專(zhuān)利名稱(chēng)：脂肪氧合酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪氧合酶和編碼它的多核苷酸。
背景技術(shù)：
脂肪氧合酶(EC1.13.11.12)是催化含有順，順-1，4-戊二烯單元的多不飽和脂肪酸如亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸的氧合作用并產(chǎn)生這些脂肪酸的氫過(guò)氧化物的酶。該酶在植物和動(dòng)物中廣泛分布。已經(jīng)分離了各種植物和哺乳動(dòng)物來(lái)源的脂肪氧合酶基因。
另一方面，僅數(shù)量有限的微生物脂肪氧合酶是已知的，而且還沒(méi)有微生物來(lái)源的脂肪氧合酶基因被描述過(guò)。Su和Oliw(J.Biological Chemistry，273(21)，13072-79(1998)描述了來(lái)自禾頂囊殼菌(Gaeumannomycesgraminis)的脂肪氧合酶。
發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種新的真菌脂肪氧合酶并測(cè)定了其序列，該序列可用于該酶的工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。他們將該基因克隆到大腸桿菌中并保藏了該克隆。
因此，本發(fā)明提供脂肪氧合酶，其為a)克隆到保藏號(hào)為DSM14139的大腸桿菌中的質(zhì)粒pUC19上的DNA序列編碼的多肽，b)具有SEQ ID NO1所示的成熟肽的氨基酸序列的多肽或可以從該多肽通過(guò)替代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的多肽，
c)(a)或(b)中定義的多肽的類(lèi)似物，所述類(lèi)似物i)和所述多肽有至少50％的同源性，ii)與抗純化形式的所述多肽的抗體具有免疫反應(yīng)性，iii)為所述多肽的等位變體，或者d)由在低嚴(yán)緊條件下和i)克隆到保藏號(hào)為DSM14139的大腸桿菌中的質(zhì)粒pUC19上的DNA序列或者ii)編碼成熟多肽的SEQ ID NO1的DNA序列或其至少有100個(gè)核苷酸的亞序列的互補(bǔ)鏈雜交的DNA編碼的多肽。
本發(fā)明還提供了多核苷酸，其含有a)克隆到大腸桿菌DSM14139中的質(zhì)粒上的編碼成熟脂肪氧合酶的部分DNA序列，b)SEQ ID NO1中所示的編碼成熟脂肪氧合酶的部分DNA序列，c)a)或b)中所定義的序列的類(lèi)似物，所述類(lèi)似物編碼脂肪氧合酶且i)和所述DNA序列至少有60％的同源性，或者ii)在高嚴(yán)緊性下和所述DNA序列的互補(bǔ)鏈或其至少有100個(gè)核苷酸的亞序列雜交，iii)為其等位變體，或者d)a)，b)或c)的互補(bǔ)鏈。
本發(fā)明的其他方面提供了含有該多核苷酸的核酸構(gòu)建體和重組表達(dá)載體，含有該構(gòu)建體或載體的重組宿主細(xì)胞和通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)脂肪氧合酶的方法。此外，本發(fā)明提供了篩選真核文庫(kù)以得到脂肪氧合酶的方法和對(duì)篩選有用的寡核苷酸探針。最后，本發(fā)明提供了脂肪氧合酶在烘焙和去污劑中的應(yīng)用。
發(fā)明詳述基因組DNA來(lái)源本發(fā)明的脂肪氧合酶基因可得自絲狀真菌，如子囊菌門(mén)(Ascomycota)，特別是Magnaporthaceae，如Magnaporthe菌株，特別是Magnaporthesalvinii Cattaneo(Mycologia 64(1)，110(1972))。此物種亦稱(chēng)為Curvulariasigmoidea、歧曲長(zhǎng)蠕孢(Helminthosporium sigmoideum)、稻小球腔菌(Leptosphaeria salvinii)、Nakataea sigmoidea、稻腐小核菌(Sclerotiumoryzae)和Vakrabeeja sigmoidea。一個(gè)例子就是菌株M.salvinii IFO6642。
備選地，可從Pyricularia，如P.oryzae或P.grisea，例如P.oryzae IFO30517中分離該基因。IFO菌株可從發(fā)酵研究所(Institute for fermentation，Osaka(IFO)，17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka532-8686，日本)購(gòu)得。
利用基于本說(shuō)明書(shū)中的DNA序列設(shè)計(jì)的探針可以從這些生物體中分離脂肪氧合酶基因。
本發(fā)明人根據(jù)布達(dá)佩斯條約將含有得自M.salvinii IFO6642的脂肪氧合酶基因的大腸桿菌菌株保藏于DSMZ-德意志微生物保藏中心(Deut-scheSammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig DE，德國(guó))。保藏日期為2001年2月28日，保藏號(hào)為DSM14139。
通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)脂肪氧合酶通過(guò)用編碼本發(fā)明脂肪氧合酶的DNA序列轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的生物體在允許產(chǎn)生此酶的條件下培養(yǎng)并從培養(yǎng)物中回收此酶可以制得本發(fā)明的脂肪氧合酶。
宿主生物體可以是真核細(xì)胞，特別是真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞，例如曲霉屬(Aspergillus)、鐮孢霉屬(Fusarium)、木霉屬(Trichoderma)或酵母屬(Saccharomyces)菌株，特別是黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、禾本科鐮孢霉(F.graminearum)、接骨木鐮孢霉(F.sambucinum)、F.cerealis或釀酒酵母(S.cerevisiae)的菌株?？筛鶕?jù)EP238,023(Novo Nordisk)，WO96/00787(Novo Nordisk)或EP244,234(Alko)中描述的一般方法在這些宿主生物體中生產(chǎn)脂肪氧合酶。
LOX的性質(zhì)本發(fā)明的脂肪氧合酶能夠氧化多種含有順-順-戊二烯基部分的底物。這樣，它作用于多不飽和脂肪酸如亞油酸(18個(gè)碳原子，2個(gè)雙鍵)，亞麻酸(18:3)，花生四烯酸(20:4)，二十碳五烯酸(EPA，20:5)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6)。它還作用于除脂肪酸外的底物，如亞油酸甲酯以及也可能地，甘油三酯。該酶對(duì)亞油酸的米氏常數(shù)(KM)非常低，并且對(duì)該底物有高專(zhuān)一性(Vmax/KM)。
