專利名稱：用于生產(chǎn)異源性蛋白的、衍生自正鏈rna病毒基因組的復制子的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及由心肌炎病毒(cardiovirus)及口瘡病毒(aphtovirus)基因組衍生的復制子或自我復制RNA分子，其可用于在動物細胞內(nèi)表達異源性蛋白。例如當將其以裸RNA的形式注入宿主動物時，這些復制子能允許所編碼異源性蛋白的翻譯。如果編碼異源性蛋白為外源性抗原的話，這些復制子會誘導出抗編碼異源性蛋白的免疫反應。本發(fā)明使用心肌炎病毒及口瘡病毒基因組來構(gòu)建這些復制子。本發(fā)明證明這些復制子以裸RNA的形式注入時，能在沒有任何形式載體或佐劑參與的情況下在受體動物體內(nèi)誘導出抗復制子編碼的異源性蛋白的免疫反應。
遺傳免疫是疫苗發(fā)展過程中的一個強有力的替代工具。其基本原理為接種含有編碼外來蛋白的基因序列的DNA表達載體。例如，接種編碼流感病毒核蛋白(NP)的裸DNA載體已被顯示能誘導抗體及細胞反應的發(fā)生，因而能保護動物宿主免受流感病毒A變體的同源及交叉毒株(2，27，28)的感染。DNA免疫的顯性包括生產(chǎn)、純化和使用的便利性，及其產(chǎn)生的持久的免疫效果。
DNA免疫相關(guān)的長期免疫可能與注射DNA的長期存在及表達有關(guān)。事實上，注射的DNA分子在小鼠模型體內(nèi)(31)能持續(xù)存在1年以上。但是從臨床觀點來看，某些問題正是由于該特點而依然存在，例如DNA序列與宿主基因組整合的潛在風險性。盡管在動物體內(nèi)(19)進行的初步研究尚未證實有基因組整合事件的發(fā)生，但是這種整合能引起插入誘變、原癌基因的活化、或染色體的不穩(wěn)定性，并從而導致疾病如癌癥的發(fā)生(35)。
為了避免這個潛在問題的發(fā)生，本發(fā)明人制造了由正鏈RNA病毒基因組衍生的裸露自我復制RNA分子或復制子。將RNA作為DNA遺傳免疫的替代物的提議由來已久，但是這種方法面臨著由RNA短暫的細胞內(nèi)半衰期及其被普遍存在的RNA酶降解而引起新問題。最初用mRNA誘導免疫反應的嘗試(5)是以肌肉注射的形式進行的，其施用形式為金顆粒包被基因槍給藥(25)或脂質(zhì)體膠囊注射以在施用過程中保護RNA(17)。為了進一步改善這些分子的輸送及其編碼的異源性蛋白的表達，已經(jīng)開發(fā)了可將異源性序列運載進入細胞的、由衣殼包裹的正鏈RNA病毒基因組衍生的自我復制RNA或復制子。在這些復制子中，基因組結(jié)構(gòu)基因被異源性序列所取代，而其非結(jié)構(gòu)基因則依然保留以進行一輪復制。該分子設計允許外源蛋白的表達。
甲病毒(alphavirus)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus，SFV)、辛德畢斯病毒(Sindbis virus)及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)基因組都已用該方法操作使其可表達外源蛋白(11，24)。RNA復制子經(jīng)蛋白包裝能使其穩(wěn)定，使所獲病毒樣顆粒能進行注射并誘導一系列抗異源性蛋白免疫反應的發(fā)生。與此相類似的是，脊髓灰質(zhì)炎病毒的正鏈RNA去掉了其衣殼編碼序列以允許外源蛋白的表達(3，21)，在將其包裝入病毒樣顆粒并給予脊髓灰質(zhì)炎病毒受體轉(zhuǎn)基因小鼠注射后(18，23)，可誘導免疫反應的發(fā)生。
與有關(guān)包裝RNA分子的研究相反的是，本發(fā)明的本發(fā)明人研究了裸RNA復制子誘導免疫反應的能力，并提出對這些載體進行包裝是不必要的，這是因為這些復制子的復制本性減少了輸入大量RNA的需要。在編碼紅細胞凝集素(HA)及流感病毒NP分子的重組SFV的案例中，注射裸RNA已被發(fā)現(xiàn)能誘導特異性抗體的產(chǎn)生(6，34)。近來，一些出版物報告了衍生自SFV的重組復制子能誘導抗流感病毒A、抗呼吸道合胞病毒及抗Looping Ill病毒的保護性抗體的產(chǎn)生(10)，以及對作為模型抗原的lacZ產(chǎn)生細胞毒T淋巴細胞(CTL)(33)。
最近本發(fā)明人報道(30)，將RNA疫苗以裸劑形式注射后，重組編碼內(nèi)在流感病毒A NP蛋白(rSFV-NP)的SFV復制子能誘導出抗流感病毒A的體液和細胞免疫反應，這些反應與質(zhì)粒DNA所誘導的相差無幾。此外，本發(fā)明人還進一步證明，裸rSFV-NP復制子在注射后，能誘導出流感病毒NP免疫顯性表位特異性的CTL反應，并能減少感染適于小鼠的流感病毒的小鼠肺內(nèi)的病毒負荷量，其程度與已被廣泛描述的DNA免疫技術(shù)所能誘導的程度相同。
本發(fā)明人還報道，編碼內(nèi)在流感病毒A NP蛋白(rΔP1-E-NP)的脊髓灰質(zhì)炎病毒復制子在以裸RNA形式注射后，其在小鼠體內(nèi)所誘導的體液免疫反應與塞姆利基rSFV-NP所誘導的相比，要弱得多。此外，注射rΔP1-E-NP復制子RNA的小鼠體內(nèi)(30)檢測不出抗流感病毒NP的CTL反應。因此，本發(fā)明人決定探索使用細小病毒家族其他成員病毒基因組的可能性，以構(gòu)建在以裸RNA形式注射后，能在動物細胞內(nèi)及動物受體內(nèi)表達異源性蛋白的新復制子?？诏彶《竞托募⊙撞《緦俚某蓡T有著相同的基因結(jié)構(gòu)，因而能用于該實驗。本發(fā)明人將門戈病毒(Mengovirus)作為心肌炎病毒原型的工作實施例。
為了構(gòu)建基于門戈病毒基因組的復制子，本發(fā)明人測出了部分基因組序列可在不影響分子復制的前提下加以去除。接下來，在門戈病毒基因組中進行了一系列包含全部或部分L-P1-2A前體蛋白編碼區(qū)框架內(nèi)缺失的遺傳工程化操作。并對相應亞基因組RNA分子的復制特征加以分析。本發(fā)明人證明，除了編碼VP2的一小段核酸序列外，從門戈病毒基因組中去除所有L-P1-2A前體蛋白的編碼區(qū)不會影響該基因組的復制能力。事實上，本發(fā)明人證明，包含門戈病毒基因組第1137位至1267位核苷酸的區(qū)域(在此指vMC24減毒株的編號方式)含有一個順式作用復制元件(CRE)，該元件對于亞基因組門戈病毒RNA分子在轉(zhuǎn)染細胞中進行復制是絕對必需的(15)。這種情形與在脊髓灰質(zhì)炎病毒和口瘡病毒基因組中觀察到的是截然不同的，在后兩者中，去除整個衣殼蛋白前體(P1)不會影響相應亞基因組RNA分子的復制(1，12)。
在構(gòu)建了門戈病毒衍生的復制子之后，本發(fā)明人證明了亞基因組門戈病毒復制子能夠表達異源性序列。復制子的免疫原性能通過不同的方法加以改進。例如，本發(fā)明人證明門戈病毒復制子可以反式衣殼化的形式轉(zhuǎn)染表達衣殼蛋白P1前體蛋白的細胞。同樣，Hoerr等人也描述了用陽離子多肽魚精蛋白濃縮復制子RNA的方法(37)。
本發(fā)明描述了由心肌炎病毒屬病毒基因組構(gòu)建的復制子的構(gòu)建方法及其用途。由于口瘡病毒同樣是細小病毒家族的成員，且和心肌炎病毒有著同樣的遺傳學結(jié)構(gòu)，因此類似的復制子還可由口瘡病毒屬病毒的基因組得以構(gòu)建。
在本文中使用的“復制子”一詞包括但不限定于自我復制的重組正鏈RNA分子。
在本文中使用的“正鏈”一詞包括但不限定于直接編碼蛋白的RNA鏈。
在本文中使用的“表達”一詞包括但不限定于引起或編碼一種蛋白或部分蛋白的生產(chǎn)。
本發(fā)明提供了一種來自RNA病毒的病毒基因組的自我復制的重組正鏈RNA分子(復制子)，其中該RNA分子包含(a)編碼該RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的RNA序列；(b)病毒復制所必需的病毒非編碼RNA序列；以及(c)編碼一種異源性蛋白或異源性蛋白片段的RNA序列；根據(jù)所述復制子的一個有利的實施方案，a)中編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的RNA序列，和/或b)中病毒復制所必需的病毒非編碼RNA序列是以突變或截斷的形式存在的。
根據(jù)所述復制子的另一個有利的實施方案，該RNA病毒是心肌炎病毒屬或口瘡病毒屬的，優(yōu)選地為門戈病毒；最優(yōu)選地，所述復制子還包含門戈病毒或泰累爾病毒(Theiler’s virus)的VP2基因中的順式作用復制元件(CRE)。
根據(jù)所述復制子的另一個有利的實施方案，c)中所定義的異源性蛋白選自生物活性蛋白、報告蛋白、細胞毒性蛋白、病原體蛋白、或是腫瘤蛋白，優(yōu)選地，報告蛋白是綠色熒光蛋白，而病原體蛋白則為流感病毒核蛋白或流感病毒紅細胞凝集素(influenza hemagglutinin)。
根據(jù)所述復制子的另一個有利的實施方案，c)中所定義的異源性蛋白片段是一種抗原或所述異源性蛋白的表位。
復制子的構(gòu)建可通過去除所有或部分衣殼編碼序列并保留所有復制必需的編碼及非編碼序列而完成。保留基因組復制序列使得病毒及異源性基因產(chǎn)物能得以在合適的細胞中進行表達。例如，在門戈病毒VP2基因中發(fā)現(xiàn)的CRE對于復制就是非常重要的。
復制子可用多種方法進行制備。在一個實施方案中，用一種DNA依賴的RNA聚合酶，如噬菌體T7、T3或SP6聚合酶對合適的DNA序列進行體外轉(zhuǎn)錄。在另一個實施方案中，復制子可通過用包含合適DNA序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染動物細胞，再由轉(zhuǎn)染細胞中分離復制子RNA而制備。例如，編碼一個復制子的互補DNA(cDNA)可置于轉(zhuǎn)錄控制之下，位于聚合酶I啟動子的下游和肝炎病毒δ核酶的上游。在本文中使用的“轉(zhuǎn)染”包括但不限定于通過電穿孔、DEAE-葡聚糖處理、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體(如Lipofectin)、蛋白質(zhì)包裝(如在假病毒顆粒中)、魚精蛋白濃縮或任何其他導入方法將DNA或RNA導入細胞。
本發(fā)明還提供了下列DNA分子，這些DNA分子在根據(jù)本發(fā)明進行的自我復制重組正鏈RNA分子的生產(chǎn)非常有用-一種編碼本發(fā)明的RNA病毒的病毒基因組的自我復制重組正鏈RNA分子的DNA分子。在一個優(yōu)選實施方案中，所述DNA分子還含有一個適當?shù)目寺≥d體；-一種DNA分子，其包含選自SEQ ID NO26和SEQ ID NO27(于2001年5月21日保藏于CNCM，Instiut Pasteur，28 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，F(xiàn)rance的質(zhì)粒，保藏號分別為I-2668和2669)或其片段的序列，以及可表達形式的、編碼一種異源性蛋白或異源性蛋白片段的DNA序列；所述DNA分子的優(yōu)選包含SEQ ID NO28(于2002年5月16日保藏于CNCM，Institut Pasteur，28 rue du Docteur Roux，75724Paris Cedex 15，F(xiàn)rance的質(zhì)粒，保藏號為I-2879)，以及-一種DNA分子，其包含選自突變或截斷形式的SEQ ID NO26和SEQ ID NO27(于2001年5月21日保藏于CNCM，Institut Pasteur，28rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，F(xiàn)rance的質(zhì)粒，保藏號分別為I-2668和2669)或其片段的序列，以及可表達形式的、編碼一種異源性蛋白或異源性蛋白片段的DNA序列。
根據(jù)所述DNA分子的一個優(yōu)選實施方案，該異源性蛋白選自生物活性蛋白、報告蛋白、細胞毒性蛋白、病原體蛋白或腫瘤蛋白。優(yōu)選地，報告蛋白為綠色熒光蛋白，病原體蛋白為流感病毒核蛋白，流感病毒紅細胞凝集素，或淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒核蛋白，而異源性蛋白片段為一種抗原或所述異源性蛋白的表位，優(yōu)選為淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒核蛋白的NP118-126表位。
本發(fā)明的復制子有多種潛在用途。在第一個實施方案中，可通過在復制子中插入編碼異源性多肽的序列，并將復制子導入動物細胞或動物宿主體內(nèi)，從而在動物細胞內(nèi)或在動物宿主體內(nèi)表達異源性蛋白。在一個實施方案中，所述動物宿主是狗、貓、豬、母牛、雞、小鼠或馬。在優(yōu)選實施方案中，所述動物宿主為人。復制子可通過多種方法導入宿主體內(nèi)，包括肌肉注射、金顆粒包被基因槍注射、蛋白包裝注射(如包裝在假病毒顆粒中)、魚精蛋白濃縮注射、或脂質(zhì)體膠囊注射。例如，一種由門戈病毒衍生的復制子能在注射部位或其附近瞬時一種治療蛋白，或者在直接注射后在實體腫瘤中表達一種毒性蛋白或促凋亡蛋白，從而提供一種抗腫瘤基因治療的形式。此外，重組復制子可用于體外或體內(nèi)表達便于檢測的報告蛋白。這些復制子可用于監(jiān)測RNA復制和RNA輸送，從而使動物細胞轉(zhuǎn)染或RNA輸送入動物宿主體內(nèi)的過程得以優(yōu)化。最后，復制子還可用于表達任何令人感興趣的蛋白，以進一步研究有關(guān)蛋白質(zhì)特性、蛋白質(zhì)生產(chǎn)或蛋白質(zhì)定位。
在另一個實施方案中，復制子可用于在動物宿主體內(nèi)誘導抗編碼異源性蛋白的免疫反應。因此，本發(fā)明的復制子與一種藥用可接受的載體能一起組成一種疫苗。藥用可接受的載體包括但不限定于無菌液體如水、油，包括石油(petroleum oil)、動物油、植物油、花生油、豆油、礦物油、芝麻油，以及生理鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油溶液、聚合陽離子顆粒、蛋白質(zhì)顆粒、魚精蛋白顆粒、脂質(zhì)體、金顆粒或任何其他能濃縮RNA的蛋白或分子。例如，復制子可以“裸露”RNA或衣殼化RNA的形式進行注射。
在一個實施例中，復制子能表達任何病原體的表位，包括細菌、真菌、病毒或寄生蟲。復制子還能表達腫瘤抗原或腫瘤抗原和病原體抗原的組合。這種復制子能誘導抗病原體或腫瘤的免疫反應，從而組成抗相應疾病的疫苗。在這點上，門戈病毒衍生的復制子能誘導強烈細胞免疫的能力是一個有利的特性。
在第二個實施例中，復制子還能作為免疫治療劑用于治療已經(jīng)患病的個體。明確地說，復制子能增強已經(jīng)存在的免疫反應或誘導抗已經(jīng)存在于個體體內(nèi)的病原體或腫瘤的新的免疫反應，從而組成了抗相應疾病的治療方法。例如，乙型肝炎可通過給予表達乙型肝炎病毒表面抗原的復制子，用該種方法進行治療。
在第三個實施例中，可構(gòu)建復制子用于表達包含一串由相同抗原或不同抗原衍生的T細胞表位的合成多肽。這些表位能特異性刺激CD4+T細胞(輔助T細胞)或CD8+T細胞(CTL)。這些復制子能(1)在考慮HLA可變性時誘導多特異性免疫反應，以及(2)限制該病原體或腫瘤細胞通過抗原逃逸對免疫反應的逃避。
在第四個實施例中，能用復制子表達任何生物活性蛋白。在一個實施方案中，生物活性蛋白是一種免疫調(diào)節(jié)蛋白，如細胞因子或趨化因子，它們能調(diào)節(jié)宿主的免疫反應。如果在復制子表達外來抗原的相同時間和相同部位進行注射的話，則細胞因子復制子能調(diào)節(jié)抗該外來抗原的免疫反應。這些復制子還能單獨用于調(diào)節(jié)抗任何病原體抗原或癌抗原的免疫反應。如果合理使用的話，這些復制子還能用于調(diào)節(jié)自身免疫的病理過程。
因此，本發(fā)明提供了一種由至少一種根據(jù)本發(fā)明制備的自我復制重組正鏈RNA分子和一種藥用可接受的載體組成的疫苗。
在所述疫苗的一個有利的實施方案中，其中的自我復制重組正鏈RNA分子為裸RNA。
在所述疫苗的另一個有利的實施方案中，其中的自我復制重組正鏈RNA分子為衣殼化RNA。
本發(fā)明還提供了一種在宿主體內(nèi)誘導保護性免疫反應的方法，其包含(a)在一種藥用可接受的載體中制備至少一種選自本發(fā)明的自我復制重組正鏈RNA分子和DNA分子的分子；以及
(b)用步驟(a)制備的產(chǎn)物免疫宿主。
