專利名稱：新蛋白質(zhì),編碼該蛋白質(zhì)的基因和它們的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗菌活性的新的蛋白質(zhì)和制備它的方法，編碼該蛋白質(zhì)的基因，和利用該蛋白質(zhì)和基因的方法。具體地，本發(fā)明涉及一種源自于至少對抗稻瘟病(Magnaporthe grisea)具有抗菌活性的白黃側(cè)耳(Pleurotus comucopiae)的蛋白質(zhì)，編碼該蛋白質(zhì)的基因，及利用該蛋白質(zhì)和基因的方法。
本申請的要求基于2001年3月12日提交的日本專利申請2001-68894的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容并入以作參考。
背景技術(shù)：
諸如殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的溶菌酶被認(rèn)為是具有抗植物病原微生物的抗菌活性的植物蛋白。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明這些酶如果單獨(dú)使用可以發(fā)揮作用(Schlumbaum et al.(1986)，Nature 324，pp.365-367)，而如果使用兩種或更多種這樣的酶組合一般可以增強(qiáng)效果(Mauch et al.(1988)，PlantPhysiol.88，pp 936-942)。已知這些分解酶抗絲狀真菌的生長抑制濃度在單獨(dú)使用時(shí)一般地約為幾十到幾百μg/ml，或者在組合使用時(shí)分別約為幾μg/ml。然而這些分解酶中沒有一個被報(bào)道具有抗稻瘟病(Magnaporthe grisea)的抗菌效果，稻瘟病對水稻作物可造成嚴(yán)重?fù)p害。
低分子量的抗菌肽(AFP)例如防衛(wèi)素也具有抗微生物活性。其中，Ca-AMP1(Japanese Domestic Announcement No.505048/96)，CB-1(Oita et al.(1996)，Biosci.Biotech.Biochem.60，pp.481-483)，Rs-AFP1和Rs-AFP2(Terras et al.1992，J.Biol.Chem.267，pp.15301-15309)，和Ace-AMP1(Japanese Domestic Announcement No.501424/97)已經(jīng)被報(bào)道具有抗稻瘟病的抗菌效果。這些低分子量的肽抑制包括上面提到的濃度為幾μg/ml左右的各種植物病原微生物50％的生長。
通過分離分解酶或低分子量的抗菌肽基因并轉(zhuǎn)染植物以嘗試制備抗病植物(Broglie et al.(1991)，Science 254，pp.1194-1197；Terras et al.(1995)，ThePlant Cell 7，pp.573-588)。最近稻的研究表明通過過表達(dá)源于稻的殼多糖酶獲得的轉(zhuǎn)化體稻增加稻瘟病抗性(Nishizawa et al.(1999)Theor.Appl.Genet.99383-390)。
其它通過基因?qū)胫苽涞目共≡⑸锏闹参镆呀?jīng)被報(bào)道例如PR蛋白(Alexander et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90pp.7327-7331)，葡糖氧化酶(Wu et al.(1995)Plant Cell 7pP.1357-1368)，芪合成酶(stilbenesynthase)(Hain et al.(1993)Nature 361pp.153-156)，等。
然而，現(xiàn)有的許多實(shí)例并沒有獲得實(shí)際上具有實(shí)用性水平的抗性的轉(zhuǎn)基因植物。這是歸因于轉(zhuǎn)基因的低水平表達(dá)，更本質(zhì)上是目前報(bào)道的抗菌蛋白本身具有很低的抗菌活性。因此，希望能夠鑒定并在實(shí)踐上應(yīng)用比常規(guī)更有強(qiáng)大的抗菌的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是尋找并鑒定一種新的以較低濃度能抑制各種病原微生物，包括導(dǎo)致水稻作物嚴(yán)重?fù)p害的稻瘟病(Magnaporthe grisea)生長的抗菌蛋白質(zhì)。
本發(fā)明另一目的是克隆編碼所述新蛋白質(zhì)的基因，并測定它的核苷酸序列。
本發(fā)明另一目的是將本發(fā)明的基因?qū)胨拗魃矬w(微生物，動物，植物等)以制備轉(zhuǎn)化體，并由此實(shí)際應(yīng)用本發(fā)明的基因。
本發(fā)明另一目的是提供一種含有本發(fā)明抗菌蛋白的抗菌試劑。


圖1顯示通過本發(fā)明抗菌蛋白質(zhì)抑制M.grisea的生長的外觀(在80℃加熱10分鐘蛋白質(zhì)組分的存在下，培養(yǎng)48小時(shí))。
圖2顯示由Q-Sepharose FF柱分離的與抗菌活性有關(guān)的白黃側(cè)耳蛋白質(zhì)級分電泳圖。M代表分子量標(biāo)記，F(xiàn)T代表已經(jīng)通過柱的組分。泳道下面的符號(-，+，++)表示抗菌活性的強(qiáng)度。括號中顯示的抗菌活性是顯示與本發(fā)明所述的純化物不同的抗菌活性的級分。
圖3顯示的是與抗菌活性有關(guān)的由MonoQ柱分離白黃側(cè)耳抗菌蛋白質(zhì)表。顯示抗菌活性洗脫的位置用+表示。
圖4由Mono Q柱分離的與抗菌活性有關(guān)的白黃側(cè)耳蛋白質(zhì)電泳圖。泳道上的數(shù)字對應(yīng)于圖3中的級分號，M代表分子量標(biāo)記，Ori表示上樣于Mono Q上的Q-Sepharose級分。泳道下面的符號(-，+，++)表示抗菌活性的強(qiáng)度。箭頭表示抗菌蛋白質(zhì)(15kDa)。
圖5顯示與抗菌活性有關(guān)的由Superose 6的白黃側(cè)耳抗菌蛋白的純化表。箭頭表示Gel過濾標(biāo)準(zhǔn)的(BIO-RAD)的洗脫位置。顯示抗菌活性級分的位置用+表示。
圖6顯示與抗菌活性有關(guān)的Superose 6純化的白黃側(cè)耳蛋白的電泳圖。泳道上的數(shù)字對應(yīng)于圖5中的級分號，Ori表示上樣于Superose 6上的MonoQ級分。泳道下面的符號(-，+，++)表示抗菌活性的強(qiáng)度。箭頭表示抗菌蛋白質(zhì)(15kDa)。
圖7顯示tamavidin 1和tamavidin 2，鏈霉抗生物素蛋白和其同系物，和抗生物素蛋白的氨基酸序列(成熟蛋白質(zhì)區(qū))的分子分類樹。
圖8顯示通過添加生物素消除抗菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將懸浮于1/2 PD培養(yǎng)基的M.grisea孢子置于微量滴定板上。制備含有1000ng/ml純化的tamavidin 1，鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的孔，進(jìn)一步含有除了這些相同濃度的蛋白外又添加了100ng/ml的生物素，再進(jìn)一步制備不含蛋白的孔并在28℃溫育48小時(shí)。同時(shí)含有50ng/ml純化tamavidin 1的孔也顯示出來。
圖9顯示在亞氨基生物素柱上純化在大腸桿菌中表達(dá)的重組tamavidin2。C表示總的可溶的沒有IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌蛋白質(zhì)級分，T代表由1mMIPTG誘導(dǎo)的總的大腸桿菌可溶性蛋白質(zhì)級分，F(xiàn)代表在由1mM IPTG誘導(dǎo)的總的大腸桿菌可溶性蛋白質(zhì)級分中，沒有和亞氨基生物素柱結(jié)合已經(jīng)通過的蛋白質(zhì)級分，W代表通過相同柱經(jīng)過洗滌處理洗脫的級分，E代表用酸性緩沖液洗脫的級分。箭頭表示tamavidin 2蛋白質(zhì)(約15kDa)，M表示分子量標(biāo)記(LMW標(biāo)記試劑盒Pharmacia LKB)。
具體實(shí)施例方式
為了解決上述的問題，本發(fā)明人首先建立了體外評估抗稻瘟病的抗菌活性的鑒定系統(tǒng)。
然后，從食用蘑菇白黃側(cè)耳中提取蛋白質(zhì)級分，并通過組合的離子交換層析和凝膠過濾層析進(jìn)行抗菌試驗(yàn)以鑒定分離和純化抗菌蛋白級分。測定了所純化蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列，以此為模板合成寡DNA，然后通過RT-PCR獲得編碼該蛋白質(zhì)的部分長度的cDNA。隨后，使用該部分長度的cDNA為探針，篩選白黃側(cè)耳子實(shí)體的cDNA文庫以鑒定編碼該蛋白質(zhì)的全長cDNA，并測定其全部核苷酸序列。因此，鑒定白黃側(cè)耳抗菌蛋白的全部氨基酸序列和編碼它的基因的核苷酸序列，從而完成了本發(fā)明。
因此，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了抗菌蛋白，可使用自白黃側(cè)耳含水提取物通過硫酸銨沉淀法沉淀級分來獲得該蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)具有至少抗稻瘟病的抗菌活性，并通過SDS-PAGE方法顯示有分子量約為15kDa組分的存在。
通常，本發(fā)明抗菌蛋白具有所附序列表中SEQ ID NO2所示的143氨基酸序列。該蛋白質(zhì)包括由SDS-PAGE估測的分子量約為15kDa、由一個單元組成的多肽(對應(yīng)于由序列表中SEQ ID NO2所示8-143氨基酸組成的多肽)。該蛋白質(zhì)還被鑒定為具有通過凝膠過濾柱測定為約30kDa分子量特征的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的抗菌蛋白還包括具有序列表中SEQ ID NO4所示的141氨基酸的蛋白質(zhì)。具有序列表中SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)還包括由SDS-PAGE估測的分子量約為15kDa由一個單元組成的多肽和通過凝膠過濾柱測定分子量約為30kDa的多肽單元，類似于具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的抗菌蛋白包括不僅具有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列，還包括與該氨基酸序列相比包含一個或多個氨基酸修飾的氨基酸，或與該氨基酸序列有52％或更高同源性的氨基酸，并且顯示抗稻瘟病的抗菌活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的抗菌蛋白優(yōu)選的是與序列表中SEQ ID NO2或4的氨基酸序列具有52％或更高，更優(yōu)選為60％或更高，還優(yōu)選為70％或更高，還優(yōu)選為80％或更高，特別優(yōu)選為90％或更高，最優(yōu)選為95％或更高的同源性。
關(guān)于本發(fā)明抗菌蛋白的與每個特定的氨基酸序列“具有52％或更高同源性的蛋白質(zhì)”的定義是指其至少具有52％同源性，優(yōu)選具有60％或更高，更優(yōu)選為70％或更高，還更優(yōu)選為80％或更高，特別優(yōu)選為90％或更高，最優(yōu)選為95％或更高的同源性。
本發(fā)明第二方面提供一種抗菌蛋白，其包括或者是一種或者是序列表中SEQ ID NO2或4的部分氨基酸序列組成的多肽組合，例如由序列表中由SEQ ID NO2所示部分氨基酸序列8-143或由SEQ ID NO4所示部分氨基酸序列8-141組成的多肽；和具有的氨基酸序列在其中所述的氨基酸序列中包含一個或多個氨基酸改變的多肽，以及與所述的氨基酸序列有52％或更高同源性的氨基酸，并且顯示抗稻瘟病的抗菌活性的多肽。
本發(fā)明第三方面提供一種制備抗菌蛋白質(zhì)的方法，其包括回收通過硫酸銨沉淀法，用75％-飽和硫酸銨沉淀的自白黃側(cè)耳的含水提取物級分；和對所述級分進(jìn)行離子交換柱層析以回收用50mM-600mM的NaCl洗脫的級分。
本發(fā)明第四方面提供了編碼本發(fā)明抗菌蛋白的基因。
本發(fā)明的基因通常由序列表中SEQ ID NO1的堿基71-502的核苷酸序列，或SEQ ID NO3堿基226-651核苷酸序列(此后有時(shí)簡單地表示“SEQ IDNO1或3的核苷酸序列”)，或包含在所述堿基序列中取代，缺失，插入和/或添加一個或多個堿基的核苷酸序列，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述核苷酸序列雜交的核苷酸序列組成。
本發(fā)明的基因具有的堿基序列通常與SEQ ID NO1的堿基71-502的核苷酸序列或SEQ ID NO3堿基226-651的核苷酸序列具有60％或更高，更優(yōu)選為70％或更高，還更優(yōu)選為80％或更高，特別優(yōu)選為90％或更高，最優(yōu)選為95％或更高的同源性。
本發(fā)明第五方面提供了通過以下方法產(chǎn)生的寡核苷酸，所述寡核苷酸可用于得到編碼源自白黃側(cè)耳的抗菌蛋白，所述方法包括從SEQ ID NO1或3編碼抗菌蛋白之基因的堿基序列中選擇滿足以下需求的兩個區(qū)域1)每個區(qū)域長為15至30個堿基；和2)每個區(qū)域堿基序列中具有40至60％比例的G+C含量；制備單鏈DNA，該DNA具有與所述區(qū)域的堿基序列相同或互補(bǔ)的堿基序列，或者制備單鏈DNA混合物，基于遺傳密碼簡并性而不會改變所述單鏈DNA所編碼的氨基酸殘基的序列；
并任選制備修飾的單鏈DNA，所述修飾沒有改變與編碼所述抗菌蛋白之基因的堿基序列結(jié)合的特異性。
本發(fā)明的寡核苷酸優(yōu)選具有序列表中SEQ ID NO10至17任一個的核苷酸序列。
本發(fā)明第六方面提供了分離本發(fā)明基因的方法，其中所述方法包括使用白黃側(cè)耳子實(shí)體eDNA文庫為模板，一對上述兩種寡核苷酸為引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，籍此擴(kuò)增編碼本發(fā)明抗菌蛋白的基因的一部分，并使用如此獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為探針篩選cDNA文庫，從而分離全長cDNA克隆。
本發(fā)明第七方面提供了含有本發(fā)明基因的重組載體。
關(guān)于本發(fā)明的重組載體，優(yōu)選載體是表達(dá)載體。
