專利名稱：患病狀態(tài)的細胞為基礎(chǔ)的檢測和鑒別的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及早期檢測患者的總體患病狀態(tài)。本發(fā)明還涉及早期特殊患病狀態(tài)之間的辨別(鑒別)。
當(dāng)疾病尚處局部性并且其病理作用限于解剖學(xué)和生理學(xué)時，特殊患病狀態(tài)的早期檢測得以早期診斷和早期治療可大大地提高患者存活的機會。任何一種試驗或疾病檢測方法的兩個關(guān)鍵性評價標(biāo)準是其靈敏度(靈敏度＝真陽性/(真陽性+假陰性)和特異性(特異性＝真陰性/(假陽性+真陰性)，它們衡量了該試驗進行地如何好以精確地?zé)o例外地檢測出所有患病個體，并且不會錯誤的包括了沒有患目標(biāo)疾病地個體。歷史上，由于靈敏度和特異性差許多診斷試驗都遭到過批評。
靈敏度是衡量一種試驗正確檢測被測試個體患目標(biāo)疾病能力的一種標(biāo)準。一種靈敏度差的試驗會產(chǎn)生高比例的假陰性，例如，個體但患有疾病被錯誤的鑒定沒有患該病。假陰性潛在的危險是患病個體在一段時間里仍然沒得到確診和治療，而此時間里疾病可能發(fā)展到晚期，那時如果給予任何治療可能已沒有什么效果。一種靈敏度低的試驗例子是HIV的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的血液試驗。這種類型的試驗顯示靈敏度差是因為直到疾病已明確并且病毒大量侵入血液時它才能檢測到病毒的存在。相反，靈敏度高的試驗例子是采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的病毒負荷檢測。獲得高靈敏度是由于這種類型的試驗可檢測到非常少量的病毒(見Lewis，D.R.等“分子診斷學(xué)舊醫(yī)學(xué)和新醫(yī)學(xué)之間的基因組橋診斷技術(shù)和服務(wù)行業(yè)上的一張白紙”(Molecular DiagnosticsThe Genomic BridgeBetween Old and New MedicineA White Paper on the Diagnostic Technologyand Services Industry)Thomas Weisel Partners，2001年6月13日)。
另一方面，特異性是衡量一種試驗的精確鑒定患者沒有患該病能力的一種標(biāo)準。特異性差的試驗含產(chǎn)生高比例的假陽性，例如個體被錯誤地鑒定為患有該疾病。假陽性的缺點是迫使患者經(jīng)受伴有風(fēng)險、情感和經(jīng)濟壓力的不須要的藥物治療，這可能對患者的健康產(chǎn)生副作用。使得難以開發(fā)對其具有高度特異性的診斷試驗的疾病的特征，是該疾病的機制常常涉及多種的基因和蛋白質(zhì)。另外，與疾病無關(guān)的某些蛋白質(zhì)可能升高。具有高特異性的試驗的例子是可檢測出p53突變的以基因為基礎(chǔ)的試驗。除非存在癌細胞，從來沒有檢測到p53突變(見Lewis，D.R.等“分子診斷學(xué)舊醫(yī)學(xué)和新醫(yī)學(xué)之間的基因組橋診斷技術(shù)和服務(wù)行業(yè)上的一張白紙”(Molecular DiagnosticsThe GenomicBridge Between Old and New MedicineA White Paper on the DiagnosticTechnology and Services Industry)Thomas Weisel Partners，2001年6月13日)。
細胞標(biāo)記物是細胞中天然產(chǎn)生的分子結(jié)構(gòu)，可發(fā)現(xiàn)該分子結(jié)構(gòu)并用于特征鑒定或鑒別健康和患病細胞。它們的存在可用人類發(fā)明和開發(fā)的探針檢測，此種探針與標(biāo)記物的結(jié)合使得能夠通過影像系統(tǒng)顯現(xiàn)和/或定量檢測這些標(biāo)記物。四種以細胞為基礎(chǔ)的標(biāo)記物檢測技術(shù)是細胞病理學(xué)、細胞計量術(shù)、細胞遺傳學(xué)和蛋白組學(xué)(proteomics)，將在下文中鑒定和描述。
細胞病理學(xué)依賴于人類專家對染色的整個細胞群中細胞形態(tài)學(xué)改變的肉眼評估。一個例子是細胞技術(shù)學(xué)家和細胞病理學(xué)家分別進行的巴氏染色宮頸-陰道標(biāo)本的細胞學(xué)篩選和細胞診斷。與細胞遺傳學(xué)、且學(xué)和細胞計量術(shù)不同，細胞病理學(xué)不是一種定量測定方法。雖然它在臨床診斷細胞學(xué)上是最新型的，但它是主觀的并且診斷結(jié)果常常靈敏度不高或不可重現(xiàn)，特別是在癌癥早期(例如，ASCUS、LSIL)。
依賴于形態(tài)學(xué)分析的試驗包括在顯微鏡下觀察患者細胞的樣品以鑒定細胞和核形狀、大小或染色行為的異常。當(dāng)通過顯微鏡觀察時，正常成熟的上皮細胞顯示大的和分化良好的濃縮細胞核。然而，以發(fā)育異常為特征的細胞，可能處在不同的分化期，一些細胞非常不成熟。最后，以侵襲性癌為特征的細胞常常表現(xiàn)為未分化、具有非常少的細胞質(zhì)和相對大的細胞核。
依賴于形態(tài)分析的診斷試驗的缺點在于細胞形態(tài)學(xué)是一個落后指標(biāo)。由于形式服從功能，常常當(dāng)某疾病已發(fā)展到危險期時，該疾病才被形態(tài)學(xué)分析所證明。疾病初期包含有分子水平上的化學(xué)變化。顯微鏡觀察可檢測到的細胞特征變化直到疾病晚期才明顯。因此，測定分子水平上的化學(xué)變化的試驗，稱為“分子診斷”試驗，比僅依賴形態(tài)分析的試驗更可能提供早期檢測。
細胞計量術(shù)是基于對溶液中單個移動的(流式細胞計數(shù))熒光染色細胞的流式顯微熒光儀器分析，或是對沉積在顯微鏡玻璃載物片(圖象細胞計數(shù))上著染細胞的計算機輔助顯微鏡儀器分析。流式細胞儀的應(yīng)用包括白血病和淋巴瘤免疫表型分析。圖象細胞計數(shù)的應(yīng)用包括DNA倍性、惡性腫瘤相關(guān)的變化(MACs)和S-相分析。流式和圖象細胞計數(shù)方法可產(chǎn)生能特征鑒定懸浮液中或顯微鏡玻璃載物片上細胞的定量資料。流式和圖象細胞計數(shù)可產(chǎn)生良好的標(biāo)記物檢測和鑒別結(jié)果，這取決于細胞染色的靈敏度和特異性及所用的流式/圖象測定儀特性。
從二十世紀的早期到中期就已定量觀察和報道了惡性腫瘤相關(guān)的變化(MAC)(OC Gruner在Birt J Surg 3506-522，1916中的“某些惡性病例中與白細胞相符的變化的研究”(Study of change met with leukocytes incertain cases of malignant disease)(HE Neiburgs，F(xiàn)G Zak，DC Allen，H Reisman，T Clardy“人和動物組織材料中的系統(tǒng)性細胞變化”(Systemiccellular change in material from human and animal tissues)，第七次Ann Mtg Inter Soc Cytol Council學(xué)報，137-144，1959)。從十九世紀中期到1975年，文件記載了對頰粘膜和頰粘膜涂片(Nieburgs，F(xiàn)inch，Klawe)、十二指腸(Nieburges)、肝(Elias，Nieburgs)、巨核細胞(Ramsdahl)、子宮頸(Nieburges，Howdon)、皮膚(Kwitiken)、血液和骨髓(Nieburgs)、單核細胞和白細胞(van Haas，Matison，Clausen)和肺及痰液中MAC的獨立的定性組織學(xué)和細胞學(xué)研究。1975年以前，這些定性研究報道了對于具體疾病檢測的MAC為基礎(chǔ)的靈敏度從76％到97％，而特異性從50％到90％。1975年OppenToth報道在定性的痰液分析研究中靈敏度為76％和特異性為81％。
關(guān)于MAC-為基礎(chǔ)的探針分析的定量觀察開始于二、三十年前(H Klawe，JRowinski“通過物鏡圖象分析檢測口頰粘膜涂片細胞中惡性腫瘤相關(guān)的變化(MAC)”(Malignancy associated changes(MAC)in cells of buccal smearsdetected by means of objective image analysis”，Acta Cytol 1830-33，1974)(GL Wied，PH Bartels，M Bibbo，JJ Sychra“子宮癌中間細胞的細胞形態(tài)標(biāo)記”(Cytomorphometric markers for uterine cancer inintermediate cell)，Analyt Quant Cytol 2257-263，1980)(G Burger，U Jutting，K Rodenacker“子宮頸癌及其前體中良性細胞群的變化”AnalytQuant Cytol 3261-271，1981)。在頰粘膜和涂片(Klawe，Burger)、子宮頸(Wied，Burger，Bartels，Vooijs，Reinhardt，Rosenthal，Boon，Katzke，Haroske，Zahniser)、乳房(King，Bibbo，Susnik)、膀胱和前列腺(Sherman，Montironi)、結(jié)腸(Bibbo)、肺和痰液(Swank，MacAulay，Payne)、和鼻粘膜(Reith)研究中進行獨立的定量組織學(xué)和細胞學(xué)研究，證明MAC，MAC-為基礎(chǔ)的靈敏度從70％到89％而特異性從52％到100％。Marek和Nakhosteen顯示(1999，美國胸科協(xié)會年會)兩項定量肺部研究結(jié)果，表明(a)靈敏度89％和特異性92％以及(b)靈敏度91％和特異性100％。
顯然惡性腫瘤相關(guān)變化(MACs)是圖象細胞計數(shù)標(biāo)記檢測技術(shù)所產(chǎn)生的有潛在性用途的探針。DNA-染色細胞核的MAC-為基礎(chǔ)的特征可與其它分子診斷探針聯(lián)用以產(chǎn)生用于檢測和鑒別肺癌和其它疾病的最優(yōu)化的分子診斷面板。
細胞遺傳學(xué)采用，例如，原位雜交(ISH)技術(shù)檢測特性異染色體為基礎(chǔ)的細胞內(nèi)變化。ISH技術(shù)可基于熒光(FISH)、多色熒光(M-FISH)、或光吸收為基礎(chǔ)的發(fā)色成象(CHRISH)技術(shù)。ISH技術(shù)家族采用DNA或RNA探針來檢測克隆的細菌細胞或培養(yǎng)的真核細胞中互補DNA序列的存在。例如，F(xiàn)ISH技術(shù)可。用于檢測某些癌癥相關(guān)的遺傳異常。例子包括Trisomy 8和HER-2 neu的探針。其它技術(shù)例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可用于檢測B-細胞和T-細胞的基因重排。由于細胞遺傳學(xué)檢測的是產(chǎn)生病理狀況的致病或“觸發(fā)”分子事件，故它是一種高度特異性的標(biāo)記檢測技術(shù)。因為可能存在的檢測事件較少，它可能比其它標(biāo)記檢測技術(shù)靈敏性低。原位雜交(ISH)是一種分子診斷方法，采用基因為基礎(chǔ)的分析檢測遺傳水平上的異常，例如突變、染色體差錯或遭受特異性病原體插入的遺傳物質(zhì)。例如，原位雜交可包括采用設(shè)計的能與特異性mRNA雜交的標(biāo)記引物處理患者細胞樣品，洗去未結(jié)合的引物并測定此標(biāo)記的信號來測定特異性mRNA的水平。由于基因序列的唯一性，一項包括基因序列測定的試驗將可能具有高特異性，產(chǎn)生非常少的假陽性。然而，由于細胞樣品中遺傳物質(zhì)的量非常低，可能只得到非常弱的信號。因此，不采用前置放大技術(shù)的原位雜交試驗將有可能特異性差，產(chǎn)生許多假陰性。
蛋白組學(xué)取決于正?；虍惓＜毎愋腿后w中的獨特的或特異性蛋白質(zhì)的過度表達，表達不足或存在/缺乏所致的細胞特性或分化。蛋白組學(xué)不僅包括蛋白質(zhì)的鑒定和定量，還包括測定它們的位置、修飾、相互作用、化學(xué)活性、和細胞/胞外功能。免疫化學(xué)技術(shù)(QIHC)(細胞中為免疫細胞化學(xué)，組織中為免疫組織化學(xué)(IHC))是采用抗體定性或定量地染色抗原(即，蛋白體)的技術(shù)。免疫染色方法采用染料作為檢測指示劑。IHC應(yīng)用的例子包括分析ER(雌激素受體)、PR(黃體酮受體)、p53腫瘤抑制基因、和EGRF預(yù)后標(biāo)記。蛋白體學(xué)通常是一種比細胞遺傳學(xué)更靈敏的標(biāo)記檢測技術(shù)，因為采用蛋白體學(xué)檢測的蛋白質(zhì)分子常常比采用細胞遺傳學(xué)檢測的細胞遺傳突變或基因序列變化高幾個數(shù)量級。但是，由于多種病理過程可導(dǎo)致相似地蛋白質(zhì)過量表達或表達不足等變化，蛋白體學(xué)可能比細胞遺傳標(biāo)記檢測技術(shù)的特異性差。免疫化學(xué)分別包括免疫活性物質(zhì)在組織切片或細胞制劑中的組織學(xué)或細胞學(xué)定位，常采用標(biāo)記抗體作為探針試劑?？衫妹庖呋瘜W(xué)，采用對疾病標(biāo)記上的某表位具有特異性的標(biāo)記抗體(探針)試劑處理細胞，然后洗去未結(jié)合的抗體并測定該標(biāo)記的信號來測定細胞樣品中該疾病標(biāo)記(特異性蛋白質(zhì))的濃度。免疫化學(xué)是根據(jù)癌細胞擁有正常細胞不同水平的某些疾病標(biāo)記的特性。癌細胞中一種疾病標(biāo)記的濃度通常足夠大能產(chǎn)生大的信號。因此，依賴于免疫化學(xué)的試驗將可能具有高的靈敏性，產(chǎn)生很少的假陰性。然而，因為除了雖病狀態(tài)外其它因子也可引起疾病標(biāo)記的濃度升高或降低，依賴于特異性疾病標(biāo)記的免疫化學(xué)分析的試驗將很可能特異性差，產(chǎn)生高比例的假陽性。
本發(fā)明提供了一種具有高靈敏度和高特異性的非侵害性疾病檢測和區(qū)別方法。該方法包括使懷疑含有患病細胞的細胞學(xué)樣品與含有多種試劑的探針面板相接觸，各個試劑能與一種特異性疾病標(biāo)記物定量結(jié)合，并檢測和分析探針試劑結(jié)合的模式。本發(fā)明還提供了構(gòu)建和驗證用于檢測一種特異性疾病(或一組疾病)和區(qū)分其不同疾病狀態(tài)的探針面板的方法。還提供了用于檢測肺癌和區(qū)分不同類型肺癌的說明性探針面板。
人體疾病是由于人體器官的適應(yīng)機制不能抵抗外部或內(nèi)部損害，導(dǎo)致機體細胞、組織、器官或系統(tǒng)結(jié)構(gòu)或功能異常。疾病可通過共有的致病機制分類，見下文表1中舉例說明。
表1
疾病是亞細胞、細胞、組織、器官、或人體解剖或生理系統(tǒng)水平上的異常變化(即病理狀況)所引起或者所導(dǎo)致的。許多病病(例如，肺癌)的特征是亞細胞或細胞水平的異常變化。可收集疑患有疾病的患者的樣品(例如，宮頸PAP涂片、廢棄的尿液、血液、痰液、結(jié)腸灌洗液)以診斷那些患者是否存在疾病及其類型。分子病理學(xué)是試圖鑒定和從診斷上利用這些細胞為疾病相關(guān)分子的變化的學(xué)科。
肺癌是這類疾病的一個說明性例子，其中高危人群和危險個體的篩檢可采用診斷試驗進行(例如分子診斷性面板分析)以檢測疾病的存在。而且，使用這些方法已檢測出患肺癌或其它疾病的患者，可采用有關(guān)的診斷試驗將相關(guān)的或同時發(fā)生的疾病狀態(tài)與特異性疾病狀態(tài)相鑒別。例如，在這個肺癌例子中，其它的分子診斷性面板試驗可能表明該患者的疾病可能與下列肺癌類型之一相一致(a)肺鱗狀細胞癌，(b)肺腺癌，(c)大細胞肺癌，(d)小細胞肺癌，或(e)間皮瘤。以細胞為基礎(chǔ)疾病狀態(tài)的早期檢測和鑒別是改善患者結(jié)局的一種假定的方法。
癌是一種腫瘤疾病，其天然病程是致命的。癌細胞，不象良性腫瘤細胞，表現(xiàn)出入侵和轉(zhuǎn)移特性并是高度退行發(fā)育的。癌包括癌瘤和肉瘤兩大類別，但在正常用法中常與癌瘤作為同義詞使用。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，癌癥每年侵襲1000萬以上的人口，并造成超過620萬人的死亡。
實際上，癌癥是可發(fā)生在機體任何部分的疾病的異質(zhì)性集合體。結(jié)果，在所有癌癥中甚至在其具體類型癌癥的諸階段中不同的治療不是同樣有效。在某些情況下，當(dāng)有更大數(shù)量的治療方法可選擇時，診斷學(xué)的進步(例如乳房造影術(shù)、子宮頸細胞學(xué)、和血清PSA檢測)，得以進行早期癌癥的檢測，并且治療傾向于更加有效。當(dāng)一個實體瘤小而局限時，僅外科手術(shù)就足以治愈。然而，當(dāng)腫瘤已擴散時，外科手術(shù)最多僅可提供有限的益處。在這種情況下，化學(xué)療法和/或放射療法的加入可用于治療轉(zhuǎn)移性疾病。雖然對延長生命有某些效果，但治療患有轉(zhuǎn)移性疾病的患者很少治愈。即使可能有最初的反應(yīng)，隨著疾病的發(fā)展，患者最終死于疾病的影響和/或治療藥物的毒性作用。
雖然沒有證實，人們通常承認早期檢測和治療將減少發(fā)病率、死亡率和癌癥治療費用。在許多情況下，早期檢測得以能在轉(zhuǎn)移前開始治療。而且，由于有更多的治療方法可選擇，率獲得治愈或明顯改善的長期存活可能性更高。
開發(fā)一種可用于篩檢“危險”人群的試驗一直是醫(yī)護人員的目標(biāo)。雖然在諸如乳腺癌的乳房造影術(shù)、前列腺癌的PSA測試和子宮頸癌的PAP涂片等取得了某種成功，但是在多數(shù)情況下，是在患者出現(xiàn)癥狀和疾病幾乎已經(jīng)致命的較晚期才檢出癌。對于大多數(shù)癌癥，尚沒有試驗或試驗的組合已顯示出必需的靈敏度和特異性，得以低費用有效地鑒定患有早期疾病的患者。
對于成功的和得到患者、醫(yī)生和第三方付款人所接受的癌癥篩檢程序，必然暗示該試驗有益(能改變結(jié)局)，廣泛可得到并能夠在一般的衛(wèi)生保健框架中容易地進行。該試驗就是相對不具有侵害性，導(dǎo)致(病人)充分的順應(yīng)性，具有高靈敏度和合理的特異性并有預(yù)測價值。另外，該試驗必須可得到，且費用較低。
對于懷疑患有癌癥的患者，必須證實診斷并且對腫瘤作出適當(dāng)?shù)募毎麑W(xué)和臨床分期以便醫(yī)生進行適當(dāng)?shù)尼t(yī)療介入。然而，目前癌癥診斷和分期所采用的某些試驗不是缺乏足夠的靈敏度或特異性，就是太具侵害性，或是作為人群為基礎(chǔ)的篩檢試驗證明費用太高。例如，下文表2和3顯示了對肺癌診斷方法的靈敏度和特異性估計，以及用于檢測肺癌的診斷試驗的費用估計。
表2
肺癌診斷的靈敏性和特異性估計[1]
*取決于診斷時的疾病期
表3
用于肺癌的診斷試驗的費用估計[1]
由于胸部射線照相(X-射線)具有合理的靈敏度、高特異性和低費用，故常常用于檢測和定位癌癥病灶。然而，小病灶常常難以檢測到，雖然較大的腫瘤相對容易在胸片上發(fā)現(xiàn)，但檢測時大量腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移。因此，胸部X-射線照相用作早期檢測方法缺乏必須的靈敏度。
計算機X-射線層析照相術(shù)(CT)可用于證實和特征鑒定肺結(jié)節(jié)并得以檢測出標(biāo)準胸部X-射線照相術(shù)常常不能檢測到的微小異常[2]。CT、和螺旋CT(Spiral CT)方法是特別對患有先前惡性痰液細胞學(xué)結(jié)果或聲帶麻痹的患者保留了可選擇的試驗。CT較常規(guī)胸片具有改進的靈敏度，已成為拍攝中心氣道的主要手段[3]。雖然能夠檢測大范圍的區(qū)域，CT常常受心臟和呼吸運動的假象所影響，雖然通過使用碘化對比材料可獲得分辨率的改進。
螺旋CT(Spiral CT)是CT的一種更快速和靈敏形式，具有比常規(guī)CT或X-射線更可靠地檢測早期癌癥病灶的潛力。螺旋CT在診斷早期疾病中似乎具有大大改進的靈敏性。然而，該試驗具有20％的假陽性率，特異性較低[4]。螺旋CT在檢測占所有肺癌1/3的中心病灶的靈敏度也較低。并且，雖然最初試驗的費用較低($300)，但隨訪的費用可能很高。采用分子診斷性面板試驗的細胞學(xué)作為螺旋CT的附屬試驗提供了有顯著應(yīng)用前景的方法，可通過評價螺旋CT-懷疑的肺結(jié)節(jié)的細針抽吸物(FNA)或活組織檢查(FNB)使假陽性結(jié)果最小化，來改進螺旋CT試驗的特異性。
熒光支氣管鏡檢提供了比常規(guī)白光支氣管鏡檢更高的靈敏度，顯著改進了中心氣道內(nèi)小病灶的檢測[5]。然而，熒光支氣管鏡檢不能檢測外周病灶，支氣管鏡檢人員要花很長時間檢測患者的氣道，并且這是一種昂貴的方法。另外，該方法具有中度侵害性，用作人群篩檢試驗會產(chǎn)生難以克服的障礙。
正電子發(fā)射X射線層析照相術(shù)(PET)是一種高靈敏度試驗，采用放射性葡萄糖鑒定肺中癌細胞的存在[6-8]。建立檢測設(shè)施的費用很高，并且在現(xiàn)場或附近需要回旋加速器。這，加上該試驗的高費用，限制了PET僅用于掃描給肺癌患者分期而不是用于該病的早期檢測。
盡管痰液細胞學(xué)用作篩檢肺癌的方法已有一些時間，但由于靈敏度低和不能減少疾病-特異性死亡率，采用痰液細胞學(xué)僅獲得有限成功。在常規(guī)的痰液細胞學(xué)中，病理學(xué)家采用細胞形態(tài)的特征性改變來鑒定惡性細胞并診斷癌癥。今天只有15％的“處在危險中”的患者或者懷疑患有肺癌的患者進行了痰液細胞學(xué)測試，不到5％的患者進行了多種評價[9]。包括腫瘤大小、位置、分化程度、細胞聚集、釋放細胞和痰液到外部環(huán)境的清除機制失效、以及痰液中細胞穩(wěn)定性差等許多因素導(dǎo)致該試驗整體效果差。
癌癥診斷傳統(tǒng)上依賴于單一分子標(biāo)記的檢測。不幸的是，癌癥是這樣一種疾病，其中單一標(biāo)記通常不能檢測或區(qū)別該疾病的多種形式。因此，僅識別單一標(biāo)記的探針已顯示基本上無效。耗盡精力地尋找“魔術(shù)子彈”(magic bullet)的診斷試驗已進行了幾十年，盡管至今也沒有發(fā)現(xiàn)通用的成功的魔術(shù)子彈探針。
本發(fā)明一個主要應(yīng)用前景是細胞為基礎(chǔ)的癌癥診斷和篩檢。對其它疾病的診斷和治療監(jiān)控將隨著技術(shù)的發(fā)展得到顯著改進，超過采用單一標(biāo)記/探針分析而不是采用多種同時標(biāo)記探針的試劑盒。由于癌癥不是一種單一疾病，這種多元分析方法特別適用于癌癥診斷。而且，這種多-因子“檢測面板(panel)”方法在細胞學(xué)和臨床學(xué)上與癌癥的非均質(zhì)特性相一致。
將面板方法成功實施于細胞為基礎(chǔ)的試驗的關(guān)鍵，是設(shè)計和開發(fā)可在化學(xué)上識別能特表鑒定和區(qū)分各種疾病的標(biāo)記物模式的優(yōu)化探針面板。本專利申請描述了設(shè)計和開發(fā)這種新穎優(yōu)化面板的有效和獨特方法。
用于樣品收集(例如用于痰液細胞學(xué)的point-of-care混合器)和制備(例如，新的細胞學(xué)保存和轉(zhuǎn)運液體，和液體為基礎(chǔ)的細胞學(xué)制備設(shè)備)的改進方法正在開發(fā)中并成為可商品化購得。結(jié)合現(xiàn)有的和這些新興的方法，這種分子診斷學(xué)以細胞為為基礎(chǔ)的面板試驗的成功實施將導(dǎo)致(a)對惡性腫瘤和其它疾病分子概乳的特征性鑒定，(b)對早期癌癥和其它疾病的檢測和鑒別方法的改進，和(c)為改進臨床診斷、預(yù)后、患者特定治療方法和治療性監(jiān)控提供了機會。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及采用細胞為基礎(chǔ)診斷方法檢測普通疾病或辨別特殊疾病狀態(tài)之間差別的一種面板(panel)。該面板包含多個探針，各個探針能特異性地結(jié)合與普通或特殊疾病狀態(tài)相關(guān)的一種標(biāo)記，其中該面板的組成探針與細胞學(xué)樣品中的細胞結(jié)合的模式是診斷所述疾病的存在或特性的依據(jù)。本發(fā)明還涉及采用以細胞為基礎(chǔ)的診斷方法檢測患者疾病或辨別疾病狀態(tài)之間差別的面板的形成方法。該方法包括測定探針結(jié)合的靈敏度和特異性，各個探針能特異性地結(jié)合與疾病相關(guān)的標(biāo)記物文庫的一個成員并選擇有限的數(shù)所述探針，其結(jié)合模式對所述疾病的存在或具體特性有診斷意義。本方法還涉及檢測疾病或辨別疾病狀態(tài)之間差別的方法。該方法包括使懷疑含有某疾病特征性的異常細胞的細胞樣品與權(quán)利要求1所述的面板相接觸，并檢測所述探針的結(jié)合模式，該模式對所述疾病的存在或具體特性有診斷意義。
附圖的簡要說明


圖1、分子標(biāo)記是包含在用于鑒定不同組織類型肺癌的面板中的優(yōu)選標(biāo)記物。標(biāo)示為“％”的攔目表示表達其具體標(biāo)記物的腫瘤樣品的百分比。
圖2、潛在的方法，其中可采用不同的標(biāo)記來辨別具體類型肺癌之間的差異。SQ表示鱗狀細胞癌，AD表示腺癌，LC表示大細胞癌，SC表示小細胞癌，ME表示間皮瘤。各個小格中出現(xiàn)的數(shù)字代表一種細胞類型相對于另一種細胞類型中標(biāo)記物變化的頻率。為了包含于此表中，比率必須大于2.0或小于0.5。數(shù)字大于100通常表示第二種標(biāo)記不被表達。在這種情況下，為了分析目的將分母設(shè)定為0.1。最后，空的小格代表表達上無差別或者缺乏表達數(shù)據(jù)。
圖3、在對照組織和癌組織中探針7和15的H-評分之間的比較。X-軸顯示H-評分而y-軸顯示病例的百分比。
圖4、相關(guān)矩陣，其中相關(guān)性測定一對變量之間的線性相關(guān)量。該矩陣中具有50％或更高的相關(guān)數(shù)字的所有標(biāo)記被認為是相關(guān)標(biāo)記。
圖5、檢測面板組合物、成對方式(pair-wise)辨別面板組合物和聯(lián)合的辨別面板組合物。面板組合物采用決策樹分析，顯示步進式LR和步進式LD。
圖6、檢測面板組合物，其中探針7不作為探針包含在內(nèi)。面板組合物采用決策樹分析，顯示步進式LR和步進式LD。
圖7、檢測面板組合物僅采用商品化的優(yōu)選探針。面板組合物采用決策樹分析，顯示步進式LR和步進式LD。
發(fā)明詳述
1.導(dǎo)言
本發(fā)明提供了一種具有高靈敏度和特異性的非侵害性疾病狀態(tài)的檢測和辨別方法。該方法包括使懷疑含有患疾病細胞的細胞樣品與含有多種試劑的面板相接觸，各個面板能定量地與一種疾病標(biāo)記物相結(jié)合，并檢測試劑結(jié)合的模式。該模式包括與面板結(jié)合的組成探針的位置和密度/濃度。本發(fā)明還提供了用于檢測疾病和用于辨別疾病狀態(tài)之間差異的面板以及用于檢測早期肺癌和辨別不同類型肺癌之間差別的面板的制備方法。面板試驗已用于醫(yī)學(xué)。例如，面板可用于血清分析。然而，由于細胞學(xué)分析包括個體細胞和組織中特異性標(biāo)記物的成象和定位，在本發(fā)明之前，面板方法對細胞學(xué)樣品是否有效是不清楚的。另外，統(tǒng)計分析是否可應(yīng)用于設(shè)計和開發(fā)優(yōu)化的細胞為基礎(chǔ)的診斷性探針面板也是不清楚。
細胞為基礎(chǔ)的篩檢程序的不多例子之一是篩檢子宮頸癌的PAP涂片。該方法已經(jīng)實施了50多年，并且大大地促成了這樣的事實，即今天幾乎沒有一個具有規(guī)律性PAP涂片的婦女死于子宮頸癌。然而，PAP涂片篩檢程序有其缺點。例如，PAP涂片勞動強度大，不能普遍接受。目前采用探針面板的分子診斷細胞為基礎(chǔ)的篩檢方法滑有這些缺點。該方法可以完全自動化并因此減少開支，增加了這種類型試驗的可接受性。
本發(fā)明提供了一種用于檢測疾病狀態(tài)和辨別疾病狀態(tài)之間差異的具有高特異性和高靈敏度的方法。本發(fā)明適用于任何以細胞為為基礎(chǔ)疾病，例如癌癥和傳染病。
此面板對癌病的存在或具體特性有診斷意義。本發(fā)明能夠快速、精確、相對無侵害性和容易地檢測和辨別細胞學(xué)樣品中患病的細胞，克服了已知的疾病檢測方法的局限性和缺點，同時保持了低費用。
制備本發(fā)明面板的本發(fā)明方法的特征是快速，可用這種速度開發(fā)該面板。
在檢測疾病和辨別疾病類型之間差別的方法中使用試劑面板(a panel ofagent)有幾個好處。一個好處是試劑面板具有足夠的豐余度得以檢測和特征鑒定疾病，因此提高了此試驗的靈敏度和特異性。鑒于許多疾病的異質(zhì)性特點，單一試劑不能鑒定巨大數(shù)量的大多數(shù)病例。
采用面板的另一個好處是面板的使用得以根據(jù)表達的特異性模式(探針的位置和密度/濃度)對各種類型疾病之間的差異進行辨別。由于各種類型疾病在發(fā)展速率、對治療的反應(yīng)、和死亡率上可能表現(xiàn)出顯著的差異，知曉具體類型即可幫助醫(yī)生選擇最適的治療方法。
2.面板
