)No.4-4873 B(1992)]，玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)[參見日本專利公告(Kokoku)No.6-55148 B(1994)]和紅球菌屬(Rhodococcus)[參見日本專利公告(Kokoku)No.7-40948 B(1995)]的微生物菌株。
使用以上微生物作為微生物催化劑生產丙烯酰胺的方法的例子包括在日本專利公開(Kokai)Nos.11-123098 A(1999)和7-265091 A(1995)以及日本專利公告(Kokoku)No.56-38118 B(1981)中的方法。反應方法的一個例子是日本專利公開(Kokai)No.11-89575 A(1999)中的方法。
此外，已經做了很多研究以提高反應中酶的活力或抑制酶活力的下降(失活)。這種研究的例子包括在低溫，低于冰點15℃下進行反應的方法[參見日本專利公告(Kokoku)No.56-38118 B(1981)]、從多個加料口依次加入低濃度的底物的方法[參見日本專利公告(Kokoku)No.57-1234B(1982)]、用有機溶劑處理微生物或其處理產物的方法[參見日本專利公開(Kokai)No.5-308980 A(1993)]、在高不飽和脂肪酸存在的條件下進行反應的方法[參見日本專利公開(Kokai)No.7-265090 A(1995)]和用戊二醛等將微生物細胞進行交聯(lián)處理的方法[參見日本專利公開(Kokai)Nos.7-265091 A(1995)和8-154691 A(1996)]。
同時，通常已知的洗滌微生物催化劑的方法包括用生理鹽水、緩沖液(如磷酸鹽或Tris鹽酸鹽的水溶液)洗滌以抑制酶活力的下降。然而，把洗滌組分對丙烯酰胺聚合物的物理性質和單體的貯存穩(wěn)定性的影響考慮在內的洗滌微生物催化劑的方法還未見報道。
如上所述，利用微生物催化劑生產丙烯酰胺的方法有望成為工業(yè)生產方法，因為該方法采用溫和的反應條件且?guī)缀醪划a生副產物，因此無需純化并且可以設計非常簡單的工藝。
盡管以上生產方法在酶反應的條件下不會產生副產物，但是它們具有一個缺陷，即當對所要使用的微生物催化劑進行洗滌時，由洗滌產生的雜質的污染可影響丙烯酰胺聚合物的物理性質和丙烯酰胺單體的貯存穩(wěn)定性。為了解決這個問題，可進行純化(如結晶、離子交換)或蒸餾。然而，由于使用了這些純化方法，使用微生物催化劑的生產方法的一個突出的特點，即反應時幾乎不產生副產物，卻不能被利用。此外，考慮到能源和環(huán)境問題，使用這些方法也是不利的。
發(fā)明概述經過為解決上述問題而進行的廣泛研究，我們已完成了本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)在使用含有得自微生物的酶-腈水合酶的微生物催化劑從丙烯腈生產丙烯酰胺的方法中，通過使用經丙烯酸水溶液洗滌的微生物催化劑，可以制備丙烯酰胺，在所制得的丙烯酰胺中，丙烯酰胺聚合物的物理性質和丙烯酰胺單體的貯存穩(wěn)定性得到了改善。
也就是說，本發(fā)明是使用可將丙烯腈轉化成丙烯酰胺的微生物催化劑生產丙烯酰胺的方法，其使用經丙烯酸水溶液洗滌的微生物催化劑。
可用于本發(fā)明的微生物催化劑可以是任何催化劑，條件是其是從具有將丙烯腈轉化成丙烯酰胺的催化活性(腈水合酶活性)的微生物制備而得。優(yōu)選的這種微生物類別包括那些屬于芽孢桿菌屬、芽孢不動菌屬、微球菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、諾卡氏菌屬、假單孢菌屬、微桿菌屬、紅球菌屬、無色桿菌屬和假諾卡氏菌屬的微生物?？梢允褂眠@些微生物中的一種或使用這些微生物的組合。
此外，在此可使用的轉化株是通過獲取來自以上微生物的腈水合酶基因、然后直接將所述基因或人工改良的基因導入自由選擇的宿主中而制備。