在所述方法的一個有利的實施方案中，步驟(a)中的自我復制重組正鏈RNA分子和DNA分子是裸露的。I在另一個所述方法的有利的實施方案中，步驟(a)中的自我復制重組正鏈RNA分子是衣殼化的。
本發(fā)明還提供了一種治療組合物，其包含在可接受的介質(zhì)中的至少一種選自本發(fā)明的自我復制重組正鏈RNA分子和DNA分子的分子。
本發(fā)明還提供了一種治療試劑盒，其包含在可接受的介質(zhì)中的至少一種選自本發(fā)明的自我復制重組正鏈RNA分子和DNA分子的分子。
本發(fā)明還提供了一種在宿主體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫反應的方法，其包含(a)在一種藥用可接受的載體中制備至少一種選自本發(fā)明的自我復制重組正鏈RNA分子和DNA分子的分子；以及(b)用步驟(a)制備的產(chǎn)物免疫宿主。
在所述方法的另一個有利的實施方案中，藥用可接受的載體選自水、石油、動物油、植物油、花生油、豆油、礦物油、芝麻油、生理鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油溶液、聚合陽離子顆粒、蛋白質(zhì)顆粒、魚精蛋白顆粒、脂質(zhì)體、和金顆粒。
在所述方法的另一個有利的實施方案中，宿主選自人、豬、狗、貓、母牛、雞、小鼠或馬。
本發(fā)明還提供了一種通過制備衣殼化RNA病毒的病毒基因組RNA的自我復制重組正鏈RNA分子以提高其免疫原性的方法，其包含
(a)用本發(fā)明的DNA或自我復制重組正鏈RNA分子轉(zhuǎn)染表達衣殼蛋白P1前體蛋白的細胞；(b)由該經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞制備衣殼化自我復制重組正鏈RNA分子；以及(c)用步驟(b)制備的產(chǎn)物免疫宿主。
本發(fā)明還提供了一種提高RNA病毒的病毒基因組的自我復制重組正鏈RNA分子的免疫原性的方法，其包含(a)濃縮本發(fā)明的自我復制重組正鏈RNA分子；以及(b)用步驟(a)制備的產(chǎn)物免疫宿主。
在下文中還將通過圖解及工作實施例的形式對本發(fā)明進行進一步的證明，其中的復制子由門戈病毒基因組經(jīng)遺傳工程化而獲得。然而必需了解的是，這些實施例僅僅用于對本發(fā)明進行說明，而并不以任何形式對本發(fā)明構(gòu)成限制。


圖1為編碼門戈病毒病毒基因組衍生的亞基因組重組復制子的質(zhì)粒示意圖。綠色熒光蛋白(GFP)、HA和NP基因分別用陰影框表示。CRE用點彩框表示。HA蛋白信號肽(SP)及HA跨膜區(qū)(TM)用黑色條帶表示。
圖2為證明重組門戈病毒聚合蛋白在兔網(wǎng)織紅細胞裂解液內(nèi)進行體外翻譯及處理的SDS-PAGE分析。分子量標記物的位置在圖右顯示。門戈病毒蛋白前體及其部分主要裂解產(chǎn)物在圖左顯示。重組復制子編碼的GFP-NP、GFP多肽及流感病毒NP由實心箭頭表示。
圖3為證明亞基因組門戈病毒衍生的復制子復制的狹線雜交(slotblot)。在所示轉(zhuǎn)染后時間點上，細胞質(zhì)RNA被提取以供分析。
圖4為用熒光細胞計數(shù)儀閱讀重組復制子rMΔBB、rMΔBB-GFP或rMΔXBB-GFP轉(zhuǎn)染的HeLa細胞內(nèi)的GFP的表達。
圖5為重組復制子rMΔBB-NP轉(zhuǎn)染的用[35S]甲硫氨酸標記的HeLa細胞內(nèi)表達的流感病毒NP蛋白免疫沉淀的SDS-PAGE分析。上樣情況如下假轉(zhuǎn)染HeLa細胞(第1泳道)；復制子rMΔBB轉(zhuǎn)染的HeLa細胞(第2泳道)；rMΔBB-NP轉(zhuǎn)染的HeLa細胞(第3泳道)；rMΔBB-GFP-NP轉(zhuǎn)染的HeLa細胞(第4泳道)，其中第1～4泳道均為轉(zhuǎn)染后10小時收獲；假轉(zhuǎn)染HeLa細胞(第5泳道)；A/PR/8/34病毒轉(zhuǎn)染的HeLa細胞(第6泳道)，其中第5、第6泳道均為轉(zhuǎn)染后20小時收獲。分子量及病毒HA蛋白、病毒NP蛋白、病毒M1蛋白的位置在圖右表示。
圖6為證明用rMΔBB-NP免疫的C57BL/6小鼠體內(nèi)誘導的NP特異性CTL活性的CTL實驗。每組4只C57BL/6小鼠以3周的間隔分別用下列疫苗方案進行免疫1、注射50μg的pCI(O)或pCI-NP(●)DNA；2、注射25μg的rMΔBB(口)或rMΔBB-NP(■)RNA。在最末一次注射3周后收獲小鼠脾細胞，在體外刺激并進行抗加載NP366肽(a)或未加載的NP366肽(b)的同基因EL4靶細胞鉻釋放實驗。圖中表示了在不同效應劑靶細胞比例下的特異性溶解的比例。所示數(shù)據(jù)為兩次實驗中的一組數(shù)據(jù)。在最末一次注射3周后，用IFNγELISPOT實驗在有免疫顯性NP366肽存在(c)的條件下對流感病毒特異性CD8+T細胞的頻率進行測試，具體描述詳見材料與方法。數(shù)據(jù)用每105個脾細胞中的SFC數(shù)目表示。
圖7為證明用rMΔBB-NP免疫的C57BL/6小鼠體內(nèi)誘導的NP特異性抗體的ELISA分析，其疫苗注射方案同圖6方案。在直接ELISA實驗中使用純化A/PR/8/34病毒體作為抗原，采用450nm的光密度值使其兩倍于背景值，取5或6只小鼠的血清，抗體效價值用混合血清(pooledserum)最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示。
圖8為用rMBBΔ-NP免疫后再以流感病毒感染的小鼠肺內(nèi)病毒負荷的繪圖?？招膱A圈代表每組的平均值，條柱代表標準差。所示數(shù)據(jù)為兩次實驗中的一組數(shù)據(jù)。
圖9A為證明天然HA在兔網(wǎng)織紅細胞裂解液內(nèi)進行體外翻譯的SDS-PAGE分析。rMΔFM-HA重組復制子編碼的流感病毒HA多肽以實心箭頭表示，未裂解的前體以空心箭頭表示。
圖9B為證明單順反子門戈病毒復制子不能在轉(zhuǎn)染真核細胞內(nèi)表達外源糖基化蛋白的狹線雜交。在所示轉(zhuǎn)染后時間點，提取細胞質(zhì)RNA并將其狹線雜交至一張尼龍膜上以供分析。
圖10為轉(zhuǎn)染重組門戈病毒復制子的[35S]甲硫氨酸標記HeLa細胞內(nèi)表達GFP融合多肽免疫沉淀的SDS-PAGE分析。上樣情況如下假轉(zhuǎn)染的HeLa細胞或轉(zhuǎn)染復制子RNA rMΔBB-GFP、rMΔBB-GFP-NP118(2個克隆)，或轉(zhuǎn)染復制子rMΔBB-GFP-lcmvNP的HeLa細胞。分子量在圖左顯示。
圖11為證明在以rMΔBB-GFP-NP118和rMΔBB-GFP-lcmvNP復制子RNA免疫的BALB/c小鼠體內(nèi)，以及在作為對照的以pCMV-NP和pCMV-MG34質(zhì)粒DNA免疫的小鼠體內(nèi)LCMV特異性T細胞的誘導的ELISPOT實驗。在最末一次注射3周后，用IFNγELISPOT實驗在有免疫顯性NP118-126肽存在的條件下測定LCMV特異性CD8+T細胞的頻率，具體方法詳見材料與方法。所獲數(shù)據(jù)用每105個脾細胞中的SFC數(shù)目表示。
圖12為用熒光細胞計數(shù)儀閱讀重組門戈病毒復制子rMΔBB-GFP或rMΔXBB-GFP-NP118或rMΔBB-GFP-lcmvNP轉(zhuǎn)染的HeLa細胞內(nèi)GFP的表達。
實施例將門戈病毒基因組衍生的復制子cDNA以正有義方向(positivesense orientation)克隆入一個細菌質(zhì)粒，位于T7 RNA聚合酶I啟動子的下游及一個獨特的BamH I裂解位點的上游。用BamH I將細菌質(zhì)粒線性化后，用T7 RNA聚合酶去合成一個病毒RNA樣轉(zhuǎn)錄子，該轉(zhuǎn)錄子可用于轉(zhuǎn)染動物細胞或用于動物宿主的體內(nèi)注射。
第一個復制子系列，即rMΔBB系列的構(gòu)建方法詳見材料與方法及例1。幾乎所有的L-P1-2A前體的編碼序列都被缺失，只留下了CRE。這些復制子確實在轉(zhuǎn)染的HeLa細胞內(nèi)復制，并隨后與載體衍生的殘余部分一起以融合蛋白的形式表達GFP或流感病毒NP。rMΔBB-NP復制子以裸RNA的形式注射后，在小鼠體內(nèi)誘導出抗NP的免疫反應。在此基礎之上，又構(gòu)建了其他復制子，它們也確實如在例9中所述的進行復制，并隨后表達淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)的NP以及H2d小鼠LCMV免疫顯性NP118-26表位相應的合成多肽。
第二個復制子系列，即rMΔFM系列的構(gòu)建的目的在于以一種更天然的方式表達外源蛋白序列，其方法為將與外源蛋白序列融合的載體序列量最小化。這些rMΔFM復制子同樣也在轉(zhuǎn)染的HeLa細胞中復制。與此相反的是，包含流感病毒HA完整序列，包括其SP和TM區(qū)在內(nèi)的rMΔFM-HA重組復制子并不具有復制能力。
小核糖核酸病毒(Picomavirus)基因組在正常情況下不編碼糖蛋白。本發(fā)明人注意到，與其過去顯示的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組衍生的復制子一樣，單順反子門戈病毒衍生的復制子不能表達外源糖基化蛋白。但是，本發(fā)明人過去曾證明雙順反子脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)復制子能表達糖蛋白。明確地說，本發(fā)明人構(gòu)建了雙順反子復制子rΔPV-IR-HA，該復制子對于HA和PV序列的翻譯被EMCV內(nèi)源性核糖體插入位點(IRES)的插入所解耦聯(lián)了。rΔPV-IR-HA復制子在轉(zhuǎn)染后進行復制，并在細胞表面表達正確糖基化的HA(29)。同樣，雙順反子門戈病毒復制子的構(gòu)建也可通過外源性、病毒或哺乳動物IRES的插入而完成，并可測試其復制及指揮糖基化蛋白如病毒或腫瘤抗原，或生物活性多肽表達的能力。
材料與方法細胞、病毒及質(zhì)粒HeLa細胞(ATCC保藏號CCL-2)在37℃、5％CO2的條件下在加入5％熱滅活胎牛血清(FCS)(TechGen#8010050)的DMEM完全培養(yǎng)基(Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基加入1mM丙酮酸鈉、4.5mg/ml L-葡萄糖、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素)中生長。
EL4(小鼠淋巴瘤，H-2b)(ATCC保藏號TIB-39)及P815(小鼠肥大細胞瘤，H-2d)(ATCC保藏號TIB-64)在加入10％FCS的RPMI完全培養(yǎng)基(PRMI1640，10mM HEPES，50μMβ-巰基乙醇，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)內(nèi)保存。
適于小鼠的流感病毒A/PR/8/34(ma)(H1N1)由感染裸鼠的肺組織勻漿液系列傳代獲得，具體方法前文已有描述(20)。以后的病毒原料通過單個尿囊途徑在11日齡的胚雞蛋內(nèi)生產(chǎn)，該方法生產(chǎn)的病毒不影響其對小鼠的致病性。
質(zhì)粒pCI-NP的構(gòu)建是通過在表達質(zhì)粒pCI(Promega#E1731)的Sal I和Sma I位點之間插入流感病毒NP的編碼序列而完成的，其位置在CMV直接-早期增強子/啟動子的下游，具體方法在其他文獻中已有描述(30)。質(zhì)粒pCI-NP包含A/PR/8/34(ma)NP cDNA的共有序列，需要者可通過向本發(fā)明人索取而獲得，同時該質(zhì)粒還包含一位于密碼子107的沉默突變(EGAG→GAA)，以及另外一個位于密碼子277的突變(Pro→Ser)。密碼子277的突變不直接影響I類主要組織相容性復合物(MHC-I)限制性免疫顯性表位NP366-374。
用于重組復制子體外翻譯的質(zhì)粒的構(gòu)建包含去除及取代L-P1-2A部分的門戈病毒cDNA質(zhì)粒是由質(zhì)粒pMC24(又叫pM16.1；由威斯康辛大學，Madison，WI的Ann Palmenberg提供)衍生得到的，該質(zhì)粒包含位于噬菌體T7啟動子下游的減毒門戈病毒毒株的全長感染性cDNA(8)。
質(zhì)粒pMΔBB(SEQ ID NO26)包含一個亞基因組門戈病毒cDNA，其中第737至3787位的核苷酸被一個Sac I/Xho I多接頭(GAGCTCGAG)(SEQ ID NO1)所取代，vMC24 cDNA的第1137至1267位核苷酸包含門戈病毒CRE(圖1)。質(zhì)粒pMΔBB的構(gòu)建是通過用BstB I消化質(zhì)粒pMN34(15)，再進行自我拼接而完成的。含有pMΔBB的細菌于2001年5月21日保藏于國立微生物培養(yǎng)物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，CNCM)，巴黎，法國，保藏號為I-2668。質(zhì)粒pMΔN34在設計上與pMΔBB相似，但去除的門戈病毒基因組部分(第737至3680位核苷酸)較少。
質(zhì)粒pMΔXBB的構(gòu)建是為了去除包含pMΔBB質(zhì)粒序列的CRE。簡而言之，通過寡核苷酸5′-TCGAGGCTAGCTT-3′(SEQ ID NO2)及5′-CGAAGCTAGCC-3′(SEQ ID NO3)的退火獲得了一個Xho I-Bst BI連接子，并將其克隆入質(zhì)粒pMNΔ34的Xho I及Bst B I位點之間。用BigDye終止子測序試劑盒(Perkin Elmer#P/N 4303150)及ABI377自動測序儀(Perkin-Elmer)測定陽性克隆的序列。
為了克隆，將質(zhì)粒pEGFP-N1(Clontech#6085-1)作為模板、各自包含一個Sac I限制性內(nèi)切酶位點(劃線部分)的寡核苷酸5’-GCTGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’(SEQ ID NO4)及5’-GCAGAGCTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’(SEQ ID NO5)作為引物，用校閱PWO聚合酶(Roche#1644947)、通過PCR法擴增GFP編碼序列。在質(zhì)粒pMΔBB及pMΔXBB框內(nèi)的Sac I位點插入GFP序列，分別得到質(zhì)粒pMΔBB-GFP及pMΔXBB-GFP。用上文中的方法測定陽性克隆的序列。
pMΔBB-NP質(zhì)粒分兩步構(gòu)建。根據(jù)重疊擴展PCR方法，用PWO聚合酶產(chǎn)生包含流感病毒A/PR/8/34(ma)NP突變cDNA的重組cDNA片段。誘變的目的在于將第277位密碼子還原為正確的Pro277，并在第160位密碼子引入一沉默突變(DGAT→GAC)，從而破壞一個BamH I位點以便進行下面的實驗。`而言之，用PCR將質(zhì)粒pCI-NP與寡核苷酸5’-TCTCCACAGGTGTCCACTCC-3’(SEQ ID NO6)及5’-CACATCCTGGGGTCCATTCCGGTGCGAAC-3’(SEQ ID NO7)、質(zhì)粒pTG-NP24(與參考文獻30中的pTG-NP82類似，但不包含P277S突變)與寡核苷酸5’-ACCGGAATGGACCCCAGGATGTGCTCTCTG-3’(SEQ ID NO8)及5’-GTCCCATCGAGTGCGGCTAC-3’(SEQ ID NO9)一起擴增，獲得兩個重疊DNA片段。用各自包含一個Xho I限制性內(nèi)切酶位點(劃線部分)的寡核苷酸5′-CGGAATTCTCGAGATGGCGTCTCAAGGCACCAAACG-3′(SEQ ID NO10)及5′-GCGAATTCTCGAGATTGTCGTACTCCTCTGCATTGTC-3′(SEQ ID NO11)獲得的融合PCR產(chǎn)物再克隆入質(zhì)粒pTG186的EcoR I位點(13)，獲得質(zhì)粒pTG-R4。用上文中的方法測定陽性克隆的序列。其次，用Xho I消化pTG-R4獲得NP編碼序列，將該序列插入pMΔBB的Xho I位點，使得NP序列和殘余門戈病毒多蛋白序列都在框內(nèi)。GFP編碼序列插入pMΔBB-NP質(zhì)粒的方法與pMΔBB質(zhì)粒的相同，使用的位點為一個獨特的Sac I位點(見上文)，從而獲得質(zhì)粒pMΔBB-GFP-NP。為了構(gòu)建pMΔBB-GFP-lcmvNP質(zhì)粒，將寡核苷酸5’-CGGAATTCTCGAGATGTCCTTGTCTAAGGAAGTTAAG-3’(SEQ-ID.NO12)及5’-GCGAATTCTCGAGTGTCACAACATTTGGGCCTC-3’(SEQ.ID NO.13)作為引物，質(zhì)粒pCMV-NP作為模板，用PCR法擴增LCMV病毒的NP編碼序列。所獲DNA片段克隆入質(zhì)粒pMΔBB-GFP的Xho I位點。用上文中的方法測定陽性克隆的序列。
