專利名稱：從包膜病毒中回收酶活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從包膜病毒中回收酶活性的方法，例如測(cè)定包裝于包膜病毒中的酶。所述方法特別開(kāi)發(fā)用于除包膜病毒外還含有非保護(hù)性酶的生物樣品。
背景在這一領(lǐng)域中一個(gè)傳統(tǒng)問(wèn)題實(shí)例是在細(xì)胞抽提物或細(xì)胞培養(yǎng)液中測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)時(shí)遇到的。在逆轉(zhuǎn)錄期間RT產(chǎn)生病毒RNA的DNA拷貝。常規(guī)的RT活性測(cè)定通過(guò)利用一個(gè)人造的模板-引物結(jié)構(gòu)和氚化的三磷酸脫氧核苷酸作為核苷酸底物來(lái)完成。該模板/引物對(duì)多聚(rA)/寡聚(dT)是最有效和最多使用的組合來(lái)測(cè)定HIV和其它逆轉(zhuǎn)錄病毒的RT(Baltimore-71，Lee等人-87)。早期已認(rèn)識(shí)到一些細(xì)胞DNA聚合酶使得這類依靠產(chǎn)生可測(cè)量的產(chǎn)物數(shù)量的測(cè)定系統(tǒng)的結(jié)果不明確。
在真核細(xì)胞中已鑒別出至少9種不同類型的DNA聚合酶。聚合酶α在細(xì)胞分裂期間負(fù)責(zé)DNA的復(fù)制，聚合酶β是涉及DNA修復(fù)的主要聚合酶，聚合酶λ負(fù)責(zé)線粒體中的DNA合成。每種細(xì)胞聚合酶以不同的形式出現(xiàn)并與不同的蛋白結(jié)合。它們的酶特性隨它們的分子形式和細(xì)胞類型來(lái)源不同而不同(參見(jiàn)評(píng)論Hübscher等人2000)。此外，細(xì)胞可以包含來(lái)自感染病毒或編碼病毒DNA聚合酶的內(nèi)源病毒基因的酶。細(xì)胞DNA聚合酶中，DNA聚合酶α最少傾向于利用prA作模板，但是有某些分子類型的這種酶可以有效拷貝prA(Goulian & Grimm 1990，Yoshida等人1981)。
實(shí)際上不同的聚合酶在定量逆轉(zhuǎn)錄病毒RT時(shí)，存在特異性問(wèn)題。圍繞這一問(wèn)題的許多方法可以在文獻(xiàn)中看到。最顯而易見(jiàn)的方法是分離病毒與細(xì)胞蛋白質(zhì)。各種方法如離心法或病毒體吸附到特異性受體或抗體上在這種情況均有使用。當(dāng)純化材料包含大量的細(xì)胞組分和微量病毒時(shí)存在的一個(gè)普遍問(wèn)題是不能排除同時(shí)純化的少量細(xì)胞聚合酶。此外，從應(yīng)用角度來(lái)看，用比較麻煩的分離步驟處理大量樣品是沒(méi)有吸引力的。
另一種方法是設(shè)計(jì)同工酶特異性酶測(cè)定條件來(lái)或多或少?gòu)臋z測(cè)中排除細(xì)胞聚合酶，如λ聚合酶。這可以通過(guò)使用抑制劑、交替金屬離子或模板/引物對(duì)來(lái)完成。例如眾所周知聚(2’-O-甲基-rC)n寡聚(dG)12-18是逆轉(zhuǎn)錄病毒RT的高特異性底物。然而經(jīng)這種方法獲得的增強(qiáng)特異性通常受到酶反應(yīng)速度相應(yīng)降低和隨后對(duì)需要檢測(cè)的酶的靈敏度降低的限制。
我們近來(lái)開(kāi)發(fā)了一種用于定量感染人群血漿樣品中的HIV RT的方法。該方法基于病毒結(jié)合到一種具有固定化離子交換劑的凝膠上?？贵w和干擾物質(zhì)經(jīng)沖洗去除而具有酶活性的RT通過(guò)用非離子去污劑裂解固定化病毒回收(Gatu等人2000)。回收的RT量用基于預(yù)先用odT固定化prA的一種靈敏RT測(cè)定來(lái)最終定量。當(dāng)用這個(gè)系統(tǒng)處理來(lái)自健康血液捐獻(xiàn)者的對(duì)照血漿時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)了純化組分中的少量RT活性。
