專利名稱：檢測髓過氧化物酶抑制劑的測定法的制作方法
背景技術(shù)：
抗微生物感染包括非特異性機理和由B淋巴細胞和T淋巴細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答兩個方面。非特異性機理，如酶的作用，pH值和上皮組織分泌物可防止很多微生物侵入。然而，當?shù)谝坏婪谰€被攻破時，吞噬細胞吞噬感染劑，并對它們進行處理，導(dǎo)致對B細胞和T細胞的刺激。吞噬系統(tǒng)缺陷，不論是先天的，還是獲得性的，都會造成嚴重的后果，這是因為對正常個體而言，致病性較低的微生物會導(dǎo)致具有低效吞噬系統(tǒng)個體的復(fù)發(fā)性感染。
多形核白細胞(PMNs)對于抗感染特別重要。這些細胞含有一種酶，即髓過氧化物酶，經(jīng)證明具有很好的殺微生物作用。PMNs利用吞噬作用非特異性地吞噬微生物，把它們摻入到被稱作吞噬體的液泡中，其與含有髓過氧化物酶的顆粒體融合，形成吞噬溶酶體。在吞噬溶酶體中，髓過氧化物酶的酶活性導(dǎo)致次氯酸，即一種有效的殺菌化合物(從過氧化氫和氯化物)的形成。次氯酸自身發(fā)生氧化，它們絕大部分與硫醇和硫醚劇烈反應(yīng)，并且可把胺轉(zhuǎn)化成氯胺，并使芳族氨基酸氯化。巨噬細胞是大的吞噬細胞，如PMNs能夠吞噬微生物。巨噬細胞可產(chǎn)生過氧化氫，在激活后，還可產(chǎn)生髓過氧化物酶。此外，血漿中的髓過氧化物酶可被巨噬細胞攝取。
髓過氧化物酶的活性與疾病之間的關(guān)聯(lián)涉及到很多炎性疾病，包括阿爾茨海默氏病，多發(fā)性硬化，哮喘，動脈粥樣硬化，癌癥，囊性纖維化，慢性阻塞性肺病，炎性腸病，和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。鑒定髓過氧化物酶抑制劑的測定法對于證實次氯酸對這種疾病發(fā)病機理的影響而言非常重要，還可用作診斷的工具。它們還可為研制抗髓過氧化物酶依賴性組織損害的有效藥物提供平臺。MPO抑制劑的適宜篩選測定法應(yīng)在實際的生理條件下測量髓過氧化物酶的氯化活性。這種測定法必須簡單，靈敏，而且可產(chǎn)生有色的或發(fā)熒光的產(chǎn)物，但不能干擾MPO的活性。檢測劑的濃度要足夠高，從而清除產(chǎn)生的所有次氯酸，但不能與酶直接反應(yīng)。目前，最普遍使用的測定法是以從次氯酸和?；撬嵝纬膳；撬崧劝窞榛A(chǔ)的。先前利用這種?；撬崧劝窚y定法的改進形式測量髓過氧化物酶活性的嘗試揭示了下列特定問題，即，否定了其用于篩選酶的可能抑制劑的用途。主要問題是，通常最適于溶解試驗化合物的溶劑二甲基亞砜(DMSO)會干擾測定，而且很多試驗化合物都在與通常所用發(fā)色團相同的區(qū)內(nèi)吸收。
生理上，PMN-衍生的髓過氧化物酶主要催化鹵化物，如氯離子的過氧化氫依賴性氧化，但其利用電子供體，如O-聯(lián)茴香胺作為底物的能力可形成測量發(fā)炎組織中PMNs的測定法的基礎(chǔ)。方法適合就可避免由組織/血液成分，如胞質(zhì)酶，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶，還原性底物如谷胱甘肽和抗壞血酸，及血紅素蛋白引起的假象，這些方法已經(jīng)描述過(Grisham等，Methodsin Enzymology，Vol.186，Ed.Packer等，San DiegoAcademic Press，pp.729-742(1990))。然而，仍然需要一種更可靠的分析方法來測量發(fā)炎組織的PMN含量，而不會受到其它內(nèi)源性組織成分的影響。
本發(fā)明描述了一種簡單，靈敏而且肯定的測定法，它可避免與目前已知測定法有關(guān)的主要問題，而且非常適于鑒定髓過氧化物酶的抑制劑。另一方面，本發(fā)明可用于與髓過氧化物酶有關(guān)的特定診斷試驗。
發(fā)明描述首先，本發(fā)明提供一種鑒定髓過氧化物酶(MPO)抑制劑的方法，該方法包括在有所述髓過氧化物酶的可能抑制劑存在的條件下，使髓過氧化物酶與過氧化氫和氯化物源反應(yīng)，產(chǎn)生次氯酸；使所有形成的次氯酸與適宜的胺反應(yīng)，形成相應(yīng)的氯胺；任選除去所有未反應(yīng)的過氧化氫；在有碘化物存在的條件下，使所有形成的氯胺與適宜的檢測分子反應(yīng)，形成氧化的檢測分子；通過在適宜波長下測量吸光度或熒光而測定所形成的氧化檢測分子的量；把引起所形成的氧化檢測分子的量降低的那些化合物鑒定為髓過氧化物酶的抑制劑.
