專(zhuān)利名稱(chēng)：?jiǎn)?dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能夠方便地以低成本及高水平表達(dá)目的基因產(chǎn)物的新啟動(dòng)子，且涉及一種用該啟動(dòng)子生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
表達(dá)系統(tǒng)用來(lái)根據(jù)目的，通過(guò)基因工程來(lái)生產(chǎn)有用的基因產(chǎn)物。在所述表達(dá)系統(tǒng)方面，使用已建立了其培養(yǎng)技術(shù)的諸如微生物細(xì)胞(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母等等)、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和植物細(xì)胞的宿主以及適合于所述宿主的啟動(dòng)子。在這些表達(dá)系統(tǒng)中，使用大腸桿菌作為宿主且用lac啟動(dòng)子或其衍生物的一種表達(dá)系統(tǒng)，由于操作上的方便因而是最常用的系統(tǒng)之一。
然而，使用lac啟動(dòng)子或其衍生物的表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)在于工業(yè)上它是不便的；因?yàn)樗枰T導(dǎo)基因表達(dá)來(lái)表達(dá)基因產(chǎn)物。例如，誘導(dǎo)由lac啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子或諸如此類(lèi)的啟動(dòng)子進(jìn)行基因表達(dá)，則需要使用一種昂貴的試劑——異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。因此，這樣的系統(tǒng)的缺點(diǎn)在于它對(duì)工業(yè)規(guī)模的操作不利。
同樣，使用一種利用來(lái)源于木糖操縱子的啟動(dòng)子且用芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌作為宿主的表達(dá)系統(tǒng)。但是，該系統(tǒng)對(duì)工業(yè)規(guī)模的操作不利，因?yàn)樗枰砑幽咎莵?lái)誘導(dǎo)表達(dá)。
通常使用利用λ噬菌體啟動(dòng)子的溫度誘導(dǎo)的表達(dá)載體。
然而，通過(guò)溫度誘導(dǎo)過(guò)量表達(dá)重組基因產(chǎn)物在下列方面可能是不利的(a)難以快速完成溫度的加速，(b)由于培養(yǎng)溫度較高，形成不溶性?xún)?nèi)涵體的可能性增加，以及
(c)熱激時(shí)在大腸桿菌中誘導(dǎo)幾種蛋白酶。
已知枯草桿菌作為穩(wěn)定期特異性的反應(yīng)，產(chǎn)生及分泌許多分解代謝酶，例如淀粉酶和蛋白酶。如果宿主能夠利用穩(wěn)定期特異性的表達(dá)機(jī)制而僅僅在宿主生長(zhǎng)完全后的穩(wěn)定期期間表達(dá)基因，則可能減少該宿主的負(fù)擔(dān)，且可能有效地表達(dá)外源基因。但是，尚未建立利用這樣一種機(jī)制的基因表達(dá)技術(shù)。
因此，希望有無(wú)需人工誘導(dǎo)基因表達(dá)而能夠有效表達(dá)的技術(shù)。
發(fā)明目的本發(fā)明主要目的是提供無(wú)需人工誘導(dǎo)基因表達(dá)而能夠以穩(wěn)定期特異性方式以高水平表達(dá)基因的啟動(dòng)子、重組DNA、基因表達(dá)用載體、表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及提供一種可方便而低成本地實(shí)施的、生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法以及一種供該方法用的試劑盒。
發(fā)明概述概述本發(fā)明如下[1]一種分離的DNA，所述分離的DNA選自(a)具有SEQ ID NO1-6中的任何一種的核苷酸序列的、在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中以穩(wěn)定期特異性方式顯示出啟動(dòng)子活性的分離的DNA或其片段，和(b)在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下可與(a)的DNA或其片段雜交的、在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中以穩(wěn)定期特異性方式顯示出啟動(dòng)子活性的分離的DNA；[2]按照[1]的分離的DNA，所述分離的DNA在被置于外源基因的上游時(shí)，則能夠在沒(méi)有誘導(dǎo)物的情況下以穩(wěn)定期特異性方式使該外源基因表達(dá)；[3]一種重組DNA，其中由[1]限定的DNA和外源基因的配置使得所述外源基因可以表達(dá)；[4]按照[3]的重組DNA，其中所述外源基因?yàn)檫x自編碼蛋白質(zhì)的核酸、編碼反義RNA的核酸以及編碼核酶的核酸的核酸；[5]一種基因表達(dá)用載體，所述載體包含由[1]限定的DNA；[6]按照[5]的基因表達(dá)用載體，其中所述載體是選自質(zhì)粒載體、噬菌體載體和病毒載體的一種載體；[7]一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含由[3]限定的重組DNA；[8]按照[7]的表達(dá)載體，其中所述載體是選自質(zhì)粒載體、噬菌體載體和病毒載體的一種載體；[9]一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞含有由[3]限定的重組DNA或由[7]限定的表達(dá)載體；[10]一種用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括培養(yǎng)由[9]限定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；并從所產(chǎn)生的培養(yǎng)物中收集蛋白質(zhì)，以及[11]一種用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒含有由[1]限定的DNA或由[5]限定的表達(dá)基因用載體。
發(fā)明詳述可以將來(lái)源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) DB104(Gene，83215-233(1989))的、含有一種位于一種以穩(wěn)定期特異性方式表達(dá)的基因之可讀框(ORF)上游的元件、且顯示出啟動(dòng)子活性的DNA用作本發(fā)明的DNA。本發(fā)明基于本發(fā)明人的意外發(fā)現(xiàn)——如果將外源基因(也稱(chēng)為目的基因)置于所述DNA的下游，則在沒(méi)有表達(dá)誘導(dǎo)物的情況下，可以高水平(即每升培養(yǎng)基100-500mg)地表達(dá)目的基因的產(chǎn)物。
本發(fā)明的DNA包括具有SEQ ID NO1-6的核苷酸序列的DNA。本發(fā)明的DNA優(yōu)選是在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中以穩(wěn)定期特異性方式顯示出啟動(dòng)子活性的分離的DNA，更優(yōu)選是在下面描述的在芽孢桿菌屬細(xì)菌或大腸桿菌中以穩(wěn)定期特異性方式顯示出啟動(dòng)子活性的分離的DNA。
按照本發(fā)明，“啟動(dòng)子”包括位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(+1)上游約10-30個(gè)堿基對(duì)的一個(gè)Pribnow框、一個(gè)TATA框或一個(gè)類(lèi)似于TATA框的區(qū)域，且負(fù)責(zé)使RNA聚合酶能從正確位置開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的功能。所述啟動(dòng)子不一定限制于這樣的區(qū)域或周?chē)鷧^(qū)域，而是除了該區(qū)域外，所述啟動(dòng)子還可包含結(jié)合除RNA聚合酶之外的蛋白質(zhì)結(jié)合所必需的供控制表達(dá)用的區(qū)域。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子區(qū)”是指包含按照本發(fā)明的啟動(dòng)子的區(qū)域。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子活性”表示當(dāng)把通過(guò)將基因置于啟動(dòng)子下游使得能夠表達(dá)該基因而獲得的構(gòu)成物引入到宿主中時(shí)，所述啟動(dòng)子具有在該宿主內(nèi)或在宿主之外生產(chǎn)該基因的表達(dá)產(chǎn)物的能力與功能。
通常，可以用包括下述步驟的方法來(lái)測(cè)量“啟動(dòng)子活性”，該方法包括(1) 將待測(cè)量的DNA連接到編碼可被容易地定量或觀測(cè)的蛋白之基因(在下文也稱(chēng)之為報(bào)道基因)上游的步驟；(2) 將所產(chǎn)生的構(gòu)成物引入到宿主中的步驟；(3) 培養(yǎng)所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化細(xì)胞從而表達(dá)該蛋白的步驟；以及(4) 測(cè)量所表達(dá)的蛋白量的步驟。例如，通過(guò)將假定具有啟動(dòng)子序列的一段序列連接到報(bào)道基因的上游，將所述構(gòu)成物引入到宿主中，并觀測(cè)該宿主內(nèi)或宿主外所述基因產(chǎn)物的表達(dá)；則可以測(cè)定“啟動(dòng)子活性”的存在。表達(dá)的觀測(cè)值作為所述啟動(dòng)子在所導(dǎo)入的宿主中的啟動(dòng)子活性的一個(gè)指標(biāo)。
當(dāng)用于本文時(shí)，“穩(wěn)定期特異性啟動(dòng)子”是指僅僅在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后的穩(wěn)定期期間指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。“穩(wěn)定期特異性啟動(dòng)子”可以只在穩(wěn)定期期間、在沒(méi)有用誘導(dǎo)物例如IPTG誘導(dǎo)的情況下，表達(dá)置于所述啟動(dòng)子下游的基因。
只要具有SEQ ID NO1-6的核苷酸序列的分離DNA的片段以穩(wěn)定期特異性方式顯示出啟動(dòng)子活性，則本發(fā)明的DNA包括這樣的分離DNA的片段。可以適當(dāng)?shù)剡x擇“片段”，使得該片段以穩(wěn)定期特異性方式顯示出啟動(dòng)子活性。用上述的包括步驟(1)至(4)的方法，則可選擇這樣的片段。
