專利名稱：新型丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是相關(guān)于人類丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的一種新型同功酶，ALT2，及其應(yīng)用該酶作為預(yù)測和監(jiān)測組織損傷和/或功能異常的標(biāo)記。本發(fā)明與應(yīng)用檢測ALT2作為診斷包括各種病因引起的組織損傷和/或功能異常，這些病因包括，但不限于肝炎、非酒精性肝脂肪變性(NASH)、脂肪肝、肝硬化、藥物性肝炎及肌肉、腦、腎及脂肪等組織的異常。
背景技術(shù)：
丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)[EC2.6.1.2.，也稱谷氨酰丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GPT)或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶]是可逆行催化丙氨酸與α酮戊二酸反應(yīng)生成谷氨酸及丙酮酸的一種吡哆醛酶。很多組織包括肝、肌肉、腎、心臟和腦組織均有ALT活性。ALT通過調(diào)節(jié)以上四種主要中間代謝產(chǎn)物之間的相互轉(zhuǎn)換在葡萄糖異生和氨基酸代謝中起重要作用。在肌肉及某些其它組織，當(dāng)氨基酸分解作為能量來源時，谷氨酰作為氨基供體，ALT將谷氨酰的α氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移至丙酮酸生成丙氨酸，后者是饑餓時血液中的主要氨基酸。丙氨酸被肝臟攝取，通過ALT作用轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進(jìn)而用于合成葡萄糖，形成所謂的丙氨酸葡萄糖循環(huán)(Felig，Theglucose-alanine cycle，Metabolism22179-207(1973))。該循環(huán)在骨骼肌進(jìn)行劇烈耗氧運動時亦非常重要，因為這一過程中不但有由蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨基，而且還通過糖酵解產(chǎn)生大量丙酮酸。此外，亦有發(fā)現(xiàn)丙氨酸轉(zhuǎn)氨作用在腦神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酰胺的合成中起重要作用(Peng，et al.，Utilization of alpha-ketoglutarate as a precursor for transmitter glutaminein cultured cerebellar granule cells，Neurochem.Res.1629-34(1991))。在培養(yǎng)的腦顆粒細(xì)胞中，α酮戊二酸與氨基供體(丙氨酸)相結(jié)合作為谷氨酰庫的前體，在鉀誘導(dǎo)細(xì)胞去極化時，釋放谷氨酰。轉(zhuǎn)氨抑制劑氨基乙醇酸可抑制谷氨酰的合成，提示ALT參與這一重要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的合成。
ALT已被作為肝功能的血清學(xué)標(biāo)記應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。當(dāng)藥物毒性、感染(細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲或其它有核生物)、酒精或肝脂肪變性等原因引起肝損害時，血清ALT水平明顯升高(Dufour，et al.，Diagnosisand monitoring of hepatic injury.II.Recommendations for use forlaboratory tests in screening，diagnosis，and monitoring，Clin.Chem.462050-2068(2000)；Sherman，K.E.，Alanine aminotransferase in clinicalpractice，Arch.Intern.Med.151260-265(1991))。
由于細(xì)胞更新，正常周圍血循環(huán)中存在很低ALT水平。普遍認(rèn)為肝臟含有最高ALT水平(Pratt and Kaplan，supra)。肝臟中ALT水平與血循環(huán)中ALT水平相差約2000到3000倍(Lott，J.A.，Alanine andaspartate aminotransferase(ALT and AST)，Year Book Medical Publisher，Chicago，111-138(1986))。因此血清、血漿或全血中ALT水平升高被認(rèn)為是肝臟損傷時肝細(xì)胞ALT“漏出”到血循環(huán)的一種標(biāo)記。通常，不同性質(zhì)肝臟損傷導(dǎo)致不同程度的血ALT升高(Dufour，et al.，Diagnosisand monitoring of hepatic injury.I.Performance characteristics oflaboratory tests，Clin.Chem.，462027-2049(2000)；Dufour，II，supra；andSherman，supra)。血轉(zhuǎn)氨酶活性明顯升高(高于正常8到10倍)提示有病毒性肝炎或藥物引起的肝損害。血清ALT慢性輕度升高(高于正常2到8倍)提示由慢性肝炎、脂肪肝或肝脂肪變性。但是血清ALT水平與肝臟損傷的原因之間相關(guān)的機制仍然不明。
盡管血清ALT已廣泛應(yīng)用于臨床生化，但由于其在某些情況并不能正確地預(yù)示疾病，該檢測仍然存在一系列不足。最新研究質(zhì)疑血清ALT檢測對診斷肝病的特異性。很多其它疾病如肥胖、肌肉疾病、心力衰竭、血色病、Wilson氏病、α1抗糜蛋白酶缺乏癥等亦常有血清ALT活性升高(參見Asayama，et al.，Relationships between an index ofbody fat distribution(based on waist and hip circumferences)and stature，and biochemical complications in obese children，Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.，221209-16(1998)；Strauss，et al.，Prevalence of abnormalserum aminotransferase values in overweight and obese adolescents[seecomments]，J.Pediatr.136727-33(2000)；Rutledge，et al.，Persistenthypertransaminasemia as the presenting finding of childhood muscledisease，Clin.Pediatr.(Phila).，24500-503(1985)；Lin，et al.，Persistenthypertransaminasemia as the presenting findings of muscular dystrophy inchildhood，Taiwan Erh Ko I Hsueh Hui Tsa Chih.40424-429(1999)；Lottand Landesman，The enzymology of skeletal muscle disorders，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.，20153-190(1984)；Friedman，et al.，Evaluation of blooddonors with elevated serum alanine aminotransferase levels，Ann.Intern.Med.，107137-44(1987)；Lozano，et al.，Study of serumalanine-aminotransferase levels in blood donors in Spain，Haematologica，83237-239(1998))。血清ALT活性受年齡、性別、飲食及藥物的影響，其升高也見于無任何癥狀病人或“健康”者(Sherman，supra；Pratt andKaplan，Evaluation of abnormal liver-enzyme results in asymptomaticpatients，N.Engl.J.Med.，3421266-1271(2000)；Blanc and Redlich，Elevated liver enzymes in asymptomatic patients，N.Engl.J.Med.，343662；discussion 663(2000))。
曾有推論存在ALT同功酶，但迄今未有人成功分離到該同功酶。既往研究應(yīng)用層析法分離細(xì)胞漿與線粒體，提示存在兩種ALT活性，即細(xì)胞漿ALT和線粒體ALT(Ziegenbein，R.，Two different forms ofglutamic pyruvic transaminase in rat heart and their intracellularlocalization，Nature，212935(1966))。近期文獻(xiàn)一般認(rèn)為ALT是一種胞漿酶(Asayama，et al.，Relationships between an index of body fatdistribution(based on waist and hip circumferences)and stature，andbiochemical complications in obese children，Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.，221209-1216(1998))。然而，生物化學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)研究都提示有兩種人類ALT存在。應(yīng)用經(jīng)典層析方法發(fā)現(xiàn)人類肝、腎、骨骼肌和心肌組織都存在具有不同生化動力學(xué)特性的細(xì)胞質(zhì)和線粒體ALT活性(Gubern，et al.，Partial characterization of the alanine aminotransferaseisoenzymes from human liver，Biochem.Soc.Trans.，181288-1289(1990)；Sakagishi，Y.，[Alanine aminotransferase(ALT)]，Nippon Rinsho，531146-1150(1995))。Kielty等應(yīng)用細(xì)胞遺傳學(xué)方法研究由大鼠肝癌細(xì)胞株與不同人類非肝源性細(xì)胞的雜交體，將肝細(xì)胞漿ALT基因定位于第8號染色體(Kielty，et al.，Regulation of expression of liver-specificenzymes.II.Activation and chromosomal localization of solubleglutamate-pyruvate transaminase，Ann.Hum.Genet.，46135-143(1982))。可是，Wijnen等通過研究人白細(xì)胞與中國地鼠纖維母細(xì)胞雜交體將細(xì)胞漿ALT基因定位于第16號染色體(Wijnen，Assignment of GPT tohuman chromosome 16，Cytogenet.Cell Genet.32327(1982))。Sohocki等在肝細(xì)胞漿ALT氨基酸序列基礎(chǔ)上(Ishiguro，et al.，Complete aminoacid sequence of human liver cytosolic alanine aminotransferase(GPT)determined by a combination of conventional and mass spectral methods，Biochemistry，3010451-10457(1991))，應(yīng)用經(jīng)典方法與大規(guī)模光譜學(xué)方法相結(jié)合，克隆了一種人類ALT基因(由于本發(fā)明的緣故，將此基因稱為ALT1基因)并將其定位于第8號染色體(Sohocki，et al.，Humanglutamate pyruvate transaminase(GPT)localization to 8q24.3，cDNA andgenomic sequences，and polymorphic sites，Genomics，40247-252(1997))。
有關(guān)ALT的檢測和產(chǎn)品信息可參見美國專利第5,952,211號和第5,804,402號。但是這兩項專利均未提及可能導(dǎo)致改進(jìn)目前用于肝損害的診斷分析方法的自然存在的人類ALT同功酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目標(biāo)之一是含有序列編號2的氨基酸序列的ALT2蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是編碼ALT2多肽鏈的聚核苷酸序列，即序列編號1之序列及其該序列的類似體。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是與ALT2特異性結(jié)合的抗體。該抗體特異性結(jié)合ALT2而不結(jié)合ALT1。進(jìn)一步，該抗體結(jié)合于序列編號2中ALT2序列和ALT2特異性片段或類似體，或者序列編號1之DNA序列所編碼的蛋白質(zhì)或ALT2特異性片段。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是ALT2的表達(dá)載體。該表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、科氏體、或者將編碼ALT2的DNA序列與表達(dá)序列如啟動子有效結(jié)合的其它形式載體。該ALT2的DNA序列包括序列編號1之序列、編碼序列編號2之中氨基酸的相應(yīng)DNA序列或編碼序列編號2之氨基酸的類似物的相應(yīng)DNA序列。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是檢測樣本中存在ALT2和/或ALT1信使核糖核酸的方法，該樣本指生物(包括但不限于人和其它哺乳動物)的組織或體液。本發(fā)明宗旨也包括應(yīng)用于檢測樣本中存在ALT2和/或ALT1信使核糖核酸的聚核苷酸探針。