本發(fā)明第八方面提供了通過將本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入宿主生物而得到的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明第九方面提供了抗菌劑，其含有本發(fā)明的抗菌蛋白作為活性成分。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案優(yōu)選的實(shí)施方案在下面詳細(xì)描述以解釋本發(fā)明。
源自白黃側(cè)耳的抗菌蛋白根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了源自白黃側(cè)耳的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)對植物病原微生物具有抗菌效果。本發(fā)明并不局限于該蛋白質(zhì)任何特定的來源，生產(chǎn)方法等，只要它具有本說明書中所述的特征即可。即本發(fā)明的抗菌蛋白可以是天然存在蛋白質(zhì)，利用基因工程技術(shù)由重組DNA表達(dá)的蛋白質(zhì)，或化學(xué)合成的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明抗菌蛋白通常具有所附序列表中SEQ ID NO2所示的1431氨基酸序列或序列表中SEQ ID NO4所示的1411氨基酸序列。然而，眾所周知天然蛋白質(zhì)常包括具有一個或多個氨基酸修飾的蛋白質(zhì)變體，所述氨基酸修飾是由以下因素引起的即產(chǎn)生蛋白質(zhì)的生物體品種差異，取決于生態(tài)型差異的基因突變或存在非常類似的同工酶所致的基因突變。本文所用術(shù)語“氨基酸修飾”指的是取代，缺失，插入和/或添加一個或多個氨基酸。本發(fā)明包括具有由克隆基因的核苷酸序列推定的，SEQ ID NO2或4所示的氨基酸序列的蛋白，但它并不局限于此。即本發(fā)明欲包括具有本文所定義特征所有同源蛋白質(zhì)。同源性至少為52％或更高，更優(yōu)選為60％或更高，還優(yōu)選為70％或更高，進(jìn)一步優(yōu)選為80％或更高，特別優(yōu)選為90％或更高，最優(yōu)選為95％或更高。
通常，當(dāng)引入具有類似特性的氨基酸殘基取代(所述取代如用一個疏水氨基酸取代另一個疏水氨基酸，用一個親水氨基酸取代另一個親水氨基酸，用一個酸性氨基酸取代另一個酸性氨基酸，或用一個堿性氨基酸取代另一個堿性氨基酸)時(shí)，所得到的修飾蛋白經(jīng)常與那些原來蛋白質(zhì)具有類似特性。通過使用基因工程技術(shù)制備具有所需突變的重組蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，因此，這些修飾蛋白質(zhì)也包含在本發(fā)明的范圍中。例如，可以應(yīng)用分子克隆2nd edition中描述的位點(diǎn)專一性誘變(Sambrook et al.，(1989))。
如本文中所用，同源性百分比可以通過例如使用Altschul et al.(Nucl.Acids.Res.25，pp.3389-3402，1997)描述的BLAST程序比較序列信息測定。例如該程序可以通過網(wǎng)絡(luò)上National Center for Biotechnology Information(NCBI)站點(diǎn)或日本DNA Data Bank(DDBJ)得到。用BLAST程序同源性撿索的各種條件(參數(shù))在該站點(diǎn)中詳細(xì)描述，盡管可以改變一些設(shè)置，通常用默認(rèn)值實(shí)施檢索?；蛘?，通過使用諸如GENETYX(Software Development Co.，Ltd.)或DNASIS(Hitachi Software Engineering)的遺傳序列信息分析軟件的序列信息比較而得以測定。
對于本發(fā)明源自白黃側(cè)耳的抗菌蛋白，其基因以及它們的同源性和具有由此編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，使用BLAST通過GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索。對于源自本發(fā)明第一白黃側(cè)耳抗菌蛋白的(SEQ ID NO2的全部氨基酸序列)進(jìn)行氨基酸序列數(shù)據(jù)庫搜尋顯示與Streptomyces violaceus的鏈霉抗生物素蛋白v2(保藏號Q53533，Bayer et al.(1995)Biochim BiophysActa 1263pp.60-66)，鏈霉抗生物素蛋白v1(保藏號Q53532)，阿維丁氏鏈霉菌(Streptmyces avidin ii)的鏈霉抗生物素蛋白(保藏號P22629，Argarana etal.(1986)Nucleic Acids Res 14pp.1871-1882)，等匹配。這三種序列的同源性擴(kuò)展到超過128氨基酸，并且分別為50％，49％和49％。與核心鏈霉抗生物素蛋白突變體w79f(Chain B)51.7％同源性的(Freitag et al.(1997)ProteinSci.6pp.1157-1166)也顯示超過了120個氨基酸。
卵清抗生物素蛋白(Gope et al.(1987)Nucleic Acids Res 15pp.3595-3606)和一些與抗生物素蛋白相關(guān)的蛋白(Keinanen et al.(1994)Eur JBiochem 220pp.615-621)也以較低同源性程度匹配。這些事實(shí)顯示該蛋白是新的蛋白。
對于本發(fā)明源自第二白黃側(cè)耳的抗菌蛋白(SEQ ID NO4的全部氨基酸序列)進(jìn)行氨基酸序列數(shù)據(jù)庫搜尋顯示與鏈霉抗生物素蛋白v2，v1，鏈霉抗生物素蛋白，分別有50％，48％和48％的同源性。
本發(fā)明的抗菌蛋白命名為＂tamavid＂是因?yàn)閺目墒秤玫哪⒐桨S側(cè)耳(Tamogitake)純化的新的鏈霉抗生物素類蛋白。本文中來自該純化蛋白的基因稱為tam1，具有由其編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)稱為tamavidin 1，tam1同系物稱為tam 2，具有由其編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)稱為tamavidin 2。
SEQ ID NOs2和4的氨基酸序列殘基1-7被認(rèn)為相當(dāng)于抗菌蛋白的前體的前導(dǎo)肽。因此，SEQ ID NO2氨基酸殘基的8-143和SEQ ID NO4的8-141為抗菌蛋白的成熟形式。因此，本發(fā)明還提供一種抗菌蛋白或者是任意多肽組合的抗菌蛋白，該多肽由SEQ ID NO2部分氨基酸序列，其是氨基酸8-143或SEQ ID NO4部分氨基酸序列其是氨基酸8-141組成的多肽；和具有包含在上述氨基酸序列中任一一個或多個的氨基酸修飾的多肽或具有與任一所述氨基酸序列同源性高于51％且顯示抗稻瘟病的抗菌活性的多肽。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的純化和分離可以通過用于純化和分離蛋白質(zhì)的常規(guī)方法例如硫酸銨沉淀，離子交換層析(Mono Q，Q Sepharose or DEAE)，凝膠過濾(Superose 6，Superose 12)適當(dāng)組合而得以完成。
例如，將白黃側(cè)耳磨碎用緩沖液提取，然后過濾，并如下面實(shí)施例所述在上清里添加合適濃度的硫酸銨，例如使之達(dá)到75％飽和通過靜置以沉淀。將沉淀透析，然后使用濃度梯度(例如50mM-600mM NaCl)的鹽通過離子交換層析洗脫，再根據(jù)抗菌活性指標(biāo)回收包含所需蛋白的級分。具有分子量約30kDa的級分可通過凝膠過濾回收，但并不限于此，本發(fā)明的抗菌蛋白通過SDS-PAGE測定的分子量約為15kDa。
或者，所述的蛋白質(zhì)可以通過已知的導(dǎo)入技術(shù)使用能在各宿主中擴(kuò)增并表達(dá)它的表達(dá)載體將DNA序列導(dǎo)入大腸桿菌，酵母或昆蟲或某種動物細(xì)胞，可獲得大量的本發(fā)明蛋白質(zhì)，所述DNA序列或者是由SEQ ID NO1的71(或92)至502的DNA序列，或者是SEQ ID NO3的226(或247)至651的DNA序列。
本文所公開的該蛋白質(zhì)的氨基酸序列和編碼它的DNA序列可以使用包括雜交和PCR基因工程的基本方法而全部或部分地容易地用于分離基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)與其它種類具有相似的生理活性，優(yōu)選的是真菌，更優(yōu)選包括蘑菇，霉菌(molds)和酵母的真菌門(Eumycota)，和包括許多蘑菇的擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)，更優(yōu)選白黃側(cè)耳所屬的蘑菇目(Agaricales)蘑菇例如糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)，香菇(Lentinus edodes)，假蜜環(huán)菌(Armillariella mellea)，松口蘑(Tricholoma matsutake)，shimeji mushrooms，F(xiàn)lammulina velutipes，Grifola frondosa，雞油菌(Cantharellus cibarius)，Pleurotus eryngii。在這種情況下，這些新的蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
抗菌蛋白的基因本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的抗菌蛋白的基因?；蝾愋筒皇芟拗?。即它可以是任何天然來源的DNA，重組DNA，化學(xué)合成的DNA和任何基因組DNA或cDNA克隆。
本發(fā)明的基因通常具有序列表中SEQ ID NO1或3的核苷酸序列。然而，下面顯示的實(shí)施例中得到的克隆的核苷酸序列僅是一實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知天然基因伴隨有少量變體，所述變體是由產(chǎn)生該基因的生物種的品種差異，或生態(tài)型差異引起的小突變，或者是由非常相似的同工酶的存在引起的小突變。因此，本發(fā)明的基因并不局限于具有序列表中SEQ ID NO1或3的堿基序列的基因，可包括編碼本發(fā)明的抗菌蛋白的任何基因。
特別是，本發(fā)明公開了該蛋白質(zhì)的氨基酸序列和編碼它的DNA序列，結(jié)果，通過使用基因工程技術(shù)(包括雜交，核酸擴(kuò)增)，利用這些序列或其部分，可以容易地從其它物種中分離出編碼具有類似生理學(xué)活性的蛋白質(zhì)的基因。在這種情況下，所得的基因也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
通過GenBank數(shù)據(jù)庫使用編碼源自于白黃側(cè)耳抗菌蛋白的基因的DNA序列(SEQ ID NO1的DNA序列71-502)和編碼源自于第二白黃側(cè)耳抗菌蛋白的基因的DNA序列(SEQ ID NO3的DNA序列226-651)進(jìn)行BLAST搜尋，發(fā)現(xiàn)在很短的范圍內(nèi)(23bp)僅有一些序列顯示同源性但不是鏈霉抗生物素蛋白的DNA序列。這表明編碼本發(fā)明該新蛋白的DNA序列與鏈霉抗生物素蛋白在DNA水平上沒有高度同源性。
更具體的是，遺傳序列分析軟件程序GENETYX-WIN ver 3.2(SoftwareDevelopment Co.，Ltd.)用于分析本發(fā)明白黃側(cè)耳抗菌蛋白的全部氨基酸序列(tamavidins 1和2)與鏈霉抗生物素蛋白(分別與鏈霉抗生物素蛋白v2和v1僅有9氨基酸和1個氨基酸不同)的同源性。結(jié)果由本發(fā)明tam1編碼的tamavidin 1的氨基酸序列顯示同源性(氨基酸同一性)為46.7％，并且由tam2編碼的tamavidin 2的氨基酸序列顯示為48.1％。全部DNA序列(序列表中SEQ ID NOs1和3)與鏈霉抗生物素蛋白的同源性對于tam1為53.8％及對于tam2為51.0％。tam1編碼的白黃側(cè)耳抗菌蛋白與卵清抗生物素蛋白的在氨基酸序列中同源性為31.2％，在DNA序列中為42.4％，tam2編碼的白黃側(cè)耳抗菌蛋白與卵清抗生物素蛋白的在氨基酸序列中同源性為36.2％，在DNA序列中為41.8％。tamavidin 1和tamavidin 2間氨基酸序列的同一性，和編碼它們的基因tam1與tam 2 DNA序列的同源性分別為65.5％和64.5％。
與鏈霉抗生物素蛋白相比，本發(fā)明的tamavidin 1和tamavidin 2其N末端的33個氨基酸截短，但可能涉及與生物素結(jié)合的所有的色氨酸(W)殘基(Gitlin et al.(1988)Biochem.J 256pp.279-282)和酪氨酸(Y)殘基(Gitlin et al.(1990)Biochem.J 269pp.527-530)都是保守的，(在SEQ ID NO2氨基酸序列的Y 34和45和W 82，98和110，在SEQ ID NO4氨基酸序列中的Y 34和45和W 80，96和108)。
推定為成熟蛋白區(qū)域的該區(qū)域平均分子量(SEQ ID NO2的氨基酸序列8-143，SEQ ID NO4的氨基酸序列8-141)分別為15158.4和14732.2，接近于鏈霉抗生物素蛋白和成熟抗生物素蛋白的平均分子量(分別為16490.6和14342.9)。
鏈霉抗生物素蛋白源自于放線菌(Actinomyces)阿維丁氏鏈霉菌，抗生物素蛋白源自于鳥(Gallus gallus)卵清。目前分離的與鏈霉抗生物素蛋白非常類似的蛋白包括自紫色鏈霉菌(Streptomyces violaceus)的鏈霉抗生物素蛋白v1和v2(Bayer et al.(1995)Biochim Biophys Acta 1263pp.60-66)，又分離了抗生物素蛋白基因同系物包括自鳥類的抗生物素蛋白-相關(guān)的基因(avr1-avr5，Keinanen et al.(1994)Eur J Biochem 220pp.615-621)。鏈霉抗生物素蛋白v1和v2與鏈霉抗生物素蛋白在氨基酸序列上分別有1個氨基酸和9個氨基酸不同，并且抗生物素蛋白-相關(guān)的蛋白與抗生物素蛋白在氨基酸序列上有68-78％的同源性，在DNA序列上有88-92％同源性。鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白在氨基酸序列上的同源性為29.2％在DNA序列上的同源性為46.8％。