本發(fā)明的DNA還包括具有在SEQ ID NO1-6的任一種核苷酸序列中至少一個(gè)核苷酸且特別是一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸被取代、缺失、插入或添加的核苷酸序列、且具有穩(wěn)定期特異性方式的啟動(dòng)子活性的DNA。一般而言，如果具有短序列的DNA有至少一個(gè)核苷酸的突變(取代、缺失、插入或添加)，則該DNA的活性可能被改變。然而，如果用上述的包括步驟(1)至(4)的方法觀測(cè)到“有突變的DNA”以穩(wěn)定期特異性方式的啟動(dòng)子活性，則本發(fā)明包括所述“有突變的DNA”。所述突變或者可以是天然發(fā)生的突變，或者可以是人工引入的突變。
可按照常規(guī)的定點(diǎn)誘變法等等，來(lái)引入人工突變。可使用的定點(diǎn)誘變法的實(shí)例包括利用琥珀突變的缺口雙鏈體法(Nucleic AcidsResearch，129441-9456(1984))，利用dut(dUTP酶)基因和ung(尿嘧啶-DNA糖基化酶)基因缺陷之宿主的Kunkel法(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the USA，82488-492(1985))以及利用琥珀突變的PCR法(WO 98/02535)。
本發(fā)明也包括這樣的分離的DNA，所述分離的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下可與本發(fā)明DNA的互補(bǔ)鏈雜交，或者例如用基于本發(fā)明DNA而按照常規(guī)方法設(shè)計(jì)并化學(xué)合成的寡核苷酸探針或引物而獲得，且最好在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，具有穩(wěn)定期特異性方式的啟動(dòng)子活性例如，用上述的包括步驟(1)至(4)的方法觀測(cè)到穩(wěn)定期特異性方式的啟動(dòng)子活性的DNA，可以被選擇作為這樣的DNA。只要所述寡核苷酸探針在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與所述DNA雜交或與具有互補(bǔ)于所述DNA的核苷酸序列的DNA雜交，那么對(duì)于所述寡核苷酸探針的核苷酸序列則沒(méi)有特別的限制。
“嚴(yán)謹(jǐn)性條件”的示例為文獻(xiàn)例如Sambrook等，Molecular cloning，A laboratory manual 2ndedition，1989，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述的那些嚴(yán)謹(jǐn)性條件。例如，嚴(yán)謹(jǐn)性條件為在含有6×SSC(1×SSC0.15 M NaCl、0.015 M檸檬酸鈉，pH 7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt’s(0.1％的牛血清白蛋白(BSA)、0.1％的聚乙烯吡咯烷酮、0.1％的Ficoll 400)和100μg/ml鮭精DNA的溶液中，于所用探針的Tm-25℃的溫度，保溫過(guò)夜。
只要所述引物在常規(guī)PCR所用的條件下能夠退火到所述DNA或具有互補(bǔ)于所述DNA的核苷酸序列的DNA上，從而起始用DNA聚合酶的延伸反應(yīng)，那么對(duì)于所述引物的核苷酸序列也沒(méi)有特別的限制。
例如按照下面的公式，可確定寡核苷酸探針或引物的TmTm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)其中，N是寡核苷酸探針或引物的鏈長(zhǎng)，％G+C為寡核苷酸探針或引物中鳥(niǎo)嘌呤殘基加胞嘧啶殘基的含量。
如果寡核苷酸探針或引物的鏈長(zhǎng)少于18個(gè)核苷酸，則可以估算Tm；例如，按殘基A+T(腺嘌呤加胸腺嘧啶)數(shù)目乘以2(℃)之積與殘基G+C殘基數(shù)目乘以4(℃)之積的和，即[(A+T)×2+(G+C)×4]，來(lái)估算Tm。
雖然并不打算限制本發(fā)明，但為了避免非特異性的雜交或退火，理想的是寡核苷酸探針或引物的鏈長(zhǎng)優(yōu)選為6個(gè)或6個(gè)以上的核苷酸、更優(yōu)選為10個(gè)或10個(gè)以上的核苷酸。而且，考慮到寡核苷酸的合成，理想的是所述長(zhǎng)度優(yōu)選為100個(gè)或100個(gè)以下的核苷酸、更優(yōu)選為30個(gè)或30個(gè)以下的核苷酸。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，寡核苷酸的設(shè)計(jì)是已知的，例如可參照Labo Manual PCR，第13-16頁(yè)，1996(Takara Shuzo)。另一方面，可使用市售的軟件，例如OLIGOTMPrimer Analysis軟件(Takara Shuzo)。
可按照已知的方法來(lái)合成寡核苷酸。例如，可以按照亞磷酰胺法，用394型DNA合成儀(Applied Biosystems)來(lái)合成寡核苷酸。另一方面，為了合成，可以用磷酸三酯法、H-膦酸酯法、硫代膦酸酯法等等。
使用本發(fā)明的DNA，提供一種重組DNA；在所述重組DNA中，本發(fā)明DNA和外源基因的配置使得可以表達(dá)所述外源基因。本發(fā)明包括這樣的重組DNA。
外源基因的實(shí)例包括但不限于編碼蛋白質(zhì)(例如酶、細(xì)胞因子或抗體)的核酸、編碼反義RNA的核酸以及編碼核酶的核酸。所述外源基因之起源的實(shí)例包括但不限于微生物(例如細(xì)菌、酵母、放線(xiàn)菌、絲狀真菌、子囊菌和擔(dān)子菌)、植物、昆蟲(chóng)和動(dòng)物。此外，可以隨目的而定，使用人工合成的基因。
具體地講，外源基因的實(shí)例包括但不限于白介素(IL)1至12的基因，干擾素(IFN)α、β和γ的基因，腫瘤壞死因子(TNF)的基因，集落刺激因子(CSF)的基因，促紅細(xì)胞生成素的基因，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β的基因，免疫球蛋白(Ig)的基因，組織纖溶酶原激活物(t-PA)的基因，尿激酶的基因以及Western firefly熒光素酶的基因。
當(dāng)用于本文時(shí)，“核酶”是指切割特定蛋白的mRNA從而阻止所述蛋白翻譯的核酸。可以在編碼特定蛋白的基因序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)核酶。例如，用FEBS Letter，228228-230(1988)中描述的方法，可制備錘頭型核酶。按照本發(fā)明的核酶包括切割特定蛋白的mRNA從而阻止所述蛋白翻譯的任何一種核酶，而不管所述核酶的類(lèi)型(例如錘頭型、發(fā)夾型或三角形)。
即使不人工誘導(dǎo)基因的表達(dá)，本發(fā)明的DNA也顯示出能夠高水平表達(dá)基因的啟動(dòng)子活性。因此，對(duì)于作為編碼蛋白質(zhì)之核酸的外源基因的表達(dá)，本發(fā)明DNA是特別優(yōu)選的。
此外，用本發(fā)明的DNA，提供一種含有本發(fā)明DNA的基因表達(dá)用載體。本發(fā)明則包括這樣的基因表達(dá)用載體。
用本發(fā)明的基因表達(dá)用載體，有可能以每升培養(yǎng)基100-500mg的水平表達(dá)蛋白質(zhì)(作為目的基因產(chǎn)物的一個(gè)實(shí)例)；因?yàn)樗鲚d體包含本發(fā)明的DNA?？梢匀菀椎?、根據(jù)預(yù)期效用而表達(dá)目的基因產(chǎn)物。
可以將質(zhì)粒載體、噬菌體載體或病毒載體或者構(gòu)成所述載體一部分的載體片段，用作本發(fā)明的基因表達(dá)用載體中的載體?？梢愿鶕?jù)待用作宿主的細(xì)胞，適當(dāng)?shù)剡x擇所述載體或載體片段。
對(duì)于可被用作宿主的細(xì)胞，則沒(méi)有特別的限制。例如，可以用革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的實(shí)例包括已建立了轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的芽孢桿菌屬的細(xì)菌。雖然并不打算限制本發(fā)明，但具體可使用枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus tearothermophilus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)或種名未定的芽孢桿菌(Bacillus sp.)。可以將通過(guò)誘變這樣的芽孢桿菌屬細(xì)菌而獲得的細(xì)菌用作宿主。同樣，可以將大腸桿菌用作宿主。已建立了大腸桿菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，產(chǎn)生了具有不同基因型的大腸桿菌細(xì)胞，并且它們都是容易得到的。因此，大腸桿菌被廣泛地用作轉(zhuǎn)化的宿主。雖然并不打算限制本發(fā)明，但具體的實(shí)例包括來(lái)源于大腸桿菌K-12的菌株HB101、C600、JM109、DH5α、DH10B、XL-1BlueMRF’和TOP10F?？梢詫⑼ㄟ^(guò)誘變這樣的大腸桿菌細(xì)胞而獲得的菌株用作宿主。
如果將枯草桿菌屬的細(xì)菌用作宿主，則所述載體的實(shí)例包括質(zhì)粒載體例如pHY、pUB110和pE194，以及噬菌體載體例如105和Spβ。如果用大腸桿菌作為宿主，則所述載體的實(shí)例包括質(zhì)粒載體例如pUC18、pUC19、pBluescript和pET，以及噬菌體載體例如λ噬菌體載體(例如λgt10和λgt11)。通過(guò)適當(dāng)選擇這樣的載體，并使本發(fā)明的DNA結(jié)合到所述載體中，則可構(gòu)建能夠以穩(wěn)定期特異性方式表達(dá)外源基因的本發(fā)明的基因表達(dá)用載體。
為了構(gòu)建本發(fā)明的基因表達(dá)用載體，可以使用Molecular cloning，Alaboratory manual 2nd(上述)中描述的或諸如此類(lèi)的技術(shù)。另一方面，例如可按照下面實(shí)施例中描述的構(gòu)建步驟來(lái)進(jìn)行構(gòu)建。
本發(fā)明的基因表達(dá)用載體可包含一個(gè)終止子(例如rrnBT1T)、一個(gè)選擇標(biāo)記基因等等。
選擇標(biāo)記基因包括氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因。
本發(fā)明的基因表達(dá)用載體可以根據(jù)目的基因產(chǎn)物的預(yù)期效用而包含下述元件。例如，為了簡(jiǎn)化分離目的基因產(chǎn)物的步驟，所述載體可包含一段能夠以與異源蛋白(例如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶或麥芽糖結(jié)合蛋白)的融合蛋白形式表達(dá)的序列；或可包含一段能夠以添加了組氨酸尾或諸如此類(lèi)的蛋白形式表達(dá)的標(biāo)志序列。