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自健康人的天然EDTA血漿包含比較大量的RT活性，RT活性還主要存在于提取自相同類型樣品的淋巴細(xì)胞組分提取物。這種未分類的酶的一些性質(zhì)描述于表1。在“病毒固定化”后用我們的分離系統(tǒng)回收的活性量小于血漿總活性的千分之一，但足以使少量HIV RT的檢測(cè)不明確。
發(fā)明詳述本發(fā)明針對(duì)上文揭示的具體問(wèn)題提供一種解決方案，但它也普遍適用于檢測(cè)包膜病毒包含的所有的酶。包膜病毒家族以及該家族中一些在人類傳播的包膜病毒的實(shí)例包括痘病毒科病毒(如牛痘和天花)、虹彩病毒科皰疹病毒科(如單純皰疹病毒、水痘病毒、細(xì)胞巨化病毒和Eppstein-Barr病毒)、披膜病毒科(如黃熱病毒、蜱傳(thick-borne)腦炎病毒、風(fēng)疹病毒和熱帶腦炎病毒)、冠狀病毒科(如人冠狀病毒)、副粘病毒科(如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸合胞體病毒)、彈狀病毒科(Rabdoviridae)(如水泡性口膜炎病毒和狂犬病病毒)、纖絲病毒科(如馬爾堡病毒和埃博拉病毒)、正粘病毒科(如流感A和B病毒)、本揚(yáng)病毒科(Bunyaviridae)(如Bwamba病毒、加利福尼亞腦炎病毒、白蛉熱病毒和里夫特山谷熱病毒)、沙粒樣病毒科(如LCM病毒、拉沙熱病毒和Juni病毒)、肝脫氧核糖核酸病毒科(如乙型肝炎病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(如HTLV和HIV)。
本發(fā)明方法基于使用修飾蛋白的化學(xué)物質(zhì)來(lái)破壞非保護(hù)性的溶解酶活性，即游離酶以及與例如蛋白質(zhì)、細(xì)胞成分或細(xì)胞器結(jié)合但不受病毒包膜保護(hù)的酶?；瘜W(xué)物質(zhì)穿透病毒包膜的能力與它的疏水性有關(guān)。如果病毒包膜對(duì)選定的化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生保護(hù)，那么有可能去除或者滅活活性化學(xué)物質(zhì)，裂解病毒體并定量釋放的病毒酶活性量。有許多具有或多或少位點(diǎn)特異性的試劑可用于蛋白修飾(見(jiàn)綜述seMeans & Feeney 1990)。
對(duì)于本發(fā)明方法，已選擇修飾半胱氨酸的物質(zhì)作為蛋白修飾化學(xué)物質(zhì)來(lái)破壞非保護(hù)性酶的活性。對(duì)N-乙基順丁烯二酰亞胺的敏感性已廣泛用于細(xì)胞DNA聚合酶的分類。通常將該試劑直接加入反應(yīng)混合物中，它有效“抑制”所有哺乳動(dòng)物DNA聚合酶，DNA聚合酶β除外。在不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒RT的共有氨基酸序列中半胱氨酸的數(shù)量具有顯著差異，即HIV 1 RT僅有2個(gè)半胱氨酸，HIV 2有3個(gè)半胱氨酸，小鼠白血病病毒(MULV)有8個(gè)半胱氨酸，而禽類成髓細(xì)胞瘤/肉瘤病毒在β亞基上有12個(gè)半胱氨酸。因此可預(yù)料病毒RT對(duì)半胱氨酸修飾的敏感性存在顯著的差異。修飾HIV RT中的半胱氨酸殘基的作用已有研究，并且至少HIV 1和HIV 2 RT的DNA聚合酶活性是相當(dāng)穩(wěn)定的(Hizi等人1992)?？紤]到已記載的不同HIV株中的巨大變異，這不見(jiàn)得對(duì)全部HIV分離株都成立。