本發(fā)明的面板包含有多種試劑，各個試劑可定量地與一疾病標(biāo)記物相結(jié)合，其中面板組成試劑的結(jié)合模式(位置和密度/濃度)可診斷一種疾病的存在或具體特性。因此，該面板可以是檢測面板或辨別面板。檢測面板檢測細胞樣品中是否存在普通疾病狀態(tài)，而辨別面板可區(qū)別已知受到含有不同類型疾病的疾病狀態(tài)影響的細胞樣品中不同的具體疾病狀態(tài)。檢測面板和辨別面板之間的差異在于面板所包含的具體試劑。檢測面板包含具有診斷疾病存在的結(jié)合模式的試劑，而辨別面板包含具有能測定疾病具體特性(即各個類型)的結(jié)合模式的試劑。
一個面板，從定義上講，包含一個以上元件。為什么采用標(biāo)記物面板檢測普通疾病或辨別具體疾病中的差別比只用一種標(biāo)記物有利有幾個原因。一個原因是對于存在于所有患病細胞而不存在于健康細胞中，其行為可用高特異性和靈敏度方法檢測以產(chǎn)生精確測試結(jié)果的一個標(biāo)記物，不可能存在一種探針。如果存在這種單一探針可用于高靈敏度和特異性檢測某具體疾病，它應(yīng)當(dāng)已經(jīng)用于臨床檢測。相反地，它導(dǎo)致面板試驗的選擇，每一個面板由多個探針組成，它們一起提供的檢測能力可保證臨床上足夠的檢測。
然而，如果選擇構(gòu)建包含一個或非常少探針的面板試驗，那么由于一些原因(例如由于生物變異性造成樣品細胞反應(yīng)性減低；許多探針試劑之間固有的變異性；弱的、過時的或有缺陷的加工試劑；對探針的不適宜加工時間或條件)任何單一標(biāo)記物/探針的組合不能執(zhí)行其標(biāo)記功能，可能導(dǎo)致該試驗檢測或辨別目標(biāo)疾病的災(zāi)難性失敗。在各個面板試驗中包含多種探針，甚至豐余的探針可大大增加以下可能性，即任何一個探針的失敗將不會導(dǎo)致該試驗的災(zāi)難性失敗。
探針是能與疾病標(biāo)記物結(jié)合的任何分子結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)。本文使用的術(shù)語“試劑”也可指能與疾病標(biāo)記物結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)。分子探針是生物學(xué)家和臨床醫(yī)生使用的用以檢測和定位表示具體疾病狀態(tài)的標(biāo)記物的尋的裝置。例如，可生產(chǎn)出能特異性結(jié)合先前鑒定為小細胞肺癌標(biāo)記物的蛋白質(zhì)的抗體。然后該抗體探針通過適當(dāng)?shù)拿庖呋瘜W(xué)方法和培育來定位懷疑患病患者的細胞和組織中的目標(biāo)蛋白標(biāo)記物。如果此抗體探針能以化學(xué)計量(即定量)方式與其目標(biāo)標(biāo)記物結(jié)合，并被產(chǎn)色的或有色的“標(biāo)記物”標(biāo)記，那么探針和其目標(biāo)標(biāo)記物的定位和定量可間接地采用光學(xué)顯微鏡和圖象細胞計量技術(shù)完成。
本發(fā)明采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲得的一些方法在DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平上檢測分子標(biāo)記物表達的變化。典型的探針可以是多克隆或單克隆抗體或其片段或與編碼面板中的分子標(biāo)記物的核酸序列互補的核酸序列。探針也可以是一種染料，例如DNA染料。用于本發(fā)明的許多抗體對作為標(biāo)記物的各種細胞表面或細胞內(nèi)抗原具有特異性。該抗體可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的技術(shù)合成。例如，在初步產(chǎn)生了抗標(biāo)記物的抗體后，可測定抗體的序列，并隨后通過重組技術(shù)制備。另外，可購買抗體。
在本發(fā)明的實施例中，探針含有標(biāo)記。一個含有標(biāo)記的探針本文常稱為“標(biāo)記探針”。該標(biāo)記可以是能夠附著在探針上的任何物質(zhì)，因此當(dāng)探針與標(biāo)記物結(jié)合時即發(fā)出一種信號或者標(biāo)記探針可通過檢測者或分析儀檢測。該標(biāo)記也可稱做“標(biāo)記物”。標(biāo)記可使用讀出裝置顯現(xiàn)。術(shù)語“讀出裝置”指用于檢測探針的分析儀器。本發(fā)明預(yù)想的標(biāo)記是能發(fā)出信號并得以鑒定樣品中成分的任何標(biāo)記。優(yōu)選的標(biāo)記包括放射性、熒光、產(chǎn)色或酶分子。因此，可能的檢測方法包括但不限于免疫細胞化學(xué)法、免疫組織化學(xué)法、原位雜交、熒光原位雜交、流式細胞計量術(shù)和圖象細胞計量術(shù)。標(biāo)記探針產(chǎn)生的信號應(yīng)具有足夠的強度使得醫(yī)師可以檢測到。
“標(biāo)記物”、“疾病標(biāo)記物”或“分子標(biāo)記物”是與疾病狀態(tài)或病原體相關(guān)的任何分子結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)。術(shù)語“抗原”可與“標(biāo)記物，”相互交換使用。廣義地定義，標(biāo)記物是由檢測者或儀器特意使用的生物指示劑，以揭示、檢測、或測定特定條件、事件或物質(zhì)的存在或頻率和/或數(shù)量。例如，核苷酸堿基的特定和獨特的序列可用作遺傳標(biāo)記物以在個體中和整個家族中追蹤基因遺傳的模式。相似地，分子標(biāo)記物是特異的分子，例如蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，它在細胞或組織中的存在表示存在特定的疾病狀態(tài)。例如，增殖性癌細胞可表達在相同類型正常細胞上沒有發(fā)現(xiàn)的新的細胞表面蛋白，或可過量表達特異性的分泌蛋白，其豐度的增加和下降(例如分別為過量表達或表達不足)可用作特殊疾病的標(biāo)記物。
用于細胞學(xué)面板的適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物是定位于細胞核、細胞質(zhì)或細胞膜之中或之上的物質(zhì)。標(biāo)記物也可位于存在于細胞中任何位置的細胞器中。位于細胞核中的典型標(biāo)記物包括但不限于成視網(wǎng)膜細胞瘤基因產(chǎn)物(Rb)、細胞周期蛋白A、二磷酸核苷激酶/nm23、端粒酶、Ki-67、細胞周期蛋白D1、增殖性細胞核抗原(PCNA)、p120(增殖相關(guān)的核仁抗原)和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(TTF-1)。位于細胞質(zhì)的典型標(biāo)記物包括但不限于VEGF、表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A(SP-A)、核苷nm23、黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)、粘蛋白1、表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B(SP-B)、ER相關(guān)蛋白質(zhì)p29和黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)。位于細胞膜上的典型標(biāo)記物包括但不限于VEGF、凝血調(diào)節(jié)蛋白、CD44v6、E-鈣粘著蛋白、粘蛋白1、人上皮相關(guān)抗原(HERA)、成纖維細胞生長因子(FGF)、肝細胞生長因子受體(C-MET)、BCL-2、N-鈣粘著蛋白、表皮生長因子受體(EGFR)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-3(GLUT-3)。位于細胞質(zhì)的細胞器中的標(biāo)記物例子是BCL-2，位于(部分)線粒體膜上。位于核的細胞器中的標(biāo)記物例子是p120(增殖相關(guān)的核仁抗原)，位于核仁。
較佳的是表達發(fā)生變化的標(biāo)記物其在疾病發(fā)展的早期產(chǎn)生，由大多數(shù)患病細胞所顯示，能檢測到75％以上的特定疾病類型，最佳90％以上的特定疾病類型和/或能區(qū)分不同類型疾病特特之間的差別。
由于探針能與標(biāo)記物結(jié)合，應(yīng)注意到本發(fā)明的面板可稱作探針面板或標(biāo)記物面板。因此，該面板可包含許多標(biāo)記物或可包含能與特異性標(biāo)記物相結(jié)合的許多探針。為了一致的緣故，本發(fā)明面板稱為探針面板；然而，它也可稱為標(biāo)記物面板。
標(biāo)記物還可包括例如細胞核中惡性腫瘤相關(guān)的變化(MACs)等特征或與癌癥患者的家族史有關(guān)的特征。惡性腫瘤相關(guān)的變化，或MACs，是發(fā)生于位于癌細胞附近外觀正常的細胞中的典型的視覺以下的變化。這些細胞核中極為微小的變化生物學(xué)上可能起因于核基質(zhì)和染色質(zhì)分布模式的變化。即使訓(xùn)練有素的檢測者通過單個細胞的肉眼觀察也不能鑒定它們，但是可采用高度自動化的、計算機化的高速圖象細胞計數(shù)儀進行細胞群的統(tǒng)計學(xué)分析來測定。檢測MACs的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，更詳細的描述見Gruner，O.C.Brit J.Surg.3；506-522(1916)；Neiburgs，H.E.等，Transaction，7th Annual Mtg.Inter.Soc.Cytol.Council 137-144(1959)；Klawe，H.Acta.Cytol.18；30-33(1974)；Wied，G.L.，等，Analty.Quant.Cytol.2；257-263(1980)；和Burger，G.，等，Analyt.Quant.Cytol.3；261-271(1981)。
本發(fā)明包括與疾病相關(guān)的任何標(biāo)記物。各標(biāo)記物本身僅僅是本發(fā)明的工具。因此，本發(fā)明不限于具體的標(biāo)記物。分類標(biāo)記物的一個方法是利用它們與其它分子的功能關(guān)系。如本文所使用的，“功能上相關(guān)”標(biāo)記物是作為所述標(biāo)記物的經(jīng)歷相同生物加工或途徑的組分，并是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知能與所述標(biāo)記物一起異常表達的組分。例如，許多標(biāo)記物與細胞增殖途徑相關(guān)，例如成纖維細胞生長因子(FGF)、(血管內(nèi)皮細胞生長因子)VEGF、細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白D1。其它的標(biāo)記物是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，例如Glut-1和Glut-3。
本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員經(jīng)良好配備能測定功能相關(guān)的標(biāo)記物，并能研究各種標(biāo)記物或進行實驗測定標(biāo)記物的功能行為。通過非限制性的例子，可將標(biāo)記物分類為參與血管生成的分子、跨膜糖蛋白、細胞表面糖蛋白、肺表面活性蛋白、核DNA-結(jié)合磷蛋白、跨膜Ca2+依賴性細胞粘著分子、細胞周期蛋白-依賴性激酶(CDK)的調(diào)節(jié)亞基、二磷酸核苷激酶、核糖核蛋白酶、在增殖性正常和腫瘤細胞中表達的核蛋白、DNA聚合酶δ的輔助因子、在正常組織中沉默而當(dāng)在惡性腫瘤中表達時可為自身的、腫瘤定向和特性的細胞毒T細胞(CTL)所識別的基因、糖基化分泌性蛋白質(zhì)、胃腸道或泌尿生殖道、肺部表面活性物質(zhì)的疏水性蛋白質(zhì)、跨膜醣蛋白、參與增殖、分化和血管生成的分子、原致癌基因、同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子、線粒體膜蛋白、在快速增殖細胞的核仁中發(fā)現(xiàn)的分子、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、或雌激素相關(guān)的熱休克蛋白。
生物標(biāo)記物和探針的類別包括，但不限于(a)形態(tài)學(xué)生物標(biāo)記物，包括DNA倍性、MAC和癌變前疾損；(b)遺傳性生物標(biāo)記物包括DNA加合物、DNA突變和調(diào)亡(apoptotic)指數(shù)；(c)細胞周期生物標(biāo)記物包括細胞增殖、分化、調(diào)節(jié)分子和調(diào)亡標(biāo)記物，和(d)分子和生化生物標(biāo)記物包括致癌基因、腫瘤抑制基因、腫瘤抗原、生長因子和受體、酶、蛋白質(zhì)、前列腺素水平和粘著分子。
“疾病狀態(tài)”可以是任何以細胞為為基礎(chǔ)的疾病。在某些實施例中，該疾病是癌癥。在其它實施例中，該疾病是傳染病。癌癥可以是任何癌癥，包括，但不限于肺、尿道、胃腸道和生殖道的上皮細胞為癌；實體癌和/或以分泌性腫瘤為基礎(chǔ)的癌癥，例如肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、甲狀腺癌、和前列腺癌；和以血液為基礎(chǔ)的癌癥，例如白血病和淋巴瘤。本發(fā)明可檢測的典型癌癥是肺、膀胱、胃腸、宮頸、乳腺前列腺癌?？蓹z測的典型傳染病的例子是以細胞為基礎(chǔ)的疾病，其中傳染性的生物是病毒、細菌、原生動物、寄生蟲或真菌。該傳染病，例如，可以是HIV、肝炎、流感、腦膜炎、單核細胞增多癥、肺結(jié)核和性傳播疾病(STD)，例如衣原體、滴蟲、淋病、皰疹和梅毒。
如本文所用，術(shù)語“普通疾病狀態(tài)”指包含幾種具體疾病類型的疾病，例如肺癌、性傳播疾病和免疫為基礎(chǔ)的疾病。具體的疾病狀態(tài)還指疾病的組織類型。例如，術(shù)語“肺癌”包括幾種具體的疾病，其中有鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌、小細胞肺癌和間皮瘤。術(shù)語“性傳播疾病”包括幾種具體的疾病，其中有淋病、人乳頭瘤病毒(HPV)、皰疹和梅毒。術(shù)語“免疫為基礎(chǔ)的疾病”包括幾種具體的疾病，例如全身性紅斑狼瘡(狼瘡)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和惡性貧血。
如本文所用，術(shù)語“高危險人群”指一組接觸過致病因子的個體，例如，在家里或工作場所的致癌源(即肺癌的“高危險人群”可能是吸煙、被動吸煙和職業(yè)性接觸)。“高危險人群中”的個體也可具有遺傳傾向。
術(shù)語“在危險中”指無癥狀的個體，但是由于家族史或明顯的接觸而處于發(fā)生疾病的明顯危險中(即，處于肺癌危險中的個體具有超過30包一年的吸煙史；“包-年”是將每天吸煙的包數(shù)乘以接觸的年數(shù)計算出的測量單位)。
癌癥是一種細胞分離失去控制的疾病，歸因于例如，基因表達的改變。在本發(fā)明的方法和面板中，癌癥可以是任何器官的惡性生長。例如，癌癥可以是肺、膀胱、腸胃、宮頸、乳房或前列腺癌。各個癌可包含患病或癌癥的組織類型的集合。術(shù)語“組織類型”指不同組織學(xué)的癌癥。取決于癌癥，可以有一種或幾種組織類型。例如，肺癌包括，但不限于，鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌、小細胞癌和間皮瘤。知道患者的癌癥組織類型非常有用，因為它可幫助醫(yī)師定位和特征鑒定法疾病等確定最佳治療策略。
傳染病包括以細胞為為基礎(chǔ)的疾病，其中傳染性生物是病毒、細菌、原生動物、寄生蟲或真菌。
典型的檢測和辨別面板是檢測肺癌，一種普通疾病的面板，和能辨別不同于所有其它類型肺癌和假陽性的一種類型肺癌、特定疾病的面板。假陽性可包括不同類型的轉(zhuǎn)移性癌，例如轉(zhuǎn)移性肝、腎或胰腺癌。
3.制備面板的方法
制備檢測患者普通疾病態(tài)或辨別特殊疾病狀態(tài)之間差別的面板的方法，包括測定探針與普通或特殊疾病狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)記物文庫結(jié)合的靈敏度和特異性，并選擇多個所述探針，其結(jié)合模式(位置和密度/濃度)可診斷該疾病的存在或具體特性。在一些實施例中，進行了任選的初步刪減和制備步驟。制備本發(fā)明面板的方法包括分析與已知組織病理學(xué)樣品中的標(biāo)記物相結(jié)合的模式，即金標(biāo)準。然后可用根據(jù)金標(biāo)準數(shù)據(jù)設(shè)計的分類器設(shè)計用于細胞計量術(shù)，具體是自動細胞計量術(shù)的分類器。因此，用選自病理分析的標(biāo)記物探針組來制備取自細胞樣品，例如痰液、細針抽吸物、尿等的新的培訓(xùn)數(shù)據(jù)組。從特定病灶脫落的細胞將以類似于金標(biāo)準的模式染色。這里描述的方法消除了選擇最佳特征組中的實驗誤差，因為基于金標(biāo)準的組織病理學(xué)樣品的完整性診斷是很高的。原則上，雖然可采用細胞學(xué)樣品來產(chǎn)生面板，但這不夠理想，因為細胞學(xué)樣品包含碎片，細胞樣品中的細胞可能惡化，并且病理學(xué)診斷可能難以得到臨床證實。
標(biāo)記物文庫是一組標(biāo)記物。該文庫可包含任何數(shù)量的標(biāo)記物。然而，在一些實施例中此文庫中標(biāo)記物的數(shù)量受到技術(shù)和/或商品化實踐性所限制，例如樣品的大小。例如，在一些實施例中，針對面板中所有的標(biāo)記物檢測各個樣品。因此，標(biāo)記物的數(shù)量不一定大于樣品可分成的樣品數(shù)量。另一個技術(shù)實踐性是時間。通常，該文庫包含不到60個標(biāo)記物。較佳地，該文庫含有不足50個標(biāo)記物。更加地，該文庫含有不足40個標(biāo)記物。最佳地，該文庫含有10-30個標(biāo)記物。潛在的面板成員文庫含有10個以上標(biāo)記物是較佳的，這樣有可能優(yōu)化面板的性能。如本文所使用術(shù)語“大約”意思是加減3個標(biāo)記物。
在某些實施例中，通過咨詢含有關(guān)于各種標(biāo)記物的信息和標(biāo)記物和普通/特異性疾病之間相互關(guān)系的信息的資料獲得文庫。典型的資料包括實驗結(jié)果、理論的或預(yù)測的分析和文獻資料，例如雜志、書、分類目錄和網(wǎng)址。這些各種各樣的資料可利用組織學(xué)或細胞學(xué)并可依賴于細胞遺傳學(xué)，例如原位雜交；蛋白組學(xué)，免疫組織化學(xué)；細胞計量術(shù)例如MAC或DNA倍性；和/或細胞病理學(xué)例如形態(tài)學(xué)。該標(biāo)記物可定位于細胞內(nèi)或細胞上的任何位置。例如，該標(biāo)記物可定位于細胞核、細胞質(zhì)或細胞膜之中或之上。該標(biāo)記物還可定位于任何前述位置中的細胞器中。
在某些實施例中，該文庫可具有不相稱的大小。因此，在啟動制備面板的基礎(chǔ)方法前可能需要一個或多個刪減步驟。該刪減步驟可包括一個或幾個后續(xù)的刪減步驟。一個刪減步驟可包括，例如，設(shè)定靈敏度和/或特異性的一任意閾值。因此，可將實驗的或預(yù)測的靈敏度和/或特異性低于此閾值的標(biāo)記物從文庫中除去?？蓡为毣蚺c其它刪減步驟順次進行的其它示范性刪減步驟，可能取決于檢測技術(shù)的要求，進入的約束條件和報道結(jié)果的不可重復(fù)性。關(guān)于檢測技術(shù)要求，有可能難以獲得檢測具體標(biāo)記物所需的機器。關(guān)于進入的約束條件，有可能許可證的限制使得難以或不可能獲得能與具體標(biāo)記物結(jié)合的探針。在某些實施例中，對各個標(biāo)記物進行了適當(dāng)?shù)纳钊氲难芯俊?br> 在某些實施例中，在啟動制備面板的基礎(chǔ)方法前，可能需要進行準備步驟。典型的準備步驟包括優(yōu)化用于客觀定量檢測文庫中的標(biāo)記物的方法和收集組織學(xué)樣品。優(yōu)化用于標(biāo)記物的客觀定量檢測方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)。例如，必須獲得必要的試劑和供給，例如緩沖液、試劑、軟件和設(shè)備。有可能試劑的濃度需要校正。例如，如果觀察到非-特異性結(jié)合，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可稀釋探針溶液的濃度。
在某些實施例中，該組織樣品是“金標(biāo)準”(Gold Standards)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道術(shù)語“金標(biāo)準”是指此樣品的組織學(xué)和臨床診斷是已知的。該金標(biāo)準常常稱做“培訓(xùn)”數(shù)據(jù)組。該金標(biāo)準包含一組可能對辨別過程有貢獻的所有特征的測量、或可靠估計量。這種特征可從代表性數(shù)量的患有已知疾病的患者收集的樣品中采集。標(biāo)準樣品可以是細胞學(xué)樣品，但這對于面板的選擇這不夠理想。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，例如活組織檢查，獲得組織樣品。在某些實施例中，每個患者的樣品的大小必須足夠大，這樣可獲得足夠的組織切片以測試文庫中的各個標(biāo)記物。
在某些實施例中，從診斷患有各個特殊疾病的多個患者獲得樣品。每個患者可獲得一個樣品，或者每個患者可獲得多個樣品。在實施例中，從各個患者獲得多個樣品，外科專家依賴于確定從一個患者獲得的各樣晶類假于從該患者獲得的其樣品。還可從對照組患者獲得樣品。對照組患者可以是健康患者或不患有待檢測的普通或特殊疾病的患者。
該基礎(chǔ)方法的第一步是測定探針與所述疾病相關(guān)標(biāo)記物文庫結(jié)合的靈敏度和特異性。在這一步驟中，將對文庫中各個標(biāo)記物具有特異性的探針加到患者標(biāo)本的樣品中。因此在一些實施例中，例如，如果此文庫中有30個標(biāo)記物，各個患者的標(biāo)本將被分為30個樣品并且各個樣品將用對30個標(biāo)記物之一具有特異性的探針處理。該探針包含可看見的標(biāo)記。因此，可檢測到探針與該標(biāo)記物結(jié)合的模式和水平。結(jié)合的模式和水平可定量檢測，即通過分析儀，或由人，例如病理學(xué)家定性檢測。
在某些實施例中，開發(fā)了目標(biāo)和/或定量評分方法以檢測探針與標(biāo)記物結(jié)合的模式和水平。該評分方法可啟發(fā)式地進行設(shè)計。例如，評分方法可用于客觀評價病理學(xué)家做出的主觀解釋。確定適當(dāng)?shù)脑u分方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。在某些實施例中，該評分方法可包括分類特征，例如標(biāo)記物探針染色的密度無、弱、中等或強。在另一個實施例中，這些特征可在顯微鏡載玻片圖象上用公式算法測定。一個典型的評分方法是將比率和密度合并成給強度分級獲得的一種“H評分”如無＝0、弱＝1、中等＝2、強＝3，和細胞百分比如0-5％＝0、6-25％＝1、26-50％＝2、51-75％＝3，＞75％＝4，然后將兩個評分相乘。例如，50％弱染色加上50％中等染將得分6＝(1×2)+(2×2)。該“H評分”以已故的Kenneth Hirsch本發(fā)明者之一命名。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠提出關(guān)于使與病理學(xué)家和樣品有關(guān)的潛在偏差最小化的問題。例如，可采用隨機化來最大程度減少形成系統(tǒng)誤差的機會。盲法可用于消除執(zhí)行實驗的人造成的實驗偏差。例如，在某些實施例中，可通過進行雙盲研究使病理學(xué)家到病理學(xué)家間的差異減到最小。如本文所用，術(shù)語“雙盲研究”是避免偏差的已完善建立的方法，其數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)分析是獨立完成的。在另一個實施例中，通過隨機測試樣品使樣品到樣品的差異最小化。例如，在病理學(xué)家分析樣品之前隨機測試樣品。在實驗方案中也應(yīng)包括隨機化。在某些實施例中，各個樣品通過至少兩個病理學(xué)家的分析。對于每個患者，得到探針與標(biāo)記物結(jié)合的可靠評價。在一個實施例中，這種診斷由有資格的病理學(xué)家作出，每個患者用兩個病理學(xué)家來核查可靠性。
應(yīng)收集充足數(shù)量的樣品以產(chǎn)生可靠的設(shè)計和可靠的統(tǒng)計學(xué)性能估計。測定多少樣品足以產(chǎn)生可靠的設(shè)計和可靠的統(tǒng)計學(xué)性能估計本領(lǐng)域是普的技術(shù)人員已知的。大多數(shù)標(biāo)準分類器設(shè)計包具有確定性能估計的可靠性的方法，并且樣品大小應(yīng)逐漸增加直到獲得可靠的估計。例如，用200個收集的樣品和從各個樣品中評估的27個不同特征可達到產(chǎn)生可靠設(shè)計的充分評估。
第二個步驟是挑選有限數(shù)量的探針。該挑選步驟可采用統(tǒng)計分析和/或模式識別技術(shù)。為了進行此挑選步驟，可將數(shù)據(jù)合并入數(shù)據(jù)庫。在某些實施例中，可給探針編號以在分析它們的效果過程中當(dāng)看不見時提供操作方法并進一步減少偏差。由于這種方法產(chǎn)生了大量的數(shù)據(jù)因此使用了嚴格的統(tǒng)計技術(shù)?？刹捎萌魏谓y(tǒng)計方法并且普通的熟練的統(tǒng)計人員能夠鑒定那一種或多少方法是適當(dāng)?shù)摹?br> 可采用任何數(shù)量的統(tǒng)計分析和/或模式識別方法。由于數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)最初不知道，并且由于用不同分類器設(shè)計方法對不同的結(jié)構(gòu)更好，所以根據(jù)數(shù)據(jù)宜采用至少兩種設(shè)計方法。在某些實施例中，可使用三種不同的方法。數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計分析和/或模式識別領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將從該數(shù)據(jù)組結(jié)構(gòu)特征認識到某些統(tǒng)計方法比其它方法更可能產(chǎn)生有效的結(jié)果，其中在這種情況下有效是指用所需數(shù)量的探針可獲得一定水平的靈敏度和特導(dǎo)性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將得統(tǒng)計分析和/或方法的效果是由數(shù)據(jù)決定的。
典型的統(tǒng)計分析和/或模式識別方法描述如下
一種決策樹方法，稱做C4.5。C4.5是公眾領(lǐng)域軟件可經(jīng)ftp獲自http//www.cse.unsw.edu.au/～quinlan/的，不受版權(quán)限制的軟件。它非常適合于可通過依次對具體特征順序應(yīng)用決定閾值最佳的數(shù)據(jù)。這一工作最好使用不相關(guān)的數(shù)據(jù)；它還用提供方差差異的類型方法處理數(shù)據(jù)?？墒褂肅4.5包提供本文顯示的例子。
a)線性辨別分析。這包括能給出最好類別分離的特征的加權(quán)組合的發(fā)現(xiàn)。這些方法用相關(guān)的數(shù)據(jù)運行得很好，但在具有相似的平均值和不同方差的數(shù)據(jù)中運行得不好。取決于所需的性能估計和圖解輸出，使用了幾個統(tǒng)計包(SPSS、SAS和R)。Fisher的線性辨別函數(shù)用于獲得使誤差率最小的分類器。采用了規(guī)范的辨別函數(shù)計算接受器工作特征(ROC)曲線，當(dāng)決定閾值改變時該曲線顯示靈敏度和選擇性之間的平衡。
c)邏輯回歸。這是線性回歸模式的非線性轉(zhuǎn)化因變量為對數(shù)奇數(shù)比(對元)所取代。線性回歸，象辨別分析，屬于在線性模式基礎(chǔ)上建立的統(tǒng)計方法類型。這種模式依據(jù)說明變量之間的線性關(guān)系。
用足夠數(shù)量的樣品，采用上述技術(shù)和軟件包，尋找能給出類別之間良好分辨力的特征組合是可能的。其它典型的統(tǒng)計學(xué)分析和/或模式識別方法是SPSS中的線性辨別函數(shù)方法和R和SAS中的邏輯回歸方法。SPSS是產(chǎn)品的全名并購自位于SPSS公司，總部在233 S.Wacker Drive，11樓，Chicago，Illinois60606的SPCC公司(www.spss.com)。SAS產(chǎn)品的全名購自SAS研究所，公司，100 SAS Campus Drive，Cary，NC 27513-2414，USA(www.sas.com)。R是產(chǎn)品全名在自由軟件基金會GNU(通用的公眾許可證General Public License)名目下可作為免費軟件得到。
http//www.r-project.org/。