此外，本發(fā)明提供一種包含上述重組DNA的表達(dá)載體。這樣的表達(dá)載體被本發(fā)明所包括。本發(fā)明的表達(dá)載體包括通過(guò)使目的基因結(jié)合到上述基因表達(dá)用載體中而獲得的構(gòu)成物。
可以將上面關(guān)于基因表達(dá)用載體而描述的載體用于本發(fā)明的表達(dá)載體。
通過(guò)(a)使所述重組DNA結(jié)合到一種合適的載體中，(b)使目的基因結(jié)合到一種基因表達(dá)用載體中，或(c)將目的基因連接到基因表達(dá)用的載體片段上，則可構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)載體。
用本發(fā)明的重組DNA或表達(dá)載體，同樣可以提供含有所述重組DNA或所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
可將上面描述的“可用作宿主的細(xì)胞”用作宿主。
例如，可按照在下述文獻(xiàn)中描述的方法，將重組DNA引入到宿主中；所述下述文獻(xiàn)即Idenshikougaku Jikken，第12-23頁(yè)，JapanRadioisotope Association(編輯)(1991)；Virology，52456(1973)；Molecular and Cellular Biology，72745(1987)；Journal of the NationalCancer Institute，41351(1968)；或EMBO Journal，1841(1982)。
例如，可按照自發(fā)感受態(tài)法(Idenshikougaku Jikken，第12-23頁(yè)，Japan Radioisotope Association(編輯)(1991))、磷酸鈣法(Molecular andCellular Biology，72745(1987))、電穿孔法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，817161(1984))、DEAE-葡聚糖法(Methods in Nucleic Acids Research，第283頁(yè)，Karam等(編輯)(1991)CRC Press)或脂質(zhì)體法(BioTechniques，6682(1989))，將表達(dá)載體引入到宿主中。
使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，提供一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、且從所產(chǎn)生的培養(yǎng)物中收集蛋白質(zhì)。本發(fā)明包括這樣的“生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法”。
具體地講，可以用包括下述步驟的方法來(lái)生產(chǎn)蛋白質(zhì)(I)用下述(a)或(b)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的步驟，(a)一種重組DNA，其中編碼蛋白質(zhì)的核酸置于本發(fā)明DNA的下游，使得所述核酸可被表達(dá)；或(b)一種包含所述重組DNA的載體；以及(II)培養(yǎng)按(I)而獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞、并從所產(chǎn)生的培養(yǎng)物中收集蛋白質(zhì)的步驟。
可根據(jù)用作宿主的細(xì)胞、待表達(dá)蛋白的性質(zhì)等等，適當(dāng)?shù)剡x擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。
可以用常規(guī)的純化蛋白質(zhì)的方法來(lái)純化如此獲得的蛋白質(zhì)。這樣的純化方法的實(shí)例包括鹽析、離子交換層析、疏水層析、親和層析以及凝膠過(guò)濾層析。
可構(gòu)建生產(chǎn)蛋白質(zhì)用的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的DNA或者本發(fā)明的基因表達(dá)用載體，所述試劑盒可以用于本發(fā)明的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。用這樣的試劑盒，可更方便地生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
實(shí)施例下面的實(shí)施例更詳細(xì)地闡明了本發(fā)明，但不應(yīng)解釋為這些實(shí)施例限制本發(fā)明的范圍。
下面描述了按照本發(fā)明使用的枯草芽孢桿菌菌株之間的關(guān)系及其特性。
枯草芽孢桿菌Marburg 168在重組DNA實(shí)驗(yàn)中通常用作枯草芽孢桿菌宿主之菌株的親代菌株。
枯草芽孢桿菌DB104枯草芽孢桿菌Marburg 168的衍生菌株中的一種需要組氨酸的菌株。除所述輔源營(yíng)養(yǎng)之外的突變(nprR2、nprE18、aprED3)與UOT1285的相應(yīng)突變是等同的。
枯草芽孢桿菌UOT1285枯草芽孢桿菌Marburg 168的衍生菌株中的一種需要色氨酸和賴(lài)氨酸的菌株。除所述輔源營(yíng)養(yǎng)之外的突變(nprR2、nprE18、aprED3)與DB104的相應(yīng)突變是等同的。
實(shí)施例1用枯草芽孢桿菌DNA芯片篩選以穩(wěn)定期特異性方式表達(dá)的基因使用枯草芽孢桿菌基因組之?dāng)?shù)據(jù)庫(kù)(http//genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)中的DNA序列信息，來(lái)設(shè)計(jì)PCR的引物；使得對(duì)枯草芽孢桿菌的所有可讀框，都可擴(kuò)增出幾乎全長(zhǎng)的可讀框。用這些引物、來(lái)自枯草芽孢桿菌Marburg 168的基因組DNA(Molecular & General Genetics，15265-69(1977))以及TaKaRaEx Taq(Takara Shuzo)或TaKaRa Z-Taq(Takara Shuzo)，在96孔板中進(jìn)行PCR。
純化所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢查純度和大??；然后，通過(guò)測(cè)量每個(gè)樣品的吸光度，來(lái)計(jì)算所述DNA的濃度。
通過(guò)異丙醇沉淀而濃縮如此獲得的DNA片段的溶液。按照WO00/26404中描述的方法，濃度分別為1.0μg/mL的各種DNA片段固定到載玻片上，從而制備DNA芯片。
在50ml的2×SG(1.6％的營(yíng)養(yǎng)肉湯、0.05％的MgSO4·7H2O、0.2％KCl、1mM的Ca(NO3)2·4H2O、0.1mM MnCl2·4H2O、0.001mM的FeSO4·7H2O、0.1％的葡萄糖)中于37℃培養(yǎng)枯草芽孢包桿菌UOT1285(Journal of General Microbiology，1351335-1345(1989))。在培養(yǎng)開(kāi)始后的3小時(shí)、4小時(shí)或5小時(shí)，取出一部分培養(yǎng)物；并通過(guò)離心收集細(xì)胞。將如此獲得的細(xì)胞懸浮于TRIZOL Reagent(Gibco BRL)中。向所述懸浮液中添加玻璃珠。用Mini-BeadBeater(Biospec Products)破裂細(xì)胞。按照TRIZOL Reagent所附帶的方案，通過(guò)氯仿抽提及異丙醇沉淀，來(lái)回收RNA。用無(wú)RNA酶的DNA酶I(Takara Shuzo)處理所回收的RNA，然后，通過(guò)苯酚/氯仿抽提，繼之以乙醇沉淀，來(lái)回收RNA。結(jié)果獲得約90-100μg的RNA。將所述RNA用作作為模板的RNA。
用15μg按上面描述方法制備的作為模板的RNA和Cy3-dUTP(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，以制備Cy3-標(biāo)記的cDNA探針。
使按照上述方法制備的DNA芯片于室溫下在預(yù)雜交溶液(4×SSC、0.2％SDS、5×Denhardt溶液、1mg/ml變性鮭精DNA)中預(yù)雜交2小時(shí)，用2×SSC洗滌，繼之以用0.2×SSC洗滌，然后干燥。接著，使用按上述方法制備的Cy3-標(biāo)記的cDNA探針，在雜交溶液中于65℃進(jìn)行雜交過(guò)夜；所述雜交溶液除了變性鮭精DNA濃度變?yōu)?.1mg/ml外，其組成與預(yù)雜交溶液的組成相同。雜交之后，用含有0.2％SDS的2×SSC于55℃洗滌所述DNA芯片達(dá)30分鐘(兩次)，并于65℃將其洗滌5分鐘(一次)，且在0.05×SSC中于室溫洗滌5分鐘；然后干燥。
用DNA芯片分析儀Affymetrix 418 Array Scanner(Affymetrix)，對(duì)經(jīng)過(guò)雜交的DNA芯片進(jìn)行熒光檢測(cè)。將通過(guò)熒光檢測(cè)而獲得的信號(hào)強(qiáng)度如下以固相中的色階表示藍(lán)色＜綠色＜黃色＜橙黃色＜紅色＜白色。
用表達(dá)數(shù)據(jù)分析軟件ImaGene(BioDiscovery)，按照所述軟件所附的說(shuō)明書(shū)，對(duì)如此獲得的圖象數(shù)據(jù)進(jìn)行信號(hào)強(qiáng)度的測(cè)量與分析。比較用rRNA之信號(hào)作為內(nèi)標(biāo)而校正過(guò)的、用數(shù)字表示的Cy3信號(hào)強(qiáng)度值，并測(cè)定枯草芽孢桿菌各個(gè)生長(zhǎng)期的基因表達(dá)信號(hào)。結(jié)果，有在培養(yǎng)3小時(shí)后觀測(cè)到強(qiáng)表達(dá)信號(hào)的基因，有在培養(yǎng)5小時(shí)后觀測(cè)到強(qiáng)表達(dá)信號(hào)的基因等等。因此，顯示出所述可讀框的表達(dá)方式顯然是相互不同的。
為了更詳細(xì)地研究表達(dá)信號(hào)的差異，通過(guò)用培養(yǎng)3小時(shí)后的表達(dá)信號(hào)除培養(yǎng)4或5小時(shí)后的表達(dá)信號(hào)計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平的比率，來(lái)確定表達(dá)水平的生長(zhǎng)期特異性。在表1中顯示了有代表性基因的結(jié)果。
表1

正如從表1中所看到的，在培養(yǎng)5小時(shí)后即在穩(wěn)定期期間，有表達(dá)水平顯著升高的基因。