在上述發(fā)明的其中一個實施方案中，所用的胺是?；撬?，它可被次氯酸轉(zhuǎn)化成牛磺酸氯胺。牛磺酸的適宜濃度約為5-10mM。
在另一實施方案中，所有未反應(yīng)的過氧化氫是用過氧化氫酶除去的。過氧化氫酶的適宜濃度約為10-20μM。
氯化鈉可用作適宜的氯化物源，例如，其量為大約50-150mM。
可直接加入過氧化氫，或利用氧化酶，如葡萄糖氧化酶或黃嘌呤氧化酶原位酶促產(chǎn)生過氧化氫。過氧化氫的適宜濃度為10-100μM。
在另一實施方案中，所用的檢測分子是聯(lián)苯胺衍生物。優(yōu)選的聯(lián)苯胺衍生物是3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，所形成的氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺是通過測量645-650nM處的吸光度而測定的。
在可選擇性的實施方案中，所述檢測分子是一種熒光探針，如

圖1所示分子中的一種。
圖1 例如，可使用二氫羅丹明作為檢測分子。把這種非熒光化合物氧化成羅丹明，當在500nm處照射時，其在536nm處發(fā)射熒光。
更具體而言，本發(fā)明的方法包括在可能的髓過氧化物酶抑制劑存在的條件下，使髓過氧化物酶與過氧化氫反應(yīng)，產(chǎn)生次氯酸，并在含有氯化鈉和10mM?；撬岬倪m宜緩沖液中，使所有形成的次氯酸與牛磺酸反應(yīng)，形成?；撬崧劝?；
任選加入過氧化氫酶至濃度高達約20μg/mL，從而除去所有殘留的過氧化氫；在有碘化鉀存在的條件下，在含有3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺和10-20％二甲基甲酰胺的適宜緩沖液中，使所有形成的?；撬崧劝放c3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺反應(yīng)，形成氧化的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺；并測量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺的量。
可使用的緩沖液包括pH值5-8的適宜醋酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽緩沖液。緩沖液的濃度應(yīng)為至少10mM，優(yōu)選至少20mM。優(yōu)選與碘化鉀的反應(yīng)是在大約pH5.4進行的。
因此，在其中一個具體實施方案中，本發(fā)明的方法包括在可能的髓過氧化物酶抑制劑(在化合物溶劑DMSO中的濃度為1％)存在的條件下，使髓過氧化物酶(2.5nM)與過氧化氫(100μM)和氯化鈉(140mM)在pH6.5的20mM磷酸鹽緩沖液中反應(yīng)，產(chǎn)生次氯酸，并使所有形成的次氯酸與10mM牛磺酸反應(yīng)，形成?；撬崧劝罚煌ㄟ^加入溶解在二甲基甲酰胺中的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(10mM)，碘化鉀(100μM)和冰醋酸(400mM)而終止測定并顯色，其中的濃度為終濃度；然后測量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺的量。