得自M.salvinii的脂肪氧合酶為9-脂肪氧合酶，即它氧化亞油酸和亞麻酸的第9和第10個(gè)碳原子之間的雙鍵。
得自M.salvinii的脂肪氧合酶在約pH7有最佳活力，并且它在3-12的寬pH范圍內(nèi)活性很高，在6-11的pH范圍內(nèi)活力大于最佳活力的50％。它在pH5-11孵育過(guò)夜后是穩(wěn)定的。
得自M.salvinii的天然脂肪氧合酶在50-60℃具有最佳活力。在40-60℃其活力較高，在70℃時(shí)其活力開(kāi)始下降。在pH7、高達(dá)50℃的條件下孵育30分鐘后，該脂肪氧合酶還是穩(wěn)定的。
重組脂肪氧合酶(在米曲霉中表達(dá))在最適溫度下的催化反應(yīng)速度比在室溫下得到的速度增加約10倍。在67.5℃得到最大反應(yīng)速度。高于最適溫度時(shí)可發(fā)現(xiàn)速度常數(shù)急劇下降。據(jù)認(rèn)為，糖基化使得重組酶比野生型酶對(duì)于熱更穩(wěn)定。
重組脂肪氧合酶在高達(dá)50℃的溫度下能保持相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性至少1小時(shí)。在50-60℃之間的更高溫度下，活力呈線性下降，并且在高于60℃孵育1小時(shí)后檢測(cè)不到活力。在45℃下的溫度孵育時(shí)，檢測(cè)不到活力損失。
脂肪氧合酶的冰凍溶液在保存時(shí)損失一些活力。加入10％的甘油后在-20℃保存2周后看不出活力損失，并且在反復(fù)融解-冰凍后該酶沒(méi)有活力損失。
在陰離子表面活性劑存在下，本發(fā)明的脂肪氧合酶具有良好的穩(wěn)定性。這樣，得自M.salvinii的脂肪氧合酶在400ppm LAS(直鏈烷基-苯磺酸鹽)存在下是穩(wěn)定的。
脂肪氧合酶的應(yīng)用脂肪氧合酶可用于綠色香料(green flavor)的合成，例如從亞麻酸的9-氫過(guò)氧化物得到壬烯醛。合成可類(lèi)似Whitehead等(Whitehead等，1995，Cereal foods world 40(4)，193-197)和US4769243的方法進(jìn)行。
脂肪氧合酶也可用于如JP H11-29410描述的植物激素的合成。
脂肪氧合酶還是良好的類(lèi)胡蘿卜素氧化劑，因此它可用于漂白含有類(lèi)胡蘿卜素或類(lèi)胡蘿卜素樣色素的食品如面粉、油或海洋食品。
其氧化活力可用于對(duì)蛋白質(zhì)、油、淀粉、纖維或它們的混合物進(jìn)行交聯(lián)?；瘜W(xué)化合物的交聯(lián)可用來(lái)合成聚合物以得到塑性纖維或塑性樹(shù)脂。脂肪氧合酶可作為去污劑對(duì)酚的、類(lèi)胡蘿卜素的或脂的污漬或污穢進(jìn)行漂白?；蛘咚捎糜谄讖U水或紡織染料。
脂肪氧合酶可用于漂白含有類(lèi)胡蘿卜素的植物或海洋食品物質(zhì)。這樣它可用于漂白制作面包、面條或意大利面食(pasta)的面粉或者漂白含有蝦青素的魚(yú)肉或魚(yú)油。
脂肪氧合酶也可用于在存在脂肪酸、油或脂肪時(shí)蛋白質(zhì)、油、淀粉、植物纖維或它們的混合物的交聯(lián)。它可用于改變食品的質(zhì)地或物理性質(zhì)或者控制脂肪和油的味道，或者在食品用途外還用于生產(chǎn)由天然材料構(gòu)成的聚合物。交聯(lián)的化合物可以是化學(xué)化合物，例如酚類(lèi)、羰基、羧基或酰胺化合物或者它們的混合物。它可用于合成塑性纖維或樹(shù)脂。
脂肪氧合酶還可以與氫過(guò)氧化物裂合酶一起協(xié)同作用用于合成香料化合物如己醛或己烯醛?；蛘邔?duì)于用作上面兩種酶的來(lái)源的植物材料，脂肪氧合酶可以加入到植物材料中以提高香料化合物的產(chǎn)量。類(lèi)似的情況可以發(fā)生在植物或動(dòng)物激素的合成中。
最后，脂肪氧合酶可用作漂白劑。它可以用于去污劑中漂白衣物上的酚的、類(lèi)胡蘿卜素的、脂的污漬或污穢?；蛘咚梢杂糜趶U水中漂白紡織染料或制漿工業(yè)的染料或者用于改變?nèi)玖腺|(zhì)地。
重組表達(dá)載體本發(fā)明的表達(dá)載體典型地包括編碼啟動(dòng)子、操縱基因、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始信號(hào)和可選地，選擇標(biāo)記基因、轉(zhuǎn)錄終止子、阻抑物基因或各種激活劑基因的控制序列。載體可以是自主復(fù)制載體或者可以整和到宿主細(xì)胞基因組中。
通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行生產(chǎn)通過(guò)用編碼本發(fā)明脂肪氧合酶的DNA序列轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞、將轉(zhuǎn)化的生物體在允許產(chǎn)生此酶的條件下培養(yǎng)并從培養(yǎng)物中回收此酶，可以制得本發(fā)明的脂肪氧合酶。
宿主生物體可以是真核細(xì)胞，特別是真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞，例如曲霉屬、鐮孢霉屬、木霉屬或酵母屬，特別是黑曲霉、米曲霉、禾本科鐮孢霉、接骨木鐮孢霉、F.cerealis或釀酒酵母的菌株?？筛鶕?jù)EP238,023(Novo Nordisk)，WO96/00787(Novo Nordisk)或EP244,234(Alko)中描述的一般方法在這些宿主生物體中生產(chǎn)脂肪氧合酶。
可以通過(guò)陽(yáng)離子交換層析一步純化該酶到同質(zhì)。
核苷酸探針可根據(jù)SEQ ID NO1的DNA序列或者SEQ ID NO2的多肽序列，特別是成熟肽部分的序列設(shè)計(jì)核苷酸探針。該探針可用于如下所描述的LOX-編碼DNA的篩選中。
可以基于SEQ ID NO2中成熟部分的氨基酸序列或者相應(yīng)部分的DNA序列用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T(1989)Molecular cloninga laboratory manual(第二版)Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York中所描述的)制備合成的寡核苷酸引物。它可以是簡(jiǎn)并探針，典型的含有至少20個(gè)核苷酸。
