專利名稱：將外源蛋白遞送到胞質(zhì)溶膠中的方法,及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及將外源蛋白遞送到胞質(zhì)溶膠中的方法，新融合蛋白及其用途。
背景技術(shù)：
很多注意力都集中在產(chǎn)生免疫反應(yīng)方面。對(duì)外源抗原的一種類型的免疫反應(yīng)是產(chǎn)生抗體，通常稱之為體液免疫。第二種形式的免疫反應(yīng)是通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)呈遞抗原產(chǎn)生的。這種類型的免疫反應(yīng)被廣義地稱為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(CMI)，或T細(xì)胞反應(yīng)。盡管這兩種類型的免疫反應(yīng)都是重要的，最近將主要注意力集中在CMI上。在處理諸如由人類免疫缺陷病毒(HIV)導(dǎo)致的AIDS的感染性疾病時(shí)，未能證實(shí)針對(duì)所述病毒及其部分的抗體反應(yīng)足以產(chǎn)生免疫性。類似地，在處理與很多惡性腫瘤相關(guān)的外源蛋白時(shí)，也未能證實(shí)所述抗體反應(yīng)是足夠的。因此，將注意力集中在產(chǎn)生CMI反應(yīng)方面。
為了誘導(dǎo)CMI，必須將一種抗原結(jié)合在APC表面上的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類或II類分子上。I類分子通常將抗原，如內(nèi)源蛋白，所述蛋白來自病毒感染，以及腫瘤抗原呈遞到外面。當(dāng)由宿主I類MHC編碼的分子呈遞病原體來源的(或癌)肽表位(通常8-10個(gè)氨基酸)時(shí)，抗原特異性T細(xì)胞通常能識(shí)別受感染的靶細(xì)胞(7)。所述表位源于被蛋白體裂解成小的肽片段的細(xì)胞質(zhì)蛋白。這些片段隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔中，在這里它們與新合成的MHC-I分子復(fù)合，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，在這里發(fā)生T細(xì)胞識(shí)別(8-13)。細(xì)胞外流體中的抗原(外源抗原)通常不能進(jìn)入大多數(shù)細(xì)胞的這種加工區(qū)室。因此，用疫苗誘導(dǎo)CMI的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是，將外源抗原遞送到胞質(zhì)溶膠內(nèi)，以便由MHC I類分子呈遞。希望能夠制備多種感染性疾病，如HIV，以及癌癥，如前列腺癌，乳腺癌和黑素瘤的疫苗。
例如，越來越多的證據(jù)表明CMI在控制HIV感染方面發(fā)揮重要作用(Ogg等，Science 2792103-6(1998)；Schmitz等，Science 283857-60(1999)；Brodie等，Nat.Med.534-41(1999))。接觸過HIV但是仍然沒有被感染的個(gè)體，通常具有抗病毒CMI，但是沒有抗體反應(yīng)。在形成特異性抗體之前，初次感染的病毒血癥，是通過病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)形成而解決的(Letvin，Science 2801875-96(1998))。以上數(shù)據(jù)表明了CMI在控制HIV感染方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
很多腫瘤與特定蛋白的表達(dá)和/或某些蛋白的過量表達(dá)相關(guān)。例如，前列腺癌與升高水平的蛋白，如前列腺特異性抗原(PSA)相關(guān)。乳腺癌可能與諸如Her-2，Muc-1，CEA之類的蛋白的表達(dá)和/或過量表達(dá)相關(guān)。因此，相當(dāng)大的注意力集中在試圖產(chǎn)生免疫反應(yīng)方面，特別是在治療所述惡性腫瘤時(shí)產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的CMI。
產(chǎn)生針對(duì)傳染性疾病的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的方法包括使用完整的感染劑，例如，通過制備遺傳工程化的失活病毒或使用殺滅的感染劑。另一種方法是亞基疫苗，它能將一種或多種抗原(而不是完整病毒)呈遞給受治對(duì)象。
為了產(chǎn)生CMI，必須將抗原遞送到細(xì)胞內(nèi)部。所述細(xì)胞對(duì)外源蛋白的吸收很差。因此，優(yōu)選方法是使用諸如病毒載體、脂質(zhì)體、裸DNA的方法或類似方法。不過，所述方法具有諸多缺陷。例如，很多重組病毒在反復(fù)施用時(shí)，其本身會(huì)產(chǎn)生抗原性反應(yīng)。由于產(chǎn)生免疫反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)形式通常需要被稱為激發(fā)的起始注射，和被稱為加強(qiáng)的后續(xù)注射，以便獲得滿意的免疫性，這可能是一個(gè)嚴(yán)重問題。另外，盡管大部分注意力一直集中在改善病毒載體的安全性方面，但是總是存在某些危險(xiǎn)。例如，很多目標(biāo)群體，如HIV感染的群體可能具有減弱的免疫系統(tǒng)。因此，在很多個(gè)體中是完全安全的某些病毒載體在上述個(gè)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生某種程度的危險(xiǎn)。將蛋白遞送到細(xì)胞內(nèi)的方法也未能證明像本發(fā)明這樣完全安全。因此，需要新的和簡單的方法將抗原遞送到胞質(zhì)溶膠內(nèi)，以便刺激CMI。
為了產(chǎn)生CMI反應(yīng)，還存在難于測定所述反應(yīng)的技術(shù)問題。
用于檢測細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室測定方法具有嚴(yán)重缺陷，特別是在應(yīng)用于各種臨床設(shè)置中的大規(guī)模疫苗效力試驗(yàn)時(shí)更是這樣，這是因?yàn)槭褂矛F(xiàn)有技術(shù)測定CMI所需要的現(xiàn)有設(shè)備和技術(shù)支持，通常在需要它們的野外設(shè)施中是很少的。人們認(rèn)為CTL在控制HIV-1感染方面起著關(guān)鍵作用，并且設(shè)計(jì)了多種HIV-1疫苗候選物，以便刺激T細(xì)胞反應(yīng)，和中和抗體(1-6)。不過，用于檢測CMI，如HIV-特異性CTL的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法是復(fù)雜的、費(fèi)時(shí)間的、并且通常局限于高度專業(yè)化的設(shè)備。用于檢測T細(xì)胞反應(yīng)的改進(jìn)方法，將會(huì)對(duì)T細(xì)胞依賴性疫苗或免疫治療的開發(fā)產(chǎn)生顯著影響。這種策略有可能被應(yīng)用于其他研究領(lǐng)域，其中，已知CMI反應(yīng)在預(yù)防和控制疾病方面起著重要作用。
體外檢測CMI反應(yīng)的一個(gè)困難是因?yàn)閷?duì)抗原呈遞的特殊需要。如上文所述，將外源蛋白遞送到胞質(zhì)溶膠內(nèi)，以便通過MHC I類分子呈遞給T細(xì)胞是一種重大挑戰(zhàn)。所述I類途徑的物理學(xué)分配一直是在體外檢測T細(xì)胞反應(yīng)的主要障礙。因此，大部分測定CMI的現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室方法，采用活病毒或細(xì)菌載體將抗原遞送到胞質(zhì)溶膠中，其中，諸如痘苗病毒的重組痘病毒是最常使用的。另一種方法是使用源于已知CTL表位的合成肽(10-20個(gè)氨基酸)從外部將MHC-I分子加載到靶細(xì)胞表面上。這種方法在一般臨床應(yīng)用中具有嚴(yán)格限制。諸如重組痘苗病毒的活病毒載體的使用，需要受過訓(xùn)練的和免疫過的實(shí)驗(yàn)室人員，包括最低污染設(shè)施，作為預(yù)防性安全措施。合成肽不僅價(jià)格十分昂貴，而且適合各種群體的多樣性MHC-I分子的“通用”肽特征的設(shè)計(jì)也是極其困難的。因此，開發(fā)測定T細(xì)胞反應(yīng)的測定方法的挑戰(zhàn)是將外源抗原的大片段遞送到胞質(zhì)溶膠內(nèi)，而又不依賴活的重組病毒或細(xì)菌載體。
因此，需要能夠用于體外檢測CMI的試劑盒。特別是可方便地在諸如非洲、印度和亞洲的遙遠(yuǎn)地方使用的試劑盒，在這些地方，有很多建議要檢測大量的疫苗候選物，如抗HIV的疫苗。
現(xiàn)在，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸如炭疽芽孢桿菌的二分蛋白外毒素家族包含可用于將諸如蛋白的外源抗原遞送到胞質(zhì)溶膠中的片段。來自所述蛋白的一種優(yōu)選的蛋白片段，是含有保護(hù)性抗原(PA)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的N-末端部分，而不是會(huì)產(chǎn)生對(duì)所述細(xì)胞的毒性的部分。更優(yōu)選地，所述片段業(yè)已修飾過，以便除去結(jié)合PA的特定結(jié)構(gòu)域。
炭疽芽孢桿菌是動(dòng)物和人類炭疽病的致病劑。由炭疽芽孢桿菌產(chǎn)生的毒素由兩種二分蛋白外毒素，致死毒素(LT)和水腫毒素組成。LT由保護(hù)性抗原(PA)和致死因子(LF)組成，而水腫毒素由PA和水腫因子(EF)組成。三種成分PA，LF和EF中，沒有一種單獨(dú)是有毒性的。不過，一旦組合在一起，水腫毒素能導(dǎo)致水腫，而LT通過在動(dòng)物和人體內(nèi)的系統(tǒng)性休克能導(dǎo)致死亡。與它在形成兩種毒素中的關(guān)鍵作用吻合，業(yè)已將PA確定為抗炭疽病疫苗的保護(hù)性成分。目前對(duì)炭疽毒素作用的分子機(jī)制的假設(shè)如下PA是具有735個(gè)氨基酸的多肽，它通過細(xì)胞受體與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面結(jié)合。一旦結(jié)合之后，通過細(xì)胞蛋白酶將PA裂解成63-kDa的分子而被激活，它在靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜中能形成環(huán)形七聚體(

圖1)(6，7)。所述PA七聚體然后與通過胞吞作用而內(nèi)化的EF或LF結(jié)合。在內(nèi)體酸化之后，PA使得EF或LF能進(jìn)入胞質(zhì)溶膠，推測是通過由所述七聚體的形成的一個(gè)孔進(jìn)入的。在胞質(zhì)溶膠中，EF起著腺苷酸環(huán)化酶的作用(8)，將ATP轉(zhuǎn)化成cAMP。異常高水平的cAMP干擾了細(xì)胞代謝。
LF在胞質(zhì)溶膠中的作用是通過一種尚不十分了解的機(jī)制導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。LF能誘導(dǎo)大量淋巴因子的過量產(chǎn)生(9)，導(dǎo)致了宿主動(dòng)物中的致死性系統(tǒng)性休克。最近的研究業(yè)已表明，LF具有兩種酶促活性它能起著鋅金屬蛋白酶的作用(10)，并且它能使促分裂原活化的蛋白激酶失活(11)。盡管仍然不清楚LF的這兩種酶促活性是如何聯(lián)系在一起的，不過，這兩種活性都是LF毒性所必須的。以前業(yè)已報(bào)導(dǎo)過，炭疽毒素B成分可用于遞送表位，所述表位在存在PA的情況下又能通過所述免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)(WO 97/23236)。
LF是具有796個(gè)氨基酸的多肽，并且決定這兩種酶促活性的功能結(jié)構(gòu)域位于383-796號(hào)氨基酸之間(圖2A)(12)。沒有該催化結(jié)構(gòu)域的N-末端截短的LF在與PA混合并且添加到培養(yǎng)的噬菌體中后，或在注射到動(dòng)物體內(nèi)后完全沒有任何毒性作用。不過，它仍然能有效結(jié)合PA。LF的PA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LFn)由1-225號(hào)氨基酸組成(圖2B)(12)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了將外源抗原遞送到細(xì)胞質(zhì)中的方法，新融合蛋白及其用途。