在另一具體實施方案中，本發(fā)明的方法包括在可能的髓過氧化物酶抑制劑存在的條件下，使髓過氧化物酶(5-20nM)與過氧化氫(100μM)反應(yīng)，產(chǎn)生次氯酸，并在含有100mM氯化鈉和10mM?；撬岬膒H6.5的20mM磷酸鹽緩沖液中，使所有形成的次氯酸與?；撬岱磻?yīng)，形成牛磺酸氯胺；加入20μM/mL濃度的過氧化氫酶以除去所有殘留的過氧化氫；在有200μM碘化鉀存在的條件下，在含有2mM 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺和10-20％二甲基甲酰胺的pH5.4的200mM醋酸鈉緩沖液中，使所有形成的牛磺酸氯胺與3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺反應(yīng)，形成氧化的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺；并測量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺的量。
在另一具體實施方案中，本發(fā)明的方法包括在可能的髓過氧化物酶抑制劑存在的條件下，使髓過氧化物酶(2.7nM)與過氧化氫(50μM)在含有140mM氯化鈉和10mM牛磺酸的pH6.5的20mM磷酸鹽緩沖液中反應(yīng)；然后把該測定溶液(150μL)加入到96孔平板的各孔中；通過向各孔中加入50μl試劑而終止反應(yīng)并顯色，其中所述試劑含有溶解在50％二甲基甲酰胺中的10mM TMB，醋酸(400mM)和碘化鈉(100μM)；并測量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺的量。
在另一具體實施方案中，本發(fā)明的方法使用了一種pH6.5的含有20mM磷酸鈉/鉀緩沖液的測定緩沖液，其中所述磷酸鈉/鉀緩沖液含有10mM?；撬岷?00mM NaCl，還使用了一種顯色試劑，所述顯色試劑含有2mM TMB，200μM KI，含有20％DMF的pH4.5的200mM醋酸鹽緩沖液。
更具體的實施方案在下面的實施例部分中描述。
本發(fā)明克服了兩個特定的問題，即已知的牛磺酸氯胺測定法作為一種篩選可能酶抑制劑的方法，不能用于測量髓過氧化物酶的活性。首先，通常所用的溶劑二甲基亞砜會干擾這些測定，其次，很多試驗化合物在與發(fā)色團相同的區(qū)中光學(xué)吸收。
本發(fā)明是一種改進的?；撬崧劝窚y定法，其中二甲基亞砜所致的干擾減到了最小，而且試驗化合物不會對檢測過程造成光學(xué)干擾。
試驗化合物對純化的髓過氧化物酶的抑制已經(jīng)使用改進的測定法測量，所述改進的測定法可用于評估化合物抑制髓過氧化物酶的能力。此外，本發(fā)明滿足了高通量篩選(HTS)的要求。而且，本發(fā)明提供了一種檢測髓過氧化物酶抑制劑的方法，用于鑒定可能治療患有涉及MPO活性疾病的患者的化合物。
人們發(fā)現(xiàn)，在適宜的pH值下，由碘化物催化，利用?；撬崧劝费趸m宜的檢測分子，如3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺，可提供一種受二甲基亞砜(DMSO)干擾最小的測定法。當檢測分子是3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺時，形成一種藍色的產(chǎn)物，其在大約645nm處具有最大吸光度。
本發(fā)明的測定法對檢測次氯酸HOCl而言，是一種靈敏而且特異的方法。它還可用于測定試驗化合物抑制髓過氧化物酶的能力。它可特別用于HTS，鑒定髓過氧化物酶的抑制劑。
對于下面實施例3公開的具體實施方案而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有100mM氯化鈉和10mM?；撬?RNH2)的pH6.5的20mM磷酸鹽緩沖液(以下稱為PBST)可使過氧化氫對髓過氧化物酶的抑制達到最小，而且10mM濃度的?；撬嶙阋源_保產(chǎn)生的所有次氯酸(HOCl)(見下面的反應(yīng)1)作為牛磺酸氯胺(RNHCl)被捕獲(見下面的反應(yīng)2)。?；撬崧劝房稍谑覝胤€(wěn)定至少1小時。因此，為使由于與試驗化合物反應(yīng)而消耗的牛磺酸氯胺減到最少，對該測定法進行了設(shè)計，以使所產(chǎn)生的量約為試驗化合物濃度的5-10倍。