更具體地講，本發(fā)明涉及一種從包含非保護(hù)性酶的生物樣品中的包膜病毒中回收酶活性的方法，該方法包括以下步驟a)將所述生物樣品和半胱氨酸改性物質(zhì)溫育以破壞非保護(hù)性酶的活性而保留病毒包膜內(nèi)的病毒酶活性，b1)從所述溫育混合物中取出包膜病毒體，或b2)用一種使病毒包膜不被裂解的滅活物質(zhì)滅活半胱氨酸改性物質(zhì)，c)用一種裂解緩沖液裂解所述病毒包膜來(lái)釋放病毒酶，d)從所述裂解緩沖液中回收所釋放的病毒酶。
在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，包膜病毒選自逆轉(zhuǎn)錄病毒科家族，特別選自慢病毒屬、HTLV/BLV病毒、哺乳動(dòng)物D-型逆轉(zhuǎn)錄病毒和哺乳動(dòng)物C-型逆轉(zhuǎn)錄病毒。
在優(yōu)選實(shí)施方案中所述慢病毒屬是人類免疫缺陷性病毒(HIV)。
在另一實(shí)施方案中回收的病毒酶活性是逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性。
在本發(fā)明方法的又一實(shí)施方案中生物樣品是一種體液樣品。體液的實(shí)例有尿、唾液、腦脊髓液、滑液、胸膜液、腹水液，特別是血液、血漿和血清。
在本發(fā)明方法的更進(jìn)一步實(shí)施方案中所述半胱氨酸改性物質(zhì)是一種水溶性非親脂物質(zhì)，如N-乙基順丁烯二酰亞胺、硫柳汞、對(duì)羥基汞基苯甲酸酯、5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，2-氨乙基2’-氨基乙烷硫代磺酸酯，2-硝基-5-硫氰基苯甲酸和甲基甲烷硫代磺酸酯。
再一個(gè)實(shí)施方案中所述滅活物質(zhì)是一種溫和的低分子量還原劑，如半胱氨酸、半胱胺、巰基琥珀酸或谷胱甘肽。
本發(fā)明還涉及一種商業(yè)包裝盒，其包括從存在于生物樣品中的包膜病毒中回收酶活性的實(shí)驗(yàn)步驟的書(shū)面說(shuō)明書(shū)和/或數(shù)據(jù)載體說(shuō)明書(shū)以及一種半胱氨酸改性物質(zhì)，如N-乙基順丁烯二酰亞胺、醋酸苯汞、硫柳汞、對(duì)羥基汞基苯甲酸酯、或5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)。所述商業(yè)包裝盒也可任選包含病毒結(jié)合基質(zhì)，如陰離子交換基質(zhì)，或一種滅活所述半胱氨酸改性物質(zhì)而保持病毒包膜不被裂解的物質(zhì)，如半胱氨酸、半胱胺、巰基琥珀酸、或谷胱甘肽，以及一種裂解緩沖液，如包含去污劑的適合酶測(cè)定的緩沖液。
現(xiàn)在通過(guò)對(duì)各種實(shí)驗(yàn)、實(shí)施例和附圖的全面描述來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于所公開(kāi)的實(shí)施方案。
實(shí)驗(yàn)概述下列方法是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明而不是限制它的使用。本發(fā)明的兩個(gè)不同的實(shí)施方案可用做不同的目的。方案I)主要用于含有酶活性封閉性抗體的樣品(如HIV病人血清陽(yáng)轉(zhuǎn)后的血漿)，它在測(cè)定病毒酶活性前必須先除去。下面方案中的聚合酶滅活步驟可用單獨(dú)溫育步驟完成。也可以選擇在病毒體結(jié)合于凝膠上的同一步驟中完成。這可以通過(guò)直接加半胱氨酸改性物質(zhì)到血漿/凝膠漿混合物中或通過(guò)所述物質(zhì)先結(jié)合到凝膠上、然后再加入血漿樣品來(lái)實(shí)行。所需的改性物質(zhì)濃度可以隨方法而變化。方案II)可用于基本沒(méi)有干擾因子如酶封閉性抗體的樣品，如HIV急性期血清。