另外，我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)可以將被修飾而使毒素結(jié)構(gòu)域失活的致死因子轉(zhuǎn)運(yùn)因子、其片段，如LFn和LFn的片段，如包括所述片段的羧基部分的片段用作轉(zhuǎn)運(yùn)因子與沒有PA的靶抗原融合，以便將所述抗原遞送到胞質(zhì)溶膠內(nèi)。所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子優(yōu)選是LFn或其片段。一種優(yōu)選類型的LFn片段是不含PA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段。所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子更優(yōu)選是LFn。例如，LFn的最靠近羧基末端的60個(gè)氨基酸可以用作轉(zhuǎn)運(yùn)因子；更優(yōu)選最靠近羧基末端的80個(gè)氨基酸。人們還可以使用其他片段。例如，可以使用含有更多致死因子蛋白的片段，只要使其毒素部分失活就行。所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子片段優(yōu)選包括LFn的最靠近羧基末端的80個(gè)氨基酸的部分，并且包括該片段的其他部分，只要除去了含有毒性的部分就行。所述片段優(yōu)選為350個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選300個(gè)氨基酸或更少，甚至更優(yōu)選250個(gè)氨基酸或更少。一種優(yōu)選的片段是105個(gè)氨基酸或更少。一種更優(yōu)選的片段是80個(gè)氨基酸或更少。然后，將該轉(zhuǎn)運(yùn)因子連接到希望遞送到胞質(zhì)溶膠中的抗原上。這一目的可以通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，可以制備含有希望遞送到所述細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的抗原的融合蛋白。
本發(fā)明的優(yōu)選方法的特征在于在接受治療的動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的新多肽。
本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的新融合多肽的DNA，以所述DNA序列為特征的重組DNA分子，用所述DNA序列和分子轉(zhuǎn)化過的單細(xì)胞宿主，以及使用所述序列、分子和宿主產(chǎn)生所述新多肽和對(duì)本發(fā)明所需的抗原的CMI免疫反應(yīng)的方法。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明的新融合肽的藥物組合物。這種組合物能有效誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，可將其用作疫苗。在另一種實(shí)施方案中，可以將所述融合蛋白用于制備生產(chǎn)細(xì)胞，優(yōu)選用于生產(chǎn)多種蛋白特別是業(yè)已證實(shí)在所述細(xì)胞中難于表達(dá)的蛋白的細(xì)菌生產(chǎn)細(xì)胞。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于檢測細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的方法。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于體外檢測細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的試劑盒。
附圖簡述圖1是表示PA-介導(dǎo)的LFn通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，以及隨后由MHC-I類分子呈遞的示意圖。
圖2A-C表示各種致死片段(LF)多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。圖2A表示LF的完整長度氨基酸序列。圖2B表示LFn的前289個(gè)氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。圖2C表示致死因子的185-289號(hào)氨基酸的序列，有時(shí)稱之為片段3(SEQ ID NO3)。
圖3A-B是表示靶的LFn的呈遞是不依賴于PA的曲線圖。在標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測定中以10∶1的效應(yīng)細(xì)胞與靶(E∶T)的比例，檢測業(yè)已充分表征的CTL克隆的活性。靶細(xì)胞是HLA-匹配的EBV-轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，業(yè)已在有或沒有PA的條件下用LFN敏化過夜。所使用的對(duì)照是重組痘苗載體(將NYCBH用于對(duì)照，而rVV-Nef或Env肽用于合適的克隆)。圖3A表示Nef-特異性克隆(KM)的活性，所述活性是用Nef重組痘苗載體，對(duì)PA和LfnNef或LFn Nef自身溫育過夜的B60限制性靶細(xì)胞測試的。包括每一種靶細(xì)胞的本底/對(duì)照(對(duì)照PA-LFn，LFn)。圖3B表示Env-特異性CTL克隆(SP 511)能以劑量依賴性方式識(shí)別用LfnEnv標(biāo)記過的靶細(xì)胞，并且，同樣是不依賴于PA的。所使用的對(duì)照是肽Env 106B(100，μg/ml)。所列舉的LFn構(gòu)建體的劑量以μg/ml為單位(LfhEnv 5＝5μ/ml的LfnEnv)。
圖4A-B是表示LFn-HIV識(shí)別是HLA限制性的曲線圖。4A表示用HLA匹配的和錯(cuò)配的用LFn-p24敏化的B-LCL檢測HLA-B14限制的Gag克隆(AC13)的活性，并且是在標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測定中檢測的。用Rw-Gag作對(duì)照。圖2B表示B60 Nef克隆(KM)的HLA-限制作用，這是用HLA匹配的和錯(cuò)配的用LFnNef敏化的靶細(xì)胞證實(shí)的。用Lfn-Nef和最佳Nef肽敏化TAP缺陷型(T2)，HLA-B60靶細(xì)胞，并且檢測裂解。T2 LfnNef靶細(xì)胞缺乏活性表明需要蛋白體加工。所有克隆都是以10∶1的E∶T比例使用的，并且將裂解水平從所述本底對(duì)照中扣除。將NYCBH用于重組痘苗病毒對(duì)照，并且將LFn本身用于LFnP24和LfnNef。陽性對(duì)照包括Nef肽180和重組痘苗載體Gag(rvv-Gag)。
圖5A-B是表示LFn-HIV的內(nèi)化和加工的曲線圖。圖5A表示在存在布雷菲爾德菌素A、細(xì)胞松弛素B和氯喹的條件下，用LfnNef敏化的HLA-匹配的靶細(xì)胞與單獨(dú)使用LfnNef相比敏化的HLA-匹配的靶細(xì)胞的Nef特異性克隆(KM)裂解作用。與細(xì)胞松弛素B和布雷菲爾德菌素A共同溫育，破壞了Nef-特異性克隆的識(shí)別作用，但是與氯喹一起溫育則不能。圖5B表示相同Nef克隆的活性，用表達(dá)Nef的重組痘苗病毒感染靶細(xì)胞過夜，或用最佳表位肽Nef 180自身敏化或在存在氯喹、細(xì)胞松弛素B或布雷菲爾德菌素A的條件下敏化。當(dāng)在存在細(xì)胞松弛素B、氯喹或布雷菲爾德菌素A的條件下溫育靶細(xì)胞和CTL克隆時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)活性的顯著降低。所示出的裂解水平扣除了低于10％的本底裂解作用。
圖6A-E是表示在Elispot測定中LFn-HIV表達(dá)的曲線圖。將來自HIV-1感染的個(gè)體的具有已知HIV-特異性CTL活性或表位的低溫保存的PBMCs用于Elispot測定，該測定使用了重組痘苗病毒或LFn-HIV。將LFn自身和NYCBH用作對(duì)照。使用重復(fù)的孔，每孔100K細(xì)胞。結(jié)果以SFC/百萬(每一百萬的成斑點(diǎn)細(xì)胞)形式報(bào)道。
圖7A-B是表示在細(xì)胞內(nèi)流式(flow-based)測定中LFn-HIV表達(dá)的FACS曲線圖。IFN-γ在Nef特異性克隆(KM)中的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)(A)以及來自具有Env-特異性CTL活性的血清陽性個(gè)體(AC2)的PBMC(B)。將未刺激過的細(xì)胞用作陰性對(duì)照(1)，并且將重組痘苗病毒用作陽性對(duì)照(2)，分別使用LfnNef和LfnEnv(3)。
圖8A和B是表示LFn融合蛋白的示意圖。
圖9是表示LFn融合蛋白的一系列示意圖。
圖10表示CHO細(xì)胞對(duì)LFn-GFP的細(xì)胞攝取。在膠原處理過的有隔室的載玻片中培養(yǎng)CHO細(xì)胞，達(dá)到80％的鋪滿度，然后與純化的LFn-GFP一起溫育1小時(shí)，然后用PBS和PBS+蛋白酶充分洗滌，以便除去膜結(jié)合蛋白。然后用抗運(yùn)鐵蛋白抗體對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行染色，并且用低聚甲醛固定。通過共焦顯微術(shù)分別檢測所述載玻片的綠色(GFP，(Super-expose)如圖10A-D所示)和紅色(抗運(yùn)鐵蛋白，如圖10E-H所示)。通過疊加相同細(xì)胞的綠色圖像和紅色圖像，形成了每一個(gè)視野的第三種圖像(圖10I-L)。因此，黃色斑點(diǎn)表示GFP可能存在于與運(yùn)鐵蛋白相同的斑點(diǎn)內(nèi)，因此，提供了對(duì)所述細(xì)胞內(nèi)GFP定位的參考。如圖10A-D所示，在用LFn-GFP處理1個(gè)小時(shí)的細(xì)胞中，有大量可見的綠色斑點(diǎn)，表明LFn-GFP確實(shí)可以進(jìn)入細(xì)胞。
圖11表示CHO細(xì)胞對(duì)GFP的細(xì)胞攝取，使用了與圖10所述相同的條件。圖11A，D和G表示用GFP溫育CHO細(xì)胞1小時(shí)的結(jié)果；圖11B-C，E-F和H-I表示用GFP溫育CHO細(xì)胞2小時(shí)的結(jié)果。圖11A-C表示通過共焦顯微術(shù)檢測綠色(GFP)的細(xì)胞視野；圖11D-F表示通過共焦顯微術(shù)檢測紅色(抗運(yùn)鐵蛋白)的相應(yīng)視野；通過疊加相同細(xì)胞的綠色圖像和紅色圖像，提供了每一個(gè)視野的第三種圖像(圖11G-I)。GFP處理過的細(xì)胞表現(xiàn)出少數(shù)綠色斑點(diǎn)(圖11)。
圖12表示GFP和LAMP-2免疫熒光的共同定位，用于表明所述溶酶體，使用了與圖10所述相同的實(shí)驗(yàn)方法。圖12A-D表示通過共焦顯微術(shù)檢測紅色的細(xì)胞視野(LAMP-2)；圖12E-H表示通過共焦顯微術(shù)檢測綠色的相應(yīng)視野(LN-GFP)。通過疊加相同細(xì)胞的綠色圖像和紅色圖像，提供了每一個(gè)視野的第三種圖像(圖12I-L)。
圖13表示GFP和EEA-1免疫熒光的共同定位，用于表明核內(nèi)體，使用圖10所述相同的實(shí)驗(yàn)方法。圖13A-D表示通過共焦顯微術(shù)檢測紅色的視野(EEA-1)；圖13E-H表示通過共焦顯微術(shù)檢測綠色的相應(yīng)視野(LN-GFP)。通過疊加相同細(xì)胞的綠色圖像和紅色圖像，提供了第三種圖像(圖13I-L)。
圖14表示GFP和抗高爾基抗體的共同定位，使用與圖10所述相同的實(shí)驗(yàn)方法。圖14A-B表示通過共焦顯微術(shù)檢測紅色(抗高爾基抗體)的細(xì)胞視野；圖14C-D表示通過共焦顯微術(shù)檢測綠色(LN-GFP)的相應(yīng)視野。通過疊加相同細(xì)胞的綠色圖像和紅色圖像，提供了每一個(gè)視野的第三種圖像(圖14E-F)。