在某些實施例中，獲得一個相關(guān)矩陣。相關(guān)性是測定一對變量之間的線性相關(guān)數(shù)量。相關(guān)矩陣通過用一個標(biāo)記物獲得的數(shù)據(jù)與用另一個標(biāo)記物獲得的數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)獲得。閾值相關(guān)數(shù)例如可設(shè)定為50％相關(guān)。假如這樣的話，具有50％或更高相關(guān)數(shù)目的所有標(biāo)記物將被認為是相關(guān)標(biāo)記物。
在本發(fā)明的某些實施例中，可利用用戶提供的因素來獲得最佳檢測面板。這種權(quán)衡可能與任何因素相關(guān)。例如，某些標(biāo)記物可能比其它標(biāo)記物更占權(quán)衡，因為成本、商業(yè)因素、錯誤分類或誤差比率、一個地區(qū)普通疾病流行、一個地區(qū)特異性疾病流行、探針的冗余和可利用性?？赡芄膭钣脩魴?quán)衡某些標(biāo)記物高于其它標(biāo)記物的某些成本相關(guān)因素，是探針的成本和商業(yè)選取問題，例如許可證有效期和條件?？赡芄膭钣脩魴?quán)衡某些標(biāo)記物高于其它標(biāo)記物的某些商業(yè)考慮相關(guān)因素是，研究和開發(fā)(R&D)時間、R&D成本、R&D風(fēng)險，即探針工作的可能性、分析設(shè)備的最終花費、最終的性能和進入市場的時間。在一個檢測面板中，例如，可能鼓勵用戶權(quán)衡某些標(biāo)記物高于其它標(biāo)記物的某些錯誤分類或誤差比率相關(guān)因素是盡量減少陰性可能是需要的。另一方面，在一個辨別面板中，可能盡量減小假陽性是需要的。與在一個地區(qū)內(nèi)普通或特殊疾病流行相關(guān)的某些因素可能鼓勵用戶權(quán)衡某些探針高于其它探針，這些因素是在某些地區(qū)內(nèi)某些普通或特殊疾病的發(fā)病或多或少地流行。關(guān)于豐余部分，在某些情況下需要該面板中有豐余部分。例如，如果某種原因使一個探能沒能檢測到，是由于面板中標(biāo)記物的生物性變異，但疾病仍可通過其它標(biāo)記物得到檢測。在某些實施例中，標(biāo)記物是優(yōu)選的豐余標(biāo)記物，可能要更重地權(quán)衡。
本發(fā)明在適應(yīng)于特征的可利用性上具有靈活性，其中成本或供給問題可能不允許最好的組合。在一個實施例中，本發(fā)明可簡單地加入可利用的特征以找到另一種組合。在另一個實施例中，使用公式算法選出允許在選擇過程中權(quán)衡成本的特征以達到盡可能減少成本的解決方案。在該實施例中，顯示了對于從所有收集的標(biāo)記物選出的組合或?qū)τ谥挥幸唤M市售的優(yōu)選的探針的標(biāo)記物性能估計。該實施例還顯示了在其高成本的基礎(chǔ)上C4.5包如何可用于減少對某些探針的權(quán)衡。這些探針組合可能不象最佳組合那樣運行得很好，但是在成本是重要因素的情況下其性能可被接受。
采用某些方法使得可將這些考慮加到分類中。這可在C4.5中得到，其中樹型設(shè)計可優(yōu)化成本。而且，辨別函數(shù)方法可給出可用于提出所需要的假陽性或假陰性可能性的單一參數(shù)輸出。用于不同閾值設(shè)定的這些參數(shù)的繪圖稱為接受器運算特征(ROC)曲線。ROC曲線顯示對于分類器的不同閾值水平假陽性與真陽性評分的估計百分比。
鑒于許多普通疾病的異質(zhì)特性，面板的構(gòu)成應(yīng)其豐余度以確保診試驗具有足夠的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值(陽性預(yù)測值＝真陽性/(真陽性+假陽性)和陰性預(yù)測值(陰性預(yù)測值＝真陰性/(加陰性+真陰性)以驗證它們用作人群篩檢的用途。然而，局部和地域性一差別可能支配該試驗在全球市場的不同部分的具體使用，因此可能顯著影響用于構(gòu)建某給定市場的最終面板試驗(paneltest)的標(biāo)準。而臨床應(yīng)用的優(yōu)化極端重要，包括負擔(dān)費用(成本)、技術(shù)能力、實驗室和保健提供者資源、作業(yè)流程問題、人力需求和探針和標(biāo)記物的可獲得性都將影響到面板中使用的標(biāo)記物的最終和局部選擇?？衫帽娝苤木€性辨別函數(shù)分析來包括和評估所有潛在的選擇因素，通過線性辨別函數(shù)分析每個局部因素在方程中由一個術(shù)語代表，并且每個局部因素根據(jù)其局部確定的意義加以權(quán)衡。這樣，在一個區(qū)域使用的優(yōu)化的面板試驗可能與在不同區(qū)域使用的優(yōu)化的面板試驗有所不同。
一旦使用上述方法設(shè)計出檢測或辨別面板(panel)，下一步是用已知的細胞樣品驗證該面板。驗證之前可進行任選的優(yōu)化步驟。在某些實施例中，可改進收集細胞樣品的方法。這包括從患者獲得樣品的方法以及混合細胞樣品的方法。在其它實施例中，可改進細胞提供方法。例如鑒定最佳的固定劑(防腐液)或轉(zhuǎn)運液體。
用于驗證采用金標(biāo)準組織樣品產(chǎn)生的檢測面板的細胞學(xué)樣品，是已明確診斷的細胞學(xué)樣品。這些樣品可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法收集。例如，痰液樣品可通過自發(fā)產(chǎn)生、誘導(dǎo)產(chǎn)生和通過采用增加痰液產(chǎn)生的藥物收集。面使該樣品與面板中的各個探針接觸，并分析探針結(jié)合的水平和模式以確定該面板的性能。在某些實施例中，可能需要進一步優(yōu)化面板。例如，可能需要從面板中除去一個探針?；蛘?，可能需要在面板中加入一個額外的探針。另外，可能需要用另一個探針代替面板上的一個探針。如果加入一個新的探針，該探針可能如相關(guān)矩陣確定的那樣是一種相關(guān)標(biāo)記物。另外，該探針可能是一個功能相似的標(biāo)記物。一旦面板被優(yōu)化，該面板可進行進一步在臨床研究中作檢測。
在其它實施例中，不需要優(yōu)化面板。如果細胞學(xué)樣品的結(jié)果與組織樣品的結(jié)果相關(guān)，就不需要優(yōu)化面板并且該面板可在臨床研究中進行進一步的檢測。
4.使用方法
一旦用上述方法獲得檢測面板，就可應(yīng)用于細胞學(xué)樣品。為了說明該方法，可將癌癥特別是肺癌用做例子。相似的步驟和程序?qū)?yīng)用于其它疾病。預(yù)計具體病灶脫落的細胞將以相似的方式染色并顯示于細胞學(xué)樣品中，例如細針抽吸物、痰液、尿，以類似于獲得檢測面板的組織病理學(xué)樣品所用方式染色。
本發(fā)明的基本方法典型地包含兩個步驟。第一，使懷疑含有患疾病細胞的細胞學(xué)樣品與含有多種試劑的檢測面板接觸，其中各個試劑定量地與疾病標(biāo)記物結(jié)合。然后，檢測各個試劑與疾病標(biāo)記物結(jié)合的水平和模式。檢測結(jié)果可用于診斷普通疾病的存在或分辨特殊疾病之間的差別。一種任選的初步試驗步驟是鑒定試劑的優(yōu)化檢測面板，該面板將輔助疾病的檢測或分辨細胞學(xué)樣品中疾病之間的差別。
細胞學(xué)標(biāo)本可包括但不限于，從體液中收集的細胞樣品，例如血液、尿、脊髓液、和淋巴系統(tǒng)；上皮細胞為基礎(chǔ)的器官系統(tǒng)，例如肺部氣管，如肺部痰液，尿道，例如膀胱沖洗液，生殖道，例如宮頸PAP涂片，和胃腸道，例如結(jié)腸沖洗液；和取自器官和系統(tǒng)中固體組織部位的細針抽吸物，例如乳房、胰、肝、腎、甲狀腺、骨髓、肌肉、前列腺和肺；取自例如乳房、胰、肝、腎、甲狀腺、骨髓、肌肉、前列腺和肺等器官和系統(tǒng)的固體組織部位的活組織檢查；和組織學(xué)樣品，例如外科活組織檢查得到的組織。
本發(fā)明的說明性試劑檢測面板包含允許精確檢測細胞學(xué)樣品中惡性細胞的任何數(shù)量的試劑。本發(fā)明預(yù)想的分子標(biāo)記物可以是有助于惡性細胞檢測的任何分子。檢測面板中包含的標(biāo)記物選擇可根據(jù)與該標(biāo)記物的表達水平或模式的變化相關(guān)的幾種不同標(biāo)準。優(yōu)選的是表達發(fā)生變化的以下分子標(biāo)記物發(fā)生于腫瘤進展的早期，為大多數(shù)腫瘤細胞所表達，能使給定腫瘤類型75％以上得到檢測，最優(yōu)選超過給定腫瘤類型的90％和/或得以分辨癌癥的組織類型之間的差別。
基本方法的第一步是檢測細胞學(xué)樣品中試劑面板的表達水平或模式的改變。該步驟通常包括使細胞學(xué)樣品與試劑，例如標(biāo)記的多克隆或單克隆抗體或其片段或核酸探針接觸，并觀察各個細胞中的信號。檢測到細胞中信號改變即表示標(biāo)記探針?biāo)槍Φ姆肿訕?biāo)記物表達水平改變。該改變依據(jù)是被測定的組織或部位點獲得的非惡性細胞相比表達水平增加或減少。
分析試劑面板表達水平或模式的改變使本領(lǐng)域技術(shù)人員能以高靈敏度和高特異性確定惡性細胞是否存在于該細胞學(xué)樣品中。術(shù)語“靈敏度”指患病者通過臨床試驗得到正確鑒定的條件機率，(真陽性結(jié)果的數(shù)目除以真陽性加假陰性結(jié)果的數(shù)目)。因此，如果一種癌癥檢測方法具有高靈敏度，檢出癌癥的百分比高，例如80％，優(yōu)選大于90％。術(shù)語“特異性”指不患病者通過臨床試驗得到正確鑒定的條件機率，(即真陰性結(jié)果的數(shù)目除以真陰性加假陽性結(jié)果的數(shù)目)。因此，如果一種癌癥檢測方法具有80％、優(yōu)選90％、更優(yōu)選95％的高特異性，該方法產(chǎn)生的假陽性百分比就低?！凹毎麑W(xué)樣品”包括從包含患病細胞的患者收集的任何樣品。本發(fā)明預(yù)想的細胞學(xué)樣品的例子包括體液、上皮細胞為基礎(chǔ)的器官系統(tǒng)沖洗液、刮削的碎屑、刷洗液、涂片或滲出液、和細針抽吸物和活組織檢查。
本發(fā)明所述的標(biāo)記物的用途假定常規(guī)獲得充足的細胞學(xué)樣品是可能的，為了隨后的評估可充分地保存該樣品。細胞學(xué)樣品可作加工和貯藏在適當(dāng)?shù)谋４鎰┲?。較佳地，將細胞學(xué)樣品收集在含有保存劑的小瓶中。該保存劑是已知能保持細胞形態(tài)和抑制或阻遏細胞蛋白和核酸降解的任何分子或分子組合。為了確保適當(dāng)?shù)幕旌?，可在收集地點高速混合樣品以分散樣品和/或分離混淆的材料例如粘液、使細胞接觸于保存劑中。
一旦獲得樣本，需用一適當(dāng)?shù)幕旌涎b置將其勻化。這得以分成等分用于多種目的，包括可能要將等分樣品送到一個以上的測試地點，以及制備多個載玻片和/或在一個載玻片上產(chǎn)生多個沉積點。使用前，標(biāo)本和各個等分先勻化將保證每個個體的載玻片將具有基本上相同分布的細胞，這樣一波載玻片的結(jié)果與另一載玻片比較才有意義。
用于分析的標(biāo)本制備包括將一個樣品加到顯微鏡載玻片上，使用的方法包括但不限于，涂片、離心、或單層細胞沉積。這些方法可以是手工操作、半自動化、或全自動化?？沙槲毎麘腋∫海瑢⒓毎练e在濾膜上，可加工轉(zhuǎn)移到準備好的載玻片上的單層細胞用于進一步的評估。通過重復(fù)這些過程可按需要制備其它載玻片。本發(fā)明包括檢測每波載玻片上的一個分子標(biāo)記物。也預(yù)想了檢測每張載玻片上幾個分子標(biāo)記物。所選每波載玻片上可檢測1-6個標(biāo)記物。在某些實施例中每張載玻片上可檢測到2個標(biāo)記物。在其它實施例中每張載玻片上可檢測3個標(biāo)記物。
本發(fā)明考慮采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲得的許多方法之一檢測DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平上分子標(biāo)記物表達的變化。檢測細胞學(xué)樣品中分子標(biāo)記物表達的水平和模式的變化通常包括使細胞學(xué)樣品接觸多克隆或單克隆抗體或其片段，或接觸編碼檢測面中的分子標(biāo)記物的核酸序列互補的核酸序列，(統(tǒng)稱為“探針”和標(biāo)記)。通常，使探針和標(biāo)記組分操作性相連接，這樣當(dāng)探針與分子標(biāo)記物反應(yīng)時，發(fā)出一個信號(一個“標(biāo)記探針”)。本發(fā)明預(yù)想的標(biāo)記是能發(fā)出或啟動一個信號得以確定樣品中某成分的任何標(biāo)記。優(yōu)選的標(biāo)記包括放射性的、熒光的、產(chǎn)色的或酶促分子。因此，檢測的可能方法包括但不限于，免疫細胞化學(xué)；蛋白組學(xué)，例如免疫化學(xué)；細胞遺傳學(xué)，例如原位雜交、和熒光原位雜交；放射檢測、細胞計量術(shù)和場效應(yīng)，例如MAC和DNA倍性(采用計算機自動化的細胞計量術(shù)進行化學(xué)計量染色核DNA的定量測定)和；細胞病理學(xué)，例如基于形態(tài)學(xué)的定量細胞病理學(xué)。標(biāo)記探針產(chǎn)生的信號較佳地具有足夠的強度使醫(yī)生或技術(shù)人員能檢測到。
一旦制成載玻片，醫(yī)生進行載玻片的顯微鏡觀察以鑒定細胞是否顯示出具有癌癥診斷特征的標(biāo)記物表達的變化。醫(yī)生可利用圖象分析系統(tǒng)和自動顯微鏡鑒定感興趣的細胞。數(shù)據(jù)的分析可利用信息處理系統(tǒng)和算法，這將有助于醫(yī)生做出明確診斷和選擇最佳治療方法。醫(yī)生還可采用能夠檢測標(biāo)記試劑存在的設(shè)備平臺檢測樣品。
分子診斷面板試驗將產(chǎn)生一個或多個具有標(biāo)記細胞和/或組織切片的玻璃顯微鏡載玻片。對于人類專家客觀地評估這些(細胞)病理學(xué)多重標(biāo)記細胞制品并具有臨床上有意義的結(jié)果的挑戰(zhàn)，實際上是一種人類難以克服的檢測和認識問題。
可開發(fā)和使用計算機輔助圖象系統(tǒng)(即Photonic MicroscopesTM)以定量和重現(xiàn)性評估探針標(biāo)記的細胞和組織的數(shù)量和位置。這種PhotonicMicroscopesTM組合了機器人載玻片處理能力、數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)(例如醫(yī)療信息)、和定量數(shù)字(光學(xué)的和電子的)圖象分析硬件和軟件模數(shù)，來檢測和報道細胞為基礎(chǔ)探針的含量和位置數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)不能通過具有相當(dāng)?shù)撵`敏度和精確性的人肉眼目測獲得。這些探針數(shù)據(jù)可用于特征鑒定和區(qū)別細胞樣品，對于各種疾病，將根據(jù)在它們各自的細胞為基礎(chǔ)的標(biāo)記物中它們的相關(guān)特征和差別。
本方法是這樣一種方法，將分子診斷面板應(yīng)用于細胞為基礎(chǔ)的標(biāo)本和樣品，并且隨后利用計算機輔助成象系統(tǒng)來定量和報告分子診斷面板試驗(paneltest)的結(jié)果。這種成象系統(tǒng)可用于評價在給定的載玻片樣品上同時采用多個探針的細胞樣品，其中的探針可作分別分析、定量和報告，因為這些探針在顯微鏡細胞學(xué)或組織載玻片上染色有所區(qū)別。
如果樣品中標(biāo)記試劑產(chǎn)生的信號具有適當(dāng)?shù)念愋秃妥銐虻膹姸?，它們可被人類觀察者(例如病理學(xué)家)通過使用標(biāo)準顯微鏡或計算機輔助顯微鏡檢測到[167]。該計算機輔助顯微鏡是一種人類工程學(xué)的、計算機界面的顯微鏡工作站，它將鼠標(biāo)驅(qū)動控制的顯微鏡操作(例如相變動、聚焦)與主要功能的計算機化自動控制(例如載玻片掃描模式)相結(jié)合。中央數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)(DataManagement System)儲存、組織和展示有關(guān)患者的信息以及所有標(biāo)本篩選和病理學(xué)家觀察得到的結(jié)果。在條形碼上打印上鑒定編號并粘貼在各個樣品的載玻片上可唯一地鑒定數(shù)據(jù)庫中的各個樣品，并與原始標(biāo)本和患者相關(guān)聯(lián)。
在一個較佳的實施例中采用自動圖象分析系統(tǒng)或介面連接于中央數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡Photonic Microscope，檢測和定量樣品中標(biāo)記試劑產(chǎn)生的信號。該光學(xué)顯微鏡提供完全自動化的顯微鏡操作的軟件控制并加入了檢測器和其它適用于定量的組件，即使信號不能被人類觀察者檢測到，例如非常弱的信號或放射性標(biāo)記發(fā)出的信號。用電子學(xué)方法儲存檢測到的信號位置，通過自動化儀器快速重新定位，供人類使用計算機輔助顯微鏡觀察[168]。
中央的數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)使用條形碼鑒定編號將所有的患者和樣品數(shù)據(jù)編檔保存。該數(shù)據(jù)可不同期從多個位點獲得，可能得自多位觀察者供人類細胞學(xué)家和/或自動化分析儀分析。這些數(shù)據(jù)可包括從等分的事先勻化的患者樣品的多張樣品載玻片獲得的結(jié)果，可將部分或全部數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到醫(yī)院的實驗室信息系統(tǒng)或從該系統(tǒng)中取出來滿足報告、歸檔、編制報表或調(diào)節(jié)的需要?？赡墚a(chǎn)生具有面板試驗和人類觀察者整合結(jié)果的一份全面報告并以硬拷貝形式或通過網(wǎng)絡(luò)計算機或互聯(lián)網(wǎng)傳遞給醫(yī)生。
在某些實施例中，本方法使得能差異性辨別不同疾病，例如癌癥的不同組織類型。術(shù)語“組織類型”是指特殊疾病狀態(tài)。根據(jù)普通疾病可以有一種或幾種組織類型。例如，肺癌包括但不限于，鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌、小細胞癌和間皮瘤。知道患者的癌癥組織類型非常有用，因為它幫助醫(yī)生定位和特征鑒定該疾病并確定最佳的治療策略。
為了測定特殊疾病狀態(tài)，選擇一種標(biāo)記物檢測面板，使得以區(qū)分特殊疾病狀態(tài)之間的差別。例如，在一個分子標(biāo)記物檢測面板內(nèi)，可鑒定出表明癌癥具體組織類型的表達模式。檢測分子標(biāo)記物面板的表達水平可通過上述方法實現(xiàn)。優(yōu)選采用具有1-20個分子標(biāo)記物的面板來區(qū)別肺癌不同組織類型之間的差異。然而，優(yōu)選采用4-7個標(biāo)記物。可開發(fā)決策樹以有助于根據(jù)標(biāo)記物表達模式區(qū)分不同組織類型之間的差別。
除了能檢測細胞樣品中的惡性細胞外，本發(fā)明也用于疾病的分子特征鑒定。這種信息常常具有預(yù)后意義并可幫助醫(yī)生為具體患者選擇最佳治療方法。另外，本發(fā)明所述的標(biāo)記物檢測面板可用于監(jiān)控患者復(fù)發(fā)或測定用于治療該疾病的療法的效果。
通過非限制性的實施例，可通過肺癌檢測面板檢測肺癌的存在并可通過辨別面板檢測肺癌的具體類型。如果醫(yī)生確定惡性細胞存在于細胞樣品中，可進行肺癌組織類型的進一步分析。本發(fā)明的肺癌組織類型包括但不限于，鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌、小細胞癌和間皮瘤。圖1顯示鑒定肺癌不同組織類型的面板中所包含的分子標(biāo)記物是優(yōu)選的分子標(biāo)記物。標(biāo)有“％”的欄目表示表達該具體標(biāo)記物的腫瘤標(biāo)本的百分比。
在確定肺癌的各種組織類型時，分析了其標(biāo)記物表達的相對水平。圖2說明可如何利用不同的標(biāo)記物來區(qū)分不同癌癥組織類型之間的差別。在該表中，SQ表示鱗狀細胞癌，AD表示腺癌，LC表示大細胞癌，SC表示小細胞癌和ME表示間皮瘤。各個小格中出現(xiàn)的數(shù)字代表一種細胞類型與另一種細胞類型中標(biāo)記物變化的頻率。此表中包括的比率必須大于2.0或小于0.5。大于100的數(shù)字通常表示第二個標(biāo)記物不表達。在這種情況下，為了分析目的將分母設(shè)定為0.1。最后，空的小格代表表達沒有區(qū)別或缺乏表達數(shù)據(jù)。
分析所收集數(shù)據(jù)的一個方法是構(gòu)建決策圖。圖1-4是決策圖的例子，可構(gòu)建該決策圖以能夠利用表達模式差別性確定肺癌的組織類型。本發(fā)明不以任何方式限于圖1-4中所提出的決策圖。某標(biāo)記物表達的相對水平可高于、低于、或等于(ND)不同組織類型惡性細胞中分子標(biāo)記物表達的水平。各個圖通過利用所示的分子標(biāo)記物檢測面板能夠分辨肺癌的五個組織類型之間的差別。
例如，圖1中面的檢測面板包括HERA、MAGE-3、凝血調(diào)節(jié)蛋白和細胞周期蛋白D1。首先使樣品與針對HERA的標(biāo)記探針接觸。如果HERA的表達比對照低，則此試驗表明肺癌的組織類型是間皮瘤。然而，如果表達高于或等于對照，使此樣品與針對MAGE-3的探針接觸。如果MAGE-3的表達低于對照，使此樣品與針對細胞周期蛋白D1的標(biāo)記探針接觸可能確定為小細胞肺癌(SC)或腺癌(AD)。如果MAGE-3的表達高于或等于對照，使此樣品與針對凝血調(diào)節(jié)蛋白的標(biāo)記探針接觸，可能確定為鱗狀細胞癌(SC)或大細胞肺癌(LC)。
圖1
在圖2中，檢測面板包括E-鈣粘著蛋白、肺表面活性物質(zhì)B(PulmonarySurfactant B)和凝血調(diào)節(jié)蛋白。首先，使樣品與針對E-鈣粘著蛋白的標(biāo)記探針接觸。如果E-鈣粘著蛋白的表達低于對照，該試驗表明肺癌的組織類型是間皮瘤(ME)。然而，如果表達高于或等于對照，使此樣品與針對肺表面活性物質(zhì)B的探針接觸。如果肺表面活性物質(zhì)B的表達低于對照，使此樣品與針對凝血調(diào)節(jié)蛋白的標(biāo)記探針接觸，可能確定為鱗狀細胞癌(SQ)或大細胞癌(LC)。如果肺表面活性物質(zhì)B高于或等于對照，使此樣品與針對CD44v6的標(biāo)記探針接觸，可能確定為腺癌(AD)和小細胞肺癌(SC)。(更多決策圖的例子見圖3和4)。
圖2
圖3
圖4
一個較佳的方法包括使用分子標(biāo)記物檢測面板，在該面板中表達模式的差別得以分辨肺癌不同組織類型之間的差別。
可構(gòu)建許多不同的決策圖以分析標(biāo)記物表達模式。這些信息可為醫(yī)生或其它保健供應(yīng)者所使用以做出對患者治療的決定并選擇最佳的治療策略。
5.檢測面板分析結(jié)果的報告
面板分析的結(jié)果可以幾種方式報告。例如，結(jié)果可報告為簡單的“是或不是”?；蛘?，結(jié)果可報告為測試結(jié)果正確的機率。例如，檢測面板研究的結(jié)果可能表明患者是否患有普通疾病。由于該面板還報告特異性和靈敏度，結(jié)果還可報告為患者患普通疾病的機率。辨別面板分析的結(jié)果將分辨特異性疾病之間的差別。其結(jié)果可報告為對于該特異性疾病是否存在的“是或不是”?；蛘?，其結(jié)果可報告為特異性疾病存在的機率。還可能對一個患者的樣品進行幾種辨別面板分析，并報告存在的疾病是其它可能性的特異性疾病的機率范圍。其它可能性也可包括假陽性。
在產(chǎn)生了各個特殊疾病存在的機率范圍的實施例中，有幾種可能的結(jié)果。例如，可能所有的可能性都是非常小的可能性。在這種情況下，醫(yī)生可能推斷患者的標(biāo)本診斷為假陽性。還有可能除了一種可能性在80-90％以上外，所有的可能性都很低。在這種情況下，醫(yī)生可能推斷此試驗證實患者患有顯示高可能性的特殊疾病。還有可能大多數(shù)疾病的可能性都很低，但對于兩種特殊疾病報告了相似的高可能性。假如這樣的話，醫(yī)生可建議更廣泛的面板試驗以確保鑒定出正確的疾病。另一種可能性是報告的所有疾病的可能性都很低，但其中一種梢高于其它卻沒有高到80-90％的范圍。假如這樣的話，醫(yī)生可建議更廣泛的面板試驗以確保鑒定出正確的疾病和/或排除不同癌癥類型的遠處源發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移性癌癥。
下面的實施例是本發(fā)明方法的說明，該方法用于選擇疾病檢測面板、疾病辨別面板、面板的驗證和面板用于在臨床中篩檢選疾病和分辨不同疾病亞型當(dāng)中的區(qū)別。選擇肺癌用于這種說明性的例子，部分是因為它對于全球健康的重要性，但應(yīng)理解根據(jù)前面通用的公開內(nèi)容，相似的方法將應(yīng)用于其它類型的癌癥，以及傳染病退行性疾病和自身免疫疾病。
說明性實施例
本方法用于開發(fā)肺癌檢測面板以及一種肺癌類型特異性辨別面板。肺癌是多種疾病極為復(fù)雜的組合，可分為兩個主要的類別。占全部肺癌大約70-80％的非-小細胞肺癌(NSCLC)可進一步細分為三種主要的組織類型，包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌。余下的20-30％的肺癌患者患有小細胞肺癌(SCLC)。另外，胸隔的惡性轉(zhuǎn)移病可在暴露于石棉的個體中發(fā)展并常常廣泛蔓延侵襲其它胸部結(jié)構(gòu)。不同形式的肺癌傾向于定位在肺的不同區(qū)域，具有不同的預(yù)后，并對各種治療形式反應(yīng)不同。
根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新的統(tǒng)計(Globocan 2000)，肺癌已成為男人和婦女中最常見的致命性惡性腫瘤，估計每年有124萬新的病例和110萬人死亡。僅在美國，國家癌癥研究所(National Cancer Institute)報道有大約186,000新的肺癌病例和每年162,000人死于這種疾病，占全部癌癥相關(guān)死亡的25％。在美國，肺癌患者整體一年存活率是40％，然而僅14％活過5年。在世界的其它地區(qū)，5年存活率明顯更低(英國為5％)。肺癌的高死亡率可歸因于這樣的事實，即大多數(shù)患者(85％)被診斷時已是癌癥晚期，此時治療選擇有限且疾病可能已轉(zhuǎn)移。在這些患者中，5年存活率在2-30％之間，取決于診斷時的階段。這與患者獲得早期診斷的病例形成強烈對比，其5年存活率大于75％。的確許多新的化學(xué)治療制劑已引入臨床應(yīng)用以治療晚期肺癌，迄今為止，沒有一種制劑在長期存活上產(chǎn)生明顯的改善。盡管早期疾病患者大概可能通過手術(shù)治愈，他們?nèi)蕴幵陲@著的危險中，因為他們具有產(chǎn)生第二次惡性腫瘤的高可能性。因此，對于肺癌患者，早期診斷和治療隨后進行積極的監(jiān)控提供了獲得長期存活率明顯改進連同降低死亡率和費用的最好機會。
目前，被懷疑患有肺癌的患者或者是由于在X-光照片上見到可疑的病灶或者由于患者出現(xiàn)癥狀。結(jié)果，大多數(shù)患者被診斷患有相對晚期的疾病。另外，由于大多數(shù)方法對于早期疾病的檢測缺乏足夠的靈敏度，美國國家癌癥研究所(NCI)、國家健康研究院最近的政策推薦對處在明顯危險中的患者人群進行肺癌篩檢測。然而，在本發(fā)明的這個實施例中，采用痰液細胞學(xué)提供的是相對無侵害性、更加有效和有成本效益的方法來早期檢測肺癌。痰液細胞學(xué)的特異性較高。最近的研究表明有經(jīng)驗的細胞技術(shù)專家能夠高度精確和可靠地識別惡性的或發(fā)育嚴重異常的細胞[10]。雖然當(dāng)從患有相對晚期的疾病的患者中收集樣品時，檢出率高達80-90％[11，12]，總的來說，痰液細胞學(xué)30-40％靈敏度僅為[13，14]。鑒于獲得和制備樣品可能相對昂貴，痰液細胞學(xué)的低靈敏度特別重要。而且，不能檢測到惡性腫瘤可能明顯地延誤治療從而減少獲得治愈的機會。
“處在危險中”人群的選擇也能可影響痰液細胞學(xué)作為篩檢工具的價值。處在顯著危險中的個體包括先前診斷為肺癌的那些個體、長期吸煙者或從前的吸煙者(＞30包年)和長期接觸石棉或肺部致癌物質(zhì)的個體。具有遺傳傾向或家族史的人也包括處在“危險”的人群中。這些個體很可能從檢測中獲益。雖然包括低危險性的個體可導(dǎo)致受檢測病例絕對數(shù)量的增加，但將難以證明保健費用含大大增加。
對于常規(guī)痰液細胞學(xué)的較差性能有影響的其它因素包括病灶的位置、腫瘤大小、組織類型和樣品的質(zhì)量。鱗狀細胞癌占所有原發(fā)肺腫瘤的31％。這些腫瘤的大多數(shù)發(fā)生在區(qū)段支氣管產(chǎn)生并延伸到最接近的肺葉和遠端亞區(qū)段分支[15]。由于這個原因，痰液細胞學(xué)在檢測這些病灶中相當(dāng)有效(79％)。最近，鱗狀細胞癌被看作為肺癌的唯一類型，它在原位或射線方法不能檢出階段經(jīng)得起細胞學(xué)檢測[15]，由于脫落的細胞對于評價可能有用。在一項大的研究中，患者進行胸部X光照片和痰液細胞學(xué)隨訪，單靠細胞學(xué)檢測出所有肺癌患者的23％，提示腫瘤處在早期并且射線方法檢測不出[16]。在另一項研究中[17]，痰液細胞學(xué)檢出76％患者是射線方法不能檢出。
在腺癌情況下，70％的腫瘤發(fā)生于肺的外圍，不太可能在常規(guī)痰液標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)惡性細胞。由于這一原因，用痰液細胞學(xué)腺癌較少被檢測到(45％)[12，18，19]，一個重要的顧慮，因為腺癌的發(fā)病率似乎在增加，特別是在婦女中[20-22]。