本發(fā)明抗菌蛋白優(yōu)選的實(shí)例，tamavidins 1和2源于擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)的白黃側(cè)耳種，并如上所述分別與鏈霉抗生物素蛋白在氨基酸序列上具有46.7％和48.1％的同源性，分別與抗生物素蛋白在氨基酸序列上具有31.2％和36.2％的同源性。因此，tamavidins 1，2形成不同于放線菌的鏈霉抗生物素蛋白組和鳥類的抗生物素蛋白組，其為第三組。除了放線菌和鳥類，該抗生物素樣蛋白首次被分離。Tamavidins 1，2是存在于蘑菇中的抗生物樣蛋白，并且其它的種類的蘑菇可能包含類似的蛋白。tamavidins1，2的氨基酸序列和tam1，tam2的DNA序列可進(jìn)一步用于搜尋和分離該蛋白質(zhì)和其基因。
用于篩選同源基因雜交條件并不具體限制。通常，優(yōu)選利用如分子生物學(xué)Vol.1Current Protocols(John Wiley and sons，Inc.)或(Sambrook等(1989))分子克隆，2ndedition中所述的嚴(yán)謹(jǐn)條件例如在5×SSC，5×Denhardt’s，1％SDS，25℃至68℃幾小時(shí)到過夜。優(yōu)選雜交溫度范圍為45℃至68℃(無甲酰胺)或30℃至42℃(50％甲酰胺)。洗滌條件涉及如在45℃至68℃，0.2×SSC。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知可以通過適當(dāng)?shù)剡x擇雜交條件例如甲酰胺濃度，鹽濃度，溫度等克隆所含核苷酸序列具有同源性高于預(yù)先確定水平的DNA。如此克隆的同源基因都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
核酸擴(kuò)增反應(yīng)的例子包括利用溫度循環(huán)進(jìn)行的反應(yīng)，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(Saiki等，1985，科學(xué)230，pp1350-1354)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(Woh等，1989，基因組學(xué)4，pp560-569；Barringer等，1990，基因89，pp117-122和Barany等，1991，美國國家科學(xué)院院刊88，pp189-193)和基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(Kwoh等，1989，美國國家科學(xué)院院刊86，pp1173-1177)和等溫反應(yīng)，如鏈置換擴(kuò)增(SDA)(Walker等，1992，美國國家科學(xué)院院刊89，pp392-396；和Walker等，1992，核酸研究，20，pp1691-1696)，自我-維持的序列復(fù)制(3SR)(Guatelli等，1990，美國國家科學(xué)院院刊87，pp1874-1878)和Qβ復(fù)制酶系統(tǒng)(Lizardi等，1988，生物技術(shù)6，pp1197-1202)。另外，還可以利用歐洲專利0525882等所公開的在競爭性擴(kuò)增靶核酸和突變序列使用基于核酸序列的擴(kuò)增(NASABA)反應(yīng)。優(yōu)選使用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增。
通過使用上述雜交或可以使用核酸擴(kuò)增反應(yīng)克隆的同源基因與序列表中SEQ ID NO1的堿基序列具有優(yōu)選為60％或更高，更優(yōu)選為70％或更高，還優(yōu)選為80％或更高，特別優(yōu)選為90％或更高，最優(yōu)選為95％或更高的同源性。
寡核苷酸根據(jù)本發(fā)明，還提供用于得到源于白黃側(cè)耳的抗菌蛋白的寡核苷酸，其通過包括下述的方法得到從SEQ ID NO1或3的編碼抗菌蛋白之基因的堿基序列中選擇滿足以下需求的兩個區(qū)域1)每個區(qū)域長15至30個堿基；和2)每個區(qū)域堿基序列中具有40至60％比例G+C含量；制備單鏈DNA，該DNA具有與所述區(qū)域的堿基序列相同或互補(bǔ)的堿基序列，或者制備單鏈DNA混合物，基于遺傳密碼簡并性而不會改變所述單鏈DNA所編碼的氨基酸殘基的序列；和根據(jù)需要，任選制備修飾的所述單鏈DNA，所述修飾沒有改變該單鏈DNA與編碼所述抗菌蛋白之基因的堿基序列結(jié)合的特異性。本發(fā)明的寡核苷酸可用于，例如雜交或擴(kuò)增反應(yīng)所述雜交用于檢測本發(fā)明的基因或分離基因，所述擴(kuò)增反應(yīng)如PCR利用合適的所述寡核苷酸的兩種作為引物對。
本發(fā)明的寡核苷酸優(yōu)選具有序列表中SEQ ID NO10至19任一個的核苷酸序列。根據(jù)SEQ ID NO9的氨基酸序列作為PCR引物設(shè)計(jì)SEQ ID NOs10-13核苷酸序列用以克隆編碼部分蛋白質(zhì)的基因片段，包括所有能編碼該氨基酸的堿基引物。SEQ ID NO14-17的核苷酸是合成用于解碼tam1和tam2基因的全部核苷酸序列的引物步行(walking)引物。SEQ ID NO18-19的核苷酸是PCR引物，其是根據(jù)SEQ ID NO3制備的用于擴(kuò)增全部ORF以構(gòu)建表達(dá)具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的重組tamavidin 2蛋白的表達(dá)載體。
通過使用白黃側(cè)耳子實(shí)體cDNA文庫為模板，和上述合適的寡核苷酸對進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)諸如PCR來擴(kuò)增和分離本發(fā)明基因的部分片段。使用所得擴(kuò)增產(chǎn)物為探針，通過例如噬斑雜交進(jìn)一步篩選cDNA文庫，即可分離全長cDNA克隆。核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法和條件，噬斑雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
例如，可以使用相當(dāng)?shù)蛧?yán)謹(jǐn)度的雜交條件，諸如，雜交條件并不限于以下條件，諸如在Molecular Biology Vol.1(John Wiley and Sons，Inc.)或Molecular Cloning(Sambrook et al.，supra.)Current Protocols中所描述的那樣溫度條件根據(jù)情況可為室溫，洗滌條件，在較高鹽濃度下洗滌，例如2 x SSC溫度可為37℃左右。
重組抗菌蛋白的制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的抗菌活性。例如，其可在50ng/ml低濃度下完全抑制稻瘟病(M.grisea)孢子的萌發(fā)(見下面實(shí)施例4)。在該濃度下甚至延長培養(yǎng)后孢子沒有萌發(fā)，表明本發(fā)明蛋白質(zhì)抗稻瘟病的效果可能是殺真菌的效果而不是部分抑制生長。就我們所知而言，目前還沒有報(bào)道有在這種低濃度(納克)下可完全抑制病原微生物的生長。在下面的實(shí)施例中，一種主要的稻病原體，稻瘟病用作抗菌試驗(yàn)的植物病原體以純化抗菌蛋白。非?？赡艿氖潜疚蔫b定的白黃側(cè)耳抗菌蛋白對除此以外的抗其它植物病原體諸如植物病原體茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)具有極大可能的抗菌效果。
因此，本發(fā)明源于白黃側(cè)耳的抗菌蛋白具有很強(qiáng)的抗菌活性，使得其可以用于諸如包含活性形式抗菌蛋白的抗菌劑和農(nóng)藥的配置中。在這種情況下，自白黃側(cè)耳通過使用例如下面描述的離子交換柱，或凝膠過濾柱純化該蛋白。然而，本發(fā)明的白黃側(cè)耳抗菌蛋白可以更方便地大量制備，其是使用能在各宿主中擴(kuò)增的表達(dá)載體通過導(dǎo)入并于大腸桿菌，酵母，昆蟲或動物細(xì)胞中表達(dá)編碼該蛋白質(zhì)的具有SEQ ID NO1的71-502或SEQ IDNO3的226-651核苷酸序列DNA(實(shí)施例5)。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明基因的重組載體。根據(jù)例如Sambrook，J等(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(第2版)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1.53(1989))所報(bào)道的方法，將本發(fā)明基因的DNA片段插入至諸如質(zhì)粒等載體中。更加方便的方法是使用商購連接試劑盒(例如寶酒造有限公司的產(chǎn)品)。將所得重組載體(例如重組質(zhì)粒)導(dǎo)入宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌TB1，LE392或XL-1Blue)。
據(jù)Sambrook，J等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(第2版)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1.74(1989)的所述，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的合適方法包括例如磷酸鈣法，氯化鈣/氯化銣法，電穿孔法，電注射法，用PEG等進(jìn)行化學(xué)處理，和使用基因槍的方法。
通過常規(guī)方法將所需基因連接至本領(lǐng)域可得到的重組載體(例如質(zhì)粒DNA)中，可以方便地制備載體。本文可以使用的合適載體的具體例子包括源自大腸桿菌的質(zhì)粒，如pBluescript，pUC18，pUC19和pBR322，Ptrc99A但本發(fā)明并不局限于此。
表達(dá)載體對產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)特別有用。對表達(dá)載體的類型沒有特別的限制，只要它具有以下功能即可，即能在原核和/或真核多種宿主細(xì)胞中表達(dá)所需基因，從而產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)。優(yōu)選載體的例子包括大腸桿菌表達(dá)載體，如pQE-30，pQE-60，pMAL-C2，pMAL-p2，pSE420等。關(guān)于酵母中的表達(dá)載體，優(yōu)選pYES2(糖酵母屬(Saccharomyces))和pPIC3.5K，pPIC9K和pAO815(畢赤氏酵母屬(Pichia))。用于昆蟲中的表達(dá)載體，諸如pBacPAK8/9，pBK283，pVL1392，pBlueBac4.5。
通過將所需表達(dá)載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞可制備轉(zhuǎn)化體。對所用合適的宿主細(xì)胞沒有特別的限制，只要它能與本發(fā)明的表達(dá)載體相容因而能被轉(zhuǎn)化即可，包括可以利用本領(lǐng)域常用的多種細(xì)胞，包括天然細(xì)胞和人工建立的重組細(xì)胞。其例子包括(屬于埃希氏菌屬(Escherichia)和芽胞桿菌屬(Bacillus))細(xì)菌，酵母(糖酵母屬，畢赤氏酵母屬)，動物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和植物細(xì)胞等。
至于宿主細(xì)胞，優(yōu)選使用大腸桿菌，酵母、植物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞，具體地是，大腸桿菌菌株諸如M15，JM109，BL21；酵母諸如INVSc1(糖酵母屬)，GS115和KM71(全為畢赤氏酵母)等)和昆蟲細(xì)胞諸如BmN4，蠶幼蟲。動物細(xì)胞的例子包括源自小鼠，非洲爪蟾，大鼠，倉鼠，猴，人的細(xì)胞，和由上述細(xì)胞建立的培養(yǎng)細(xì)胞系。對植物細(xì)胞沒有特別的限制，只要它能被培養(yǎng)即可，所述植物細(xì)胞包括源自例如煙草，擬南芥，水稻，玉米和小麥等的細(xì)胞。
當(dāng)使用細(xì)菌，特別是大腸桿菌作為宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體一般至少由啟動子/操縱子域，起始密碼子，編碼所需抗菌蛋白的基因，終止密碼子，終止子以及可復(fù)制單位組成。
當(dāng)使用酵母，植物細(xì)胞，動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體優(yōu)選包括至少啟動子，起始密碼子，編碼所需抗菌蛋白的基因，終止密碼子，終止子。如果需要其還可包含編碼信號肽的DNA，增強(qiáng)子序列，所需基因5’和3’側(cè)的非-翻譯區(qū)，選擇標(biāo)記區(qū)，可復(fù)制單位等。
本發(fā)明載體中優(yōu)選的起始密碼子是甲硫氨酸密碼子(ATG)。終止密碼子的例子可以是常用的終止密碼子，例如TAG，TGA和TAA。
“可復(fù)制單位”指的是能在宿主細(xì)胞中復(fù)制其完整DNA序列的DNA。其包括天然質(zhì)粒，人工修飾的質(zhì)粒(即由天然質(zhì)粒制備的質(zhì)粒)和合成質(zhì)粒等。質(zhì)粒的優(yōu)選的是pQE30，pET或pCAL或其人工修飾(如用合適的限制性內(nèi)切核酸酶處理pQE30，pET或pCAL得到的DNA片段)(對大腸桿菌而言)；質(zhì)粒pYES2或pPIC9K(對酵母而言)；和質(zhì)粒pBacPAK8/9等(對昆蟲細(xì)胞而言)。
關(guān)于增強(qiáng)子序列和終止序列，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的那些，例如源自SV40的序列。
關(guān)于選擇標(biāo)記，可以利用本領(lǐng)域通過常規(guī)方法常用的選擇標(biāo)記。其例子包括抗生素抗性基因，所述抗生素諸如四環(huán)素，氨芐青霉素，卡那霉素，新霉素，潮霉素，壯觀霉素。
通過將至少上述啟動子，起始密碼子，編碼所需抗菌蛋白的基因，終止密碼子和終止子域順序地和環(huán)形地連接至適當(dāng)?shù)目蓮?fù)制單位即可制備表達(dá)載體。在此方法中，必要時(shí)也可以通過常規(guī)方法，如用限制性酶消化或使用T4DNA連接酶連接，來使用適當(dāng)?shù)腄NA片段(例如接頭或其它限制性酶位點(diǎn)等)。
可使用公知方法將本發(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入(即轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)導(dǎo)))至宿主細(xì)胞。