圖15表示GFP和抗-20s免疫熒光的共同定位，用于表示所述蛋白體。條件類似于在圖10所使用的條件，所不同的是，將HeLa細(xì)胞與40μg/ml LNgfp共同溫育2小時(shí)。圖15A-D表示通過共焦顯微術(shù)檢測紅色(抗20s抗體)的細(xì)胞視野，圖15E-H表示通過共焦顯微術(shù)檢測綠色(LN-GFP)的相應(yīng)視野。通過疊加相同細(xì)胞的綠色圖像和紅色圖像，提供了每一個(gè)視野的第三種圖像(圖15I-L)。通過比較圖12-15中的不同圖像，具有大部分黃色斑點(diǎn)的疊加的圖像是圖15所示的圖像，其中，綠色斑點(diǎn)表示細(xì)胞內(nèi)LFn-GFP，它與表示細(xì)胞蛋白體的紅色斑點(diǎn)顯著重疊。
圖16表示與缺乏PA相比，在類似于圖15所使用的條件下，添加PA不會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)綠色斑點(diǎn)的數(shù)量。圖16A-F表示在沒有PA的條件下用LN-GFP溫育HeLa細(xì)胞；圖16G-L表示在有PA的條件下溫育HeLa細(xì)胞。圖16A-B和G-H表示通過共焦顯微術(shù)檢測紅色(抗20s抗體)的細(xì)胞視野，圖16C-D和I-J表示通過共焦顯微術(shù)檢測綠色(LN-GFP)的相應(yīng)視野。通過疊加相同細(xì)胞的綠色圖像和紅色圖像提供了每一個(gè)視野的第三種圖像(圖16E-F和K-L)。
圖17中分別用不同的抗原制劑腹膜內(nèi)注射免疫三組BALB/c小鼠，每組4只(15μg LFn-p24加4μg PA，15μg LFn-p24+4μg PA加明礬，15LFn-p24僅加明礬)。在免疫之后1周，將來自免疫過的BALB/c小鼠的脾單核細(xì)胞用作CTL源。通過與來自未免疫過的γ輻射過的和肽脈沖的BALB/c脾細(xì)胞一起培養(yǎng)，體外激活脾培養(yǎng)物中的CTL。在37℃下，在CO2孵育箱中培養(yǎng)6天之后，檢測成熟的CTL(效應(yīng)細(xì)胞)裂解51Cr-標(biāo)記過的P20肽脈沖的P815細(xì)胞(陽性靶細(xì)胞)或51Cr-標(biāo)記過的介質(zhì)脈沖的細(xì)胞(陰性靶細(xì)胞)的能力。所示出的裂解百分比扣除了陰性靶細(xì)胞的本底裂解，并且是以每一組的平均值形式提供的。
圖18中分別用15μg LFn-p24，15μg MLFn-p24和15μg p24通過腹膜內(nèi)注射免疫三組BALB/c小鼠，每組4只。免疫1周之后，檢測脾組織中的CTL。
發(fā)明詳述現(xiàn)在，我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)了一種用于將外源蛋白遞送到胞質(zhì)溶膠中的方法，包括在沒有保護(hù)性抗原(PA)的條件下將靶抗原(如蛋白)結(jié)合于含有二分蛋白外毒素的片段的轉(zhuǎn)運(yùn)因子。優(yōu)選將所述靶抗原融合于所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子。所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子優(yōu)選是來自炭疽芽孢桿菌的致死因子的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它由1-288號(hào)氨基酸(SEQ ID NO2)或其不包括PA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段，如羧基部分組成。例如，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子的優(yōu)選類型的氨基酸LFn1氨基酸片段的最靠近羧基末端的大約80個(gè)氨基酸的片段包括至少80個(gè)氨基酸，通過用預(yù)設(shè)參數(shù)進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)它與SEQ ID NO2具有至少80％的同源性。更優(yōu)選的是，該片段與它具有至少90％的同源性，更優(yōu)選，與它具有至少95％的同源性。所述片段優(yōu)選不包括PA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一種優(yōu)選的轉(zhuǎn)運(yùn)因子是LFn片段或其部分。更優(yōu)選的是，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子包括LFn的最靠近羧基末端的至少60個(gè)氨基酸，但不包括PA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一種優(yōu)選的片段具有來自SEQ ID NO2的羧基部分的大約105個(gè)氨基酸或更少。
所述靶抗原可以包括希望誘導(dǎo)針對(duì)它的CMI反應(yīng)的任何分子，包括病毒抗原和腫瘤抗原。
本發(fā)明的一種實(shí)施方案提供了一種包含所生產(chǎn)的新融合多肽的組合物。本發(fā)明的另一種實(shí)施方案包括通過將外源蛋白遞送到胞質(zhì)溶膠中而檢測CMI反應(yīng)的測定方法。一種優(yōu)選實(shí)施方案提供了用于檢測CMI反應(yīng)的試劑盒。
本發(fā)明的新融合多肽包括與靶抗原連接的轉(zhuǎn)運(yùn)因子。所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子可以包括任何二分蛋白外毒素的片段，該片段能在缺乏保護(hù)性抗原的條件下將所述蛋白遞送到胞質(zhì)溶膠中，而且不包括任何有毒性的片段。該轉(zhuǎn)運(yùn)方法不依賴于PA相關(guān)的途徑，因此不需要PA。一種優(yōu)選的外毒素是炭疽芽孢桿菌的致死因子(LF) (SEQ ID NO1)(圖2A)。LF的PA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是LFn的一部分，或它的可以跨過細(xì)胞膜的片段，由1-255號(hào)氨基酸組成(SEQ ID NO2)(圖2B)。LFn的任何片段都可以用作轉(zhuǎn)運(yùn)因子。它優(yōu)選不包括PA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域存在于LFn的N-末端的一半(1-149號(hào)氨基酸)。一種優(yōu)選片段具有來自SEQ ID NO2的羧基部分的105個(gè)氨基酸或更少。優(yōu)選最靠近羧基末端的60個(gè)氨基酸，更優(yōu)選最靠近羧基末端的80個(gè)氨基酸，一種優(yōu)選的轉(zhuǎn)運(yùn)因子是片段3(SEQID NO3)(圖2C)。
人們還可以將其他片段用作轉(zhuǎn)運(yùn)因子。所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子優(yōu)選是350個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選300個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選它是250個(gè)氨基酸或更少。
優(yōu)選用作所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子的其他片段與LFn的片段3(SEQ ID NO3)具有至少55％的同源性(圖2C)。例如，炭疽芽孢桿菌的水腫因子的片段使用預(yù)設(shè)參數(shù)通過Blast分析，發(fā)現(xiàn)與片段3具有大約57％的同源性。更優(yōu)選它與之具有至少65％的同源性，更優(yōu)選它與之具有至少75％的同源性；更優(yōu)選它與之具有至少80％的同源性；更優(yōu)選它與之具有至少90％的同源性；更優(yōu)選它與之具有至少95％的同源性。
將所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白連接在任何希望遞送到胞質(zhì)溶膠中的抗原上。所述連接優(yōu)選是融合蛋白形式的。不過，可以產(chǎn)生現(xiàn)有技術(shù)中已知的其他接頭。例如，一種接頭單元可能是所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一部分，然后通過化學(xué)方法將其連接在靶抗原上。優(yōu)選的抗原包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲和腫瘤相關(guān)抗原。優(yōu)選的病毒抗原包括來自任何病毒的蛋白，其中，需要一種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。特別優(yōu)選的病毒包括HIV-1，HIV-2，肝炎(包括乙型和丙型肝炎)病毒，埃博拉病毒，西尼羅病毒和皰疹病毒，如HSV-2。優(yōu)選的細(xì)菌抗原包括來自鼠傷寒沙門氏菌和分支桿菌(包括結(jié)核分支桿菌)的抗原。優(yōu)選的寄生蟲抗原包括來自瘧原蟲屬(包括惡性瘧原蟲)的抗原。
優(yōu)選的腫瘤抗原包括在誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)時(shí)被識(shí)別的表位，包括但不局限于以下各種前列腺癌抗原(如PSA，PSMA等)，乳腺癌抗原(如HER2/neu，小型-MUC，MUC-1，HER2受體，mammoglobulin，labyrinthine，SCP1，NY-ESO-1，SSX-2，N-末端封閉的可溶性細(xì)胞角蛋白，43kD人類癌抗原，PRAT，TUAN，Lb抗原，癌胚抗原，聚腺苷酸聚合酶，p53，mdm-2，p21，CA15-3，癌蛋白18/stathmin，和人腺體激肽釋放酶)，和黑素瘤抗原等。
當(dāng)人們希望在受治對(duì)象體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選還可以使用一種免疫佐劑。佐劑為本領(lǐng)域所公知，并且包括細(xì)胞因子，如IL-2，Ig-IL-2，CM-CSF，CpG，RIBL Detox(Ribi Immunochemical)，QS21(CambridgeBiotech)，不完全弗氏佐劑及其他。我們業(yè)已意外地發(fā)現(xiàn)，盡管明礬在現(xiàn)有系統(tǒng)中確實(shí)能抑制CTL誘導(dǎo)，還是將明礬優(yōu)選用于刺激特異性CTL。
本發(fā)明的方法還可用于通過與CMI測定組合制備與所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子融合的腫瘤抗原文庫而鑒定其他癌抗原，如下文所述。
所述靶抗原可以是能夠遞送到胞質(zhì)溶膠中的任何大小的抗原。所述靶抗原優(yōu)選少于750個(gè)氨基酸，更優(yōu)選少于600個(gè)氨基酸，更優(yōu)選少于500個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的新融合多肽可以包括單個(gè)靶抗原或多個(gè)靶抗原作為單個(gè)融合蛋白的一部分。一種優(yōu)選的融合多肽包括若干種HIV-1蛋白的片段，如gag和nef(圖8，9)。
人們還可以利用諸如HIV的感染性病毒的多種菌株制備表位(參見圖9)。
所述新融合多肽可以是較大的多聚體分子的一部分，它可以是通過重組方法生產(chǎn)的或可以是化學(xué)方法合成的。所述多聚體還可以包括與除了氨基酸以外的部分，包括脂類和糖類融合或偶聯(lián)的多肽。
所述多聚體蛋白優(yōu)選由在同一分子內(nèi)的重復(fù)的多個(gè)T細(xì)胞表位組成，所述表位是隨機(jī)排列的，或者在它們之間具有間隔基(氨基酸或其他成分)。
可以方便地制備編碼所述新融合蛋白的DNA序列。例如，編碼LFn的序列是眾所周知的，并且可以通過已知技術(shù)修飾，如缺失不需要的部分，如可變環(huán)，并且插入任何其他需要的編碼序列，如接頭片段。編碼各種靶抗原的所述序列在本領(lǐng)域中也是已知的。另外，編碼各種氨基酸殘基的密碼子是已知的，并且通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以方便地制備其他編碼序列。
DNA序列可以在多種動(dòng)物中使用，以便表達(dá)所述新融合蛋白，所表達(dá)的融合蛋白可用于多種用途，包括用于疫苗組合物和用于CMI測定，如下文所述。
編碼新融合蛋白的DNA能夠以多種宿主/載體組合形式表達(dá)。載體包括化學(xué)偶聯(lián)物，如披露于WO 93/04701中的偶聯(lián)物，它具有導(dǎo)向部分(例如，細(xì)胞表面受體的配體)和核酸結(jié)合部分(例如聚賴氨酸)，病毒載體(例如，DNA或RNA病毒載體)，質(zhì)粒，噬菌體等。所述載體可以是染色體、非染色體或合成載體。