腫瘤的大小也可影響獲得正確診斷的可能性，當(dāng)考慮用于無癥狀個體疾病檢測的篩檢測試時，該因素特別重要。雖然僅有50％的機會小于24mm的腫瘤將被讀作真陽性，檢測出較大病灶的機率超過84％[12]。
最近的報道也表明標(biāo)本的細胞構(gòu)成將影響痰液細胞學(xué)的靈敏度[14，23]。通常，鱗狀細胞癌患者產(chǎn)生具有明顯數(shù)量的腫瘤細胞標(biāo)本，從而增加了正確診斷的可能性[14，23]。對于腺癌患者，據(jù)報道在痰液標(biāo)本中存在腫瘤細胞在95％的標(biāo)本中不到10％，在75％的標(biāo)本中不到2％，使診斷明顯地更加困難。
分化的程度也可影響病理學(xué)家檢出惡性細胞的能力，特別是腺癌。分化良好的腫瘤細胞常常類似于非腫瘤性呼吸上皮細胞。在小細胞癌情況下，痰液樣品常常含有具有獨特外觀的松散凝聚的細胞巢(nest)。然而，最近用于加工痰液樣品的技術(shù)傾向于解聚細胞，使診斷更加困難。
樣品質(zhì)量是可造成痰液細胞學(xué)低靈敏度的另一個因素。最近的報道提出可能從70-85％受試者獲得充足的樣品。然而，獲得成功的測定常常需要患者提供多個標(biāo)本[13]。這一方法不方便、耗時并費用大。由于常常要求患者收集好幾天標(biāo)本，患者的順從性通常也低。觀察先前的吸煙者同樣重要，雖然他們處在發(fā)生肺癌的明顯危險中，但常常不能產(chǎn)生足夠的標(biāo)本。樣品的保存和加工是另一個關(guān)鍵因素，可能影響痰液細胞學(xué)作為診斷試驗的價值。
最后，即使能夠獲得充足的樣品和最佳地制備，細胞技術(shù)專家一般要觀察每個樣品的2-4個玻片，每一玻片通常花費4分鐘[24]。鑒于常規(guī)痰液細胞學(xué)的靈敏度低、技術(shù)復(fù)雜性高和勞動強度，毫不奇怪該試驗作為肺癌早期檢測的人群篩檢幾乎被普遍地否定[25]。
即使這些技術(shù)問題得到解決，痰液細胞學(xué)靈敏度仍是一個重要的問題。假陰性結(jié)果的頻繁出現(xiàn)可大大延誤患者接受潛在的有療治療。雖然有可能開發(fā)出具有較大靈敏度的試驗，這種改進必須不會喪失特異性。假陽性結(jié)果數(shù)量的增加將使患者遭受不必要的、常常是侵害性的和費用高的隨訪、并將對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生負面影響。本發(fā)明克服了與先前早期癌癥檢測方法相關(guān)的許多限制，包括與肺癌早期檢測所用的痰液細胞學(xué)相關(guān)的那些限制。
肺癌是疾病的一種異質(zhì)性集合體。為了確保試驗具有必需水平的靈敏度和特異性以證明其作為人群篩檢的用途，本發(fā)明預(yù)想采用，例如，10-30個細胞標(biāo)記物的文庫來開發(fā)檢測面板。本發(fā)明文庫的選擇是根據(jù)相關(guān)科學(xué)文獻的回顧和再分析，其中，在大多數(shù)情況下，檢測取自肺癌患者的活組織中標(biāo)記物的表達，并試圖將表達與預(yù)后相聯(lián)系。
例如，一種早期檢測、特征鑒定、和/或監(jiān)測患者痰液中肺癌的優(yōu)選面板可包括分子標(biāo)記物，在至少75％的腫瘤樣品中該標(biāo)記物表達的變化發(fā)生。一種典型的面板包括選自VEGF、凝血調(diào)節(jié)蛋白、CD44v6、SP-A、Rb、E-鈣粘著蛋白、細胞周期蛋白A、nm23、端粒酶、Ki-67、細胞周期蛋白D1、PCNA、MAGE-1、粘蛋白、SP-B、HERA、FGF-2、C-MET、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子、Bcl-2、N-鈣粘著蛋白、EGFR、Glut-1、ER-相關(guān)的(p29)、MAGE-3和Glut-3的標(biāo)記物。一種優(yōu)選面板包括在85％以上腫瘤標(biāo)本中發(fā)生變化的分子標(biāo)記物。一種典型的面板包括選自Glut1、HERA、Muc-1、端粒酶、VEGF、HGF、FGF、E-鈣粘著蛋白、細胞周期蛋白A、EGF受體、Bcl-2、細胞周期蛋白D1和N-鈣粘著蛋白的分子標(biāo)記物。除Rb和E-鈣粘著蛋白外，肺癌診斷與標(biāo)記物表達的增加相關(guān)。在下面的表4中提供了在本發(fā)明實施例中所用的探針/標(biāo)記物文庫的簡要描述。注意到下表中抗體的編號與貫穿本實施例的抗體/探針/標(biāo)記物的編號一致。
表4
下文描述了該優(yōu)選面板中的各個分子標(biāo)記物。表5，列舉了各型肺癌組織中標(biāo)記物表達的百分比，在這一節(jié)的末尾給出。
葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(Glut1和Glut3)[26-28]
葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(Glut1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-3(Glut3)是一種遍在性表達的高親合力葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白。腫瘤細胞常常顯示比正常細胞高的呼吸率、葡萄糖吸收和葡萄糖代謝，并且認為腫瘤細胞中葡萄糖攝入的提高由葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白所介導(dǎo)。已報道在肺癌中某些類型的GLUT同工型過量表達。Glut1的細胞定位在細胞膜上。GLUT-1和GLUT-3是用于疾病檢測的標(biāo)記物。
惡性細胞顯示葡萄糖攝入增加，這似乎是由葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(Glut)家族所介導(dǎo)。致癌基因和生長因子似乎可調(diào)節(jié)這些蛋白的表達以及它們的活性。蛋白質(zhì)Glut家族的成員在不同的人體組織中顯示不同模式的分布，并且快速增殖常常與它們的過量表達相關(guān)聯(lián)。最近證據(jù)提示Glut1是由大百分率的NSCLC和大多數(shù)的SCLC表達的。
雖然在NSCLC和SCLC中Glut3的表達相對低，相當(dāng)比率(39.5％)的大細胞癌表達此蛋白質(zhì)。在I期腫瘤中，在25％的病例中83％的腫瘤以75-100％的細胞染色水平表達Glut1。這些數(shù)據(jù)提示在腫瘤發(fā)展過程中Glut1的過量表達是相對早的事件。在＞90％的II期和IIIA期癌癥中還檢測了Glut1的免疫反應(yīng)性。在Glut1和Glut3的免疫反應(yīng)性和腫瘤分化之間還顯示出逆相關(guān)。表達高水平的Glut1的腫瘤似乎特別具有攻擊性，這與不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)。如果腫瘤的此蛋白質(zhì)為陰性，可觀察到更好的存活率。
人上皮相關(guān)抗原(HERA)[29，30]
HERA是一種目前尚未知其功能的跨膜糖蛋白。HERA存在于大多數(shù)正常和惡性上皮上。最近的報道提示在NSCLC的所有組織類型中HERA表達很高，使之可以用做檢測標(biāo)記物。相反，在間皮瘤中缺乏HERA表達，因此提示它具有作為辨別標(biāo)記物的用途。HERA的細胞定位在細胞表面。
堿性成纖維細胞生長因子(FGF)[31-34]
堿性成纖維細胞生長因子(FGF)是一種對肝素和其它氨基葡聚糖具有高度親合力的多肽生長因子。在癌癥中，F(xiàn)GF行使強促細胞分裂原功能，在血管生成、分化和增殖中起作用，并參與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。FGF的過量表達常發(fā)生于SCLC和鱗狀細胞癌中。在許多病例中(62％)，細胞還表達FGF受體，提示存在一種自分泌環(huán)。48％的1期腫瘤過量表達FGF。II期肺癌FGF的頻率為84％。生長因子或其受體的表達與不良預(yù)后相關(guān)。那些I期疾病患者、表達FGF5年存活率為73％，相對于那些FGF陰性的患者5年存活率為80％。細胞定位在細胞膜。
端粒酶[35-42]
端粒酶是一種核糖核蛋白酶，它延伸和保持真核染色體的端粒。它包含具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的催化蛋白質(zhì)亞基和具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的RNA亞基以及用做端粒延伸的模板的RNA亞基。不表達端粒酶的細胞隨著每次細胞分裂具有相繼縮短的端粒，這最終導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定、老化和細胞死亡。端粒酶的細胞定位是核。
端粒酶的表達似乎發(fā)生在無限增殖化的細胞中，并且酶的活性是惡性表型的共同特征。大約80-94％的肺癌顯示高水平的端粒酶活性。另外，71％的化生、80％的組織轉(zhuǎn)化和82％的發(fā)育異常表達酶活性。所有的原位癌(CIS)標(biāo)本顯示酶活性。在惡化前組織中低水平的表達可能與樣品中僅少量的細胞(5和20％)表達酶活性的事實相關(guān)。這與腫瘤中20-60％的細胞可表達酶活性形成對比。根據(jù)樣品有限的數(shù)量，將出現(xiàn)端粒酶活性的表達在SCLC中也是常見的。
增殖性細胞核抗原(PCNA)[43-51]
PCNA行使DNA聚合酶δ的輔助因子功能。PCNA在細胞周期的S期和與DNA修復(fù)相關(guān)的DNA合成期中表達。PCNA在廣泛的正常和惡性組織的增殖細胞中表達。PCNA的細胞定位為細胞核。
PCNA的表達是快速分裂細胞的共同特征并在98％的腫瘤中檢測到。免疫組織化學(xué)染色是在83％的NSCLC中檢測到中到強染色的細胞核。在51％的p-53-陰性腫瘤中觀察到強PCNA染色。然而，當(dāng)PCNA(＞50％的細胞染色)和p53都過量表達時(＞10％的細胞染色)，預(yù)后傾向于在更短的發(fā)展時間里更差。雖然PCNA常在肺癌的所有階段中檢測到，但在轉(zhuǎn)移性疾病中更常見強染色。31％的CIS也過量表達PCNA。
CD44[51-58]
CD44v6是一種作用為細胞粘著分子的細胞表面糖蛋白。它在上皮、間皮和造血組織的廣范正常和惡性細胞中表達。已顯示在某些人惡性腫瘤中特異性CD44的剪接變體的表達與轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。預(yù)計它可用于鱗狀細胞癌和腺癌之間的檢測和辨別。CD44是一種細胞粘著分子，似乎在腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移中起作用。另一種剪接導(dǎo)致幾個變體同工型的表達。通常在SCLC中缺乏CD44表達，在NSCLC中不定表達。最高水平的表達發(fā)生于鱗狀細胞癌，因此其在腫瘤類型之間的辨別中具有價值。在非腫瘤的組織中，在支氣管上皮細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和肺小泡細胞(alveolar pneumocyte)中觀察到CD44染色。在CD44表達和腫瘤分期、復(fù)發(fā)或存活率之間沒有明顯的相關(guān)性，特別是當(dāng)過量表達發(fā)生于疾病早期時。在轉(zhuǎn)移性的病灶中，100％的鱗狀細胞癌和75％的腺癌顯示CD44v6強陽性。這些數(shù)據(jù)傾向于表明CD44表達的變化發(fā)生在腫瘤發(fā)展的相對晚期，這限制了其作為早期檢測標(biāo)記物的價值。最近的發(fā)現(xiàn)提示CD44v8-10變體由大部分的NACLC表達，使之可能成為候選的標(biāo)記物。
細胞周期蛋白A[59-62]
細胞周期蛋白A是在細胞周期的特定時期控制轉(zhuǎn)變點的細胞周期蛋白-依賴性激酶(CDK)的調(diào)節(jié)性亞基。在S期和在向G2期發(fā)展的過程中可檢測到它。細胞周期蛋白A的細胞定位是細胞核。
含有細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶的蛋白質(zhì)復(fù)合體具有調(diào)節(jié)細胞周期進程的功能。細胞周期蛋白表達的變化與影響CCDN1基因的遺傳改變相關(guān)。雖然細胞周期蛋白起調(diào)節(jié)分子的作用，細胞周期蛋白-依賴性激酶細胞周期蛋白作為活化和滅活Rb的催化亞基。
免疫組織化學(xué)分析揭示細胞周期蛋白的過量表達與Ki-67高標(biāo)記指數(shù)所表明的細胞增殖的提高有關(guān)。細胞周期蛋白的過量表達發(fā)生于75％的NSCLC中并似乎發(fā)生在腫瘤進程的相對早期。最近的報道表明66.7％的I/II期和70.9％的III期腫瘤過量表達細胞周期蛋白A。在不良分化的腫瘤中核著色是普遍的。細胞周期蛋白A的表達常常與平均存活時間減少和產(chǎn)生抗藥性傾向相關(guān)。然而，表達的增加還與對阿霉素的較大反應(yīng)相關(guān)。
細胞周期蛋白D1[63-73]
細胞周期蛋白D1，與細胞周期蛋白A一樣，是控制細胞周期特定時期轉(zhuǎn)變點的細胞周期蛋白-依賴性激酶(CDK)的調(diào)節(jié)亞基。細胞周期蛋白D1調(diào)節(jié)細胞進入細胞周期的S期。在大范圍的人類惡性腫瘤中該基因常被擴增和/或其表達下調(diào)。細胞周期蛋白D1的細胞定位是細胞核。
和細胞周期蛋白A一樣，細胞周期蛋白D1行使調(diào)節(jié)細胞周期進程的功能。細胞周期蛋白D1的著色主要是細胞質(zhì)與組織類型無關(guān)。報道提示細胞周期蛋白D1的過量表達發(fā)生于40-70％的NSCLC和80％的SCLC中。在37.9％的I期60％的II期和57.9％的III期腫瘤中觀察到細胞周期蛋白D1著色。細胞周期蛋白D1的表達還見于發(fā)育異常和化組織中，提供了這些變化發(fā)生于腫瘤進程相對早期的證據(jù)。過度表達細胞周期蛋白D1的患者顯示較短的平均存活時間和較低的5年存活率。
肝細胞生長因子受體(C-MET)[74-77]
C-MET是一種編碼用于HGF的跨膜受體酪氨酸激酶的原癌基因。HGF是肝細胞和內(nèi)皮細胞的一種促有絲分裂原，并對幾種上皮細胞起源類型的細胞發(fā)揮多效(pleitrophic)活性。C-MET的細胞定位是細胞表面。
肝細胞生長因子/擴散因子(HGF/SF)刺激廣譜的上皮細胞，引起它們增殖、移動和進行包括血管生成的復(fù)雜分化過程。HGF/SF結(jié)合由c-MET致癌基因編碼的受體。盡管正常和惡性組織都表達HGF受體，HGF/SF的表達似乎局限于惡性組織。
盡管人肺通常表達低水平的HGF/SF，但在NSCLC中表達明顯增加。采用蛋白質(zhì)印跡分析，88.5％的肺癌顯示此蛋白質(zhì)表達增加。所有組織類型的腫瘤都以增加的濃度表達此蛋白質(zhì)。盡管蛋白質(zhì)水平的增加發(fā)生于疾病的所有階段，最近的證據(jù)提示除癌細胞外，基質(zhì)細胞和/或炎性細胞可能產(chǎn)生此生長因子。
粘蛋白(Mucin)-MUC-1[78-82]
粘蛋白-1來自高度糖基化的分泌蛋白家族，該家族包括的主要蛋白成分為包被和保護氣管支氣管樹、胃腸道和泌尿生殖道的粘液凝膠。粘蛋白-1在上皮性腫瘤中非典型地表達。粘蛋白-1的細胞定位是細胞質(zhì)和細胞表面。
粘蛋白是一種高分子量的糖蛋白家族，由多種分泌性上皮細胞合成，有膜結(jié)合性或分泌性。在呼吸道內(nèi)，這些蛋白質(zhì)形成包被和保護氣管支氣管樹的粘液凝膠。粘蛋白表達的變化常發(fā)生于包括肺癌的惡性轉(zhuǎn)移結(jié)合處?，F(xiàn)存的證據(jù)表明這些變化可作用于細胞生長調(diào)節(jié)的改變、免疫系統(tǒng)的識別和腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力。
雖然正常肺組織表達MUC-1，但發(fā)現(xiàn)在具有最高水平腺癌發(fā)生的肺癌中有明顯較高水平的表達。著色似乎與疾病期無關(guān)，在吸煙者中比在先前吸煙者或不吸煙者中更常見。一些惡變前病灶也顯示出MUC-1表達增加。
甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(TTF-1)[83-84]
TTF-1屬于同源域轉(zhuǎn)錄因子家族，能活化甲狀腺特異性和肺特異性分化基因。TTF-1的細胞定位是細胞核。
TTF-1是一種最初發(fā)現(xiàn)能介導(dǎo)甲狀腺球蛋白轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。最近，在間腦和細支氣管小泡上皮細胞中也發(fā)現(xiàn)了TTF-1的表達。在肺中，TTF-1功能是作為調(diào)節(jié)表面活性物質(zhì)蛋白和克拉拉分泌蛋白合成的轉(zhuǎn)錄因子。TTF-1的過量表達發(fā)生于大部分的肺腺癌中并可能有助于鑒別原發(fā)肺癌和轉(zhuǎn)移到肺的癌?？蓹z測到表達TTF-1并具細胞角蛋白7陽性和細胞角蛋白20陰性的腺癌，靈敏度95％。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[33-，61，85-89]
VEGF在血管發(fā)生中起重要作用，它促進腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移。有多種形式的VEGF；兩種較小的同工型是分泌蛋白并起擴散劑作用，而較大的兩種保持與細胞聯(lián)接。VEGF的細胞定位是細胞質(zhì)、細胞表面和胞外基質(zhì)。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種重要的新血管生成因子和內(nèi)皮細胞特異性促有絲分裂質(zhì)。新血管生成是癌發(fā)生后期、腫瘤發(fā)展中的重要過程，在產(chǎn)生遠距離轉(zhuǎn)移中特別重要。VEGF能與常常存在于表達生長因子的腫瘤中的特異性受體Flt結(jié)合，提示存在一種自分泌環(huán)。
免疫組織化學(xué)分析揭示表達VEGF的細胞顯示擴散性和細胞質(zhì)著色模式。雖然非腫瘤細胞不表達，VEGF存在于大部分的NSCLC和較小比例的SCLC中。一些報道顯示在早期肺癌中有高水平的VEGF。
VEGF的表達與轉(zhuǎn)移頻率的增加相關(guān)。研究顯示VEGF表達表明腺癌(但不是鱗狀細胞癌)不良預(yù)后和較短的無病間隔。與低水平VEGF組3年和5年存活率分別為90.9和77.9％相比較，表達高水平VEGF的組3年和5年存活率為50％和16.7％。
表皮生長因子受體(EGFR)[90-104]
表皮生長因子受體(EGFR)是一種跨膜糖蛋白，它能被各種配體結(jié)合并活化。結(jié)合啟動了一系列事件導(dǎo)致DNA合成、細胞增殖和細胞分化。已證明EGFR存在于廣譜的正常組織中，并發(fā)現(xiàn)在各種腫瘤中有EGFR的量表達。肺腺癌和大細胞癌(而非-小細胞肺癌)中觀察到其表達增加。EGFR的細胞定位是細胞表面。
EGFR在細胞生長和分化中起重要作用。EGFR均一地存在于表皮細胞層，但不存在于組織學(xué)正常的支氣管上皮的表層。由于這個例外，正常組織不會均一著色。最近的證據(jù)提示EGF受體的過量表達對于侵入性肺癌的發(fā)展不是絕對必要的條件。然而，似乎在EGFR發(fā)生過量表達的情況下，這是一個在更多晚期疾病中具有較強的染色強度的相對早期事件。
對于患有侵入性癌的患者，腫瘤的EGF著色為50-77％。EGFR的過量表達在鱗狀細胞癌中比在腺癌中更常見并且在SCLC中常見。最高水平的EGFR發(fā)生在晚期和轉(zhuǎn)移性疾病結(jié)合處，其水平約為I/II期腫瘤中見到的EGFR濃度的兩倍。這些評價提示在I期腫瘤中觀察到的EGFR水平大約為正常組織中見到的兩倍。另外，48％的支氣管病灶也顯示EGFR著色，包括組織轉(zhuǎn)化、非典型、發(fā)育異常和CIS。在這些相同的癌癥患者“正常的”支氣管粘膜中，，39％的病例觀察到EGFR過量表達，但是在非癌癥的支氣管上皮中未見到EGFR過量表達。另外，發(fā)生EGFR的過量表達在吸煙者的腫瘤中比不吸煙者中更為頻繁，特別是在鱗狀細胞癌中。
盡管幾項研究提示EGFR的過量表達與不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)，其它的研究未能獲得這一相關(guān)性。
二磷酸核苷激酶/nm23[105-111]
二磷酸核苷激酶(NDP激酶)/nm23是一種二磷酸核苷激酶。具有高度轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細胞常常缺乏或僅少表達的nm23蛋白質(zhì)，所以nm23蛋白被描述為轉(zhuǎn)移抑制蛋白。nm23的細胞定位是核和細胞質(zhì)。
nm23/二磷酸核苷/激酶A(nm23)的表達是腫瘤進殿的一個標(biāo)志，其中在表達和轉(zhuǎn)移潛力之間具有反相關(guān)。如果I期腫瘤過量表達nm23，在平均35個月的隨訪中沒有見到轉(zhuǎn)移的證據(jù)。免疫組織化學(xué)分析揭示染色是擴散的、細胞質(zhì)的和通常局限于惡性細胞。肺泡巨噬細胞也表達此蛋白質(zhì)。鑒于其高水平表達與低轉(zhuǎn)移潛力相關(guān)，目前還不能解釋為什么正常上皮細胞不表達nm23。
在高比率的NSCLC中，特別是大細胞肺癌和74％的SCLC中觀察到強烈染色，提示該蛋白質(zhì)在腫瘤進展中起重要作用。除鱗狀細胞癌外，染色強度似乎隨病期的發(fā)展而增高。根據(jù)可得到的證據(jù)，似乎nm23在SCLC和NSCLC中都是預(yù)后因子。
Bcl-2[101-，112-125]
Bcl-2是一種在調(diào)亡抑制中起中心作用的線粒體膜蛋白。Bcl-2過量表達是程序性細胞死亡受抑制的細胞的共同特征。Bcl-2的細胞定位是細胞表面。
Bel-2是被認為在促進細胞的最終分化、延長非-周期細胞(non-細胞周期蛋白g cell)存活和阻抑周期細胞凋亡中起作用的一種原癌基因。Bcl-2可能作為同型二聚體存在或可形成具有Bax的異質(zhì)二聚體。作為一種同型二聚體，Bax行使誘導(dǎo)凋亡的功能。然而，Bax-bcl-2復(fù)合體的形成阻抑了細胞凋亡。通過阻抑凋亡，bcl-2表達似乎向受疾病侵襲的細胞提供了存活優(yōu)勢。Bcl-2表達也可在抗藥性發(fā)展中起作用。Bcl-2的表達受p53的負調(diào)節(jié)。
bcl-2的免疫組織化學(xué)分析揭示細胞質(zhì)染色為異質(zhì)模式。在腺癌中，bcl-2的表達明顯地與較小腫瘤(＜2cm)和較低的增殖活性相關(guān)。大百分率的SCLC中，bcl-2的表達似乎與神經(jīng)內(nèi)分泌分化和發(fā)生更加密切相關(guān)。
腫瘤前病灶中不存在Bcl-2的過量表達，提示bcl-2的變化在腫瘤發(fā)展進程中發(fā)生得相對較晚。除腫瘤細胞外，bcl-2的免疫染色也發(fā)生于基底細胞中和正常細支氣管的腔(luminal)表面，但在更多的分化的細胞類型中通常檢測不到。
在NSCLC中bcl-2免疫反應(yīng)性與改進的預(yù)后相關(guān)是有爭議的。一些報道提出雖有表達bcl-2的腫瘤的患者具有良好的預(yù)后并且復(fù)發(fā)需要更長的時間。一些報道表明bcl-2的表達在患有轉(zhuǎn)移性疾病的患者中傾向于降低。對鱗狀細胞癌患者，bcl-2的表達與5年存活率的改善相聯(lián)系。然而，在三個較大規(guī)模的研究中沒有將存活著處與bcl-2表達相關(guān)聯(lián)，特別是對早期疾病患者。
雌激素受體-相關(guān)蛋白(p29)[126]
ER相關(guān)蛋白p29是一種發(fā)現(xiàn)與雌激素受體的表達相關(guān)的雌激素-相關(guān)熱休克蛋白。p29的細胞定位是細胞質(zhì)。
雌激素依賴性細胞內(nèi)加工在正常組織的生長調(diào)節(jié)中很重要并可能在惡性腫瘤的調(diào)節(jié)中起作用。在一項研究中，111個肺癌有109個肺癌檢測到(98％)p29的表達。p29表達和存活時間之間的關(guān)系對于男人和女人是不同的。p29的表達與較差的存活相關(guān)，特別是在I和II期疾病的婦女中。在男人中，p29表達與長期存活之間沒有相關(guān)性。
成視網(wǎng)膜細胞瘤基因產(chǎn)物(Rb)[68，73，123，127-141]
成視網(wǎng)膜細胞瘤基因產(chǎn)物(Rb)是一種核DNA-結(jié)合磷蛋白。磷酸化的Rb能結(jié)合DNA腫瘤病毒的癌蛋白以及基因調(diào)節(jié)蛋白從而抑制DNA的復(fù)制。Rb蛋白可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起作用；Rb功能的喪失導(dǎo)致失控的細胞生長。Rb的細胞定位是核。
成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(pRb)是一種由成視網(wǎng)膜細胞瘤基因編碼的蛋白質(zhì)并以細胞周期依賴方式磷酸化和脫磷酸化。認為PRb是在G0/G1期行使調(diào)節(jié)細胞周期功能的一種重要的腫瘤抑制基因。在其高磷酸化(hypophosphorylated)狀態(tài)中，pRb能抑制從G1向S期的轉(zhuǎn)變。在G1期中，當(dāng)細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)磷酸化此蛋白時，發(fā)生pRb的生長抑制特性的失活。pRb的高磷酸化(hyperphosphorylation)阻止其形成具有E2F的復(fù)合體，該復(fù)合體功能是作為DNA合成所需要的轉(zhuǎn)錄因子蛋白。
已在不同類型癌癥中證明成視網(wǎng)膜細胞瘤(Rb)基因的失活，包括肺癌。小細胞癌不能對pRb染色表明Rb功能喪失?？偟恼f來，17.6％的腫瘤不能表達pRb，與關(guān)于病期或結(jié)節(jié)狀況報見的無相關(guān)性。在31％發(fā)育異常的支氣管活組織檢查中也見到染色的減少。然而，似乎在pRb表達和發(fā)育異常的嚴重程度之間沒有相關(guān)性。相反，取自臨近腫瘤區(qū)域的正常支氣管上皮和細胞表達了pRb陽性核。這些數(shù)據(jù)提示Rb蛋白表達的改變可能發(fā)生在某些肺癌發(fā)展的早期。
Rb陽性的癌患者傾向于具有略微良好的預(yù)后，但是在大多數(shù)研究中此差異并不明顯。然而，腺癌患者，其腫瘤是pRb陰性和或者p53ras陽性，顯示5年存活率下降。鱗狀細胞癌中沒有出現(xiàn)相似的關(guān)系。已報道pRb陰性腫瘤比Rb陽性腫瘤更可能顯示對阿霉素的抗性。
凝血調(diào)節(jié)蛋白[142-147]
凝血調(diào)節(jié)蛋白是一種跨膜糖蛋白。通過它加速蛋白質(zhì)C的活化(進而通過結(jié)合蛋白質(zhì)S和凝血酶起抗凝血劑)，TM的合成是減少內(nèi)皮細胞表面凝塊形成的幾種重要機制之一。凝血調(diào)節(jié)蛋白的細胞定位是細胞表面。
循環(huán)性腫瘤細胞凝聚宿主血小板似乎在轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。凝血調(diào)節(jié)蛋白通過凝血酶在活化抗凝血劑蛋白C中起著重要作用是血管內(nèi)凝血的重要調(diào)節(jié)劑。除了在正常鱗狀上皮中表達外，凝血調(diào)節(jié)蛋白的表達也發(fā)生在鱗狀上皮組織轉(zhuǎn)化、原位癌、和侵入性鱗狀細胞癌中。雖然存在于74％的源發(fā)鱗狀細胞癌中，只有44％的轉(zhuǎn)移性病灶對凝血調(diào)節(jié)蛋白著色。這些數(shù)據(jù)提示，隨著癌癥的發(fā)展，凝血調(diào)節(jié)蛋白的表達下降。當(dāng)與分化不良的腫瘤相比時，較高水平的表達傾向于發(fā)生在良好和中度分化的腫瘤中。
凝血調(diào)節(jié)蛋白-陰性鱗狀細胞癌患者傾向于具有更差的預(yù)后。18％凝血調(diào)節(jié)蛋白-陰性患者擁有5年存活率，與之相比，此蛋白質(zhì)染色陽性的腫瘤病例5年存活率為60％。發(fā)展成為轉(zhuǎn)移性疾病在凝血調(diào)節(jié)蛋白-陰性腫瘤中也更常見(69％比37％)這些腫瘤發(fā)展到胸部外(extrathorasic)的傾向更大。因此，鱗狀細胞癌病例喪失凝血調(diào)節(jié)蛋白表達似乎是預(yù)兆性的。觀察凝血調(diào)節(jié)蛋白表達的變化發(fā)生于NSCLC的晚期并且是正常支氣管上皮細胞表達此蛋白質(zhì)這將傾向于限制其作為早期檢測標(biāo)記物的用途。然而，由于大部分間皮瘤和僅一小部分腺癌表達凝血調(diào)節(jié)蛋白，該標(biāo)記物具有辨別這兩種腫瘤類型的潛在用途。
E-鈣粘著蛋白和N-鈣粘著蛋白[148-151]
E-鈣粘著蛋白是一種跨膜Ca2+依賴性細胞粘著分子。它通過控制組織結(jié)構(gòu)和保持組織完整性的機制在細胞的生長和發(fā)育中起重要作用。E-鈣粘著蛋白促進上皮細胞的細胞間粘著、上皮極化的建立、腺體分化和層化。已在許多癌瘤中觀察到E-鈣粘著蛋白表達下調(diào)并通常與晚期和進程相關(guān)。E-鈣粘著蛋白的細胞定位是細胞表面。