實(shí)施例2用枯草芽孢桿菌的大膜片(macromembrane)來(lái)篩選以穩(wěn)定期特異性方式表達(dá)的基因通過(guò)用15μg實(shí)施例1中制備的作為模板的RNA和DIG-11-dUTP(Roche Diagnostics)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，來(lái)制備地高辛配基(在下文稱(chēng)之為DIG)-標(biāo)記的cDNA探針。
然后，用DIG-標(biāo)記的cDNA探針來(lái)進(jìn)行與枯草芽孢桿菌DNA陣列(Eurogentec，在下文稱(chēng)之為大膜片；來(lái)源于枯草芽孢桿菌Marburg 168的推定的可讀框)的雜交。至于雜交，在42℃于DIGEasyHyb Granules(Roche Diagnostics)溶液中預(yù)雜交達(dá)30分鐘，然后，在42℃雜交過(guò)夜。用DIG洗滌與阻斷緩沖液(Wash and Block Buffer)以及檢測(cè)試劑盒(Detection kit)(兩者都得自Roche Diagnostics)進(jìn)行檢測(cè)。
在感光膠片上顯出檢測(cè)的結(jié)果。用圖像分析軟件Adobe Photoshop(Adobe)，將所述結(jié)果的圖像收入圖像分析儀Model GS-700 ImagingDensitometer(BioRed)中。用圖像分析軟件MultiAnalyst(Bio-Red)，按照所述軟件所附的說(shuō)明書(shū)，來(lái)測(cè)量與分析所述信號(hào)的強(qiáng)度。根據(jù)數(shù)字表示的DIG信號(hào)強(qiáng)度，來(lái)測(cè)定基因在枯草芽孢桿菌各個(gè)生長(zhǎng)期的表達(dá)信號(hào)。結(jié)果，有在培養(yǎng)3小時(shí)后觀測(cè)到強(qiáng)表達(dá)信號(hào)的基因，有在培養(yǎng)5小時(shí)后觀測(cè)到強(qiáng)表達(dá)信號(hào)的基因等等。因此，顯示出所述可讀框的表達(dá)方式顯然是互不相同的。
為了更詳細(xì)地研究表達(dá)信號(hào)的差異，通過(guò)用培養(yǎng)3小時(shí)后的表達(dá)信號(hào)除培養(yǎng)4或5小時(shí)后的表達(dá)信號(hào)計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平的比率，來(lái)確定表達(dá)水平的生長(zhǎng)期特異性。在表2中顯示了有代表性基因的結(jié)果。
表2

正如從表2中所看到的，在培養(yǎng)5小時(shí)后即在穩(wěn)定期期間，有表達(dá)水平顯著升高的基因。
實(shí)施例3穩(wěn)定期特異性啟動(dòng)子的篩選為了篩選穩(wěn)定期特異性的啟動(dòng)子，如實(shí)施例1和實(shí)施例2中所述，進(jìn)行了兩輪相應(yīng)的篩選；根據(jù)結(jié)果，來(lái)總體判斷表達(dá)水平在培養(yǎng)5小時(shí)后即在穩(wěn)定期期間顯著升高的基因，且挑選出下面的23種基因，并將其用于下面的實(shí)驗(yàn)；所述基因?yàn)閍coA、acoL、iolJ、sigF、sipW、spoIIB、spoIIIAH、spoIVA、yabS、ybcO、ybcP、ybcQ、ybcS、ybcT、ybdA、ybdD、yfiA、ygaB、yjdB、yngJ、yobH、yqxA以及yrzF。
通過(guò)連接外源基因到來(lái)自所述23種以穩(wěn)定期特異性方式表達(dá)的基因、推測(cè)含有所述基因的啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段上，構(gòu)建外源基因表達(dá)用的載體，進(jìn)行穩(wěn)定期特異性啟動(dòng)子的篩選。
使用市售的用于凝膠純化和質(zhì)粒純化的酶以及用于凝膠純化和質(zhì)粒純化的試劑盒，來(lái)構(gòu)建所述基因表達(dá)用載體。除非另有說(shuō)明，按照Molecular cloning，A laboratory manual 2nd(Sambrook等，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press)中描述的方法，進(jìn)行操作。
為了擴(kuò)增包含以穩(wěn)定期特異性方式表達(dá)的所述23種基因之上游區(qū)的、大約180bp的DNA片段，設(shè)計(jì)了總共46種引物。所述DNA片段中的所述區(qū)位于所述基因SD序列的上游，且推測(cè)這些區(qū)包含啟動(dòng)子。根據(jù)實(shí)施例1中描述的枯草芽孢桿菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http//genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)的序列，來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)。另外，為了簡(jiǎn)化擴(kuò)增后的操作，在所設(shè)計(jì)的各個(gè)引物的兩側(cè)，添加了限制性?xún)?nèi)切酶KpnI和EcoRI的位點(diǎn)。
準(zhǔn)備從中擴(kuò)增推測(cè)含有啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段的基因、擴(kuò)增用的引物以及顯示所述引物序列的SEQ ID NO(在園括號(hào)中)如下acoA基因，引物aAF1(SEQ ID NO7)和aAR1(SEQ ID NO8)；spoIIB基因，引物spBF1(SEQ ID NO9)和spBR1(SEQ ID NO10)；ybcO基因，引物ybOF1(SEQ ID NO11)和ybOR1(SEQ ID NO12)；yjdB基因，引物yjBF1(SEQ ID NO13)和pjBR1(SEQ ID NO14)；yngJ基因，引物ynJF1(SEQ ID NO15)和ynJR1(SEQ ID NO16)；以及yrzE基因，引物yrEF1(SEQ ID NO17)和yrER1(SEQ ID NO18)。
用ISOPLANT試劑盒(Nippon Gene)，按照所述試劑盒所附的說(shuō)明書(shū)，由枯草芽孢桿菌DB104(Gene，83215-233(1989))制備基因組DNA。
用作為模板的所述基因組DNA與如上所述設(shè)計(jì)的引物，如下進(jìn)行PCR94℃達(dá)30秒、50℃達(dá)1分鐘以及72℃達(dá)1分鐘的循環(huán)20個(gè)。
在下面，使用如上所述擴(kuò)增的、推測(cè)含有啟動(dòng)子的23種DNA片段。
將來(lái)源于WO 98/56926中描述的激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)的超耐熱蛋白酶PFUS的基因，用作用來(lái)篩選穩(wěn)定期特異性啟動(dòng)子的外源基因。
枯草芽孢桿菌DB104/pSPO124ΔC(FERM BP-6294)是一株WO98/56926中描述的含有質(zhì)粒pSPO124ΔC的菌株，質(zhì)粒pSPO124ΔC包含超耐熱蛋白酶PFUS的基因。在5ml含有10μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)枯草芽孢桿菌DB104/pSPO124ΔC過(guò)夜。然后用QIAGEN Plasmid Mini試劑盒(Qiagen)，按照所述試劑盒所附的說(shuō)明書(shū)，由所收集的細(xì)胞制備出質(zhì)粒pSPO124ΔC。在這種情況下，于37℃處理懸浮于添加了4mg/ml濃度的溶菌酶的緩沖液P1中的細(xì)胞達(dá)30分鐘；緩沖液P1是所述試劑盒所附的緩沖液。
用作為模板的質(zhì)粒pSPO124ΔC和引物PLF1(SEQ ID NO19)與PLR1(SEQ ID NO20)，通過(guò)PCR，擴(kuò)增一種5448 bp的DNA片段。所述片段不僅包含所述SD序列以及編碼來(lái)自枯草芽孢桿菌的枯草蛋白酶之a(chǎn)prE基因的分泌信號(hào)，而且包含超耐熱蛋白酶PFUS的結(jié)構(gòu)基因。在下面，將這種片段用作載體片段。
作為一個(gè)實(shí)例，下面描述了關(guān)于包含yngL基因之啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段的操作。
用限制性?xún)?nèi)切酶KpnI和EcoRI(兩者都來(lái)自Takara Shuzo)消化所擴(kuò)增的、推測(cè)包含yngJ基因之啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段，并將其純化。將所述DNA片段與用限制性?xún)?nèi)切酶KpnI和EcoR I消化的載體片段混合，并使其連接。用所述反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌DB104。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在含有1％脫脂乳和10μg/ml卡那霉素的LB平板上。在37℃保溫所述平板達(dá)16小時(shí)。
為了從所產(chǎn)生的卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子中選擇出其中插入了所述180bp DNA片段的克隆，設(shè)計(jì)了可用來(lái)擴(kuò)增含有所述啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段的引物UBF1(SEQ ID NO21)和SBPR1(SEQ ID NO22)。用這兩種引物的組合以及TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)，在含有1mM PMSF的反應(yīng)混合物中如下進(jìn)行PCR94℃達(dá)30秒、55℃達(dá)1分鐘以及72℃達(dá)1分鐘的循環(huán)20個(gè)。
如此，選擇出其中插入了所述180bp DNA片段的克隆。由所選的轉(zhuǎn)化子制備質(zhì)粒，并將其稱(chēng)為pND20。
對(duì)其它22種DNA片段進(jìn)行類(lèi)似的操作。于是，在得到了轉(zhuǎn)化子的克隆之中，得到了啟動(dòng)子序列不同于pND20中的啟動(dòng)子序列的18個(gè)克隆。由所述這些轉(zhuǎn)化子制備了總計(jì)19類(lèi)的質(zhì)粒。
實(shí)施例4用穩(wěn)定期特異性表達(dá)載體生產(chǎn)超耐熱蛋白酶(1) 用包含超耐熱蛋白酶PFUS之基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)及粗酶溶液的制備枯草芽孢桿菌DB104/pND20是通過(guò)將實(shí)施例3中制備的包含超耐熱蛋白酶PFUS基因的質(zhì)粒pND20引入到枯草芽孢桿菌DB104中而產(chǎn)生的菌株。在37℃于1ml含有10μg/ml卡那霉素的TKRBS1培養(yǎng)基(20mg/ml的聚胨、2mg/ml的酵母膏、10mg/ml的肉膏、40mg/ml的葡萄糖、20μg/ml的FeSO4·7H2O、20μg/ml的MnSO4.5H2O以及2μg/ml的ZnSO4.7H2O)中，培養(yǎng)枯草芽孢桿菌DB104/pND20。在開(kāi)始培養(yǎng)后4、7、10或13天，收集100μl的培養(yǎng)物。在95℃加熱所述培養(yǎng)物達(dá)30分鐘，然后離心收集上清液。將所述上清液用作粗酶溶液。