篩選真核DNA文庫(kù)可通過(guò)包括如下步驟的方法得到具有脂肪氧合酶活性的多肽a)制備真核DNA文庫(kù)，b)篩選文庫(kù)以選擇與上述探針雜交的DNA分子，c)用所選的DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，d)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以表達(dá)該DNA分子編碼的多肽，以及e)分析表達(dá)的多肽以選擇具有脂肪氧合酶活性的多肽。
可通過(guò)常用方法制備真核DNA文庫(kù)。它可包括來(lái)自于諸如如上所述的合適來(lái)源的基因組DNA或者雙鏈cDNA。
DNA序列的分子篩選可通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)后進(jìn)行雜交來(lái)實(shí)施。
根據(jù)熟知的方法，可分離出在分子篩選中產(chǎn)生的PCR片段并將其亞克隆到合適的載體中。此PCR片段可用于通過(guò)例如菌落或者噬菌斑雜交篩選DNA文庫(kù)。
雜交雜交可以用于指示給定的DNA序列和對(duì)應(yīng)于本發(fā)明DNA序列的核苷酸探針相類(lèi)似。雜交可在低、中或高嚴(yán)緊性條件下進(jìn)行。下面詳細(xì)描述了一個(gè)雜交條件的實(shí)例。
決定核苷酸探針與同源DNA或RNA序列雜交的合適條件包括將含有DNA片段或RNA的濾膜預(yù)浸泡于5×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液)中10min，將濾膜在具有5×SSC(Sambrook等，1989)、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml超聲變性的鮭魚(yú)精子DNA(Sambrook等，1989)的溶液中預(yù)雜交，然后在含有隨機(jī)引發(fā)的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)Anal.Biochem.1326-13)、32P-dCTP標(biāo)記的(比活力＞1×109cpm/μg)探針的相同溶液中于約45℃雜交12小時(shí)。然后將濾膜在2×SSC、0.5％SDS中于溫度至少55℃，尤其至少60℃，更尤其至少65℃，例如至少70℃或者至少75℃下洗滌兩次，30分鐘。
用x-光片檢測(cè)在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子。
序列對(duì)比(alignment)與同源性本發(fā)明的脂肪氧合酶和核苷酸序列可以和此處公開(kāi)的序列有至少75％或至少85％，尤其至少90％或至少95％，例如至少98％的同源性。
為了本發(fā)明的目的，用對(duì)蛋白質(zhì)和DNA對(duì)比都有用的Needleman-Wunsch對(duì)比(即總體對(duì)比)進(jìn)行了序列對(duì)比和同源性得分的計(jì)算。對(duì)蛋白質(zhì)和DNA對(duì)比分別使用默認(rèn)的得分矩陣BLOSUM50和單位矩陣。對(duì)于缺口中的第一個(gè)殘基的罰分，對(duì)蛋白質(zhì)為-12而對(duì)DNA為-16；對(duì)于缺口中其他殘基的罰分，對(duì)蛋白質(zhì)為-2而對(duì)DNA為-4。對(duì)比采用FASTA軟件包，版本v20u6(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“改進(jìn)的生物學(xué)序列分析工具”，PNAS 852444-2448和W.R.Pearson(1990)“用FASTP和FASTA進(jìn)行快速靈敏的序列比較”，Methods in Enzymology，18363-98)。
實(shí)施例材料與方法分子克隆技術(shù)在Sambrook等(1989)中描述。
下面的商品化質(zhì)粒和大腸桿菌菌株用于亞克隆和DNA文庫(kù)構(gòu)建pT7Blue(Novagen)pUC19(TOYOBO，日本)大腸桿菌JM109(TOYOBO，日本)大腸桿菌DH12S(GIBCO BRL，Life Technologies，USA)用DIG標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(Boehringer Manheim)進(jìn)行雜交探針的標(biāo)記和檢測(cè)。尼龍膜Hybond-N+(Amersham，英國(guó))用于菌落雜交中DNA的轉(zhuǎn)移。
大豆脂肪氧合酶(I-B型)(目錄號(hào)#L7315)和蝦青素(目錄號(hào)#A-9335)由Sigma提供。β-胡蘿卜素(目錄號(hào)#031-05533)由Wako提供。
培養(yǎng)基和緩沖液COVE-ar每升342.3g蔗糖，20ml COVE鹽溶液，10mM丙烯酰胺，15mM CsCl2，30g純凈瓊脂(Difco)COVE2-ar每升30g蔗糖，20ml COVE鹽溶液，10mM丙烯酰胺，30g純凈瓊脂(Difco)COVE鹽溶液每升26g KCl，26g MgSO4-7H2O，76g KH2PO4，50mlCove微量金屬。
Cove微量金屬每升0.04g NaB4O7-10H2O，0.4g CuSO4-5H2O，1.2gFeSO4-7H2O，0.7g MnSO4-H2O，0.7g Na2MoO2-2H2O，0.7g ZnSO4-7H2O。
AMG微量金屬每升14.3g ZnSO4-7H2O，2.5g CuSO4-5H2O，0.5gNiCl2，13.8g FeSO4，8.5g MnSO4，3.0g檸檬酸。
YPG每升4g酵母抽提物，1g KH2PO4，0.5g MgSO4-7H2O，15g葡萄糖，pH6.0。
STC0.8M山梨糖醇，25mM Tris pH8，25mM CaCl2。
STPC溶于STC緩沖液的40％PEG4000。
Cove頂層瓊脂糖每升342.3g蔗糖，20ml COVE鹽溶液，10mM乙酰胺，10g低熔點(diǎn)瓊脂糖。
MS-9每升30g大豆粉，20g甘油，pH6.0。
MDU-2Bp每升45g麥芽糖-1H2O，7g酵母抽提物，12g KH2PO4，1g MgSO4-7H2O，2g K2SO4，5g尿素，1g NaCl，0.5ml AMG微量金屬溶液pH5.0。
宿主生物體米曲霉BECh2在WO00/39322中描述。它是JaL228(在WO98/123000中描述)的突變株，而JaL228是IFO4177的突變株。