例如對細(xì)菌(諸如大腸桿菌，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis))而言的Cohen等(美國國家科學(xué)院院刊，69，2110(1972))報(bào)道的方法，原生質(zhì)體法(Mol.Gen.Genet.，168，111(1979))或感受態(tài)法(分子生物學(xué)雜志，56，209(1971))；對釀酒酵母而言的Hinnens等(美國國家科學(xué)院院刊，75，1927(1978))報(bào)道的方法和鋰法(細(xì)菌學(xué)雜志，153，163(1988))；對植物細(xì)胞而言的葉片法(leaf disc)(科學(xué)，227，129(1985))和電穿孔法(自然，319，791(1986))；對動物細(xì)胞而言的Graham(病毒學(xué)，52，456(1973))報(bào)道的方法；和對昆蟲細(xì)胞而言的Summers等(分子細(xì)胞生物學(xué)，3，pp2156-2165(1983))報(bào)道的方法。
通過使用本發(fā)明的DNA片段，植物轉(zhuǎn)化的載體可特別用于構(gòu)建抗病植物。對植物載體類型沒有特別的限制，只要它能在植物細(xì)胞中表達(dá)目的基因并因而產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)即可。所述載體的優(yōu)選的是pBI221和pBI121(Clontech)和由它們衍生的載體。尤其是轉(zhuǎn)化單子葉植物實(shí)例，可使用例如pIG121Hm和pTOK233(Hiei等，植物雜志，6，pp271-282(1994))，pSB424(Komari等，植物雜志，10，pp165-174(1996))。
通過用本發(fā)明的DNA片段取代上述載體中的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因以制備轉(zhuǎn)化植物所用的載體，然后將該載體導(dǎo)入植物，即可制備轉(zhuǎn)基因植物。植物轉(zhuǎn)化載體優(yōu)選的是至少含有啟動子，起始密碼子，目的基因(本發(fā)明的DNA序列或其部分)，終止密碼子和終止子。另外，所述載體如果需要還含有編碼信號肽的DNA，增強(qiáng)子序列，所需基因5’和3’非-翻譯域，選擇標(biāo)記域等。
對啟動子和終止子沒有特別的限制，只要它能在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用即可。組成型表達(dá)啟動子的例子包括已被插入至上述載體中的35S啟動子，以及肌動蛋白和遍在蛋白基因啟動子。然而，更優(yōu)選插入誘導(dǎo)型啟動子。其可允許僅在轉(zhuǎn)基因植物與害蟲接觸之后才能產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)，因此植物獲得了抗性。合適的誘導(dǎo)型啟動子包括苯丙氨酸氨裂合酶(phenylalanine ammonia-lyase)，殼多糖酶，葡聚糖酶，硫堇和消炎痛控釋劑(osmosin)基因的啟動子，和其它可應(yīng)答害蟲或脅迫的基因的啟動子。
通過使用下列方法將基因轉(zhuǎn)移至植物，所述方法包括農(nóng)桿菌法(Horsch等，科學(xué)，227，129(1985)；Hiei等，植物雜志，6，pp271-282(1994))，電穿孔法(Fromm等，自然，319，791(1986))，PEG法(Paszkowski等，EMBO J.，3，2717(1984))，顯微注射法(Crossway等，Mol.Gen.Genet.，202，179(1986))，粒子轟擊法(McCabe等，Bio/Technology，6，923(1988))等，但不具體的限制地使用任何方法，只要它適合將基因轉(zhuǎn)染至所需植物即可。類似地，宿主植物并不局限于特定的物種，只要它能與本發(fā)明轉(zhuǎn)化植物的載體相容，并能被其轉(zhuǎn)化即可。具體地可利用本領(lǐng)域常用的植物，例如雙子葉植物(例如煙草，擬南芥，番茄，黃瓜，胡蘿卜，大豆，馬鈴薯，甜菜，蕪菁(turnip)，白菜(Chinese cabbage)，油菜，棉花，矮牽牛花等)和單子葉植物(例如水稻，玉米，小麥等)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過在營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)包含如上所述制備的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞而得以表達(dá)(制備)。營養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選包含宿主細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)生長必需的碳源，無機(jī)氮源或有機(jī)氮源。碳源的例子包括葡萄糖，葡聚糖，可溶性淀粉，蔗糖，甲醇。無機(jī)氮源或有機(jī)氮源的例子包括銨鹽，硝酸鹽，氨基酸，玉米漿，蛋白胨，酪蛋白，肉精(beef extract)，豆餅(soybean meal)，馬鈴薯提取物等。必要時(shí)，還可進(jìn)一步含有其它營養(yǎng)成分(例如無機(jī)鹽(氯化鈉，氯化鈣，磷酸二氫鈉，氯化鎂等)，維生素和抗生素諸如四環(huán)素，新霉素，氨芐青霉素，卡那霉素)。
通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)?？蛇m當(dāng)選擇培養(yǎng)條件(例如溫度，培養(yǎng)基的pH，培養(yǎng)時(shí)間)以大量產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)。對于在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，表達(dá)重組蛋白質(zhì)的培養(yǎng)條件包括但并不局限于此，在4℃至40℃下進(jìn)行保溫，通過0.01mM至5.0mM IPTG誘導(dǎo)。
可按下列方法從上述培養(yǎng)物中回收本發(fā)明的蛋白質(zhì)。當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中積累時(shí)，通過例如離心或過濾等收集宿主細(xì)胞，然后懸浮于適當(dāng)緩沖液(例如濃度約為10M至100mM的如Tris緩沖液，磷酸緩沖液，HEPES緩沖液或MES緩沖液，其pH值范圍隨緩沖液的不同而變化，但希望pH范圍為5.0至9.0)。然后，通過適于所用宿主細(xì)胞的方法破碎細(xì)胞，離心得到宿主細(xì)胞的內(nèi)容物。當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞中被分泌出來時(shí)，通過例如離心或過濾等從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞和培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞的裂解物或或培養(yǎng)物濾過物可直接或用硫酸銨沉淀和透析后用于分離/純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
使用下列方法進(jìn)行分離/純化。當(dāng)用6×組氨酸，GST，麥芽糖-結(jié)合蛋白質(zhì)等標(biāo)記所述蛋白質(zhì)時(shí)，可使用基于適于每個所用標(biāo)記物的親和層析法。在下文所述的實(shí)施例4中，表達(dá)了N-末端被6×組氨酸標(biāo)記的重組抗菌蛋白，但本發(fā)明并不局限于此。通過使用Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)純化該重組蛋白質(zhì)，所述瓊脂糖對6×組氨酸具有親和性。當(dāng)產(chǎn)生不具有任何上述標(biāo)記的本發(fā)明的蛋白質(zhì)時(shí)，可以使用下文實(shí)施例所詳述的基于離子交換層析法的方法。也可以將這些方法與凝膠過濾，疏水層析，等電層析等聯(lián)合。也可使用如Hofmann等所述在亞氨基生物素親和柱上的純化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77pp.4666-4668(1980))。下面實(shí)施例5中，重組tamavidin 2蛋白從50ml大腸桿菌獲得1mg的產(chǎn)量。
如上所述由遺傳工程技術(shù)或自天然來源獲得的純化抗菌蛋白具有抗菌活性?？咕钚钥梢酝ㄟ^，但并不限于，在存在預(yù)先確定濃度例如10ng/ml-1000ng/ml，優(yōu)選50ng/ml的本發(fā)明的抗菌蛋白下，在微量滴定板28℃培養(yǎng)懸浮于培養(yǎng)基(例如1/2 PD，蔗糖-蛋白胨)中的孢子48小時(shí)得以測定，并與不含抗菌蛋白的對照(實(shí)施例4)相比，評估是否稻瘟病的生長/增殖(例如菌絲的延伸)受到抑制。
或者，可以進(jìn)行下面的試驗(yàn)，將稻瘟病的集落置于培養(yǎng)皿中瓊脂培養(yǎng)基中心，并且將預(yù)先確定量的本發(fā)明抗菌蛋白水溶液滴在集落周圍，將培養(yǎng)皿在28℃培養(yǎng)約48小時(shí)至一周。然后，通過與未處理區(qū)相比較評估在抗菌蛋白處理過的區(qū)域菌絲的延伸是否被抑制從而來鑒定抗菌活性。
抗菌劑本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的抗菌活性。例如，在我們的試驗(yàn)中其可以在低濃度諸如50ng/ml抑制稻瘟病菌菌的生長。在下面的實(shí)施例中，使用了作為水稻最重要的病蟲害菌即稻瘟病菌和被用作抗菌試驗(yàn)的植物病原體。本文鑒定的白黃側(cè)耳抗菌蛋白顯示抗它們的抗菌效果。本發(fā)明的蛋白質(zhì)除了對M.grisea以外，也對其它的植物病原體微生物最有可能具有抗菌效果。
因此，本發(fā)明源于白黃側(cè)耳抗菌蛋白具有很強(qiáng)的抗菌活性，使得其可以用于諸如包含活性形式抗菌蛋白的抗菌劑和農(nóng)藥的配置中。在這種情況下，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA序列插入在例如如上所述的大腸桿菌或酵母有功能的表達(dá)載體中從而大量制備蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的抗菌蛋白是新的鏈霉抗生物素樣蛋白，表明其可以結(jié)合一種維生素即生物素(vitamin H)。已知稻瘟病菌的生長需要生物素。這些事實(shí)表明本發(fā)明抗菌蛋白與試驗(yàn)培養(yǎng)基中游離的生物素結(jié)合以在培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生物素缺陷，結(jié)果抑制了稻瘟病菌的生長。事實(shí)上，如下面實(shí)施例4所述在生物素過量加入到試驗(yàn)培養(yǎng)基時(shí)，消除了本發(fā)明tamavidin 1的抗菌活性。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)商購獲得的鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白也具有類似于tamavidin 1抗稻瘟病的抗菌效果，并證實(shí)該效果也被生物素所消除。
本發(fā)明表明抗病蟲害尤其是抗稻瘟病的可能性通過控制一種維生素，生物素的量而可以賦予植物。通過控制維生素賦予抗病的可能性到目前還是未知。這是全新的觀念。該觀念也包括在本發(fā)明中。例如包含本發(fā)明抗菌蛋白作為活性成分的制品可以用作農(nóng)藥。在這種情況中，除了本發(fā)明抗菌蛋白，生物素結(jié)合蛋白(例如阿維丁氏鏈霉菌的鏈霉抗生物素蛋白和卵清抗生物素蛋白，和其同系物)也包括在本發(fā)明的觀念之中。
因此，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明抗菌蛋白作為活性成分的抗菌試劑。通常，本發(fā)明抗菌試劑可全部地或局部地噴灑于植物。
抗菌試劑的噴灑劑量取決于植物的類型，生長時(shí)間，癥狀，噴灑的方法，處理的時(shí)間，所使用的蛋白質(zhì)的類型(例如全長的蛋白質(zhì)或通過先前蛋白的取代，缺失，插入和/或添加而得到的部分蛋白)，植物生長環(huán)境的氣候和土壤情況以及其它因素而不同，抗菌劑可以一天一次，每天幾次或者是間隔幾天散布。噴灑量因各種條件而變化。如果需要，本發(fā)明的抗菌劑還可與增溶劑，懸浮劑，乳化劑等混合散布。將水的或非水的增容劑、懸浮劑混合成有一種或多種活性物質(zhì)至少有一種惰性稀釋液。包括水的稀釋液的例子包括蒸餾水和鹽水。非水的稀釋液的例子包括丙烯乙二醇，聚乙烯乙二醇，和諸如橄欖油的植物油以及諸如乙醇的醇。
這種抗菌組合物可以進(jìn)一步包含諸如防腐劑，濕潤劑，乳化劑，分散劑或穩(wěn)定劑(例如精氨酸，天冬氨酸等)的輔助劑。
如果需要，這些組合物通過不讓細(xì)菌通過的過濾器過濾或添加殺菌劑或放射而滅菌。它們還可通過例如干凍制備為滅菌的固體組合物，然后在使用前溶解于無菌的蒸餾水中或其它溶劑中。
由此獲得的抗菌劑的劑量形式可以合適地根據(jù)所需目的來確定，即其可以以在有下述添加劑，片劑，丸劑，粉末，顆粒，溶液，乳狀液等的混合液中使用。
通過將本發(fā)明編碼抗菌蛋白基因插入植物來制備抗病植物。因此，抗病植物可通過例如用構(gòu)建體導(dǎo)入植物而得以制備，所述構(gòu)建體其中在植物中有功能的啟動子與編碼本發(fā)明抗菌蛋白的基因相連并且在植物中有功能的終止子進(jìn)一步被添加到下游。在這種情況中，用于在植物中有胞外分泌功能編碼信號肽的DNA序列被添加到本發(fā)明基因的5’側(cè)以啟動植物細(xì)胞外tamavidin的分泌?；蛘?，該基因密碼子的用途可適合于單子葉或雙子葉植物而不改變氨基酸以促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)外抗菌蛋白的蓄積。使用這些手段的組合制備抗病植物的方法也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
tamavidin，抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白或它們非常類似的蛋白用于制備抗病植物以及除了水稻以外的植物也包括在本發(fā)明中。盡管本文分析的病原體真菌是稻瘟病，其它需要生物素用于生長的植物病原體真菌和病原體細(xì)菌非?？赡艿匾苍诒景l(fā)明的范圍之內(nèi)。