為了重建NP118-126H2d的LCMV限制性免疫顯性表位的編碼序列，將濃度為100μM的寡核苷酸5’TCGAAGCTAGCGAAAGACCCCAAGCTTCAGGTGTGTATATGGGTAATTTGACAC-3’(SEQ IDNO14)及5’TCGAGTGTCAAATTACCCATATACACACCTGAAGCTTGGGGTCTTTCGCTAGCT-3’(SEQ ID NO15)在750mM Tris-HCl(pH7.7)內(nèi)，在100℃的條件下處理5分鐘，再在20℃條件下處理1小時進行退火而獲得一個合成連接子。將該連接子插入pMΔBB-GFP質(zhì)粒的Xho I位點，獲得質(zhì)粒pMΔBB-GFP-NP118。用上文中的方法測定陽性克隆的序列。
為了構(gòu)建pMΔFM質(zhì)粒(SEQ ID NO27)，將濃度為100μM的寡核苷酸5′TCGAGGCTAGCCAGCTTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTTGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCT-3′(SEQ ID NO16)及5′TCGAAGGGCCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAGAAGGTCAA AATTCAACAGCTGGCTAGCC-3′(SEQ ID NO17)在750mM Tris-HCl(pH 7.7)內(nèi)，在100℃的條件下處理5分鐘，再在20℃條件下處理1小時進行退火而獲得一個合成連接子。將該連接子插入pMΔBB質(zhì)粒的Xho I位點，獲得質(zhì)粒p2AB。接下來，將濃度寡核苷酸5′-CGAGCATG-3′(SEQ ID NO18)及5′-CTAGCATGCTCGAGCT-3′(SEQID NO19)退火獲得第二個連接子。將該連接子插入pΔ2AB的Sac I和Nhe I位點，獲得質(zhì)粒pMΔFM。用上文中的方法測定陽性克隆的序列。包含pMΔFM質(zhì)粒的細菌于2001年5月21日保藏于CNCM，保藏號為I-2669。
為了克隆流感病毒HA序列，采用標準RNA提取步驟用5M硫氰酸胍硫氰酸胍和苯酚從感染A/PR/8/34(ma)的小鼠肺組織勻漿中提取病毒基因組RNA。將所獲病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。接下來，用PWO聚合酶、以及寡核苷酸5′-CTGGATCCAAAATGAAGGCAAACCT-3′(SEQ IDNO20)和5′-CAGGATCCTAGATGCATATTCTGCACTG-3′(SEQ ID NO21)、通過PCR法擴增在起始密碼子之前和終止密碼子之后都包含BamHI位點的HA編碼序列。將所獲DNA片段克隆入質(zhì)粒pTG186的BamHI位點，獲得質(zhì)粒pTG-HA8。
再用寡核苷酸5’-GAAAGGCAAACCTACTGGTCCTGTT-3’(SEQ IDNO22)及5’-CGTGCAGTCGACAGGATGCATATTCTGCACTGCAAAG-3’(SEQ ID NO23)作為引物，質(zhì)粒pTG-HA8作為模板，用PCR擴增A/PR/8/34(ma)病毒的HA編碼序列。寡核苷酸引物的設計要使所獲DNA片段能被Sal I消化，并在klenow破壞的Sal I位點和Nhe I位點之間克隆入質(zhì)粒p2ΔAB的框內(nèi)，獲得質(zhì)粒pMΔFM-HA。用上文中的方法測定陽性克隆的序列。該質(zhì)粒包含一個重組復制子cDNA，其中翻譯起始密碼子AUG后跟隨的HA序列與口蹄疫病毒(FMDV)2A/2B自我催化裂解位點在框內(nèi)融合，其后跟隨CRE，原始門戈病毒2A/2B裂解位點以及病毒多蛋白的殘余部分(見圖1)。
質(zhì)粒DNA的體外轉(zhuǎn)錄用BamH I將門戈病毒衍生的質(zhì)粒線性化，再根據(jù)生產(chǎn)廠商的使用說明用Promega RiboMAX-T7大規(guī)模RNA生產(chǎn)系統(tǒng)(Promega#P1300)對其進行轉(zhuǎn)錄。在體內(nèi)實驗中，采用標準分子生物學技術(shù)，用RQ1 DNA酶(1.5U/μg DNA，Promega#M6101)在37℃處理反應混合物20分鐘，用苯酚-氯仿抽提一次，先在乙酸銨-異丙醇溶液中沉淀，再在乙酸鈉-異丙醇內(nèi)沉淀，將沉淀在無內(nèi)毒素PBS中復懸(生命科學)。在體外翻譯實驗中，用相同步驟處理反應混合物，但僅用乙酸銨-異丙醇沉淀一次，并將沉淀復懸于無RNA酶的水中。
兔網(wǎng)織紅細胞型解液的體外翻譯用FlexiTM兔網(wǎng)織紅細胞裂解液系統(tǒng)(Promega#L4540)加入0.8mCi/ml[35S]-甲硫氨酸(Amersham#SJ1515；1000Ci/mmol)、0.5mMMgCl2及100mM KCl，將體外合成的RNA(10μg/ml)進行體外翻譯。在30℃孵育反應混合物3小時，在30℃用100μg/ml RNA酶A在10mM的EDTA內(nèi)處理15分鐘，在12％SDS聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)進行電泳分析，穿孔將凝膠在柯達X-OMAT膠片上放射自顯影。
RNA轉(zhuǎn)染用Easyject plus電穿孔裝置(Equibio)通過電穿孔法將RNA轉(zhuǎn)染入HeLa細胞。簡而言之，將16×106個細胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗兩次，將沉淀復懸于800μl以冰預冷的PBS中，并在32μg RNA或DNA存在的條件下以單個脈沖(240V，1800μF，最大阻抗)在0.4cm電極間隙的電穿孔槽中電穿孔。細胞立即轉(zhuǎn)移入加入2％FCS的DMEM完全培養(yǎng)基內(nèi)，分裝入8個35mm直徑的組織培養(yǎng)皿中，在37℃、5％CO2條件下孵育。
RNA復制的分析在轉(zhuǎn)染后的不同時間間隔，用標準步驟制備細胞質(zhì)RNA(26)。在1×SSC、50％甲酰胺、7％甲醛中于65℃溫育變性15分鐘后，將RNA樣品轉(zhuǎn)移至一張尼龍膜(Hybond N，Amersham#RPN203N)上，并用32P標記的RNA探針雜交，該探針與門戈病毒RNA的第6022至7606位核苷酸互補。雜交在65℃條件下，在含6×SSC、5×Denhardt溶液及0.1％SDS的溶液內(nèi)進行18小時。在室溫下用2×SSC、0.1％SDS溶液將膜洗3遍，再在65℃下用0.1×SSC、0.1％SDS溶液洗3遍。最后將膜曝光于STORMTM820磷屏成像儀(分子動力學)，并用Image Quant程序分析(分子動力學)RNA轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)GFP表達的分析用所述方法轉(zhuǎn)染HeLa細胞。在轉(zhuǎn)染后8至12小時，用胰蛋白酶消化細胞，用PBS洗滌，并在100μl PBS、1％多聚甲醛內(nèi)于4℃孵育60分鐘進行固定。接下來在FACScalibur熒光細胞計數(shù)儀(Becton-Dickinson)上分析樣品的熒光強度。
RNA轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)流感病毒NP表達的分析在峰表達(peak expression)時刻，用[35S]-甲硫氨酸(50μCi/ml；Amersham；1000Ci/mmol)對流感病毒A/PR/8/34感染或RNA/DNA轉(zhuǎn)染細胞進行代謝標記2小時。峰表達時刻是通過對rMΔBB-GFP復制子RNA或pCI-GFP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的HeLa細胞內(nèi)GFP的表達進行研究而確定的。對于RNA轉(zhuǎn)染細胞，在轉(zhuǎn)染后6至9小時可觀察到峰表達。對于DNA轉(zhuǎn)染細胞，在轉(zhuǎn)染后20小時可觀察到峰表達。流感病毒A/PR/8/34轉(zhuǎn)染的HeLa細胞在轉(zhuǎn)染后20小時觀察到峰表達。接下來用PBS洗滌細胞，并用50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1mMEDTA、1％NP40及0.5％蛋白酶抑制劑Cocktail(Sigma)裂解細胞。細胞提取物在有吸附兔抗流感病毒A/PR/8/34抗體的蛋白A瓊脂糖凝膠珠(Amersham Pharmacia Biotech#17-0780-01)的RIPA緩沖液(50mMTris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，0.1％脫氧膽酸鹽，0.1％十二烷基硫酸鈉，0.5％NP40和0.5％蛋白酶抑制劑Protease Inhibitor Cocktail)中于4℃免疫沉淀過夜。用RIPA緩沖液洗滌免疫沉淀物，用Laemmli樣品緩沖液(50mM Tris-HCl(pH6.8)，2％SDS，5％β-巰基乙醇，20％甘油)于65℃進行萃取，用SDS-PAGE分析，并在柯達X-OMAT膠片上放射自顯影使其顯像。
RNA轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)GFP融合蛋白表達的分析用上文中描述的NP表達分析方法對RNA/DNA轉(zhuǎn)染HeLa細胞的提取物進行免疫沉淀和分析，但使用的抗體為兔抗GFP抗體(Invitrogen#46-0092)。
免疫用包含50μg質(zhì)粒DNA或25μg門戈病毒復制子RNA的100μlPBS對周齡為7至8周的C57BL/6雄性小鼠(IFFA CREDO)進行肌肉注射(i.m.)(雙側(cè)脛前肌各50μl)。間隔3周再以i.m.的形式行加強注射。用于注射的DNA是用Nucleobond PC2000試劑盒(Nucleobond#740576)制備的，隨后再用triton X114進行提取步驟，最后用苯酚-氯仿進行抽提。用QCL-1000內(nèi)毒素試劑盒(Bio Whittaker#50-647U)檢測樣品是否確實不含有內(nèi)毒素(＜100U/mg)。RNA的制備在前文中已進行了分析，在注射后用瓊脂糖凝膠電泳證實其未被降解。
抗體效價在最末一次注射的3周后取小鼠的血液。將混合血清連續(xù)稀釋以用ELISA法測定NP特異性抗體效價，每孔用0.5μg被去污劑破壞的A/PR/8/34病毒作為抗原。簡而言之，在0.2M碳酸鈉、0.2M碳酸氫鈉(pH9.6)溶液內(nèi)，將96孔ELISA板(NUNC Maxisorp，#439454)于4℃用0.5μg被去污劑破壞的A/PR/8/34病毒包被過夜。用與辣根過氧化物酶(HRP)(Biosystems#BI2413C)偶聯(lián)的1/2000稀釋抗小鼠IgG(H+L)抗體檢測結(jié)合抗體，并根據(jù)廠商的說明加入TMB過氧化酶底物(KPL#50-76-00)使其顯像。
在450nm波長光密度值為背景值兩倍的混合血清稀釋倍數(shù)的倒數(shù)即為抗體的效價。每組混合血清由4或5只小鼠制備。
細胞毒性實驗在最末一次免疫后3周收集小鼠脾細胞，并將其以2×106個細胞/ml的密度接種于直立T75瓶內(nèi)，培養(yǎng)基為加入10％FCS、1.0mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉及2.5％伴刀豆球蛋白A上清的RPMI完全培養(yǎng)基。用與10μM NP366肽(ASNENMETM，Neosystem；SEQ ID NO24)一起在加入5％FCS的PRMI完全培養(yǎng)基內(nèi)于37℃脈沖處理3小時、洗滌及照射(2500拉德)的同基因脾細胞(106/ml)對脾細胞再刺激7天。用標準4小時51Cr釋放細胞毒性實驗測定再刺激效應細胞的細胞毒活性，基本原理已有前文論述(9)。在51Cr標記過程中用或不用脈沖將EL4和P815靶細胞與NP366肽一起處理。將細胞在培養(yǎng)基中單獨孵育或在1％triton X-100中孵育，分別測定放射活性的自發(fā)值和最大值。特異性51Cr釋放的百分比用如下公式計算(實驗釋放值-自發(fā)釋放值)/(最大釋放值-自發(fā)釋放值)×100。
IFNγ ELISPOT實驗在最末一次接種后3周收集小鼠脾細胞，并用標準IFNγELISPOT實驗系統(tǒng)檢測流感病毒或LCMV病毒特異性CD8+T細胞的存在。簡而言之，用1μM流感病毒NP366合成肽(ASNENMETM，Neosystem；SEQID NO24)、LCMV NP118-26肽(RPQASGVYM，Neosystem，SEQ IDNO25)及IL-2(10U/ml)刺激脾細胞20小時，并在已用大鼠抗小鼠IFNγ抗體(R4-6A2，Becton-Dickinson)包被的96孔Multiscreen HA硝酸纖維素板(Millipore)中每孔加入5×105經(jīng)照射(2000拉德)同基因脾細胞作為飼養(yǎng)細胞。將細胞與結(jié)合了生物素的大鼠抗小鼠IFNγ抗體(XMG1.2，Becton-Dickinson)、堿性磷酸酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白(Becton-Dickinson)及BCIP/NBT底物(Sigma)一起連續(xù)孵育以顯示斑點。通過計數(shù)每孔中斑點產(chǎn)生細胞(SFC)的數(shù)目確定產(chǎn)IFNγ細胞的頻率。所獲結(jié)果用每105個脾細胞中的SFC數(shù)目表示。
用A/PR/8/34(ma)病毒感染小鼠進行免疫試驗在第三次免疫后1周或3周，用100mg/kg氯胺酮(Merial)將C57BL/6小鼠輕度麻醉，并用溶解于40μl PBS內(nèi)的100pfu(0.1LD50)A/PR/8/34(ma)病毒經(jīng)鼻感染小鼠。在感染后7天殺死小鼠。制備肺組織勻漿，并用標準噬斑實驗(36)在單層MDCK細胞上測定病毒的效價。用小樣本假設(變量常態(tài)分布，進行比較的總體偏差相同)以Student’s獨立t檢驗對個體小鼠病毒效價的對數(shù)(log10)進行統(tǒng)計學分析。
包含質(zhì)粒pMΔBB和pMΔFM的菌種存放于CNCM，巴斯德研究院，28，rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex15，法國，如下表所示質(zhì)粒 保藏號 存放日期pMΔBB(SEQ ID NO26)I-2668 May 21，2001pMΔFM(SEQ ID NO27)I-2669 May 21，2001pMΔBB-GFP-lcmvNP(SEQ ID NO28) I-2879 May 16，2002
實施例1制備衍生自門戈病毒基因組的重組復制子為了制備門戈病毒基因組衍生的復制子，首先要構(gòu)建質(zhì)粒載體pMΔBB，其中衣殼蛋白的L-P1-2A前體蛋白編碼序列被一個Sac I/Xho I多接頭及原先位于VP2衣殼蛋白編碼序列內(nèi)的門戈病毒CRE(15)所取代。該取代的操作仍保留了最佳2A/2B自我催化裂解位點相應的序列，該位點的組成為2A的C端19個氨基酸和2B的第一個氨基酸(7)(圖1)。明確地說，去除了質(zhì)粒pMC24(其包含位于T7噬菌體φ10啟動子的下游的門戈病毒減毒株完整感染性cDNA)的第737-3787位核苷酸，即編碼結(jié)構(gòu)蛋白、L蛋白和2A蛋白的L-P1-2A區(qū)。去除的序列被一個Sac I，Xho I多接頭及包含門戈病毒CRE的序列所取代。如上所述，包含在2A/2B位點順式自我催化裂解最佳序列的、編碼2A的C端22個氨基酸的序列被保留下來。所獲質(zhì)粒pMΔBB(SEQ ID NO26，8017個堿基對)能與T7RNA聚合酶一起體外轉(zhuǎn)錄合成rMΔBB復制子RNA。SEQ IDNO26的第一個堿基對應于復制子RNA的第一個堿基，用于在轉(zhuǎn)錄前將質(zhì)粒線性化的BamH I位點位于4837位，T7啟動子為第7999位至第8017位核苷酸，2個G殘基(第8016和第8017位核苷酸)實際上是由T7RNA聚合酶得到的該質(zhì)粒合成轉(zhuǎn)錄子的組成部分。