米曲霉的轉(zhuǎn)化米曲霉菌株BECh2接種于100ml YPG培養(yǎng)基中并在80rpm攪拌下于32℃孵育16小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集長(zhǎng)大的菌絲體，然后用0.6M KCl洗滌并重新懸浮于含有Glucanex(Novozymes)的30ml 0.6M的KCl中，使其濃度為30μl/ml。將混合物在60rpm攪拌下于32℃孵育，直到形成原生質(zhì)體。過(guò)濾除去剩余的菌絲體后，離心收集原生質(zhì)體并用STC緩沖液洗滌兩次。原生質(zhì)體用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(hematitometer)計(jì)數(shù)并重新懸浮于STC∶STPC∶DMSO(8∶2∶0.1)中使得終濃度為1.2×107個(gè)原生質(zhì)體/ml。向100μl原生質(zhì)體溶液中加入約4μg DNA，輕輕混合并冰上孵育30分鐘。向混合物中加入1μl STPC緩沖液并在37℃再孵育30分鐘。加入在50℃預(yù)熱的10ml Cove頂層瓊脂糖后，將反應(yīng)混合物倒在COVE-ar瓊脂平板上。將平板在32℃孵育5天。
SDS-PAGE用商品化的凝膠PAGEL AE6000 NPU-7.5L(7.5T％)在儀器AE-6400(Atto，日本)上按照所提供的方案進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。將15μl樣品懸浮于15μl 2倍濃度的上樣緩沖液(100mM Tris-HCl(pH6.8)，200mM二硫蘇糖醇，4％SDS，0.2％溴酚藍(lán)和20％甘油)中并煮沸5分鐘。將20μl樣品溶液上樣到聚丙烯酰胺凝膠上并在電泳緩沖液(25mMTris，0.1％SDS，192mM甘氨酸)中電泳，每塊凝膠20mA。所得凝膠用SYPRO Orange染色并用分子成像儀FX(BIO-RAD)檢測(cè)。
分析脂肪氧合酶活力分光光度分析通過(guò)跟蹤形成的在234nm有光吸收的氫過(guò)氧化物，于25℃用分光光度計(jì)測(cè)定脂肪氧合酶活力。向0.98ml緩沖液(50mM KH2PO4/NaHPO4，pH7.0)中加入10μl底物溶液(10mM亞麻酸，分散于0.2％Tween20中)之后加入10μl酶溶液開(kāi)始反應(yīng)。一個(gè)單位將使每分鐘234nm的光吸收增加0.001。
FOX分析通過(guò)用Hiscotron向每一80μl含有分散于0.02％Tween 20中的0.7mM亞麻酸的50mM緩沖液中加入20μl酶溶液起始測(cè)定試驗(yàn)，之后孵育10min。通過(guò)加入900μl FOX試劑溶于甲醇∶水(9∶1)的硫酸(25mM)、二甲酚橙(100μM)、硫酸亞鐵(100μM)、丁化羥基甲苯(4mM)，中止此測(cè)定試驗(yàn)?？瞻讓?duì)照在孵育時(shí)僅含有底物溶液，但在加入FOX試劑后加入酶溶液。酸化的二甲酚橙的黃色由于脂質(zhì)氫過(guò)氧化物介導(dǎo)的染料的Fe2+離子的氧化而轉(zhuǎn)變成藍(lán)色。加入FOX試劑后1小時(shí)測(cè)定Fe3+復(fù)合物在620nm的光吸收。
漂白分析通過(guò)跟蹤470nm的光吸收在25℃用分光光度計(jì)測(cè)定脂肪氧合酶的漂白效果。色素溶液制備如下將150μl色素儲(chǔ)液(每1ml氯仿中含1mg色素)蒸發(fā)至干。然后緩慢加入30ml含有0.3％Tween 20的緩沖液(50mMKH2PO4/NaHPO4，pH7.0)使色素溶解。向0.98ml色素溶液中加入10μl底物溶液(10mM亞麻酸，分散于0.2％的Tween20中)，加入10μl酶溶液開(kāi)始反應(yīng)。
實(shí)施例1從M.salvinii中克隆基因組LOX基因用SacI消化從Magnaporthe salvinii得到的基因組DNA并在1.0％的瓊脂糖凝膠上分離。從凝膠中回收了約2.5kbp的DNA消化物并和用BAP處理過(guò)的、用SacI線性化的pUC19連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH12S中以構(gòu)建部分基因組文庫(kù)。對(duì)其進(jìn)行篩選，分離出脂肪氧合酶陽(yáng)性的大腸桿菌菌落并回收稱(chēng)為pSG28的質(zhì)粒。質(zhì)粒pSG28含有一個(gè)2.5kbp的SacI基因組片段，該片段含有推定的LOX同源序列。2.5kbp中的1973bp序列見(jiàn)SEQ.ID 1所示。
鑒定了內(nèi)含子并顯示于SEQ ID NO1中。對(duì)剪接位點(diǎn)的預(yù)測(cè)方法在S.M.Hebsgaard等，Nucleic Acids Research，1996，Vol.24，No.17，3439-3452中描述。
推定的可讀框由1851bp組成，推導(dǎo)的氨基酸序列相應(yīng)于如SEQ IDNO2所示的617個(gè)氨基酸。其分子量估計(jì)為67500Da。
含有質(zhì)粒pSG28的大腸桿菌DH12S作為DSM14139保藏于DSMZ，保藏日期為2001年2月28日。
實(shí)施例2在米曲霉中表達(dá)M.salvinii LOX構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒M.salvinii基因組基因的部分基因組序列通過(guò)PCR，用pSG28作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物3和4(SEQ ID NO3和4)使得BamHI和XhoI位點(diǎn)位于PCR產(chǎn)物的兩端(分別為引物3的第4-9位核苷酸和引物4的第5-10位核苷酸)。PCR反應(yīng)混合物由2.5mM dNTP、引物3和引物4各30pmol、5個(gè)單位LA taq聚合酶(Takara)和提供的GC緩沖液I組成。反應(yīng)條件如下所示。步驟1之后向反應(yīng)混合物中加入LA taq聚合酶。
*步驟2到步驟4重復(fù)30次。
分離PCR擴(kuò)增的1.9kb的片段并克隆到pT7Blue上得到pSG29。
將質(zhì)粒pSG29用BamHI和XhoI消化，并將含有LOX基因的1.9kb片段與用BamHI和XhoI消化的pMT2188連接。質(zhì)粒pMT2188有修飾的黑曲霉中性淀粉酶啟動(dòng)子、構(gòu)巢曲霉TPI引導(dǎo)序列、黑曲霉葡糖淀粉酶終止子、作為真菌轉(zhuǎn)化標(biāo)志的構(gòu)巢曲霉amdS基因和作為大腸桿菌轉(zhuǎn)化標(biāo)志的釀酒酵母ura3。用大腸桿菌DB6507進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在大腸桿菌DB6507中有pyrF基因缺陷，但可以用釀酒酵母Ura3彌補(bǔ)。所得質(zhì)粒稱(chēng)為pSG30。
在米曲霉中表達(dá)M.salvinii的LOX用質(zhì)粒pSG30轉(zhuǎn)化米曲霉BECh2并分離選擇陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體于32℃在COVE 2-ar上生長(zhǎng)5天并接種到100ml MS-9搖瓶中。在32℃劇烈振蕩培養(yǎng)1天后，將3ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到100ml置于搖瓶中的MDU-2Bp中并于32℃培養(yǎng)3天。3500rpm離心培養(yǎng)液10分鐘并收集上清液。