反應(yīng)1反應(yīng)2TMB可用作檢測分子。它以大約1mM的終濃度使用，這樣與氧化劑相比它就是過量存在的，從而保證其與?；撬崧劝芬?∶1的化學(xué)數(shù)量反應(yīng)。必須加入碘化鉀是因為它催化?；撬崧劝放cTMB之間的反應(yīng)，而且在沒有碘化物存在的條件下，反應(yīng)不會發(fā)生(見下面的反應(yīng)3和4)。大約5.4的pH值對于維持氧化的TMB的穩(wěn)定性是最佳的，而且可使?；撬崧劝费趸饣?。pH較低時，可以發(fā)生碘化物的非特異性氧化，pH較高時，碘化物的氧化較慢，而且氧化的TMB不太穩(wěn)定。
反應(yīng)3反應(yīng)4本發(fā)明的牛磺酸氯胺測定法包括兩個部分，一個是產(chǎn)生?；撬崧劝返倪^程，第二是氧化檢測分子，如TMB的過程。在第一個反應(yīng)中，髓過氧化物酶形成次氯酸，次氯酸與牛磺酸反應(yīng)，變成?；撬崧劝繁徊东@。在第二個反應(yīng)中，所形成的牛磺酸氯胺可用于定量氧化，例如TMB形成氧化的TMB。
作為一種驗證上述測定法的方法，可通過在含有140mM氯化鈉的pH7.4的10mM磷酸鹽緩沖液中，加入試劑HOCl和5.5mM?；撬岫a(chǎn)生牛磺酸氯胺。向?；撬崧劝分屑尤氲润w積的顯色試劑時，溶液變成藍色。產(chǎn)物的吸收光譜在500-700nm之間有一個較寬的峰，最大值出現(xiàn)在645nm處。經(jīng)測定，消光系數(shù)為14,520±330M-1cm-1。645nm處的吸光度與加入到PBST中的HOCl濃度成正比。
碘化物的最佳濃度是通過使用0-1mM濃度的碘化物測定的。當?shù)饣锏臐舛却笥?0μM時，所形成的氧化的TMB最多。
已知當通過把pH值降低至1而促進TMB氧化時，DMSO會干擾?；撬崧劝窚y定。因此測量了本發(fā)明測定法中，DMSO對TMB氧化的抑制。為了測量抑制，在加入56μM HOCl之前，向PBST(pH7.4)中加入各種濃度的DMSO。在加入等體積顯色試劑之前，該反應(yīng)一直進行10分鐘。人們發(fā)現(xiàn)，如果PBST中DMSO的濃度低于約1％，那么DMSO對?；撬崧劝窓z測的影響很小。
本發(fā)明的?；撬崧劝窚y定法可用于檢測由純化的人髓過氧化物酶產(chǎn)生的HOCl。把過氧化氫(10μM)加入到pH6.5的20mM磷酸鹽緩沖液中，所述磷酸鹽緩沖液含有20nM髓過氧化物酶，100mM NaCl和10mM牛磺酸。把混合物室溫溫育15分鐘，加入過氧化氫酶(10μM/ml)終止反應(yīng)。5分鐘后，加入顯色試劑，以檢測產(chǎn)生的牛磺酸氯胺。把產(chǎn)生的牛磺酸氯胺量與通過把100μM HOCl加入到PBST中形成的量進行比較。通過與HOCl標準比較，顯示有100μM過氧化氫轉(zhuǎn)化成了113μMHOCl。因此，在實驗誤差內(nèi)，所有的過氧化氫都轉(zhuǎn)化成了HOCl，然后作為?；撬崧劝繁徊东@。過氧化氫儲液的濃度是使用E240 43.6M-1cm-1測定的，次氯酸鹽儲液的濃度是使用E292 350M-1cm-1測定的。
研究確定在沒有氯化物存在的條件下TMB是否全部氧化。換句話說，是為了顯示TMB的氧化被限制在HOCl的最初形成，而且它不會被過氧化氫和髓過氧化物酶直接氧化。在沒有氯化物存在的條件下，未觀察到TMB的氧化，而且使用過氧化氫酶進行的進一步研究支持了這一觀察結(jié)果。