E-鈣粘著蛋白是一種鈣依賴性上皮細胞粘著分子。E-鈣粘著蛋白表達的下降與腫瘤去分化和轉(zhuǎn)移以及存活率降低相聯(lián)系。在中度分化和分化差的鱗狀細胞癌和SCLC中觀察到其表達下降。腺癌中E-鈣粘著蛋白表達沒有變化。而且，雖然腺癌表達E-鈣粘著蛋白，但這些腫瘤不能表達N-鈣粘著蛋白，這與間皮瘤表達N-鈣粘著蛋白而不表達E-鈣粘著蛋白相反。因此，這些標(biāo)記物可用于分辨腺癌和間皮瘤之間的差別。
E-鈣粘著蛋白的表達還可用于評估鱗狀細胞癌患者的預(yù)后。其中60％的表達E-鈣粘著蛋白的腫瘤患者存活了3年，僅36％的顯示表達降低的患者存活了3年。
MAGE-1和MAGE-3[152-156]
黑色素瘤抗原-1(MAGE-3)和黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)是在正常組織中通常沉默但在惡性腫瘤中表達的一個基因家族的成員，可為自身指向腫瘤的特異性細胞毒T細胞(CTLV’s)所識別。MAGE-1和MAGE-3的細胞定位是細胞質(zhì)。
MAGE-1、MAGE-3和MAGE-4基因產(chǎn)物是可為細胞毒T淋巴細胞所識別的腫瘤相關(guān)抗原。如此，它們在NSCLC中可用做免疫療法的靶標(biāo)。一些SCLC也表達MAGE蛋白，但正常細胞不表達。當(dāng)MAGE表達的頻率下降至低于用做檢測標(biāo)記物所必需的水平時，組織類型之間表達模式的差別提示MAGE表達可用作辨別標(biāo)記物。這一用途還得到如下觀察的支持，即50％的鱗狀細胞癌中超過90％的腫瘤細胞顯示出的MAGE-3過量表達的證據(jù)，30％的腫瘤在至少50％的細胞中顯示其過量表達。
核仁蛋白(p120)[157]
p120(與增殖相關(guān)的核仁抗原)見于G1早期快速增殖細胞的核仁中。P120的細胞定位是核。
核仁蛋白p120是一種其功能尚未闡明的與增殖相關(guān)的蛋白質(zhì)。在腫瘤的組織中檢測到強染色，但在巨噬細胞和正常組織中沒有檢測到。p120的過量表達在鱗狀細胞癌中比在腺癌或大細胞癌中更加常見，提出了這一標(biāo)記物可用于辨別腫瘤類型的可能性。
肺表面活性物質(zhì)[83，158-166]
肺表面活性物質(zhì)是一種富含磷脂的混合物，其功能是減小肺泡-液體界面上的表面張力，因此提供了換氣所必需的肺泡穩(wěn)定性。表面活性物質(zhì)蛋白似乎專門在氣道中表達，由肺泡II型細胞產(chǎn)生。非腫瘤性肺中，在正常和化生的肺泡II型細胞和一些無纖毛支氣管上皮細胞中檢測到原-表面活性物質(zhì)-B的免疫反應(yīng)性。60％的腺癌的10-50％腫瘤細胞含有強的細胞質(zhì)免疫反應(yīng)性顯大部分染色。對于原-表面活性物質(zhì)-B鱗狀細胞癌和大細胞癌不能染色。
表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B(SP-B)是組成肺表面活性物質(zhì)的四種疏水性蛋白質(zhì)之一，是由II型肺泡細胞分泌的磷脂和蛋白質(zhì)的復(fù)合物。肺鱗狀細胞和大細胞癌以及非肺部腺癌不表達SP-B。SP-B的細胞定位是細胞質(zhì)。
SP-A是一種肺表面活性物質(zhì)蛋白，在吐氣結(jié)束時防止肺泡塌陷中具有重要作用。SP-A是肺泡上皮細胞(II型呼吸細胞(pneumocyte))唯一的分化標(biāo)記物；即使在腫瘤狀態(tài)下該抗原也被保存。SP-A的細胞定位是細胞質(zhì)。
肺部表面活性物質(zhì)A似乎比粘蛋白性類型對100％染色的非粘蛋白性支氣管肺泡癌具有特異性。肺表面活性物質(zhì)潛在地具有辨別肺癌與其它肺部轉(zhuǎn)移癌癥的用途。除腫瘤細胞外，對肺表面活性物質(zhì)A非腫瘤性呼吸細胞也著色。對于肺表面活性物質(zhì)A用肺表面活性物質(zhì)B染色在腺癌中相對常見，但在其它形式的NSCLC或SCLC中不常見。間皮瘤也不能表達肺表面活性物質(zhì)A，導(dǎo)致有人提出肺表面活性物質(zhì)A可能具有辨別腺癌和間皮瘤的用途。
Ki-67
Ki-67是一種在增殖性正常細胞和腫瘤細胞中表達并在休眠細胞中下調(diào)的核蛋白。它存在于細胞周期的G1、S、G2和M期，但不存在于Go期。通常用做增殖的標(biāo)記物。Ki-67的細胞定位是核。
表5
+顯示標(biāo)記物表達變化的腫瘤百分比
*沒有獲得數(shù)
a.獲得適當(dāng)大小的標(biāo)記物文庫
為了獲得與肺癌相關(guān)的適當(dāng)大小的標(biāo)記物文庫需要初步的刪減步驟。在文獻中已知一百多個與肺癌相關(guān)的標(biāo)記物。文獻中鑒定的和評估的可能包含在面板實驗中的候選探針的部分列表包括針對bax、Bcl-2、c-MET(HGFr)、CD44S、CD44v4、CD44v5、CD44v6、cdk2激酶、CEA(癌胚抗原)、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白D1(bcl-1)、E-鈣粘著蛋白、EGFR、ER-相關(guān)(p29)、erbB-1、erbB-2、FGF-2(bFGF)、FOS、Glut-1、Glut-2、Glut-3、Glut-4、Glut-5、HERA(MOC-31)、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-51、整合蛋白VLA2、整合蛋白VLA3、整合蛋白VLA6、JUN、角蛋白、角蛋白7、角蛋白8、角蛋白10、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白16、角蛋白17、角蛋白18、角蛋白19、A-型核纖層蛋白(A；C)、B-型核纖層蛋白(B1；B2)、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-4、黑色素瘤相關(guān)抗原克隆NKI/C3、mdm2、mib-1(Ki-67)、粘蛋白1(MUC-1)、粘蛋白2(MUC-2)、粘蛋白3(MUC-3)、粘蛋白4(MUC-4)、MYC、N-鈣粘著蛋白、NCAM(中性細胞粘著蛋白)、nm23、p120、p16、p21、p27、p53、p-鈣粘著蛋白、PCNA、成視網(wǎng)膜細胞瘤、SP-A、SP-B、端粒酶、凝血調(diào)節(jié)蛋白、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1、VEGF、波形蛋白和waf1的抗體。通過文獻的初出評估檢測早期癌細胞中探針的表觀效果、不同癌癥狀態(tài)細胞之間的差別和對靶癌細胞的定位標(biāo)記，對最初的標(biāo)記物名單作了刪減。該標(biāo)記物名單通過除去一些標(biāo)記物作進一步刪減，這些標(biāo)記物利用將難以還源為實踐，因為它們難以產(chǎn)生或獲得，具有不適當(dāng)?shù)臋z測技術(shù)需求或報道的結(jié)果再現(xiàn)性很差。完成了所有的刪減步驟后，獲得了一個27個標(biāo)記物的文庫。
b.優(yōu)化方案和獲得金標(biāo)準肺癌樣品
獲得檢測面板前還需要初步的制備步驟。從端口賣主獲得含有適當(dāng)標(biāo)記物的探針。分析探測的方案用于以優(yōu)化客觀定量檢測。例如，測定出PCNA的濃度太低。起初，PCNA以S809緩沖液作1∶4000稀釋。進行第二次稀釋，以S809作1∶3200稀釋。各個標(biāo)記物的最佳方案見以下表中。注意第二欄目為“抗體名稱”。除了MOC-31外，這一列表中的探針是以標(biāo)記物名稱列出，因為許多供應(yīng)商以標(biāo)記物名稱平抗體。注意這些試劑可能以另一種方式列出，例如，抗VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-CD44v6等。
從UCLA獲得金標(biāo)準組織標(biāo)本。從兩個來源獲得組織標(biāo)本。病例采用標(biāo)準方法進行診斷，包括觀查蘇木精和曙紅(H&E)染色的玻片以及病史。用任意數(shù)字編碼和標(biāo)記標(biāo)本玻片，以使作研究的病理學(xué)家看不到病史診斷和抗體標(biāo)記物以及保護患者的隱私。
采用載有癌和非癌(對照)組織的組織切片的標(biāo)本玻片。分析了總共175個不同病例。在這一組中，位于表6中的如下診斷具有以下的發(fā)生頻率
表6
c.分子標(biāo)記物檢測面板表達水平的測定
制備了各病例足夠的標(biāo)本玻片，這樣每個玻片中僅檢測一個探針。通常，制備含有細胞樣品的顯微鏡載片，使該細胞樣品與一個或多個針對具體分子標(biāo)記物的標(biāo)記探針接觸。每項研究的病理學(xué)家獨立地檢查H&E染色的載玻片作出各病例的診斷，然后檢查各個與探針反應(yīng)的和免疫化學(xué)染色的載玻片以評估探針結(jié)合的水平，在標(biāo)準化數(shù)據(jù)的表格上記錄結(jié)果。
更詳細地，在甲醛固定、石蠟包埋(FFPE)的組織上進行免疫組織化學(xué)染色。在用聚-L-賴氨酸覆蓋的載玻片上將組織切片切成4微米厚，室溫干燥過夜。組織切片的脫去石蠟和復(fù)水如下進行為了完全除去標(biāo)本的所有包埋介質(zhì)，將載玻片在兩次連續(xù)的二甲苯-替代物(Histoclear)水浴中培育各5分鐘。在于兩次連續(xù)的100％試劑級的乙醇水浴培育各3分鐘前拍去載玻片上所有的液體。在兩次95％的試劑級乙醇最終水浴中培育各3分鐘前再次拍去載玻片上所有過多的液體。經(jīng)過最后一次95％乙醇水浴之后，用自來水沖洗載玻片并保存于洗滌緩沖液中(含有0.05％Tween 20的Tris-緩沖鹽洗滌緩沖液，相當(dāng)于1∶10稀釋的DAKO自染色儀(Autostainer)洗滌緩沖液，編碼S3306)。下表7給出用于本研究的試劑的完全名單以及相應(yīng)的產(chǎn)物編碼。本研究中使用的檢測系統(tǒng)是DAKO EnVision+HRP小鼠(編碼K4007)或家兔(編碼K4003)和LSAB+HRP(編碼K0690)。根據(jù)包裝說明書進行免疫試驗方案。該試劑盒含有兩種液體成分DAB+底物生色原(編碼K3468)。
表7
預(yù)處理在優(yōu)化肺組織上的這些抗體中是關(guān)鍵的。由于抗體需要酶消化，在室溫下使用DAKO蛋白質(zhì)酶K(編碼S3020)5分鐘。需要誘導(dǎo)的靶再生抗體采用DAKO靶再生溶液(編碼S1700)或DAKO高pH靶再生溶液(編碼S3307)作預(yù)處理。將組織放置于預(yù)熱的靶再生溶液中并在95℃水浴中培育20或40分鐘(取決于具體的方案)。然后使組織切片在室溫下冷卻20分鐘。
脫去石蠟、復(fù)水和組織預(yù)處理后，將所有的標(biāo)本培育在3％過氧化氫溶液中以粹滅內(nèi)源性過氧化物酶活性。為了盡可能減少非特異性本底，對于兩種抗體FGF和端粒酶特別采用了封閉試劑。
如表8中所示，將組織標(biāo)本與200微升最佳稀釋的第一抗體一起培育特定的時間。注意表8中標(biāo)記物/抗體的編號與貫穿本文的抗體探針和標(biāo)記物的編號一致。然后以DAKO 1X自動染色儀緩沖液(編碼S3306)洗滌載玻片。根據(jù)抗體，采用正確的檢測系統(tǒng)。用于DAKO EnVision+HRP和LSAB+HRP檢測系統(tǒng)的步驟和總培養(yǎng)時間顯示于下文表9中。采用3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進行顯色反應(yīng)，在反應(yīng)部位產(chǎn)生棕色沉淀。
表8
表9
免疫染色后，所有的載玻片在DAKO蘇木精(編碼S3302)中培育3分鐘并用DAKO Mount Media(S3025)封固蓋玻片。所有方案采用IHC3.0.2版軟件在DAKO自動染色儀上進行。
免疫染色在光學(xué)顯微鏡下觀察以確定對照正常染色其組織完整。標(biāo)記載玻片、裝箱并送給指定的病理學(xué)家進行結(jié)果分析。經(jīng)培訓(xùn)的病理學(xué)家鑒定樣品中見到的癌估計染色密度和染色細胞的比例評估標(biāo)記物探針的靈敏度。將這些評分放進患者的數(shù)據(jù)表中。病理學(xué)家不知道原始診斷和免疫染色中使用的抗體標(biāo)記物。每張載玻片由至少兩個病理學(xué)家解讀，其結(jié)果記錄在數(shù)據(jù)收集表上。為了對該程序提供額外的完整性，由第二位或第三位病理學(xué)家重復(fù)該方法。然后將獲得的數(shù)據(jù)配對以鑒定數(shù)據(jù)登的差錯。補充的數(shù)據(jù)還促進了更好的分類器設(shè)計。
對于每個病例，分析了多達27張載玻片，對于編號為1-17、19-28的每一個標(biāo)記物分別染色。標(biāo)記物18(C-MET)的染色不能優(yōu)化，并因此該標(biāo)記物/探針沒有使用。病理學(xué)家1評價了所有175個病例的載玻片。病理學(xué)家2評價了99個病例的載玻片。病理學(xué)家3評價了80個病例的載玻片。
下表10顯示各位病理學(xué)家對每種診斷的多少病例所作的載玻片評分
表10
對于一些選擇的統(tǒng)計分析技術(shù)，必需kw考慮那些所有27張載玻片都有評分的病例。下表11顯示每種診斷有多少病例完成了所有27張載玻片的評分。
表11
從此表可以計算出各位病理學(xué)家評價了以下總數(shù)的完全病例。病理學(xué)家1評價了119個病例所有27張載玻片。病理學(xué)家2評價了83個病例的所有27張載玻片。病理學(xué)家3評價了23個病例的所有27張載玻片。
癌癥數(shù)據(jù)點的總數(shù)是172。這包括病理學(xué)家1的113個數(shù)據(jù)點和病理學(xué)家2的60個數(shù)據(jù)點。對照數(shù)據(jù)點的總數(shù)是101。這包括病理學(xué)家1的62個數(shù)據(jù)點和病理學(xué)家2的39個數(shù)據(jù)點。
圖3顯示在對照組織和癌組織中探針7和15的H-評分之間的比較。X-軸顯示H-評分而y-軸顯示具有該具體H-評分的病例的百分比。H-評分之間的差異明顯。
對于每一個患者將其評分通過電子學(xué)方法輸入病理檢查表(Pathology ReviewForm)，它整理該評分進入數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫顯示患者的鑒定人以及診斷、染色細胞的比例和染色密度。將該比例和密度整理后輸入通過強度分級獲得的單一的“H-評分”中，強度分級為無＝0、弱＝1、中＝2、強＝3，和細胞百分比為0-5％＝0、6-25％＝1、26-50％＝2、51-75％＝3、＞75％＝4，然后將兩個級別相乘。例如，50％的弱染色加50％的中染色將得分10＝2×2+2×3。這是貫穿本分析的標(biāo)準評分系統(tǒng)，除了部分3(f)、下文，標(biāo)題為“采用其它(非-H-評分)客觀評分參數(shù)的效果”，它研究另一種評分系統(tǒng)。
采用標(biāo)準分類方法尋找探針的最佳組合。通常這要用例如“分支和束縛算法”(Branch and Bound Algorithm)的搜尋程序來發(fā)現(xiàn)最佳特征的結(jié)構(gòu)層次，根據(jù)鑒別力試驗分級，并根據(jù)顯著性試驗截取。這一過程還確定了決策規(guī)則或最佳分類規(guī)則。
設(shè)計具有這些特征的分類器性能可從用于設(shè)計該分類器的數(shù)據(jù)評估。將所有的設(shè)計數(shù)據(jù)直接用于分類器得到非常不可靠的性能估計。
對本實施例收集數(shù)據(jù)的分析提供具有最佳類別分離的探針的最佳選擇。因此，獲得了僅需要幾個探針進行此分析的檢測面板。然而，數(shù)據(jù)顯示用其它探針組合可獲得接近最佳的性能。因此，當(dāng)成本或供應(yīng)問題可能不允許最佳組合時，本發(fā)明在適應(yīng)于探針的可用性方面是靈活的。在某些情況下，本發(fā)明可簡單地應(yīng)用于可得到的特征以尋找另一種組合。在其它情況下，可用該算法來選擇允許將成本考慮包括在選擇過程中特征以獲得低成本解決方法。
選擇數(shù)據(jù)收集和分析試驗的設(shè)計以通過良好建立的雙盲方法避免偏差，其中數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)分析是獨立進行的。
在第一種情況下，病理學(xué)家用常規(guī)染色檢查載玻片以作出診斷。將該診斷輸入病理檢查表。然后以隨機次序向病理學(xué)家提供用標(biāo)記物探針染色的載玻片，給染色細胞的百分比和染色的相對濃度評分。給載玻片編號以不讓病理學(xué)家知道有關(guān)探針的信息。為了使被核查的數(shù)據(jù)具有完整性，兩個病理學(xué)家檢查了所有患者。
將數(shù)據(jù)整理輸入數(shù)據(jù)庫，然后由一組統(tǒng)計學(xué)家進行檢查。給探針編號以在分析它們的有效性過程中不知道染色它們的方法。
分析的第一階段是通過比較各個患者的記錄核查數(shù)據(jù)的完整性。當(dāng)發(fā)現(xiàn)大的差異時，核查該數(shù)據(jù)記錄并糾正任何明顯的差錯。無法說明的差異放在數(shù)據(jù)。
然后，由4個統(tǒng)計學(xué)家分別分析數(shù)據(jù)，因為不同的統(tǒng)計學(xué)方法適合于數(shù)據(jù)中不同類型信息的辨別這一事實，采用了不同的技術(shù)。
選擇最佳探針組合過程的第一步是將數(shù)據(jù)分成兩組，一組用于設(shè)計分類器，一組用于測試分類器的性能。通過選擇作出設(shè)計(培訓(xùn))組的設(shè)計，但顯示對測試組評價的最佳性能，可有把握的作出結(jié)論此分類器對數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)已通用化并且不適合培訓(xùn)組中見到的具體情況。
為了檢測可靠性，通常用許多隨機選擇的排列數(shù)據(jù)和測試數(shù)據(jù)組進行重復(fù)分析。該方法由于給出分類器性能的良好估計而得到普遍的接受。當(dāng)這些測試顯示不一致的探針選擇時，則懷疑這種探針選擇是不可靠的。
d.統(tǒng)計分析和/或模式識別
1.數(shù)據(jù)分析導(dǎo)論
a.輸入數(shù)據(jù)
i.原始數(shù)據(jù)
將每一位患者的評分用電子學(xué)方法輸入病理檢查表，整理這些評分輸入數(shù)據(jù)庫，顯示患者的鑒定人以及診斷、染色細胞的比例、和染色密度。
ii.計算數(shù)據(jù)
分析中使用了各個探針的評分效率，從強度/百分數(shù)表得以計算。將該比例和密度整理輸入具有簡單規(guī)則的單一“H-評分”中，其中H＝染色比例x(如果染色強為3+染色中等為2+染色弱為1)。這是于探針相關(guān)的特征值
iii.另一種計算數(shù)據(jù)參數(shù)
上述H-評分是啟發(fā)式地得出的，一種尋找結(jié)合百分比和強度的更好方法的簡單分析沒有顯示超過H-評分的明顯改進(部分3(f)，標(biāo)題為“采用其它(非-H-評分)客觀評分參數(shù)的效果”)。一個更大的數(shù)據(jù)庫可能允許將來選取更好的規(guī)則。
iv.用戶提供的對每個標(biāo)記物的權(quán)衡
當(dāng)成本或供應(yīng)問題可能不允許最佳組合時，本發(fā)明在適應(yīng)于特征的可獲得性方面是靈活的。例如，本發(fā)明可簡單地應(yīng)用于可獲得的特征來尋找另一種組合?；蛘撸糜谶x擇特征的算法允許將成本考慮包括在選擇過程以獲得最少成本的解決方案。對于選自所有收集的標(biāo)記物或僅得自一個供應(yīng)商的那些標(biāo)記物的組合顯示了標(biāo)記物性能估計。還顯示了假定在探針高成本的基礎(chǔ)上，C4.5包如何可用于減少某些探針的考慮。這些探針組合不象最佳組合那樣運行，但是當(dāng)成本是重要因素時，其性能是可以接受的。
v.用戶提供的對每種類別的權(quán)衡
所用的某些方法允許權(quán)衡應(yīng)用于類別的加權(quán)。這在C4.5中可以獲得，其中樹圖設(shè)計可優(yōu)化成本。而且，辨別功能方法給出可用于得到所需假陽性或假陰性可能性的單一參數(shù)輸出。用于不同閾值設(shè)定的這些參數(shù)圖表稱為接收器操作曲線(Receiver Operating Curve)。
vi.檢測面板-假定
假定低的假陰性的可能性對于癌癥檢測方法是需要的(避免以增加需要重新篩檢的假陽性數(shù)目為代價而錯過陽性患者)。還假定該癌癥辨別方法需要較低的假陽性評分(盡量減少患者接收錯誤治療)。
假定檢測面板需要6個或更多個探針以獲得可接收的性能而成本不高。還假定不接受假陰性誤差率超過5％的檢測面板。不接受超出這一范圍的檢測面板。假定認為細胞計量術(shù)面板可能比本文分析的組織學(xué)為基礎(chǔ)的面板的性能更差。最終目的是好于20％的誤差率的細胞計量術(shù)面板，這接近子宮頸PAP涂片篩檢器的性能。
vii.辨別面板-假定
假定需要6個或更多個探針的面板花費不大并假定需要好于20％的誤差率。不接受超出這一范圍的面板。
b.輸出數(shù)據(jù)
由本分析提供的輸出數(shù)據(jù)包括
·模糊矩陣(Confusion Matrices)，顯示測試組的數(shù)據(jù)如何分類為真陽性、假陽性、真陰性或假陰性。這些可顯示為實際數(shù)字或百分比。模糊矩陣在標(biāo)題為“性能矩陣”的章節(jié)2(d)中討論。模糊矩陣顯示測試組數(shù)據(jù)如何分類為真陽性、假陽性、真陰性或假陰性。一個通過決策圖分析的數(shù)據(jù)獲得的典型模糊矩陣顯示于下表12中，用于同時辨別腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌、間皮瘤和小細胞癌。
表12
·誤差率，總結(jié)模糊矩陣中的數(shù)據(jù)作為所有錯誤分類的和除以分類總數(shù)并以百分比表示。
·接收器操作特征(Recerver Operating Characteristic)(ROC)曲線顯示在分類器中對于不同的閾值假陽性和假陰性評分的估計百分比(或每單位的概率)。一種不能比隨機選擇更好地辨別的無差別分類器，將提供具有相等的真和假讀數(shù)的ROC曲線。該曲線下的面積將是50％(0.5的概率)。
·曲線下的面積(AUC)常常用做分類器性能和提供這種AUC圖形的最標(biāo)準的辨別功能包的總體評價。一種完美的分類器可具有100％的曲線下面積，而一種無價值的分類器僅具有近50％的AUC(0.5)。
·靈敏度和特異性(可從模糊矩陣獲得)。見標(biāo)題為“靈敏度和特異性”的章節(jié)2(d)(iii)。
·標(biāo)記物相關(guān)矩陣。見圖4。
i.檢測面板組成
這些面板根據(jù)數(shù)據(jù)被分成兩類患有五種癌癥的任何一種的患者和無任何一種癌癥的患者。并不是對所有的患者都提供所有的探針。對某具體分析缺失一個或多個探針時，將這些病例從數(shù)據(jù)中刪去。所以，當(dāng)探針數(shù)目減少時進行分析，數(shù)據(jù)組可能包括略微更多的病例。
包含于該分析中的探針數(shù)目是27。盡管在許多情況下加入了一個錯誤的探針，輸入的那個探針數(shù)據(jù)來自設(shè)定在統(tǒng)一產(chǎn)生的數(shù)字0和12之間的隨機數(shù)字產(chǎn)生器。將該錯誤探針包含于許多早期分析中以確保探針選擇過程中的完整性。該錯誤探針還用于一種逐漸從分析中消除探針的方法。比該錯誤探針提供更少信息的探針可能不難鑒定并從選擇過程中除去。及早消除這種探針加速了分析并使該分析更不易受到這些探針引起的結(jié)果(噪聲)變化的影響。
ii.檢測面板的性能
如從該研究得到的那樣，報道了通過不同方法選擇的探針組合以及根據(jù)模糊矩陣、％誤差率、和AUC對它們的性能的估計。
iii.檢測面板-另一種組成
檢測面板也可從減少了的探針組中選擇。在一組面板中，獲得了權(quán)衡過商業(yè)上優(yōu)選的標(biāo)記物的面板性能測定。當(dāng)將最佳探針從分析中除去以尋找辨別探針的新組合時還分析了獲得的性能。發(fā)現(xiàn)作用于其自身的一個探針的性能非常高(探針7)。然而，如下面性能圖13中所示，用線性辨別分析評估，當(dāng)加入更多的標(biāo)記物時其性能得到改善。采用最佳的亞組邏輯回歸確定了最佳的亞組探針。該改進具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。
表13
探針7
探針7和16
探針7、15和16
探針1、7、15和16
探針1、4、7、15和16
用邏輯回歸評價的最佳和次佳探針亞組(采用最佳亞組邏輯回歸確定)顯示于下表中。AUC＝ROC曲線下的面積。注意平均AUC是在隨機系列和測試劃分(70％∶30％)基礎(chǔ)上從100次試驗獲得的平均值。該結(jié)果顯示于下表14中。
表14
iv.辨別面板-組成
本研究的這一部分中設(shè)計并檢測了五種分類器，每個分類器設(shè)計用于檢測所有癌癥患者中一種癌癥的存在。這五種配對方式系統(tǒng)的應(yīng)用使得可疑的病例在分析中出現(xiàn)不只一次，或根本不出現(xiàn)?？设b定這些病例并進行更密切的監(jiān)視、重新檢測或采用另一種檢測方案。
本研究中探針的數(shù)目仍為27個，一個假探針用于早期以減少分析數(shù)量。
v.辨別面板-性能
采用上述性能估計量來顯示用不同技術(shù)發(fā)現(xiàn)的最佳探針組合的性能。
vi.辨別面板-另一種組成
反復(fù)分析了含有商業(yè)優(yōu)選探針的探針組合。性能退化，但對幾種減少組分類器并非異常。采用最佳亞組邏輯回歸確定的不含探針7的最佳探針亞組顯示于下表15中。采用線性辨別分析評價了這些數(shù)據(jù)。
表15
探針28
探針10和28
探針10、15和28
探針1、10、15和28
探針1、10、15、16和28
用邏輯回歸評價具有探針7的最佳和次佳探針亞組(采用最佳亞組邏輯回歸確定)顯示于下表中。AUC＝ROC曲線下的面積。注意平均AUC是在隨機系列和測試劃分(70％∶30％)基礎(chǔ)上從100次試驗獲得的平均值。該結(jié)果顯示于下表16中。
表16
2.數(shù)據(jù)分析方法
在這節(jié)中，描述了獲得數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的初步理解過程作為解釋所用的不同方法獲得的結(jié)果的指南。
a.不同性分析
i.病理學(xué)家與病理學(xué)家之間的不同性和病理學(xué)家的合并評分
(1)t-檢驗
在本臨床試驗中兩個病理學(xué)家檢查了每個患者的載玻片。病理學(xué)家1檢查了所有的患者，病理學(xué)家2也檢查了該組的大約一半，而病理學(xué)家3檢查了余下的患者。采用兩種H-評分的獨立估計，可檢測病理學(xué)家工作的一致性。
采用一種易于獲得的統(tǒng)計方法檢驗病理學(xué)家之間的差異。這是配對樣品的t-檢驗。它采集各對評估之間的差異，使之平均并表示為總差異的比例。然后t-檢驗將這一比例轉(zhuǎn)化為估計從同一人群獲得兩組樣品的可能性的概率(P值)。
將該檢驗用于各個標(biāo)記物探針、對病理學(xué)家1和病理學(xué)家2檢查的所有病例、以及由病理學(xué)家1和病理學(xué)家3檢查的所有病例的評分。由于應(yīng)用了27種試驗(覆蓋了所有探針)，選出一個低值P＝0.01作為“顯著性閾值”。顯示各個探針和兩對病理學(xué)家的P評分的結(jié)果見下表17、18、19和20。顯然病理學(xué)家1和病理學(xué)家2比病理學(xué)家1和病理學(xué)家3更具有一致性。
表17
病理學(xué)家1、病理學(xué)家2的評分
表18
病理學(xué)家1、病理學(xué)家2在0.01時的評分閾值(α＝1％水平的顯著性)
表19
病理學(xué)家2、病理學(xué)家3的評分
表20
病理學(xué)家1、病理學(xué)家3在0.01時的評分閾值(α＝1％水平的顯著性)
由于H-評分是主觀的，它傾向于對邊緣病例產(chǎn)生標(biāo)尺因素差異和噪聲。因此，不管顯示病理學(xué)家1和病理學(xué)家2之間統(tǒng)計學(xué)差異評分的三個特征，該合并數(shù)據(jù)作為測量儀器的代表可被接受。將病理學(xué)家1和病理學(xué)家2的數(shù)據(jù)合并成單一數(shù)據(jù)組用于分析加工。病理學(xué)家3的結(jié)果沒有用于獨立檢驗?zāi)康摹２捎貌±韺W(xué)家3的數(shù)據(jù)進行的這種檢驗由于明顯的差異將產(chǎn)生顯示性能低下的偏差。
由于認為它們是不同的病例，具有任何一個病例的結(jié)果之間的獨立性程度的差異性，故將病理學(xué)家1和病理學(xué)家2的數(shù)據(jù)組合。當(dāng)用這種數(shù)據(jù)檢驗時，性能估計將偏向于更樂觀的值。這是由于同一患者的樣品可在培訓(xùn)檢驗亞組中同時產(chǎn)生。然而，這不會使用于尋找特征最佳組合的方法無效，它僅僅使性能的估計產(chǎn)生偏差。
(2)H-評分不同性的分析
(a)背景
在各個探針內(nèi)，H-評分可能由于各種原因而不同。在某種程度上它們因疾病類型而相應(yīng)地變化，這很有用，由于這種原因造成的差異使病理學(xué)家解讀載玻片時有啟發(fā)性，而隨機變化對以前兩種差異來源的檢測設(shè)置了限制。
方差分析(ANOVA)是減少數(shù)據(jù)變異來源和檢驗其統(tǒng)計學(xué)顯著性的一種標(biāo)準技術(shù)。ANOVA概括數(shù)據(jù)組的總變差作為合計項，它可歸因于變異的具體來源或原因。