本發(fā)明的另一目標(biāo)為檢測樣本中存在ALT2和/或ALT1蛋白質(zhì)的方法，該樣本指生物(包括但不限于人和其它哺乳動物)的組織或體液。本發(fā)明宗旨也包括應(yīng)用與ALT2或ALT1特異性結(jié)合的單克隆或多克隆抗體檢測樣本中存在ALT2和/或ALT1蛋白質(zhì)。該樣本包括各種體液如血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、腦脊液、腸液、關(guān)節(jié)液、齒齦液、陰道液和胸腔液。該樣本也包括各種組織如肝、腦、肌肉、脂肪和腎組織等。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是診斷和檢測含ALT2之組織的損傷或疾病的方法。該方法包括應(yīng)用與ALT2特異性結(jié)合的單克隆或多克隆抗體檢測生物體液中ALT2的含量，應(yīng)用與ALT1特異性結(jié)合的單克隆或多克隆抗體檢測生物體液中ALT1的含量以及比較ALT2與ALT1的相對含量。當(dāng)檢測樣本ALT2水平高于ALT1水平達(dá)一定程度或ALT2水平升高達(dá)到某一特定范圍時，可診斷該生物患有特定的疾病或損傷。該樣本包括各種體液如血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、腦脊液、腸液、關(guān)節(jié)液、齒齦液、陰道液和胸腔液。該樣本也包括各種組織如肝臟、腦、肌肉、脂肪、心臟和腎組織等。
本發(fā)明另一宗旨是一種用于診斷含ALT2組織損傷或疾病的試劑盒，該試劑盒含有檢測體液中ALT2水平的檢測劑及其判定所測定的ALT2水平是否與含ALT2組織損傷或特定的疾病相關(guān)的指引。該試劑盒也可能含有檢測體液中ALT1水平的檢測劑及其判定所測定的ALT1水平是否與含ALT2組織損傷或特定的疾病相關(guān)的指引。檢測ALT2及ALT1的方法包括生物學(xué)分析法、基于抗體的分析方法、酶聯(lián)免疫吸附分析、蛋白質(zhì)免疫印跡法和放射免疫分析等方法。
本發(fā)明另一宗旨為一種用于診斷含ALT2和/或ALT1的組織損傷或疾病的試劑盒，該試劑盒包括與ALT2特異性、免疫試劑、陽性及陰性對照等。該試劑盒也可能包括與ALT1特異性結(jié)合的多克隆或單克隆抗體及判定所測定的ALT2和/或ALT1是否可診斷含ALT2和/或ALT1組織的損傷或疾病的指引。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是一種用于測定體液中ALT2水平改變(高于或低于正常)的試劑盒。該試劑盒包括體液中ALT2水平的檢測劑及其判定所測的ALT2水平是否在與某一特定情形相關(guān)的范圍的指引。本發(fā)明也可能包括一種測定體液中ALT1改變(高于或低于正常)的試劑盒，該試劑盒含有檢測體液中ALT1水平的試劑及其判定所測得的ALT1水平在與某一特定情形相關(guān)的范圍的指引。該試劑盒也可能比較ALT1和ALT2的水平以及判定該ALT1和ALT2水平是否在與某一特定情形相關(guān)的范圍的指引。檢測ALT1和ALT2的方法可能是以下方法的其中之一生物學(xué)分析法、基于抗體的分析方法、酶聯(lián)免疫吸附分析、蛋白質(zhì)免疫印跡法、快速免疫分析法或放射免疫分析等。
本發(fā)明的另一宗旨是一種制備ALT2的方法，所生產(chǎn)的ALT2可以是與序列編號2之DNA序列所編碼的氨基酸序列相同或相類似物、部分片段或衍生物。該方法包括克隆編碼ALT2的DNA序列到表達(dá)載體、引導(dǎo)該表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞而產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞和將重組宿主細(xì)胞置于可表達(dá)ALT2的任何狀態(tài)。該發(fā)明宗旨之一也包括分離和純化表達(dá)的ALT2。重組質(zhì)粒中的DNA序列包括序列編號1之序列及其任何編碼ALT2片段、類似物或衍生物的DNA序列。
本發(fā)明的目標(biāo)之一包括一種診斷生物(包括但不限于人類和哺乳類動物)與體液中ALT2和/或ALT1改變相關(guān)的狀況的方法。該方法包括應(yīng)用至少一種特異性結(jié)合ALT2的抗體與體液標(biāo)本相結(jié)合，進(jìn)而檢測與ALT2結(jié)合的ALT2抗體的量，并與已知的無該特定狀況的生物(包括但不限于人類和哺乳類動物)體液中ALT2抗體量比較，當(dāng)待測體液樣本結(jié)合的ALT2抗體含量與已知的無該特定狀況的生物體液中ALT2抗體量有明顯差異時，將提示該生物存在該特定狀況。此外，該方法也包括應(yīng)用至少一種特異性結(jié)合ALT1的抗體與體液標(biāo)本相結(jié)合，進(jìn)而檢測與ALT1結(jié)合的ALT1抗體的量，并與已知的無該特定狀況的生物體液中ALT1抗體量比較，當(dāng)待測體液樣本結(jié)合的ALT1抗體含量與已知并與已知的無該特定狀況的生物體液中ALT1抗體量有明顯差異時，將提示該生物存在該特定狀況。該方法可進(jìn)一步比較所檢測到的ALT2抗體量與總抗體量和/或ALT1抗體量，和/或比較所測定的ALT1抗體量與總抗體量和/或與所測定的ALT2抗體量。當(dāng)所測定的抗ALT2抗體量與ALT1抗體量或總抗體量的比值在某一特定范圍時，提示該特定狀況的存在。與此相似，當(dāng)所測定的抗ALT1抗體量與ALT2抗體量或總抗體量的比值在某一特定范圍時，提示該特定狀況的存在。該方法中所指體液可以是以下其中之一血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、腦脊液、腸液、關(guān)節(jié)液、齒齦液、陰道液和胸腔液。


圖1示出ALT2之cDNA序列(序列編號1)。
圖2示出推論的ALT2氨基酸序列(序列編號2)與既往已發(fā)表的人類ALT(ALT1)的氨基酸序列(序列編號3)的比較。
具體實施例方式
本發(fā)明包括ALT2的核酸及氨基酸序列、ALT2及ALT1的特異性抗體以及應(yīng)用上述蛋白質(zhì)、核酸和抗體來診斷含ALT2組織的不同疾病和狀況如脂肪肝、代謝綜合癥X，以及用于鑒別診斷不同原因所致的肝損害，包括脂肪肝(肝脂變)、酒精、創(chuàng)傷、感染、中毒及其它原因所致的肝損害。
本發(fā)明也包括ALT2的類似物和功能片段及其含有ALT2核酸序列的表達(dá)載體和含有ALT2核酸序列表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
本申請中，應(yīng)用序列分析軟件如Wisconsin大學(xué)的GCG序列分析軟件包或NCBI的BLAST等程序來衡量類似物類似程度。這類軟件通過對不同替代、缺失和其它修飾的類似體之間的相似序列的匹配比較而判定其相似程度。
“功能片段”包括保持有ALT2功能、活性或生物免疫特征的序列編號2中的片段和與ALT2有相似氨基酸序列的其它蛋白質(zhì)。這里描述的以全長的ALT2為例的有關(guān)篩選某一片段的功能的方法也可加以修飾使其同樣適用于ALT2片段。
“本質(zhì)相同的蛋白”指在不損害該蛋白的功能情況下的某些氨基酸序列改變，包括保守性氨基酸替代即同一類別的其它氨基酸(如頡氨酸替代甘氨酸、精氨酸替代賴氨酸等)或有一個或多個非保守性氨基酸被替代、缺失或插入某些氨基酸。通常指與序列編號2之序列的相似度在85％以上，特別是達(dá)從90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％到100％的相似度。
“純蛋白質(zhì)”指已從其自然存在的混合物中分離出來ALT2蛋白質(zhì)。其重量比達(dá)到至少60％以上時可認(rèn)為是純化蛋白，較好者指ALT2重量達(dá)75％、80％、90％、95％，甚至99％以上。本質(zhì)上純化的ALT2蛋白質(zhì)可通過從含ALT2的自然物質(zhì)中提取，或通過表達(dá)重組編碼ALT2的核酸而產(chǎn)生，或通過化學(xué)合成。其純度可通過適當(dāng)?shù)姆椒▉頇z測如柱層析、聚丙烯酰氨凝膠電泳或高效液相層析法。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)從其自然存在的混合物中分離出來時，它實質(zhì)上已游離于其自然相關(guān)的其它組分，因而，與從自然來源的蛋白質(zhì)不同，應(yīng)用化學(xué)合成或從細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)實質(zhì)上也已經(jīng)游離于其自然相關(guān)的其它組分。因此，實質(zhì)上純化的蛋白質(zhì)也包括了那些來源于真核細(xì)胞但是在細(xì)菌或其它原核細(xì)胞中合成的蛋白質(zhì)。
本描述中的核酸在有調(diào)節(jié)序列、載體時，可根據(jù)該領(lǐng)域中已知的方法在不同的原核和真核細(xì)胞中表達(dá)。
根據(jù)這些方法產(chǎn)生的ALT2可通過一系列成熟的方法進(jìn)行純化，例如應(yīng)用抗ALT2抗體偶聯(lián)的固相親和層析。ALT2與抗原性標(biāo)記蛋白的融合蛋白也可應(yīng)用抗標(biāo)記蛋白的抗體進(jìn)行純化，應(yīng)用經(jīng)典的純化方法如液相層析、梯度離心、凝膠電泳等方法可得到進(jìn)一步純化。各種蛋白質(zhì)的純化方法均可用于重組ALT2蛋白質(zhì)的純化。以下將更具體描述ALT2蛋白質(zhì)的純化。
組建ALT2融合蛋白也是本發(fā)明的目標(biāo)之一。融合蛋白包括將適當(dāng)?shù)娜诤匣锇榈鞍椎陌被峒尤搿⑻娲蚝椭脫QALT2的一個或多個相鄰的氨基酸。該融合蛋白可通過應(yīng)用目前所知的DNA重組技術(shù)而獲得。簡言之，編碼所要的ALT2雜交體蛋白的DNA分子可通過PCR突變、點突變和/或限制性核酸內(nèi)切酶消化和連接反應(yīng)而獲得，然后將此雜交體插入表達(dá)載體并引導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中。
含全部或部分ALT2的重組表達(dá)載體可通過各種不同形式的已知方法來構(gòu)建，常用表達(dá)載體為質(zhì)粒和科氏體。表達(dá)載體包括一個或多個ALT2片段，典型表達(dá)載體包括序列編號1之ALT2核酸序列。
本文中，“可操作性編碼”指一個或多個蛋白質(zhì)編碼區(qū)及其表達(dá)該編碼序列所編碼的蛋白質(zhì)所需的調(diào)節(jié)序列，如啟動子結(jié)合序列、增強子序列、核蛋白結(jié)合序列等類似序列。本文中有關(guān)目前可用于篩選調(diào)節(jié)序列并將其引入重組表達(dá)載體的現(xiàn)有基本技術(shù)將不再詳述。例如，用于原核及真核系統(tǒng)的適當(dāng)調(diào)節(jié)序列可參見1997年由紐約JohnWiley父子出版社出版Ausubel等編著的第三版“分子生物學(xué)簡要方法”。
用于ALT2的表達(dá)載體通常含有與其表達(dá)宿主細(xì)胞種系相適應(yīng)的調(diào)節(jié)序列，例如，在以大腸桿菌作為宿主細(xì)胞時，可用大腸桿菌來源的質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(Bolivar等，Gene，295，1977)，pBR322含有氨卞青霉素(AMPR)和四環(huán)素抗性基因，從而提供一種簡易的篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。
適合于原核宿主細(xì)胞表達(dá)的啟動子包括β半乳糖酶和半乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等，Nature，275615，1978；Goeddel等，Nature，281544，1979)，鹼性磷酸酶色氨酸啟動子系統(tǒng)(Goeddel，Nucleic Acids Res.，84057，1980)和像taq啟動子的雜合啟動子系統(tǒng)(de Boer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25，1983)。其它的功能性細(xì)菌啟動子系統(tǒng)也可應(yīng)用。通常目前技術(shù)已知這些啟動子的核酸序列，因而，技術(shù)人員可通過應(yīng)用某些提供所需核酸限制性內(nèi)切酶序列的連接序列將其與編碼所感興趣蛋白質(zhì)的核酸序列相連接(Siebenlist等，Cell，20269，1980)。
除原核生物外，某些真核微生物如酵母菌也可以作為調(diào)節(jié)序列的來源，釀酒酵母是常用的真核宿主微生物之一，用于酵母宿主的適當(dāng)啟動子序列包括3磷酸甘油激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073，1980)或其它糖原降解酶，如磷酸丙酮酸水合酶、3磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、6磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、3磷酸甘油酯歧化酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶等(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7149，1968；Holland，Biochemistry，174900，1978)。
其它一些在生長條件控制方面具有更優(yōu)越性的可誘導(dǎo)的酵母啟動子有酒精脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、氮代謝降解酶系、金屬硫酶、3磷酸甘油醛脫氫酶、與麥芽糖及乳果糖利用相關(guān)的酶系等。酵母增強子常?？稍鰪娊湍竼幼拥幕钚?。