各種化合物影響髓過氧化物酶氯化活性的能力證實，本發(fā)明的測定法可測量HOCl的產(chǎn)生，而且該測定法適于發(fā)現(xiàn)酶的可能抑制劑。
在上述時間過程實驗的條件下，在有或沒有10μM試驗化合物存在時，利用髓過氧化物酶產(chǎn)生次氯酸。加入過氧化氫開始反應(yīng)，加入過氧化氫酶5分鐘后終止反應(yīng)。加入20μg/ml的過氧化氫酶可抑制90％HOCl的形成。
上述所有測定法也可任選在有酪氨酸存在的條件下進行。酪氨酸的適宜濃度約為5-20μM。
時間過程實驗顯示，酪氨酸可提高HOCl的產(chǎn)生，這是因為過氧化氫抑制髓過氧化物酶。該實驗還顯示可測量髓過氧化物酶的氯化活性，這是因為酪氨酸不會影響過氧化活性。這個結(jié)論可由氨苯砜的作用支持，已知其可抑制氯化活性，但不能抑制髓過氧化物酶的過氧化活性。進一步的實驗顯示，氨苯砜，ABAH，對-溴苯胺，和二甲氧基苯都可抑制HOCl的產(chǎn)生，其程度與在髓過氧化物酶氯化活性的其它測定法中顯示的相似。因此，本發(fā)明的測定法適于發(fā)現(xiàn)髓過氧化物酶的抑制劑。實驗還顯示，DMSO不會影響HOCl的檢測。結(jié)果在表1中給出。
表1純化的人髓過氧化物酶所致的HOCl產(chǎn)生的抑制劑
另一方面，本發(fā)明涉及上述測定法測量MPO活性水平，特別是在生物流體中的水平的用途。髓過氧化物酶的活性涉及很多炎性疾病，包括阿爾茨海默氏病，多發(fā)性硬化，哮喘，動脈粥樣硬化，癌癥，囊性纖維化，慢性阻塞性肺病，炎性腸病，和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。因此，本發(fā)明的測定法可用于在很多炎性疾病，包括神經(jīng)炎性疾病中尋找危險因子MPO。
嗜中性白細胞和其它吞噬細胞通過消耗NADPH時氧的一個電子還原而產(chǎn)生O2-(超氧)。絕大多數(shù)O2-自身反應(yīng)形成H2O2(過氧化氫)。這些試劑可形成大量高度反應(yīng)性的殺微生物氧化劑，包括HOCl(次氯酸)，它是利用H2O2通過髓過氧化物酶催化的Cl-氧化而產(chǎn)生的；OH(羥基)是利用Fe++或Cu+還原H2O2而產(chǎn)生的；ONOO-(過亞硝酸鹽)是通過O2-和NO之間的反應(yīng)形成的；還有很多其它的殺微生物氧化劑。這些反應(yīng)性氧化劑是為了殺死侵入的微生物而制造的，但它們也可損害近旁的組織，而且被認為是很多疾病的致病因素(B.M.Babior，Am.J.Med.，2000，109，33-44)。這些疾病包括阿爾茨海默氏病，多發(fā)性硬化，哮喘，動脈粥樣硬化，癌癥，囊性纖維化，慢性阻塞性肺病，炎性腸病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，肺氣腫，急性呼吸窘迫綜合征，再灌注損傷及惡性腫瘤。
MPO還涉及冠狀動脈疾病(Hazen等，JAMA，2001，286，2136-2142)。因此，本發(fā)明的測定法可用于在外周血嗜中性白細胞中尋找動脈粥樣硬化的危險因子MPO。
鑒定髓過氧化物酶抑制劑的測定法對于證實次氯酸對這種疾病發(fā)病機理的影響很重要，而且可作為診斷的工具。它們還可為研制抗髓過氧化物酶依賴性組織損害的有效藥物提供一個平臺。
現(xiàn)在，通過下列非限制性實施例舉例說明本發(fā)明。
實施例1在這里我們描述一種體外MPO測定法，它可用于評估對酶活性的抑制。實質(zhì)上，MPO測定法被設(shè)計用來測定次氯酸(HOCl)的產(chǎn)生，它是由酶體內(nèi)產(chǎn)生的關(guān)鍵生理產(chǎn)物。下面給出測定反應(yīng)的略圖
2.