使用含有其它18種質(zhì)粒中的一種的枯草芽孢桿菌DB104，以類(lèi)似的方式制備粗酶溶液。
(2)生產(chǎn)超耐熱蛋白酶之能力的比較通過(guò)光譜測(cè)量由使用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA(Sigma)作為底物的酶之水解反應(yīng)產(chǎn)生的對(duì)硝基苯胺，來(lái)確定超耐熱蛋白酶PFUS的活性。
具體地講，用100mM的磷酸緩沖液(pH7.0)適當(dāng)?shù)叵♂寽?zhǔn)備測(cè)定酶活性的酶制劑。將50μl在100mM磷酸緩沖液(pH7.0)中含有1mM濃度的Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA的溶液加入到50μl樣品溶液中。讓混合物在95℃反應(yīng)30分鐘。然后，在冰上使所述反應(yīng)混合物冷卻而終止反應(yīng)。測(cè)量在405nm的吸光度，從而確定所產(chǎn)生的對(duì)硝基苯胺的量。
將所述酶的一個(gè)單位定義為在95℃時(shí)1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺的酶量。
假定超耐熱蛋白酶PFUS的比活為9.5單位/mg蛋白，則根據(jù)所測(cè)定的酶活性來(lái)計(jì)算表達(dá)的酶蛋白的量。
用實(shí)施例4-(1)中制備的粗酶溶液作為酶制劑，測(cè)定超耐熱蛋白酶的活性。結(jié)果，用六種質(zhì)粒(pND1、pND6、pND10、pND19、pND20、pND23)，觀測(cè)到超耐熱蛋白酶PFUS的表達(dá)。在SEQ ID NOS1-6中，顯示了結(jié)合到這六種質(zhì)粒中的啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列。在表3中顯示了用這六種質(zhì)粒而觀測(cè)到的表達(dá)水平。在表3中，結(jié)果以規(guī)定用枯草芽孢桿菌DB104/pSPO124ΔC所觀測(cè)到的表達(dá)水平為1時(shí)的相對(duì)值表示。
表3

正如從表3中所看到的，與使用pSPO124ΔC所觀測(cè)到的表達(dá)水平相比，使用pND6、pND10和pND20，觀測(cè)到超耐熱蛋白酶PFUS表達(dá)水平升高(pND6，大約1.2倍；pND10，大約1.5倍或更高；pND20，大約2倍或更高)。使用pND6，則在培養(yǎng)早期的第4天，幾乎沒(méi)觀測(cè)到超耐熱蛋白酶PFUS的表達(dá)。在培養(yǎng)晚期的第10天，所述表達(dá)水平則高于使用pSPO124ΔC所觀測(cè)到的表達(dá)水平。
至于用以觀測(cè)到超耐熱蛋白酶PFUS表達(dá)的質(zhì)粒，在表4中顯示了按天計(jì)算的達(dá)到超耐熱蛋白酶PFUS最高表達(dá)水平的培養(yǎng)期和生產(chǎn)力以及啟動(dòng)子所來(lái)源的基因名稱(chēng)。表4中的生產(chǎn)力以每升培養(yǎng)基中的mg量來(lái)表示。
表4

正如從表4中所看到的，與pSPO124ΔC的結(jié)果相比，使用pND6、pND10和pND20，則在較短的培養(yǎng)期(以天計(jì)算)內(nèi)生產(chǎn)出較大量的超耐熱蛋白酶PFUS。
實(shí)施例5用穩(wěn)定期特異性表達(dá)載體生產(chǎn)堿性蛋白酶、硝基苯磷酸酶、吡咯烷酮羧肽酶和甲硫氨酰氨肽酶(1)載體的制備通過(guò)PCR，擴(kuò)增除去了作為報(bào)道基因的蛋白酶PFUS基因的區(qū)域，即擴(kuò)增包含啟動(dòng)子區(qū)、SD序列、分泌信號(hào)以及所述載體的區(qū)域。在所述PCR中，使用引物NDF1(SEQ ID NO23)與NDR1(SEQ ID NO24)，而且使用上面實(shí)施例3中構(gòu)建的質(zhì)粒pND1、pND6、pND10、pND19和pND23中的一種或pSPO124ΔC(對(duì)照)作為模板。用限制性?xún)?nèi)切酶SpeI和MluI(兩者都得自Takara Shuzo)消化所擴(kuò)增的片段，并將其純化。在下面，將這些片段用作載體片段。
(2)報(bào)道基因的制備及表達(dá)載體的構(gòu)建(i)堿性蛋白酶基因從National Institute of Technology and Evaluation得到含有來(lái)自超級(jí)嗜熱菌Aeropyrum pernix K1的堿性蛋白酶基因的質(zhì)粒A2GR7310。通過(guò)用所述質(zhì)粒作為模板以及用引物AP1F1(SEQ ID NO25)與AP1R1(SEQ ID NO26)進(jìn)行PCR，來(lái)擴(kuò)增編碼堿性蛋白酶的區(qū)域。用限制性?xún)?nèi)切酶SpeI和MluI(兩者都得自Takara Shuzo)消化所擴(kuò)增的片段，并將其純化。在下面，將這片段用作報(bào)道基因片段。
在SEQ ID NO33中，顯示了來(lái)自A.pernix、用作報(bào)道基因的堿性蛋白酶基因的核苷酸序列。
通過(guò)將報(bào)道基因片段分別連接到來(lái)源于pND6、pND10和pSPO124ΔC的載體片段上而獲得的重組質(zhì)粒(表達(dá)載體)，則相應(yīng)地被稱(chēng)為pND6A1、pND10A1和pSPOA1。
(ii)硝基苯磷酸酶基因從National Institute of Technology and Evaluation得到含有來(lái)自超級(jí)嗜熱菌Aeropyrum pernix K1的硝基苯磷酸酶基因的質(zhì)粒A2GR0030。通過(guò)用所述質(zhì)粒作為模板以及用引物AP7F1(SEQ IDNO27)與AP7R1(SEQ ID NO28)進(jìn)行PCR，來(lái)擴(kuò)增編碼硝基苯磷酸酶的區(qū)域。用限制性?xún)?nèi)切酶SpeI和MluI(兩者都得自Takara Shuzo)消化所擴(kuò)增的片段，并將其純化。在下面，將這片段用作報(bào)道基因片段。
在SEQ ID NO34中，顯示了來(lái)自A.pernix的、被用作報(bào)道基因的硝基苯磷酸酶基因的核苷酸序列。
通過(guò)將所述報(bào)道基因片段分別連接到來(lái)源于pND10、pND23和pSPO124ΔC的載體片段上而獲得的重組質(zhì)粒(表達(dá)載體)，則相應(yīng)地被稱(chēng)為pND10A7、pND23A7和pSPOA7。
(iii)吡咯烷酮羧肽酶基因從National Institute of Technology and Evaluation獲得含有來(lái)自超級(jí)嗜熱菌Pyrococcus horikoshii OT3的吡咯烷酮羧肽酶基因的質(zhì)粒2708。通過(guò)用所述質(zhì)粒作為模板以及用引物PH1F1(SEQ ID NO29)與PH1R1(SEQ ID NO30)進(jìn)行PCR，來(lái)擴(kuò)增編碼吡咯烷酮羧肽酶的區(qū)域。用限制性?xún)?nèi)切酶SpeI和MluI(兩者都得自Takara Shuzo)消化所擴(kuò)增的片段，并將其純化。在下面，將這片段用作報(bào)道基因片段。
在SEQ ID NO35中，顯示了來(lái)自P.horikoshii的、被用作報(bào)道基因的吡咯烷酮羧肽酶基因的核苷酸序列。
通過(guò)將所述報(bào)道基因片段分別連接到來(lái)源于pND10、pND19和pSPO124ΔC的載體片段上而獲得的重組質(zhì)粒(表達(dá)載體)，則相應(yīng)地被稱(chēng)為pND10P1、pND19P1和pSPOP1。
(iv)甲硫氨酰氨肽酶基因從National Institute of Technology and Evaluation獲得一種來(lái)自超級(jí)嗜熱菌Pyrococcus horikoshii OT3的甲硫氨酰氨肽酶基因的PCR擴(kuò)增片段PH0628PCR。通過(guò)用所述片段作為模板以及用引物PH2F1(SEQID NO31)與PH2R1(SEQ ID NO32)進(jìn)行PCR，來(lái)擴(kuò)增編碼甲硫氨酰氨肽酶的區(qū)域。用限制性?xún)?nèi)切酶SpeI和MluI(兩者都得自Takara Shuzo)消化所擴(kuò)增的片段，并將其純化。在下面，將這一片段用作報(bào)道基因片段。
在SEQ ID NO36中，顯示了來(lái)自P.horikoshii的、被用作報(bào)道基因的甲硫氨酰氨肽酶基因的核苷酸序列。
通過(guò)將所述報(bào)道基因片段分別連接到來(lái)源于pND1、pND19和pSPO124ΔC的載體片段上而獲得的重組質(zhì)粒(表達(dá)載體)，則相應(yīng)地被稱(chēng)為pND1P2、pND19P2和pSPOP2。
(3)轉(zhuǎn)化子的制備及報(bào)道基因的表達(dá)用在實(shí)施例5-(2)中構(gòu)建的各種表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌DB104。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在含有1％脫脂乳和10μg/ml卡那霉素的LB平板上。在37℃保溫所述平板達(dá)16小時(shí)。
從所產(chǎn)生的卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子中，選擇出其中插入了編碼所述酶的基因之一的克?。徊⒃?7℃于1ml含有10μg/ml卡那霉素的TKRBS1培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)10天(在堿性蛋白酶的情況下只培養(yǎng)7天)后收集的培養(yǎng)物于95℃加熱30分鐘，并離心收集上清液。將所述上清液用作粗酶溶液(酶制劑)。
(4)活性的測(cè)定(i)堿性蛋白酶用明膠(Nacalai Tesque)作為底物，如下測(cè)定堿性蛋白酶的活性。