ANOVA可在許多統(tǒng)計包中得到。選擇了公眾結(jié)構(gòu)功能域包(public domainpackage)“R”(“用于統(tǒng)計計算的R項目”(The R Project for StatisticalComputing)，http//www.R-project.org/)。
(b)目的
為了對病理學(xué)家1和2的H-評分數(shù)據(jù)進行ANOVA分析和考慮這種數(shù)據(jù)是否可安全地融入一連貫組中用于進一步分析來選擇面板。
(c)方法
從數(shù)據(jù)庫中，選出病理學(xué)家1和2的數(shù)據(jù)。只有對給定的探針完整的數(shù)據(jù)才用于該探針的ANOVA分析。
將肺氣腫、肉芽腫性疾病和間質(zhì)性肺病的對照類別聚合在一起稱為給出因子疾 病內(nèi)的6種水平的“標(biāo)準”。
給病理學(xué)家編碼為具有2水平的因子(病理學(xué)家1、病理學(xué)家2)。
手寫R以依次對各個探針進行標(biāo)準ANOVA分析，所用的因子有疾病、病理學(xué)家、和相互作用項疾病病理學(xué)家。結(jié)果顯示于下表21中。“Df”定義為自由度。在n次觀察的一數(shù)據(jù)組中，已知與平均值偏離的n-1，nth是自動測定的。N-1是自由度的數(shù)目。合計Sq和平均Sq是離勢值。F是根據(jù)F分布的關(guān)于兩種變量相等的統(tǒng)計檢驗。Pr(＞F)是用于測定該不同性是否具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的概率。
表21
H-評分的不同性分析
(d)結(jié)果分析
在所有病例下(除探針21)探針的反應(yīng)與疾病有關(guān)。這并不奇怪，因為這些探針是為了這一目的而推測性選擇的。探針的反應(yīng)與病理學(xué)家沒有關(guān)系(p＝0.05水平)。這表明可安全地合并這些數(shù)據(jù)并用兩個病理學(xué)家的數(shù)據(jù)作為數(shù)據(jù)的兩次測量。
在少數(shù)病例，探針7、14、17，有一些獲得顯著性相互作用項的證據(jù)。這表明病理學(xué)家之間對某些疾病的評分具有某些差異。這些情況中的某些很可能歸因于數(shù)據(jù)中一個偶然的逸出值。
(e)結(jié)論
結(jié)果表明合并這一數(shù)據(jù)用于進一步分析是安全的。該數(shù)據(jù)表明在某些情況下病理學(xué)家和疾病之間的微小的相互作用似乎歸因于隨機來源。
ii.患者與患者的不同性
通過章節(jié)2(a)(i)(2)的疾病疾病的不同性測定了患者與患者的不同性(見上文，“H-評分的不同性分析”)。
iii.標(biāo)記物與標(biāo)記物的不同性
繪制柱形圖(PathologistData.xls，工作表柱形圖)顯示用于對照和癌癥的各個探針的標(biāo)記物評分的分布。
b.標(biāo)記物相關(guān)矩陣分析
群體相關(guān)系數(shù)(“應(yīng)用的多元統(tǒng)計分析”(Applied Mulitvariate StatisticalAnalysis)，R.A.Johnson和D.W.Wichern，第二版，1988，Prentice-Hall，N.J.)測定一對隨機變量之間的線性相關(guān)的量。通常，不知道隨機變量的分布和相關(guān)參數(shù)并且不可能直接計算的群體相關(guān)系數(shù)。在這種情況下，可從樣品數(shù)據(jù)中計算出樣品相關(guān)系數(shù)。見圖4。然而，樣品相關(guān)系數(shù)僅僅是群體相關(guān)系數(shù)的一種估計。而且，由于它是在樣品數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上計算的，純粹意外地，當(dāng)實際上在相應(yīng)的隨機變量之間可能沒有實際關(guān)系時它可能顯示出強陽性或陰性相關(guān)(“現(xiàn)代初級統(tǒng)計學(xué)”(Modern Elementary Statistics)J.E.Freund，第六版，1984，Prentice-Hall，N.J.)。
相關(guān)系數(shù)可衡量一個變量預(yù)測其它變量的能力。然而，強的線性相關(guān)并不意味著因果關(guān)系。相關(guān)系數(shù)的平方稱為決定系數(shù)。對于二元變量數(shù)據(jù)組計算出的決定系數(shù)可衡量一個變量中不同性的比例，這可用它與其它變量的線性關(guān)系來解釋。當(dāng)涉及幾個變量時，可依次計算出每一對的相關(guān)數(shù)并且該系數(shù)組可書寫為矩陣稱作系數(shù)矩陣。見圖4。
可模擬各個標(biāo)記物的H-評分作為隨機變量。該多元變量數(shù)據(jù)組的樣品相關(guān)矩陣可從標(biāo)題為“輸入數(shù)據(jù)”的上述章節(jié)中描述的輸入數(shù)據(jù)計算出來。
c.模式識別
統(tǒng)計學(xué)模式識別是在定量測定(稱做特征)的基礎(chǔ)上分類信號或幾形模型的一種方法。統(tǒng)計學(xué)模型識別本質(zhì)上歸納為將n-維特征空間分成相應(yīng)于感興趣的種類或類別的區(qū)域的問題。
本研究所用的不同的分類器方法對數(shù)據(jù)中不同的結(jié)構(gòu)形式很靈敏。
對于決策圖方法，不同數(shù)據(jù)組合的初步分析鑒定到從不為C4.5所用的用于檢測面板的標(biāo)記物。將這些標(biāo)記物從分析中除去，這導(dǎo)致更一致的結(jié)果，被除去的探針的故障只會在選擇過程中產(chǎn)生噪聲。
用于檢測面板的探針的相似的初步分析鑒定出要在詳細分析前除去的噪聲探針。
SPSS中的線性辨別功能方法具有用于減少分析中標(biāo)記物數(shù)量的部步進式過程。通常，這減少用于分析的探針到2和7之間。
R和SAS中的邏輯回歸方法對變量選擇實施步進式的步驟。在SAS中，還提供了一個最佳亞組變量選擇項。在R中用該步進式方法與多重隨機試驗結(jié)合以開發(fā)用于選擇變量的啟發(fā)式的方法，根據(jù)一個給定的特征在100次訓(xùn)練和試驗數(shù)據(jù)的隨機選擇中使用的次數(shù)(分別分為70％∶30％)?？膳c人工隨機特征的計數(shù)相比較的計數(shù)特征被逐步消除直到獲得超過100次運行的最小的一致性特征組。
i.統(tǒng)計學(xué)方法
根據(jù)多元變量統(tǒng)計學(xué)分析地點，問題是一個在高維空間(和將這一空間分成感興趣的區(qū)域)估計的密度函數(shù)。假定隨機(特征)載體的分布是已知的，理論上最好的分類器是Bayes分類器，因為它使分類誤差的機率減至最小(K.Fukunaga，“統(tǒng)計學(xué)模式識別”(Statistical Pattern Recognition)，第二版，學(xué)術(shù)出版社Academic Press，1990，第三頁)。不幸的是，由于它的復(fù)雜性，特別是當(dāng)特征空間的維度很高時Bayes分類器的使用很困難。在實踐中，使用更簡單的參數(shù)分類器。參數(shù)分類器是依據(jù)對基礎(chǔ)密度或辨別功能的假設(shè)。最普通的這種分類器是線性和二次分類器。在多元變量統(tǒng)計學(xué)分析中，這種分類器歸入辨別分析的標(biāo)題之下。辨別分析技術(shù)與多元變量線性回歸模型密切相關(guān)并概括了線性模型(包括邏輯和多項式回歸)。
(1)具有二項式反應(yīng)的邏輯回歸
(a)背景
選擇一組用于檢測面板上使用的標(biāo)記物的問題可作為具有二項式反應(yīng)的邏輯回歸問題加以闡明。反應(yīng)變量是具有兩種水平的因子正常(非癌癥)和異常(癌癥)。說明性變量是標(biāo)記物H-評分。
選擇一組用于癌辨別面板上使用的標(biāo)記物的問題也可作為具有二項式反應(yīng)的邏輯回歸問題加以闡明。反應(yīng)變量是具有兩種水平的因子正常(不是感興趣的癌)和異常(感興趣的癌)。說明性變量是標(biāo)記物H-評分。
步進式變量選擇可用于選擇用于分辨兩種類型之間的區(qū)別的原始變量(標(biāo)記物)的亞組。這是一種在計算上要花費很多的運用，并最適合于計算機。幾種商品化的和不公眾領(lǐng)域軟件包---例如R、S-plus、和SAS-實施步進式邏輯回歸。
根據(jù)分別在R和SAS中發(fā)現(xiàn)的步進式變量選擇方法研究了特征選擇的兩種不同方法。
(b)試驗數(shù)據(jù)
用于本分析的數(shù)據(jù)包括由病理學(xué)家1和病理學(xué)家2檢查病例的標(biāo)記物1-17、和19-28的H-評分，以及在本報告的其它部分中描述的H-評分。另外，將一個虛擬的標(biāo)記物，18，加入此數(shù)據(jù)組。該虛擬的標(biāo)記物包括從均勻分布隨機選擇的0-12的整數(shù)值。
(c)方法1使用R包(1.4.1版)
計算機化的模型擬合程序通常不能處理丟失的數(shù)據(jù)。這是用于R的glm(廣義的線性模型的glm基底)程序的例子。因此，當(dāng)使用glm擬合一模型時必需排除其中有一個或多個漏測值的所有病例。當(dāng)擬合含有27個真實標(biāo)記物和一個虛擬標(biāo)記物的初始完全模型時，這使數(shù)據(jù)組減少至僅202個病例。使用這樣少的觀察資料，決定進行變量選擇以訓(xùn)練采用的選擇變量的分類器，評估其性能的最好方法是對數(shù)據(jù)隨機劃分成訓(xùn)練組和試驗組進行100次試驗。
(i)劃分數(shù)據(jù)成為訓(xùn)練組和試驗組
在每次試驗開始時，將數(shù)據(jù)劃分成試驗組和訓(xùn)練組。這通過隨機選擇30％的異常和30％的正常以形成試驗組來完成，并用余下的觀察資料形成訓(xùn)練組。
(ii)變量(標(biāo)記物)的選擇
在每次試驗開始時，將包括所有變量(標(biāo)記物)的完全模型擬合到訓(xùn)練數(shù)據(jù)中。在R中使用glm擬合邏輯回歸模型。所用的編碼片段如下
my.模型<-類別～X1+X2+X3+X4+X5+X6+X7+X8+X9+X10+X11+X12+X13+X14+X15+X16+X17+X18+X19+X20+X21+X22+X23+X24+X25+X26+X27+X28
my.glm<-glm(my.模型，系列＝二項式(連接＝對元)，數(shù)據(jù)＝訓(xùn)練數(shù)據(jù))
然后根據(jù)Akaike信息標(biāo)準(Akaike Information Criterion)(AIC)用程序step AIC進行步進式變量選擇。該程序是可公開得到的MASS文庫的一部分。該文庫和程序的描述見“具有S-PLUS的現(xiàn)代實用統(tǒng)計學(xué)”(Modern Applied Statisticswith S-PLUS)(W.N.Venable and B.D.Ripley，Springer-Verlag，Pathologist NewYork，1999)。進行這一步驟的R編碼片段如下
my.步驟<-step AIC(my.glm，方向＝雙向)
然后根據(jù)試驗數(shù)據(jù)上評估得到的模型。所用的編碼片段如下
概率異常<-預(yù)測(my.步驟，檢驗數(shù)據(jù)，類型＝？反應(yīng)？)
在錯誤分類的實際誤差率(AER)和ROC曲線下的面積(AUC)方面記錄了該分類器的性能。100次試驗后，仍然保留100個模型以及它們相關(guān)的AER和AUC。構(gòu)建了一個頻率表，記錄在100個模型中各個變量出現(xiàn)的次數(shù)。一個例子顯示于表12中
表22
該表用于決定棄去哪一個標(biāo)記物。首先，頻率小于或等于10的所有標(biāo)記物被棄去。接著根據(jù)虛擬標(biāo)記物的頻率(通常為虛擬標(biāo)記物頻率的1到1.5倍)選擇截斷頻率。棄去頻率低于該截斷值的所有標(biāo)記物。然后余下的標(biāo)記物，和虛擬標(biāo)記物一起，用作另外100次試驗的完全模型并重復(fù)此刪減步驟。如果需要，可提高削減的嚴格度以迫使一個或更多的標(biāo)記物離開模型。如果需要，余下的標(biāo)記物可用作又100次試驗的完全模型。當(dāng)達到所需的面板成員數(shù)或當(dāng)前模型的平均AUC低于以前的模型時停止刪減。
為了闡明刪減步驟設(shè)想了上述表格。利用檢測面板數(shù)據(jù)獲得該表。涂有陰影的項目表示刪減后保留的那些標(biāo)記物。采用以下的完全模型進行另外100次試驗。
my.模型<-類別～X6+X7+X8+X12+X16+X18+X23+X25
再構(gòu)建了頻率表，表23
表23
涂有陰影的項目顯示刪減后保留的標(biāo)記物(使用47截斷值)。另外100次試驗采用以下的完全模型進行
my.模型<-類別～X6+X7+X8+X12+X18+X23+X25
還構(gòu)建了頻率表，表24
表24
在這一點上選擇50截斷值。涂有陰影的項目顯示用于5或員面板的剩余標(biāo)記物。在每一步中，平均的AUC提高94.37％ 95.45％ 95.78％。
(iii)評估該檢測面板的性能
為了評估該面板的性能，象前面一樣進行了100次試驗，但是不進行步進式選擇程序。對于各次試驗，記錄AUC、靈敏度和特異性。對于上述檢測面板的例子，結(jié)果為
>my.模型<-類別～X7+X25+X6+X23+X12
>總計(AUC)
最小值 第一次計數(shù) 中值 平均值 第三次計數(shù) 最大值
0.9289 0.9590 0.96150.9601 0.9630 0.9630
>總計(靈敏度)
最小值 第一次計數(shù) 中值 平均值 第三次計數(shù) 最大值
0.8519 0.9630 0.96300.9737 1.0000 1.0000
>總計(特異性)
最小值 第一次計數(shù) 中值 平均值 第三次計數(shù) 最大值
0.8378 0.9730 0.97300.9749 1.0000 1.0000
總的來說，該面板具有97.37％的靈敏度和97.49％的特異性。ROC下的面積是96.01％。
(d)方法2使用SAS(8.2版)
可在SAS中采用程序LOGISTIC進行邏輯回歸。當(dāng)反應(yīng)變量是兩級因子時，該程序適合于二元對數(shù)模型(與系列＝二元和連接＝對數(shù)與R中的glm等價)。對于指定的模型，SAS自動排除所有遺漏的多元變量觀察資料。不象R，SAS能夠進行最佳亞組變量選擇程序。在SAS中進行這一步驟所需要的編碼片段如下
PROC LOGISTIC DATA＝WORK.panel；
CLASS Class；
MODEL Class＝X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 X25 X26 X27 X28/SELECTION＝
SCORE BEST＝28；
RUN；
該程序應(yīng)用于完整的數(shù)據(jù)組。參數(shù)BEST＝28指導(dǎo)SAS尋找最佳的28個單變量模型、最佳的28個雙變量模型、最佳的28個三變量模型、直至最佳的28個28-變量模型。
(i)評估面板的性能
將模型1中描述的程序用于評估各個面板的性能。下表25產(chǎn)生自檢測面板數(shù)據(jù)。它只列出了兩個最佳的1-、2-、3-、4-、和5-標(biāo)記物面板結(jié)果。
表25
(2)線性辨別分析
(a)背景
商品化統(tǒng)計學(xué)包SPSS具有允許設(shè)計和檢驗單純線性辨別功能的程序。一種通常使用的方法是Fisher線性辨別功能。這在特征空間中找到高平面(hyper-plane)，它給出類別的良好分離。對于類別分布具有不同平均值，但相似的多元變量高斯分布的兩個類別問題，此分類器給出最佳的性能。該方法可啟發(fā)性地延伸到多類別問題，但這沒有應(yīng)用于本研究中。
此方法在其手段上過于簡單，但對于與含有大量特征的數(shù)據(jù)組有關(guān)的問題是健全的(robust)(在我們的例子中探針數(shù)目是27，對于只含有約200個標(biāo)本(病例)的數(shù)據(jù)組產(chǎn)生問題)。
這個統(tǒng)計包具有一種程序，能鑒定有助于辨別過程的特征。這種“步進式方法”首先發(fā)現(xiàn)最有辨別力的特征。然后順次加入其它特征并對分類器作評估。探索組合，這樣如果發(fā)現(xiàn)較佳的組合，最終的解決方案可排除最初選出的特征。特征的數(shù)目逐漸增加，直到統(tǒng)計學(xué)檢驗顯示余下的特征對分類過程沒有實際貢獻。
采用留一種方法而獲得對性能的估計。這將從數(shù)據(jù)組中除去一個樣品形成訓(xùn)練組。留出的樣品留作試驗組，應(yīng)用于分類器，得到的分類累積在模糊矩陣(confusion matrix)中。對數(shù)據(jù)中的情況重復(fù)該程序。該程序可得出沒有偏差的性能估計，但該估計將具有一個高的分歧。
方法
在SPSS中選擇適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)組用于分析，選擇“分析”、選擇“分類”、選擇“辨別…”，在表格上選擇“Fishers方法”、“留出一種的檢驗”和“采用步進式方法”。輸入診斷作為分組變量和輸入所有的特征作為獨立變量。輸入“OK”以完成分析。對于其它參數(shù)的預(yù)設(shè)值在設(shè)定時被舍去。
分析輸出包括本分析中使用的特征的列表、規(guī)范的辨別函數(shù)和模糊矩陣以及正確的分類比率(I-誤差率)。
為了計算ROC曲線，將規(guī)范的辨別函數(shù)應(yīng)用于選擇的特征以產(chǎn)生新的特征。在SPSS中，采用Graph、ROC繪制該曲線。
ii.分層次的方法決策圖
(1)背景
決策圖學(xué)習(xí)是用于歸納推理的最廣泛使用和實用的方法之一。它是一種分類方法，該方法對于噪聲數(shù)據(jù)是健全的并能夠認識到分離性的表達(Tom M.Mitchell，“機器學(xué)習(xí)”(Machine Learning)，McGraw-Hill，New York，NY，1997)。
最通用的和可獲得的機器學(xué)習(xí)包是“C4.5”，其源碼發(fā)表于(J.Ross Quinlan，“C4.5機器學(xué)習(xí)程序”，Morgan Kaufmann，San Mateo CA，1993)。
當(dāng)一個決策圖正在被訓(xùn)練(在訓(xùn)練數(shù)據(jù)上)時，該算法決定在圖表樹(tree)的每個節(jié)點上，數(shù)據(jù)的哪一種屬性在這一節(jié)點上使用最好作出決定。因此當(dāng)完成圖表樹構(gòu)建時，它將選擇一些屬性組來使用并忽略其它屬性征。在我們的申請中，采用決策圖來加工從分子探針獲得的測量值，該決策圖有效地選擇了一種探針面板，以及組合探針評分的方法，最好地解釋了數(shù)據(jù)的分類。為了獲得對面板性能的無偏向估計，得到的圖表樹必需根據(jù)訓(xùn)練中沒有使用的數(shù)據(jù)進行評估。進行這一步驟的一種標(biāo)準技術(shù)是交叉(cross-validation)。采用了10-倍(10-fold)交叉證實。
交叉證實是最佳利用有限數(shù)據(jù)的一種方法。在10-倍交叉證實中，將數(shù)據(jù)隨機分成10份差不多相等大小的部分，小心使各個部分中含有大約相同數(shù)量的一類病例。然后，在組合的部分2-9上訓(xùn)練決策圖并在部分1上測試，然后在組合的部分1、3-9上訓(xùn)練并在部分2上測試，如此進行，輪流維持檢驗組10次通過數(shù)據(jù)一次。以這種方式，檢驗僅在維持的數(shù)據(jù)上進行，因此是無偏向的，并且所有的數(shù)據(jù)剛好被檢測一次，因此可計算出整個數(shù)據(jù)組的總誤差率。
通常構(gòu)建圖表樹直到它們非常適合于訓(xùn)練數(shù)據(jù)，然后通過修剪除去“噪聲”的枝和葉將它們“刪減掉”。這改進了決策圖對未發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)的概括能力并對獲得良好性能是必要的。C4.5包包括兩種刪減圖表樹的方法，首先是標(biāo)準圖表樹刪減算法，其次是規(guī)則選取算法(rule extraction algorithm)。通常，可在這一數(shù)據(jù)上找到基于圖表樹的方法以得出優(yōu)良結(jié)果。因此，沒有報告規(guī)則為基礎(chǔ)的方法。
(2)數(shù)據(jù)準備
如其它地方所描述獲得各種探針對于正常組織和五種不同癌癥(腺癌、大細胞癌、間皮瘤、小細胞肺癌和鱗狀細胞癌)的反應(yīng)的數(shù)據(jù)。從數(shù)據(jù)庫中摘錄探針1-28、和病理學(xué)家中病理學(xué)家1和病理學(xué)家2的H-評分并輸入平面數(shù)據(jù)文件中。對于決策圖分析，采用各個數(shù)據(jù)點(甚至由兩個病理學(xué)家對一個相同的物理載波片進行觀察)作為疾病對染色的作用的獨立觀察資料。這可能略微正向偏離分類的性能但對面板選擇應(yīng)沒有影響。
·將肺氣腫、肉芽腫性疾病、和間質(zhì)性肺病的對照類別綜合在一起并稱為“正?！?。
·對于檢測面板將所有的癌癥綜合在一起并稱為“異?！?，使之成為2個類別問題。
·對于一個辨別面板，從數(shù)據(jù)中除去正常病例以形成5個類別問題。
·對于維持辨別面板，依次維持各個癌癥，余下癌癥綜合為“其它”，以產(chǎn)生一個五種2類別的問題組。
C4.5需要一個“名稱”文件，該文件描述包括在分析中的數(shù)據(jù)和屬性。該辨別面板的命名文件例子是，表26
表26
從數(shù)據(jù)中遺漏掉探針18并在所有的設(shè)計中設(shè)定為“忽略”。在該命名文件中設(shè)定屬性至“忽略”是從面板中修剪探針的簡單而有效的方法并用于數(shù)據(jù)分析。
(3)數(shù)據(jù)分析
采用提供有的附用軟件包的C4.5.標(biāo)準(缺省)參數(shù)的“xval.sh”原本在各個數(shù)據(jù)組上運行10倍交叉證實。交叉證實是開發(fā)用于對小數(shù)據(jù)組進行分類器訓(xùn)練和測試的一種技術(shù)。它包括將數(shù)據(jù)隨機分成N個相等大小的部分。然后分類器在N-1部分上訓(xùn)練并在其余部分測試。這樣重復(fù)N次。
由于在一次交叉證實(CV)試驗中訓(xùn)練的決策圖可能與在另一次中獲得的決策圖不同(選出的探針和決策圖系數(shù)都不同)，計算出由決策圖在10次試驗中選擇各個探針的次數(shù)。
通過設(shè)置略去在10次CV試驗中5次或更多次數(shù)沒有在刪減的決策圖表中出現(xiàn)的探針，進行了探針的初次揀選。
然后用這個較小的候選探針組重復(fù)交叉證實。通過設(shè)置略去在10次試驗中5次或更多次數(shù)沒有在刪減的決策圖中出現(xiàn)的探針，進行探針的第二次揀選。如果還有探針被除去，進行第三次CV試驗。
通過各種試驗選擇面板，并且它們的估計誤差性能顯示于結(jié)果圖表中。用于決策圖分析的面板性能顯示于下表27中。
表27
面板性能-決策圖檢測面板探針3、7、19、25和28
成對辨別4、6、14、19和23
成對辨別3、6、17、19和25
成對辨別 1、5、10、13、21、27和28
成對辨別3、12和16
成對辨別12、17、20、23和25
檢測(不包含探針7) 6、10、16和19
檢測(只用商品化的優(yōu)選探針) 5、6、10、16、19和23
一個典型的決策圖結(jié)構(gòu)顯示于下表28和29中，用于在小細胞肺癌和其余四種類型肺癌之間的辨別。
C4.5信息輸出公式
表28
表29
圖示形式
步進式線性辨別的面板性能顯示于下表30中
表30
面板性能-步進式LD檢測面板1、4、7、15和16
成對辨別 4、5、14、19、20、25和27
成對辨別 1、2、3、24、25和26
成對辨別 1和7
成對辨別 3、12和6
成對辨別12、19、22和23
檢測(不包含探針7) 1、2、3、4、10、11、15、16、 23、24、27和28
檢測(只用商品化的優(yōu)選探針)8、10、11、19、23和28
步進式邏輯回歸分析的面板性能顯示于下表31中
表31
面板性能-步進式LR 檢測面板 6、7、12、23和24
成對辨別 14、19、20、25和27
成對辨別 3和10
成對辨別 1、4、6、16和21
成對辨別3、7、12和16
成對辨別 12、13和23
檢測(不包含探針7) 1、10、19、23和28
檢測(只用商品化的優(yōu)選探針) 10、19、20、23和28
iii.神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和另一種方法
人造神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)ANN’s是候選的模式識別技術(shù)，它可容易地應(yīng)用于選擇特征和設(shè)計與本發(fā)明有關(guān)的分類器。然而這種技術(shù)很少了解數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)以及具體探針以LDF給出的方式所產(chǎn)生的影響。由于這個原因，本研究中沒有采用這一類算法。LDF代表線性辨別函數(shù)，特征的線性組合的結(jié)果是確定分類的閾值。
這一類技術(shù)包括例如多層感知機MLP、Back-Prop、Kohonen的自我組織圖譜(Self-Organizing Maps)、學(xué)習(xí)載體量子化(Learning Vector Quantization)、K-毗鄰(K-nacyest meighbors)和遺傳算法等算法。
iv.專門的主題
(1)假設(shè)
·線性辨別分析
·假定兩個類別的協(xié)方差矩陣是相等的。
·只有當(dāng)兩個類別是多元變量正態(tài)分布時將錯誤分類的成本減到最小。
·假定說明性變量是連續(xù)的而不是絕對的(在本研究中，H-評分是絕對的，而在實踐中(即在自動化系統(tǒng)中)強度可在連續(xù)的范圍內(nèi)測定)。
·邏輯回歸(二項式廣義線性模型)
見Venerable和Ripley，第7章(“具有S-PLUS的現(xiàn)代實用統(tǒng)計學(xué)”(W.N.Venerable和B.D.Ripley，Springer-Verlag，New York，1999)。
(2)標(biāo)記物排斥(解除選擇)
辨別分析和回歸程序的計算機化執(zhí)行包括步進式變量選擇程序；例如，R中的步驟AIC。設(shè)計這些程序以選擇最佳變量亞組用做說明性變量。實際上，由于這些程序的步進性質(zhì)，不保證挑選到預(yù)測的最佳變量(Johnson和Wichern，299頁)。然而，這種程序的確提供了標(biāo)記物選擇和解除選擇的基礎(chǔ)。
(3)成對式檢驗
在“實用多元變量的統(tǒng)計學(xué)分析”R.A.Johnson和D.W.Wichern，第二版，1988，Prentice Hall，H.J.中討論了設(shè)計多類分類器中固有的問題。這是開發(fā)幾種不同的二-類分類器的動機。
(4)面板組成中的多余考慮
“線性模型形成了分類統(tǒng)計學(xué)的核心并依然是許多統(tǒng)計學(xué)實踐的基礎(chǔ)”“具有S-PLUS的現(xiàn)代實用統(tǒng)計學(xué)”(W.N.Venable and B.D.Ripley，Springer-Verlag，Pathologist New York，1999)。線性模型是t-檢驗、方差分析(ANOVA)、回歸分析以及各種多元變量方法包括辨別分析的基礎(chǔ)。說明性變量可以或不可以作為第一次序項進入該模型。(非線性)邏輯回歸也是這樣。邏輯回歸模型是線性回歸模型的簡單的非線性轉(zhuǎn)化因變量由對數(shù)優(yōu)勢率(對元)所取代?？傊?，這些統(tǒng)計學(xué)方法是基于說明性變量之間的線性關(guān)系。因此，尋找面板中多余部分的一個途徑是鑒定高度相關(guān)的變量(標(biāo)記物)。在面板中可以用一個標(biāo)記物代替另一個標(biāo)記物以獲得相似的性能。
尋找面板中多余部分的另一種方法是進行“最佳亞組”回歸分析。鑒于起始模型具有所有感興趣的說明性變量，其目的是尋找最佳的單變量回歸模型、最佳的雙變量回歸模型等。該方法在SAS統(tǒng)計學(xué)包中進行。
(5)權(quán)衡評分的應(yīng)用
(a)商業(yè)和臨床考慮
由于許多原因，包括策略上的和商業(yè)上的因素；成本；有用性；使用的便利性，它可優(yōu)選地用于鼓勵面板中某些探針的選擇并懲罰其它探針的選擇，同時針對面板的大小或性能直轄市這種選擇。
(b)屬性成本計算
這種屬性權(quán)衡(在決策圖中)的方法已在其它文章中的機器學(xué)習(xí)文獻中提出，例如背景知識的結(jié)合(M.Nunez，“背景知識的應(yīng)用”(The Use of BackgroundKnowledge)，機器學(xué)習(xí)(Machine Learning)6231-250，1991)，以及從機器人傳感器獲得信息的差價成本計算(M.Tan，“分類知識的成本敏感性學(xué)習(xí)及其在機器人學(xué)中的應(yīng)用”(Cost-sensitive Learning of Classification Knowledge and itsApplications in Robotics)，機器學(xué)習(xí).137-33，1993)。