優(yōu)選的以上轉化株的例子包括已被轉化而具有無色桿菌屬腈水合酶的大腸桿菌MT10770(FERM P-14756)(日本專利公開(Kokai)No.8-266277 A(1996))、已被轉化而具有假諾卡氏菌屬腈水合酶的大腸桿菌MT10822(FERM BP-5785)(日本專利公開(Kokai)No.9-275978 A(1997))或已被轉化而具有玫瑰色紅球菌屬腈水合酶的微生物(日本專利公開(Kokai)No.4-211379 A(1992))。
以上微生物可以通過任何適合于給定微生物菌種的方法培養(yǎng)。
在本發(fā)明中，從微生物制備的微生物催化劑指的是通過培養(yǎng)微生物而得到的培養(yǎng)液、通過收集過程等得到的細胞、通過超聲等而被破裂的細胞，或者是那些在細胞破裂后所制備的包括粗酶、部分純化的酶或純化酶的物質。必要時可將這些微生物催化劑固定在載體如聚丙烯酰胺凝膠、藻酸鹽、角叉藻聚糖或離子交換樹脂上。可以根據(jù)酶的穩(wěn)定性、生產規(guī)模等適當?shù)剡x擇使用微生物催化劑的方式。
本發(fā)明中的術語“洗滌”指的是洗滌經培養(yǎng)的微生物細胞和/或反應中將要使用的微生物催化劑。因此，經培養(yǎng)的微生物細胞和反應中將要使用的微生物催化劑都可以用丙烯酸洗滌，或者只有反應中將要使用的微生物催化劑可以用丙烯酸洗滌。例如，反應中將要使用的微生物催化劑可用水或緩沖液等洗滌一次，然后在反應前用丙烯酸洗滌。微生物催化劑可在反應開始之前的即刻用丙烯酸洗滌。
此外，可使用任何洗滌方法。在此可闡明的這種方法的例子包括反復洗滌并離心的方法，以及用中空纖維膜洗滌的方法。此外，固定化的微生物催化劑可以通過在洗滌過程中反復攪拌和沉淀固定的催化劑并除去上清液進行洗滌。
考慮到洗滌效率、酶穩(wěn)定性等因素，可適當?shù)卦O定任何洗滌方法和任何洗滌次數(shù)。
將被用于洗滌的丙烯酸的濃度優(yōu)選為其在丙烯酸水溶液中的濃度以質量計為0.01％至10％，更優(yōu)選地，以質量計為0.05％至1％，最優(yōu)選以質量計為0.1％。
當丙烯酸的濃度以質量計為0.01％或更少時，將增加洗滌時間和洗滌次數(shù)，從而使該步驟復雜化。此外，洗滌的次數(shù)增加在洗滌過程中可引起細胞破裂、已固定細胞發(fā)生崩潰等。以質量計10％或更多的濃度是不利的，因為它可引起酶活力的下降并且在經濟上也是不利的。
用氫氧化鈉、氨水等可調節(jié)丙烯酸水溶液的pH值。優(yōu)選將在此使用的溶液的pH值調節(jié)到5至11，更優(yōu)選地6至10，最優(yōu)選地為7。
如上所述制備的微生物催化劑在懸浮或分散于丙烯酸水溶液的狀態(tài)下或者處于易于固-液分離的狀態(tài)下時，可用作微生物催化劑。
本發(fā)明的最佳實施方式以下實施例將對本發(fā)明進行更為具體的描述，但并不意味著限制本發(fā)明的范圍。
實施例1(1)制備經培養(yǎng)并洗滌的微生物細胞的方法在30L發(fā)酵罐(Takasugi Seisakusho)中、30℃下，將具有腈水合酶活性的玫瑰色紅球菌J-1(FERM BP-1478)(日本專利公告(Kokoku)No.6-55148 B(1994))置于含有濃度為以質量計2％的葡萄糖、以質量計1％的尿素、以質量計0.5％的蛋白胨、以質量計0.3％的酵母提取物和以質量計0.05％的氯化鈷的培養(yǎng)基(pH7.0)中，在有氧條件下培養(yǎng)60小時。
將20L上述培養(yǎng)液通過一個交叉流動型中空纖維膜組件循環(huán)過濾。培養(yǎng)的細胞是通過依次將體積和濾液體積相當?shù)?、濃度以質量計為0.7％的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)加到培養(yǎng)液中進行洗滌，從而得到了經洗滌的微生物細胞。
(2) 制備固定微生物的載體向500g(1)中所得的經洗滌的細胞的懸浮液(當轉化成干細胞重量時濃度以質量計為20％)中加入500g含有濃度以質量計分別為20％、2％和2％的丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺和2-二甲氨丙基甲基丙烯酰胺的單體混合物溶液，以使其充分懸浮。向懸浮液中加入濃度以質量計為5％(2g)的過硫酸銨和濃度以質量計為50％(2g)的N，N，N，N-四甲基乙二胺以進行聚合和膠凝。將產物切成約1-mm的立方體，從而得到固定微生物的載體。