3.
pH6.5的20mM磷酸鹽緩沖液中的反應(yīng)混合物含有2.5nM MPO(來源于Planta的純化的人類的酶)，100μM H2O2，140mM NaCl，10mM?；撬?，20μM酪氨酸和1％的化合物溶劑DMSO。在用H2O2開始反應(yīng)之前，用緩沖液中的MPO酶預(yù)溫育化合物大約15分鐘。整個反應(yīng)是室溫時，在96孔平板中進行10分鐘。加入終止/顯色試劑終止反應(yīng)，所述終止/顯色試劑含有溶解在二甲基甲酰胺中的TMB(10mM)，KI(100μM)和冰醋酸(400mM)，其中所述濃度為終濃度。所有試驗濃度都是進行至少兩次單獨的雙份測定而獲得的(除非另有說明，n＝2)?；衔锏囊种茲舛纫詐IC50表示，它是-log IC50。
已經(jīng)對于人的MPO測試了各種化合物。從中可以看出，氨苯砜是所試驗的砜類/磺胺類中最有效的抑制劑。吲哚和其它化合物也可有效阻斷人MPO所致的HOCl產(chǎn)生。砜類/磺胺類，吲哚，和各種化合物的所有數(shù)據(jù)分別在表2，3和4中給出。
表2砜類/磺胺類對人MPO-HOCl產(chǎn)生的抑制
表3吲哚對人MPO-HOCl產(chǎn)生的抑制
表4各種化合物對人MPO-HOCl產(chǎn)生的抑制
實施例2在這里，我們描述功能性人嗜中性白細胞測定法用于測定MPO抑制劑對HOCl產(chǎn)生作用的用途。該測定法可檢測HOCl從受刺激的(例如，PMA，LPS，fMLP，zymozan)人嗜中性白細胞的產(chǎn)生。人嗜中性白細胞是通過在Polymorphprep(Nycomed)上進行密度離心而從新鮮的肝素化血液中純化的。這些嗜中性白細胞可在純化后立即使用。標準的反應(yīng)混合物含有下列成分2×106個嗜中性白細胞，140mM NaCl，5mM?；撬幔?.5mM MgCl2，1mM CaCl2和1mg/ml葡萄糖。試驗化合物是在DMSO中配制的，并以0.5％的最終DMSO濃度加入到細胞中。在加入PMA刺激劑(1μg/ml)之前，37℃用嗜中性白細胞預(yù)溫育試驗化合物15分鐘。然后使測定于37℃再進行30分鐘。溫育結(jié)束時，離心收集上清液，并使用上述終止/顯色試劑測定HOCl。所有化合物都至少進行2次單獨的雙份測定，因為有2個不同的供體，所以n＝2。
其中一些抑制劑的數(shù)據(jù)在表5中給出。
表5受到刺激的人嗜中性白細胞對HOCl產(chǎn)生的抑制
我們還可看出，在所用的測定條件和抑制劑濃度下，人嗜中性白細胞不受細胞毒性的影響，這是通過乳酸脫氫酶從受損嗜中性白細胞的釋放而評估的。乳酸脫氫酶的活性是按照Boehringer MannheimGmbH，Sandhofer Strabe 116，D-68305 Mannheim，Germany(Cytotoxicity Detection Kit-LDH-Cat No1 644 793)所述測量的。
實施例3在這個實施例中，測定是這樣進行的在可能的髓過氧化物酶抑制劑存在的條件下，使髓過氧化物酶(5-20nM)與過氧化氫(100μM)反應(yīng)產(chǎn)生次氯酸，然后在含有100mM氯化鈉和10mM?；撬岬膒H6.5的磷酸鹽緩沖液中，使所有形成的次氯酸與?；撬岱磻?yīng)，形成?；撬崧劝?。然后加入過氧化氫酶至20μg/mL的濃度，除去所有殘留的過氧化氫。然后加入大約等體積的顯色試劑，即含有2mM TMB，200μM碘化鉀和10-20％二甲基甲酰胺的pH5.4的200nM醋酸鈉緩沖液。大約5分鐘后，利用吸收光譜法在大約645nM處測量所形成的氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺的量。