將編碼GFP、流感病毒NP或GFP-NP融合蛋白的序列插入位于CRE及重建2A/2B裂解位點上游的pMΔBB多接頭，與編碼門戈病毒多蛋白的剩余序列一起位于框內(nèi)，從而獲得質(zhì)粒pMΔBB-GFP、pMΔBB-NP及pMΔBB-GFP-NP(圖1)。
作為陰性對照的質(zhì)粒pMΔXBB和pMΔXBB-GFP分別與pMΔBB和pMΔBB-GFP類似，但其中的ΔX構(gòu)建部分不含門戈病毒CRE(圖1)。
在此應用的所有質(zhì)粒都是通過業(yè)內(nèi)已知技術(shù)在實驗室中獲得的。它們的核苷酸序列都是已知且可獲得的。用PCR對這些序列進行擴增時，已對插入部分進行了完全測序從而對其進行了檢驗。
用T7RNA聚合酶對pMΔBB、pMΔBB-GFP、pMΔBB-NP和pMΔBB-GFP-NP質(zhì)粒DNA進行體外轉(zhuǎn)錄，用Bam HI線性化所獲的rMΔBB、rMΔBB-GFP、rMΔBB-NP和rMΔBB-GFP-NP重組RNA在兔網(wǎng)織紅細胞裂解液內(nèi)進行體外翻譯。用SDS-PAGE分析翻譯產(chǎn)物并通過放射自顯影使其顯像。如圖2所示，復制子編碼的多蛋白被3C蛋白酶正確地裂解，以表達RNA擴增所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白，證據(jù)為裂解的最終產(chǎn)物如2C、3C、3D和3CD蛋白。與此相反的是，沒有在rMΔBB衍生的復制子中觀察到重建2A/2B位點的正確順式裂解。本發(fā)明人預測，外源序列會與7個連接子編碼殘基、CRE編碼多肽(CREP，44個氨基酸)及2A蛋白的最后22個殘基一起表達為融合蛋白，從而將外源多肽擴大為8kD。對于重組rMΔBB-NP復制子而言，正確裂解的NP-CREP-2A*融合蛋白的表達會顯示為在預測分子量為63kDa的位置出現(xiàn)一條條帶，而實際上在分子量為70kDa或稍大一些的位置上觀察到一條條帶(圖2)。與此相反的是，GFP-CREP-2A*和GFP-NP-CREP-2A*融合蛋白移行的分子量與預測的相近(分別為35kDa和89kDa)。
本發(fā)明人解釋由rMΔBB-NP復制子編碼的NP蛋白預測大小與實際大小之間的明顯不一致是由于2A/2B裂解沒有發(fā)生，而是在2B多肽內(nèi)出現(xiàn)了一個代替裂解，其位置大約距其N端三分之一(假設2B蛋白大小為151個氨基酸)。在此例中，由rMΔBB-NP載體編碼的NP相關(guān)性異源性序列以NP-CREP-2A*-Δ2B融合多肽的形式表達?？赡苁俏挥诹呀馕稽c之前由NP序列及CRE編碼的氨基酸的延展(stretch)迫使2A序列的殘余部分折疊，從而使裂解不能進行。本發(fā)明人目前對于2B多肽內(nèi)出現(xiàn)的異常裂解尚沒有解釋，但是對其他細小病毒的代替處理方法已進行了描述，尤其是當處理串聯(lián)步驟中的一個裂解被阻斷時的情況(4) 。
實施例2門戈病毒基因組衍生復制子rMΔBB、rMΔBB-GFP、rMΔBB-NP及rMΔBB-GFP-NP的復制特點本發(fā)明人接下來對外源序列是否能在不影響RNA復制的前提下插入門戈病毒基因組進行了確定。此外，由于流感病毒NP在以往已顯示出能與RNA發(fā)生非特異性聯(lián)合的性質(zhì)(14，32)，其與門戈病毒RNA之間發(fā)生的反應在理論上會影響整體復制效率。因此，將rMΔBB、rMΔBB-GFP、rMΔBB-NP及rMΔBB-GFP-NP的合成RNA轉(zhuǎn)錄子轉(zhuǎn)染入HeLa細胞，并在轉(zhuǎn)染后不同時間點提取全部細胞質(zhì)RNA。狹線雜交后用與門戈病毒RNA第6022-7606位核苷酸互補的[32p]放射性標記riboprobe(體外轉(zhuǎn)錄)與RNA雜交發(fā)現(xiàn)，所有的RNA都進行了高效復制(圖3)。在本發(fā)明人的研究中用電穿孔法轉(zhuǎn)染細胞，該法比經(jīng)典的DEAE-葡聚糖技術(shù)的轉(zhuǎn)染效率高(能轉(zhuǎn)染50％以上的細胞)。在這些條件下，不論有沒有衣殼蛋白存在，所有的4種RNA都誘導出了一種細胞病理效應(CPE)，并導致單層細胞在轉(zhuǎn)染后24小時全面破壞(數(shù)據(jù)未在本文中顯示)。綜上所述，這些結(jié)果說明插入外源序列如GFP或NP編碼序列對于RNA的復制沒有負效應。
實施例3重組門戈病毒衍生的復制子對綠色熒光蛋白的表達通過監(jiān)測門戈病毒衍生復制子轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的530nm熒光，用熒光細胞計數(shù)儀分析GFP的表達。用電穿孔將HeLa細胞假轉(zhuǎn)染或用rMΔBB、rMΔBB-GFP、rMΔXBB-GFP復制子RNA轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后9小時，用胰蛋白酶消化細胞，并用FACScalibur熒光細胞計數(shù)儀分析其熒光強度，根據(jù)預試驗結(jié)果，這時所有的檢測復制子都處于GFP表達高峰期內(nèi)(7至12小時)。如圖4所示，在rMΔBB-GFP轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)能檢測到GFP的表達，而在假轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)或空載體rMΔBB轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)則無GFP的表達。有趣的是，復制子rMΔXBB-GFP RNA轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)沒有顯示出任何熒光，該結(jié)果證實了門戈病毒CRE對于RNA復制是必需的結(jié)論，而且證實了外源序列的顯著表達必需在RNA復制的前提下進行。因此，門戈病毒衍生重組復制子顯示出能在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)指導GFP高效表達的能力。
例4重組門戈病毒衍生復制子對流感病毒核蛋白的表達如方法中所述，通過加入抗A/PR/8/34病毒抗體，用免疫沉淀法處理門戈病毒衍生的復制子轉(zhuǎn)染的細胞或A/PR/8/34病毒感染的細胞的細胞質(zhì)提取物。根據(jù)預試驗結(jié)果，通過電穿孔法用復制子RNA轉(zhuǎn)染HeLa細胞，并在表達峰值時用[35S]-甲硫氨酸代謝標記2小時。制備細胞質(zhì)提取物，用抗流感病毒A/PR/8/34多克隆抗體免疫沉淀蛋白質(zhì)，用SDS-PAGE對其進行分析并通過放射自顯影使其顯像。如圖5所示，在rMΔBB-NP轉(zhuǎn)染細胞的提取物(第3泳道)內(nèi)，明顯有一分子量為70kDa的蛋白質(zhì)被特異性免疫沉淀。正如預期的那樣，在假轉(zhuǎn)染細胞或空載體rMΔBB復制子RNA轉(zhuǎn)染的細胞細胞質(zhì)內(nèi)沒有觀察到任何免疫反應蛋白。
門戈病毒衍生復制子表達的NP融合多肽明顯移動至分子量70kD處(圖5，第3泳道)，其分子量顯著大于A/PR/8/34病毒感染細胞所表達的天然NP的分子量(55kD)(第6泳道)。如實施例1中所討論的，這個分子量之間的差異是由NP-CREP-2A*融合蛋白的額外氨基酸殘基及2B蛋白的額外殘基造成的，該結(jié)果與體外實驗所觀察到的一致。同樣，該結(jié)果與門戈病毒多肽2A/2B位點沒有發(fā)生蛋白裂解，而是在2B序列內(nèi)部的一個替代裂解位點發(fā)生了蛋白裂解的假說相一致。有趣的是，這并不影響復制子RNA的整體復制效率，提示該替代裂解途徑可能為門戈病毒多蛋白連鎖反應的一部分。
重組復制子rMΔBB-GFP-NP轉(zhuǎn)染的HeLa細胞(圖5，第4泳道)同樣引起NP相關(guān)蛋白的高水平表達。由于NP相關(guān)物質(zhì)移動至大于預期值的分子量處(實際值約為97kD，而非預期的89kD)，因此估計在2A/2B位點同樣也沒有發(fā)生裂解。
因此，門戈病毒衍生重組復制子顯示出能在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)指導大小至少可多達2200個核苷酸的異源性序列高效表達的能力。
實施例5以裸RNA形式注射重組門戈病毒衍生的復制子后誘導NP特異性CTL應答為了確定使用裸門戈病毒衍生復制子注射以引出一異源性特異性免疫應答的可行性，本發(fā)明人確定了將重組rMΔBB-NP以裸RNA形式注射能否誘導出NP特異性CTL應答，明確地說是抗NP顯性H-2Db限制性表位NP366的免疫應答。
為了實現(xiàn)這個目的，用25μg rMΔBB-NP裸RNA給C57BL/6肌肉注射兩次，中間間隔一月，或用50μg pCI-NP裸DNA給小鼠肌肉注射一次作為陽性對照。該免疫程序根據(jù)過去的實驗確定，并基于對以下現(xiàn)象的觀察，即注射一次質(zhì)粒DNA足已誘導一可檢測的NP特異性CTL應答，其水平僅次于由亞致死劑量流感病毒A/PR/8/34(ma)感染中恢復小鼠所獲水平(數(shù)據(jù)未在本文中顯示)。在最末一次注射3周后收獲小鼠脾細胞，在體外以NP366肽刺激并在7天后用經(jīng)典鉻釋放實驗檢測其溶細胞活性，詳見材料與方法。注射rMΔBB-NP RNA或pCI-NP DNA的小鼠脾細胞在負荷NP366肽的條件下特異性溶解同基因EL4細胞(圖6a)。由rΔBB-NP復制子RNA誘導的CTL活性與pCI-NP DNA誘導的極為相似，且水平很高(即在效應細胞對靶細胞比為6.7∶1時特異性溶解60％至70％)。所有未免疫對照小鼠或用不包含NP序列的對照空載體免疫的小鼠脾細胞在刺激后都沒有觀察到任何溶細胞反應(圖6，空心標志)；在沒有負荷肽的靶細胞中亦未觀察到任何溶細胞反應(圖6b)。最后，無論是否用肽孵育，所有效應細胞對同源異體P815靶細胞(H-2d)的溶細胞反應都保持為背景水平(數(shù)據(jù)未在本文中顯示)，提示該溶細胞活性為H-2限制性，因而可能由I類限制性CD8+T細胞效應產(chǎn)生。
最后，用IFNγELISPOT實驗對肌肉注射rMΔBB-NP RNA及pCI-NP DNA誘導的兩種特異性T細胞應答進行了定量測定。用流感病毒免疫顯性NP366肽體外刺激免疫小鼠脾細胞，根據(jù)其應答水平測定IFNγ產(chǎn)生細胞的頻率，詳見材料與方法。如圖6c所示，復制子RNA和質(zhì)粒DNA免疫小鼠的T細胞頻率都非常高且在同一范圍內(nèi)(100/105脾細胞)。正如預期的那樣，兩個空對照即在沒有NP366肽存在的條件下或空載體免疫小鼠的每105個脾細胞所獲SFC數(shù)目都小于1。
這些發(fā)現(xiàn)顯示門戈病毒復制子在以裸RNA形式注射時具有免疫原性，并且能誘導出抗注射外源序列如流感病毒NP的異源性特異性免疫性。
實施例6重組復制子rMΔBB-NP免疫后誘導NP特異性抗體為了評估重組復制子rMΔBB-NP在以裸RNA形式注射后能否誘導抗流感病毒抗原特異性抗體的產(chǎn)生，用25μg rMΔBB-NP RNA給C57BL/6小鼠肌肉注射3次，每次間隔3周，或用50μg PCI-NP DNA注射作為陽性對照。在最末一次注射3周后收集小鼠血清(DNA注射1或2次，RNA注射2次)。用ELISA法測定特異性抗NP抗體。
如圖7所示，25μg裸rMΔBB-NP RNA注射兩次可誘導血清抗流感病毒NP抗體的產(chǎn)生。其NP特異性ELISA效價稍高于注射一次50μg質(zhì)粒pCI-NP DNA所誘導的，但明顯低于注射兩次pCI-NP DNA所誘導的抗體水平。
如同實施例5一樣，這些發(fā)現(xiàn)顯示門戈病毒復制子以裸RNA注射時具有免疫原性，并能誘導出抗插入流感病毒NP外源序列的異源性特異性免疫應答。將實施例5和實施例6綜合考慮，兩者都證明了門戈病毒復制子既能誘導抗編碼異源性蛋白的體液免疫(抗體)，又能誘導細胞免疫(CTL)。
實施例7體外保護性免疫為了顯示rMΔBB-NP產(chǎn)生體外保護性免疫的能力，用25μg rMΔBB或rMΔBB-NP復制子RNA，或50μg pCI或pCI-NP質(zhì)粒DNA免疫C57BL/6小鼠(每組6只)，共注射3次，每次間隔3周。最末一次注射3周后，用102pfu(0.1LD50)適于小鼠的A/PR/8/34病毒刺激小鼠，并在刺激7天后測定小鼠肺內(nèi)的病毒效價。如圖8所示，用每一種NP編碼載體注射的小鼠體內(nèi)的病毒負荷明顯低于用相應空載體注射的小鼠病毒負荷(p＜0.001；student′s t檢驗)。
值得注意的是，盡管由于本發(fā)明人使用的適于小鼠病毒株的毒力很高(C57BL/6小鼠的LD50為103pfu)，病毒負荷僅中度下降，但裸RNA免疫所引起的下降與裸DNA免疫所引起的同樣有效。該結(jié)果證實由門戈病毒衍生復制子裸RNA引起免疫應答(很可能是CTL)能通過降低肺內(nèi)病毒效價起到抗流感病毒的保護作用。
實施例8門戈病毒基因組衍生重組rMΔFM復制子的制備為了以一種更為天然的形式表達外源序列，本發(fā)明人探索了將與外源序列融合的載體序列最小化的可能性。為了達到這個目的，通過在pMΔBB編碼復制子的多接頭和CRE序列之間插入FMDV的2A/2B自我催化裂解位點序列構(gòu)建質(zhì)粒pMΔFM(圖1)。在這個最佳方案中，該裂解位點包含2A蛋白的C端19個殘基和2B蛋白的第一個脯氨酸(7)。
所獲質(zhì)粒pMΔFM(8092個堿基對)對應于SEQ ID NO27第一個堿基對應于復制子RNA的第一個堿基，用于在轉(zhuǎn)錄前將質(zhì)粒線性化的BamHI位點位于4912位，T7啟動子為第8074位至第8092位核苷酸，2個G殘基(第8091和第8092位核苷酸)實際上是由T7RNA聚合酶得到的該質(zhì)粒合成轉(zhuǎn)錄子的組成部分。
接下來，將流感病毒A/PR/8/34(ma)的HA基因插入于pMΔFM的Sac I和Nhe I位點之間，緊鄰FMDV 2A序列的上游，且與剩余多蛋白序列一起位于框內(nèi)，獲得質(zhì)粒pMΔFM-HA。
為了驗證這些構(gòu)建的質(zhì)粒能翻譯為多蛋白并如預期在終末產(chǎn)物內(nèi)裂解，如上文所述在體外對相應線性化質(zhì)粒進行了轉(zhuǎn)錄，并將合成的RNA在兔網(wǎng)織紅細胞裂解液內(nèi)翻譯。所有的復制子都顯示出正確裂解終末產(chǎn)物的類似翻譯輪廓，證據(jù)為2C、3C、3D及3CD病毒多肽的存在(圖9A)。
特別是在重組復制子rMΔBB-HA內(nèi)觀察到重建FMDV2A/2B位點的正確順式裂解；在預期的65kDa分子量處出現(xiàn)的條帶(圖9A)表明了包含F(xiàn)MDV2A蛋白(21個氨基酸)和多接頭(5個氨基酸)的26個額外氨基酸殘基的正確裂解HA-2A*融合蛋白的表達。有趣的是，在更大分子量處出現(xiàn)的條帶提示該裂解在此體外翻譯實驗中并非100％有效。
相應母代復制子rMΔFM的該裂解產(chǎn)物以3.4kDa大小的MCS-2A融合蛋白形式出現(xiàn)，由于其分子量小因而不可見，但有一分子量為16kDa的多肽條帶存在；該多肽可能與跨越門戈病毒CRE、門戈病毒2A蛋白的最后22個殘基及2B的N端的序列相對應，提示在本例中FMDV2A/2B位點亦發(fā)生了裂解，而原始的門戈病毒2A/2B仍未裂解，該現(xiàn)象與上文所述的rMΔBB及rMΔBB-NP實例中的現(xiàn)象一致。
為了測試這些第二代復制子的復制有效性，通過電穿孔法用合成RNA轉(zhuǎn)染HeLa細胞，在轉(zhuǎn)染后不同時間點提取細胞質(zhì)RNA并用Northern雜交分析，使用的探針為門戈病毒特異性[32P]標記的riboprobe(體外轉(zhuǎn)錄)，其序列與門戈病毒基因組第6022-7606位核苷酸互補。如圖9B所示，rMΔFM復制子的確如同其母代rMΔBB一樣高效復制，提示該新操作的2A/2B裂解對于RNA合成沒有負效應。另一方面，rMΔFM-HA重組復制子沒有復制能力。