I)用于測(cè)定含RT封閉性抗體的材料的逆轉(zhuǎn)錄病毒RT的方案，所述方案以破壞可溶性的細(xì)胞酶繼之以從微型柱分離病毒RT為基礎(chǔ)1)標(biāo)記所需使用的5ml塑料管。將它們放于Nalgene盒子中。加1ml樣品(如HIV感染個(gè)體的EDTA血漿)到每種標(biāo)記的管中。加入100μl66mM的5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)緩沖水溶液，渦旋混合并于室溫下溫育樣品1小時(shí)。
在這個(gè)過(guò)程中游離的血漿酶活性被破壞而病毒體內(nèi)包含的酶仍保持完整。然后通過(guò)幾個(gè)分離步驟從5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、酶活性封閉性抗體以及其它可能干擾病毒RT定量的物質(zhì)中純化病毒體。以下的方案以使用FractogelEMD TMAE Hicap凝膠為基礎(chǔ)。
2)仔細(xì)懸浮所述分離膠并向每個(gè)樣品的預(yù)處理管中轉(zhuǎn)移1500μl凝膠漿。
3)將所述試管放入軌道式搖床上于室溫溫育樣品和凝膠漿1小時(shí)。
4)標(biāo)記所需數(shù)目的15ml塑料微型柱，以鑒定要分析的樣品。將所述柱管安裝在一個(gè)柱型洗滌裝置中，如Supelco Visiprep固相提取真空歧管。轉(zhuǎn)移上述結(jié)合管中的內(nèi)容到它們相應(yīng)的柱中。轉(zhuǎn)移前短暫渦旋所述塑料管以均勻分散凝膠。
5)當(dāng)所有微型柱被填充后，用真空吸干凝膠。關(guān)閉真空并開(kāi)始用9ml緩沖液A填充每一微型柱進(jìn)行洗滌。當(dāng)所有的微型柱被填充后，用真空吸干凝膠。
6)再重復(fù)步驟5三次，總共洗滌4次。每次洗滌后吸干凝膠。在第4次洗滌后吸干凝膠后，關(guān)閉真空并繼續(xù)第7步。
所述洗滌步驟從系統(tǒng)中除去了未結(jié)合的RT封閉性抗體和5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)。
7)向所有干膠中加入9ml調(diào)節(jié)緩沖液(B)。用真空吸干凝膠。
8)重復(fù)步驟7。在關(guān)閉真空控制前所有的調(diào)節(jié)緩沖液(B)已從凝膠中去除。
9)卸下柱狀洗滌裝置的上部分。將具有標(biāo)記塑料管的管架安裝入一個(gè)干凈的容器中。重新安裝裝置的上部分?？刂扑鲂」軓拿恳恢艹寥肫湎鄳?yīng)的塑料管中。
10)加300μl裂解緩沖液(C)到每一柱管中。讓所述緩沖液位于柱管中5分鐘。然后，用真空慢慢吸干凝膠。這樣每管將含有大約300μl病毒裂解產(chǎn)物。
從第10步的裂解產(chǎn)物中回收的RT活性基本上沒(méi)有RT封閉性抗體和細(xì)胞聚合酶活性，而且可以用靈敏的RT活性測(cè)定方法，例如基于Ekstrand等人1996年描述的方法Cavidi-HS-kit Lenti RT，定量測(cè)定所述RT活性。
注意RT酶對(duì)半胱氨酸改性物質(zhì)不敏感，例如野生型HIV 1 RT，任選在有高達(dá)5mM 5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)存在的情況下測(cè)定。