用前面描述的分光光度計(jì)方法測(cè)定上清液的脂肪氧合酶活力。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液顯示約100,000U/ml的活性而未轉(zhuǎn)化的米曲霉BECh2未顯示活力。對(duì)培養(yǎng)上清液還進(jìn)行SDS-PAGE分析。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體顯示出80-100kDa的成片條帶，這表明蛋白高度糖基化。未轉(zhuǎn)化的米曲霉BECh2沒(méi)有顯示任何顯著的條帶。
實(shí)施例3脂肪氧合酶的底物專(zhuān)一性用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定了M.salvinii脂肪氧合酶對(duì)許多底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
作為比較，也用大豆脂肪氧合酶對(duì)一種底物進(jìn)行了試驗(yàn)。
實(shí)施例3脂肪氧合酶活力的pH依賴(lài)性用上面描述的FOX分析測(cè)定了在各種pH值下M.salvinii脂肪氧合酶的相對(duì)活力，使用下面的緩沖液50mM檸檬酸/檸檬酸鈉(pH2.21-3.73)，KH2PO4/Na2HPO4(pH5.30，6.17)，Tris/HCl(pH7.01，8.02)，甘氨酰甘氨酸NaCl/NaOH(pH9.33-11.0)。
實(shí)施例4脂肪氧合酶活力的溫度依賴(lài)性在pH7.0孵育10min研究溫度對(duì)M.salvinii脂肪氧合酶的影響
實(shí)施例5脂肪氧合酶的漂白效果檢測(cè)了M.salvinii LOX的漂白效果。包括大豆L1用于比較。β-胡蘿卜素和蝦青素用作色素。
結(jié)果表明M.salvinii LOX漂白了色素溶液。大豆LOX對(duì)漂白幾乎無(wú)作用。
序列表<110>諾和酶股份有限公司(Novozymes A/S)<120>脂肪氧合酶<130>10148<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1973<212>DNA<213>Magnaporthe salvinii<220>
<221>CDS<222>(1)..(381)<220>
<221>mat_peptide<222>(52)..()<220>
<221>CDS<222>(501)..(1970)<400>1atg cgc atc gga ctc ttg gcc ttc gcc gtc gcg gcg cgc tat gtg gaa 48Met Arg Ile Gly Leu Leu Ala Phe Ala Val Ala Ala Arg Tyr Val Glu-15 -10 -5gcg ctg cca gtc gcg agc ggc gaa gaa gtg gcc tcg tcg tcc gct ccg 96Ala Leu Pro Val Ala Ser Gly Glu Glu Val Ala Ser Ser Ser Ala Pro-1 1 5 10 15acg acg ctg ccc tcg acg tcg agc agc tct gcg ctt ccc tcc ccg acc 144Thr Thr Leu Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Leu Pro Ser Pro Thr20 25 30aag tac acg ctt ccc cac gag gac ccc aac ccg gaa gcg agg aag gcc 192Lys Tyr Thr Leu Pro His Glu Asp Pro Asn Pro Glu Ala Arg Lys Ala35 40 45gag ata gcg tta aag agg gga ggg ttc ctc tac gga ccc tcc acc ctg 240
Glu Ile Ala Leu Lys Arg Gly Gly Phe Leu Tyr Gly Pro Ser Thr Leu50 55 60ggc cag act acc ttt tac ccc agc ggg acc ctg ggg acc gcc atg tcg 288Gly Gln Thr Thr Phe Tyr Pro Ser Gly Thr Leu Gly Thr Ala Met Ser65 70 75caa cgc gac cag gcc ctc tgg ctc agg gat gca gag aac caa acg ata 336Gln Arg Asp Gln Ala Leu Trp Leu Arg Asp Ala Glu Asn Gln Thr Ile80 85 90 95aca gcg tat cgt gaa gcc aac gag aca ctg agg gat atc cag agc 381Thr Ala Tyr Arg Glu Ala Asn Glu Thr Leu Arg Asp Ile Gln Ser100 105 110gtatgtgtcg agccgtgttt atgcgttcca atcattctct gtgctcctgt ccgtccccgc 441ccggggttac agccaagccg attcagtagc taactcggaa tgtctggttt gctctgcag500cat ggc ggt ctc aag acg ctt gac gac ttc gcg ctc ctc tac gac ggc 548His Gly Gly Leu Lys Thr Leu Asp Asp Phe Ala Leu Leu Tyr Asp Gly115 120 125cat tgg aaa gcg tcg gtc cca gag gga ata gaa aag ggc atg ctg agc 596His Trp Lys Ala Ser Val Pro Glu Gly Ile Glu Lys Gly Met Leu Ser130 135 140aac tac act tcg gac ctg ctc ttt tcc atg gag cgg ctc tcc aac aac 644Asn Tyr Thr Ser Asp Leu Leu Phe Ser Met Glu Arg Leu Ser Asn Asn145 150 155ccc tac agc ctc aag cgc ctc cat cca acc aag gac aag ctg ccg ttc 692Pro Tyr Ser Leu Lys Arg Leu His Pro Thr Lys Asp Lys Leu Pro Phe160 165 170agc gtc gag gac aag gtg gtc aag cag ctg acg gcc acg acg ctt gcg 740Ser Val Glu Asp Lys Val Val Lys Gln Leu Thr Ala Thr Thr Leu Ala175 180 185 190gcg ctc cac aag gcc ggc cgt ctc ttc ttc gtt gac cac agc gat cag 788Ala Leu His Lys Ala Gly Arg Leu Phe Phe Val Asp His Ser Asp Gln195 200 205aag aaa tac acg ccg cag gca ggt cgg tat gct gcg gcc tgc cag ggg 836Lys Lys Tyr Thr Pro Gln Ala Gly Arg Tyr Ala Ala Ala Cys Gln Gly210 215 220