對通過上述方法得到的固定微生物的載體進行20次循環(huán)處理，每個循環(huán)由下面步驟組成(1)在濃度以質量計為0.1％的丙烯酸鈉溶液(pH7.0)中懸浮并攪拌，(2)靜置，沉淀，和(3)除去上清液。
(3)酰胺化反應將3200g的0.2g/L的丙烯酸鈉水溶液置于另外一個內容積為5升的燒瓶中。向丙烯酸水溶液中加入3g(2)中制備的固定化的微生物。攪拌溶液并保持pH7.0，溫度20℃。
向所述溶液中連續(xù)加入丙烯腈以保持丙烯腈的濃度以質量計為2％，然后進行聚集反應直至丙烯酰胺的濃度以質量計達到50％。
反應結束后，將溶液用孔徑為0.45μm的膜過濾器過濾以除去催化劑。
(4)評估聚合物的物理性質的方法將以質量計20％的實施例1(3)中得到的丙烯酰胺溶于以質量計80％的水中。調節(jié)pH 8.0后，將溶液轉移至杜瓦瓶中，然后將系統(tǒng)中的空氣替換為氮氣。然后，加入0.0004％的過硫酸銨、0.0004％的硫酸鐵和0.01％的4，4’-偶氮雙-(4-氰基戊酸)進行聚合。將這樣得到的含水凝膠狀聚合物用碎肉機切成直徑為幾毫米的顆粒。然后將這些顆粒在80℃下干燥10小時，然后用Wiley碾磨機將其磨碎得到粒徑為2mm或更小的顆粒，從而得到聚合物粉末。
將這樣得到的聚合物粉末用500g水配制成濃度為0.2％的溶液，室溫攪拌4小時使其溶解。然后測量布魯克菲爾德粘度(B型粘度計，轉子的轉速30rpm，1號轉子)。然后，溶液經過80目的金屬網(wǎng)過濾，測定用水洗滌后保留在網(wǎng)上的不溶物質的質量。
(5)評估單體貯存穩(wěn)定性的方法將50g實施例1(3)中得到的50％的丙烯酰胺單體水溶液和鐵測試片置于100ml由聚乙烯制成的瓶子中，然后用蓋子封瓶以防止揮發(fā)。將瓶子保存在50℃的高溫盒中，然后根據(jù)聚合產物的產生與否確定其穩(wěn)定性。
實施例1(4)和(5)的結果見表1和表2。
比較實施例1比較實施例1和實施例1類似地進行，只是在實施例1(2)中制備固定微生物的載體這一步中使用了0.7％的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)而不是以質量計0.1％的丙烯酸鈉水溶液(pH 7.0)。結果見表1和表2。
表1聚合物的物理性質

表2貯存穩(wěn)定性

此處引用的所有出版物、專利和專利申請都完整地引入作為參考。
工業(yè)適用性如上所詳述，在用微生物催化劑生產丙烯酰胺時，使用經丙烯酸洗滌的微生物催化劑使得可以獲得具有高貯存穩(wěn)定性和優(yōu)良質量的丙烯酰胺。
權利要求
1.使用具有腈水合酶的微生物生產丙烯酰胺的方法，其使用經丙烯酸水溶液洗滌的微生物催化劑。
2.權利要求1的生產丙烯酰胺的方法，其中的微生物催化劑是從至少一種選自芽孢桿菌屬、芽孢不動菌屬、微球菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、諾卡氏菌屬、假單孢菌屬、微桿菌屬、紅球菌屬、無色桿菌屬和假諾卡氏菌屬的微生物制備而得。
3.權利要求1或2的生產丙烯酰胺的方法，其中丙烯酸水溶液中的丙烯酸的濃度以質量計為0.01％至10％。
4.權利要求1至3的任何一項的生產丙烯酰胺的方法，其中丙烯酸水溶液的pH值為5至11。
全文摘要
本發(fā)明所提供的是使用微生物催化劑生產具有良好的貯存穩(wěn)定性和改良的丙烯酰胺聚合物物理性質的丙烯酰胺的方法。用丙烯酸水溶液洗滌具有將丙烯腈轉化成丙烯酰胺的催化活性的微生物催化劑，然后將經洗滌的微生物催化劑用于轉化反應以完成上述丙烯酰胺的生產。
文檔編號C12P13/02GK1549863SQ0280735
公開日2004年11月24日 申請日期2002年3月27日 優(yōu)先權日2001年3月27日
發(fā)明者番場啟泰, 諸岡奈津子, 津子 申請人:大野綠水株式會社