通過對被稱為“C4.5”的標(biāo)準機器學(xué)習(xí)軟件包的微小改變進實這文獻中的兩種成本敏感算法(J.Ross Quinlan，“C4.5用于機器學(xué)習(xí)的程序”，MorganKaufmann，CA.1993.)。為方便起見，在本方法后實行Nunez的“EG2”算法。
在.C4.5決策圖構(gòu)建階段，該算法比較各個變量屬性以分開和選擇能獲得最大量信息的一種屬性，Gi。在EG2算法中，(2Gi-1)/(Ci+1)被最大化，將它并入屬性i，Ci的信息成本。權(quán)衡的載體需要用戶設(shè)定一個優(yōu)先值。
(i)編碼修改
修改C4.5源碼以進行M.Nunez提出的經(jīng)濟的廣義“EG2”算法(背景知識的應(yīng)用，機器學(xué)習(xí)6231-250，1991)。
對C4.5包的精確修改如下。
在文件“R8/Src/contin.c”中的下列行后。(J.Ross Quinlan，“C4.5機器學(xué)習(xí)的程序”，Morgan Kaufmann，CA.1993)
插入新的一行
其中屬性成本的向量事先已從用戶保存的文本文件中讀入。
(ii)實驗方法
商品化的優(yōu)選探針是2、4、5、6、8、10、11、12、16、19、20、22、23、28。
為了舉例，假設(shè)由于成本的原因上述探針是商品化的優(yōu)選探針并希望考慮這種成本而重新選擇檢測面板。
采用修改的C4.5決策圖軟件，給予商品化的優(yōu)選探針零罰分而非商品化優(yōu)選探針2個罰分。用修改的C4.5算法運行10-倍交叉證實面板選擇方法(如其它地方所描述的)。
(iii)結(jié)果
標(biāo)準決策圖檢測面板由探針3、7、19、25、28組成。獲得的面板成員是2、6、7、10、19、25、28，它們僅使用了2個商品化優(yōu)選探針，P7和P25。盡管由于對于這些數(shù)據(jù)它們的優(yōu)良性能造成成本增加，注意到這些探針是用本方法選出的。該面板現(xiàn)在增大了7個探針而原來為5個。對于這些數(shù)據(jù)面板性能沒有明顯下降，雖然作為降低探針成本的一種折衷方案其性能現(xiàn)在是次優(yōu)的。
(iv)結(jié)論
已建立了一種將使用探針的成本并入面本選擇方法的直接方法。
(c)錯誤分類成本計算
(i)背景
由于許多原因，可能需要選擇最佳的面板，記住不同類型的分類錯誤的成本可能不同。例如，可能需要選擇一個對一種疾病(比方說大細胞癌)具有增加的靈敏度的面板，并希望用模糊矩陣中某處特異性的降低和靈敏度來交換。
理論上，可能需要將錯誤分類成本的矩陣(具有與模糊矩陣相同的維度)包含了所有可能的成本組合。實際上，僅輸入那些不一致(non unity)的花費(不履行default)。
商業(yè)決策圖軟件See5(RuleQuest Research Pty Ltd，30 Athena Avenue，St Ives Pathologist 3SW 2075，Australia.(http//www.rulequest.com))包含了這一能力并用于下面的論證中。
(ii)目的
標(biāo)準聯(lián)合辨別面板(在別處描述的)由以下成員組成P2、3、4、5、12、14、16、19、22、23、28。并給出如下估計的模糊矩陣
(檢出)大細胞癌的靈敏度低至26％。如果希望在一個新設(shè)計的面板中提高這個靈敏度，可使用如下方法。
(iii)方法
產(chǎn)生如下成本文件
該文件與任何其它癌癥一樣以10的系數(shù)向上權(quán)衡大細胞癌的錯誤分類。這將傾向于在這一類別中提高檢測的靈敏度(在別處的性能降低)，但是沒有權(quán)衡能夠確保完美的分類。
采用了標(biāo)準決策圖面板選擇方法(用See5而不是C4.5)。
(iv)結(jié)果
新的面板成員是P2、3、4、5、6、9、12、14、16、17、25、28。具有估計的性能
以上證明了大細胞癌的估計靈敏度現(xiàn)在提高到48％。
(v)結(jié)論
證明了可將錯誤分類的差價成本計算包括面板選擇方法中的直接方法。
d.性能矩陣
表明各個方法的估計性能的分析提供的輸出包括
i.ROC分析
接受器工作特征(ROC)曲線顯示了分類器中不同閾值水平的假陽性和假陰性評分的估計百分比(或每單位概率)。一個無差別的分類器(不能比隨機選擇更好地辨別)，將顯示ROC曲線具有相等的真和假讀數(shù)。此曲線下的面積將為50％(0.5概率)。
曲線下的面積(AUC)常常用做分類器性能總的評估并且大多數(shù)商業(yè)購買的辨別函數(shù)包計算這一特征。一個完美的分類器將具有100％的曲線下面積，一個無價值的分類器將具有近50％的AUC(0.5)。
ii.模糊矩陣計數(shù)和百分率
模糊矩陣顯示檢驗組的數(shù)據(jù)是怎樣分類的。對于成對方式的檢驗，這些分類是真陽性、假陽性、真陰性或假陰性的評分的計數(shù)。這些可顯示為實際計數(shù)或百分率。對于試圖僅用一個面板得出唯一診斷的多方式面板，模糊矩陣將顯示出各個正確分類的計數(shù)。例如，每次檢測出小細胞癌，象這樣它將被輸入矩陣的一對角線。錯誤的評分；例如小細胞癌怎樣經(jīng)常地被錯誤地鑒定為鱗狀細胞癌將被輸入矩陣的適當(dāng)?shù)姆菍蔷€單元。利用誤差率將模糊矩陣中的數(shù)據(jù)相加作為所有錯誤分類的總和除以分類的總數(shù)目，表示為百分率。
iii.靈敏度和特異性
特異性指任何定義排除有病病例的程度。如果一個定義具有差的特異性，其假陽性就高。這意味著當(dāng)實際上不存在疾病時，它標(biāo)記個體有疾病癥。靈敏度是指任何定義包括所有健康人的程度。如果一個定義具有差的靈敏度，其假陰性就高(患病的個體被錯誤地診斷為沒有患病)。
3.數(shù)據(jù)分析和結(jié)果
a.樣品大小和變異性
·組合的病理學(xué)家1和病理學(xué)家2數(shù)據(jù)組的354個病例中，僅202個病例有每個標(biāo)記物(變量或特征)的H-評分。
·完成觀察的數(shù)量少和大量的變量導(dǎo)致評估問題(維度的原因)。因此，必需嚴格地刪減用于建立分類器的變量數(shù)目。
·由于觀察的數(shù)量少，將數(shù)據(jù)分成不同的訓(xùn)練組和檢驗組(對于分類器性能的健全估計是必需的)是不慎重的。由于這種原因，需要采用重新取樣的方法(例如交叉證實和多重隨機試驗)。
·由于對各個類型的癌癥的觀察太少，用于癌癥辨別的多類分類器的設(shè)計很困難。
b.撤消-選擇的標(biāo)記物
標(biāo)記物采用上述方法撤消選擇。撤消選擇的標(biāo)記物在面板中以非-選擇物表示。
c.檢測面板的組成
i.選擇的標(biāo)記物探針
用于所有三種方法的選擇的標(biāo)記物探針概括于圖5中。
ii.最大程減小選擇的標(biāo)記物組
對于檢測面板，很清楚對于一個標(biāo)記物探針7傳遞了最佳的檢測性能。分析了探針的組合以考察是否可能獲更多探針的可靠面板。
(1)方法
邏輯回歸方法允許最佳亞組根據(jù)性能測定(Fisher評分)進行排列。該分析用于選擇1-5個探針的組合。Fishers線性辨別函數(shù)和對數(shù)模型(邏輯回歸)用于說明這些組合的性能。上文顯示了數(shù)據(jù)。
(2)結(jié)論
探針7自身作為一個分類器性能良好；然而，單用探針7的一個缺點是探針7具有高的假陰性評分。采用Fishers線性辨別函數(shù)作為一個分類器的最佳性能，是采用探針7和16。在采用其它組合的面板中結(jié)果的變異性提示更多的特征加入的噪聲超過改進分類評分的任何潛能。少量的錯誤評分的樣品產(chǎn)生了這些較稀有事件的統(tǒng)計學(xué)不良顯示。設(shè)計具有較大量病例的分類器可能允許設(shè)計更好的分類器。根據(jù)數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)，采用不同分類器選擇最佳探針組合的技術(shù)可能產(chǎn)生不同的最佳面板。
iii.補充的標(biāo)記物
顯示可設(shè)計出適合不同探針的有用性的面板?？刹捎貌煌姆椒ㄟx擇這些亞組決策圖、邏輯回歸、和線性辨別函數(shù)。數(shù)據(jù)在上文中顯示。
方法
采用SPSS，將Fisher線性辨別函數(shù)應(yīng)用于從面板獲得的評分，其中由于選取限制因素應(yīng)用了限制。例如，所有的探針獲自一個供應(yīng)商。另外，選擇步進式選擇來尋打特征的最佳組合。采用留出一個(Leave-One-Out)的交叉證實檢驗評估了性能。
iv.另一種標(biāo)記物作用的生物學(xué)機制
(功能上等價的標(biāo)記物)
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠測定功能上等價的標(biāo)記物。該面板中所用的標(biāo)記物的功能行為在通篇文章中描述。
v.標(biāo)記物定位
本研究中所用的各種標(biāo)記物的定位描述于本文的其它地方。
vi.面板性能
三種方法的性能顯示于上文中。
vii.面板性能解釋的局限
·由于小的數(shù)據(jù)組和需要采用重新取樣的方法，分類器具有被過度刪減的危險(使擬合數(shù)據(jù)大靠近)。
·采用細胞學(xué)標(biāo)本的面板性能難以精確預(yù)測，由于不清楚痰液細胞學(xué)樣品是否將含有足夠數(shù)目的細胞，該細胞是組織學(xué)驗證研究中的分析的細胞的代表。假定給出一個足夠大小的細胞樣品，人們還是希望優(yōu)化的面板與細胞學(xué)標(biāo)本表現(xiàn)相似。
d.辨別面板的組成
i.用于所有癌癥的一種5-方面(5-way)面板
在三種分析技術(shù)中，只有決策圖是接受單一的5-方面面板。因此構(gòu)建了一種決策圖以同時分類所有類型的肺癌。該面板的成員顯示于圖5中。該面板的性能在上文面板性能表中顯示。
ii.用于分辨一種類型肺癌和所有其它肺癌的檢測面板板
線性辨別函數(shù)不能很好地適合于同時進行多類別分辨。分析了五個不同分類器的性能，其中分別設(shè)計每一個分類器以分辨一種癌癥與合并的所有癌癥組的差別，。當(dāng)具有候選癌癥之一時，這種組合具有不將其它病例分類的潛力，或當(dāng)具有兩種或多種候選癌癥時分出一種疾病的潛力。這在識鑒定不一致病例作進一步檢查中具有潛在的優(yōu)越性。
已知道一種辨別面板對于所有癌癥類型的總的誤差率具有相當(dāng)高(一個五種方式的分類器)。在上文顯示的面板性能數(shù)據(jù)中，顯示了五個成對方式分類器的性能，設(shè)計每種分類器能從四種其它可能的癌癥中鑒定出一種癌癥。這種方法與使用決策圖和線性辨別函數(shù)進行分析相適應(yīng)。這種技術(shù)當(dāng)應(yīng)用時，具有傳遞有兩種以上解釋發(fā)現(xiàn)的潛力，對一位患者給出兩種或多種診斷，提示要作進一步的臨床研究。該技術(shù)具有不傳遞發(fā)現(xiàn)的潛能，又一次提示要作進一步的調(diào)查(或許用檢測面板進行再檢驗)。
iii.說明檢測面板的假陽性病例可能性的面板
可訓(xùn)練一個另外的面板來分辨假陽性病例(來自檢測面板)和五種癌癥類型之間的區(qū)別。這包括從檢測面板中選出那些被錯誤地分類為異常的個體病例。這訓(xùn)練了一個對于檢測這些“特殊”病例的較難問題的專用分類器。然而，雖然這在理論上是合理的任務(wù)，但數(shù)據(jù)組只產(chǎn)生這些病例中的四種，并且認為該人群對于分析不中充分代表性的。
iv.選擇的標(biāo)記物
用于所有三種方法的選擇的標(biāo)記物探針概括于圖5中。
v.最大程度減少選出標(biāo)記物組
本標(biāo)題是在“采用不同方法獲得相似結(jié)果論證方法的有效性”下提出的。
vi.補充的標(biāo)記物
本標(biāo)題是在“采用不同方法獲得相似結(jié)果論證方法的有效性”下提出的。
vii.其它標(biāo)記物作用的生物學(xué)機制
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定功能上等價的標(biāo)記物。面板中所用的標(biāo)記物的功能行為在通篇文章中描述。
viii.標(biāo)記物定位
本研究所用的各種標(biāo)記物的定位在通篇文章中描述。
ix.面板性能
三種方法的性能概括于圖5中。
e.權(quán)衡參數(shù)的作用
除前面討論的用于標(biāo)記物以及用于疾病(分類)的用戶提供的權(quán)衡標(biāo)準外，還可采用二元權(quán)衡方案。例如，如果權(quán)衡所有非-DAKO提供的探針為“0”，而且權(quán)衡所有DAKO提供的探針為“1”，那么最優(yōu)化面板將僅含有DAKO提供的探針。這對于任何意圖只采用它們的提供物來開發(fā)和銷售分子診斷面板試劑盒的供應(yīng)商是一種重要的產(chǎn)品設(shè)計能力。
f.采用其它(非H-評分)客觀評分參數(shù)的效果
i.背景
含有一組邏輯框的病理檢查表如下表32
表32
此標(biāo)準評分系統(tǒng)采用通過給強度分級獲得的“H評分”，如無＝0，弱＝1，中＝2，強＝3，并且細胞百分比如0-5％＝0，6-25％＝1，26-50％＝2，51-75％＝3，＞75％＝4，然后將兩種級別相乘。例如，50％的弱染色加上50％的中等染色將得分10＝2×2+2×3。
ii.方法
分析了另一種評分方法，其中反應(yīng)被分為以下的低、中和高
(a)如果超過50％的細胞具有中等或中等以上染色→高
(b)如果超過50％的細胞不染色→低
(c)其它→中
采用這種3-級因子代替H-評分重復(fù)決策圖檢測面板選擇方法。如果需要，這使該圖表在各個節(jié)點上分為3個分支。
iii.結(jié)果
選出的面板為探針3、7、10、11、16、19、20、28。具有如下的估計性能
這應(yīng)與具有H-評分的參考性能相比較
iv.結(jié)論
·當(dāng)采用推薦的另一種評分系統(tǒng)時，性能基本上損失了(較大的面板、較低靈敏度和較低的特異性)。
·將H-評分處理為連續(xù)的變量(在0-12的范圍內(nèi))似乎對在檢測數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上的面板選擇是接近最佳的。
·沒有檢查許多其它可能的評分系統(tǒng)，但是它們對于實驗檢測的面板設(shè)計和開發(fā)方法是可行的和可采用的。
4.肺癌的檢測和辨別面板
下面列出的是由上述說明性的實施例確定的典型的肺癌檢測和辨別面板。注意盡管下文列出的面板列舉了具體的探針，但各具體探針可為相關(guān)的探針或功能相關(guān)的探針?biāo)〈?br> 檢測(無約束條件)
·結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-細胞周期蛋白A
·抗-細胞周期蛋白A、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)
·抗-細胞周期蛋白A、抗-ER-相關(guān)P29
·抗-細胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B
·抗-細胞周期蛋白A、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-VEGF
·抗-細胞周期蛋白A、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B
·抗-細胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-VEGF
·抗-細胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A
·抗-細胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-VEGF、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A
·抗-細胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-VEGF、抗-細胞周期蛋白D1
·抗-細胞周期蛋白A、結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)
·抗-細胞周期蛋白A、結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-ER-相關(guān)P29
·抗-細胞周期蛋白A、結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B
·抗-細胞周期蛋白A、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-VEGF
·抗-細胞周期蛋白A、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、結(jié)合一種或多種附加探針的抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B
·抗-細胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-VEGF
·抗-細胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A
·抗-細胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-VEGF、結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A
·抗-細胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-VEGF、結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-細胞周期蛋白D1
檢測(W/O抗-細胞周期蛋白A)
·結(jié)合一種或多種附加探針的抗-Ki-67。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原和抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B的任何一個探針的抗-Ki-67。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原和抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B的任何兩種探針的抗-Ki-67。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原和抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B的任何三種探針的抗-Ki-67。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原和抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B的任何四種探針的抗-Ki-67。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原和抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B的任何五種探針的抗-Ki-67。
·抗-Ki-67、抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原和抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原和抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B的任何一個探針并具有一種或多種附加探針的抗-Ki-67。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原和抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B的任何兩種探針并具有一種或多種附加探針的抗-Ki-67。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原和抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B的任何三種探針并具有一種或多種附加探針的抗-Ki-67。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原和抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B的任何四種探針并具有一種或多種附加探針的抗-Ki-67。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原和抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B的任何五種探針并具有一種或多種附加探針的抗-Ki-67。
·抗-Ki-67、抗-VEGF、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性細胞核抗原、抗-成熟表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白B和一種或多種附加探針。用商品化的優(yōu)選探針進行檢測
·結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-Ki-67。
·結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-TTF-1。
·結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-EGFR。
·結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-增殖性細胞核抗原。
·選自抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性細胞核抗原的兩種探針。
·選自抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性細胞核抗原的三種探針。
·抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性細胞核抗原。
·選自抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性細胞核抗原、和一種或多種附加探針的兩種探針。
·選自抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性細胞核抗原、和一種或多種附加探針的三種探針。
·抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性細胞核抗原、和一種或多種附加探針。
分辨腺癌和其它肺癌之間的差別
·抗-粘蛋白1和抗-TTF-1
·與選自抗-VEGF、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相關(guān)P29和抗-Glut3的任何一種探針結(jié)合的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·與選自抗-VEGF、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相關(guān)P29和抗-Glut3的任何兩種探針結(jié)合的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·與選自抗-VEGF、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相關(guān)P29和抗-Glut3的任何三種探針結(jié)合的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·與選自抗-VEGF、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相關(guān)P29和抗-Glut3的任何四種探針結(jié)合的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·抗-VEGF、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-粘蛋白1、抗-TTF-1、抗-BCL2、抗-ER-相關(guān)P29和抗-Glut3。
·抗-粘蛋白1、抗-TTF-1和一種或多種附加的探針。
·與選自抗-VEGF、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相關(guān)P29和抗-Glut3的任何一種探針結(jié)合、并具有一種或多種附加探針的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·與選自抗-VEGF、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相關(guān)P29和抗-Glut3的任何兩種探針結(jié)合、并具有一種或多種附加探針的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·與選自抗-VEGF、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相關(guān)P29和抗-Glut3的任何三種探針結(jié)合、并具有一種或多種附加探針的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·與選自抗-VEGF、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相關(guān)P29和抗-Glut3的任何四種探針結(jié)合、并具有一種或多種附加探針的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·抗-VEGF、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-粘蛋白1、抗-TTF-1、抗-BCL2、抗-ER-相關(guān)P29、抗-Glut3和一種或多種附加探針。
分辨鱗狀細胞癌和其它肺癌之間的差別
·結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-CD44v6。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相關(guān)P29和抗-黑色素瘤相關(guān)抗原3的任何一種探針的抗-CD44v6。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相關(guān)P29和抗-黑色素瘤相關(guān)抗原3的任何兩種探針的抗-CD44v6。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相關(guān)P29和抗-黑色素瘤相關(guān)抗原3的任何三種探針的抗-CD44v6。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相關(guān)P29和抗-黑色素瘤相關(guān)抗原3的任何四種探針的抗-CD44v6。
·抗-CD44v6、抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相關(guān)P29和抗-黑色素瘤相關(guān)抗原3。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相關(guān)P29和抗-黑色素瘤相關(guān)抗原3的任何一種探針，并具有一種或多種附加探針的抗-CD44v6。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相關(guān)P29和抗-黑色素瘤相關(guān)抗原3的任何兩種探針，并具有一種或多種附加探針的抗-CD44v6。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相關(guān)P29和抗-黑色素瘤相關(guān)抗原3的任何三種探針，并具有一種或多種附加探針的抗-CD44v6。
·結(jié)合有選自抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相關(guān)P29和抗-黑色素瘤相關(guān)抗原3的任何四種探針，并具有一種或多種附加探針的抗-CD44v6。
·抗-CD44v6、抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相關(guān)P29和抗-黑色素瘤相關(guān)抗原3和一種或多種附加探針。
分辨大細胞癌和其它肺癌之間的差別
·結(jié)合有一種或多種附加探針的抗-VEGF。
·抗-VEGF和抗-p120
·抗-VEGF和抗-Glut3
·抗-VEGF、抗-p120和抗-細胞周期蛋白A
·抗-VEGF、抗-p120和一種或多種附加探針
·抗-VEGF、抗-Glut3和一種或多種附加探針
·抗-VEGF、抗-p120、抗-細胞周期蛋白A和一種或多種附加探針分辨間皮瘤和其它肺癌之間的差別
·結(jié)合一種或多種附加探針的抗-CD44v6。