用50mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)適當(dāng)?shù)叵♂寽?zhǔn)備測(cè)定酶活性的酶制劑。使所述稀釋液與SDS-PAGE加樣緩沖液混合。讓所述混合物于室溫靜置30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，然后，使其在含有SDS和0.05％明膠的10％聚丙烯酰胺凝膠上電泳。電泳后，用50mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)洗滌所述凝膠。使經(jīng)洗滌的凝膠在95℃于50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中保溫達(dá)3小時(shí)。然后，在冰上冷卻所述反應(yīng)混合物以終止反應(yīng)。用考馬斯藍(lán)使所述凝膠著色。運(yùn)用圖像分析軟件Adobe Photoshop(Adobe)，將所述凝膠的圖像轉(zhuǎn)變成圖像文件；且使用NIH圖像軟件，用數(shù)字來(lái)表示活性信號(hào)。
(ii)硝基苯磷酸酶用對(duì)硝基苯磷酸(Sigma)作為底物，如下測(cè)定硝基苯磷酸酶的活性。
用含有1mM ZnCl2的100mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，適當(dāng)?shù)叵♂寽?zhǔn)備測(cè)定酶活性的酶制劑。將50μl在含有1mM ZnCl2的100mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)中含有濃度2mM的對(duì)硝基苯磷酸的溶液加到50μl樣品溶液中。使所述混合物在95℃反應(yīng)10分鐘。然后，在冰上冷卻所述反應(yīng)混合物以終止反應(yīng)。用Piper Phosphate Assay Kit(試劑盒)(Molecular Probe)，通過(guò)測(cè)量由于544nm的激發(fā)而產(chǎn)生的590nm的熒光發(fā)射，來(lái)測(cè)定所產(chǎn)生的游離磷酸的量。
(iii)吡咯烷酮羧肽酶用焦谷氨酸4-甲基-香豆?jié)M基(coumaryl)-7-酰胺(在下文稱(chēng)之為Pyr-MCA；Peptide Institute)作為底物，如下測(cè)定吡咯烷酮羧肽酶的活性。
用含有10mM DTT與1mM EDTA的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，適當(dāng)?shù)叵♂寽?zhǔn)備測(cè)定酶活性的酶制劑。將50μl在含有10mM DTT與1mM EDTA的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中含有濃度0.2mM的Pyr-MCA的溶液加到50μl樣品溶液中。使所述混合物在95℃反應(yīng)30分鐘；然后，在冰上冷卻所述反應(yīng)混合物以終止反應(yīng)。通過(guò)測(cè)量由于355nm的激發(fā)而導(dǎo)致的460nm的熒光發(fā)射，來(lái)測(cè)定所產(chǎn)生的MCA的量。
將所述酶的一個(gè)單位定義為在95℃1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol的MCA的酶量。
(iv)甲硫氨酰氨肽酶用Met-Ala-Ser(Bachem)作為底物，如下測(cè)定甲硫氨酰氨肽酶的活性。
用含有0.5mM CoCl2的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)，適當(dāng)?shù)叵♂寽?zhǔn)備測(cè)定酶活性的酶制劑。將45μl在含有0.5mM CoCl2的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)中含有濃度1mM的Met-Ala-Ser的溶液加到5μl樣品溶液中。使所述混合物在75℃反應(yīng)5分鐘。然后，在冰上冷卻所述反應(yīng)混合物，并向其中加入10μl 100mM的EDTA而終止所述反應(yīng)。向所述混合物中加入50μl的混合物A(含有0.18mg/ml L-氨基酸氧化酶、50μg/ml過(guò)氧化物酶和0.18mg/ml鄰聯(lián)二茴香胺的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5))。使所述混合物在37℃反應(yīng)10分鐘。然后，在冰上冷卻所述反應(yīng)混合物以終止反應(yīng)。測(cè)定在450nm的吸光度。
(5)生產(chǎn)能力的比較根據(jù)如實(shí)施例5-(4)中所述而測(cè)定的酶制劑的酶活性，來(lái)計(jì)算培養(yǎng)物中所包含的總的酶活性。
將使用具有aprE基因啟動(dòng)子的表達(dá)載體(pSPOA1、pSPOA7、pSPOP1或pSPOP2)所觀測(cè)到的表達(dá)水平規(guī)定為1。在表5中顯示了各種表達(dá)載體的相對(duì)表達(dá)水平。
表5報(bào)道基因 載體啟動(dòng)子 相對(duì)表達(dá)水平A.pernix pND6A1 spoIIB 6.16堿性蛋白酶 pND10A1 ybcO23.8pSPOA1 aprE1.00A.pernix pND10A7 ybcO2.29硝基苯磷酸酶 pND23A7 yrzE1.68pSPOA7 aprE1.00P.horikoshii pND10P1 ybcO1.43吡咯烷酮羧肽酶 pND19P1 yjdB3.73pSPOP1 aprE1.00P.horikoshii pND1P2 acoA1.81甲硫氨酰氨肽酶 pND19P2 yjdB1.98pSPOP2 aprE1.00
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供無(wú)需誘導(dǎo)基因表達(dá)而能夠以穩(wěn)定期特異性方式高水平表達(dá)基因的啟動(dòng)子。
序列表的獨(dú)立文本SEQ ID NO1pND1上的啟動(dòng)子區(qū)。
SEQ ID NO2pND6上的啟動(dòng)子區(qū)。
SEQ ID NO3pND10上的啟動(dòng)子區(qū)。
SEQ ID NO4pND19上的啟動(dòng)子區(qū)。
SEQ ID NO5pND20上的啟動(dòng)子區(qū)。
SEQ ID NO6pND23上的啟動(dòng)子區(qū)。
SEQ ID NO7用于擴(kuò)增acoA基因的啟動(dòng)子序列的引物aAF1。
SEQ ID NO8用于擴(kuò)增acoA基因的啟動(dòng)子序列的引物aAR1。
SEQ ID NO9用于擴(kuò)增spoIIB基因的啟動(dòng)子序列的引物spBF1。
SEQ ID NO10擴(kuò)增spoIIB基因的啟動(dòng)子序列的引物spBR1。
SEQ ID NO11用于擴(kuò)增ybcO基因的啟動(dòng)子序列的引物ybOF1。
SEQ ID NO12用于擴(kuò)增ybcO基因的啟動(dòng)子序列的引物ybOR1。
SEQ ID NO13用于擴(kuò)增yjdB基因的啟動(dòng)子序列的引物ykBF1。
SEQ ID NO14用于擴(kuò)增yjdB基因的啟動(dòng)子序列的引物yjBR1。
SEQ ID NO15用于擴(kuò)增yngJ基因的啟動(dòng)子序列的引物ynJF1。
SEQ ID NO16用于擴(kuò)增yngJ基因的啟動(dòng)子序列的引物ynJR1。
SEQ ID NO17用于擴(kuò)增yrzE基因的啟動(dòng)子序列的引物yrEF1。
SEQ ID NO18用于擴(kuò)增yrzE基因的啟動(dòng)子序列的引物yrER1。
SEQ ID NO19引物PLF1。
SEQ ID NO20引物PLR1。
SEQ ID NO21引物UBF1。
SEQ ID NO22引物SBPR1。
SEQ ID NO23引物NDF1。
SEQ ID NO24引物NDR1。
SEQ ID NO25用于擴(kuò)增堿性蛋白酶基因編碼區(qū)的引物AP1F1。
SEQ ID NO26用于擴(kuò)增堿性蛋白酶基因編碼區(qū)的引物AP1R1。
SEQ ID NO27擴(kuò)增硝基苯磷酸酶基因編碼區(qū)的引物AP7F1。
SEQ ID NO28擴(kuò)增硝基苯磷酸酶基因編碼區(qū)的引物AP7R1。
SEQ ID NO29擴(kuò)增吡咯烷酮羧肽酶基因編碼區(qū)的引物PH1F1。
SEQ ID NO30擴(kuò)增吡咯烷酮羧肽酶基因編碼區(qū)的引物PH1R1。
SEQ ID NO31擴(kuò)增甲硫氨酰氨肽酶基因編碼區(qū)的引物PH2F1。
SEQ ID NO32擴(kuò)增甲硫氨酰氨肽酶基因編碼區(qū)的引物PH2R1。
序列表<110>寶酒造株式會(huì)社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)<120>啟動(dòng)子<130>663087<150>JP 2001-72802<151>2001-03-14<160>36<170>Patentln Ver.2.1<210>1<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND1上的啟動(dòng)子區(qū)序列。
<400>1gtcaaaggcc gggtgatatc cggtcttttt tttgcatgct gtaaaacgag acaaatgaat 60cagtttgaga caaaacgaga cacacgtctc aaactgtctc caaagtgaag atgagaagac 120tgattttacg ggctcaaaag actggcacac ttcttgcatt tataatggtg aaccctaaat 180<210>2<211>190<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND6上的啟動(dòng)子區(qū)序列。
<400>2ccgcagggag cattttagcc tatttatacg gtgactctat catttctttt tatatcaaaa 60tggcattggg ctgactgctg aaaaatttga cgaacgtttt ttggacaagg cgacaaaagt 120cttgttcttt ttttctttgc ctgtgctaaa gtgtgtagca tgaaaagccg acaagaacgg 180tcaagcaaat190
<210>3<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND10上的啟動(dòng)子區(qū)序列。
<400>3ctgtttttct cgagaggata gcttgtcagc ttttctattt ttaaagggtt aaaatattct 60atttatacta attaatgtaa tttttaggat aatatacaaa atccccctta cttcgacaat 120tgcaatctgg tattatcgta tcgcatggga gctatgtcaa tagactctat gcaaaaattg 180<210>4<211>184<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND19上的啟動(dòng)子區(qū)序列。