ctt ttc tat gtg gac gcg cgg tcc aat cag ttc ctg ccg ctg gcc atc 884Leu Phe Tyr Val Asp Ala Arg Ser Asn Gln Phe Leu Pro Leu Ala Ile225 230 235aag acc aac gtg ggc gca gac ctg acg tac acg cca ctc gac gac aag 932Lys Thr Asn Val Gly Ala Asp Leu Thr Tyr Thr Pro Leu Asp Asp Lys240 245 250aac gac tgg ctt ctg gcc aag atc atg ttc aac aac aat gac ctg ttc 980Asn Asp Trp Leu Leu Ala Lys Ile Met Phe Asn Asn Asn Asp Leu Phe255 260 265 270tac tcg cag atg tac cat gtc ctg ttc cac acg gtt cca gaa atc gtg 1028Tyr Ser Gln Met Tyr His Val Leu Phe His Thr Val Pro Glu Ile Val275 280 285cac atg gcc gcc atc cgg acg cta agc gag agc cac ccg gtg ctg gcc 1076His Met Ala Ala Ile Arg Thr Leu Ser Glu Ser His Pro Val Leu Ala290 295 300gtg ctc aat cgg atc atg tat caa gcc tat gcg atc cgg cca gtg ggc 1124Val Leu Asn Arg Ile Met Tyr Gln Ala Tyr Ala Ile Arg Pro Val Gly305 310 315gaa cgc atc ctg ttc aac ccg ggc ggg ttt tgg gac cag aac ctt ggc 1172Glu Arg Ile Leu Phe Asn Pro Gly Gly Phe Trp Asp Gln Asn Leu Gly320 325 330ctg ccc gcc acg gcg gcc gtc gac ttt ctc agt tcc atc tac gcc cat 1220Leu Pro Ala Thr Ala Ala Val Asp Phe Leu Ser Ser Ile Tyr Ala His335 340 345 350ggc gag ggc ggg ttc cgg gcc ggc tac gtg gaa aac aac ctg cgc aag 1268Gly Glu Gly Gly Phe Arg Ala Gly Tyr Val Glu Asn Asn Leu Arg Lys355 360 365cgg ggg ctg gtg ggc gac acc ttt ggc ggc ccg gcg ctc ccg cac ttc 1316Arg Gly Leu Val Gly Asp Thr Phe Gly Gly Pro Ala Leu Pro His Phe370 375 380ccc ttc tac gag gac gcg cag cgc gtc ctc ggg gcg atc cgc ggc ttc 1364Pro Phe Tyr Glu Asp Ala Gln Arg Val Leu Gly Ala Ile Arg Gly Phe385 390 395atg cag gcc ttt gtc gsc tcg acc tsc ggg ggc gac gsc ggc gcg ctg 1412Met Gln Ala Phe Val Asp Ser Thr Tyr Gly Gly Asp Asp Gly Ala Leu400 405 410
gcg cgc gac ttt gag ctg cag gac tgg gtg gcc gag gcc aac ggg ccg 1460Ala Arg Asp Phe Glu Leu Gln Asp Trp Val Ala Glu Ala Asn Gly Pro415 420 425 430gcg cag gtg cgc gac ttc ccc acg gcg ccg ctg cgg cgg cgc gag gag 1508Ala Gln Val Arg Asp Phe Pro Thr Ala Pro Leu Arg Arg Arg Glu Glu435 440 445ctg gtg ggc atc ctg acg cac ata gcc tgg aac acg ggc ggc gcg cac 1556Leu Val Gly Ile Leu Thr His Ile Ala Trp Asn Thr Gly Gly Ala His450 455 460cac gtt cta aac cag ggg gcg ccc gtg cgc gcc tcg ggc gtg ctg ccg 1604His Val Leu Asn Gln Gly Ala Pro Val Arg Ala Ser Gly Val Leu Pro465 470 475ctc cac ccg gcg gct ctt tac gcg ccc gtc ccg gcg gcc aag ggc gcc 1652Leu His Pro Ala Ala Leu Tyr Ala Pro Val Pro Ala Ala Lys Gly Ala480 485 490gtc gcg tcc agc gac ggc ctg ctg gcg tgg ctg ccg gac gag gtc aaa 1700Val Ala Ser Ser Asp Gly Leu Leu Ala Trp Leu Pro Asp Glu Val Lys495 500 505 510tcg gtg gag cag gtg tcg ctg ctg gcg cgc ttc aac cgc gcg cag gtt 1748Ser Val Glu Gln Val Ser Leu Leu Ala Arg Phe Asn Arg