另一方面，敏感性酶如MuLV RT和來(lái)自于某些治療抗性HIV 1病毒株的RT，需要添加巰基還原劑(如半胱氨酸或半胱胺)到裂解緩沖液中。
II)用于測(cè)定樣品中基本沒(méi)有酶封閉性抗體的RT活性的方案，如HIV急性期血漿或病毒培養(yǎng)上清夜，所述方案以可溶的細(xì)胞酶滅活接著以5，5′-二硫代雙(2-確基苯甲酸)滅活為基礎(chǔ)。
1)將200μl樣品(如HIV急性期血漿)與20μl 33mM 5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)緩沖水溶液混合。于室溫下將樣品在軌道式搖床上溫育1小時(shí)。
2)加入巰基還原劑，如20μl 33mM半胱胺，于室溫下將樣品在軌道式搖床上再溫育30分鐘。
3)用含去污劑如triton X-100的適合RT測(cè)定的緩沖液四倍系列稀釋樣品?，F(xiàn)在所述病毒體裂解并且每一稀釋液的RT活性可以用靈敏的RT測(cè)定如Cavidi-HS-kit Lenti RT來(lái)測(cè)定。
4)如果樣品稀釋度和形成的產(chǎn)物量之間呈線性關(guān)系，則最初樣品中的RT活性量根據(jù)稀釋度范圍內(nèi)數(shù)值來(lái)計(jì)算。
實(shí)施例材料分離膠如FractogelEMD TMAE或FractogelEMD TMAE Hicap在200mM(2-(N-嗎林代)乙磺酸)(MES)pH5.4，275mM碘化鉀和肝素80IU/ml中的分離膠。
微型柱如Biorad Poly-Prep(7311553)微型柱洗滌裝置如Supelco Visiprep固相提取真空歧管。
塑料管如Nunc4.5ml冷凍管。
半胱氨酸改性劑，例如66mM 5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)于0.4M三(羥乙基)氨基甲烷的緩沖水溶液中(pH6.8)。
溫和的巰基還原劑，如33mM半胱胺水溶液。
洗滌緩沖液(A)20mM MES pH6.0，500mM醋酸鉀(KAc)。
調(diào)節(jié)緩沖液(B)一種適合RT測(cè)定的緩沖液，如10mM(N-(2-羥乙基-哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(Hepes)pH7.6，25mM KAc，20mM氯化鎂(MgCl2)，0.2mM乙二醇雙(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)，2mM精胺和0.5mg/ml加熱滅活的牛血清白蛋白。
裂解緩沖液(C)一種適合RT測(cè)定的緩沖液，包括一種去污劑如1％t-八苯氧基聚乙氧基乙醇(triton X-100)、一種酶穩(wěn)定劑如13ng/ml寡聚(dT22)、0.025mg/ml硫酸葡聚糖以及與調(diào)節(jié)緩沖液(B)同樣的組分。由于RT對(duì)SH氧化/修飾敏感，所以在處理含RT的病毒時(shí)可任選添加一種巰基還原劑，如0.2mM半胱胺。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了用硫柳汞預(yù)保溫對(duì)血清/血漿中不同聚合酶活性的作用。重組野生型HIV 1 RT(■)，來(lái)自一種HIV 1突變體(Y181C)的重組RT(◇)，Jaagsiekte病毒RT(▲)，F(xiàn)IV RT(○)，牛白血病病毒(BLV)RT(◆)，豬內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)RT(●)以及來(lái)自健康血液捐獻(xiàn)者的血漿樣品(□)。