<400>4tgctattaac attttaagga tggccattct ctctcagcaa ttttccatca taaatacaaa 60ctctgtgcag ggcacacaat attcttagct caaatcaatt gatcgttcac atattattaa 120catttattta caaggaaaat aattactttt attgaattgt tatagtgcaa gacaaaaaac 180ttta 184<210>5<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND20上的啟動(dòng)子區(qū)序列。
<400>5ttcccggctt tatcaaaggg ccaagttatt gcgtttacga tatggatggt atgcgcctac 60tgcatgtatt tgctcatccc gctgatatta tcacataaaa aatgattcag ttttaatttt 120cagacttttc ttgtcaggga atgattatag aactcgccta ataggatgtt acaaagatgt 180<210>6
<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND23上的啟動(dòng)子區(qū)序列。
<400>6tgaccaatat cacaaaatac aatacgactg tgcgaaacgc aatagtgaga agctcttcca 60ttatgcacct ccaactcatt ataggttgca acaaaatgat caatttatgt aagaaaaacc 120gattgcattt cacaaagctt ttacgtctaa ttcatgggat aagggaatac atttttacaa 180<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物aAF1的序列，用于擴(kuò)增acoA基因的啟動(dòng)子序列。
<400>7gggggaattc gtcaaaggcc gggtgata 28<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物aAR1的序列，用于擴(kuò)增acoA基因的啟動(dòng)子序列。
<400>8ggggggtacc atttagggtt caccatta28<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物spBF1的序列，用于擴(kuò)增spo11B基因的啟動(dòng)子序列。
<400>9gggggaattc ccgcagggag cattttag28<210>10<211>28<212>DNA<213>人T序列<220>
<223>人工序列的描述引物spBR1的序列，用于擴(kuò)增spollB基因的啟動(dòng)子序列。
<400>10ggggggtacc atttgcttga ccgttgtt28<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物yb0F1的序列，用于擴(kuò)增ybc0基因的啟動(dòng)子序列。
<400>11gggggaattc ctgtttttct cgagagga28<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物yb0R1的序列，用于擴(kuò)增ybc0基因的啟動(dòng)子序列。
<400>12ggggggtacc caatttttgc atagagtc28<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物yjBF1的序列，用于擴(kuò)增yjdB基因的啟動(dòng)子序列。
<400>13gggggaattc tgctattaac attttaag 28<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物yjBR1的序列，用于擴(kuò)增yjdB基因的啟動(dòng)子序列。
<400>14ggggggtacc taaagttttt tgtcttgc 28<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物ynJF1的序列，用于擴(kuò)增yngJ基因的啟動(dòng)子序列。
<400>15gggggaattc ttcccggctt tatcaaag 28<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物ynJR1的序列，用于擴(kuò)增yngJ基因的啟動(dòng)子序列。
<400>16ggggggtacc acatctttgt aacatcct 28<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物yrEF1的序列，用于擴(kuò)增yrzE基因的啟動(dòng)子序列。
<400>17gggggaattc tgaccaatat cacaaaat 28<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物yrER1的序列，用于擴(kuò)增yrzE基因的啟動(dòng)子序列。
<400>18ggggggtacc ttgtaaaaat gtattccc 28<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PLF1的序列。
<400>19ggggggtacc caaaaggaga gggggatccg 30<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PLR1的序列。
<400>20gggggaattc ttaggaacgt acagacggc29<210>21<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物UBF1的序列。
<400>21aaaggctttt aagccgtctg 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物SBPR1的序列。
<400>22cctgcgcaga catgttgctg 20<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物NDF1的序列。
<400>23ggtgacgcgt aagctttaat gcggtagtt29<210>24<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物NDR1的序列。
<400>24ggggactagt cctccggcag cctgcgcag29
<210>25<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物AP1F1的序列，用于擴(kuò)增堿性蛋白酶基因的編碼區(qū)。
<400>25gaggactagt ggtcgctgta gtaactgg 28<210>26<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物AP1R1的序列，用于擴(kuò)增堿性蛋白酶基因的編碼區(qū)。
<400>26ggggacgcgt cagcttgaga cggcagtc 28<210>27<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物AP7F1的序列，用于擴(kuò)增硝基苯基磷酸酶基因的編碼區(qū)。
<400>27gaggactagt gtttgcggat ctagacggcg tgata 35<210>28<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物AP7R1的序列，用于擴(kuò)增硝基苯基磷酸酶基因的編碼區(qū)。
<400>28ggggacgcgt cacccccctc tgcagaactc gctga 35<210>29<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PH1F1的序列，用于擴(kuò)增吡咯烷酮羧肽酶基因的編碼區(qū)。
<400>29gaggactagt gaagatctta ttgactgg 28<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PH1R1的序列，用于擴(kuò)增吡咯烷酮羧肽酶基因的編碼區(qū)。
<400>30ggggacgcgt cacctgagtt gtgatgaatg 30<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PH2F1的序列，用于擴(kuò)增甲硫氨酰氨肽酶基因的編碼區(qū)。
<400>31gaggactagt ggatgttgac aagcttattg 30<210>32<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PH2R1的序列，用于擴(kuò)增甲硫氨酰氨肽酶基因的編碼區(qū)。
<400>32ggggacgcgt cattccgttg ttacagtcac 30<210>33<211>1323<212>DNA<213>Aeropyrum pernix<400>33gtggtcgctg tagtaactgg tgtaattcag gtgggaacta agatcgcggc tattgcgatc 60gcgctgatct tcattctgcc tctcttccct gtttatacgg gatcggcggc tggggctagc 120acggttgtga tagctaagat taatcctgag gagtttaacc ctaaggcggt ggaggctctt 180cagggcaagg taatatatgt tgctgatctg gcccccgttg ctataattag cataccagga 240aaggctgtag gcctgctctc taaactacct ggtgttgtca gcgtttccga ggacggcgtg 300gtccaggcta tggccaagcc gccgtgggct ggcggcggga ataagtctca gcctgccgag 360gtcctgcctt ggggtgtcga ctatatcgat gccgagctag tatggcccga tggggttacc 420ggctgggttg acgttaacgg tgacggggac ggcgagatag aggttgccgt tattgacact 480ggtgtcgata aggaccatcc cgaccttgca ggcaacattg tctgggggat atctgttttg 540aacggcagga tatcctccaa ctaccaggat agaaacggcc acggtacaca cgtaacgggc 600actgtagccg ccatagacaa cgatataggg gtgatagggg ttgcacacag cgtggagatc 660tacgccgtta aagctctcgg taacgggggt tacggcagct ggagcgacct tataatagct 720atagaccttg ctgtgaaggg gccggacggc gtaattgacg ctgatggaga tggcgtcgtc 780gctggggatc cagacgatga tgctccagag gttatctcca tgagcctagg tgggagcagc 840ccaccaccag aactccacga cgttatcaag gcggcgtaca accttggaat aactattgtc 900gcagcagcgg gtaacgacgg ggcggacagc ccctcatacc ctgcagccta ccctgaggta 960atagcggtag gcgctataga cgagaacggc aacgtaccta gctggagcaa tagaaaccct 1020gaggttgctg cacctggagt gaacatacta agcacctacc ccgacgatac ctatgaggag 1080ctgagcggca ctagcatggc gactccacac gtgtcaggga ctgtggctct aatacaggct 1140gccaggctgg ccgctggcct ccctctactc cctccgggaa gcgagagtga cactactcca 1200gacaccgtga ggggcgtact gcatactact gctactgacg cgggagaccc aggctacgat 1260agcctgtatg gatacggtat catagacgcc tatgacgccg tgcagactgc cgtctcaagc 1320tga1323<210>34