由于rMΔFM-HA復制子中的HA包含一SP區(qū)和TM區(qū)，這一發(fā)現(xiàn)可能與另一細小病毒基因組即脊髓灰質(zhì)炎病毒構(gòu)建的復制子類似。確實發(fā)現(xiàn)在緊鄰脊髓灰質(zhì)炎病毒復制子多蛋白N端處SP區(qū)的存在廢除了相應RNA的復制(1，16)。通過顯示在rMΔFM-HA脊髓灰質(zhì)炎病毒復制子內(nèi)插入實質(zhì)為糖基化跨膜蛋白的流感病毒HA的完整序列，該復制子的復制被廢除(29)，本發(fā)明人近來證實了這一現(xiàn)象。此外，本發(fā)明人還演示了用去除其P1區(qū)的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組衍生復制子表達HA糖基化序列是可能的，前提為通過在外源序列和剩余P2P3多蛋白序列之間插入一異源性IRES如EMCV IRES將這些復制子雙順反子化(29)。
因此可構(gòu)建雙順反子門戈病毒復制子?？赏ㄟ^在Sac I/Xho I多接頭和pMΔBB質(zhì)粒剩余多蛋白序列之間插入一外源病毒或哺乳動物IRES完成該構(gòu)建。例如通過插入A型或B型馬鼻炎病毒外源IRES可構(gòu)建所述雙順反子門戈病毒復制子，這是因為這兩者的IRES有效地競爭心肌炎病毒屬典型代表EMCV病毒IRES的翻譯因子(38)。正如本發(fā)明人過去用雙順反子脊髓灰質(zhì)炎病毒演示的那樣，這些雙順反子門戈病毒復制子能夠進行復制并表達糖基化外源多肽。例如可將流感病毒HA序列插入所述新構(gòu)建的雙順反子門戈病毒復制子中的一個內(nèi)。
當糖基化是多肽抗原性或生物活性的關(guān)鍵參數(shù)時，這些新構(gòu)建的雙順反子門戈病毒復制子允許研究人員感興趣的外源抗原或蛋白的表達。例如門戈病毒雙順反子復制子可用于表達病毒抗原如乙肝病毒HBs抗原或人免疫缺陷病毒的包裝糖蛋白，或用于表達腫瘤抗原如人腫瘤細胞的表面抗原。
如在兔網(wǎng)織紅細胞裂解液內(nèi)觀察到的，門戈病毒rMΔFM復制子載體還能用于指導非糖基化外源蛋白在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的天然表達。
實施例9門戈病毒復制子對其他抗原LCMV核蛋白(NP)或LCMVNP118-126表位的表達為了顯示門戈病毒衍生復制子在以裸RNA形式接種后能誘導抗其他抗原的異源性特異性免疫應答，本發(fā)明人構(gòu)建了rMΔBB-GFP-1cmvNP和rMΔBB-GFP-NP118復制子。這些復制子以GFP融合蛋白的形式分別編碼LCMV NP及LCMV NP118-126 H2d限制性免疫顯性表位。
為了達到該目的，本發(fā)明人構(gòu)建了質(zhì)粒pMΔRB-GFP-lcmvNP(SEQID NO28，10417個堿基對)，詳見材料與方法。SEQ ID NO28的第一個堿基對應于復制子RNA的第一個堿基。用于在轉(zhuǎn)錄前將質(zhì)粒線性化的BamHI位點位于7237位，T7啟動子為第10399位至第10417位核苷酸，2個G殘基(第10416和第10417位核苷酸)實際上是由T7RNA聚合酶得到的該質(zhì)粒合成轉(zhuǎn)錄子的組成部分。
接下來，rMΔBB-GFP-lcmvNP復制子RNA轉(zhuǎn)染HeLa細胞細胞質(zhì)提取物在預期的97kDa分子量處出現(xiàn)的條帶表明LCMV NP與GFP以融合多肽的形式得到了表達(圖10)。用熒光細胞計數(shù)儀在530nm波長監(jiān)測復制子轉(zhuǎn)染HeLa細胞內(nèi)熒光的存在也同樣證明了GFP的表達(圖12)。與此相類似的是，NP118-126LCMV表位的前體大小為15個氨基酸(NP116-130，大約為1.7kDa)，其表達也作為融合蛋白被檢測到了，分子量略大于GFP(35kDa)。這表明重組rMΔBB-GFP-lcmvNP和rMΔBB-GFP-NP118 RNA如同其母代rMΔBB-GFP復制子一樣，確實進行了復制，并能使插入序列得到合成。此外，本例及例3都顯示了GFP的表達作為門戈病毒衍生復制子RNA復制標記物的適用性。
最后，用25μg rMBB-GFP、rMΔBB-GFP-lcmvNP或rMΔBB-GFP-NP118裸RNA給BALB/c小鼠肌肉注射兩次，或用50μg pCMV-NP或pCMV-MG34(40)裸DNA給小鼠注射作為陽性對照。用LCMV免疫顯性NP118-126肽對經(jīng)免疫小鼠的脾細胞進行體外刺激，并用IFNγELISPOT實驗測定產(chǎn)IFNγ細胞的頻率，詳見材料與方法。如圖11所示，rMΔBB-GFP-lcmvNP和rMΔBB-GFP-NP118復制子都誘導出了高頻率的LCMV特異性T細胞(70～200/105脾細胞)。有趣的是，這些頻率都略高于用質(zhì)粒DNA進行遺傳免疫后所測到的頻率。
總而言之，這些發(fā)現(xiàn)表明由于門戈病毒復制子能以全長外源抗原或相應外源表位短相關(guān)肽的免疫原性形式進行表達，因此該復制子對于誘導異源性特異性免疫應答具有多種用途。
以上對整個發(fā)明都已進行了詳細的論述，經(jīng)驗豐富的業(yè)內(nèi)人員會發(fā)現(xiàn)本發(fā)明可在一定等效范圍內(nèi)進行操作，而不破壞其整體性，也不需要進行任何過度實驗。此外，盡管在本文中用了一些實施方案及實施例對本發(fā)明進行了描述，但本發(fā)明人相信本發(fā)明還能進行進一步的調(diào)整。本申請書意在涵蓋所有根據(jù)上文中總體原則對本發(fā)明進行的變動、使用或適應性調(diào)整。
所有在本文中引用的參考文獻、手冊、專利及專利申請書的內(nèi)容都作為整體并入作為參考。
參考文獻1.Ansardi，D.C.，Z.Moldoveanu，D.C.Porter，D.E.Walker，R.M.Conry，A.F.LoBuglio，S.McPherson，and C.D.Morrow 1994.Characterization of poliovirus replicons encoding carcinoembryonic antigen.Cancer Res.546359-64.
2.Bot，A.，S.Bot，A.Garcia-Sastre，and C.Bona 1996.DNAimmunization of newborn mice with a plasmid-expressing nucleoprotein ofinfluenza virus.Viral Immunol.9207-10.
3.Choi，W.S.，R.Pal-Ghosh，and C.D.Morrow 1991.Expressionof human immunodeficiency virus type 1(HIV-1)gag，pol，and env proteinsfrom chimeric HIV-1-poliovirus minireplicons.J Virol.652875-83.
4.Cohen，L.，K.M.Kean，M.Girard，and S.Van der Werf 1996.Effects of P2 cleavage site mutations on poliovirus polyprotein processing.Virology.22434-42.
5.Conry，R.M.，A.F.LoBuglio，M.Wright，L.Sumerel，M.J.Pike，F(xiàn).Johanning，R.Benjamin，D.Lu，and D.T.Curiel 1995.Characterization ofa messenger RNA polynucleotide vaccine vector.Cancer Res.551397-400.
6.Dalemans，W.，A.Delers，C.Delmelle，F(xiàn).Denamur，R.Meykens，C.Thiriart，S.Veenstra，M.Francotte，C.Bruck，and J.Cohen 1995.Protection against homologous influenza challenge by genetic immunizationwith SFV-RNA encoding Flu-HA.Annals of the New York Academy ofSciences.772255-6.
7.Donnelly，M.L.，D.Gani，M.Flint，S.Monaghan，and M.D.Ryan 1997.The cleavage activities of aphthovirus and cardiovirus 2A proteins.J.Gen.Virol.7813-21.
8.Duke，G.M.，and A.C.Palmenberg 1989.Cloning and synthesisof infectious cardiovirus RNA containing short，discrete Poly(C)tracts.JVirol.631822-1826.
9.Escriou，N.，C.Leclerc，S.Gerbaud，M.Girard，and S.van derWerf 1995.Cytotoxic T cell response to Mengo virus in miceeffector cellphenotype and target proteins.J.Gen.Virol.761999-2007.
10.Fleeton，M.N.，M.Chen，P.Berglund，G.Rhodes，S.E.Parker，M.Murphy，G.J.Atkins，and P.Liljestrm 2001.Self-replicating RNAvaccines elicit protection against Influenza A Virus，Respiratory SyncytialVirus，and a Tickborne Encephalitis Virus.J.Infect.Dis.1831395-8.
11.Frolov，I.，T.A.Hoffman，B.M.Pragai，S.A.Dryga，H.V.Huang，S.Schlesinger，and C.M.Rice 1996.Alphavirus-based expressionvectorsstrategies and applications.Proc.Natl.Acad Sci.USA.9311371-7.
12.Kaplan，G.，and V.R.Racaniello 1988.Construction andcharacterization ofpoliovirus subgenomic replicons.J.Virol.621687-96.
13.Kieny，M.P.，G.Rautmann，D.Schmitt，K.Dott，S.Wain-Hobson，M.Alizon，M.Girard，S.Chamaret，A.Laurent，L.Montagnier，and J.P.Lecocq 1986.AIDS virus env protein expressed from a recombinantvaccinia virus.Biotechnology.4790-795.
14.Kingsbury，D.W.，I.M.Jones，and K.G.Murti 1987.Assemblyof influenza ribonucleoprotein in vitro using recombinant nucleoprotein.Virology.156396-403.
15.Lobert，P.E.，N.Escriou，J.Ruelle，and T.Michiels 1999.Acoding RNA sequence acts as a replication signalin cardioviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9611560-5.
16.Lu，H.H.，L.Alexander，and E.Wimmer 1995.Construction andgenetic analysis of dicistronic polioviruses containing open reading frames forepitopes of human immunodeficiency virus type 1 gP120.J.Virol.694797-806.
17.Martinon，F(xiàn).，S.Krishnan，G.Lenzen，R.Magno，E.Gomard，J.-G.Guillet，J.-P.Levy，and P.Meulien 1993.Induction of virus-specificcytotoxic T lymphocytes in vivo by liposome-entrapped mRNA.Eur.J.Immunol.231719-1722.
18.Moldoveanu，Z.，D.C.Porter，A.Lu，S.McPherson，and C.D.Morrow 1995.Immune responses induced by administration of encapsidatedpoliovirus replicons which express HIV-1 gag and envelope proteins.Vaccine.131013-22.
19.Nichols，W.W.，B.J.Ledwith，S.V.Manam，and P.J.Troilo1995.Potential DNA vaccine integration into host cell genome.Annals of theNew York Academy of Sciences.77230-9.
20.Oukka，M.，J.C.Manuguerra，N.Livaditis，S.Tourdot，N.Riche，I.Vergno，P.Cordoparis，and K.Kosmatopoulos 1996.Protection againstlethal viral infection by vaccination with nonimmunodominant peptides.J.Immunol.1573039-45.
21.Percy，N.，W.S.Barclay，M.Sullivan，and J.W.Almond 1992.Apoliovirus replicon containing the chloramphenicol acetyltransferase gene canbe used to study the replication and encapsidation of poliovirus RNA.J.Virol.665040-6.
22.Pogulis，R.J.，A.N.Vallejo，and L R.Pease 1996.In vitrorecombination and mutagenesis by overlap extension PCR.Methods Mol Biol.57167-76.
23.Porter，D.C.，J.Wang，Z.Moldoveanu，S.McPherson，and C.D.Morrow 1997.Immunization of mice with poliovirus replicons expressing theC-fragment of tetanus toxin protects against lethal challenge with tetanus toxin.Vaccine.15257-64.
24.Pushko，P.，M.Parker，G.V.Ludwig，N.L.Davis，R.E.Johnston，and J.F.Smith 1997.Replicon-helper systems from attenuated Venezuelanequine encephalitis virusexpression of heterologous genes in vitro andimmunization against heterologous pathogens in vivo.Virology.239389-401.