例如，可用于真核宿主的表達(dá)載體包括含有源于SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、巨細(xì)胞病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)控制序列的載體?？捎糜诩?xì)菌宿主的表達(dá)載體包括細(xì)菌質(zhì)粒，如來自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括pBluescript，pGEX-2T，pUC載體，col E1，pCR1，pBR322，pMB9及其衍生物，較寬宿主范圍質(zhì)粒，如RP4，噬菌體DNAs，例如，λ噬菌體的多種衍生物，例如，λ.GT10和λ.GT11，以及其他噬菌體?？捎糜诮湍讣?xì)胞的表達(dá)載體包括2μ質(zhì)粒及其衍生物?？捎糜诶ハx細(xì)胞的載體包括pVL 941。
優(yōu)選的載體包括病毒載體，融合蛋白和化學(xué)偶聯(lián)物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括Moloney鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一種優(yōu)選的基于HIV的病毒載體包括至少兩種載體，其中，gag和pol基因來自HIV基因組，而env基因來自另一種病毒。優(yōu)選DNA病毒載體。所述載體包括皰疹病毒載體，如單純皰疹I(lǐng)病毒(HSV)載體(Geller，A.I.等.，J Neurochem64487，1995；Lim，F(xiàn).等.，見DNA CloningMammalian Systems，D.Glover，Ed.，Oxford Univ.Press，Oxford England，1999；Geller，A.I.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 907603，1993；Geller，A.I.，I Proc Natl.Acad.Sci USA 871149，1990)，腺病毒載體(LeGalLaSalle等.，Science 259988，1993；Davidson，等.，Nat.Genet3219，1993；Yang，等.，R Virol.692004，1995)，和腺伴隨病毒載體(Kaplitt，M.G.，等.，Na t.Genet.8148，1994)。將所述DNA序列與一種啟動(dòng)子可操作地連接，以便能在宿主細(xì)胞中表達(dá)。所述啟動(dòng)子為本領(lǐng)域所熟知，并且可以方便地選擇。
可以將多種單細(xì)胞宿主細(xì)胞用于表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。所述宿主可以包括眾所周知的真核和原核宿主，如大腸桿菌、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉屬、真菌、酵母，昆蟲細(xì)胞，如草地貪夜蛾(SF9)，動(dòng)物細(xì)胞，如CHO和小鼠細(xì)胞，非洲綠猴細(xì)胞，如COS 1，COS 7，BSC 1，BSC40和BMT 10，和人類細(xì)胞，以及組織培養(yǎng)的植物細(xì)胞。本發(fā)明的分子可用于制備多種生產(chǎn)細(xì)胞，這些生產(chǎn)細(xì)胞特別適用于生產(chǎn)某些目前難于在細(xì)胞中大量表達(dá)的蛋白。
包括由本發(fā)明的DNA序列編碼的新融合多肽的分子可以從發(fā)酵物或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離，并且用多種常規(guī)方法中的任意一種純化，包括液相層析，如正相或反相層析，使用HPLC，F(xiàn)PLC等；親和層析(如使用無機(jī)配體或單克隆抗體)；大小排阻層析；固定的金屬螯合層析；凝膠電泳等等；在不超出本發(fā)明范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇最合適的分離和純化技術(shù)。
可以方便地制備所述新融合蛋白的穩(wěn)定化形式，例如，通過偶聯(lián)，如聚(烯化氧)偶聯(lián)物。所述偶聯(lián)物優(yōu)選是通過將所述聚(烯化氧)的羥基末端共價(jià)鍵合于所述融合蛋白的不會(huì)影響其構(gòu)象的部分的游離氨基而形成的。其他本領(lǐng)域認(rèn)可的偶聯(lián)所述物質(zhì)的方法包括酰胺或酯連接?？梢允褂霉矁r(jià)連接以及非共價(jià)偶聯(lián)，如親脂性或親水性相互作用。
所述偶聯(lián)物可以包括非抗原性聚合物，如葡聚糖，聚乙烯吡咯烷酮，多糖，淀粉，聚乙烯醇，聚丙烯酰胺或其他類似的，基本上為非免疫原性的聚合物。優(yōu)選聚乙二醇(PEG)。其他聚(烯化氧)包括單甲氧基-聚乙二醇聚丙二醇，聚乙二醇的嵌段共聚物，和聚丙二醇等。還可以用C1-4烷基取代單甲氧基基團(tuán)對(duì)所述聚合物的遠(yuǎn)端進(jìn)行封端。所使用的聚(烯化氧)在室溫下必須可溶于液體。因此，其分子量優(yōu)選為大約200-大約20,000道爾頓，更優(yōu)選2,000-大約10,000，更優(yōu)選大約5,000。
本領(lǐng)域技術(shù)普通技術(shù)人員可以理解的是，可以在所得到的本發(fā)明的新融合蛋白上偶聯(lián)多種可能的成分。例如，參見″Conjugate Vaccines″，Contributions to Microbiology and Immunology，J.M.Cruse andR.E.Lewis，Jr(eds.)，Carger Press，New York，1989，該文獻(xiàn)的所有內(nèi)容被收作本文參考。
偶聯(lián)可以通過結(jié)合兩種分子的任何化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，只要所述新融合蛋白和其他部分保留其相應(yīng)的活性就行。這種連接包括許多化學(xué)機(jī)制，例如，共價(jià)結(jié)合，親和結(jié)合，嵌入，配位結(jié)合和復(fù)合。不過，優(yōu)選的結(jié)合是共價(jià)結(jié)合，共價(jià)結(jié)合可以通過現(xiàn)有側(cè)鏈的直接縮合或通過外部橋接分子的摻入而實(shí)現(xiàn)。很多二價(jià)和多價(jià)連接劑可用于將蛋白分子，如本發(fā)明的抗體與其他分子偶聯(lián)。例如，典型的偶聯(lián)劑可以包括有機(jī)化合物，如硫酯，碳二亞胺，琥珀酰亞胺酯，二硫氰酸鹽，戊二醛，重氮苯和六亞甲基二胺。以上所列舉的偶聯(lián)劑并非是對(duì)本領(lǐng)域已知的各種類型連接劑的窮舉，相反，它只是更常見的偶聯(lián)劑的代表(參見Killen和Lindstrom，J.Immunol.1331335-2549，1984；Jansen，F(xiàn).K.，等.，Imm.Rev.62185-216，1982和Vitettaetal.，同上)。
優(yōu)選接頭披露于文獻(xiàn)中。例如，參見Ramakrishnan，S.，等.，CancerRes.44201-208(1984)，其中披露了MBS(M-馬來酰苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯)的用途。還可參見Umemoto等.，美國專利5,030,719，該專利披露了通過寡肽接頭將鹵化酰肼衍生物偶聯(lián)在一種抗體上。特別優(yōu)選的接頭包括(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；(ii)SMPT(4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫)-甲苯(Pierce Chem.Co.，Cat.(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亞胺基-6[3-(2-吡啶基二硫)丙酰氨基]己酸酯(Pierce Chem.Co.，Cat #21651G)；(iv)硫代-LC-SPDP(硫代琥珀酰亞胺基6[3-(2-吡啶基二硫)-丙酰胺]己酸酯(Pierce Chem.Co.Cat.#2165-G)；和(v)EDC偶聯(lián)的磺基-NHS(N-羥基磺基琥珀酰亞胺Pierce Chem.Co.，Cat.#24510)。
上文所披露的接頭包括具有不同作用的成分，因此，產(chǎn)生了具有不同生理化學(xué)特性的偶聯(lián)物。例如，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳族羧酸酯的磺基-NHS值更穩(wěn)定。含有NHS-酯的接頭的溶解度比磺基-NHS酯的溶解度低。另外，所述接頭SMPT含有空間位阻二硫鍵，并且，可以形成穩(wěn)定性增加的偶聯(lián)物。一般，二硫鍵的穩(wěn)定性比其他鍵差，因?yàn)槎蜴I在體外被裂解，導(dǎo)致了較低的偶聯(lián)物可利用性。具體地講，磺基-NHS可以增強(qiáng)碳二亞胺偶聯(lián)的穩(wěn)定性。當(dāng)碳二亞胺偶聯(lián)(如EDC)被用于與磺基-NHS結(jié)合時(shí)，所形成的酯比碳二亞胺偶聯(lián)反應(yīng)本身更抗水解作用。
本發(fā)明的新融合蛋白可用于蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。例如，某些蛋白在某些表達(dá)系統(tǒng)中是難于表達(dá)的，這些系統(tǒng)包括細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。與諸如LFn的轉(zhuǎn)運(yùn)因子融合之后，可以穩(wěn)定某些所述蛋白。我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子優(yōu)選為250個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選150個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選105個(gè)氨基酸或更少，甚至更優(yōu)選80個(gè)氨基酸或更少。
本發(fā)明的融合蛋白可用于產(chǎn)生免疫反應(yīng)，例如，作為疫苗。
典型的藥物組合物是治療有效量的新融合蛋白，它能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，因此，起著預(yù)防性免疫原的作用，任選包含在可以藥用的、并且相容的載體中。本文所使用的術(shù)語“可以藥用的并且相容的載體”將在下文作更全面的說明，它包括(i)一種或多種相容的固體或液體填料稀釋劑或膠囊化物質(zhì)，所述物質(zhì)適合給予人類或其他動(dòng)物，和/或(ii)一種能夠?qū)⑺龇肿舆f送到靶細(xì)胞中的系統(tǒng)。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“載體”表示天然的或合成的有機(jī)或無機(jī)成分，本發(fā)明的分子與它組合，以便有利于使用。術(shù)語“治療有效量”是本發(fā)明的藥物組合物能產(chǎn)生需要的結(jié)果或?qū)σ委煹奶囟òY狀產(chǎn)生需要的影響的本發(fā)明藥物組合物的量。例如，產(chǎn)生提供預(yù)防性保護(hù)作用的免疫反應(yīng)所需要的量。通常，當(dāng)所述組合物被用作預(yù)防性免疫原時(shí)，在初次給藥之后，需要定期進(jìn)行至少1次“加強(qiáng)”。在制備采用相同成分的組合物時(shí)可以使用各種濃度，以便提供針對(duì)接受治療的患者的年齡、癥狀嚴(yán)重程度、治療持續(xù)時(shí)間和給藥方式的變化。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，將同樣是免疫原性多肽的本發(fā)明的新融合多肽摻入多成分疫苗中，該疫苗可能包含其他免疫原性多肽。多成分疫苗可以包含本發(fā)明的新融合蛋白，以便誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)，并且包含其他抗原，以便誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)。
在一種優(yōu)選的免疫方法中，可以用本發(fā)明的新融合蛋白激發(fā)，然后用不同的新融合蛋白加強(qiáng)。