此外，一般認(rèn)為不僅抗植物病原體微生物而且本質(zhì)上需要生物素用于生長的動物病原體的效果，尤其是針對人和家畜的病原體微生物，因此本發(fā)明包括本發(fā)明抗菌蛋白，抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白和它們非常類似的蛋白在該種情形中用作治療試劑。
鏈霉抗生物素蛋白DNA序列已經(jīng)被公開(Garwin et al.，WO/8602077)，但在普通數(shù)據(jù)庫搜尋期間，如前所述，本發(fā)明tam1和tam2與鏈霉抗生物素蛋白的DNA不匹配，并且在使用如上所述核酸序列/氨基酸序列分析軟件程序既使硬性比較實(shí)際上顯示與鏈霉抗生物素蛋白DNA同源性僅為51.0-53.8％。
鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白在分子生物學(xué)，生物化學(xué)等情況中已被廣泛地用作實(shí)驗(yàn)試劑，是由于它們與生物素及其衍生物有強(qiáng)的結(jié)合能力。例如根據(jù)表達(dá)為融合蛋白的鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的生物素結(jié)合親和力它們可以用于核酸和蛋白質(zhì)的檢測系統(tǒng)中(Liang.WO/9707244)或純化方法中(Skerra et al.EP835934，Kopetzki.WO/9711186)。當(dāng)前廣泛公知或報(bào)道的是本發(fā)明Tamavidin1和tamavidin 2在這些應(yīng)用中使用。
目前報(bào)道的鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白與植物相關(guān)的應(yīng)用包括使用抗生物素蛋白制備雄性不育植物(Howard and Albertsen.WO/9640949)，鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白用作殺蟲蛋白(Czapla et al.WO/9400992)，和在植物中制備抗生物素蛋白(Baszczynski et al.US Pat.No.5767379)。這些文獻(xiàn)中描述的鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白還可應(yīng)用于本發(fā)明源于白黃側(cè)耳抗菌蛋白。
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下面的實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，而本發(fā)明并不限于此。
實(shí)施例實(shí)施例1構(gòu)建檢測系統(tǒng)1)建立鑒定系統(tǒng)培養(yǎng)病原菌在燕麥粉培養(yǎng)基(Difco有限公司，添加有1％蔗糖)上培養(yǎng)Magnaporthe grisea(稻瘟病)(TUS-1菌株，品種337，由農(nóng)林水產(chǎn)省東北農(nóng)業(yè)試驗(yàn)場提供)以產(chǎn)生分生孢子用作接種物。根據(jù)需要加入10％甘油，將孢子懸浮液儲存于-80℃。
在1/2馬鈴薯湯(PD，Difco)中將茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)(JT872菌株)培養(yǎng)2天。使用Teflon勻漿器輕輕在1/2 PD中研磨3塊菌絲體(約5mm)以得到菌絲片段用作接種物。
將上述接種物分別加入96孔微滴板(Coming)。以約1000/孔的密度加入M.grisea分生孢子，或以約300/孔的密度加入茄屬絲核菌菌絲片段于100μl 1/2 PD中。然后，在28℃恒溫箱中保溫48小時(shí)。通過用微滴板讀數(shù)儀(Benchmark，Bio-Rad)測定595nm的光吸收來監(jiān)測真菌的生長。
2)自白黃側(cè)耳提取蛋白預(yù)先用剪刀將商購的100g白黃側(cè)耳子實(shí)體切碎后，使用液氮凍干，在研缽中研磨以得到精細(xì)的粉末。然后用300ml 100mM Hepes-KOH緩沖液(PH 7.5)4℃提取30分鐘并緩慢攪拌。使提取物用Miracloth濾過，然后以10,000xg離心20分鐘。然后在上清液中加入硫酸銨以達(dá)到75％飽和，于4℃靜置過夜。再次以15,000xg離心20分鐘之后，將沉淀物溶解于3ml 10mMHepes-KOH緩沖液(PH7.5)中，并使用透析管(Spectra/Porl MWCO 6-8000，Spectrum Medical Industries)，對著20mM Hepes-KOH緩沖液(pH7.5)進(jìn)行透析。離心除去不可溶的物質(zhì)之后，得到白黃側(cè)耳蛋白質(zhì)樣品。通過Bradford法，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，測定白黃側(cè)耳蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)水平。
實(shí)施例2抗菌蛋白的純化1)粗白黃側(cè)耳蛋白樣品的抗菌活性將給定量的白黃側(cè)耳蛋白樣品添加到M.grisea和茄屬絲核菌培養(yǎng)系統(tǒng)中，該樣品在培養(yǎng)開始后馬上加入，培養(yǎng)2天(46-48小時(shí))，然后通過測定吸光度對抗菌活性進(jìn)行評估。結(jié)果顯示白黃側(cè)耳的提取物包含具有高度抗Magnaporthe grisea和茄屬絲核菌抗菌(antifungal)活性的物質(zhì)。對于M.grisea觀察到完全抑制萌發(fā)和抑制菌絲生長而茄屬絲核菌觀察到抑制菌絲生長。對于M.grisea的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁分離并看起來象質(zhì)壁分離。
為了進(jìn)一步分析所檢測的抗菌活性的性質(zhì)，加熱后檢測殘留的活性。抗菌試驗(yàn)在60和80℃加熱10分鐘，通過稀釋蛋白質(zhì)樣品評估抗菌的活性。結(jié)果，將抗M.grisea和茄屬絲核菌的抗菌活性在60℃加熱前和加熱后進(jìn)行比較。然而，抗茄屬絲核菌的抗菌活性在80℃加熱后消失。相對比的是，盡管誘導(dǎo)質(zhì)壁分離的活性丟失，通過在80℃加熱后菌絲的前端膨脹已停止生長顯示了新的抗M.grisea(圖1)。
為了獲知調(diào)控這些活性包含于粗白黃側(cè)耳蛋白樣品加熱級分中的該核心物質(zhì)的近似分子量，將樣品通過超濾膜分級以研究抗菌活性，使用超濾膜的Ultrafree MC10,000 NMWL過濾單位(分級(cut-off)分子量10000，Millipore)進(jìn)行分析，把樣品級分分為通過膜級分和未通過膜級分的。結(jié)果，僅未通過膜的級分都有活性。因此，活性核心的分子量估測至少為10000或更高。
2)通過離子交換層析純化然后純化抗菌蛋白。起初，將150mg/20ml的粗蛋白樣品上樣于備有離子交換單體Q Sepharose FF(Pharmacia)的自制柱(內(nèi)直徑1.5cm×高10cm，柱體積10ml)以部分純化抗菌蛋白。設(shè)流速為2ml/min，基礎(chǔ)緩沖液為50mMTris pH 8.0，50mM NaCl，洗脫緩沖液為50mM Tris pH 8.0，600mM NaCl，梯度為50mM到600mM NaCl的共100分鐘。將一部分各級分(12.5ml)進(jìn)行抗M.grisea的抗菌試驗(yàn)并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。各級分的蛋白質(zhì)溶液與等量的2×SDS流動的緩沖液在95℃反應(yīng)(Sambrook et al.(1989)MolecularCloning 2nd edition，Cold Spring Harbor)5分鐘，然后根據(jù)Laemmli(Laemmli(1970)Nature 227pp.680-685.)的方法通過SDS-PAGE電泳。所用凝膠為15％PAGEL(ATTO)，并且該蛋白質(zhì)用銀染色I(xiàn)I kit Wako (Wako PureChemical Industries)檢測。為了估測近似的分子量和蛋白的量，進(jìn)行分子量標(biāo)記(LMW marker kitPharmacia LKB，依分子量大小分別為94 kDa，67kDa，43kDa，30kDa，20.1kDa，14.4kDa)。通過銀染的蛋白質(zhì)電泳圖在與抗菌活性相關(guān)的圖2中顯示。
在NaCl濃度為160mM和240mM-280mM的兩峰顯示抗菌活性。在160mM的峰中包含的蛋白質(zhì)通過菌絲前端膨脹以終止生長而發(fā)揮作用，而在70℃加熱10分鐘并沒有消失。然而，包含于240mM-280mM峰中的蛋白質(zhì)在M.grisea中誘導(dǎo)質(zhì)壁分離，并在相同溫度下加熱后消失。因此，進(jìn)行嘗試以純化在160mM峰中包含的抗菌蛋白。
將相當(dāng)于120mM-240mM濃度NaCl的級分轉(zhuǎn)移至透析管(Spectra/Por1MWCO 6-8000，Spectrum Medical Industries)，對50mM Tris-HCl pH 8.0，50mM NaCl在4℃過夜透析。在Centriprep-10(分級分子量10,000，Amicon)的濃縮后按70℃加熱30分鐘。離心后，將上清通過0.22μm濾膜過濾。將該蛋白樣品(約10ml)上樣于MonoQ HR 5/5(Pharmacia)以分離/純化抗菌蛋白。設(shè)流速為1ml/min，基礎(chǔ)緩沖液為50mM Tris-HCl，pH 8.0，50mM NaCl，洗脫緩沖液為50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl，梯度為50mM到500mM NaCl在上樣后20分鐘開始到40分鐘。將部分各級分(1ml)進(jìn)行抗M.grisea的抗菌試驗(yàn)并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
圖3顯示了HPLC圖表與抗菌活性強(qiáng)度關(guān)系。結(jié)果顯示抗菌蛋白的洗脫峰表現(xiàn)在200mM-260mM離子強(qiáng)度(NaCl濃度)附近。
圖4顯示了電泳圖與抗菌活性強(qiáng)度關(guān)系。各泳道上部的圖對應(yīng)于圖3中的級分號?？赡芘c抗菌活性相關(guān)的蛋白質(zhì)帶的精細(xì)檢測發(fā)現(xiàn)可能的候選物的兩條帶(約15KDa)(圖4箭頭)。帶的強(qiáng)度和抗菌的活性的水平可能存在正相關(guān)性，表明該帶可能是核心的抗菌蛋白。
3)通過凝膠過濾的純化和分子量的估測為了純化白黃側(cè)耳抗菌蛋白并估計(jì)天然分子量，如上獲得的Mono Q級分#41-46在Ultrafree MC10,000 NMWL過濾單元(Millipore)濃縮并在凝膠過濾柱上Superose 6 HR 10/30(Pharmacia)上樣。在流率為0.5ml/min所用的緩沖液為50mM MES-NaOH pH 6.0，50mM NaCl。蛋白質(zhì)分子量和近似的洗脫時(shí)間通過凝膠過濾柱標(biāo)準(zhǔn)(BIO-RAD)預(yù)測，然后上樣具有抗菌活性的MonoQ級分。
結(jié)果，當(dāng)該蛋白在A280監(jiān)測時(shí)尖峰顯示在30kDa(圖5).抗菌活性集中于峰并且接近30kDa。這表明白黃側(cè)耳的抗菌活性源于具有凝膠過濾確定的約30kDa分子量的單一蛋白質(zhì)。當(dāng)各級分(0.25ml)在SDS-PAGE后銀染，對顯示于圖4中的15kDa檢測僅約30kDa(圖6)。除了15kDa的帶沒有顯示出其它的帶。這強(qiáng)有力的再次表明15kDa蛋白對抗菌活性發(fā)揮了作用?？咕鞍椎牧客ㄟ^光密度計(jì)由分子量標(biāo)記(20.1kDa胰島素抑制物)估測，并且抗M.grisea的50％生長抑制濃度計(jì)算為約50ng/ml。自粗重100g白黃側(cè)耳子實(shí)體通過上述方法純化的抗菌蛋白的量約0.2mg。
實(shí)施例3cDNA的分離
1)白黃側(cè)耳抗菌蛋白的氨基酸序列的測定如上獲得的Superose 6級分在Ultrafree MC 10,000 NMWL(Millipore)上濃縮并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。在既不包含Tris又不含甘氨酸(glycine)的緩沖系統(tǒng)中將級分轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)用考馬斯亮藍(lán)R-250輕染色然后褪色。接著將可能抗菌活性的15kDa蛋白帶切下。15kDa蛋白帶用賴胺酰內(nèi)肽酶(Wako Pure Chemical Industries)或V8蛋白酶(Wako Pure ChemicalIndustries)部分消化。
結(jié)果，14kDa的級分通過賴胺酰內(nèi)肽酶消化獲得，并且14kDa和12kDa級分通過V8蛋白酶消化獲得。遷移后將這些帶轉(zhuǎn)移。然后N-末端氨基酸序列通過Edman降解使用氣相蛋白質(zhì)測序儀(HPG1005A ProteinSequencing System)得以確定。
結(jié)果，下面的44氨基酸自15kDa蛋白確定N′-Leu Xaa Gly Xaa Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Xaa Xaa Met Asn Leu ThrAla Asn Lys Asp Gly Ser Leu Xaa Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val ProXaa Xaa Tyr His Leu Ala Gly Arg Tyr-C′(SEQ ID NO5)其中及此后Xaa是未知的。下面的50氨基酸自賴胺酰內(nèi)肽酶消化14kDa蛋白確定N′-Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro ProThr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val ThrLeu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val-C′(SEQ ID NO6)。
下面的21氨基酸自V8蛋白酶消化14kDa蛋白確定N′-Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr AlaAsn Lys Asp Gly-C′(SEQ ID NO7).