實施例4這次測定基本上是按照實施例3所述進行的，區(qū)別在于在可能的髓過氧化物酶抑制劑存在的條件下，使髓過氧化物酶(2.7nM)與過氧化氫(50μM)在含有140mM氯化鈉和10mM?；撬岬膒H6.5的20mM磷酸鹽緩沖液中反應(yīng)；然后把該測定溶液(150μl)加入到96孔平板的各孔中；通過向各孔中加入50μL試劑而終止反應(yīng)并顯色，其中所述試劑含有溶解在50％二甲基甲酰胺中的10mM TMB，醋酸(400mM)和碘化鈉(100μM)；然后測量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺的量。
實施例4所述測定法的靈敏度和穩(wěn)定性是如下確立的。把各種濃度的HOCl加入到含有10mM?；撬岬?0mM磷酸鹽緩沖液中，產(chǎn)生?；撬崧劝贰０?50μl溶液加入到96孔平板中后，再加入50μl顯色試劑。混合后，立即對平板讀數(shù)(A650)，1小時后測定靈敏度和產(chǎn)物的穩(wěn)定性。
結(jié)果在圖2中表示。
圖2.使用碘化物催化的TMB測定法檢測HOCl的標準曲線。A650分別是在混合后立即讀數(shù)的(●)，以及在1小時后讀數(shù)的(■)。
從圖2可以看出，當在96孔平板中進行時，TMB測定法可很容易地檢測10μM HOCl。在各濃度下，室溫1小時后，產(chǎn)物仍然非常穩(wěn)定，減少不到10％。
MPO產(chǎn)生HOCl的時間曲線在圖3中表示。
圖3.MPO產(chǎn)生HOCl的時間曲線從圖3可以很明顯地看出，在上述反應(yīng)條件下，H2O2到HOCl的轉(zhuǎn)化進行大約30分鐘。曲線的形狀表明，H2O2很少產(chǎn)生抑制。通過比較圖2&3，很明顯MPO可把所有的H2O2轉(zhuǎn)化成HOCl。因此無需加入任何過氧化氫酶來除去過量的H2O2。
反應(yīng)的顏色在5分鐘的時候，只比1小時后增加了6％。這表明，加入顯色試劑可防止MPO產(chǎn)生更多的HOCl，并防止直接氧化TMB。
實施例5測定緩沖液含有10mM?；撬岷?00mM NaCl的pH6.5的20mM磷酸鈉/鉀緩沖液。
顯色試劑2mM TMB，200μMKI，含有20％DMF的pH5.4的200mM醋酸鹽緩沖液。
室溫時，向10μl稀釋在測定緩沖液中的化合物中加入40μl MPO(終濃度2.5nM)10分鐘。然后室溫加入50μl H2O2(終濃度100μM)，或加入作為對照的單獨的測定緩沖液10分鐘。在加入100μl TMB顯色試劑(含有20％二甲基甲酰胺(DMF)和200μM KI的pH5.4的200mM醋酸鹽緩沖液中，TMB的濃度為2mM)之前，通過加入10μl 0.2mg/ml的過氧化氫酶(終濃度18μg/ml)5分鐘而終止反應(yīng)?；旌掀桨?，隨后在650nm處讀數(shù)。
使用實施例5所述的測定法，在沒有酪氨酸存在的條件下，對照化合物氨苯砜的IC50值為257±73nM，在有8μM酪氨酸存在的條件下，其IC50值為7120±610nM。另一個對照化合物，4-氨基苯甲酸酰肼(ABAH)在沒有酪氨酸存在條件下的IC50值為86±6nM，在有8μM酪氨酸存在條件下的IC50值為118±8nM。
實施例6該實施例描述了一種使用二氫羅丹明作為檢測分子的測定法，其適于使用384孔平板進行高通量篩選(HTS)。
測定結(jié)構(gòu)酶溶液110ml pH6.5的200mM NaH2PO4(20mM終濃度)110ml 1.4M NaCl (140mM終濃度)110ml 100mM?；撬?(10mM終濃度)2.75ml 10mM酪氨酸 (25μM終濃度)275μl 10μM MPO (25nM終濃度)用蒸餾水補足至1100ml底物溶液 110ml pH6.5的200mM NaH2PO4(20mM終濃度)110ml 1.4M NaCl (140mM終濃度)110ml 100mM?；撬?(10mM終濃度)20μl 8.8M H2O2(160μM終濃度)用蒸餾水補足至1100ml檢測溶液 110ml pH6.5的200mM NaH2PO4(20mM終濃度)110ml 1.4M NaCl (140mM終濃度)110ml 100mM?；撬?(10mM終濃度)220ml DMSO(20％終濃度)16.5ml 20mM KI(300μM終濃度)8ml 72.5mM二氫羅丹明 (527.3μM終濃度)