人們還可以用含有多種不同新融合蛋白的混合物激發(fā)，并且可以用多種不同的新融合蛋白或用包含多種抗原的融合蛋白加強(qiáng)(圖8，9)。
可以將所述新融合蛋白用于制備能夠識(shí)別并且與之相互作用的多種抗原，例如，來自不同HIV菌株的抗原的多種T細(xì)胞。還可以將所述新融合蛋白的DNA序列用作亞單位疫苗。
為了產(chǎn)生免疫反應(yīng)，如用一種疫苗組合物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，優(yōu)選還使用一種佐劑。佐劑包括，但不局限于明礬，RIBI Detox(RibiImmunochemical)，QS21(Cambridge Biotech)，和不完全弗氏佐劑。明礬是優(yōu)選的佐劑。另一類佐劑包括諸如細(xì)胞因子的免疫刺激劑，如IL-12，IL-4和諸如B7的共刺激分子。已知具有免疫刺激作用的多種分子包括諸如ICAM和LFA的輔助分子。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，在最初的免疫給藥之前，給予患者GM-CSF。GM-CSF可以用一種病毒載體給藥，或作為藥物制劑中的分離的蛋白給藥?？梢允褂米魟┑慕M合，如GM-CSF，I CAM和LFA。盡管通常會(huì)產(chǎn)生針對(duì)感染性疾病抗原的強(qiáng)的免疫反應(yīng)，而對(duì)于腫瘤相關(guān)抗原來說，通常會(huì)產(chǎn)生較弱的免疫反應(yīng)。因此，優(yōu)選將上文所述的免疫刺激劑與它們一起使用。如上文所述，明礬是優(yōu)選的佐劑。
本發(fā)明的免疫刺激組合物可有利地與其他治療方案一起使用。例如，所述系統(tǒng)可以與傳統(tǒng)治療方案聯(lián)合用于癌癥治療，包括手術(shù)、放療、化療和激素治療。例如，包含本發(fā)明新融合蛋白的乳腺癌疫苗可以與能干擾雌激素活性的檸檬酸他莫昔芬聯(lián)合使用。該系統(tǒng)還可以與免疫治療聯(lián)合，例如，使用HerceptinTM(trastuzumab)，即為了阻斷HER2受體而開發(fā)的一種抗HER2人源化單克隆抗體；骨髓移植；和外周血干細(xì)胞治療也可以使用?？梢耘c本發(fā)明組合物聯(lián)合使用的其他優(yōu)選的治療方案，包括血管發(fā)生抑制劑和細(xì)胞毒性劑。
本文所使用的術(shù)語“相容性”表示所述藥物組合物的成分能夠與本發(fā)明的小分子、核酸和/或多肽混合，并且彼此混合，其方式使得不會(huì)顯著破壞需要的藥效。
本發(fā)明藥物組合物的劑量根據(jù)受治對(duì)象以及所使用的特定給藥途徑而變化。劑量可以為0.1-100000μg/kg/天，更優(yōu)選1-10000μg/ml。所述組合物的優(yōu)選劑量優(yōu)選為至少2μg/ml。僅僅是舉例來說，對(duì)于人類而言可以使用例如大約1mg-大約300mg/的總的劑量范圍。該劑量可以根據(jù)組合物以定期的間隔遞送。例如，至少分2次給藥，優(yōu)選間隔大約4周。其他化合物可以每天給藥。本發(fā)明的藥物組合物還可以按照多種其他業(yè)已充分鑒定的方法給予受治對(duì)象。例如，某些目前被接受的免疫方案包括以下方案(i)給藥時(shí)間為，第一個(gè)劑量在選定日期給藥；第二個(gè)劑量在第一個(gè)劑量之后1個(gè)月給藥；第三個(gè)劑量在隨后的日期，例如，在第二劑量之后5個(gè)月給藥。參見Product Information，Physician′sDesk Reference，Merck Sharp & Dohme(1990)，1442-43.(例如，乙型肝炎疫苗型方案)；(ii)例如，對(duì)于其他疫苗來說，所推薦的兒童給藥方法是第一個(gè)劑量在選定日期給藥(6周大或更大一些)；第二個(gè)劑量在第一個(gè)劑量之后4-8周給藥；第三個(gè)劑量在第二個(gè)劑量之后4-8周給藥；第四個(gè)劑量在第三個(gè)劑量之后6-12個(gè)月給藥；第五個(gè)劑量在4-6歲大時(shí)給藥；在最后一個(gè)劑量之后，每隔10年進(jìn)行額外的加強(qiáng)。參見Product Information，Physician′s Desk Reference，Merck Sharp&Dohme(1990)，879(例如，白喉、破傷風(fēng)和百日咳型疫苗方案)。用于遞送特定組合物的多個(gè)劑量的理想的時(shí)間間隔，可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過少量常規(guī)實(shí)驗(yàn)就可以確定。
本發(fā)明的新融合蛋白還可以單獨(dú)(純粹)給藥，或者以可以藥用的鹽的形式給藥。在用于醫(yī)藥中時(shí)，所述鹽應(yīng)當(dāng)是可以藥用的，但是非可以藥用的鹽可以被方便地用于制備它的可以藥用的鹽，并且沒有被排除在本發(fā)明范圍之外。所述可以藥用的鹽包括，但不局限于用以下酸制備的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、唾液酸、對(duì)甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸、和苯磺酸。另外，可以藥用的鹽可以制備成堿金屬或堿土金屬鹽，如羧酸基團(tuán)的鈉、鉀或鈣鹽。因此，本發(fā)明還提供了用于醫(yī)學(xué)使用的藥物組合物，它包含本發(fā)明的核酸和/或多肽，以及一種或多種它的可以藥用的載體，并且任選包含任何其他治療成分。
所述組合物包括適合口服、直腸、陰道內(nèi)、局部、鼻內(nèi)、眼內(nèi)或腸胃外給藥的組合物，上述所有給藥途徑都可以用作使用本發(fā)明物質(zhì)的給藥途徑。其他合適的給藥途徑包括直接鞘內(nèi)給藥至腦脊液(CSF)，直接注射到動(dòng)脈表面和通過實(shí)質(zhì)內(nèi)注射，直接注射到器官內(nèi)靶部位。優(yōu)選適合腸胃外給藥的組合物。術(shù)語“腸胃外”包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸液技術(shù)。優(yōu)選肌內(nèi)給藥。
所述組合物可以方便地以單位劑量形式提供，并且可以通過藥物學(xué)領(lǐng)域所熟知的任何方法制備。所述方法通常包括將本發(fā)明的活性成分與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體結(jié)合在一起的步驟。
適合口服的本發(fā)明的組合物可以以獨(dú)立的單位形式提供，如膠囊、扁膠囊、片劑或錠劑，各自在脂質(zhì)體中含有預(yù)定數(shù)量的本發(fā)明的核酸和/或多肽，或作為懸浮在含水液體或無水液體中的懸浮液，如糖漿、酏劑、或乳液。
適合腸胃外給藥的優(yōu)選組合物通常包含本發(fā)明分子的無菌含水制劑，該制劑優(yōu)選是與受體血液等滲的。所述含水制劑可以按照已知方法，用合適的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配制。無菌注射制劑還可以是溶解在無毒、腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如溶解在1，3-丁二醇中的溶液?？梢允褂玫目山邮艿妮d體和溶劑包括水、Ringer′s溶液、和等滲氯化鈉溶液。另外，通常將無菌固定油用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以使用任何無刺激性固定油，包括合成的一或二甘油酯。另外，諸如油酸的脂肪酸可用于制備注射劑。
為了進(jìn)一步改進(jìn)產(chǎn)生本發(fā)明提供的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)的可能性，可以分析由本發(fā)明的核酸序列所編碼的多肽的氨基酸序列，以便鑒定可能與受體結(jié)合相關(guān)的氨基酸序列的需要部分。例如，可以對(duì)多肽序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，以便確定所述位點(diǎn)。
通過合適的測定方法，如下文所披露的CMI測定，以及通過其他常規(guī)類型的免疫測定方法，可以檢測與本發(fā)明分子形成的復(fù)合物。
本發(fā)明提供了體外測定細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的測定方法。用于檢測CMI反應(yīng)的現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室鑒定方法存在嚴(yán)重缺陷，特別是在各種臨床場合下應(yīng)用于大的疫苗效力試驗(yàn)時(shí)更是如此。這是因?yàn)楝F(xiàn)有的設(shè)備和技術(shù)支持是有限的。如上文所述，人們認(rèn)為CTL在控制HIV-1感染方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，設(shè)計(jì)了多種HIV-1疫苗候選物以刺激T細(xì)胞反應(yīng)，以及中和抗體(1-6)。
本發(fā)明的用于測定T細(xì)胞反應(yīng)的方法對(duì)于開發(fā)所有T細(xì)胞依賴型疫苗或免疫療法具有重要作用。該策略可應(yīng)用于其他研究領(lǐng)域，其中，CMI反應(yīng)在預(yù)防和控制有關(guān)疾病方面發(fā)揮重要作用。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了新融合多肽在Elispot測定中的用途。Elispot測定的主要優(yōu)點(diǎn)是，可以對(duì)大量人群的大量CTL反應(yīng)進(jìn)行有效和經(jīng)濟(jì)的評(píng)估(例如，參見Lalvani等.，J.Exp.Med.186859-65(1997))。Elispot測定可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞，包括低溫保存的PBMCs，以及CD8+CTL細(xì)胞。例如，來自HIV-1陽性個(gè)體的CD8+CTL克隆。
另一種優(yōu)選實(shí)施方案提供了將所述新型融合多肽用于流式細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測定的用途?；诹魇郊?xì)胞術(shù)的測定，可以在體外刺激抗原特異性T細(xì)胞之后檢測細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)積累。用抗原刺激CTLs，并且與布雷菲爾德菌素A一起溫育，它能抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，并且在細(xì)胞內(nèi)積累新合成的蛋白，如細(xì)胞因子。表面標(biāo)記(CD8，CD3)和IFN-γ和CD69的細(xì)胞內(nèi)染色，可以在未表征過的MHC背景中針對(duì)抗原性表位對(duì)特定細(xì)胞群進(jìn)行檢測和定量。
使用本發(fā)明新型融合多肽的CMI測定，可用于評(píng)估針對(duì)多種病毒、細(xì)菌和腫瘤抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)。所述測定可用于評(píng)估疫苗效力或抑制傳染性病原體的感染狀態(tài)。
使用本發(fā)明的新型融合多肽的CMI測定還可用作檢測癌抗原的早期診斷試劑盒。
本發(fā)明還提供了用于檢測CMI反應(yīng)的試劑盒。一種優(yōu)選的試劑盒包含裝在試管、孔等中的新融合蛋白。所述試劑盒優(yōu)選包含用于體外檢測CMI反應(yīng)的含有病毒或腫瘤的試劑。所述試劑盒優(yōu)選包含用于抽取諸如血液的生物學(xué)樣品的裝置。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒包含指導(dǎo)檢測CMI反應(yīng)的說明書。所述試劑盒優(yōu)選包含冷凍干燥形式的新融合蛋白。
一種優(yōu)選的試劑盒包含冷凍干燥的，并且涂敷在用于采集血液的試管內(nèi)側(cè)上的新融合蛋白。這樣，可以將血液直接從個(gè)體體內(nèi)抽入所述試管中，以便溫育數(shù)小時(shí)(例如4小時(shí))，然后固定。這種固定樣品可長時(shí)間(例如2周)穩(wěn)定用于CMI測定。所述試劑盒特別適用于野外校正樣品，例如，在疫苗效力試驗(yàn)期間使用，這種情況通常出現(xiàn)在偏遠(yuǎn)地區(qū)。類似地，其他優(yōu)選實(shí)施方案包括涂敷在諸如平皿、孔或試管的任何表面上的冷凍干燥的蛋白，可以在它上面添加小體積的生物學(xué)樣品。優(yōu)選的生物學(xué)樣品包括血液、尿液、唾液、糞便、來自腦脊液的上清液和細(xì)胞樣品。