另一方法是將重組病毒用作表達(dá)載體，例如腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、泡疹病毒、牛痘病毒、或RNA病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒或α病毒。較好的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括從鼠類或鳥類來源的逆轉(zhuǎn)錄病毒，較好的α病毒載體為來源于Sindbis或Semliki森林病毒。所有這些載體均能轉(zhuǎn)移或進(jìn)入含有某一選定標(biāo)記的基因，因而可構(gòu)建可識別的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
通過將一個或多個感興趣的基因序列及另一編碼某一特定靶細(xì)胞受體的配基的基因序列同時插入病毒載體中，則該載體將作用于該特定的靶細(xì)胞。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可通過插入編碼糖、糖脂、或糖蛋白的DNA序列而成為針對某一特定靶細(xì)胞的病毒載體。應(yīng)用針對逆轉(zhuǎn)錄病毒的抗體如可完成較好的靶定作用，如針對其粘膜感應(yīng)器周圍部分，可應(yīng)用MALT特異性抗體。該領(lǐng)域發(fā)展的新技術(shù)或已確認(rèn)的方法也可能引用用于本發(fā)明中，可插入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的特異性核酸序列將引導(dǎo)含有該核酸序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒特異性作用于靶細(xì)胞。
標(biāo)準(zhǔn)的連接反應(yīng)技術(shù)常用于構(gòu)建包括所需的編碼、非編碼及控制序列的適當(dāng)載體，純化的質(zhì)?；駾NA片段被酶切、末端補齊、再連接成所需的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
以質(zhì)粒載體為例，為了證實所構(gòu)建質(zhì)粒的序列正確性，可將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，通過適當(dāng)?shù)目股睾Y選被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞提取質(zhì)粒，通過限制性核酸內(nèi)切酶或序列測定加以分析(方法見Messing等，Nucleic Acids Res.，9309，1981；Maxam等，Methods in Enzymology，65499，1980)，也可用目前文獻(xiàn)中已有的其它方法。酶切后的DNA片段通過經(jīng)典的凝膠電泳分離(Maniatis等，1982版，分子克隆，第133-134頁)。
上述表達(dá)載體可轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在合適于誘導(dǎo)其啟動子的傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)以篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞或擴增該基因，培養(yǎng)條件如溫度、酸鹼度等的與前述用于表達(dá)的宿主細(xì)胞培養(yǎng)一樣，也可見于相關(guān)的文獻(xiàn)中。
克隆ALT2應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及核酸測序方法從人類脂肪組織cDNA文庫產(chǎn)生表達(dá)序列片段(ESTs)。用于產(chǎn)生ESTs的PCR和序列測定的引物來自于用于構(gòu)建人類脂肪組織cDNA文庫的載體TripEX。引物P922(5’-AATACGACTCACTATAGGGCGAATTGG-3’序列編號4)及引物P923(5’-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3’，序列編號5)用于PCR擴增反應(yīng)，引物P927(5’-GTTGGTACCCGGGAATTC-3，，序列編號6)用于DNA序列測定。PCR反應(yīng)條件為94℃2分鐘后，94℃15秒，58℃30秒及68℃4分鐘，共10個循環(huán)，以后接著20個循環(huán)中，每增加一個循環(huán)，增加延伸時間5秒，最后在72℃反應(yīng)7分鐘。ALT2 5’端部分通過應(yīng)用一連接引物(AP1)及ALT2特異性引物P11065’-TAGGTGCATAGTGCCATCAC-3’[AY029173中核苷酸447-428，(序列編號7)]從BD生物科技公司人脂肪組織Marathon cDNA試劑盒之cDNA中采用5’cDNA快速擴增法而得，PCR反應(yīng)條件為94℃30秒，56℃30秒及72℃1分鐘，共30個循環(huán)。
應(yīng)用BigDye序列測定試劑測定所得PCR產(chǎn)物的序列。測序反應(yīng)條件為總體積為20μl中含100ng PCR產(chǎn)物、5pmol引物、4μl BigDye序列測定混合物，反應(yīng)條件為96℃15秒，50℃10秒及60℃4分鐘，共25個循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物通過Sephdex-G50層析柱純化，真空離心干燥后，在ABI PRISM 377測序儀進(jìn)行序列測定。進(jìn)而得到完整全長DNA序列，證實該cDNA編碼一種新的ALT類似物，將其命名為ALT2。該3,957鹼基對的cDNA含有一1,569鹼基對的開放讀碼區(qū)，編碼含459個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。ALT1及ALT2核糖核酸序列均有兩個可能的起始編碼ATG，在其編碼的蛋白質(zhì)中分別相隔51個氨基酸殘基(ALT2)及24個氨基酸殘基(ALT1)。在ALT2，其兩個起始編碼均無Kozak序列，因而，哪個起始編碼作為的翻譯起點更為有效或長氨基端的ALT2是否含有靶定信號有待進(jìn)一步確定。第二個起始編碼后的序列有明顯的保守性，提示從第二個ATG后編碼的蛋白質(zhì)可能對其功能更為重要。
圖1示出ALT2的cDNA序列(序列編號1)，該核酸及氨基酸序列已于2001年4月16日存于基因庫中(基因庫編號AY029173)，但文章直到2002年3月1日才發(fā)表。應(yīng)用GCG10的序列最佳匹配程序檢測發(fā)現(xiàn)所推論得到的人類ALT2的459個氨基酸序列與人ALT1氨基酸序列(序列編號3)相比較有69％的一致性和78％的相似性(圖2)。在氨基端ALT2比ALT1長27個氨基酸殘基，ALT2及ALT1的推算分子量分別為59kDa和55kDa，推算等電點分別為6.42和7.11。
保守性功能基團(tuán)分析(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)顯示ALT2含有完整的I類轉(zhuǎn)氨酶(aminotrans_2，pfam00155)，結(jié)構(gòu)(該結(jié)構(gòu)包括天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶)和部分II類轉(zhuǎn)氨酶(aminotrans_2，pfam00222)結(jié)構(gòu)，不同的轉(zhuǎn)氨酶包括天門冬氨酸、酪氨酸及磷酸組氨酰氨基轉(zhuǎn)移酶中均含有這些結(jié)構(gòu)。
用ALT2 cDNA作為探針去查詢基因庫高產(chǎn)出基因組序列(HighThroughput Genomic Sequences，HTGS)發(fā)現(xiàn)其與第16號染色體的3個(基因庫序列編號AC007225、AC018845和AC007338)相互連接的尚未完成序列測定的人類基因組人工細(xì)菌克隆(BAC)有非常好的匹配。含有ALT2的BAC克隆由新墨西哥州的Los Alamos實驗室提供。通過比較ALT2 cDNA序列與基因庫中基因組DNA序列，并應(yīng)用PCR擴增在基因庫中序列尚不清楚的部分和DNA序列測定，從而得出ALT2基因結(jié)構(gòu)。包括外顯子1到外顯子4、外顯子5到外顯子12分別位于兩部分連續(xù)的基因組DNA序列中，應(yīng)用PCR進(jìn)一步確定其正確性。外顯子4到外顯子5之間的缺失部分通過以BAC克隆BP11-169E6為模板，用來源于外顯子4及外顯子5的引物P11455’-CAGGTGATGGC ACTATGCACCT-3’[AY029173中核苷酸425-446，序列編號8]和P10905’-CTCCCGTCCTCAGGTAGATGTTGT-3’[AY029173中核苷酸653-630，序列編號9]進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件已于上述。PCR產(chǎn)物通過序列測定加以證實。通過合并所有序列后，得到含有12個外顯子、長度約50kb的ALT2基因序列，其剪接位點和外顯子內(nèi)含子交接部分序列見表一。除ALT1基因較短，僅約3kb，ALT2與ALT1之間的基因結(jié)構(gòu)非常相似。
表一


由于基因庫中HTGS數(shù)據(jù)庫并非最終確定序列，還可能存在錯誤，ALT2基因染色體定位也通過篩選人與地鼠放射性雜交方陣而確定。應(yīng)用來源于ALT2 cDNA 3’非翻譯部分序列的一對引物5′-GGCAGGATGTTGCACTAGCTT-3’(序列編號32)以及5′-GGCTGCACTATGTGTCACTGA-3’(序列編號33)，采用StanfordGeneBridge 3放射性雜交基因芯片(Research Genetics，Invitrogen，Carlsbad，CA)進(jìn)行ALT2基因的染色體定位(Gong，et al.，Uncouplingprotein-3 is a mediator of thermogenesis regulated by thyroid hormone，beta3-adrenergic agonists，and leptin，J.Biol.Chem.，27224129-24132(1997))。所用的PCR反應(yīng)條件為94℃30秒，56℃30秒及72℃30秒，共30個循環(huán)。結(jié)果分析通過Stanford大學(xué)網(wǎng)址(http//www-shgc.Stanford.edu/RH/)(Stanford，CA))進(jìn)行。
編碼結(jié)果，00000010000000001000001000000000001100001001000001000100000020011100000010000100000被定位于16號染色體(26cRs，LOD值等于8.5)。該結(jié)果與前述應(yīng)用人白細(xì)胞與中國地鼠纖維母細(xì)胞雜交體而將ALT活性定位于16號染色體相一致，但與ALT1不同，后者位于第8號染色體。
ALT2及ALT1的組織分布采用Northern方法測定，應(yīng)用Trizol從人及恒河猴的脂肪組織中提取總核糖核酸(Gong，et al，Genomicstructure and promoter analysis of the human obese gene，J.Biol.Chem.，2713971-3974(1996)；Hotta，et al，Circulating concentrations of theadipocyte protein adiponectin are decreased in parallel with reducedinsulin sensitivity during the progression to type 2 diabetes in rhesusmonkeys，Diabetes，501126-1133(2001))。簡言之，將脂肪組織在Tizol中勻漿(每100mg組織加1ml Trizol)后，短暫離心(12,000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)，除去上層油脂部分后，每ml Trizol加入0.2μl氯仿，混勻后離心，將含有核糖核酸的水相轉(zhuǎn)移至新的試管，用異丙醇沉淀RNA。其余RNA購于BD生物科技公司。RNA印跡雜交中，每泳道含15微克RNA，人ALT2探針為相應(yīng)于基因庫編號AY029173中核苷酸615到3957的DNA片段，人ALT1探針來源于IMAGE克隆2129833(Research Genetics，Invitrogen)中的2.1kb的插入片段。采用隨機標(biāo)記法進(jìn)行放射性32P-dCTP標(biāo)記探針，在Amersham Pharmacia生物科技公司的Rapid-hyb緩沖液中于攝氏65℃進(jìn)行雜交，應(yīng)用0.5×SSC/1％SDS緩沖液在攝氏65℃洗膜兩次，進(jìn)行顯影。
可見約3.9kb的ALT2信使核糖核酸在肌肉、腎、腦及脂肪組織有高水平表達(dá)，在肝臟和乳房組織中有低水平表達(dá)。與此相反，約1.4kb的ALT1信使核糖核酸在腎、肝、脂肪和心臟中有中等水平的表達(dá)。猴脂肪組織中也有高水平的ALT2表達(dá)，但沒有ALT1表達(dá)。ALT2與ALT1的大小與預(yù)計的大小相一致。兩種ALT均只檢測到一條帶，提示該兩種基因均無其它剪接形式。ALT2表現(xiàn)為主要的ALT，其信使核糖核酸比ALT1表達(dá)分布更廣泛。該結(jié)果與基因庫中ALT轉(zhuǎn)錄程度相一致，在2百50萬總的表達(dá)序列片斷(EST)中，ALT2 EST有228個，但ALT1 EST僅有11個(GenBank Builder#130)。