<211>768<212>DNA<213>Aeropyrum pernix<400>34gtgtttgcgg atctagacgg cgtgatatgg cttgggcagg aacctataga ggataaccta 60gtagtgctta ggactctggc gagcgagggt aggcttgtgg ttctcactaa taattcgacg 120cgaagtagga gagtttacgc ggctatgctc gagagggtgg gcctcgacat agagcccggg 180aggatagtaa cgagcgccta cagcgccgcc gtcctgctga agaaaaagct gggaccatcc 240accgccctgg ttgtagggga ggaggggctg gttgaagagc ttgctgtgga gggccatgta 300gtggcgagct cgagcgacaa catcgacgtt gatgcggtgg tcgtcggcct cgacaggaac 360ctcacctatg ggaagctggc gagggctgcc tccgcaatac acagcgggag ccttttcgtg 420gcgacgaacc tcgaccacgc cctaccaacc cccagaggcc tcataccagg tgcaggatcc 480attgtggctc ttctggagaa ggcaacgggg gtcaagcctg cgattgtcgc tgggaagccg 540tccaggggct tggccgaggt tctagagagc cttttcaagc cggtcaggcc cctcgtggtg 600ggtgatagga tagatactga cgtggagttc gccagggcct ggggtgttga ttctcttctc 660gtgctcactg gcctctacag gggtgtcagc atagaggagg cttctaggaa ggctggggag 720ggggtgaggg ttgccaggag tctcagcgag ttctgcagag gggggtag 768<210>35<211>621<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii<400>35atgaagatct tattgactgg ctttgagccc tttggaggtg acgataagaa tcccactatg 60gatatagttg aagctctaag cgaaaggata cctgaggtcg ttggggagat actacccgta 120tccttcaaga gggctagaga aaagctcctc aaggtacttg acgatgttag gccagatata 180accataaacc tgggcttggc cccaggaaga acgcacatat ccgttgagag agtagccgtg 240aacatgatag atgcgaggat tccggataat gatggagagc aaccgaagga tgaacccata 300gtcgagggag gacctgcagc ttattttgca acaataccca ctagggagat agtcgaagag 360atgaagaaga acggcattcc agcggttctc tcttacacgg ctggaactta tctctgcaat 420ttcgccatgt atttaacctt acacacatca gctaccaagg gatatcccaa gattgctggc 480ttcatacacg ttccctacac tccggatcaa gtcctggaga aaaagaatac tccgagcatg 540tctctagatt tagaaataaa gggagtggag atagcaataa gggttgctca gagcgcgcta 600cattcatcac aactcaggta g621<210>36<211>888<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii
<400>36atggatgttg acaagcttat tgaagccggt aaaatagcta aaaaggttag agaagaagcc 60gttaaacttg caaagccagg agtttcgctc ttggaactgg cagagaaaat tgagagtaga 120atagttgaac ttggaggtaa gccagctttt ccggcaaacc tttccctaaa tgaggtcgct 180gcccactaca ctccttacaa gggagatcaa actgttctca aagagggaga ctatctaaag 240atagatttgg gagttcatat agatggatac atagctgata ctgctgtaac cgttagggtt 300ggaatggatt ttgatgaact tatggaagct gctaaagaag ccctggaaag cgcaatttca 360gttgcaaggg ccggtgtcga agttaaagaa ctcgggaaag caatagaaaa tgaaattagg 420aagagaggct ttaaccccat tgtaaacctt agtgggcata aaatagagag gtacaagctt 480catgctgggg taagcatccc caatatctac agaccccacg ataactatgt cctccaggaa 540ggagatgtct ttgcaataga accctttgca acaacgggtg cggggcaagt tatagaagtt 600ccccccacgt taatatacat gtacgtcagg gatgccccag tcaggatggc ccaagccagg 660tttctgcttg ctaagataaa gagggagtac aagacacttc cctttgctta taggtggttg 720caaggagaga tgcccgaagg gcagttaaaa ctagccttaa gatccctgga gagatccggg 780gccttgtacg gttaccctgt gctaagggag ataaggggag gaatggtcac gcagttcgag 840catacaataa tagttgaaaa agactccgtg actgtaacaa cggaatga 888
權(quán)利要求
1.一種分離的DNA，所述分離的DNA選自(a)具有SEQ ID NO1-6中的任何一種的核苷酸序列且在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中以穩(wěn)定期特異性方式顯示出啟動(dòng)子活性的分離的DNA或其片段，和(b)在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下可與(a)的DNA或其片段雜交且在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中以穩(wěn)定期特異性方式顯示出啟動(dòng)子活性的分離的DNA。
2.按照權(quán)利要求1的分離的DNA，所述分離的DNA在被置于外源基因的上游時(shí)，能夠以穩(wěn)定期特異性方式使所述外源基因表達(dá)。
3.一種重組DNA，其中由權(quán)利要求1限定的DNA和外源基因的配置使得所述外源基因可以表達(dá)。
4.按照權(quán)利要求3的重組DNA，其中所述外源基因?yàn)檫x自編碼蛋白質(zhì)的核酸、編碼反義RNA的核酸以及編碼核酶的核酸的核酸。
5.一種基因表達(dá)用載體，所述載體包含由權(quán)利要求1限定的DNA。
6.按照權(quán)利要求5的基因表達(dá)用載體，其中所述載體是選自質(zhì)粒載體、噬菌體載體和病毒載體的一種載體。
7.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含由權(quán)利要求3限定的重組DNA。
8.按照權(quán)利要求7的表達(dá)載體，其中所述載體是選自質(zhì)粒載體、噬菌體載體和病毒載體的一種載體。
9.一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞含有由權(quán)利要求3限定的重組DNA或由權(quán)利要求7限定的表達(dá)載體。
10.一種用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括培養(yǎng)由權(quán)利要求9限定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；并且從所產(chǎn)生的培養(yǎng)物中收集蛋白質(zhì)。
11.一種用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒含有由權(quán)利要求1限定的DNA或由權(quán)利要求5限定的表達(dá)基因用載體。
全文摘要
分離的DNA，所述分離的DNA是具有由序列表中SEQ ID NO1－6中的任何一種表示的堿基序列或其片段、且在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中顯示出穩(wěn)定期特異性啟動(dòng)子活性的DNA。
文檔編號(hào)C12N1/15GK1507490SQ0280973
公開(kāi)日2004年6月23日 申請(qǐng)日期2002年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月14日
發(fā)明者下條智子, 高藏晃, 落合一賴(lài), 淺田起代藏, 加滕郁之進(jìn), 之進(jìn), 代藏, 賴(lài) 申請(qǐng)人:寶生物工程株式會(huì)社