在一種特定例子中，諸如上文所述的可能僅含有LFn的羧基部分的LFn融合蛋白，可以在缺乏PA的情況下，以MHC-I限制方式敏化CTL靶細(xì)胞。在這種向MHC-I途徑呈遞外源蛋白抗原的新方法中，抗原的胞質(zhì)溶膠遞送取決于與細(xì)胞內(nèi)抗原加工相關(guān)的功能性轉(zhuǎn)運(yùn)，而不依賴于活的病毒或細(xì)菌載體。所述LFn片段是能夠從胞質(zhì)溶膠進(jìn)入MHC-I途徑的新類型蛋白的例子。事實(shí)上，例如，LFn可以在缺乏PA的條件下將HIV-I抗原遞送到細(xì)胞質(zhì)中，這一點(diǎn)與現(xiàn)有的對(duì)有關(guān)炭疽致死毒素如何起作用的假說相矛盾(32)。在正常情況下，LF(炭疽致死因子)是取決于PA的，以便發(fā)揮其毒性作用，并且LF的毒性結(jié)構(gòu)域可能具有防止進(jìn)入細(xì)胞的未知功能。
另外，諸如LFn-HIV的融合蛋白，可以用作調(diào)整和簡化用于在疫苗試驗(yàn)中檢測T細(xì)胞反應(yīng)的方法的工具。該方法還可用于研究其他細(xì)胞內(nèi)病毒或細(xì)菌疾病，如病毒性肝炎，TB，和瘧疾。本發(fā)明可消除在現(xiàn)有CMI測定中使用活的重組痘苗病毒的必要性。與使用重疊的合成肽相比，它還具有若干優(yōu)點(diǎn)，這種重疊的合成肽不僅昂貴，并且尚未證實(shí)對(duì)具有HLA-I多樣性的不同群體的理論覆蓋率。所述新抗原遞送提供了簡化的CMI測定，該測定方法被普遍應(yīng)用于野外用途。另外，所述LFn融合蛋白便于在大腸桿菌中生產(chǎn)，可以用相對(duì)簡單的方法純化，并且穩(wěn)定。
本發(fā)明所提供的所有新融合多肽，以及編碼所述多肽的DNA序列基本上不含炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原或其片段，因此可安全地用于多種用途，而沒有對(duì)宿主造成意外損傷的危險(xiǎn)。因此，本發(fā)明的新型融合多肽特別有利于用于產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的多種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)的組合物和方法。
下面的實(shí)施例用于說明本發(fā)明，而不是要以任何形式限定本發(fā)明。
實(shí)施例1材料和方法LFn-HIV融合蛋白通過PCR擴(kuò)增來自HIV-HXB的編碼env gp120，gag p24的DNA片段，克隆到LFn表達(dá)質(zhì)粒pET15bLFn上，并且測序，以便證實(shí)LFn和HIV編碼序列之間的框內(nèi)融合。由HIV-ELI擴(kuò)增Nef編碼序列。LFn及其融合衍生物的蛋白表達(dá)載體是pET15b質(zhì)粒(Novagen；Madison，WI)。該載體系統(tǒng)的主要特征包括誘導(dǎo)型T7啟動(dòng)子，用于蛋白純化的內(nèi)部His-標(biāo)記，和多個(gè)克隆位點(diǎn)。重組LFn是以細(xì)胞內(nèi)可溶蛋白形式在大腸桿菌中表達(dá)的，在其N-末端具有6個(gè)串聯(lián)的組氨酸殘基(14)。在10升Bioflow2000臺(tái)式生物反應(yīng)器(New Brunswick Scientific，NJ)中生長細(xì)菌。使用市售試劑盒，按照生產(chǎn)商(Novagen)的方法純化帶有His-標(biāo)記的蛋白。通過現(xiàn)有技術(shù)修飾LFn編碼區(qū)可以制備LFn片段。
試劑在Applied Biosystems肽合成儀(Model 430A)上合成合成肽。所使用的重組痘苗病毒是vAbT 141(Gag)，vAbT 299(Env)和Nef(15)，用NYCH作為對(duì)照痘苗載體。將布雷菲爾德菌素A，細(xì)胞松弛素B和氯喹(Sigma，St Louis，MO)添加到細(xì)胞培養(yǎng)物中，培養(yǎng)2小時(shí)，并且洗滌2次，然后重新添加到所述細(xì)胞中。用于流式分析的抗體是從Becton-Dickinson(San Jose，CA)獲得的。
流式細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色用LFN-HIV(30μg/ml)、重組痘苗載體(MOI 3-5)或肽(10μg/ml)在37℃下，在5％CO2中溫育低溫保存的PBMCs過夜。用最佳肽(10μg/ml)、LFn-HIV(10μg/ml)或重組痘苗病毒(MOI 3-5)溫育自體B-LCLs過夜，洗滌2次，并且在存在共刺激抗CD28和抗CD49d(1μg/ml，Becton-Dickinson，San Jose，CA)的條件下以10∶1的E∶T比例添加到效應(yīng)細(xì)胞中。然后添加布雷菲爾德菌素A(10μl，1μg/ml)，并且在37℃下溫育細(xì)胞培養(yǎng)物6小時(shí)(對(duì)于APC來說使用IgG1，對(duì)于FITC來說使用PE，PerCP和IgG2b)或別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的CD3單克隆抗體(Mab)，藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗-CD8 Mab(Becton Dickinson)的飽和溶液染色。在4℃下遮光溫育20分鐘之后，用FACS洗滌液洗滌2次。添加100μl試劑A(Fix and Perm試劑盒，Caltag Laboratories，Austria)，并且在室溫下(RT)遮光溫育20分鐘之后，用FACS洗滌液洗滌2次。然后添加100μl試劑B(Fix and Perm試劑盒)，并且在室溫下溫育細(xì)胞5分鐘。在添加FITC-IFNγ和多甲藻素葉綠素蛋白(PerCP)-偶聯(lián)的CD69 Mab(CD69 perCP)抗體并且在4℃下遮光溫育之后，用FACS洗滌液洗滌所述細(xì)胞兩次，并且在Becton DickinsonFACScalibur流式細(xì)胞計(jì)上，用Cell Quest軟件分析。
使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)和Cellquest軟件(Becton Dickinson)通過四色染色分析樣品。所使用的陰性對(duì)照和陽性對(duì)照是未刺激過的細(xì)胞和分別用促分裂原植物凝集素PHA(0.25μg/ml，Murex Biotech)刺激過的細(xì)胞。
細(xì)胞系和培養(yǎng)條件將自體Epstein-Barr病毒(EBV)-轉(zhuǎn)化過的B類淋巴母細(xì)胞以及T1和T2(HLA-B60)細(xì)胞系用作抗原呈遞細(xì)胞(APCs)。用合適的指數(shù)肽或LFn-HIV構(gòu)建體脈沖靶細(xì)胞，或用重組痘苗病毒感染過夜。AC 13(HLA B14限制的p24[DRFYKTLRA])和KM(HLV B60限制的Nef[KEKGGLEGL])是Gag和Nef-特異性克隆(分別)和AC2(HLA B44限制的gp120[AENLWVTVY])。都是從HIV感染的個(gè)體體內(nèi)獲得的，對(duì)這種個(gè)體的CTL反應(yīng)業(yè)已作過充分鑒定(Rosenberg，個(gè)人通信)，并且通過一個(gè)血清陽性烏干達(dá)人制備了Env特異性克隆(SP 511)(16)。用于Elispot研究的PMBCs是來自塞內(nèi)加爾和烏干達(dá)的HIV-1感染的個(gè)體(15，16)。為了研究布雷菲爾德菌素A，細(xì)胞松弛素B或氯喹對(duì)LFn-HIV MHC-I類限制呈遞的影響，用所述蛋白構(gòu)建體標(biāo)記APCs，在RPMI 1640m 10％FCS中培養(yǎng)，并且與相應(yīng)的試劑共培養(yǎng)1小時(shí)，然后洗滌，并且通過標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測定檢測。
Elispot對(duì)低溫保存的PBMCs進(jìn)行Elispot測定。在4℃下，用0.5mg/ml的單克隆抗體1-D1K(Mabtech，Stockholm，Sweden)對(duì)96孔硝酸纖維素平板(Millititer，Millipore Corp.，Bedford，MA)預(yù)包被過夜。然后用磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)洗滌所述平板6次，分別以每孔50,000個(gè)細(xì)胞，和每孔25,000個(gè)細(xì)胞的密度添加PBMCs至雙份的孔。在37℃下，在5％CO2中溫育所述平板過夜，并且以0.5mg/ml的濃度添加生物素化的單克隆抗體抗IFN-Mab(Mabtech)，溫育10分鐘，然后添加鏈親和素-ALP(Mabtech)在室溫下溫育1小時(shí)。用PBS洗滌所述平板3次，并且添加5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基蘭(Sigma)，以便使反應(yīng)顯色。15分鐘之后，添加自來水以便終止反應(yīng)。以暗斑形式檢測各個(gè)細(xì)胞因子生長細(xì)胞，觀察所述細(xì)胞，并且以SFC/孔(成斑點(diǎn)集落/孔)形式定量。從所述斑點(diǎn)數(shù)量中扣除對(duì)照孔的數(shù)量，并且將4個(gè)孔加以平均計(jì)算CTL頻率(CTLp)。最終的CTLp是作為每106個(gè)細(xì)胞的平均頻率形式報(bào)導(dǎo)的。如果SFCs至少為對(duì)照的2倍的話，就將其反應(yīng)視為是陽性的。本底SFC平均低于15/孔。
鉻釋放測定在存在重組IL-2的條件下，用抗CD3單克隆抗體(12F6)刺激CD8+CTL克隆，并且在7天內(nèi)測定活性。用表達(dá)HIV-1基因產(chǎn)物的重組痘苗病毒(感染復(fù)數(shù)為3-5)或用LFn蛋白(5-30μg/ml)感染靶細(xì)胞，包括自體B-LCL或HLA-匹配的APCs過夜，并且用放射性鉻(51Cr)標(biāo)記。在200μl的最終體積中，效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞的比例(E∶T)為10∶1，所有特征都是在雙份的孔中進(jìn)行的。4小時(shí)之后收獲上清液，并且根據(jù)以下公式確定特異性裂解的百分比100×[(實(shí)驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)]。HIV-特異性CTL活性被定義為高出本底/對(duì)照10％。對(duì)于所有測定來說，自發(fā)釋放小于最大釋放的30％。
在沒有PA的條件下由LFn-HIV介導(dǎo)的HIV-1抗原進(jìn)入和加工為了評(píng)估LFn-HIV與細(xì)胞表面上的MHC-1分子締合的能力，在存在或不存在PA的條件下，用LFn-HIV敏化類淋巴母細(xì)胞B細(xì)胞系(B-LCL)，并且通過標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測定，用若干業(yè)已充分表征的HIV-特異性CTL克隆進(jìn)行測定(圖3)。我們發(fā)現(xiàn)在有或沒有PA的條件下，用LFn-HIV對(duì)CTL識(shí)別的靶細(xì)胞的敏化程度相當(dāng)。裂解水平是取決于劑量的，并且獲得了與陽性對(duì)照相當(dāng)?shù)乃?，其中，B-LCLs是用表達(dá)相同HIV抗原的重組痘苗病毒感染的。只有在靶細(xì)胞與LFn-HIV一起長時(shí)間(8小時(shí)與1小時(shí))(數(shù)據(jù)未發(fā)表)溫育時(shí)，才證實(shí)了HIV-特異性CTL活性，表明了表面抗原出現(xiàn)的推遲和需要細(xì)胞內(nèi)加工。
LFn-HIV在經(jīng)典MHC-I途徑中呈遞我們隨后證實(shí)了LFn-HIV是由經(jīng)典的MHC-I途徑提供的，表現(xiàn)為CTLs對(duì)所述構(gòu)建體的識(shí)別是HLA-I限制性的(圖4)。用呈遞LFn-Nef或LFn-p24的HLA匹配的和錯(cuò)配的靶細(xì)胞，分別檢測HLAB60-和B14-限制型的兩種Nef-(KM)和Gag-特異性(AC13)克隆。只有HLA-匹配的靶細(xì)胞表現(xiàn)出顯著裂解，證實(shí)了LFn-HIV的MHC-I呈遞。