在細(xì)菌中表達(dá)ALT1和ALT2應(yīng)用人肌肉cDNA作為模板，采用PCR擴增ALT2的編碼序列部分，PCR反應(yīng)條件為94℃30秒，56℃30秒及72℃1分30秒，28個循環(huán)后，72℃延伸7分鐘，反應(yīng)采用Roche公司的高保真PCR反應(yīng)系統(tǒng)，引物為含有NdeI連接序列的引物P12665’-acctgaattcatATGCAGCGGGCGGCGGCGCT-3’(基因庫編號AY029173中第95到114核苷酸序列，序列編號34)和含有HindIII連接序列的引物P11175’-ggctcagaagcttTCACGCGTACTTCTCCAGCAA-3’(基因庫編號AY029173中第1666到1646核苷酸序列，序列編號35)。所得PCR產(chǎn)物應(yīng)用NdeI和HindIII酶切后，亞克隆于質(zhì)粒pPET28a的聚組氨酸標(biāo)記后，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pPET28_ALT2，通過DNA序列測定證實插入的ALT2序列無突變。
采用相同的方法構(gòu)建ALT1的表達(dá)質(zhì)粒pPET28_ALT1，其引物為P11185’-ctgggtagacatATGGCCTCGAGCACAGGTGAC-3’(基因庫編號NM_005309中第268到288核苷酸序列，序列編號36)和P11195’ccccagctgaagcttTCAGGAGTACTCGAGGGTGAAC-3’(基因庫編號NM_005309中第1158到1137核苷酸序列，序列編號37)，模板為含有ALT1的質(zhì)粒(IMAGE克隆2129833)。
為了表達(dá)ALT2及ALT1蛋白質(zhì)，將質(zhì)粒pPET28_ALT2、pPET28_ALT1或pPET28a(作為陰性對照)分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌，分別挑取一個轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落在50毫升含30微克/毫升卡那霉素的LB液中培養(yǎng)至OD600為0.7時，加入IPTG至終濃度為1毫摩爾以誘導(dǎo)產(chǎn)生重組蛋白。分別收集來自20ml加入IPTG前及加入IPTG 3小時后的培養(yǎng)液中的細(xì)菌，重新懸浮在5毫升磷酸緩沖液中，短暫超聲波破碎三次，每次10秒鐘，將細(xì)胞裂解液在攝氏4℃10,000g離心15分鐘，收集上清作SDS-PAGE電泳及酶活性測定。
ALT活性測定采用Sigma公司的GPT優(yōu)化丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒。簡述之，在攝氏25度將2.5毫升含有左旋丙氨酸、還原型輔酶I(NADH)、乳酸脫氫酶和酮戊二酸的試劑A與試劑B混合物與0.5毫升細(xì)胞裂解上清液混合，于340nm波長處測定混合后1、2、3分鐘的吸光度，該吸光度降低的斜率與其ALT活性成比例。細(xì)胞裂解上清液蛋白質(zhì)濃度的測定采用考馬斯亮藍(lán)G250方法，標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清白蛋白。1單位ALT活性定義為在攝氏25度時每分鐘催化生成1微摩爾輔酶I(NAD)的酶量。
在非誘導(dǎo)條件下，轉(zhuǎn)化了pPET28_ALT2和pPET28_ALT1質(zhì)粒的大腸桿菌的細(xì)胞裂解液含有明顯的ALT活性(轉(zhuǎn)化pPET28_ALT2的細(xì)菌為121單位/毫克蛋白，轉(zhuǎn)化pPET28_ALT1的細(xì)菌為86單位/毫克蛋白)，而轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pPET28的細(xì)菌僅含有較低的ALT活性(16單位/毫克蛋白)，這可能是由于前二者在細(xì)菌中的“溢出”表達(dá)所致。IPTG誘導(dǎo)后，含pPET28_ALT2細(xì)菌ALT活性升高了2.8倍，含pPET28_ALT1的細(xì)菌ALT活性升高了2倍，而含陰性對照細(xì)菌ALT活性無明顯增加。
如上所述，準(zhǔn)備IPTG誘導(dǎo)前后分別轉(zhuǎn)化了pPET28_ALT2、pPET28_ALT1或pPET28a的細(xì)菌裂解上清液，進(jìn)行SDS_PAGE電泳分析，應(yīng)用10％SDS_PAGE膠，采用考馬斯亮藍(lán)染色及應(yīng)用抗組氨酸抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，IPTG誘導(dǎo)后，可分別見約62kDa及58kDa大小蛋白質(zhì)帶，與ALT2(推算分子量為58kDa)及ALT1(推算分子量為54kDa)相一致。這些結(jié)果證實ALT2 cDNA編碼功能性丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶。
脂肪肝中ALT2的表達(dá)由于ALT2在脂肪組織中表達(dá)很高，我們檢測了肥胖狀態(tài)時脂肪肝的ALT2的表達(dá)水平。肥胖小鼠已被認(rèn)為是非常好的非酒精性脂肪肝的動物模型，非酒精性脂肪肝與肥胖及糖尿病有很強的相關(guān)性(Koteish and Diehl，Animal models of steatosis，Semin.Liver.Dis.，21(1)89-104(2001))。4個月大小的肥胖小鼠(ob/ob)或非肥胖小鼠(ob/+)被處死后，立即取出其肝組織，應(yīng)用上述Trizol方法提取總RNA。每泳道加入15微克總RNA在瓊脂糖膠中進(jìn)行電泳并行RNA印跡分析，應(yīng)用32P-dCTP通過隨機引物標(biāo)記法標(biāo)記鼠ALT1 cDNA探針(對應(yīng)于氨基酸106至294，來源于EST，IMAGE克隆521920，基因庫編號AA106294)，在Amersham Pharmacia生物科技公司的Rapid-hyb緩沖液中于65℃進(jìn)行雜交，用0.5×SSC及1％SDS緩沖液在攝氏65度洗膜兩次，應(yīng)用PhosphorImager進(jìn)行雜交信號定量分析，統(tǒng)計學(xué)處理采用學(xué)生t檢驗。結(jié)果顯示與非肥胖小鼠相比較，肥胖小鼠肝臟ALT2信使核糖核酸表達(dá)高1.9倍(p＜0.05)，而ALT1表達(dá)無改變。因而，脂肪肝時，ALT2特異性升高。
ALT2作為產(chǎn)生ALT2組織的疾病或損傷的標(biāo)志如前所述，目前ALT活性測定不能區(qū)分ALT1與ALT2。由此，其用于檢測肝損害的準(zhǔn)確性受到很大的限制。肝臟含有兩種ALT，在脂肪肝的動武模型中只有ALT2信使核糖核酸表達(dá)升高，而ALT1信使核糖核酸的表達(dá)無改變。分別檢測ALT1及ALT2的不同改變對鑒別由于脂肪肝或其它原因如酒精、藥物、化學(xué)毒物、創(chuàng)傷、感染或其它類型的肝損害將十分有用。
進(jìn)一步而言，脂肪組織之ALT2比ALT1高，檢測ALT2或同時測定ALT2與ALT1將可用于代謝紊亂綜合癥和其它脂肪組織異常的診斷。
最后，建立能區(qū)別血液或組織中ALT1與ALT2的檢測方法可能用于診斷產(chǎn)生或含有ALT2之組織的損傷或疾病。
可用針對ALT的抗體測定血液及體液中ALT蛋白質(zhì)的總量來診斷某一生物(人、哺乳動物或其它)肝臟損傷或疾病(見下文)，ALT活性等于或超過40國際單位/升時提示有肝臟損傷或疾病。另一方面，當(dāng)某一生物的血液或其它體液中總ALT蛋白質(zhì)量超過無肝損傷或肝疾病生物的ALT總量的最高限的1.5到2倍以上時，提示該生物有肝臟損傷或肝臟疾病。
為了確定肝臟損害的原因，應(yīng)該應(yīng)用ALT1及ALT2特異性抗體測定血液或其它體液中ALT2與ALT1蛋白質(zhì)的相對含量(見下文)。ALT2及ALT1的相對量也可用酶學(xué)分析法或已知可區(qū)分ALT1與ALT2活性的其它方法。當(dāng)血液或其它體液中ALT2的量超過ALT1量的1.5倍以上時，其肝臟損害很可能由肝脂肪變所致，當(dāng)血液或其它體液中ALT2的量低于ALT1量的1.5倍時，其肝臟損害常由感染、中毒或創(chuàng)傷所致。
對那些除肝臟以外的產(chǎn)生ALT2的組織的疾病或狀況來說，也可采取相似的策略。當(dāng)某一生物的血液或其它體液中ALT2蛋白質(zhì)量超過無損傷或疾病的生物之ALT2的最高限的1.5到2倍以上時，則可診斷該組織有損傷或疾病。ALT2特異性抗體可用于檢測血液或其它體液中ALT2的量(見下文)。
當(dāng)某一生物血液或其它體液的ALT2蛋白質(zhì)量比ALT1蛋白質(zhì)量高出0.5倍，如同時有高低密度脂蛋白血癥、高甘油三酯、高血壓及超體重時，該生物就很可能患有代謝紊亂綜合癥。
與此相似，應(yīng)用組織作為診斷標(biāo)本時，如組織中ALT2信使核糖核酸水平比ALT1信使核糖核酸水平高出1.5倍，其肝臟損害常常由于脂肪肝所致。同樣，如果脂肪組織中ALT2信使核糖核酸水平為ALT1信使核糖核酸水平3倍以上，支持代謝紊亂綜合癥的診斷，當(dāng)然，對診斷代謝紊亂綜合癥還需要結(jié)合其它指標(biāo)如低密度脂蛋白、甘油三酯、血壓水平及其是否肥胖等。對其它產(chǎn)生ALT2的組織，當(dāng)某一組織ALT2信使核糖核酸水平超過已知無疾病或損傷的組織之ALT2信使核糖核酸水平的1.5至2倍以上時，則可診斷該生物存在該產(chǎn)生ALT2組織的疾病或損傷。
有關(guān)ALT1和/或ALT2的檢測可以是檢測某一組織中ALT1和/或ALT2的信使核糖核酸水平，也可以是組織和體液中ALT1和/或ALT2蛋白質(zhì)的量，這些體液包括血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、腦脊液、腸液、關(guān)節(jié)液、齒齦液、陰道液和胸腔液等。采用檢測體液中的ALT蛋白質(zhì)或其片斷的方法優(yōu)于采用檢測組織中ALT蛋白質(zhì)或其片斷或信使核糖核酸的方法。
信使核糖核酸分析ALT1和/或ALT2信使核糖核酸的方法需要從組織和/或體液標(biāo)本中分離信使核糖核酸，一些液態(tài)的生物標(biāo)本如血漿、血清、組織切片或提取液、淋巴細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液可不需要純化而直接用于該檢測，也可先純化、或部分純化后進(jìn)行分析。純化步驟包括分離、提取、破壞細(xì)胞或勻漿組織或體液。純化時也可加入一些與探針不起反應(yīng)的載體核酸以減少非特異性的核酸結(jié)合。
其次，標(biāo)本可用去污劑或蛋白酶處理以利所檢測的核酸的釋放和穩(wěn)定，加入部分蛋白酶是較理想的方法，因為該處理可使核酸更穩(wěn)定的可容狀態(tài)。在一系列蛋白酶中，可用于本方法的有蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶、鹼性蛋白酶、溶菌酶和枯草桿菌蛋白酶。分離和純化信使核糖核酸時另一種很有用的酶是DNA酶。常采用加熱法使信使核糖核酸變性以破壞其形成的二級結(jié)構(gòu)。
破壞信使核糖核酸的二級結(jié)構(gòu)后，在適合探針結(jié)合到特異性目的信使核糖核酸的條件下應(yīng)用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交反應(yīng)和探針合成的常規(guī)方法可參見冷泉港實驗室T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook于1982年編著的“分子克隆”一書。雜交反應(yīng)可在不同的酸鹼度、鹽濃度和不同的溫度條件下進(jìn)行。pH可在6到9范圍，較適pH范圍為6.8到8.5；鹽濃度可從0.15M鈉鹽到0.9M鈉鹽不等。也可使用與以上鈉鹽離子強度相當(dāng)?shù)钠渌栯x子。雜交溫度可從攝氏30度到攝氏80度不等，較好的溫度范圍為攝氏45度到攝氏70度。也可加入一些其它化合物以促進(jìn)在較低的溫度如接近室溫下進(jìn)行特異性雜交，在這些添加的化合物中，甲酰胺可降低溫度的需求。
檢測ALT2信使核糖核酸的探針實例之一是能與ALT2信使核糖核酸互補并特異性結(jié)合的聚核苷酸，聚核苷酸的長度可從10鹼基到4,000個鹼基以上，較好長度為20到3,500個鹼基。用于ALT2信使核糖核酸印跡雜交的一個較好的探針為對應(yīng)于基因庫中編號AY029173之615到3,957鹼基對的約3300鹼基的聚核苷酸。
檢測ALT1信使核糖核酸的探針實例之一是能與ALT1信使核糖核酸互補并特異性結(jié)合的聚核苷酸，其長度可從10鹼基到4,000個鹼基以上，較好者長度為20到3,500個鹼基。
檢測核糖核酸的常用方法為RNA印跡雜交、RNA酶保護(hù)反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，所有這些方法已為人們熟知。
值得指出的另一點是聚核苷酸探針的標(biāo)記是用一些可與核酸探針共價結(jié)合或緊密相連的以致可進(jìn)行檢測和定量分析探針的物質(zhì)，這些物質(zhì)中包括放射性同位素如3H、125I、131I、32P、33P、14C和35S；化學(xué)發(fā)光分子如丫啶類物質(zhì)或發(fā)光胺、熒光物質(zhì)如螢光素、藻色蛋白、稀土元素螯合劑、若丹明等；酶底物和抑制劑如辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶、6磷酸果糖脫氫酶、β半乳糖苷酶、丙酮酸激酶、鹼性磷酸酶、乙先膽鹼酯酶等；金屬顆?；蚱渌椛洳淮┩阜肿尤缒z體金、磁性粒子；含有以上任何一種物質(zhì)的脂質(zhì)體；抗原如蛋白質(zhì)、碳水化合物或半抗原分子及其與這些抗原特異性結(jié)合的抗體；和作為成對結(jié)合單位的糖脂或糖蛋白。
雜交后，將結(jié)合到ALT2的信使核糖核酸，標(biāo)記探針與未結(jié)合的探針分離，檢測結(jié)合的雜交探針的量，從而得知樣本中ALT信使核糖核酸的含量。非雜交的探針與雜交的探針的分離可用凝膠分子篩或親和層析方法。與ALT2相似，雜交后，將ALT1信使核糖核酸結(jié)合的標(biāo)記探針與非雜交上的標(biāo)記探針分離后，檢測雜交后標(biāo)記抗體的量，從而測定樣本中ALT1信使核糖核酸的量。同樣，凝膠分子篩或親和層析方法可用于非雜交的探針與雜交的探針的分離。凝膠分子篩層析法常作為該分離的優(yōu)選的方法，分離的基本條件在分離過程中目的基因核酸與探針保持于相互結(jié)合。分離的試劑中可含有核酸酶抑制劑和添加與探針無反應(yīng)的載體核酸。