25.Qiu，P.，P.Ziegelhoffer，J.Sun，and N.S.Yang 1996.Gene gundelivery of mRNA in situ results in efficient transgene expression and geneticimmunization.Gene Therapy.3262-8.
26.Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis 1989.Molecularcloninga laboratory manual，2nd ed，vol.1.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York.
27.Ulmer，J.B.，J.J.Donnelly，S.E.Parker，G.H.Rhodes，P.L.Felgner，V.J.Dwarki，S.H.Gromkowski，R.R.Deck，C.M.DeWitt，A.Friedman，L.A.Hawe，K.R.Leander，D.Martinez，H.C.Perry，J.W.Shiver，D.L.Montgomery，and M.A.Liu 1993.Heterologous protection againstinfluenza by injection of DNA encoding a viral protein.Science.2591745-1749.
28.Ulmer，J.B.，T.M.Fu，R.R.Deck，A.Friedman，L.Guan，C.DeWitt，X.Liu，S.Wang，M.A.Liu，J.J.Donnelly，and M.J.Caulfield 1998.Protective CD4+ and CD8+T cells against influenza virus induced byvaccination with nucleoprotein DNA.J.Virol.725648-53.
29.Vignuzzi，M.，S.Gerbaud，S.van der Werf，and N.Escriou 2002.Expression of a membrane-anchored glycoprotein，the Influenzahemagglutinin，by dicistronic replicons derived from the poliovirus genome.J.Virol.765285-90.
30.Vignuzzi，M.，S.Gerbaud，S.van der Werf，and N.Escriou 2001.Naked RNA immunization with replicons derived from the poliovirus andSemliki Forest virus genomes for the generation of a cytotoxic T cell(CTL)response against the Influenza A virus nucleoprotein.J.Gen.Virol.821737-47.
31.Wolff，J.A.，J.J.Ludtke，G.Acsadi，P.Williams，and A.Jani1992.Long-term persistence of plasmid DNA and foreign gene expression inmouse muscle.Human Molecular Genetics.1363-9.
32.Yamanaka，K.，A.Ishihama，and K.Nagata 1990.Reconstitutionof influenza virus RNA-nucleoprotein complexes structurally resemblingnative viral ribonucleoprotein cores.J.Biol.Chem.26511151-5.
33.Ying，H.，T.Z.Zaks，R.F.Wang，K.R.Irvine，U.S.Kammula，F(xiàn).M.Marincola，W.W.Leitner，and N.P.Restifo 1999.Cancer therapy using aself-replicating RNA vaccine.Nature Medicine.5823-7.
34.Zhou，X.，P.Bergland，G.Rhodes，S.E.Parker，M.Jondal，and P.Liljestrm 1994.Self-replicating Semliki Forest virus RNA as recombinantvaccine.Vaccine.121510-1514.
35.Kurth，R.1995.Risk potential of the chromosomal insertion offoreign DNA.Ann.N.Y.Acad.of Sci.772140-51.
36.Manuguerra，J.C.and C.Hannoun 1999.Influenza and otherViral Respiratory Diseases，surveillance and laboratorv diagnosis.Edited bythe Institut Pasteur.ISBN 2-901320-28-7.
37.Hoerr，I.，R.Obst，H.G.Rammensee，and G.Jung 2000.In vivoapplication of RNA leads to induction of specific cytotoxic T lymphocytesand antibodies.Eur.J.Immunol.301-7.
38.Hinton.T.M.and B.S.Crabb 2001.The novel picomavirusEquine rhinitis B virus contains a strong type II internal ribosomal entry sitewhich functions similarly to that of Encephalomyocarditis virus.J.Gen.Virol.822257-69.
39.Yokoyama，M.J.Zhang，and J.L.Whitton 1995.DNAimmunization confers protection against lethallymphocytic choriomeningitisvirus infection.J.Virol.692684-88.
40.Rodriguez，F(xiàn).L.L.An，S.Harkins，J.Zhang，M.Yokouama，G.Widera，J.T.Fuller，C.Kincaid，I.L.Campbell，and J.L.Whitton 1998.DNAimmunization with minigeneslow frequency of memory cytotoxic Tlymphocytes and inefficient antiviral protection are rectified by ubiquitination.J.Virol.725174-81.
序列表<110>巴斯德研究院<120>用于生產(chǎn)異源性蛋白的、衍生自正鏈RNA病毒基因組的復制子<130>SF226PCT102<140>
<141>
<150>美國臨時申請N？0/292,515<151>2001-05-23<160>28<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>1gagctcgag9<210>2<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>2tcgaggctag ctt13<210>3<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>3cgaagctagc c 11<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>4gctgagctca tggtgagcaa gggcgaggag c 31
<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>5gcagagctcc ttgtacagct cgtccatgcc g31<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>6tctccacagg tgtccactcc 20<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>7cacatcctgg ggtccattcc ggtgcgaac 29<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>8accggaatgg accccaggat gtgctctctg 30<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>9gtcccatcga gtgcggctac 20<210>10<211>36<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>10cggaattctc gagatggcgt ctcaaggcac caaacg 36<210>11<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>11gcgaattctc gagattgtcg tactcctctg cattgtc 37<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>12cggaattctc gagatgtcct tgtctaagga agttaag 37<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>13gcgaattctc gagtgtcaca acatttgggc ctc 33<210>14<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>14tcgaagctag cgaaagaccc caagcttcag gtgtgtatat gggtaatttg acac54<210>15<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述質(zhì)粒
<400>15tcgagtgtca aattacccat atacacacct gaagcttggg gtctttcgct agct 54<210>16<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<4 00>16tcgaggctag ccagctttga attttgacct tcttaagctt gcgggagacg tcgagtccaa 60ccctgggccc t 71<210>17<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>17tcgaagggcc cagggttgga ctcgacgtct cccgcaagct taagaaggtc aaaattcaac 60agctggctag cc 72<210>18<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>18cgagcatg 8<210>19<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>19ctagcatgct cgagct 16<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>20ctggatccaa aatgaaggca aacct 25
<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>21caggatccta gatgcatatt ctgcactg 28<210>22<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>22gaaaggcaaa cctactggtc ctgtt 25<210>23<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>23cgtgcagtcg acaggatgca tattctgcac tgcaaag 37<210>24<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>24Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met1 5<210>25<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽<400>25Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met1 5
<210>26<211>8017<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述質(zhì)粒<400>26tttgaaagcc gggggtggga gatccggatt gccggtccgc tcgatatcgc gggccgggtc60cgtgactacc cactccccct ttcaacgtga aggctacgat agtgccaggg cgggtcctgc120cgaaagtgcc aacccaaaac cacataaccc cccccccccc tccccccccc ctcacattac180tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtctgtc tatatgttac ttctactaca240ttgtcgtctg tgacgatgta ggggcccgga acctggtcct gtcttcttga cgagtattcc300taggggtctt tcccctctcg acaaaggaat acaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc360agttcctctg gacgcttctt gaagacaagc aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg420gaatccccca cctggtgaca ggtgcctctg cggccgaaag ccacgtgtgt aagacacacc480tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgcgttgg atagttgtgg aaagagtcaa540atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccactg600gctgggatct gatctggggc ctcggtgcgc gtgctttaca cgcgttgagt cgaggttaaa660aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaacc acgacaataa720tatggctaca accatggagc tcgagaatac agaggagatg gagaatttat cagaccgagt780gtctcaagac actgccggca acacggtcac aaacacccaa tcaaccgttg gtcgtcttgt840cggatacgga acagttcatg atggggaaca tccattcgaa acacattatg caggatactt900ttcagatctt ttgatccacg atgtcgagac caatcccggg cctttcacgt ttaaaccaag960acaacggccg gtttttcaga ctcaaggagc ggcagtgtca tcaatggctc aaaccctact1020gccgaacgac ttggccagca aagctatggg atcagccttt acggctttgc tcgatgccaa1080cgaggacgcc caaaaagcaa tgaagattat aaagacgtta agttctctat cggatgcatg1140ggaaaatgta aaaggaacat tgaacaaccc ggagttctgg aaacaactct taagcagatg1200tgtgcaactg attgccggga tgacgatagc agtgatgcat ccggacccct tgacgctgct1260ttgcttggga gtcttgacag cagcagagat cacaagccag acaagcctgt gcgaagaaat1320agcagctaaa ttcaaaacaa tcttcactac tcccccccct cgttttcctg tgatctcact1380tttccaacag cagtcccccc ttaaacaggt caatgatgtt ttctctctgg caaagaacct1440agactgggca gtgaagacag ttgaaaaagt ggttgattgg tttggaactt gggttgcaca1500agaagagaga gagcagaccc tggatcagct gctccagcga ttccccgagc acgcgaagag1560gatttcagac cttcgtaatg gaatggctgc ctatgttgaa tgcaaggaga gcttcgattt1620ctttgagaaa ctttacaatc aagcagttaa ggagaagaga actggaattg ctgccgtttg1680tgaaaagttc agacaaaaac atgaccatgc cacggcacga tgtgaaccag ttgtgatcgt1740gttgcgcggt gatgctggtc agggaaagtc attgtcaagt caaatcattg cccaggctgt1800ttctaaaact atttttgggc gccagtcagt ctattctctt cctcctgatt cagatttctt1860tgatggctat gagaaccagt ttgccgcaat aatggatgat ttgggacaaa atcccgatgg1920ttcagatttt accaccttct gccagatggt gtccacgaca aacttactcc caaacatggc1980tagtctggag agaaaaggaa cccccttcac atctcagctc gtagtggcta cgacaaatct2040cccggagttt agacctgtta caattgccca ttatcctgct gttgagcgcc gcattacttt2100cgactactcg gtgtctgcag gtccagtttg ttcaaagacc gaagctggtt gcaaagtgtt2160ggatgttgaa agagccttta ggccaacagg tgatgcccct cttccatgtt tccaaaataa2220ttgcctattc ttggaaaagg ctggcctgca gttcagagat aataggtcca aggagatttt2280atctttggtt gatgtgatcg agagagctgt gactagaata gagaggaaga agaaagtcct2340cacagcggtg cagacccttg tggcccaagg gcctgttgat gaagttagct tttactcggt2400tgtccagcag ctcaaggcta gacaggaagc tacagatgag cagttggagg aactccagga2460agcctttgcc cgggttcagg agcggagttc agtgttctca gactggatga agatttccgc2520catgctttgt gccgccaccc tagctctcac acaagtggtg aagatggcta aggctgtcaa2580acagatggtg agaccagact tggtgcgggt ccagctggat gagcaagaac agggtcctta2640taacgaaacc acccgtataa agcccaaaac tcttcaattg ctagatgtcc agggtccaaa2700tccgactatg gactttgaaa agtttgttgc taagtttgtt acagccccca ttggttttgt2760gtaccccaca ggtgttagca ctcagacatg cctacttgtg aagggacgta ccctggcggt2820gaatcggcac atggcagagt ctgactggac ctccattgta gtgcgtggtg ttagccacac2880ccgctcctca gtgaaaatta tcgccatagc caaagctggg aaggagactg atgtgtcgtt2940cattcgcctt tcatctggtc ccttgtttag agataatact agcaagtttg tgaaggccag3000tgacgtattg ccccatagct cttcccccct tattgggatc atgaatgtgg acattccaat3060gatgtataca gggacatttc tgaaggctgg cgtctcggtg ccggttgaga cagggcagac3120tttcaaccac tgcatccact acaaagcaaa tacacggaaa ggctggtgtg ggtctgcaat3180cctggccgat cttggtggga gcaagaagat tctgggcttc cattcagccg gctccatggg3240cgttgcagcc gcgtcgataa tttcacaaga aatgatcgat gcggtggtgc aggccttcga 3300gccccagggt gcacttgagc ggctgccaga tggtccgcgc atccatgtac cccgaaagac3360
tgctttgcgc ccgactgttg ccagacaggt cttccaaccc gcttttgccc cagctgttct 3420ttctaaattt gacccacgca cggatgctga tgttgacgaa gtagcttttt caaaacatac 3480atccaatcag gaaaccctcc ccccagtgtt tagaatggtt gctagggaat atgcgaacag 3540agtattcgca ctgttgggca gagacaatgg aaggctgtca gtcaagcaag ccttggatgg 3600acttgagggg atggacccta tggacaagaa cacttcccca ggccttccat atactacgct 3660aggaatgcgt agaacagatg ttgtagattg ggaaaccgcc actcttatcc cctttgcagc 3720agagagacta gaaaaaatga ataacaaaga cttttccgac attgtctatc agacattcct 3780caaggacgag cttagaccta tagagaaggt acaagccgcc aagacacgga ttgtggatgt 3840tccaccattt gagcactgca ttctgggtag acaactgctc gggaagttcg cttccaaatt 3900ccagacccaa ccgggtctgg aattgggctc tgcaattggg tgtgacccag acgtgcattg 3960gacagccttt ggtgtggcaa tgcaaggctt tgaaagggtg tatgatgtgg attattccaa 4020ttttgattct acccattcag tagctatatt taggttattg gcagaggaat tcttttctga 4080agagaatggc ttcgacccat tggttaagga ttatcttgag tccttagcca tttcaaaaca 4140tgcgtatgag gaaaagcgct atctcataac cggtggtctt ccgtctggtt gtgcagcgac 4200ctcaatgtta aatacaataa tgaataatat tattattagg gccggtttgt atcttacata 4260taaaaatttt gagtttgatg acgtgaaggt cttgtcttat ggtgatgatc ttctagtggc 4320aactaattac caattgaact ttgatagagt gagaacaagc ctggcaaaga caggatataa 4380gattacaccc gctaacaaaa cttctacctt tcccctggaa tcaactcttg aggatgtagt 4440attcctgaag agaaaattta agaaagaggg ccctctatat cgacctgtca tgaatagaga 4500ggcgttagaa gcaatgttgt catattatcg tccagggact ctatctgaga aactcacttc 4560aatcactatg cttgccgtgc attctggcaa acaggagtac gatcgactct ttgccccgtt 4620tcgcgaggtt ggagtgatcg taccaacttt tgagagtgtg gagtacagat ggaggagcct 4680gttctggtaa tagcgcggtc actggcacaa cgcgttaccc ggtaagccaa ccgggtgtac 4740acggtcgtca taccgcagac agggttcttc tactttgcaa gataaactag agtagtaaaa 4800taaatagttt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacgggat cctctagagt cgacctgcag 4860gcatgcaagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattccg agcttggcgt aatcatggtc 4920atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 4980aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 5040gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 5100ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 5160ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 5220acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 5280aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 5340tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 5400aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 5460gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 5520acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 5580accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 5640ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 5700gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 5760gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 5820ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 5880gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 5940cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 6000cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 6060gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 6120tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 6180gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 6240agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 6300tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 6360agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 6420gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 6480catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 6540ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 6600atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 6660tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 6720cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 6780cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 6840atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 6900aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 6960ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 7020aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga 7080aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct 7140cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 7200agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 7260
tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca 7320ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggaaatt 7380gtaaacgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt 7440aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg 7500ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc 7560aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc accctaatca 7620agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga 7680tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa 7740ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc 7800gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcgcgccatt cgccattcag gctgcgcaac 7860tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga 7920tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa 7980acgacggcca gtgaattgta atacgactca ctatagg 8017<210>27<211>8092<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述質(zhì)粒<400>27tttgaaagcc gggggtggga gatccggatt gccggtccgc tcgatatcgc gggccgggtc 60cgtgactacc cactccccct ttcaacgtga aggctacgat agtgccaggg cgggtcctgc 120cgaaagtgcc aacccaaaac cacataaccc cccccccccc tccccccccc ctcacattac 180tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtctgtc tatatgttac ttctactaca 240ttgtcgtctg tgacgatgta ggggcccgga acctggtcct gtcttcttga cgagtattcc 300taggggtctt tcccctctcg acaaaggaat acaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc 360agttcctctg gacgcttctt gaagacaagc aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg 420gaatccccca cctggtgaca ggtgcctctg cggccgaaag ccacgtgtgt aagacacacc 480tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgcgttgg atagttgtgg aaagagtcaa 540atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccactg 600gctgggatct gatctggggc ctcggtgcgc gtgctttaca cgcgttgagt cgaggttaaa 660aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaacc acgacaataa 720tatggctaca accatggagc tcgagcatgc tagccagctg ttgaattttg accttcttaa 780gcttgcggga gacgtcgagt ccaaccctgg gcccttcgag aatacagagg agatggagaa 840tttatcagac cgagtgtctc aagacactgc cggcaacacg gtcacaaaca cccaatcaac 900cgttggtcgt cttgtcggat acggaacagt tcatgatggg gaacatccat tcgaaacaca 960ttatgcagga tacttttcag atcttttgat ccacgatgtc gagaccaatc ccgggccttt 1020cacgtttaaa ccaagacaac ggccggtttt tcagactcaa ggagcggcag tgtcatcaat 1080ggctcaaacc ctactgccga acgacttggc cagcaaagct atgggatcag cctttacggc 1140tttgctcgat gccaacgagg acgcccaaaa agcaatgaag attataaaga cgttaagttc 1200tctatcggat gcatgggaaa atgtaaaagg aacattgaac aacccggagt tctggaaaca 1260actcttaagc agatgtgtgc aactgattgc cgggatgacg atagcagtga tgcatccgga 1320ccccttgacg ctgctttgct tgggagtctt gacagcagca gagatcacaa gccagacaag 1380cctgtgcgaa gaaatagcag ctaaattcaa aacaatcttc actactcccc cccctcgttt 1440tcctgtgatc tcacttttcc aacagcagtc cccccttaaa caggtcaatg atgttttctc 1500tctggcaaag aacctagact gggcagtgaa gacagttgaa aaagtggttg attggtttgg 1560aacttgggtt gcacaagaag agagagagca gaccctggat cagctgctcc agcgattccc 1620cgagcacgcg aagaggattt cagaccttcg taatggaatg gctgcctatg ttgaatgcaa 1680ggagagcttc gatttctttg agaaacttta caatcaagca gttaaggaga agagaactgg 1740aattgctgcc gtttgtgaaa agttcagaca aaaacatgac catgccacgg cacgatgtga 1800accagttgtg atcgtgttgc gcggtgatgc tggtcaggga aagtcattgt caagtcaaat 1860cattgcccag gctgtttcta aaactatttt tgggcgccag tcagtctatt ctcttcctcc 1920tgattcagat ttctttgatg gctatgagaa ccagtttgcc gcaataatgg atgatttggg 1980acaaaatccc gatggttcag attttaccac cttctgccag atggtgtcca cgacaaactt 2040actcccaaac atggctagtc tggagagaaa aggaaccccc ttcacatctc agctcgtagt 2100ggctacgaca aatctcccgg agtttagacc tgttacaatt gcccattatc ctgctgttga 2160gcgccgcatt actttcgact actcggtgtc tgcaggtcca gtttgttcaa agaccgaagc 2220tggttgcaaa gtgttggatg ttgaaagagc ctttaggcca acaggtgatg cccctcttcc 2280atgtttccaa aataattgcc tattcttgga aaaggctggc ctgcagttca gagataatag 2340gtccaaggag attttatctt tggttgatgt gatcgagaga gctgtgacta gaatagagag 2400gaagaagaaa gtcctcacag cggtgcagac ccttgtggcc caagggcctg ttgatgaagt 2460
tagcttttac tcggttgtcc agcagctcaa ggctagacag gaagctacag atgagcagtt2520ggaggaactc caggaagcct ttgcccgggt tcaggagcgg agttcagtgt tctcagactg2580gatgaagatt tccgccatgc tttgtgccgc caccctagct ctcacacaag tggtgaagat2640ggctaaggct gtcaaacaga tggtgagacc agacttggtg cgggtccagc tggatgagca2700agaacagggt ccttataacg aaaccacccg tataaagccc aaaactcttc aattgctaga2760tgtccagggt ccaaatccga ctatggactt tgaaaagttt gttgctaagt ttgttacagc2820ccccattggt tttgtgtacc ccacaggtgt tagcactcag acatgcctac ttgtgaaggg2880acgtaccctg gcggtgaatc ggcacatggc agagtctgac tggacctcca ttgtagtgcg2940tggtgttagc cacacccgct cctcagtgaa aattatcgcc atagccaaag ctgggaagga3000gactgatgtg tcgttcattc gcctttcatc tggtcccttg tttagagata atactagcaa3060gtttgtgaag gccagtgacg tattgcccca tagctcttcc ccccttattg ggatcatgaa3120tgtggacatt ccaatgatgt atacagggac atttctgaag gctggcgtct cggtgccggt3180tgagacaggg cagactttca accactgcat ccactacaaa gcaaatacac ggaaaggctg3240gtgtgggtct gcaatcctgg ccgatcttgg tgggagcaag aagattctgg gcttccattc3300agccggctcc atgggcgttg cagccgcgtc gataatttca caagaaatga tcgatgcggt3360ggtgcaggcc ttcgagcccc agggtgcact tgagcggctg ccagatggtc cgcgcatcca3420tgtaccccga aagactgctt tgcgcccgac tgttgccaga caggtcttcc aacccgcttt3480tgccccagct gttctttcta aatttgaccc acgcacggat gctgatgttg acgaagtagc3540tttttcaaaa catacatcca atcaggaaac cctcccccca gtgtttagaa tggttgctag3600ggaatatgcg aacagagtat tcgcactgtt gggcagagac aatggaaggc tgtcagtcaa3660gcaagccttg gatggacttg aggggatgga ccctatggac aagaacactt ccccaggcct3720tccatatact acgctaggaa tgcgtagaac agatgttgta gattgggaaa ccgccactct3780tatccccttt gcagcagaga gactagaaaa aatgaataac aaagactttt ccgacattgt3840ctatcagaca ttcctcaagg acgagcttag acctatagag aaggtacaag ccgccaagac3900acggattgtg gatgttccac catttgagca ctgcattctg ggtagacaac tgctcgggaa3960gttcgcttcc aaattccaga cccaaccggg tctggaattg ggctctgcaa ttgggtgtga4020cccagacgtg cattggacag cctttggtgt ggcaatgcaa ggctttgaaa gggtgtatga4080tgtggattat tccaattttg attctaccca ttcagtagct atatttaggt tattggcaga4140ggaattcttt tctgaagaga atggcttcga cccattggtt aaggattatc ttgagtcctt4200agccatttca aaacatgcgt atgaggaaaa gcgctatctc ataaccggtg gtcttccgtc4260tggttgtgca gcgacctcaa tgttaaatac aataatgaat aatattatta ttagggccgg4320tttgtatctt acatataaaa attttgagtt tgatgacgtg aaggtcttgt cttatggtga4380tgatcttcta gtggcaacta attaccaatt gaactttgat agagtgagaa caagcctggc4440aaagacagga tataagatta cacccgctaa caaaacttct acctttcccc tggaatcaac4500tcttgaggat gtagtattcc tgaagagaaa atttaagaaa gagggccctc tatatcgacc4560tgtcatgaat agagaggcgt tagaagcaat gttgtcatat tatcgtccag ggactctatc4620tgagaaactc acttcaatca ctatgcttgc cgtgcattct ggcaaacagg agtacgatcg4680actctttgcc ccgtttcgcg aggttggagt gatcgtacca acttttgaga gtgtggagta4740cagatggagg agcctgttct ggtaatagcg cggtcactgg cacaacgcgt tacccggtaa4800gccaaccggg tgtacacggt cgtcataccg cagacagggt tcttctactt tgcaagataa4860actagagtag taaaataaat agttttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac gggatcctct4920agagtcgacc tgcaggcatg caagcttttg ttccctttag tgagggttaa ttccgagctt4980ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca5040caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact5100cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct5160gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc5220ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca5280ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg5340agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca5400taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa5460cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc5520tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc5580gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct5640gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg5700tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag5760gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta5820cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg5880aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt5940tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt6000ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag6060attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat6120ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc6180tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat6240aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc6300acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag6360
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 6420agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 6480ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 6540agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 6600tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 6660tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 6720attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 6780taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 6840aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 6900caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 6960gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 7020cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 7080tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 7140acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 7200gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 7260cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 7320cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat 7380tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata 7440ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 7500atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 7560tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 7620gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 7680ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 7740aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 7800gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 7860gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtcgcg ccattcgcca 7920ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag 7980ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag 8040tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gg 8092<210>28<211>10417<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述質(zhì)粒<400>28tttgaaagcc gggggtggga gatccggatt gccggtccgc tcgatatcgc gggccgggtc 60cgtgactacc cactccccct ttcaacgtga aggctacgat agtgccaggg cgggtcctgc 120cgaaagtgcc aacccaaaac cacataaccc cccccccccc tccccccccc ctcacattac 180tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtctgtc tatatgttac ttctactaca 240ttgtcgtctg tgacgatgta ggggcccgga acctggtcct gtcttcttga cgagtattcc 300taggggtctt tcccctctcg acaaaggaat acaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc 360agttcctctg gacgcttctt gaagacaagc aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg 420gaatccccca cctggtgaca ggtgcctctg cggccgaaag ccacgtgtgt aagacacacc 480tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgcgttgg atagttgtgg aaagagtcaa 540atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccactg 600gctgggatct gatctggggc ctcggtgcgc gtgctttaca cgcgttgagt cgaggttaaa 660aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaacc acgacaataa 720tatggctaca accatggagc tcatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt 780gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga 840gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa 900gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag 960ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta 1020cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt 1080gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga 1140ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat 1200catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga 1260ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc 1320cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa 1380cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg 1440catggacgag ctgtacaagg agctcgagat gtccttgtct aaggaagtta agagcttcca 1500