我們還檢查了LFn-HIV的攝取和加工的潛在機(jī)制。為了確定LFn-HIV在細(xì)胞表面上的內(nèi)化是否是活躍進(jìn)行的，我們用100μM的細(xì)胞松弛素B(17，18)——一種吞噬作用抑制劑預(yù)溫育B-LCL，然后添加LFn-HIV抗原。在存在細(xì)胞松弛素B的情況下，破壞了CTL識(shí)別，這表明它是一種胞吞介導(dǎo)的內(nèi)化過程。
如果將外源LFn融合蛋白導(dǎo)入胞質(zhì)溶膠，并且隨后進(jìn)行加工的話，就需要TAP蛋白(與抗原加工相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，以便將肽轉(zhuǎn)運(yùn)到ER腔中與MHC-I結(jié)合(19-21)。為了評(píng)估在胞吞作用之后對(duì)抗原加工的要求，我們檢測了LFn-HIV融合蛋白敏化B60-表達(dá)細(xì)胞系T1和T2以便由CTL裂解的能力。T2細(xì)胞(22-24)是缺乏TAP功能的T1細(xì)胞的衍生物，它能將肽從蛋白體轉(zhuǎn)運(yùn)到ER腔中，以便與MHC-I結(jié)合(19，20)。在T2細(xì)胞中的識(shí)別受到破壞(圖4B)，表明在加工之后需要表位轉(zhuǎn)運(yùn)。如果用直接針對(duì)表面“空”MHC-I分子的最佳表位肽脈沖所述細(xì)胞的話，相同克隆對(duì)TAP缺陷型靶細(xì)胞的識(shí)別得以保持，避免了對(duì)細(xì)胞內(nèi)加工的需要。
為了進(jìn)一步證實(shí)外源蛋白進(jìn)入MHC I類途徑的機(jī)制，用布雷菲爾德菌素A處理靶細(xì)胞，它能抑制來自ER和高爾基復(fù)合體的蛋白的胞吐作用，并且抑制新組裝的肽-MHC復(fù)合體到達(dá)細(xì)胞表面(25)。在給靶細(xì)胞呈遞LFn-HIV之前添加布雷菲爾德菌素A，能有效阻斷CTLs的識(shí)別作用(圖5)。這一發(fā)現(xiàn)，連同以前對(duì)HLA限制和TAP需求的驗(yàn)證，證實(shí)了LFn-HIV是由MHC I類途徑中的B-LCL加工和呈遞的。
LFn-HIV的加工對(duì)氯喹是不敏感的很多外源抗原在MHC-I分子上的呈遞涉及到在胞吞腔室中的蛋白水解作用(26-28)，并且所述肽隨后得以進(jìn)入胞質(zhì)溶膠，在這里它進(jìn)入MHC I類途徑。為了研究LFn介導(dǎo)的抗原呈遞作用是否需要在酸性小泡中的蛋白水解作用，我們?cè)诮佑|LFn-HIV期間用氯喹處理B-LCL(圖5)。已知氯喹能提高內(nèi)體和溶酶體區(qū)室的pH，從而抑制組織蛋白酶的蛋白水解作用，這種酶的活性需要酸性環(huán)境(29，30)。我們的發(fā)現(xiàn)表明，具有滲漏特征的吞噬體不是LFn-HIV進(jìn)入胞質(zhì)溶膠的必要條件。
如果用最佳八聚體表位脈沖靶細(xì)胞表面的話，添加細(xì)胞松弛素B、布雷菲爾德菌素A或氯喹，不會(huì)影響靶細(xì)胞的識(shí)別和裂解，這表明所述試劑既不會(huì)影響CTL功能，又不會(huì)影響靶細(xì)胞存活力(圖5)。
通過不同的CMI測定比較LFn-HIV和重組痘苗病毒在證實(shí)了LFn-HIV用MHC-I分子將CTL表位呈遞到細(xì)胞表面的能力之后，我們進(jìn)一步試驗(yàn)了LFn融合蛋白在各種CMI測定中的可應(yīng)用性，包括酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot)測定和流式細(xì)胞內(nèi)干擾素測定。這些測定方法提供了對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)的更簡單和更快速的評(píng)估，并且，理論上更適合大規(guī)模臨床測試，特別是用于疫苗研究領(lǐng)域。Elispot測定的主要優(yōu)點(diǎn)是，可以在大量人群中對(duì)HIV-特異性CTL反應(yīng)進(jìn)行有效和經(jīng)濟(jì)地評(píng)估(31)。目前，有多種抗原刺激被用于該測定，包括能表達(dá)HIV抗原的重組痘苗病毒或重疊的合成肽。在Elispot測定中，測試了來自若干HIV-1陽性個(gè)體的冷凍保存的PBMCs和CD8+CTL克隆，與能表達(dá)相同抗原的重組痘苗病毒平行使用LFnp24，LFn-Nef或LFn-gp120。用LFn-HIV觀察到了相當(dāng)?shù)陌唿c(diǎn)形成集落，并且在某些場合下，與重組痘苗病毒相比出現(xiàn)了更少的本底斑點(diǎn)(圖6)。
通過流式細(xì)胞測定檢測在體外刺激抗原特異性T細(xì)胞之后細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)積累。用抗原刺激CTLs，并且用布雷菲爾德菌素A溫育，它能抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，并且使得諸如IFN-γ的新合成的細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)積累。表面標(biāo)記(CD8，CD3)和IFN-γ和CD69的細(xì)胞內(nèi)染色，可以在未鑒定過的HLA-I背景中對(duì)針對(duì)抗原性表位的特異性T細(xì)胞群進(jìn)行檢測和定量。用LFn-Nef刺激Nef-特異性克隆(KM)，并隨后通過流式分析評(píng)估干擾素的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)(圖7A)。在CD8+細(xì)胞群中，用LFn-Nef和表達(dá)Nef的重組痘苗病毒檢測Nef-特異性反應(yīng)。用LFn-Env和表達(dá)Env的重組痘苗病毒(rVV-Env)敏化來自具有已知gp120表位的個(gè)體(AC2)的新分離的、未刺激過的PBMCs。與用rVV-Env溫育的細(xì)胞相比，在接觸LFn-Env的細(xì)胞中，在CD8+細(xì)胞群中細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的百分比更高一些(圖7B)。
實(shí)施例2在沒有PA的條件下，LFn融合蛋白也能以MHC-I限制的方式敏化CTL靶細(xì)胞。LFn融合蛋白的這種胞質(zhì)溶膠遞送，取決于與抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)抗原加工相關(guān)的功能性轉(zhuǎn)運(yùn)(Cao H，Agrawal D，Kushner N，Touzjian N，Essex M，and Lu Y.J Infect.Dis.185244-251(2002))。我們業(yè)已證實(shí)與LFn融合的綠色熒光蛋白(GFP)在沒有PA的情況下能進(jìn)入細(xì)胞。我們還證實(shí)外源GFP的這種PA非依賴型LFn遞送與細(xì)胞蛋白體相關(guān)，這一結(jié)論與以前的觀察吻合。
LFn-GFP和GFP構(gòu)建和純化通過將來自pEGFP-Cl(Clontech)的GFP開放讀框插入在以前的研究中所披露的LFn表達(dá)載體中，構(gòu)建了LFn-GFP融合蛋白(Lu，Y.，R.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 978027-32(2000))，所述融合蛋白可溶于細(xì)菌細(xì)胞提取物中，并且可以通過一個(gè)步驟的親和層析純化。純化融合蛋白的分子量大約為55kD，并且其溶液具有亮綠色(資料未發(fā)表)。為了對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行適當(dāng)控制，將GFP自身構(gòu)建在相同的細(xì)菌表達(dá)載體pETl5b中，以便在GFP和LFn-GFP的表達(dá)、純化和使用中的唯一差別是，在GFP中缺少LFn序列。
LFn-GFP能進(jìn)入CHO細(xì)胞，而GFP則不能將CHO細(xì)胞在膠原處理過的有隔室的載玻片中培養(yǎng)達(dá)到80％的鋪滿度，然后用純化的LFn-GFP溫育1-2小時(shí)，然后用PBS和PBS+蛋白酶進(jìn)行充分洗滌，以便消除膜結(jié)合蛋白。然后用抗運(yùn)鐵蛋白抗體對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行染色，并且用低聚甲醛固定。通過共焦顯微術(shù)分別檢查所述載玻片的綠色(GFP)和紅色(抗運(yùn)鐵蛋白)。通過疊加相同細(xì)胞的綠色圖像和紅色圖像，提供了每一個(gè)視野的第三種圖像。因此，黃色斑點(diǎn)表示GFP可能存在于與運(yùn)鐵蛋白相同的斑點(diǎn)內(nèi)，因此提供了GFP在細(xì)胞內(nèi)的定位的參考。如圖10所示，在用LFn-GFP處理1小時(shí)的細(xì)胞中存在大量可見的綠色斑點(diǎn)，這表明LFn-GFP確實(shí)進(jìn)入了細(xì)胞。在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下，GFP處理過的細(xì)胞表現(xiàn)出少量綠色斑點(diǎn)(圖11)。
LFn-GFP在處理過的細(xì)胞內(nèi)的定位使用與上述圖10-11相同的實(shí)驗(yàn)方法，我們分別用抗溶酶體抗體(圖12)，抗核內(nèi)體抗體(圖13)，抗高爾基抗體(圖14)和抗蛋白體抗體(圖15)取代了抗運(yùn)鐵蛋白抗體。通過比較不同的圖像，具有最多的黃色斑點(diǎn)的圖像是圖15所示的圖像，其中，綠色斑點(diǎn)表示細(xì)胞內(nèi)LFn-GFP與表示細(xì)胞蛋白體的紅色斑點(diǎn)顯著重疊。
PA的存在不能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)LFn-GFP的攝取我們進(jìn)一步檢驗(yàn)了在存在PA的條件下是否能增強(qiáng)LFn-GFP的攝取，檢驗(yàn)是在圖10-15所使用的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的。如圖16所示，與缺乏PA的細(xì)胞相比，添加PA不能增加細(xì)胞內(nèi)綠色斑點(diǎn)的數(shù)量。另外，PA的存在似乎減少了黃色斑點(diǎn)的數(shù)量。很顯然，在這種條件下，這些黃色斑點(diǎn)仍然可能表示LFn-GFP的進(jìn)入仍然是PA非依賴型的。
實(shí)施例3
缺失LFn的N-末端一半，以及明礬對(duì)LFn免疫的佐劑作用其他動(dòng)物免疫結(jié)果表明，包括PA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的LFn的N-末端一半可以缺失，而不會(huì)對(duì)抗原遞送產(chǎn)生負(fù)面影響。非常意外的是，我們發(fā)現(xiàn)添加明礬能顯著增強(qiáng)LFn融合蛋白的CTL誘導(dǎo)。
盡管在過去兩年中進(jìn)行了很多成功的嘗試，我們一直未能證實(shí)在存在PA的條件下LFn-p24能在免疫過的BALB/c小鼠體內(nèi)刺激CTL。以前的研究業(yè)已證實(shí)，諸如LFn-V3，LFn-LLO，和LFn-OVA的LFn融合蛋白能夠在小鼠體內(nèi)刺激特異性CTL(Lu，Y.，等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 978027-32(2000)；Ballard，J.D.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，12531-12534(1996)；Ballard，J.D.，等.，Infect.Immun.66，615-619(1998))。所述融合蛋白僅具有12-33個(gè)氨基酸，而LFn-p24具有大約230個(gè)氨基酸。因此，插入抗原的大小可能產(chǎn)生差異。我們決定檢驗(yàn)添加免疫佐劑是否能提高LFn-p24的免疫原性。在測試過的試劑中，包括重組IL-2，Ig-IL2，CpG，明礬及其他，明礬意外地表現(xiàn)出最佳佐劑活性。人們普遍認(rèn)為某些實(shí)驗(yàn)佐劑，如QS21和PCPP能增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而明礬實(shí)際上能抑制CTL誘導(dǎo)(Schiembeck，R.，等.，J.Immunol.1521110-1119(1994)；Barouch，D.H.等，Science 290486(2000)；Davis，H.L.等.，J.Immunol.160870-876(1998)；Payne，L.G.等.，Dev.Biol.Stand.9279-87(1998))。