在分離雜交與未雜交的標(biāo)記探針的方法中，較好者為采用以聚丙烯酰氨、葡聚糖、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖及其類似材料為基質(zhì)的凝膠分子篩層析法。適宜于該方法的產(chǎn)品有Pharmacia公司的Sephadex系列G50、G100和G200及Sepharose系列CL2B，4B，6B，S-200，S-400和S-1000。其它適用產(chǎn)品有BioRad公司的P-20，P-60，P-100，P-200，A-0.5m和A-1.5m等。
將雜交上的探針與未雜交的探針分離后，需要檢測雜交探針的存在或?qū)ζ溥M(jìn)行定量，該測定方法取決于探針的標(biāo)記種類，用放射性同位素標(biāo)記時，可用γ計數(shù)器或液體閃爍計數(shù)器或其它檢測方法如放射性自顯影或其它顯像技術(shù)。當(dāng)探針用分別用抗體或其中部分片段或抗原、受體或配基、酶或酶底物、或與某一物質(zhì)相結(jié)合的另一物質(zhì)來標(biāo)記時，則可分別用抗體或其中部分片段或抗原、受體或配基、酶或酶底物、或與某一物質(zhì)相結(jié)合的另一物質(zhì)來進(jìn)行檢測和定量。進(jìn)一步，結(jié)合于與探針相連分子的物質(zhì)本身可含有可檢測的標(biāo)志如某種酶或同位素。如果用某種酶或酶抑制劑標(biāo)記探針，可用測定是否存在該酶活性來檢測探針的存在與否，較好者為那些可產(chǎn)生用分光光度計可測定的光能量變化的酶反應(yīng)。其它標(biāo)記包括輻射透不過的物質(zhì)應(yīng)用電磁輻射測定、磁粒子用磁場檢測、用于檢測抗體與特異性抗原的免疫學(xué)方法、熒光及化學(xué)發(fā)光標(biāo)記法和其它任何檢測特異性成對結(jié)合物質(zhì)如糖脂或糖蛋白等。
為了精確測定未知樣本中ALT2或ALT1信使核糖核酸的量，可同時應(yīng)用含已知量的目的核酸序列的樣本作為陽性或陰性對照來標(biāo)準(zhǔn)化檢測結(jié)果。
通過比較未知樣本與已知量的正常健康組織中信使核糖核酸的量，通常在相同的組織之間比較如肝組織與肝組織、脂肪組織與脂肪組織比較。如果所測得的未知樣本中的信使核糖核酸量在某一預(yù)先設(shè)定的范圍，可判斷該個體患有特定的疾病、損傷或一些可影響樣本組織的其它情況。
制備ALT1及ALT2特異性抗體應(yīng)用上述pPET28-ALT1和pPET28-ALT2質(zhì)粒及IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)菌產(chǎn)生ALT1及ALT2蛋白質(zhì)，如上所述，制備細(xì)菌裂解物及其無細(xì)胞上清液，將此上清液通過用含有足以使蛋白質(zhì)變性的尿素的緩沖液平衡好的鎳親和層析柱，搜集流出的各組分，通過凝膠電泳，應(yīng)用抗組氨酸標(biāo)記肽的抗體證實純化的蛋白質(zhì)。
含純化的蛋白質(zhì)的洗出組分在適當(dāng)緩沖液中透析后，將純化蛋白質(zhì)注入兔體內(nèi)以誘導(dǎo)產(chǎn)生多克隆抗體，注射純化蛋白質(zhì)前及注射后30天取血樣儲存于攝氏負(fù)20度。應(yīng)用純化的蛋白質(zhì)通過ELISA或蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測血樣中是否存在多克隆抗體，并檢測ALT1多克隆抗體是否與ALT2蛋白質(zhì)有交叉反應(yīng)，以及ALT2多克隆抗體是否與ALT1蛋白質(zhì)有交叉反應(yīng)。選擇那些含有僅對一種ALT特異性結(jié)合的多克隆抗體的動物，分離其脾臟細(xì)胞。將該脾臟細(xì)胞懸浮液與HGPRT陰性骨髓瘤細(xì)胞混合，加入35％甘油，將細(xì)胞于含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)液中生長10到14天后，將存活的雜交瘤細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。
另一種生產(chǎn)ALT1或ALT2特異性抗體的方法是將編碼ALT2的cDNA(序列編號1)連接到pGEX-4T-1表達(dá)質(zhì)粒中，從而ALT2與GST(谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)相融合。應(yīng)用0.8mM IPTG誘導(dǎo)BL21(DE3)大腸桿菌產(chǎn)生重組融合蛋白，收集細(xì)胞后，用B-Per試劑裂解細(xì)胞，在攝氏4度時，將裂解液與谷光甘肽瓊脂糖載體混合，2小時后于3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，用磷酸緩沖液將其洗兩次后，用含10mM還原型谷光甘肽的50mM Tris鹽酸緩沖液洗出蛋白質(zhì)。
得到的純化ALT2-GST可用Amersham Pharmacia生物科技公司ECL蛋白質(zhì)生物素化試劑盒將其與生物素連接。簡而言之，將1mg蛋白質(zhì)溶解在1ml pH 8.6的碳酸氫鹽緩沖液中，與每毫克蛋白30μl生物素反應(yīng)試劑孵育30分鐘后，應(yīng)用Sephadex G25層析柱純化，用5ml磷酸緩沖液(pH 7.4)將蛋白質(zhì)洗出，搜集含ALT2-GST的組分。
生物素化后的ALT2-GST蛋白譜可用12％SDS-PAGE和銀染色進(jìn)行分析。用1∶1000稀釋的抗GST抗體及含1∶12,000稀釋的HRP標(biāo)記抗羊IgG檢測ALT2-GST蛋白。ALT2-GST蛋白可被1∶6,000稀釋在PBST的鏈球菌抗生物素蛋白偶聯(lián)的辣根過氧化酶檢測到，該免疫檢測應(yīng)用ECL蛋白質(zhì)免疫印跡檢測試劑盒(Amersham Pharmacia生物科技公司)。
將純化的ALT2-GST注射到豚鼠、兔、大鼠、小鼠或其它合適的動物，從而產(chǎn)生ALT2抗體。經(jīng)過多次注射后，分離動物的脾臟，如前述方法制備脾臟細(xì)胞及雜交瘤細(xì)胞。
然后，檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中抗ALT2抗體。將生物素化的ALT2-GST加入鏈球菌抗生物素蛋白包被的96孔板中，然后加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，通過洗板去除未結(jié)合的抗體及生物素標(biāo)記的ALT2-GST后，加入針對第一抗體的辣根過氧化酶標(biāo)記的特異性第二抗體，然后，洗去未結(jié)合的抗體，加入辣根過氧化酶的底物試劑，在攝氏25度下反應(yīng)15分鐘，加入0.5mM硫酸終止反應(yīng)，測定其在波長為450納米的吸光度，從而知道哪些孔含有ALT2抗體。然后將該抗ALT2的抗體用于檢測含有純化ALT2的SDS-PAGE膠以再次證實該抗體結(jié)合ALT2，最后將抗ALT2的抗體加入含有純化ALT1的SDS-PAGE膠以篩選只特異性結(jié)合ALT2的抗體。
除采用ALT1代替ALT2外，采用相同的策略產(chǎn)生抗ALT1特異性抗體。
如果需要，將用目前熟知的方法制備針對多克隆抗體的單克隆抗體。
合成的ALT2片段或ALT1片段也可作為免疫原用于制備抗體。
值得指出的是ALT2核酸序列也可用于構(gòu)建重組細(xì)胞株、重組微生物、表達(dá)載體等類似重組體，這些重組體可用于表達(dá)ALT2蛋白。另一方面，這些重組體可用于篩選抑制或增加ALT2活性的試劑。
當(dāng)用ALT2的編碼序列構(gòu)建表達(dá)載體或其它載體時，ALT2的編碼序列將被插入載體之編碼序列后，并在可被誘導(dǎo)、阻滯，或組織特異性表達(dá)的啟動子的控制下。此外，也可能含有一些其它組分如適用于不同分子生物學(xué)技術(shù)的載體中的調(diào)節(jié)序列。
在另一具體方法中，提供含有編碼ALT2蛋白質(zhì)的DNA的載體，優(yōu)先考慮將序列編號2中的DNA分子插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，從而用其來轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。例行的表達(dá)載體包括能夠引導(dǎo)插入宿主細(xì)胞中的核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子，表達(dá)載體的代表包括質(zhì)粒和/或病毒載體序列。適當(dāng)?shù)妮d體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，牛痘病毒載體、CMV病毒載體、BLUESCRIPT載體、桿狀病毒載體等。另一方面能夠引導(dǎo)克隆的基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的啟動子可以是能被誘導(dǎo)和阻滯的啟動子，包括病毒或細(xì)胞的啟動子。
在某些具體方法中，趨于采用可選擇性標(biāo)志來篩選含有克隆基因的細(xì)胞，選擇性標(biāo)志通常與要克隆的目的基因DNA分子同時引入細(xì)胞，通常包括編碼對氨卞青霉素、新酶素、潮酶素和氨甲喋呤等藥物產(chǎn)生抵抗性的蛋白的基因。其它一些選擇性標(biāo)記可提供可檢測的信號，如β半乳糖苷酶可用于鑒定含有插入目的基因DNA分子的細(xì)胞。
抗體分析有關(guān)ALT1的抗體分析法包括將分裝的樣本(體液或組織)與ALT1特異性抗體結(jié)合，然后用目前熟知的相關(guān)技術(shù)測定與抗體結(jié)合的ALT1的量，通過與已知的健康生物標(biāo)準(zhǔn)樣本相比較，如果測定的ALT1的量在一特定的范圍，則可診斷該生物患有某一疾病、損傷或某一特定狀況。
有關(guān)ALT2的抗體分析法包括將分裝的樣本(體液或組織)與ALT2特異性抗體混合，然后用已知的相關(guān)技術(shù)測定與抗體結(jié)合的ALT2的量，通過與已知的健康生物標(biāo)準(zhǔn)樣本相比較，如果測定的ALT2的量在一特定的范圍，則可診斷該生物患有某一疾病、損傷或某一特定狀況。由于ALT2主要在肝臟、肌肉、腎臟、腦及脂肪組織表達(dá)，其檢測可用于診斷肝臟損傷、肝臟疾病或有肝臟、肌肉、腎臟、腦及脂肪組織相關(guān)的疾病或特定狀況。
以測定血液樣本為例，從生物個體(人、哺乳動物或其它動物)取出血液后，于攝氏4度離心20分鐘以分離血清，將血清儲存于攝氏負(fù)20度直至進(jìn)行檢測。
將上述血漿與ALT1或ALT2特異性抗體于室溫下孵育1.5小時或于攝氏4度下孵育過夜，然后于攝氏4度離心20分鐘，將所得沉淀懸浮于緩沖液中，在10％的SDS-PAGE膠中電泳后，將膠在含有種系特異性的ALT1和ALT2抗體的緩沖液中孵育并檢測。應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡分析的優(yōu)點是其利用ALT1與ALT2的分子量不同來區(qū)分二者，以得到特異性的檢測。
本發(fā)明中的抗體或其片段非常適用于不同的免疫分析，可用于快速免疫分析、蛋白質(zhì)免疫印跡分析、放射免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附分析、免疫熒光顯微鏡、免疫電鏡或其它類型的免疫分析。該抗體或其片段可用于液相或結(jié)合于固相載體。
抗體或其片段可被任何標(biāo)記物及采用任何標(biāo)記方法進(jìn)行標(biāo)記?？捎糜诒景l(fā)明的標(biāo)記物包括但不限于酶標(biāo)記物、放射性同位素標(biāo)記物、非放射性同位素標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物及化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物等。
適用的標(biāo)記酶包括，但不限于馬來酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、過氧化物酶、鹼性磷酸酶、天冬酰氨酶、葡萄糖氧化酶、β半乳糖甘酶、核糖核酸酶、尿激酶、過氧化氫酶、6磷酸葡萄糖脫氫酶、淀粉酶和乙先膽鹼酯酶等。
適合的放射性同位素標(biāo)記物包括，但不限于3H、111In、125I、32P、33P、35S、14C、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、21Ci、211At、212Pb、47Sc和109Pd。
適合的非放射性同位素標(biāo)記物包括，但不限于157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和46Fe。
適合的熒光標(biāo)記物包括，但不限于152Eu標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、異硫氰酸標(biāo)記物、鹼性蕊香紅標(biāo)記物、藻紅蛋白標(biāo)記物、異藻青蛋白標(biāo)記物和熒光氨標(biāo)記物等。
適合的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物包括，但不限于芳香丫啶酯標(biāo)記物、咪唑標(biāo)記物、丫啶鹽標(biāo)記物、草酸酯標(biāo)記物、蟲熒光素標(biāo)記物及蟲熒光素酶標(biāo)記物等。
本發(fā)明亦可能采用適用于本發(fā)明的其它的相關(guān)的新標(biāo)記物，可用文獻(xiàn)中常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)方法將這些標(biāo)記物與抗體或其片段相連接。典型的方法可參見有關(guān)蛋白與蛋白質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)及偶聯(lián)蛋白的應(yīng)用及酶免疫分析文獻(xiàn)(Kennedy，J.H.，et al.，Protein-protein coupling reactions and theapplications of protein conjugates，Clin.Chim Acta，701-31(1976)；Schuurs and Van Weemen，Enzyme-immunoassay，Clin.Chim Acta，811-40(1977))。在后者提到的偶聯(lián)方法如戊二醛法、過碘酸鹽法、二馬來酸氨法等其它方法均可能用作本申請的參考。