Ala Gln Val515 520 525agg gac aga aac cag acg gtg cgc aac atg ttc gcc gca ccg gag ctg 1796Arg Asp Arg Asn Gln Thr Val Arg Asn Met Phe Ala Ala Pro Glu Leu530 535 540ctg gct gga aat ggc gag gcg tac gcg gcg gcc aac gcg agg ttc gtc 1844Leu Ala Gly Asn Gly Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Asn Ala Arg Phe Val545 550 555gag gag acg ggc cgg ata agc cgc gag ata gag ggc agg ggt ttc gat 1892Glu Glu Thr Gly Arg Ile Ser Arg Glu Ile Glu Gly Arg Gly Phe Asp560 565 570agc aag ggc ctg agc cag ggg atg ccc ttt atc tgg acc gcc ttg aat 1940Ser Lys Gly Leu Ser Gln Gly Met Pro Phe Ile Trp Thr Ala Leu Asn575 580 585 590ccc gcg gtg aac ccg ttt ttc ctg agc atc tag 1973Pro Ala Val Asn Pro Phe Phe Leu Ser Ile
595 600<210>2<211>617<212>PRT<213>Magnaporthe salVinii<400>2Met Arg Ile Gly Leu Leu Ala Phe Ala Val Ala Ala Arg Tyr Val Glu-15 -10 -5Ala Leu Pro Val Ala Ser Gly Glu Glu Val Ala Ser Ser Ser Ala Pro-1 1 5 10 15Thr Thr Leu Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Leu Pro Ser Pro Thr20 25 30Lys Tyr Thr Leu Pro His Glu Asp Pro Asn Pro Glu Ala Arg Lys Ala35 40 45Glu Ile Ala Leu Lys Arg Gly Gly Phe Leu Tyr Gly Pro Ser Thr Leu50 55 60Gly Gln Thr Thr Phe Tyr Pro Ser Gly Thr Leu Gly Thr Ala Met Ser65 70 75Gln Arg Asp Gln Ala Leu Trp Leu Arg Asp Ala Glu Asn Gln Thr Ile80 85 90 95Thr Ala Tyr Arg Glu Ala Asn Glu Thr Leu Arg Asp Ile Gln Ser His100 105 110Gly Gly Leu Lys Thr Leu Asp Asp Phe Ala Leu Leu Tyr Asp Gly His115 120 125Trp Lys Ala Ser Val Pro Glu Gly Ile Glu Lys Gly Met Leu Ser Asn130 135 140Tyr Thr Ser Asp Leu Leu Phe Ser Met Glu Arg Leu Ser Asn Asn Pro145 150 155Tyr Ser Leu Lys Arg Leu His Pro Thr Lys Asp Lys Leu Pro Phe Ser160 165 170 175Val Glu Asp Lys Val Val Lys Gln Leu Thr Ala Thr Thr Leu Ala Ala180 185 190
Leu His Lys Ala Gly Arg Leu Phe Phe Val Asp His Ser Asp Gln Lys195 200 205Lys Tyr Thr Pro Gln Ala Gly Arg Tyr Ala Ala Ala Cys Gln Gly Leu210 215 220Phe Tyr Val Asp Ala Arg Ser Asn Gln Phe Leu Pro Leu Ala Ile Lys225 230 235Thr Asn Val Gly Ala Asp Leu Thr Tyr Thr Pro Leu Asp Asp Lys Asn240 245 250 255Asp Trp Leu Leu Ala Lys Ile Met Phe Asn Asn Asn Asp Leu Phe Tyr260 265 270Ser Gln Met Tyr His Val Leu Phe His Thr Val Pro Glu Ile Val His275 280 285Met Ala Ala Ile Arg Thr Leu Ser Glu Ser His Pro Val Leu Ala Val290 295 300Leu Asn Arg Ile Met Tyr Gln Ala Tyr Ala Ile Arg Pro Val Gly Glu305 310 315Arg Ile Leu Phe Asn Pro Gly Gly Phe Trp Asp Gln Asn Leu Gly Leu320 325 330 335Pro Ala Thr Ala Ala Val Asp Phe Leu Ser Ser Ile Tyr Ala His Gly340 345 350Glu Gly Gly Phe Arg Ala Gly Tyr Val Glu Asn Asn Leu Arg Lys Arg355 360 365Gly Leu Val Gly Asp Thr Phe Gly Gly Pro Ala Leu Pro His Phe Pro370 375 380Phe Tyr Glu Asp Ala Gln Arg Val Leu Gly Ala Ile Arg Gly Phe Met385 390 395Gln Ala Phe Val Asp Ser Thr Tyr Gly Gly Asp Asp Gly Ala Leu Ala400 405 410 415Arg Asp Phe Glu Leu Gln Asp Trp Val Ala Glu Ala Asn Gly Pro Ala420 425 430Gln Val Arg Asp Phe Pro Thr Ala Pro Leu Arg Arg Arg Glu Glu Leu