圖17中分別用不同的抗原制劑腹膜內(nèi)注射免疫三組BALB/c小鼠，每組4只(15μg LFn-p24加4μg PA，15μg LFn-p24+4μg PA加明礬，15LFn-p24僅加明礬)。在免疫之后1周，將來自免疫過的BALB/c小鼠的脾單核細(xì)胞用作CTL源。通過與來自未免疫過的γ輻射過的和肽脈沖的BALB/c脾細(xì)胞一起培養(yǎng)，體外激活脾培養(yǎng)物中的CTL。在37℃下，在CO2孵育箱中培養(yǎng)6天之后，檢測成熟的CTL(效應(yīng)細(xì)胞)裂解51Cr-標(biāo)記過的P20肽脈沖的P815細(xì)胞(陽性靶細(xì)胞)或51Cr-標(biāo)記過的介質(zhì)脈沖的細(xì)胞(陰性靶細(xì)胞)的能力。所示出的裂解百分比扣除了陰性靶細(xì)胞的本底裂解，并且是以每一組的平均值形式提供的。
如圖17所示，通過添加明礬，我們能夠證明LFn-p24能夠在有或沒有PA的條件下在免疫過的小鼠體內(nèi)刺激特異性CTL。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PA的存在并非是體內(nèi)抗原遞送所必需的。
其中的LFn的N-末端一半業(yè)已缺失的LFn融合蛋白仍然是有活性的。
為了證實(shí)在沒有PA的情況下LFn-p24能夠誘導(dǎo)CTL，我們構(gòu)建了一種突變型LFn融合蛋白(MLFn-p24)，其中，去掉了LFn的N-末端一半(1-149)，以便破壞其結(jié)合PA的能力。我們通過為了測試PA-依賴型膜轉(zhuǎn)運(yùn)而專門設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)了這一點(diǎn)。簡單地講，在4℃下，用CHO-K1細(xì)胞溫育胰蛋白酶切口的PA。然后用冷PBS洗滌所述細(xì)胞，并且與35S-標(biāo)記過的LFn-NG或LFn-ENV一起，在4℃下溫育2小時(shí)。充分洗滌所述細(xì)胞，并且在37℃下接觸MES/葡糖醛酸緩沖液(pH 4.8)2分鐘。然后添加鏈霉蛋白酶E或緩沖液，消化尚未內(nèi)化的表面結(jié)合的LFn融合蛋白。然后再次洗滌所述細(xì)胞，裂解，并且計(jì)數(shù)。按照以下公式計(jì)算通過PA轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白的百分比。比例＝100×(在有PA和鏈霉蛋白酶處理過的細(xì)胞的情況下的計(jì)數(shù)-在沒有PA和鏈霉蛋白酶處理過的細(xì)胞的情況下的計(jì)數(shù))/(在有PA和模擬處理過的細(xì)胞的條件下的計(jì)數(shù)-在沒有PA和模擬處理過的細(xì)胞的條件下的計(jì)數(shù))。在這種特殊測定方法中，PA將高達(dá)7 2％的膜結(jié)合LFn轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，而由PA轉(zhuǎn)運(yùn)的MLFn的量是無法檢測的。
然后，我們?cè)诿庖哌^的小鼠體內(nèi)比較了LFn-p24和MLFn-p24對(duì)CTL的誘導(dǎo)。在圖18中，通過腹膜內(nèi)注射，分別用15μg LFn-p24，15μgMLFn-p24和15μg p24對(duì)三組BALB/c小鼠，每組四只進(jìn)行免疫。免疫1周之后檢測脾組織中的CTL。
如圖18所示，在進(jìn)行一次免疫接種之后，LFn-p24和MLFn-p24都能刺激顯著的CTL活性。事實(shí)上，與LFn-p24誘導(dǎo)的反應(yīng)相比，我們重復(fù)觀察到了由MLFn-p24引起的改進(jìn)的CTL誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了LFn的C-末端一半(150-253)確實(shí)負(fù)責(zé)所述細(xì)胞內(nèi)抗原遞送，因?yàn)閺乃隹乖?p24)中缺失MLFn序列，能破壞有效的CTL誘導(dǎo)。
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權(quán)利要求
1.一種將靶抗原遞送到細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的方法，包括將所述靶抗原結(jié)合于一種轉(zhuǎn)運(yùn)因子，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子包含對(duì)所述細(xì)胞沒有毒性的二分蛋白外毒素的片段，并且，其中不使用保護(hù)性抗原(PA)。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子包含SEQ ID NO2(LFn)或其部分。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子是不包含SEQ ID NO2的結(jié)合PA的部分的片段。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子是LFn的最靠近羧基末端的80個(gè)氨基酸。
5.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子不包含SEQ ID NO2的1-149號(hào)氨基酸。
6.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子是由SEQ ID NO3編碼的。
7.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子是具有至少80個(gè)氨基酸的片段，它與SEQ ID NO2具有至少80％的同源性。
8.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子是具有350個(gè)或更少氨基酸的片段。
9.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子具有300個(gè)或更少氨基酸。
10.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子具有250個(gè)或更少氨基酸。
11.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子具有105個(gè)或更少氨基酸。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子具有SEQ ID NO2的150-253號(hào)氨基酸或更少。
13.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述靶抗原選自下列一組病毒抗原、細(xì)菌抗原和腫瘤抗原。
14.如權(quán)利要求13的方法，其中，所述病毒抗原是HIV抗原。
15.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子通過表達(dá)一種融合多肽與所述靶抗原結(jié)合，其中，由單個(gè)核酸編碼序列編碼所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子和靶抗原。
16.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子通過化學(xué)鍵與所述靶抗原結(jié)合。
17.一種包含靶抗原和轉(zhuǎn)運(yùn)因子的分離的多肽，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子包含二分蛋白外毒素的一個(gè)片段，該片段對(duì)所述細(xì)胞沒有毒性，并且起著將靶抗原遞送到細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的作用。
18.如權(quán)利要求17的分離的多肽，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子不包含與相應(yīng)保護(hù)性抗原(PA)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。
19.一種分離的DNA，它編碼權(quán)利要求18的多肽。
20.如權(quán)利要求16的分離的DNA，還包含含有至少一個(gè)用于表達(dá)肽的啟動(dòng)子序列的5’側(cè)翼區(qū)。
21.一種載體，含有權(quán)利要求20的分離的DNA。
22.一種藥物組合物，包含免疫原性量的分離的包含靶抗原和轉(zhuǎn)運(yùn)因子的多肽，其中，所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子包含二分蛋白外毒素的一個(gè)片段，該片段對(duì)所述細(xì)胞沒有毒性，并且起著將靶抗原遞送到細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的作用，并且其中不存在相應(yīng)的保護(hù)性抗原。
23.如權(quán)利要求22的藥物組合物，還包含一種佐劑。
24.如權(quán)利要求23的藥物組合物，其中，所述佐劑是明礬。
25.一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物權(quán)利要求22的藥物組合物。
26.如權(quán)利要求25的方法，其中，所述藥物組合物是通過皮下或肌內(nèi)給藥方法給藥的。
27.如權(quán)利要求25的方法，其中，所述藥物組合物是通過口服攝取給藥的。
28.一種生產(chǎn)蛋白的方法，包括在一種細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求18的分離的核酸。
29.如權(quán)利要求28的方法，其中，所述細(xì)胞選自下列一組細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
30.如權(quán)利要求29的方法，其中，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
31.一種測定細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的方法，包括將權(quán)利要求17的多肽用于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)測定。
32.如權(quán)利要求31的方法，其中，所述細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)測定選自下列一組Elispot測定和流式細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測定。
33.一種用于體外檢測細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的試劑盒，包含權(quán)利要求17的新多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于將外源蛋白遞送到胞質(zhì)溶膠中的方法，包括將靶抗原(如一種蛋白)結(jié)合于包含二分蛋白外毒素的片段的轉(zhuǎn)運(yùn)因子，但不是相應(yīng)的保護(hù)性抗原。優(yōu)選將所述靶蛋白融合于所述轉(zhuǎn)運(yùn)因子。優(yōu)選的轉(zhuǎn)運(yùn)因子包括來自炭疽芽孢桿菌的致死因子(LFn)的保護(hù)性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它包括1－255號(hào)氨基酸，優(yōu)選與LFn具有至少80％同源性的至少80個(gè)氨基酸的片段，以及來自羧基部分的不結(jié)合PA的大約105個(gè)氨基酸的片段。所述靶抗原可以包括希望誘導(dǎo)CMI反應(yīng)的任何分子，包括病毒抗原和腫瘤抗原。
文檔編號(hào)C12N15/74GK1636060SQ02810886
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2002年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月28日
發(fā)明者Y·盧, H·曹 申請(qǐng)人:哈佛大學(xué)校長及研究員協(xié)會(huì), 綜合醫(yī)院公司