本發(fā)明中抗體或其片段的檢測可通過應(yīng)用載體而得以改進(jìn)，熟知的載體有玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、自然或合成纖維素、聚丙烯酰氨、瓊脂糖和磁鐵。本發(fā)明中的載體屬性可為可溶性，也可為不溶性物質(zhì)，這些支持材料可有任何可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，只要其能與ALT2或ALT1相結(jié)合，因而，支持材料可以是像連珠樣的球形、像試管內(nèi)面或木竿外表面一樣的圓柱形，也可能其表面平展如紙張和試劑條。相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中被確認(rèn)可用于常規(guī)實驗的其它適合于結(jié)合單克隆抗體的新載體也可能用于該發(fā)明中。
ALT2或ALT1抗體或其片段可能用于ALT2或ALT1的定性或定量分析，該類分析可通過應(yīng)用任何目前在相關(guān)領(lǐng)域采用的免疫分析法來完成，這些方法包括放射免疫分析、免疫測定法、免疫PCR法和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測等。采用已知的標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)技術(shù)，可將ALT2或ALT1特異性抗體包被于如微滴定板或膜(如硝酸纖維膜)的載體物質(zhì)(固相載體)表面，將其與體液標(biāo)本如可疑有產(chǎn)生ALT2的組織的損傷或疾病的動物血清相接觸，通過任何已知的測定方法如熒光抗體光譜測定或比色法等檢測血中ALT2與ALT2抗體形成的復(fù)合物。也可用1978年紐約NorthHolland出版社出版、由Work等編著的“分子生物學(xué)中實驗室技術(shù)和生物化學(xué)”一書中描述的放射免疫分析及Wide發(fā)表在1970年由愛丁堡Kirkham和Hunter編輯的“放射免疫分析方法學(xué)”第199到206頁。
ALT1和ALT2抗體也將用于對肝臟疾病或狀況的進(jìn)展追蹤，即在病程不同時間進(jìn)行ALT1或ALT2測定，通過比較不同時間之ALT水平來量化該疾病或狀況的好轉(zhuǎn)或加重的程度。
試劑盒(Kits)上述方法可能用于本發(fā)明中應(yīng)用上述ALT1和/或ALT2特異性抗體檢測生物標(biāo)本中ALT1和/或ALT2的試劑盒。該檢測ALT1和/或ALT2的試劑盒可能包括上述分別特異性結(jié)合ALT1或ALT2的單克隆或多克隆抗體或其片段(這些抗體可能偶聯(lián)于熒光素、磷光體、酶、放射性標(biāo)記物等)、適當(dāng)?shù)拿嘎?lián)抗體的底物如過氧化物酶的底物過氧化氫、封閉試劑如正常羊或兔血清或溶于生理鹽水中的3％牛血清白蛋白等和其它試劑諸如如Tris鹽酸緩沖液、磷酸緩沖液、EDTA等或兩種或以上的混合緩沖液等。試劑盒可能包括有一個或多個試劑容器。趨向于將ALT1特異性抗體放于一個試劑瓶，而ALT2特異性抗體放于另一試劑瓶，但并非一定需要如此。其它試劑容器可包括用于檢測與抗體結(jié)合的ALT1或ALT2的必需試劑。應(yīng)用該試劑盒時，需將含有ALT1和/或ALT2的樣本加入含有抗體的容器使其與ALT1特異性抗體或ALT2特異性抗體接觸適當(dāng)時間后，洗滌并加入特異性針對ALT1或ALT2的標(biāo)記抗體，再次洗滌以除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體，檢測結(jié)合的標(biāo)記抗體而完成檢測。該試劑盒中可能包括如何判定樣本中ALT1和/或ALT2的量以及該測定的量所提示的相關(guān)診斷的指引。該試劑盒也可能包括有陰性和陽性對照品。
此處提供的樣本僅作說明之用，并不意味限制本發(fā)明的范圍。有關(guān)本申請的方法學(xué)的詳細(xì)描述中提及的參考文獻(xiàn)方法，在實際應(yīng)用時將有可能在不改變其基本精神前提下作不同的變化或修飾。
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<302>新型丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶cDNA克隆、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和功能性表達(dá)<303>Genomics<304>79<305>3<306>445-450<307>2002<308>GenBank/AY029173<309>2001-04-16<400>1ggcggtgctc aaggtgcggc ccgagcgcag ccggcgcgag cgcatcctca cgctggagtc 60catgaacccg caggtgaagg cggtggagta cgccgtgcgg ggacccatcg tgctcaaggc120cggcgagatc gagctcgagc tgcagcgggg tatcaaaaag ccattcacag aggtcatccg180agccaacatc ggggacgccc aggctatggg gcagcagcca atcaccttcc tccggcaggt240gatggcacta tgcacctacc caaacctgct ggacagcccc agcttcccag aagatgctaa300gaaacgtgcc cggcggatcc tgcaggcttg tggcgggaac agcctggggt cctacagtgc360tagccagggt gtcaactgca tccgtgaaga tgtggctgcc tacatcacca ggagggatgg420cggtgtgcct gcggaccccg acaacatcta cctgaccacg ggagctagtg acggcatttc480tacgatcctg aagatcctcg tctccggggg cggcaagtca cggacaggtg tgatgatccc540catcccacaa tatcccctct attcagctgt catctctgag ctcgacgcca tccaggtgaa600ttactacctg gacgaggaga actgctgggc gctgaatgtg aatgagctcc ggcgggcggt660gcaggaggcc aaagaccact gtgatcctaa ggtgctctgc ataatcaacc ctgggaaccc720
cacaggccag gtacaaagca gaaagtgcat agaagatgtg atccactttg cctgggaaga 780gaagctcttt ctcctggctg atgaggtgta ccaggacaac gtgtactctc cagattgcag 840attccactcc ttcaagaagg tgctgtacga gatggggccc gagtactcca gcaacgtgga 900gctcgcctcc ttccactcca cctccaaggg ctacatgggc gagtgtggtt acagaggagg 960ctacatggag gtgatcaacc tgcaccctga gatcaagggc cagctggtga agctgctgtc1020ggtgcgcctg tgccccccag tgtctgggca ggccgccatg gacattgtcg tgaacccccc1080ggtggcagga gaggagtcct ttgagcaatt cagccgagag aaggagtcgg tcctgggtaa1140tctggccaaa aaagcaaagc tgacggaaga cctgtttaac caagtcccag gaattcactg1200caaccccttg cagggggcca tgtacgcctt ccctcggatc ttcattcctg ccaaagctgt1260ggaggctgct caggcccatc aaatggctcc agacatgttc tactgcatga agctcctgga1320ggagactggc atctgtgtcg tgcccggcag tggctttggg cagagggaag gcacttacca1380cttcaggatg actatcctcc ctccagtgga gaagctgaaa acggtgctgc agaaggtgaa1440agacttccac atcaacttcc tggagaagta cgcgtgagga cgcctgagcc ccagcgggag1500acctgtcctt ggctcttcct cccaatgccc gtcaggctga actcgcctcc cccgtgactc1560tgcctcgggc ctcgcagagg ccgctggtca cttcgtcatc attttgcccc tggagacgtc1620tttctttgtg ccttgatgtt gagagcgcct ctcttttgag caaacaagca ttctatatgc1680aaccagagta gaggggacct gctcagcagg tgtgaccagg gttctctgaa tctgttattg1740tttttgcttc tggaaagttc atttggggtt tacaacaact aggatgtgtt gggtgagatg1800tttcagatct ggagaaatga gcaggtgtcg ggaaatgtgt gacttaaccg tggtgagggc1860tggaaatcca aactcaccac catgatctgt gaaataaagc ccttagcggt gtgaagcatc1920cggtcctttg aacagaaggg cctggaaggc ccctggggct gagaaagggt ccgcccggtg1980gcctggaggc aggcgccggg agcgcagtag cacgtggact gggcaggatg ttgcactagc2040ttggggtaga tgctgggggc tgcggccacg gtcagagggc cccactgtga ggcgtgggtg2100tgagccaggc tgcaggagga actgggcctc cgcttcccag caacgcagcc aggcctgaga2160attctgtgcg cccggcgggc tttgggaatg aggggttccc ttgaacatgc gtaggctgga2220accccgtctg agaggtctcc ctgaatttca gtgacacata gtgcagcccg gcagtgtccc2280acttccgtgg agagagccgc tggaatggtg tggacccatc ccgcgggtga ccggtgcctg2340ttctcccctg accgagcctg tgagcacatc gccccctgct ggcgacagcg gggaaatgag2400ggctgaaaat atcctcccca caagggcaat ccccgggacc tgccgagcag ccaaggccct2460gtcctttctt gaatggtggc gagctgaatc tggtcggttt cctagctttt aggtggtaaa2520
agtgcctggc agcttggctg ccgtggagga gtcagtcgtg gttggaggtt cattgccgtg2580ctttcatgca gagtgttttg ccttcatgtt agcttccggc tcccctccca ggctgcagac2640tctgacctgt ggcatcaggc ttctcccagt acaggagggt gccatccccc agcatgcggc2700ttctctgcca ttagcagccc tgggcgggcc gaccacactc gaggctgcgg tgctacgggc2760ttagccctcg cctccctcac tgggagcttc cccatcctcc ctgccttccc cagtgggaag2820ttagggaagc tcaggagcct gggaccccgc atgtcccaaa atgggattgg agaagctgga2880gagaaagcag aagaggccga ggagtgaggc agcagcctct atgcttgatt tccacaccgg2940gtccgtgcag aggaaacaga aactcccaac tgtccttacc caccgacatc acagccccta3000tgaagaaagt agccacaatc tcaaataaca aaagggaatg ttctaaaact ttttcttcct3060taaaaaatgg agaaaattgc acttgtgctt gctgtgtggt atataaacca ggattagtcc3120cagggtcgtg aggtttctgg tgaaaaggtt aaatcgtaga agctagtata ttttttatat3180ttttgtaaca attgcttttt tcatggggga ggcggggtta gtatttatag tcctaacaag3240tccagtaatt ttttataaat cttcagatta taaacagccc ctaaaaactt tacaacgttt3300acacagtttt ttaaaaagag actgtataca cttgatttgc tttcaaaata aataaggtca3360gctagtctag gaggttaacg tcgggtagga atgctgatca tgataggttt ggttttctac3420agattctgtt ccggtgcctt tcctatccag gcaccacctg agaaagttgt catttgaggt3480cgcacttgga agttacatct gtgaagtttc tgtcattcgt ccagatctgt gtgtgtagca3540tgtgctgagg aagcacgtgc tgggctgtgc ctcagacagt gcatcaccgg gcacccagag3600gcttgcctgg ctattcctgt tctggtgtgt gtggagtgtt ggggaggaac agatgcagat3660caacctgtgg ctgttttccc gtctaggttc tcacaggtat ctcctgacag aggtacttaa3720caatggctct gctggaaatt tctataaata aaatgtccaa aatggaaa 3768<210>2<211>523<212>PRT<213>人類<300>
<301>Yang，R.Z.，Blaileanu，G.，Hansen，B.C.，Shuldiner，A.R.and Gong，D.W.