下面的23氨基酸自12kDa蛋白確定N′-Leu Thr Gly Thr Xaa Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Xaa Asn Leu Thr AlaAsn Xaa Asp Gly Xaa Leu-C′(SEQ ID NO8).
最后確定69氨基酸N′-Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr AlaAsn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro ProThr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val ThrLeu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val-C′(SEQ ID NO9).
2)設(shè)計(jì)簡并引物基于1)中確定的氨基酸序列，合成四種包含所有可能堿基的引物。括號中的數(shù)字表明簡并程度。
TMR15＇-acnggnacntggtayaayg-3’(256)(對應(yīng)于SEQ ID NO9的第2位氨基酸殘基Thr至第8位Glu)(SEQ IDNO10)TMR25＇-garytiggiwsnacnatgaa-3’(256)(對應(yīng)于SEQ ID NO9的第8位氨基酸殘基Glu至第14位Asn)(SEQ IDNO11)TMF15＇-gtrttytcraaiswiacn-3’(128)(對應(yīng)于SEQ ID NO9的第59位氨基酸殘基Ala至第65位Thr)(SEQ IDNO12)TMF25＇-cciarigtnacnccytgncc-3’(256)(對應(yīng)于SEQ ID NO9的第51位氨基酸殘基Gly至第57位Gly)(SEQ IDNO13)其中分別是＂i＂表示肌苷，＂r＂表示＂g或a＂，＂y＂表示＂c或t＂，＂w＂表示＂a或t＂，＂s＂表示＂g或c＂，＂n＂表示＂a或g或c或t＂。
3)構(gòu)建白黃側(cè)耳子實(shí)體cDNA文庫通過SDS苯酚的方法自白黃側(cè)耳子實(shí)體提取全部的核酸并通過氯化鋰沉淀回收全部的RNA。然后，自全部的RNA使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)制備白黃側(cè)耳mRNA。自約5g的子實(shí)體，獲得10μg mRNA，在ZAP cDNA合成試劑盒(Stratagene)使用5μg以合成cDNA。通過凝膠過濾級分化約0.5-5kb cDNA并與Uni-ZAP XR載體(Stratagene)連接利用Gigapack III(Stratagene)包裝。根據(jù)試劑盒的指示實(shí)施所有的方法。由此構(gòu)建的白黃側(cè)耳子實(shí)體cDNA文庫的效價(jià)估測在約3,000,000pfu。
4)通過RT-PCR制備探針使用2)中合成的引物和3)中合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR以試圖擴(kuò)增適合用于篩選文庫探針的白黃側(cè)耳抗菌蛋白的部分長cDNA。反應(yīng)條件如下50μl反應(yīng)溶液包含10ng cDNA，5μl 10×Ex taq緩沖液，4μl 2.5mM各dNTP，5pmoles引物/各序列和1μl Ex taq(Takara)+Taq START抗體(Clontech)，將該反應(yīng)溶液使用程序化溫度控制系統(tǒng)PC-700(ASTEK)在94℃，3min運(yùn)行1個循環(huán)；94℃，1min；50℃，1min，72℃，1min進(jìn)行35個循環(huán)，接著在72℃，6min1個循環(huán)。結(jié)果，約150-190bp的產(chǎn)物被擴(kuò)增，其是使用下面的引物對TMR1-TMRF1，TMR1-TMRF2，TMR2-TMRF1和TMR2-TMRF2。
將這些PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化并克隆入載體pCRII(Invitrogen)中。對這些克隆進(jìn)行測序以揭示它們包含兩種cDNAs，即1)中所確定的相同氨基酸序列嚴(yán)格編碼的cDNA(將源于TMR2-TMRF1和TMR2-TMRF2對；特別是將源于TMR2-TMRF2對的cDNA命名為TM100)，和具有與1)中所確定的氨基酸序列約75％同源性的氨基酸序列所編碼的cDNA(源于TMR1-TMRF1，TMR1-TMRF2對；特別是，將源于TMR1-TMRF1對的cDNA命名為TM75)。
5)篩選全長的cDNA將得自4)的cDNA克隆TM100和TM75自載體中切割并用作探針以篩選白黃側(cè)耳子實(shí)體的cDNA文庫。根據(jù)ZAP cDNA合成試劑盒(Stratagene)的說明在方形培養(yǎng)皿(14×10cm)，將約20,000pfu的噬菌體用宿主XL1-blue MRF’鋪板。將噬菌粒與Hybond-N+尼龍濾膜(Amersham)接觸以按照該膜的說明通過堿變性DNA，并固定于膜上。該探針為使用rediprimeIITMDNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham)的32P-標(biāo)記。在0.5M NaHPO4(pH7.2)，7％SDS，1mM EDTA于65℃雜交過夜，在40mM NaHPO4(pH7.2)，1％SDS，1mM EDTA于65℃洗滌兩次20分鐘。自約160,000pfu噬菌體初級篩選出用TM100探針為600陽性克隆和用TM75探針為30陽性克隆。它們中，自TM100探針的24克隆和自TM75探針的12克隆進(jìn)一步進(jìn)行次級篩選和三級篩選也針對純化噬斑，所選的所有克隆按照ZAP cDNA合成試劑盒的(Stratagene)指示進(jìn)行體內(nèi)切割。結(jié)果，自TM100探針的18克隆和自TM75探針的12克隆被回收為整合入噬菌粒載體pBluescript SK的cDNA。這些克隆的插入長度通過限制性內(nèi)切酶分析得以鑒定。
6)確定堿基序列每一上述cDNA克隆最長的克隆的全部核苷酸序列雙鏈都得以確定。起初，該克隆的5’和3’的核苷酸序列使用M13引物(takara)在ABIPRISM熒光測序儀得以確定(Model 310 Genetic Analyzer，Perkin Elmer)。
然后，合成下面的引物TM100inRVgTC AAg gCg TTA CTC Tgg(SEQ ID NO14)，其是基于自TM100最長克隆的5’核苷酸序列數(shù)據(jù)；TM100inFWCTg ggT gAg gAT CAC CTC(SEQ ID NO15)，其是基于自相同克隆的3’核苷酸序列數(shù)據(jù)；TM75inRVgAT gTC TAC gTg CCC TAC(SEQ ID NO16)，其是基于自TM75最長克隆的5’核苷酸序列數(shù)據(jù)；和TM75inFWACg ACT CAg AgA AgA ACT g(SEQ ID NO17)，其是基于相同克隆的3’核苷酸序列數(shù)據(jù)；并用于測序。因此，自TM100和TM75最長克隆的DNA雙鏈序列得以確定，使得確定全部的核苷酸序列。
結(jié)果顯示編碼白黃側(cè)耳抗菌蛋白cDNA(源于TM100探針)編碼143個氨基酸(SEQ ID NO2)由全長671堿基(SEQ ID NO1)組成。自純化的蛋白質(zhì)確定的N-末端氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO2氨基酸殘基8-76。SEQ IDNO2氨基酸序列和直接自該純化蛋白質(zhì)確定的67氨基酸除了兩未知的氨基酸(在SEQ ID NO2氨基酸序列中的W65和S73)其它全部相同。由此得出結(jié)論克隆的cDNA源于編碼白黃側(cè)耳抗菌蛋白的基因。
自cDNA序列確定的蛋白質(zhì)的N-末端序列與實(shí)際上純化的蛋白的N-末端序列不相同，即在起始密碼子蛋氨酸之后7個氨基酸的L(亮氨酸)位于純化蛋白質(zhì)的N-末端。這表明白黃側(cè)耳抗菌蛋白首先被翻譯為前體然后，將N-末端前導(dǎo)序列(7氨基酸)截短。推定成熟蛋白氨基酸(SEQ ID NO2的第8-第143位的136個氨基酸序列)序列的平均分子量使用基因序列分析軟件程序GENETYX-WIN ver 3.2(Software Development Co.，Ltd.)確定為15158.4，等電點(diǎn)計(jì)算為6.22。這種分子量與通過SDS-PAGE所估的純化蛋白(15kDa)非常相符。此外，存在兩個推定的糖基化位點(diǎn)(SEQ ID NO2的氨基酸殘基21和71中的N)。
另一方面，編碼自白黃側(cè)耳抗菌蛋白同系物的cDNA(自TM75)編碼141個氨基酸(SEQ ID NO4)，由全長840堿基(SEQ ID NO3)組成。該cDNA包含在5’末端包含三種ATG密碼子，但當(dāng)翻譯自第一和第二ATG密碼子，終止密碼子緊接其后并且僅有12和31氨基酸可以被編碼。只有翻譯起始于第三個ATG密碼子，可以編碼141。終止密碼子TGA在相同的讀框內(nèi)位于該ATG102bp上游。因此，幾乎可以確定的是第三個ATG是起始密碼子。
推定成熟的氨基酸序列(SEQ ID NO4的氨基酸殘基中由8-141殘基組成的134氨基酸的序列)的分子量估測在14732.2，并且等電點(diǎn)計(jì)算為8.62。還存在一個推定的糖基化位點(diǎn)(SEQ ID NO4的N 115)。本發(fā)明白黃側(cè)耳抗菌蛋白和其同系物的同源性使用GENETYX-WIN分析在氨基酸水平上為65.5％在DNA水平上為64.5％(ORF 72.2％)。
通過GenBank數(shù)據(jù)庫利用BLAST對本發(fā)明的源于白黃側(cè)耳抗菌蛋白和其基因以及它們的同系物和具有其編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)實(shí)施同源性搜尋。數(shù)據(jù)庫搜尋本發(fā)明的源于白黃側(cè)耳抗菌蛋白的氨基酸序列(SEQID NO2)全部氨基酸序列發(fā)現(xiàn)同源性序列諸如紫色鏈霉菌的鏈霉抗生物素蛋白v2(保藏號Q53533，Bayer et al.(1995)Biochim Biophys Acta 1263pp.60-66.)和v1(保藏號Q53532)，阿維丁氏鏈霉菌ii(Streptmyces avidin ii)的鏈霉抗生物素蛋白(保藏號P22629，Argarana et al.(1986)Nucleic Acids Res 14pp.1871-1882)，等。這三種氨基酸同源性擴(kuò)展到超過128氨基酸，并分別是50％，49％和49％。卵清抗生物素蛋白(Gope et al.(1987)Nucleic Acids Res 15pp.3595-3606)和一些與抗生物素蛋白相關(guān)的蛋白(Keinanen et al.(1994)EurJ Biochem 220pp.615-621)也以低同源性程度匹配。核心鏈霉抗生物素蛋白突變體w79f ChainB(Freitag et al.(1997)Protein Sci.6pp.1157-1166)也匹配，與鏈霉抗生物素蛋白僅一個氨基酸不同，并且其中鏈霉抗生物素蛋白的36個N-末端氨基酸和20個C-末端氨基酸被截短，同源性為51.7％。
這些事實(shí)表明該蛋白是新的蛋白。數(shù)據(jù)庫搜尋本發(fā)明第二源于白黃側(cè)耳抗菌蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO4的全部氨基酸序列)顯示分別與鏈霉抗生物素蛋白v2，v1和鏈霉抗生物素蛋白有50％，48％和48％的同源性程度。
然而，相似的數(shù)據(jù)庫使用，編碼源于第一白黃側(cè)耳抗菌蛋白基因的DNA序列(SEQ ID NO1的71-502)和編碼源于第二白黃側(cè)耳抗菌蛋白的DNA序列(SEQ ID NO3的226-651)發(fā)現(xiàn)在很短的范圍(23bp)內(nèi)僅有幾個氨基酸顯示同源性但不是鏈霉抗生物素蛋白DNA序列。這表明編碼本發(fā)明新蛋白的DNA序列與鏈霉抗生物素蛋白的DNA序列在DNA水平上沒有高度同源性。
本發(fā)明的抗菌蛋白命名為＂tamavidin＂是由于從食用的蘑菇白黃側(cè)耳(Tamogitake)純化的新的鏈霉抗生物素類蛋白。本文中衍生于該純化蛋白的基因稱為tam1，具有由其編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)稱為tamavidin 1，tam1同系物稱為tam 2，具有由其編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)稱為tamavidin 2。當(dāng)遺傳序列分析軟件程序GENETYX-WIN ver 3.2用于分析本發(fā)明白黃側(cè)耳抗菌蛋白和鏈霉抗生物素蛋白的全部氨基酸序列(鏈霉抗生物素蛋白分別與鏈霉抗生物素蛋白v2和v1僅有9氨基酸和1個氨基酸不同)的同源性。結(jié)果由本發(fā)明tam1編碼的tamavidin 1的氨基酸序列顯示同源性(氨基酸同一性)為46.7％，并且由tam2編碼的tamavidin 2的氨基酸序列顯示為48.1％。全部DNA序列(序列表中SEQ ID NOs1和3)與鏈霉抗生物素蛋白的同源性對于tam1為53.8％(ORF56.8％)及對于tam2為51.0％(ORF57.3％)。tam1編碼的白黃側(cè)耳抗菌蛋白與卵清抗生物素蛋白的在氨基酸序列中同源性為31.2％，在DNA序列中為42.4％，tam2編碼的白黃側(cè)耳抗菌蛋白與卵清抗生物素蛋白的在氨基酸序列中同源性為36.2％，在DNA序列中為41.8％。
通過UPGMA方法使用GENETYX-WIN制作tamavidin 1，tamavidin 2，鏈霉抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白V1，鏈霉抗生物素蛋白V2 and抗生物素蛋白成熟蛋白區(qū)域的氨基酸序列的分子系統(tǒng)樹。結(jié)果如圖7所示tamavidin 1和tamavidin 2形成不同于鏈霉抗生物素蛋白組和抗生物素蛋白組的第三組。
與鏈霉抗生物素蛋白相比，本發(fā)明tamavidin 1和tamavidin 2在N-末端33氨基酸截短，但可能涉及與生物素結(jié)合的所有的色氨酸(W)殘基(Gitlin etal.(1988)Biochem.J 256pp.279-282)和酪氨酸(Y)殘基(Gitlin et al.(1990)Biochem.J 269pp.527-530)都是保守的(在SEQ ID NO2氨基酸序列的Y 34和45和W 82，98和110，在SEQ ID NO4氨基酸序列中的Y 34和45和W 80，96和108)。
推定為成熟蛋白區(qū)域的該區(qū)域(SEQ ID NO2的氨基酸序列8-143，SEQ ID NO4的氨基酸序列8-141)平均分子量分別計(jì)算為15158.4和14732.2，接近于成熟鏈霉抗生物素蛋白和成熟抗生物素蛋白的平均分子量(分別為16490.6和14342.9)。這些事實(shí)強(qiáng)有力表明不僅tam1編碼的tamavidin 1而且tam2編碼的tamavidin 2是具有生物素結(jié)合親和力的蛋白。
實(shí)施例4通過添加生物素消除抗菌活性的實(shí)驗(yàn)本發(fā)明抗菌蛋白是新的鏈霉抗生物素蛋白樣蛋白，表明其結(jié)合一種維生素，D-生物素(維生素H，Katayama Chemical)。稻瘟病菌的生長已知需要生物素。這些事實(shí)表明本發(fā)明的抗菌蛋白與試驗(yàn)培養(yǎng)基存在的游離的生物素以誘導(dǎo)生物素結(jié)合缺陷的培養(yǎng)基，結(jié)果抑制了稻瘟病菌(M.grisea)的生長。
圖8顯示通過添加生物素消除抗菌活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體地是，將懸浮于1/2PD的M.grisea孢子置于微量滴定板上。設(shè)計(jì)以下各孔添加含有50ng/ml或1000ng/ml純化的tamavidin 1的孔，再在包含1000ng/ml的tamavidin 1中添加100ng/ml抗生物素蛋白的孔，另外不含蛋白的孔，并在28℃溫育48小時(shí)。