435 440 445Val Gly Ile Leu Thr His Ile Ala Trp Asn Thr Gly Gly Ala His His450 455 460Val Leu Asn Gln Gly Ala Pro Val Arg Ala Ser Gly Val Leu Pro Leu465 470 475His Pro Ala Ala Leu Tyr Ala Pro Val Pro Ala Ala Lys Gly Ala Val480 485 490 495Ala Ser Ser Asp Gly Leu Leu Ala Trp Leu Pro Asp Glu Val Lys Ser500 505 510Val Glu Gln Val Ser Leu Leu Ala Arg Phe Asn Arg Ala Gln Val Arg515 520 525Asp Arg Asn Gln Thr Val Arg Asn Met Phe Ala Ala Pro Glu Leu Leu530 535 540Ala Gly Asn Gly Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Asn Ala Arg Phe Val Glu545 550 555Glu Thr Gly Arg Ile Ser Arg Glu Ile Glu Gly Arg Gly Phe Asp Ser560 565 570 575Lys Gly Leu Ser Gln Gly Met Pro Phe Ile Trp Thr Ala Leu Asn Pro580 585 590Ala Val Asn Pro Phe Phe Leu Ser Ile595 600<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>引物3
<400>3cgcggatcca tgcgcatcgg actcttggc29<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>引物4<400>4cccgctcgag ctagatgctc aggaaaaacg g 3權(quán)利要求
1.脂肪氧合酶，其為a)克隆在保藏號(hào)為DSM 14139的大腸桿菌中的質(zhì)粒pUC19上的DNA序列編碼的多肽，b)具有SEQ ID NO1中所示的成熟肽的氨基酸序列的多肽或可以從該多肽通過(guò)替代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的多肽，c)(a)或(b)中定義的多肽的類(lèi)似物，該類(lèi)似物i)和所述多肽至少有50％的同源性，ii)與抗純化形式的所述多肽的抗體有免疫反應(yīng)性，iii)為所述多肽的等位變體，或者d)由在低嚴(yán)緊條件下和i)克隆在保藏號(hào)為DSM 14139的大腸桿菌中的質(zhì)粒pUC19上的DNA序列或者ii)編碼成熟多肽的SEQ ID NO1的DNA序列或其至少有100個(gè)核苷酸的亞序列的互補(bǔ)鏈雜交的DNA編碼的多肽。
2.權(quán)利要求1的脂肪氧合酶，其來(lái)源于絲狀真菌，如子囊菌門(mén)，如Magnaporthe的菌株，特別是M.salvinii，更特別的是菌株IFO 6642。
3.DNA，其含有編碼權(quán)利要求1或2的脂肪氧合酶的核酸序列。
4.多核苷酸，其含有a)克隆在大腸桿菌DSM 14139中的質(zhì)粒上的編碼成熟脂肪氧合酶的部分DNA序列，b)SEQ ID NO1中所示的編碼成熟脂肪氧合酶的部分DNA序列，c)a)或b)中所定義的序列的類(lèi)似物，該類(lèi)似物編碼脂肪氧合酶且i)和所述DNA序列至少有60％的同源性，或者ii)在高嚴(yán)緊性下和所述DNA序列的互補(bǔ)鏈或其至少有100個(gè)核苷酸的亞序列雜交，iii)為其等位變體，或者d)a)、b)或c)的互補(bǔ)鏈。
5.含有權(quán)利要求3或4的核酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述核酸序列和能夠在適宜的表達(dá)宿主中指導(dǎo)脂肪氧合酶表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)控制序列可操作的連接。
6.重組表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求5的核酸構(gòu)建體、啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。
7.重組宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求5的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求6的載體。
8.生產(chǎn)脂肪氧合酶的方法，其包括在有助于產(chǎn)生脂肪氧合酶的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞和回收脂肪氧合酶。
9.寡核苷酸探針，其由至少20個(gè)核苷酸組成且編碼SEQ ID NO2的部分多肽序列。
10.獲得具有脂肪氧合酶活性的多肽的方法，其包括a)制備真核DNA文庫(kù)，b)篩選文庫(kù)以選擇與權(quán)利要求9的探針雜交的DNA分子，c)用所選的DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，d)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以表達(dá)該DNA分子編碼的多肽，以及e)分析表達(dá)的多肽以選擇具有脂肪氧合酶活性的多肽。
11.制備生面團(tuán)或生面團(tuán)的烘焙產(chǎn)品的方法，其包括向生面團(tuán)中加入權(quán)利要求1或2的脂肪氧合酶。
12.含有權(quán)利要求1或2的脂肪氧合酶的生面團(tuán)組合物。
13.含有表面活性劑和權(quán)利要求1或2的脂肪氧合酶的去污劑組合物。
14.前述權(quán)利要求的去污劑組合物，其中表面活性劑為陰離子型的。
15.氧化多不飽和脂肪酸的方法，其包括在有空氣存在時(shí)使該酸和權(quán)利要求1或2的脂肪氧合酶接觸。
16.前述權(quán)利要求的方法的應(yīng)用，用于合成綠色香料或植物激素。
全文摘要
本發(fā)明人從Magnaporthe salvinii中發(fā)現(xiàn)了一種新的真菌脂肪氧合酶并測(cè)定了其序列。他們對(duì)該酶的基因進(jìn)行了測(cè)序，將該基因克隆到大腸桿菌中并保藏了此克隆。基于該序列信息的寡核苷酸探針對(duì)于篩選真核文庫(kù)以得到脂肪氧合酶是有用的。該脂肪氧合酶可用于烘焙和去污劑中。
文檔編號(hào)A21D13/00GK1541264SQ02808499
公開(kāi)日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2002年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月20日
發(fā)明者明子杉尾, 高木忍 申請(qǐng)人:諾和酶股份有限公司