atggacgcaa gcattgagaa gagaattgca gagcttcaca tcagatgtga aggctgctgt 1560cattaaggat gcaaccaacc ttctgaatgg gttggacttc tctgaggtca gcaatgttca 1620gaggatcatg aggaaggaaa agagagatga caaagaccta cagagactca gaagtctcaa 1680ccagactgta cattctcttg tggatttaaa gtcaacatca aagaagaatg ttttgaaagt 1740ggggaggctc agtgcagaag aactgatgtc tcttgcggct gaccttgaga agctgaaggc 1800caagatcatg aggtctgaaa ggccccaggc ttcaggggta tatatgggga acttaacaac 1860acagcaacta gaccaaagat ctcagatcct acagatagtt gggatgagaa agcctcagca 1920gggtgcaagt ggtgtggtaa gagtttggga tgtgaaagac tcatcacttt tgaacaatca 1980atttggcaca atgccaagtc taactatggc ttgtatggcc aaacagtcac agactccgct 2040caatgacgtt gtacaagcgc tcacagacct tggcttgctt tacacagtca agtatccaaa 2100tcttaatgat cttgaaaggc tgaaagacaa gcacccagtt ctgggggtca tcactgaaca 2160gcagtccagc atcaacattt ctggctataa ctttagtctt ggtgctgccg tgaaggcagg 2220ggcagccctg ttggatgggg gtaacatgtt agagtcaatt ttgatcaagc caagcaacag 2280cgaggacctc ttgaaggcag ttctcggggc caagagaaaa ctcaacatgt ttgtttcaga 2340ccaagttggg gacaggaacc cttatgaaaa catcctctat aaagtttgcc tttcaggtga 2400aggatggcca tacatagctt gtagaacatc gattgtgggg agagcatggg aaaacacaac 2460aattgatctc acaagcgaga aacctgcagt caactcaccc aggccagcgc ctggagcagc 2520aggtccacct caggtgggct taagctacag ccagacaatg cttttaaaag acctcatggg 2580aggaattgac cccaacgctc ctacatggat tgacattgag ggtagattta atgatccagt 2640ggaaatagca attttccaac cacagaacgg gcagttcata cacttttaca gggaacccgt 2700tgatcaaaaa caattcaagc aagattccaa gtactcacac ggcatggatc ttgccgacct 2760cttcaatgcg caacccgggt tgacctcgtc agttataggt gctcttccgc aggggatggt 2820tctaagctgt caaggctccg atgacatcag aaagcttctg gactcacaaa ataggaagga 2880cattaagctt atcgatgttg aaatgaccag ggaagcttcg agggagtatg aagacaaagt 2940gtgggacaaa tatggctggt tgtgtaagat gcatactgga atagtaaggg acaaaaagaa 3000gaaagagatc accccgcact gtgcactcat ggactgcatc atttttgaaa gcgcctccaa 3060agcaaggctc ccagatctga aaactgttca caacattctg ccacatgacc taatttttag 3120aggcccaaat gttgtgacac tcgagaatac agaggagatg gagaatttat cagaccgagt 3180gtctcaagac actgccggca acacggtcac aaacacccaa tcaaccgttg gtcgtcttgt 3240cggatacgga acagttcatg atggggaaca tccattcgaa acacattatg caggatactt 3300ttcagatctt ttgatccacg atgtcgagac caatcccggg cctttcacgt ttaaaccaag 3360acaacggccg gtttttcaga ctcaaggagc ggcagtgtca tcaatggctc aaaccctact 3420gccgaacgac ttggccagca aagctatggg atcagccttt acggctttgc tcgatgccaa 3480cgaggacgcc caaaaagcaa tgaagattat aaagacgtta agttctctat cggatgcatg 3540ggaaaatgta aaaggaacat tgaacaaccc ggagttctgg aaacaactct taagcagatg 3600tgtgcaactg attgccggga tgacgatagc agtgatgcat ccggacccct tgacgctgct 3660ttgcttggga gtcttgacag cagcagagat cacaagccag acaagcctgt gcgaagaaat 3720agcagctaaa ttcaaaacaa tcttcactac tcccccccct cgttttcctg tgatctcact 3780tttccaacag cagtcccccc ttaaacaggt caatgatgtt ttctctctgg caaagaacct 3840agactgggca gtgaagacag ttgaaaaagt ggttgattgg tttggaactt gggttgcaca 3900agaagagaga gagcagaccc tggatcagct gctccagcga ttccccgagc acgcgaagag 3960gatttcagac cttcgtaatg gaatggctgc ctatgttgaa tgcaaggaga gcttcgattt 4020ctttgagaaa ctttacaatc aagcagttaa ggagaagaga actggaattg ctgccgtttg 4080tgaaaagttc agacaaaaac atgaccatgc cacggcacga tgtgaaccag ttgtgatcgt 4140gttgcgcggt gatgctggtc agggaaagtc attgtcaagt caaatcattg cccaggctgt 4200ttctaaaact atttttgggc gccagtcagt ctattctctt cctcctgatt cagatttctt 4260tgatggctat gagaaccagt ttgccgcaat aatggatgat ttgggacaaa atcccgatgg 4320ttcagatttt accaccttct gccagatggt gtccacgaca aacttactcc caaacatggc 4380tagtctggag agaaaaggaa cccccttcac atctcagctc gtagtggcta cgacaaatct 4440cccggagttt agacctgtta caattgccca ttatcctgct gttgagcgcc gcattacttt 4500cgactactcg gtgtctgcag gtccagtttg ttcaaagacc gaagctggtt gcaaagtgtt 4560ggatgttgaa agagccttta ggccaacagg tgatgcccct cttccatgtt tccaaaataa 4620ttgcctattc ttggaaaagg ctggcctgca gttcagagat aataggtcca aggagatttt 4680atctttggtt gatgtgatcg agagagctgt gactagaata gagaggaaga agaaagtcct 4740cacagcggtg cagacccttg tggcccaagg gcctgttgat gaagttagct tttactcggt 4800tgtccagcag ctcaaggcta gacaggaagc tacagatgag cagttggagg aactccagga 4860agcctttgcc cgggttcagg agcggagttc agtgttctca gactggatga agatttccgc 4920catgctttgt gccgccaccc tagctctcac acaagtggtg aagatggcta aggctgtcaa 4980acagatggtg agaccagact tggtgcgggt ccagctggat gagcaagaac agggtcctta 5040taacgaaacc acccgtataa agcccaaaac tcttcaattg ctagatgtcc agggtccaaa 5100tccgactatg gactttgaaa agtttgttgc taagtttgtt acagccccca ttggttttgt 5160gtaccccaca ggtgttagca ctcagacatg cctacttgtg aagggacgta ccctggcggt 5220gaatcggcac atggcagagt ctgactggac ctccattgta gtgcgtggtg ttagccacac 5280ccgctcctca gtgaaaatta tcgccatagc caaagctggg aaggagactg atgtgtcgtt 5340cattcgcctt tcatctggtc ccttgtttag agataatact agcaagtttg tgaaggccag 5400
tgacgtattg ccccatagct cttcccccct tattgggatc atgaatgtgg acattccaat 5460gatgtataca gggacatttc tgaaggctgg cgtctcggtg ccggttgaga cagggcagac 5520tttcaaccac tgcatccact acaaagcaaa tacacggaaa ggctggtgtg ggtctgcaat 5580cctggccgat cttggtggga gcaagaagat tctgggcttc cattcagccg gctccatggg 5640cgttgcagcc gcgtcgataa tttcacaaga aatgatcgat gcggtggtgc aggccttcga 5700gccccagggt gcacttgagc ggctgccaga tggtccgcgc atccatgtac cccgaaagac 5760tgctttgcgc ccgactgttg ccagacaggt cttccaaccc gcttttgccc cagctgttct 5820ttctaaattt gacccacgca cggatgctga tgttgacgaa gtagcttttt caaaacatac 5880atccaatcag gaaaccctcc ccccagtgtt tagaatggtt gctagggaat atgcgaacag 5940agtattcgca ctgttgggca gagacaatgg aaggctgtca gtcaagcaag ccttggatgg 6000acttgagggg atggacccta tggacaagaa cacttcccca ggccttccat atactacgct 6060aggaatgcgt agaacagatg ttgtagattg ggaaaccgcc actcttatcc cctttgcagc 6120agagagacta gaaaaaatga ataacaaaga cttttccgac attgtctatc agacattcct 6180caaggacgag cttagaccta tagagaaggt acaagccgcc aagacacgga ttgtggatgt 6240tccaccattt gagcactgca ttctgggtag acaactgctc gggaagttcg cttccaaatt 6300ccagacccaa ccgggtctgg aattgggctc tgcaattggg tgtgacccag acgtgcattg 6360gacagccttt ggtgtggcaa tgcaaggctt tgaaagggtg tatgatgtgg attattccaa 6420ttttgattct acccattcag tagctatatt taggttattg gcagaggaat tcttttctga 6480agagaatggc ttcgacccat tggttaagga ttatcttgag tccttagcca tttcaaaaca 6540tgcgtatgag gaaaagcgct atctcataac cggtggtctt ccgtctggtt gtgcagcgac 6600ctcaatgtta aatacaataa tgaataatat tattattagg gccggtttgt atcttacata 6660taaaaatttt gagtttgatg acgtgaaggt cttgtcttat ggtgatgatc ttctagtggc 6720aactaattac caattgaact ttgatagagt gagaacaagc ctggcaaaga caggatataa 6780gattacaccc gctaacaaaa cttctacctt tcccctggaa tcaactcttg aggatgtagt 6840attcctgaag agaaaattta agaaagaggg ccctctatat cgacctgtca tgaatagaga 6900ggcgttagaa gcaatgttgt catattatcg tccagggact ctatctgaga aactcacttc 6960aatcactatg cttgccgtgc attctggcaa acaggagtac gatcgactct ttgccccgtt 7020tcgcgaggtt ggagtgatcg taccaacttt tgagagtgtg gagtacagat ggaggagcct 7080gttctggtaa tagcgcggtc actggcacaa cgcgttaccc ggtaagccaa ccgggtgtac 7140acggtcgtca taccgcagac agggttcttc tactttgcaa gataaactag agtagtaaaa 7200taaatagttt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacgggat cctctagagt cgacctgcag 7260gcatgcaagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattccg agcttggcgt aatcatggtc 7320atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 7380aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 7440gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 7500ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 7560ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 7620acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 7680aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 7740tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 7800aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 7860gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 7920acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 7980accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 8040ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 8100gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 8160gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 8220ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 8280gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 8340cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 8400cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 8460gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 8520tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 8580gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 8640agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 8700tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 8760agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 8820gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 8880catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 8940ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 9000atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 9060tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 9120cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 9180cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 9240atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 9300
aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 9360ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 9420aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga 9480aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct 9540cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 9600agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 9660tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca 9720ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggaaatt 9780gtaaacgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt 9840aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg 9900ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc 9960aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc accctaatca 10020agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga 10080tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa 10140ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc 10200gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcgcgccatt cgccattcag gctgcgcaac 10260tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga 10320tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa 10380acgacggcca gtgaattgta atacgactca ctatagg 1041權(quán)利要求
1.一種RNA病毒的病毒基因組的自我復制重組正鏈RNA分子，其中所述RNA分子包含a)編碼該RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的RNA序列；b)病毒復制所必需的病毒非編碼RNA序列；以及c)編碼一異源性蛋白或異源性蛋白片段的RNA序列。
2.一種RNA病毒的病毒基因組的自我復制重組正鏈RNA分子，其中所述RNA分子包含(a)編碼該RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的RNA序列；(b)病毒復制所必需的病毒非編碼RNA序列，其中a)中的RNA序列和/或b)中的病毒非編碼RNA序列為突變或截斷的形式，以及(c)編碼一異源性蛋白或異源性蛋白片段的RNA序列。
3.權(quán)利要求1或2的自我復制重組正鏈RNA分子，其中的RNA病毒屬于心肌炎病毒屬或口瘡病毒屬。
4.權(quán)利要求3的自我復制重組正鏈RNA分子，其中的RNA病毒為門戈病毒。
5.權(quán)利要求4的自我復制重組正鏈RNA分子，其進一步包含門戈病毒VP2基因的順式作用復制元件(CRE)。
6.權(quán)利要求4的自我復制重組正鏈RNA分子，其進一步包含泰累爾病毒VP2基因的順式作用復制元件(CRE)。
7.權(quán)利要求1至6中任一項的自我復制重組正鏈RNA分子，其中所述的異源性蛋白選自生物活性蛋白、報告蛋白、細胞毒性蛋白、病原體蛋白或腫瘤蛋白。
8.權(quán)利要求7的自我復制重組正鏈RNA分子，其中所述的報告蛋白為綠色熒光蛋白。
9.權(quán)利要求7的自我復制重組正鏈RNA分子，其中所述的病原體蛋白為流感病毒核蛋白或流感病毒紅細胞凝集素。
10.權(quán)利要求1至6中任一項的自我復制重組正鏈RNA分子，其中所述的異源性蛋白片段為一抗原或所述異源性蛋白的表位。
11.一種疫苗，其包含至少一種權(quán)利要求1至7及9至10中任一項的自我復制重組正鏈RNA分子及一種藥用可接受的載體。
12.權(quán)利要求11的疫苗，其中所述的自我復制重組正鏈RNA分子為裸RNA。
13.權(quán)利要求11的疫苗，其中所述的自我復制重組正鏈RNA分子為衣殼化的。
14.權(quán)利要求11至13中任一項的疫苗，其中所述的藥用可接受的載體選自水、石油、動物油、植物油、花生油、豆油、礦物油、芝麻油、生理鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油溶液、聚合陽離子顆粒、蛋白質(zhì)顆粒、魚精蛋白顆粒、脂質(zhì)體和金顆粒。
15.一種在宿主體內(nèi)誘導保護性免疫應答的方法，其包含(a)在藥用可接受的載體中制備至少一種權(quán)利要求1至7及9至10中任一項的自我復制重組正鏈RNA分子；以及(b)用步驟(a)的制劑免疫宿主。
16.權(quán)利要求15的在宿主體內(nèi)誘導免疫應答的方法，其中(a)中的權(quán)利要求1至7及9至10中任一項的自我復制重組正鏈RNA分子制備為裸RNA形式。
17.權(quán)利要求15的在宿主體內(nèi)誘導免疫應答的方法，其中(a)中的權(quán)利要求1至7及9至10中任一項的自我復制重組正鏈RNA分子為衣殼化的RNA。
18.權(quán)利要求15至17中任一項的方法，其中所述的藥用可接受的載體選自水、石油、動物油、植物油、花生油、豆油、礦物油、芝麻油，生理鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油溶液、聚合陽離子顆粒、蛋白質(zhì)顆粒、魚精蛋白顆粒、脂質(zhì)體和金顆粒。
19.權(quán)利要求15至18中任一項的方法，其中所述的宿主為人、豬、狗、貓、牛、雞、小鼠或馬。
20.一種DNA分子，其編碼一種RNA病毒的病毒基因組的自我復制重組正鏈RNA分子，其中所述的RNA分子包含(a)編碼該RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的RNA序列；(b)病毒復制所必需的病毒非編碼RNA序列；以及(c)編碼一異源性蛋白或異源性蛋白片段的RNA序列。
21.一種DNA分子，其編碼一種RNA病毒的病毒基因組的自我復制重組正鏈RNA分子，其中所述的RNA分子包含(a)編碼該RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的RNA序列；(b)病毒復制所必需的病毒非編碼RNA序列；其中a)中的RNA序列和/或b)中的病毒非編碼RNA序列為突變或截斷的形式；以及(c)編碼一異源性蛋白或異源性蛋白片段的RNA序列。
22.權(quán)利要求20或21的DNA分子，其中所述的RNA病毒為心肌炎病毒屬或口瘡病毒屬。
23.權(quán)利要求22的DNA分子，其中所述的RNA病毒為門戈病毒。
24.權(quán)利要求23的DNA分子，其進一步編碼包含門戈病毒VP2基因的順式作用復制元件(CRE)的RNA。
25.權(quán)利要求23的DNA分子，其進一步編碼包含泰累爾病毒VP2基因的順式作用復制元件(CRE)的RNA。
26.權(quán)利要求20至25中任一項的DNA分子，其中所述的異源性蛋白選自生物活性蛋白、報告蛋白、細胞毒性蛋白、病原體蛋白或腫瘤蛋白。
27.權(quán)利要求26的DNA分子，其中所述的報告蛋白為綠色熒光蛋白。
28.權(quán)利要求26的DNA分子，其中所述的病原體蛋白為流感病毒核蛋白或流感病毒紅細胞凝集素。
29.權(quán)利要求26的DNA分子，其中所述的異源性蛋白片段為一抗原或所述異源性蛋白的表位。
30.權(quán)利要求26的DNA分子，其進一步包含一合適的克隆載體。
31.一種DNA分子，其包含SEQ ID NO26的序列(于2001年5月21日保藏于CNCM，巴斯德研究院，28 rue du Docteur Roux，75724 ParisCedex 15，法國，保藏號為I-2668)或其片段，以及可表達形式的、編碼異源性蛋白或異源性蛋白片段的DNA序列。
32.一種DNA分子，其包含突變或截斷的SEQ ID NO26序列(于2001年5月21日保藏于CNCM，巴斯德研究院，28 rue du DocteurRoux，75724 Paris Cedex 15，法國，保藏號為I-2668)或其片段，以及可表達形式的、編碼異源性蛋白或異源性蛋白片段的DNA序列。
33.權(quán)利要求31或32的DNA分子，其中所述的異源性蛋白選自生物活性蛋白、報告蛋白、細胞毒性蛋白、病原體蛋白或腫瘤蛋白。
34.權(quán)利要求33的DNA分子，其中所述的報告蛋白為綠色熒光蛋白。
35.權(quán)利要求33的DNA分子，其中所述的病原體蛋白是流感病毒核蛋白或流感病毒紅細胞凝集素。
36.權(quán)利要求31或32的DNA分子，其中所述的異源性蛋白片段為一抗原或所述異源性蛋白的表位。
37.一種DNA分子，其包含SEQ ID NO27序列(于2001年5月21日保藏于CNCM，巴斯德研究院，28 rue du Docteur Roux，75724 ParisCedex 15，法國，保藏號為I-2669)或其片段，以及編碼異源性蛋白或異源性蛋白片段的DNA序列。
38.一種DNA分子，其包含突變或截斷的SEQ ID NO27序列(于2001年5月21日保藏于CNCM，巴斯德研究院，28 rue du DocteurRoux，75724 Paris Cedex 15，法國，保藏號為I-2669)或其片段，以及可表達形式的、編碼異源性蛋白或異源性蛋白片段的DNA序列。
39.權(quán)利要求37或38的DNA分子，其中所述的異源性蛋白選自生物活性蛋白、報告蛋白、細胞毒性蛋白、病原體蛋白或腫瘤蛋白。
40.權(quán)利要求39的DNA分子，其中所述的病原體蛋白為流感病毒核蛋白或流感病毒紅細胞凝集素。
41.權(quán)利要求37或38的DNA分子，其中所述的異源性蛋白片段為一抗原或所述異源性蛋白的表位。
42.一種在宿主體內(nèi)誘導保護性免疫應答的方法，其包含(a)在藥用可接受的載體中制備至少一種權(quán)利要求20至41中任一項的DNA分子；以及(b)用步驟(a)的制劑免疫宿主。
43.權(quán)利要求42的在宿主體內(nèi)誘導保護性免疫應答的方法，其中所述的DNA分子為裸DNA。
44.權(quán)利要求42的在宿主體內(nèi)誘導保護性免疫應答的方法，其中所述的DNA分子為衣殼化的DNA。
45.一種治療組合物，其包含在一可接受的介質(zhì)內(nèi)的、至少一種權(quán)利要求20至41中任一項的DNA分子或一種權(quán)利要求1至7及9至10中任一項的自我復制重組正鏈RNA分子。
46.一種治療試劑盒，其包含在一可接受的介質(zhì)內(nèi)的、至少一種權(quán)利要求20至41中任一項的DNA分子或一種權(quán)利要求1至7及9至10中任一項的自我復制重組正鏈RNA分子。
47.一種在宿主體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫應答的方法，其包含(a)在一藥用可接受的載體內(nèi)制備至少一種選自權(quán)利要求20至41中任一項的DNA分子和一種權(quán)利要求1至7及9至10中任一項的自我復制重組正鏈RNA分子的分子；以及(b)用步驟(a)的制劑免疫宿主。
48.權(quán)利要求42的方法，其中所述的藥用可接受的載體選自水、石油、動物油、植物油、花生油、豆油、礦物油、芝麻油、生理鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油溶液、聚合陽離子顆粒、蛋白質(zhì)顆粒、魚精蛋白顆粒、脂質(zhì)體和金顆粒。
49.權(quán)利要求42的方法，其中所述的宿主為人、豬、狗、貓、牛、雞、小鼠或馬。
50.用于通過生產(chǎn)一衣殼化的RNA病毒的病毒基因組的自我復制重組正鏈RNA分子而提高RNA病毒的病毒基因組的自我復制重組正鏈RNA分子的免疫原性的方法，其包含(a)將權(quán)利要求1至7及9至10中任一項的自我復制重組正鏈RNA分子或權(quán)利要求20至41中任一項的DNA分子轉(zhuǎn)染入表達衣殼蛋白P1前體的細胞內(nèi)；(b)由該轉(zhuǎn)染的細胞制備衣殼化的自我復制重組正鏈RNA分子；以及(c)用步驟(b)的制劑免疫宿主。
51.用于提高RNA病毒的病毒基因組的自我復制重組正鏈RNA分子的免疫原性的方法，其包含(a)濃縮權(quán)利要求1至7及9至10中任一項的自我復制重組正鏈RNA分子；以及(b)用步驟(a)的濃縮的RNA分子免疫宿主。
52.權(quán)利要求31的DNA分子，其包含SEQ ID NO28的序列(于2002年5月16日保藏于CNCM，巴斯德研究院，28 rue du Docteur Roux，75724Paris Cedex 15，法國，保藏號為I-2879)。
53.權(quán)利要求36或41的DNA分子，其中所述異源性蛋白的表位為淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒核蛋白的NP118-126表位。
全文摘要
本發(fā)明涉及由心肌炎病毒及口瘡病毒基因組衍生的復制子或自我復制RNA分子，其能用于在動物細胞內(nèi)表達異源性蛋白。當以裸RNA形式注射入動物宿主體內(nèi)時，這些復制子能使所編碼異源性蛋白得以翻譯。如果所編碼異源性蛋白為外源性抗原，則這些復制子能誘導針對所編碼異源性蛋白的免疫應答。本發(fā)明使用心肌炎病毒及口瘡病毒基因組構(gòu)建這些復制子。本發(fā)明證實了這些復制子在以裸RNA形式注射時，不需要任何載體或佐劑即能在動物宿主體內(nèi)誘導針對復制子編碼異源性蛋白的免疫應答。
文檔編號C12N15/86GK1575339SQ02810488
公開日2005年2月2日 申請日期2002年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月23日
發(fā)明者尼古拉斯·埃斯克瑞歐, 西爾維·范－德爾－韋夫, 馬爾科·維紐齊, 西爾維·熱爾博 申請人:巴斯德研究院