結(jié)果，如圖8中所示M.Grisea菌絲的延伸在含tamavidin 1甚至濃度為50ng/ml相當(dāng)?shù)匾种啤Ｈ欢?，在既含有tamavidin 1(1000ng/ml)又有生物素的孔和對照孔菌絲正常延伸。因此，本發(fā)明抗菌蛋白的活性通過過量添加生物素到試驗(yàn)培養(yǎng)基中而實(shí)際上得以消除，這可能是由于超過一定量添加生物素結(jié)合了大部分的用于分析tamavidin 1而滅活其抗菌活性。
類似的試驗(yàn)在商業(yè)購得的在濃度1000ng/ml的卵清抗生物素蛋白(Sigma)和阿維丁氏鏈霉菌ii的鏈霉抗生物素蛋白(Sigma)實(shí)施。結(jié)果顯示兩種蛋白質(zhì)具有抗M.Grisea的抗菌活性并且該活性通過生物素消除(圖8)。
實(shí)施例5重組tamavidin 2蛋白的生物素結(jié)合活性1)構(gòu)建表達(dá)載體tam2基因雖然是分離為本發(fā)明tam1基因的同系物，但是由tam2基因編碼的tamavidin 2，實(shí)際上是否顯示了與生物素結(jié)合活性。具體地是，將tam2基因插入大腸桿菌以表達(dá)重組tamavidin 2，并且進(jìn)行檢測該蛋白是否在亞氨基生物素柱上被純化。
起初，通過PCR合成用于擴(kuò)增全部實(shí)施例3中獲得的tam2基因的ORF(序列表中SEQ ID NO3的226-651)引物對。
TM75Bsp55’-ACCAACATgTCAgACgTTCAA-3’(SEQ ID NO18)TM75Hin35’-ATgAAAgCTTTTACTTCAACCTCgg-3’(SEQ ID NO19).
TM75Bsp5包含限制性內(nèi)切酶BspLU 11I的識別位點(diǎn)(下劃線)并且TM75Hin3包含限制性內(nèi)切酶HindIII的識別位點(diǎn)(下劃線)。這些引物用于在以包含tam2基因的質(zhì)粒(pBluescript，實(shí)施例3(6))作為模板實(shí)施PCR。利用程序性溫度控制系統(tǒng)PC-700(ASTEK)，50μl反應(yīng)溶液包含500ng模板質(zhì)粒DNA，5μl 10×Pyrobest緩沖液，4μl 2.5mM各dNTP，10pmoles各引物，0.5μl Pyrobest DNA聚合酶(Takara)在94℃，3min運(yùn)行1個循環(huán)；94℃，1min；50℃，1min，72℃，1min進(jìn)行15個循環(huán)，接著在72℃，6min 1個循環(huán)。
所得的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BspLU 11I(Roche)和HindIII(Takara)雙消化并進(jìn)行凝膠純化。所用的大腸桿菌表達(dá)載體為pTrc99A(PharmaciaLKB)。該載體為用NcoI(Takara)和HindIII雙消化并凝膠純化，和用上述限制性內(nèi)切酶消化的PCR產(chǎn)物連接，然后插入到大腸桿菌TB1。所插入的tam2基因的核苷酸序列得以證實(shí)。
2)重組蛋白的表達(dá)和在生物素柱上的純化將具有包含tam2表達(dá)載體pTrcc99A的大腸桿菌TB1的單集落接種至包含抗生素氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行前培養(yǎng)至約OD600＝0.5。然后添加IPTG的終濃度為1mM以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并且通過在37℃振蕩再培養(yǎng)4.5小時(shí)。培養(yǎng)基的體積為50mL，不含IPTG(異丙基-β-D(-)-thiogalactopyranoside，Wako Pure ChemicalIndustries)對照也進(jìn)行檢測。通過離心收集培養(yǎng)細(xì)胞并直至蛋白質(zhì)純化儲存于-80℃參考Hofmann等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774666-4668(1980))的方法將Tamavidin 2在亞氨基生物素上純化。將細(xì)胞懸浮于1.5mL緩沖液A(50mM CAPS(3-[環(huán)己氨基]-1-丙烷磺酸，SIGMA)，pH 11，50mM NaCl)并超聲破碎。離心之后，將上清收集為全部可溶的蛋白。用0.5mL 2-亞氨基生物素-瓊脂糖(SIGMA)在具有直徑0.5cm高5cm的柱填充裝柱并用緩沖液A預(yù)平衡。將全部可溶的蛋白在該亞氨基生物素瓊脂糖柱上上柱。在該柱用5mL 50mM CAPS pH 11，500mM NaCl洗滌之后，tamavidin 2被用1.5mL50mM NH4OAC，pH4.0進(jìn)行洗脫。全部可溶的蛋白和已通過該柱的級分，洗滌級分，和洗脫級分進(jìn)行在15％PAGEL(ATTO)進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
遷移之后，將該蛋白用考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)R-250(Wako Pure Chemical Industries)染色。結(jié)果顯示于圖9。如圖9所示，1mMIPTG(T)誘導(dǎo)的大腸桿菌全部可溶性級分(T)顯示約15kDa的帶，而在未誘導(dǎo)的級分(C)中未發(fā)現(xiàn)。該分子量與tam2基因編碼的141氨基酸所推導(dǎo)的15467的分子量極為一致。
此外，該15kDa蛋白在用50mM NH4OAC，pH4.0洗脫的級分(E)中出現(xiàn)，但未在通過生物亞氨基素柱的級分(F)和柱的洗滌級分(W)中顯現(xiàn)。該15kDa蛋白形成洗脫級分的主要成分。這種結(jié)果顯示tam2編碼的tamavidin2結(jié)合生物素，該結(jié)果還顯示其可方便地通過上述方法純化。得自50mL培養(yǎng)基的大腸桿菌中表達(dá)的重組tamavidin 2產(chǎn)量約1mg。
效果對包含下述蛋白成分作為活性成分的制備預(yù)計(jì)可用于抗菌劑，該蛋白成分的特征在于其根據(jù)本發(fā)明包含由SEQ ID NO2或4的氨基酸序列組成的多肽或由其部分序列組成并且能與生物素或其衍生物結(jié)合的多肽。
抗病植物也可通過將本發(fā)明具有SEQ ID NO1的71-502或92-502序列的DNA或具有SEQ ID NO3的226-651或247-651序列的DNA與在植物細(xì)胞中有功能的合適組成型啟動子，器官/時(shí)間特異性啟動子或?qū)γ{迫或病蟲害作出反應(yīng)的誘導(dǎo)型啟動子，整合入在植物細(xì)胞中有功能的終止子序列的表達(dá)盒中，然后將該盒導(dǎo)入植物細(xì)胞以再生個體。這種情況下，編碼用于運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器的信號肽的DNA序列或用于胞外分泌信號序列也可與編碼本發(fā)明抗菌蛋白DNA序列連接。
本發(fā)明的蛋白可以在大腸桿菌，酵母，植物，昆蟲或動物諸如，非洲瓜蟾中大量產(chǎn)生或制備，其是通過將編碼本發(fā)明的DNA整合入能在上述細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白的表達(dá)載體。這種情況下，編碼用于運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器的信號肽的DNA序列或用于胞外分泌信號序列也可與編碼本發(fā)明抗菌蛋白DNA序列連接。
本發(fā)明蛋白和生物素間強(qiáng)的相互作用可應(yīng)用于鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白當(dāng)前廣泛應(yīng)用的各種分析技術(shù)中。
序列表<110>日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社和欣根塔有限公司(JAPAN TOBACCO INC.and Syngenta Limited)<120>新蛋白質(zhì)，編碼該蛋白質(zhì)的基因和它們的使用方法<130>YCT697<160>19<210>1<211>671<212>DNA<213>白黃側(cè)耳(Pleurotus cornucopiae)<220>
<221>CDS<222>(71)...(502)<400>1gcccagagag accatctata acctctgcgt ccaaaccttc attgaaagct tcaaccccca 60gtcccccatc atg aaa gac gtc caa tct ctc ctc acc gga acc tgg tac 109Met Lys Asp Val Gln Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr1 5 10aat gaa ctc ggc tca aca atg aat ttg act gca aat aaa gac ggt tcg 157Asn Glu Leu Gly Ser Thr MET Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser15 20 25ctc acc gga acg tac cac tcc aac gtc ggc gag gtt ccc cca act tat 205Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr30 35 40 45cac ctt tct ggc cgg tac aac ctc cag ccc ccc tcg ggt caa ggc gtt 253His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val50 55 60act ctg gga tgg gcg gtg tct ttc gaa aac act agt gcg aat gtt cat 301Thr Leu Gly Trp Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Val His65 70 75tct gtc tca aca tgg agc ggg cag tac ttc tct gaa ccc gcc gag gtg 349Ser Val Ser Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Val80 85 90atc ctc acc cag tgg ctg ttg tca agg agc tct gag cgc gaa gat ttg 397Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu95 100 105
tgg cag tcc acc cat gtg ggg cat gat gag ttc agc aag aca aag cca445Trp Gln Ser Thr His Val Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro110 115 120 125acc aag gag aag att gcc cag gct caa ctc ctt cgt cgc ggg ttg aag493Thr Lys Glu Lys Ile Ala Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys130 135 140ttc gag tga acctgattca cgaaaaattc cgtctatcca acgttggaga tgactccac551Phe Glu143ctcaagttgt gaatgtttgc tcatttgtac cgaatctgta cgacaagttt gtctgccacc611atgtacatcg caaagaatta tcaagaaact ccatgacctg ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa671<210>2<211>143<212>PRT<213>白黃側(cè)耳(Pleurotus cornucopiae)<400>2Met Lys Asp Val Gln Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr1 5 10Asn Glu Leu Gly Ser Thr MET Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser15 20 25Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr30 35 40 45His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val50 55 60Thr Leu Gly Trp Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Val His65 70 75Ser Val Ser Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Val80 85 90Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser G1u Arg Glu Asp Leu95 100 105Trp Gln Ser Thr His Val Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro110 115 120 125Thr Lys Glu Lys Ile Ala Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys130 135 140Phe Glu143<210>3
<211>840<212>DNA<213>白黃側(cè)耳(Pleurotus cornucopiae)<220>
<221>CDS<222>(226)...(651)<400>3gtggactctt gcgcgggcag gtacattcac aggtcgtgca ggttgtggga gtattcagtg60gctcagactc ttgtgctgac gggtatagat tcacaagccg tgcaggttgt gggagtactc 120agagggtgag tgattgaatg gaagcacatc ggcgctggtt tcaagccgag aattgaggaa 180gtaatactcc aagccgatga gaggttacag agatcctcta ccacc atg tca gac gtt 237Met Ser Asp Val1caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc aac tcc aag atg 285Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Asn Ser Lys Met5 10 15 20gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga aag tac ctc tcc 333Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Ser25 30 35aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct ggt cgc tat aac 381Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Asn40 45 50ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg tgg gcg gta tcc 429Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly Trp Ala Val Ser55 60 65tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg agc gga cag ttc 477Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Phe70 75 80ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg ttg ttg tca tcg 525Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Ser85 90 95 100agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt gtg ggg aat gat 573Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu Val Gly Asn Asp105 110 115
tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc gct cat gct caa 621Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile Ala His Ala Gln120 125 130ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa cgagggtcat cgcaaacaaa ccc 674Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys135 140 141catcggtctt gaccggtgat ccaaccccaa ggtctaatca atgccggatg actccatttg 734aggatgtgaa ttagttgcca tttgtatgac ttgatttgtc tgttgtgtag tatcggatta 794agaatcacat ctcgttaacc ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 840<210>4<211>141<212>PRT<213>白黃側(cè)耳(Pleurotus cornucopiae)<400>4Met Ser Asp Val1Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Asn Ser Lys Met5 10 15 20Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Ser25 30 35Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Asn40 45 50Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly Trp Ala Val Ser55 60 65Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Phe70 75 80Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp Leu Leu Ser Ser85 90 95 100Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu Val Gly Asn Asp105 110 115Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile Ala His Ala Gln120 125 130Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys135 140 141<210>5<211>44<212>PRT<213>白黃側(cè)耳(Pleurotus cornucopiae)
<220>
<223>Xaa代表未知氨基酸殘基<400>5Leu Xaa Gly Xaa Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Xaa Xaa Met Asn Leu Thr1 5 10 15Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Xaa Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly20 25 30Glu Val Pro Xaa Xaa Tyr His Leu Ala Gly Arg Tyr35 40 44<210>6<211>50<212>PRT<213>白黃側(cè)耳(Pleurotus cornucopiae)<220>
<223>Xaa代表未知氨基酸殘基<400>6Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro1 5 10 15Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly20 25 30Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala35 40 45Asn Val50<210>7<211>21<212>PRT<213>白黃側(cè)耳(Pleurotus cornucopiae)<220>
<223>Xaa代表未知氨基酸殘基<400>7Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr1 5 10 15Ala Asn Lys Asp Gly20 21<210>8
<211>23<212>PRT<213>白黃側(cè)耳(Pleurotus cornucopiae)<220>
<223>Xaa代表未知氨基酸殘基<400>8Leu Thr Gly Thr Xaa Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Xaa Asn Leu Thr1 5 10 15Ala Asn Xaa Asp Gly Xaa Leu20 23<210>9<211>69<212>PRT<213>白黃側(cè)耳(Pleurotus cornucopiae)<220>
<223>Xaa代表未知氨基酸殘基<400>9Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr1 5 10 15Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly20 25 30Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro35 40 45Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn50 55 60Thr Xaa Ala Asn Val65<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>10acnggnacnt ggtayaayg<210>11<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>6和9<223>i代表肌苷<400>11garytiggiw snacnatgaa<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>12 and 15<223>i代表肌苷<400>12gtrttytcra aiswiacn<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>3 and 6<223>i代表肌苷<400>13cciarigtna cnccytgncc<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>14gtcaaggcgt tactctgg<210>15<211>18<212>DNA
<213>人工序列<400>15ctgggtgagg atcacctc<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>16gatgtctacg tgccctac<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>17acgactcaga gaagaactg<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>18accaacatgt cagacgttca a<210>19<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>19atgaaagctt ttacttcaac ctcgg
權(quán)利要求
1.一種抗菌蛋白，可通過使用硫酸銨沉淀法自白黃側(cè)耳水提取物沉淀的級分來獲得該蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有至少對稻瘟病的抗菌活性，其在SDS-PAGE法中，顯示出分子量約為15kDa的組分的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗菌蛋白，其中N-末端具有SEQ ID NO9所述的N-末端氨基酸序列Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala AsnLys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro ProThr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly ValThr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val其中Xaa未知。
3.一種對稻瘟病顯示抗菌活性的抗菌蛋白，其中所述蛋白具有SEQ IDNO2或NO4的氨基酸序列，或在所述序列中有一個或多個氨基酸修飾的氨基酸序列，或與所述序列具有52％或更高同源性的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的抗菌蛋白，具有與SEQ ID NO2或4的氨基酸序列有60％或更高同源性氨基酸序列。
5.權(quán)利要求3的抗菌蛋白，具有與SEQ ID NO2或4的氨基酸序列有70％或更高同源性氨基酸序列。
6.權(quán)利要求3的抗菌蛋白，具有與SEQ ID NO2或4的氨基酸序列有80％或更高同源性氨基酸序列。
7.權(quán)利要求3的抗菌蛋白，具有與SEQ ID NO2或4的氨基酸序列有90％或更高同源性氨基酸序列。
8.權(quán)利要求3的抗菌蛋白，具有與SEQ ID NO2或4的氨基酸序列有95％或更高同源性氨基酸序列。
9.一種由單獨(dú)的多肽或其組合組成的抗菌蛋白，其中所述多肽選自由SEQ ID NO2的8-143的部分氨基酸序列或SEQ ID NO4的8-141的部分氨基酸序列組成的多肽，和在所述任一項(xiàng)氨基酸序列中具有一個或更多個修飾氨基酸的多肽；和與所述任一項(xiàng)氨基酸序列具有52％甚至更高的同源性的多肽。其中所述多肽對稻瘟病顯示抗菌活性。
10.一種制備權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的抗菌蛋白的方法，其中包括回收通過硫酸銨沉淀法，用75％-飽和硫酸銨沉淀的自白黃側(cè)耳含水提取物的級分；和對所述級分進(jìn)行離子交換柱層析以回收用濃度50mM-600mM的NaCl洗脫的級分。
11.一種編碼權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的抗菌蛋白的基因。
12.權(quán)利要求11的基因，其中所述基因具有SEQ ID NO1的堿基71-502堿基序列或具有SEQ ID NO3堿基226-651堿基序列，或具有在此堿基序列中取代，缺失，插入和/或添加一個或多個堿基的堿基序列，或能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與上述任一堿基序列雜交的堿基序列。
13.權(quán)利要求11或12的基因，具有與SEQ ID NO1的堿基71-502堿基序列或與具有SEQ ID NO3堿基226-651堿基序列有至少60％的同源性的堿基序列。
14.權(quán)利要求11或12的基因，具有與SEQ ID NO1的堿基71-502堿基序列或具有與SEQ ID NO3堿基226-651堿基序列有至少70％的同源性的堿基序列。
15.權(quán)利要求11或12的基因，具有與SEQ ID NO1的堿基71-502堿基序列或具有與SEQ ID NO3堿基226-651堿基序列有至少80％的同源性的堿基序列。
16.權(quán)利要求11或12的基因，具有與SEQ ID NO1的堿基71-502堿基序列或具有與SEQ ID NO3堿基226-651堿基序列有至少90％的同源性的堿基序列。
17.權(quán)利要求11或12的基因，具有與SEQ ID NO1的堿基71-502堿基序列或具有SEQ ID NO3堿基226-651堿基序列有至少95％的同源性的堿基序列。
18.通過以下方法產(chǎn)生的用于得到編碼源自白黃側(cè)耳的抗菌蛋白的基因的寡核苷酸，所述方法包括根據(jù)以下需求，從編碼SEQ ID NO1或3抗菌蛋白之基因的堿基序列中選擇兩個區(qū)域1)每個區(qū)域長15-30個堿基；2)每個區(qū)域堿基序列中G+C的含量的比例為40-60％；制備單鏈DNA，該DNA具有與所述區(qū)域的堿基序列相同或互補(bǔ)的堿基序列，或者制備根據(jù)遺傳密碼簡并性不改變所述單鏈DNA所編碼的氨基酸殘基的單鏈DNA混合物；并任選制備修飾的所述單鏈DNA，所述修飾不喪失與編碼所述抗菌蛋白之基因的單鏈DNA堿基序列的結(jié)合特異性。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的寡核苷酸，具有權(quán)利要求10-19任一項(xiàng)所述的核苷酸序列。
20.一種分離根據(jù)權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)的基因的方法，其中所述方法包括使用權(quán)利要求18或19的兩種寡核苷酸作為引物對和白黃側(cè)耳子實(shí)體cDNA文庫為模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，籍此擴(kuò)增編碼根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的任一項(xiàng)抗菌蛋白之基因的一部分，和使用如此獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為探針篩選該cDNA文庫，從而分離全長cDNA克隆。
21.一種含有根據(jù)權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)基因的重組載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的重組載體，其中所述載體是表達(dá)載體。
23.通過將根據(jù)權(quán)利要求21或22的重組載體導(dǎo)入宿主生物而得到的轉(zhuǎn)化體。
24.權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)化體，其是抗病性植物。
25.一種包括權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)抗菌蛋白作為活性成分的抗菌劑。
26.一種由權(quán)利要求23轉(zhuǎn)化體制備的重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明的目的是篩選和鑒定新的抗微生物蛋白，濃度甚至相對較低的該蛋白質(zhì)也能抑制植物病原菌的生長，所述病原菌包括Magnaporthe grisea和茄屬絲核菌，它們能導(dǎo)致?lián)p害水稻作物的兩種主要疾病。本發(fā)明的另一目的是克隆該蛋白質(zhì)的基因。根據(jù)本發(fā)明，提供了抗微生物蛋白，可通過硫酸銨沉淀法使用自白黃側(cè)耳水提取物沉淀的級分來獲得該蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有至少稻瘟病的抗微生物活性，其在SDS－PAGE法中，顯示出分子量約為15kDa的組分的存在。本發(fā)明還提供了編碼該蛋白質(zhì)的基因和使用它們的方法。
文檔編號C12N1/21GK1505681SQ0280914
公開日2004年6月16日 申請日期2002年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月12日
發(fā)明者高倉由光 申請人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社, 欣根塔有限公司