<302>新型丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶cDNA克隆、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和功能性表達(dá)<303>Genomics<304>79<305>3<306>445-450<307>2002<308>GenBank/AY029173<309>2001-04-16
<400>2Met Gln Arg Ala Ala Ala Leu Val Arg Arg Gly Cys Gly Pro Arg Thr1 5 10 15Pro Ser Ser Trp Gly Arg Ser Gln Ser Ser Ala Ala Ala Glu Ala Ser20 25 30Ala Val Leu Lys Val Arg Pro Glu Arg Ser Arg Arg Glu Arg Ile Leu35 40 45Thr Leu Glu Ser Met Asn Pro Gln Val Lys Ala Val Glu Tyr Ala Val50 55 60Arg Gly Pro Ile Val Leu Lys Ala Gly Glu Ile Glu Leu Glu Leu Gln65 70 75 80Arg Gly Ile Lys Lys Pro Phe Thr Glu Val Ile Arg Ala Asn Ile Gly85 90 95Asp Ala Gln Ala Met Gly Gln Gln Pro Ile Thr Phe Leu Arg Gln Val100 105 110Met Ala Leu Cys Thr Tyr Pro Asn Leu Leu Asp Ser Pro Ser Phe Pro115 120 125Glu Asp Ala Lys Lys Arg Ala Arg Arg Ile Leu Gln Ala Cys Gly Gly130 135 140Asn Ser Leu Gly Ser Tyr Ser Ala Ser Gln Gly Val Asn Cys Ile Arg145 150 155 160Glu Asp Val Ala Ala Tyr Ile Thr Arg Arg Asp Gly Gly Val Pro Ala165 170 175Asp Pro Asp Asn Ile Tyr Leu Thr Thr Gly Ala Ser Asp Gly Ile Ser180 185 190Thr Ile Leu Lys Ile Leu Val Ser Gly Gly Gly Lys Ser Arg Thr Gly195 200 205Val Met Ile Pro Ile Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Val Ile Ser210 215 220Glu Leu Asp Ala Ile Gln Val Asn Tyr Tyr Leu Asp Glu Glu Asn Cys
225 230 235 240Trp Ala Leu Asn Val Asn Glu Leu Arg Arg Ala Val Gln Glu Ala Lys245 250 255Asp His Cys Asp Pro Lys Val Leu Cys Ile Ile Asn Pro Gly Asn Pro260 265 270Thr Gly Gln Val Gln Ser Arg Lys Cys Ile Glu Asp Val Ile His Phe275 280 285Ala Trp Glu Glu Lys Leu Phe Leu Leu Ala Asp Glu Val Tyr Gln Asp290 295 300Asn Val Tyr Ser Pro Asp Cys Arg Phe His Ser Phe Lys Lys Val Leu305 310 315 320Tyr Glu Met Gly Pro Glu Tyr Ser Ser Asn Val Glu Leu Ala Ser Phe325 330 335His Ser Thr Ser Lys Gly Tyr Met Gly Glu Cys Gly Tyr Arg Gly Gly340 345 350Tyr Met Glu Val Ile Asn Leu His Pro Glu Ile Lys Gly Gln Leu Val355 360 365Lys Leu Leu Ser Val Arg Leu Cys Pro Pro Val Ser Gly Gln Ala Ala370 375 380Met Asp Ile Val Val Asn Pro Pro Val Ala Gly Glu Glu Ser Phe Glu385 390 395 400Gln Phe Ser Arg Glu Lys Glu Ser Val Leu Gly Asn Leu Ala Lys Lys405 410 415Ala Lys Leu Thr Glu Asp Leu Phe Asn Gln Val Pro Gly Ile His Cys420 425 430Asn Pro Leu Gln Gly Ala Met Tyr Ala Phe Pro Arg Ile Phe Ile Pro435 440 445Ala Lys Ala Val Glu Ala Ala Gln Ala His Gln Met Ala Pro Asp Met450 455 460Phe Tyr Cys Met Lys Leu Leu Glu Glu Thr Gly Ile Cys Val Val Pro
465 470 475 480Gly Ser Gly Phe Gly Gln Arg Glu Gly Thr Tyr His Phe Arg Met Thr485 490 495Ile Leu Pro Pro Val Glu Lys Leu Lys Thr Val Leu Gln Lys Val Lys500 505 510Asp Phe His Ile Asn Phe Leu Glu Lys Tyr Ala515 520<210>3<211>496<212>PRT<213>人類<300>
<301>Sohocki，M.M.，Sullivan，L.S.，Harrison，W.R.，Sodergren，E.J.，Elder，F(xiàn).F.，Weinstock，G.，Tanase，S.and Daiger，S.P.
<302>人谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)定位于染色體8q24.3、cDNA及其基因序列和多態(tài)性位點<303>Genomics<304>40<305>2<306>247-252<307>1997<308>GenBank/NM_005309<309>2000-11-01<400>3Met Ala Ser Ser Thr Gly Asp Arg Ser Gln Ala Val Arg His Gly Leu1 5 10 15Arg Ala Lys Val Leu Thr Leu Asp Gly Met Asn Pro Arg Val Arg Arg20 25 30Val Glu Tyr Ala Val Arg Gly Pro Ile Val Gln Arg Ala Leu Glu Leu35 40 45Glu Gln Glu Leu Arg Gln Gly Val Lys Lys Pro Phe Thr Glu Val Ile50 55 60Arg Ala Asn Ile Gly Asp Ala Gln Ala Met Gly Gln Arg Pro Ile Thr65 70 75 80Phe Leu Arg Gin Val Leu Ala Leu Cys Val Asn Pro Asp Leu Leu Ser85 90 95Ser Pro Asn Phe Pro Asp Asp Ala Lys Lys Arg Ala Glu Arg Ile Leu
100 105 110Gln Ala Cys Gly Gly His Ser Leu Gly Ala Tyr Ser Val Ser Ser Gly115 120 125Ile Gln Leu Ile Arg Glu Asp Val Ala Arg Tyr Ile Glu Arg Arg Asp130 135 140Gly Gly Ile Pro Ala Asp Pro Asn Asn Val Phe Leu Ser Thr Gly Ala145 150 155 160Ser Asp Ala Ile Val Thr Val Leu Lys Leu Leu Val Ala Gly Glu Gly165 170 175His Thr Arg Thr Gly Val Leu Ile Pro Ile Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr180 185 190Ser Ala Thr Leu Ala Glu Leu Gly Ala Val Gln Val Asp Tyr Tyr Leu195 200 205Asp Glu Glu Arg Ala Trp Ala Leu Asp Val Ala Glu Leu Ala Arg Ala210 215 220Leu Gly Gln Ala Arg Asp His Cys Arg Pro Arg Ala Leu Cys Val Ile225 230 235 240Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly Gln Val Gln Thr Arg Glu Cys Ile Glu245 250 255Ala Val Ile Arg Phe Ala Phe Glu Glu Arg Leu Phe Leu Leu Ala Asp260 265 270Glu Val Tyr Gln Asp Asn Val Tyr Ala Ala Gly Ser Gln Phe His Ser275 280 285Phe Lys Lys Val Leu Met Glu Met Gly Pro Pro Tyr Ala Gly Gln Gln290 295 300Glu Leu Ala Ser Phe His Ser Thr Ser Lys Gly Tyr Met Gly Glu Cys305 310 315 320Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Val Glu Val Val Asn Met Asp Ala Ala Val325 330 335Gln Gln Gln Met Leu Lys Leu Met Ser Val Arg Leu Cys Pro Pro Val
340 345 350Pro Gly Gln Ala Leu Leu Asp Leu Val Val Ser Pro Pro Ala Pro Thr355 360 365Asp Pro Ser Phe Ala Gln Phe Gln Ala Glu Lys Gln Ala Val Leu Ala370 375 380Glu Leu Ala Ala Lys Ala Lys Leu Thr Glu Gln Val Phe Asn Glu Ala385 390 395 400Pro Gly Ile Ser Cys Asn Pro Val Gln Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro405 410 415Arg Val Gln Leu Pro Pro Arg Ala Val Glu Arg Ala Gln Glu Leu Gly420 425 430Leu Ala Pro Asp Met Phe Phe Cys Leu Arg Leu Leu Glu Glu Thr Gly435 440 445Ile Cys Val Val Pro Gly Ser Gly Phe Gly Gln Arg Glu Gly Thr Tyr450 455 460His Phe Arg Met Thr Ile Leu Pro Pro Leu Glu Lys Leu Arg Leu Leu465 470 475 480Leu Glu Lys Leu Ser Arg Phe His Ala Lys Phe Thr Leu Glu Tyr Ser485 490 495<210>4<211>27<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(27)<223>引物P922來源于載體TripEX<400>4aatacgactc actatagggc gaattgg 27<210>5<211>26<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(26)<223>引物P923來源于載體TripEX<400>5ctcgggaagc gcgccattgt gttggt26<210>6<211>18<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(18)<223>引物P927來源于載體TripEX<400>6gttggtaccc gggaattc 18<210>7<211>20<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(20)<223>ALT2特異性引物p1106(AY029173第447-428位核苷酸序列)<400>7taggtgcata gtgccatcac 20<210>8<211>22<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(22)<223>ALT2特異性引物P1145(AY029173第425-446位核苷酸序列)<400>8caggtgatgg cactatgcac ct22<210>9<211>24<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(24)<223>引物P1090(AY029173第653～630位核苷酸序列)<400>9ctcccgtcct caggtagatg ttgt 24<210>10<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>5’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子1外顯子/內(nèi)含子交界處5’端剪接序列<400>10cgacaggcac gt 12<210>11<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>3’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子1內(nèi)含子/外顯子交界處3’端剪接序列<400>11tgccagggtt tc 12<210>12<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>5’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子2外顯子/內(nèi)含子交界處5’端剪接序列<400>12cagcgggtga gc 12<210>13<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>3’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子2內(nèi)含子/外顯子交界處3’端剪接序列<400>13gcccagggta tc 12<210>14<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>5’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子3外顯子/內(nèi)含子交界處5’端剪接序列<400>14cggcaggtga gc 12<210>15<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>3’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子3內(nèi)含子/外顯子交界處3’端剪接序列<400>15ccccaggtga tg 12<210>16<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>5’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子4外顯子/內(nèi)含子交界處5’端剪接序列<400>16gcctgggtga gg 12<210>17<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>3’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子4內(nèi)含子/外顯子交界處3’端剪接序列<400>17ttacagggtc ct 