用蒸餾水補足至1100ml陰性對照20ml 10mM氨苯砜(1mM終濃度)用蒸餾水補足至200ml化合物的稀釋物是用5％DMSO/H2O制備的，化合物在5μl中的濃度為110μM。
陽性和陰性對照含有0.4μl DMSO賦形劑，并用化合物稀釋。在稀釋完平板后，向陰性對照孔中加入5μl 1mM對照化合物氨苯砜。
過程向每個平板的所有孔中加入25μl酶溶液；然后預(yù)溫育平板45分鐘；向每個平板的所有孔中加入25μl底物溶液；然后溫育平板15分鐘；向每個平板的所有孔中加入25μl檢測溶液；然后通過閱讀熒光強度而對平板計數(shù)(485nm激發(fā)，530nm發(fā)射，505nm二色)實施例7用于診斷用途的測定MPO活性的測定法還可對急性炎癥患者含有MPO的組織樣血液，血液的細胞部分，唾液或分離組織進行。對于這種類型的測定法而言，優(yōu)選使用葡萄糖氧化酶以大約10μM/分鐘的速率產(chǎn)生過氧化氫，然后在5-10分鐘后，使用顯色試劑終止反應(yīng)。以這種方法，所述測定法提供了一種簡單的診斷試驗，因此所獲得的信息可廣泛用于評估多種炎性疾病中的危險因子MPO。
權(quán)利要求
1.一種鑒定髓過氧化物酶(MPO)抑制劑的方法，該方法包括在有所述髓過氧化物酶的可能抑制劑存在的條件下，使髓過氧化物酶與過氧化氫和氯化物源反應(yīng)，產(chǎn)生次氯酸；使所有形成的次氯酸與適宜的胺反應(yīng)，形成相應(yīng)的氯胺；任選除去所有未反應(yīng)的過氧化氫；在有碘化物存在的條件下，使所有形成的氯胺與適宜的檢測分子反應(yīng)，形成氧化的檢測分子；通過在適宜的波長下測量吸光度或熒光而測定所形成的氧化檢測分子的量；把引起所形成的氧化檢測分子的量降低的那些化合物鑒定為髓過氧化物酶的抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測分子是3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述胺是?；撬帷?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)與牛磺酸氯胺的反應(yīng)是在大約pH 5.4，有碘化物存在的條件下進行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項所述的方法，其中所有未反應(yīng)的過氧化氫是用過氧化氫酶除去的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項所述的方法，它是作為高通量篩選進行的。
7.權(quán)利要求1-6任何一項所述的方法用于髓過氧化物酶活性的診斷試驗的用途。
全文摘要
一種檢測髓過氧化物酶抑制劑的測定法，該方法包括在有所述髓過氧化物酶的可能抑制劑存在的條件下，使髓過氧化物酶與過氧化氫和氯化物源反應(yīng)，產(chǎn)生次氯酸；使所有形成的次氯酸與適宜的胺反應(yīng)，形成相應(yīng)的氯胺；任選除去所有未反應(yīng)的過氧化氫；在有碘化物存在的條件下，使所有形成的氯胺與適宜的檢測分子反應(yīng)，形成氧化的檢測分子；通過在適宜的波長下測量吸光度或熒光而測定所形成的氧化檢測分子的量；把引起所形成的氧化檢測分子的量降低的那些化合物鑒定為髓過氧化物酶的抑制劑。還公開了髓過氧化物酶活性的診斷試驗。
文檔編號C12N9/08GK1507495SQ02809553
公開日2004年6月23日 申請日期2002年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月8日
發(fā)明者A·凱特爾, A 凱特爾 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司