·結(jié)合一種或多種附加探針的抗-增殖性細胞核抗原。
·結(jié)合一種或多種附加探針的抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)
·與一種或多種附加探針結(jié)合的、選自抗-CD44v6、抗-增殖性細胞核抗原和抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)的兩個探針
·抗-CD44v6、抗-增殖性細胞核抗原、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)和一種或多種附加探針。
分辨小細胞肺癌和其它肺癌之間的差別
·結(jié)合一種或多種附加探針的抗-增殖性細胞核抗原。
·結(jié)合一種或多種附加探針的抗-BCL2。
·結(jié)合一種或多種附加探針的抗-EGFR。
·選自抗-增殖性細胞核抗原、抗-BCL2和抗-EGFR的兩個探針
·抗-增殖性細胞核抗原、抗-BCL2、抗-EGFR
·選自抗-增殖性細胞核抗原、抗-BCL2和抗-EGFR，并結(jié)合一種或多種附加探針的兩個探針
·抗-增殖性細胞核抗原、抗-BCL2、抗-EGFR和一種或多種附加探針同時分辨腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌、間皮瘤和小細胞癌的差別
·選自抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-CD44v6、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-增殖性細胞核抗原、抗-粘蛋白1、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-N-鈣粘著蛋白、抗-EGFR和抗-增殖性細胞核抗原的兩種或多種探針
·抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-CD44v6、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-增殖性細胞核抗原、抗-粘蛋白1、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-N-鈣粘著蛋白、抗-EGFR和抗-增殖性細胞核抗原
·選自與一種或多種附加探針結(jié)合的、抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-CD44v6、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-增殖性細胞核抗原、抗-粘蛋白1、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-N-鈣粘著蛋白、抗-EGFR和抗-增殖性細胞核抗原的兩種或多種探針
·與一種或多種附加探針結(jié)合的抗-VEGF、抗-凝血調(diào)節(jié)蛋白、抗-CD44v6、抗-表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A、抗-增殖性細胞核抗原、抗-粘蛋白1、抗-人上皮相關(guān)抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-N-鈣粘著蛋白、抗-EGFR和抗-增殖性細胞核抗原
5.結(jié)論
a.分子診斷面板方法的有效性
i.非-直觀解決方案
繪制柱形圖(PathologistData.xls，工作表柱形圖)顯示用于比較對照和癌癥的各個探針的標(biāo)記物評分的分布。從這些柱形圖中清楚可見用于具體面板的探針的直觀選擇無疑是不明顯的，并且在缺乏明顯方法時描述的本發(fā)明允許尋找有效的組合。
ii.各種產(chǎn)物用途的優(yōu)化
iii.采用不同方法獲得的相似結(jié)果證實方法的有效性
本文中各種分析所獲得結(jié)果的詳細研究總結(jié)在圖表中，顯示了以下的發(fā)現(xiàn)。
1.各個探針性能的仔細研究沒有制成可能比任何一個探針性能更好的明顯探針組合。
2.對所有三種分類方法在相似的特征組基礎(chǔ)上進行了評估。小的差異可歸因于數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，這種數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)可能對一種分類器比對另一種分類器更有利。
3.當(dāng)檢驗設(shè)計過程中不讓看見的獨立的病理學(xué)家提供的數(shù)據(jù)時，用這些方法中的一種設(shè)計的所有分類器顯示獲得了良好的性能。這給予本發(fā)明很高的信心。
4.基于單用探針7的檢測面板給出了高性能。
5.如果探針7與探針16或25組合，那么可獲得更好的性能。
6.盡管其它探針與探針7組合似乎進一步改善性能，但捕捉額外病例的數(shù)量太少以致于它們可能不具有代表性并且如此設(shè)計的分類器不能通用。
7.選自除探針7外的探針面板的性能提供了某種辨別力，這種辨別力與當(dāng)今實際用于人篩選的相比較是足夠好的，但可能在未來的臨床診斷細胞學(xué)領(lǐng)域中對自動化細胞計數(shù)器不是足夠好的(見圖6)。
8.其它探針組合可提供有用的、但較差的性能。
9.如果某些探針難以獲得，本發(fā)明允許選擇其它探針組合。這通過根據(jù)商品化的優(yōu)選探針組的分類器設(shè)計作了說明。見圖7。
10.本發(fā)明允許針對昂貴的探針采用權(quán)衡法，不是完全從分析中排除它們，如果它們的作用重要允許包含在面板中。
11.本發(fā)明允許設(shè)計一種類型肺癌的特異性辨別面板，該面板可從所有其它癌癥中辨別出一種類型的肺癌。
12.一種能區(qū)分五種癌癥的面板的性能分析顯示辨別是可能的，但其總誤差率比一組五個面板大，后者中各個面板設(shè)計用于從其它類型中辨別一種癌癥。
13.一種非常有用的辨別力是通過組合五個兩方法分類器而獲得的。
14.通過用于五種辨別面板三種分類方法選出的普通探針組，再一次給出這一結(jié)果的可信性。
15.用于分離腺癌病例的探針是1、14、19、20、25和27。
16.用于分離鱗狀細胞癌病例的探針是1、2、3、24、25和26。
17.用于分離大細胞肺癌病例的探針是1和7或1和21。
18.用于分離間皮瘤病例的探針是3、12和16。
19.用于分離小細胞肺癌病例的探針是12、20和23。
20.用于同時識別所有癌癥的探針是1、2、3、4、12、14、19、22、23和28。
21.采用本發(fā)明定義的多重成對面板的優(yōu)點是，可疑病例在五種面板的任何一種上可能不得分，而混淆的病例可在兩種或多種面板上顯示。這種反常的報告提醒細胞學(xué)家需要進一步的分析。
iv.風(fēng)險處理研究
應(yīng)用于本研究的所有檢驗是根據(jù)實際統(tǒng)計的。當(dāng)檢驗新的數(shù)據(jù)時根據(jù)性能上小的改進選出的探針有統(tǒng)計學(xué)變異的風(fēng)險。為了得到結(jié)果的可信度，檢驗了對病理學(xué)家1和病理學(xué)家2的數(shù)據(jù)進行線性辨別分析的最佳分類器。應(yīng)記住病理學(xué)家3的數(shù)據(jù)與病理學(xué)家1和病理學(xué)家2的數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)差異，所以如果當(dāng)采用病理學(xué)家3的數(shù)據(jù)檢驗時獲得了良好結(jié)果，那么這的確是鼓舞人心的。
(1)用未看見的數(shù)據(jù)進行檢驗的報告-檢測面板
(a)方法
在上文標(biāo)題為“檢測面板的組成”的章節(jié)中，我們顯示了用特征7和16獲得的良好分類。采用SUSS，選出報告了7和16的H評分的所有病理學(xué)家3的數(shù)據(jù)。然后利用轉(zhuǎn)換和計算，產(chǎn)生了規(guī)范的辨別功能作為一個新特征。然后檢驗這一特征單獨性能。
(b)結(jié)果
這些是測試根據(jù)病理學(xué)家1和病理學(xué)家2的數(shù)據(jù)設(shè)計的分類器以及測試病理學(xué)家3的數(shù)據(jù)的結(jié)果。采用對探針7和16的線性辨別函數(shù)設(shè)計出分類器。規(guī)范的病理學(xué)家2的函數(shù)＝0.965*探針7-0.298*探針16。
采用探針7和16對病理學(xué)家3的數(shù)據(jù)進行分類的結(jié)果
預(yù)計的分組成員數(shù) 總數(shù)
診斷(UCLA) 0 1
原始計數(shù)0 20 1 21
1 6 41 47
％ 0 95.24.8100.0
1 12.887.2 100.0
交叉證實計數(shù)0 20 1 21
1 6 41 47
％ 0 95.24.8100.0
1 12.887.2 100.0
a.僅對分析的那些病例進行交叉證實。在交叉證實中，各個病例通過產(chǎn)生自除那個病例外的所有病例的函數(shù)進行分類。
b.89.7％的原始分組的病例被正確分類
c.89.7％的交叉證實分組的病例被正確分類
這比將根據(jù)探針7的病理學(xué)家3的數(shù)據(jù)分類更好，顯示如下
只采用探針7對病理學(xué)家3的數(shù)據(jù)分類的結(jié)果
預(yù)計的分組成員數(shù) 總數(shù)
診斷(UCLA) 0 1
原始計數(shù) 0 20 1 21
1 8 3947
％ 0 95.24.8 100.0
1 17.083.0 100.0
交叉證實計 0 20 1 21
數(shù)
1 8 3947
％ 0 95.24.8 100.0
1 17.083.0 100.0
a.僅對分析的那些病例進行交叉證實。在交叉證實中，各個病例通過產(chǎn)生自除那個病例外的所有病例的函數(shù)進行分類。
b.86.8％的原始分組的病例被正確分類
c.86.8％的交叉證實分組的病例被正確分類
(c)結(jié)論
這使人們相信基于7和16的雙-探針分類器比僅用探針7的更好。
(2)用未看見的數(shù)據(jù)進行檢驗的報告-辨別面板
(a)背景
下面的報告是采用病理學(xué)家1和病理學(xué)家2采用LOF得出的數(shù)據(jù)設(shè)計并用未看見的病理學(xué)家3的數(shù)據(jù)檢驗過的分類器的性能。在設(shè)計階段病例數(shù)相對少，而且檢驗數(shù)據(jù)的病例數(shù)也少，所以在第一和第二組的性能之間可預(yù)見變異性程度良好。
(b)方法
在SPSS中，建立了標(biāo)題為“模式識別”的章節(jié)中產(chǎn)生的標(biāo)準辨別函數(shù)并根據(jù)病理學(xué)家3的數(shù)據(jù)對所有五種類型的癌癥進行檢驗。
(c)結(jié)果
間皮瘤LDF＝探針3sc*.385-探針12s*.317+探針16s*1.006
分類結(jié)果
預(yù)計的分組成員數(shù) 總數(shù)
間皮瘤＝1 0 1
其它＝0
原始計數(shù) 0 38 2 40
1 1 7 8
％ 0 95.05.0 100.0
1 12.587.5 100.0
交叉證實計數(shù) 0 38 2 40
1 1 7 8
％ 0 95.05.0 100.0
1 12.587.5 100.0
a.僅對分析的那些病例進行交叉證實。在交叉證實中，各個病例通過產(chǎn)生自除那個病例外的所有病例的函數(shù)進行分類。
b.93.8％的原始分組的病例被正確分類
c.93.8％的交叉證實分組的病例被正確分類
小細胞癌LDF＝探針12s*.575-探針20s*.408-探針22s*.423+探針23s*.344
分類結(jié)果
預(yù)計的分組成員數(shù)總數(shù)
小細胞癌＝1 01
其它＝0
原始計數(shù)0 39 3 42
1 15 6
％ 0 92.9 7.1 100.0
1 16.7 83.3100.0
交叉證實計數(shù)0 39 3 42
1 15 6
％ 0 92.9 7.1 100.0
1 16.7 83.3100.0
a.僅對分析的那些病例進行交叉證實。在交叉證實中，各個病例通過產(chǎn)生自除那個病例外的所有病例的函數(shù)進行分類。
b.91.7％的原始分組的病例被正確分類
c.91.7％的交叉證實分組的病例被正確分類
鱗狀細胞癌LDF＝探針1sc*.328-探針2sc*.295-探針3sc*.741+探針24s*.490+探針25s*.393+探針26s*.426
分類結(jié)果
預(yù)計的分組成員數(shù) 總數(shù)
鱗狀細胞癌＝1 0 1
其它＝0
原始計數(shù)0 31435
1 2 911
％ 0 88.6 11.4 100.0
1 18.2 81.8 100.0 交叉證實計數(shù) 0 31435
1 2 911
％ 0 88.6 11.4 100.0
1 18.2 81.8 100.0
a.僅對分析的那些病例進行交叉證實。在交叉證實中，各個病例通過產(chǎn)生自除那個病例外的所有病例的函數(shù)進行分類。
b.87.0％的原始分組的病例被正確分類
c.87.0％的交叉證實分組的病例被正確分類
大細胞癌LDF＝探針1sc*.847+探針7sc*.452
分類結(jié)果
預(yù)計的分組成員數(shù) 總數(shù)
大細胞癌＝1 0 1
其它＝0
原始計數(shù) 0 23 15 38
1 4 5 9
％ 0 60.539.5 100.0
1 44.455.6 100.0
交叉證實計數(shù) 0 23 15 38
1 4 5 9
％ 0 60.539.5 100.0
1 44.455.6 100.0
a.僅對分析的那些病例進行交叉證實。在交叉證實中，各個病例通過產(chǎn)生自除那個病例外的所有病例的函數(shù)進行分類。
b.59.6％的原始分組的病例被正確分類
c.59.6％的交叉證實分組的病例被正確分類
用非常少量的大細胞癌的病例設(shè)計和檢驗的分類器的性能較低但有用，所以這一結(jié)果仍非常令人鼓舞。
腺癌，LDF＝探針4sc*.515+探針5sc*.299-探針14s*.485+探針19s*.347+探針20s*.723+探針25s*.327+探針27s*.327
分類結(jié)果
預(yù)計的分組成員數(shù) 總數(shù)
腺癌＝1 0 1
其它＝0
原始計數(shù)0 29 5 34
1 0 14 14
％ 0 85.314.7 100.0
1 0 100.0 100.0
交叉證實計數(shù)0 29 5 34
1 0 14 14
％ 0 85.314.7 100.0
1 0 100.0 100.0
a.僅對分析的那些病例進行交叉證實。在交叉證實中，各個病例通過產(chǎn)生自除那個病例外的所有病例的函數(shù)進行分類。
b.89.6％的原始分組的病例被正確分類
c.89.6％的交叉證實分組的病例被正確分類
(d)結(jié)論
注意到這些分類器的性能經(jīng)得起應(yīng)用于不看見數(shù)據(jù)的檢驗是非常鼓舞人心的。這得出在檢測各個癌癥的能力上具有非常高的把握。
(3)對不同患者和病理學(xué)家的數(shù)據(jù)進行訓(xùn)練和檢驗
作為有效性(robustness)的“最后”檢驗，在病理學(xué)家1和病理學(xué)家2檢查的數(shù)據(jù)上訓(xùn)練了LDF。這樣去除了病理學(xué)家3檢查的數(shù)據(jù)。因此對病理學(xué)家3和病理學(xué)家1檢查的數(shù)據(jù)進行了檢驗，數(shù)據(jù)沒有偏差。以前，通過采用用于檢測和訓(xùn)練的同一患者的數(shù)據(jù)的檢驗過程具有偏差。
LDF產(chǎn)生了相同的特征組，除了不包括探針4。該LDF＝探針1sc*.288+探針7sc*.846-探針15s*.249-探針16s*.534
分類結(jié)果
曲線下的面積＝0.977
預(yù)計的分組成員數(shù)總數(shù)
診斷(UCLA) 01
原始計數(shù) 0 20 0 20
1 937 46
％0 100.0.0 100.0
1 19.6 80.4100.0
交叉證實計數(shù) 0 20 0 20
1 937 46
％0 100.0.0 100.0
1 19.6 80.4100.0
a.僅對分析的那些病例進行交叉證實。在交叉證實中，各個病例通過產(chǎn)生自除那個病例外的所有病例的函數(shù)進行分類。
b.86.4％的原始分組的病例被正確分類
c.86.4％的交叉證實分組的病例被正確分類
對病理學(xué)家3的數(shù)據(jù)僅用探針7仍獲得了一個合理的結(jié)果，但是與曲線下較小的面積相似的結(jié)果，。
分類結(jié)果
曲線下面積＝.908
預(yù)計的分組成員數(shù) 總數(shù)
診斷(UCLA)0 1
原始計數(shù) 019 1 20
17 3946
％095.05.0 100.0
115.284.8 100.0
交叉證實計數(shù) 019 1 20
17 3946
％095.05.0 100.0
115.284.8 100.0
a.僅對分析的那些病例進行交叉證實。在交叉證實中，各個病例通過產(chǎn)生自除那個病例外的所有病例的函數(shù)進行分類。
b.87.9％的原始分組的病例被正確分類
c.87.9％的交叉證實分組的病例被正確分類
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權(quán)利要求
1.一種采用細胞為基礎(chǔ)的診斷檢測普通疾病狀態(tài)或分辨特殊疾病狀態(tài)之間的區(qū)別的檢測面板，其特征在于，所述面板包含多個探針，每一個探針能特異性地結(jié)合與普通或特殊病狀聯(lián)合的標(biāo)記物，其中細胞學(xué)樣品中面板的成分探針與細胞結(jié)合的模式診斷所述疾病的存在或具體特性具有診斷意義。
2.如權(quán)利要求1所述的面板，其特征在于，所述普通疾病選自癌癥和傳染病。
3.如權(quán)利要求2所述的面板，其特征在于，所述癌癥選自上皮細胞為基礎(chǔ)的癌癥、實體瘤為基礎(chǔ)的癌癥、分泌性腫瘤為基礎(chǔ)的癌癥和血液為基礎(chǔ)的癌癥。
4.如權(quán)利要求2所述的面板，其特征在于，所述傳染病選自細胞為基礎(chǔ)的疾病，其中傳染性生物是病毒、細菌、原生動物、寄生蟲或真菌。
5.如權(quán)利要求1所述的面板，其特征在于，所述面板通過權(quán)衡以下因數(shù)得以優(yōu)化，所述因素選自成本、一地區(qū)中流行的普通疾病一地區(qū)中流行的特殊疾病探針的可用性和商業(yè)上的考慮。
6.如權(quán)利要求1所述的面板，其特征在于，所述各個探針含有一個可檢測的標(biāo)記物。
7.如權(quán)利要求6所述的面板，其特征在于，所述探針包含抗體。
8.如權(quán)利要求6所述的面板，其特征在于，所述標(biāo)記物選自生色團、熒光團、染料、放射性同位素和酶。
9.如權(quán)利要求8所述的面板，其特征在于，所述標(biāo)記物是可用電磁輻射檢測的生色團，所述電磁輻射選自β射線、γ射線、X射線、紫外線、可見光、紅外線和微波。
10.如權(quán)利要求1所述的面板，其特征在于，所述結(jié)合模式用光子顯微鏡檢術(shù)檢測。
11.如權(quán)利要求10所述的面板，其特征在于，所述光子顯微鏡檢術(shù)利用至少一種電磁輻射，所述電磁輻射選自γ射線、X射線、β射線、紫外線、可見光、紅外線和微波。
12.如權(quán)利要求3所述的面板，其特征在于，所述檢測是用于肺癌，而所述分辨是辨別鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌、小細胞癌和間皮瘤之間的區(qū)別。
13.如權(quán)利要求1所述的面板，其特征在于，所述檢測是用于性傳播播疾病而所述分辨是辨別原體、滴蟲(trichomonas)、淋病、皰疹和梅毒之間的區(qū)別。
14.一種形成采用細胞為基礎(chǔ)檢測診斷檢測患者疾病或在疾病狀態(tài)之間區(qū)別的面板的方法，其特征在于，所述方法包括
(a)確定探針結(jié)合的靈敏度和特異性，各個探針能特異性地結(jié)合與一疾病相關(guān)的標(biāo)記物文庫的一個成員；和
(b)選擇有限數(shù)量的所述探針，其結(jié)合模式對于所述疾病的存在或具體特性有診斷意義。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述確定包括
(a)分別將從已知患有所述疾病的患者的組織學(xué)或細胞學(xué)樣品和已知沒有患所述疾病的患者的組織學(xué)或細胞學(xué)樣品與所述的各個探針接觸；
(b)測定在已知所述標(biāo)記物存在于所述樣品的細胞中的位置上，各個探針與其互補的疾病標(biāo)記物特異性結(jié)合的量；和
(c)使所述的各個量與所述疾病的存在和具體特性相關(guān)聯(lián)。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述選擇包括一種或多種統(tǒng)計學(xué)分析方法、模式識別方法和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述選擇包括采用權(quán)衡因素方法。
18.一種檢測疾病或分辨疾病狀態(tài)之間的區(qū)別的方法，其特征在于，所述方法包括
(a)使懷疑含有某疾病的特征性異常細胞的細胞學(xué)樣品與權(quán)利要求1所述的面板接觸；和
(b)檢測所述探針的結(jié)合模式，所述模式對于所述疾病的存在或具體特性具有診斷意義。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述細胞學(xué)樣品是從體液、上皮細胞為基礎(chǔ)的器官系統(tǒng)、細針抽吸物(fine needle aspiration)或活組織檢查收集的細胞樣品。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述細胞學(xué)樣品是痰液。
21.一種采用細胞為基礎(chǔ)的診斷檢測普通疾病或分辨特殊疾病狀態(tài)之間區(qū)別的面板，其特征在于，所述面板根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法形成。
22.如權(quán)利要求21所述的面板，其特征在于，所述疾病是肺癌。
23.如權(quán)利要求1所述的面板，其特征在于，所述疾病標(biāo)記物選自形態(tài)學(xué)生物標(biāo)記物、遺傳性生物標(biāo)記物、細胞周期生物標(biāo)記物、分子生物標(biāo)記物和生化生物標(biāo)記物。
24.如權(quán)利要求3所述的面板，其特征在于，所述上皮細胞為基礎(chǔ)的癌癥是呼吸道、尿道、胃腸道或生殖道癌癥。
25.如權(quán)利要求3所述的面板，其特征在于，所述實體瘤為基礎(chǔ)的癌癥選自肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、甲狀腺癌、和前列腺癌。
26.如權(quán)利要求3所述的面板，其特征在于，所述分泌性腫瘤為基礎(chǔ)的癌癥選自肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、甲狀腺癌、和前列腺癌。
27.如權(quán)利要求3所述的面板，其特征在于，所述血液為基礎(chǔ)的癌癥選自白血病和淋巴瘤。
28.如權(quán)利要求24所述的面板，其特征在于，所述疾病是肺癌并且所述探針結(jié)合的標(biāo)記物選自Glut1、HERA、FGF、端粒酶、PCNA、CD44v6、細胞周期蛋白A、HGF、MUC-1、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子、VEGF、EGF受體、PCNA、nm23、E-鈣粘著蛋白、Bcl-2、細胞周期蛋白D1、RB、N-粘著蛋白、凝血調(diào)節(jié)蛋白及它們的功能性等價物。
29.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述體液選自血液、尿、脊髓液和淋巴液。
30.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述上皮細胞為基礎(chǔ)的器官系統(tǒng)選自呼吸道、尿道、生殖道和胃腸道。
31.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述細針抽吸物取自器官和系統(tǒng)中的實體組織類型。
32.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述活組織檢查取自器官和系統(tǒng)中的實體組織類型。
33.如權(quán)利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述器官和系統(tǒng)選自乳房、胰腺、肝、腎、甲狀腺、骨髓、肌肉、前列腺和肺。
34.如權(quán)利要求23所述的面板，其特征在于，所述形態(tài)學(xué)生物標(biāo)記物選自DNA倍性、MACs和惡變前的病灶。
35.如權(quán)利要求23所述的面板，其特征在于，所述遺傳性生物標(biāo)記物選自DNA加合物、DNA突變和細胞凋亡指數(shù)。
36.如權(quán)利要求23所述的面板，其特征在于，所述細胞周期生物標(biāo)記物選自細胞增殖標(biāo)記物、分化標(biāo)記物、調(diào)節(jié)分子和細胞凋亡標(biāo)記物。
37.如權(quán)利要求23所述的面板，其特征在于，所述分子生物標(biāo)記物或生化生物標(biāo)記物選自致癌基因、腫瘤抑制基因、腫瘤抗原、生長因子和受體、酶、蛋白質(zhì)、前列腺素和粘附分子。
38.如權(quán)利要求24所述的面板，其特征在于，所述肺部癌癥是肺癌。
39.如權(quán)利要求38所述的用于檢測肺癌的面板，其特征在于，所述多個探針包括能與細胞周期蛋白A、或其相關(guān)的標(biāo)記物或其功能上相關(guān)的標(biāo)記物結(jié)合的探針。
40.如權(quán)利要求39所述的面板，其特征在于，所述多個探針還包括能與SP-B、HERA或ER-相關(guān)的(p29)、或相關(guān)的標(biāo)記物或其功能上相關(guān)的標(biāo)記物結(jié)合的一種或多種探針。
41.如權(quán)利要求38所述的能分辨腺癌與其它類型肺癌中區(qū)別的面板，其特征在于，所述多個探針包括能與粘蛋白1和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1、或其相關(guān)的標(biāo)記物或其功能上相關(guān)的標(biāo)記物結(jié)合的探針。
42.如權(quán)利要求41所述的面板，其特征在于，所述多個探針還包括能與VEGF、SP-A、BCL-2、ER-相關(guān)的(p29)和Glut3、或其相關(guān)的標(biāo)記物或其功能上相關(guān)的標(biāo)記物結(jié)合的一種或多種探針。
43.如權(quán)利要求38所述的能分辨與鱗狀細胞癌其它類型肺癌的區(qū)別的面板，其特征在于，所述多個探針包括能結(jié)合CD44v6和ER-相關(guān)的(p29)之一或二者、或其相關(guān)的標(biāo)記物或其功能上相關(guān)的標(biāo)記物的探針。
44.如權(quán)利要求43所述的面板，其特征在于，所述多個探針還包括能與VEGF、凝血調(diào)節(jié)蛋白、Glut1和MAGE3、或其相關(guān)的標(biāo)記物或其功能上相關(guān)的標(biāo)記物結(jié)合的一種或多種探針。
45.如權(quán)利要求38所述的能分辨大細胞癌與其它類型肺癌的區(qū)別的面板，其特征在于，所述多個探針包括能與VEGF、細胞周期蛋白A和P120、或其相關(guān)的標(biāo)記物或其功能上相關(guān)的標(biāo)記物結(jié)合的一種或多種探針。
46.如權(quán)利要求38所述的能分辨間皮瘤與其它類型肺癌的區(qū)別的面板，其特征在于，所述多個探針包括能與CD44v6、PCNA和HERA，或其相關(guān)的標(biāo)記物或其功能上相關(guān)的標(biāo)記物結(jié)合的一種或多種探針。
47.如權(quán)利要求38所述的能分辨小細胞癌與其它類型肺癌的區(qū)別的面板，其特征在于，所述多個探針包括與PCNA、BCL-2和EGFR、或其相關(guān)的標(biāo)記物或其功能上相關(guān)的標(biāo)記物結(jié)合的一種或多種探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有高度靈敏度和特異性的檢測和辨別疾病狀態(tài)的方法。該方法全程能確定細胞為基礎(chǔ)的樣品中是否含有異常細胞，以及對于某些疾病能夠確定存在的疾病的組織學(xué)類型。該方法檢測細胞樣品中分子標(biāo)記物的表達水平和模式的改變。還提供了檢測面板的選擇和驗證程序。
文檔編號C12N5/08GK1554025SQ02809759
公開日2004年12月8日 申請日期2002年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月12日
發(fā)明者N·J·普雷斯曼, K·S·赫希, N J 普雷斯曼, 赫希 申請人:莫諾根股份有限公司