12<210>18<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>5’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子5外顯子/內(nèi)含子交界處5’端剪接序列<400>18atttctgtac gt 12<210>19<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>3’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子4內(nèi)含子/外顯子交界處3’端剪接序列<400>19ttgcagacga tc 12<210>20<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>5’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子6外顯子/內(nèi)含子交界處5’端剪接序列<400>20ccacaggtct gc 12<210>21<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>3’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子6內(nèi)含子/外顯子交界處3’端剪接序列<400>21ttataggcca gg 12<210>22<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>5’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子7外顯子/內(nèi)含子交界處5’端剪接序列<400>22gatgaggtaa ga 12<210>23<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>3’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子7內(nèi)含子/外顯子交界處3’端剪接序列<400>23ccgcaggtgt ac 12<210>24<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>5’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子8外顯子/內(nèi)含子交界處5’端剪接序列<400>24gggcgagtac gt 12<210>25<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>3’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子8內(nèi)含子/外顯子交界處3’端剪接序列<400>25ctccaggtgt gg 12<210>26<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>5’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子9外顯子/內(nèi)含子交界處5’端剪接序列<400>26agccgagtga gt 12<210>27<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>3’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子9內(nèi)含子/外顯子交界處3’端剪接序列<400>27catcaggaga ag 12<210>28<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>5’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子10外顯子/內(nèi)含子交界處5’端剪接序列<400>28gctcaggtct gg 12<210>29<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>3’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子10內(nèi)含子/外顯子交界處3’端剪接序列<400>29ccataggccc at 12<210>30<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>5’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子11外顯子/內(nèi)含子交界處5’端剪接序列<400>30cttcaggtat ga 12<210>31<211>12<212>DNA<213>人類<220>
<221>3’clip<222>(1)..(12)<223>ALT2外顯子11內(nèi)含子/外顯子交界處3’端剪接序列<400>31tgccaggatg ac 12<210>32<211>21<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(21)<223>用于染色體定位的ALT2引物<400>32ggcaggatgt tgcactagct t 21<210>33<211>21<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(21)<223>用于染色體定位的ALT2引物<400>33ggctgcacta tgtgtcactg a 21<210>34<211>32<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(32)<223>用于A1T2的NdeI連接引物p1266(對應(yīng)于AY029173第95～114位核苷酸序列)<400>34acctgaattc atatgcagcg ggcggcggcg ct 32<210>35<211>34<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(34)<223>用于ALT2的HindIII連接引物p1117(對應(yīng)于AY029173第1666～1646位核苷酸序列)<400>35ggctcagaag ctttcacgcg tacttctcca gcaa 34<210>36<211>33<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(33)<223>用于ALT1的引物p1118(對應(yīng)于NM_005309第268～288位核苷酸序列)<400>36ctgggtagac atatggcctc gagcacaggt gac33<210>37<211>37<212>DNA<213>人類<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(37)<223>用于ALT1的引物p1119(對應(yīng)于NM_005309第1158～1137位核苷酸序列)<400>37ccccagctga agctttcagg agtactcgag ggtgaac3權(quán)利要求
1.一種分離和純化了的ALT2蛋白質(zhì)，含有對應(yīng)于序列編號2中氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中，分離和純化的編碼ALT2蛋白質(zhì)的核酸。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中，所述分離和純化的核酸，其核苷酸序列為序列編號1之序列。
4.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中，含有與分離和純化的ALT2特異性結(jié)合的抗體。
5.一種ALT2表達(dá)載體，其中，將分離和純化的編碼ALT2蛋白質(zhì)的核酸序列與表達(dá)序列功能性結(jié)合。
6.一種檢測樣本中含有權(quán)利要求1所述編碼ALT2蛋白質(zhì)的信使核糖核酸的方法，該方法包括(1)將核酸探針與標(biāo)本接觸，核酸探針與所要檢測的信使核糖核酸在嚴(yán)格洗滌雜交條件下有特異性的結(jié)合；(2)檢測核酸探針與信使核糖核酸結(jié)合的雜交體。
7.一種檢測生物體液中權(quán)利要求1所述ALT2蛋白質(zhì)的方法，包括(1)體液標(biāo)本與至少一種特異性結(jié)合ALT2蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合；(2)檢測樣本中與ALT2結(jié)合的抗體。
8.一種診斷或測定可疑生物是否患有含ALT2蛋白質(zhì)的組織的疾病或損傷的方法，包括(1)從可疑生物來的體液標(biāo)本與至少一種與ALT2蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的第一抗體接觸；(2)檢測與ALT2蛋白質(zhì)結(jié)合的第一抗體；(3)體液標(biāo)本與至少一種與ALT1蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的第二種抗體結(jié)合；(4)檢測與ALT1蛋白質(zhì)結(jié)合的第二抗體；(5)比較與第一抗體結(jié)合的ALT2及與第二抗體結(jié)合的ALT1的量，當(dāng)ALT2的量足以超過ALT1的量時，提示該生物存在含ALT2的組織的疾病或損傷。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述體液包括血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、腦脊液、腸液、關(guān)節(jié)液、齒齦液、陰道液和胸腔液等。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述組織包括肝、腦、肌肉、心臟、脂肪和腎臟。
11.一種診斷或測定可疑生物是否患有含ALT2蛋白質(zhì)的組織的疾病或損傷的方法，包括(1)從可疑生物來的體液標(biāo)本與至少一種與ALT2蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的第一抗體接觸；(2)檢測與ALT2蛋白質(zhì)結(jié)合的第一抗體；(3)比較該待測可疑體液樣本中ALT2含量與已知從無含ALT2組織損傷或疾病的生物樣本中ALT2含量，當(dāng)待測樣本中ALT2水平高于正常樣本中ALT2水平時，提示待測樣本的生物患有含ALT2組織的疾病或損傷。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述體液樣本包括血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、腦脊液、腸液、關(guān)節(jié)液、齒齦液、陰道液和胸腔液等。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述組織包括肝、腦、肌肉、心臟、脂肪和腎臟。
14.一種用于診斷含ALT2的組織的損傷和疾病的試劑盒，包括(1)檢測體液中ALT2蛋白質(zhì)的測定劑；(2)判定上述(1)中所測定的結(jié)果是否與含ALT2組織的損傷或疾病相關(guān)的指引。
15.如權(quán)利要求14所述的診斷試劑盒，其中，進(jìn)一步包括(3)檢測體液中ALT1蛋白質(zhì)的測定劑；(4)判定上述(4)中所測定的結(jié)果是否與相關(guān)組織的損傷或疾病相關(guān)的指引。
16.如權(quán)利要求14或15所述的試劑盒，其中，所述試劑盒的測定法包括生物學(xué)分析、基于抗體的分析法、酶聯(lián)免疫吸附分析法、蛋白質(zhì)免疫印跡分析法、快速免疫分析法和放射免疫分析法。
17.一種用于診斷含ALT2或ALT1的組織的疾病或損傷的試劑盒，包括(1)分裝的特異性結(jié)合ALT2的抗體；(2)免疫分析試劑；(3)用于決定所測定的ALT2結(jié)果是否提示患有含ALT2或ALT1組織的損傷或疾病的標(biāo)準(zhǔn)。
18.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)包括判定ALT2升高或降低是否可診斷為含ALT2或ALT1組織的損傷或疾病的指引。
19.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，進(jìn)一步包括(1)分裝的特異性結(jié)合ALT1的抗體；(2)用于決定所測定的ALT1結(jié)果是否提示患有含ALT1組織的損傷或疾病的標(biāo)準(zhǔn)。
20.如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中，所述試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)包括判定ALT1升高或降低是否可診斷為含ALT2或ALT1組織的損傷或疾病的指引。
21.一種用于有體液中ALT2水平改變的相關(guān)狀況的診斷試劑盒，其中，包括(1)檢測體液中ALT2蛋白質(zhì)的測定劑；(2)判定上述(1)中所測定的結(jié)果是否在診斷該相關(guān)狀況的范圍內(nèi)。
22.一種用于有體液中ALT1水平改變的相關(guān)狀況的診斷試劑盒，包括(1)檢測體液中ALT2蛋白質(zhì)的測定劑；(2)判定上述(1)中所測定的結(jié)果是否在診斷該相關(guān)狀況的范圍內(nèi)。
23.一種用于有體液中ALT1和/或ALT2水平改變的相關(guān)狀況的診斷試劑盒，包括(1)檢測體液中ALT2蛋白質(zhì)的測定劑；(2)檢測體液中ALT1蛋白質(zhì)的測定劑；(3)判定上述(1)和(2)中所測定的結(jié)果是否在診斷該相關(guān)狀況的范圍內(nèi)的指引。
24.一種診斷可疑生物與體液中ALT2水平改變相關(guān)之特定狀況的方法，包括(1)從可疑生物來的體液標(biāo)本與至少一種與ALT2蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體接觸；(2)檢測與ALT2蛋白質(zhì)結(jié)合的該抗體；(3)比較待測樣本中該抗體水平與已知從無該狀況的生物樣本中該抗體水平，當(dāng)待測樣本中該抗體水平明顯不同于正常樣本中該抗體水平時，提示待測樣本的生物存在該特定的狀況。
25.一種診斷可疑生物與體液中ALT1水平改變相關(guān)之特定狀況的方法，包括(1)從可疑生物來的體液標(biāo)本與至少一種與ALT1蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體接觸；(2)檢測該樣本中與ALT1蛋白質(zhì)結(jié)合的該抗體；(3)比較待測樣本中該抗體水平與已知從無該狀況的生物樣本中該抗體水平，當(dāng)待測樣本中該抗體水平明顯不同于正常樣本中該抗體水平時，提示待測樣本的生物存在該特定的狀況。
26.如權(quán)利要求24和25中所述的方法，其中，所述體液樣本包括血液、血清、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液、唾液、精液、腦脊液、腸液、關(guān)節(jié)液、齒齦液、陰道液和胸腔液等。
27.如權(quán)利要求21、22和23所述的試劑盒，其中，所述的測定方法包括生物學(xué)分析、基于抗體的分析法、酶聯(lián)免疫吸附分析法、蛋白質(zhì)免疫印跡分析法、快速免疫分析法和放射免疫分析法劑等。
28.一種制備序列編號2的ALT2蛋白質(zhì)的方法，包括(1)將ALT2核酸序列引入到一種表達(dá)載體中；(2)將該表達(dá)載體引導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞中而形成重組宿主細(xì)胞；(3)將該重組宿主細(xì)胞置于可表達(dá)ALT蛋白質(zhì)的條件下。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述ALT2聚核苷酸序列為序列編號1之序列。
全文摘要
一種新的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因(ALT2)已從人類組織中分離出來，ALT2特異性核酸、蛋白質(zhì)及其抗體已描述如上。ALT2主要在肝臟、腎臟、腦、肌肉和脂肪組織中表達(dá)。ALT2可用作產(chǎn)生ALT2的組織的損傷和疾病的診斷。
文檔編號C12N9/64GK1636058SQ02809770
公開日2005年7月6日 申請日期2002年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月14日
發(fā)明者龔大為, 艾倫·舒爾迪納, 楊榮澤 申請人:龔大為, 艾倫·舒爾迪納, 楊榮澤