圖2顯示A和B兩個(gè)圖表，表明了從摻入FIV的血漿回收的病毒RT活性和選擇性破壞內(nèi)源性RT活性。來(lái)自健康血液捐獻(xiàn)者的已破壞淋巴細(xì)胞的EDTA血漿(左側(cè)柱)和滅活胎牛血清稀釋的FIV(右側(cè)柱)與A)5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，和B)硫柳汞溫育?；厥盏腞T活性對(duì)物質(zhì)濃度做圖。
圖3顯示了消除來(lái)自健康血液捐獻(xiàn)者的血漿樣品中的聚合酶活性的圖。
圖4顯示了按照本發(fā)明回收自人血漿的HIV RT與用RNA PCR測(cè)量的病毒RNA之間的相關(guān)性。
圖5顯示了用替代方案處理來(lái)自HIV感染患者的血漿樣品的圖。在方案I中聚合酶滅活步驟如下進(jìn)行A)單獨(dú)溫育；B)在病毒結(jié)合到凝膠的同一步驟中進(jìn)行；C)同B，但是凝膠和所述物質(zhì)一起貯藏；D)同C，但是凝膠用之前進(jìn)行洗滌。血漿RT活性(◆)，HIV RT活性(●)。
圖6顯示了未經(jīng)純化的具有高內(nèi)源性RT活性的樣品中病毒RT的定量。來(lái)自健康血液捐獻(xiàn)者的EDTA血漿(A)，滅活FCS中的FIV病毒(B)和細(xì)胞培養(yǎng)基中的FIV病毒(C)。
實(shí)施例1.來(lái)自人血漿的DNA聚合酶的一些性質(zhì)。
研究在缺乏引物的RT反應(yīng)混合物(Cavidi HS-kit Lenti RT)中添加指示成分的作用。來(lái)自兩個(gè)健康血液捐獻(xiàn)者的EDTA血漿(1μl/測(cè)定)、重組HIV 1 RT或細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)源的FIV RT用作酶。結(jié)果列于表1。
人血漿聚合酶活性依賴于引物，對(duì)通過(guò)ddNTP與模板互補(bǔ)的抑制作用敏感，但對(duì)焦磷酸鹽類似物不敏感。
實(shí)施例2.各種半胱氨酸-改性劑破壞人血漿聚合酶活性的能力。
50μl人EDTA血漿樣品和50μl系列稀釋每種物質(zhì)樣品混合。將所述樣品在軌道式搖床上溫育一小時(shí)。然后將每種樣品稀釋20倍，用CavidiHS kit Lenti RT測(cè)量殘余的聚合酶活性。每一物質(zhì)濃度下的聚合酶活性換算成沒(méi)有改性物質(zhì)存在下溫育血漿的對(duì)照的百分比，以物質(zhì)濃度作圖，50％酶活性降低所需的物質(zhì)濃度從圖中獲得。
缺少內(nèi)源性RT活性的人血漿HIV病毒按照“用于測(cè)定來(lái)自含RT封閉性抗體的材料的逆轉(zhuǎn)錄病毒RT的方案”用5mM所示物質(zhì)處理。用CavidiHS kit Lenti RT測(cè)定回收的HIV RT。結(jié)果列于表2。
實(shí)施例3.用硫柳汞溫育對(duì)血清/血漿中不同聚合酶的作用。
將重組野生型HIV 1 RT(■)，來(lái)自Nevirapine抗性HIV 1突變體(Y181C)的重組RT(◇)，來(lái)自綿羊肺癌的Jaagsiekte病毒(JSV)RT(▲)，貓白血病病毒(FIV)RT(○)，牛白血病病毒(BLV)RT(□)和來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)RT(●)稀釋于加熱滅活的胎牛血清。將所述不同的病毒酶制劑和來(lái)自健康血液捐獻(xiàn)者的EDTA血漿樣品(□)用指定濃度的硫柳汞于室溫(22℃)溫育60分鐘。將所有樣品用適合RT測(cè)定的緩沖液稀釋100倍，然后測(cè)定每種樣品中的殘余RT活性。三種RT測(cè)定，每種適合測(cè)量的RT類型HIV 1、JSV、和FIV RT用CavidiHS kit Lenti RT測(cè)量。BLV RT用CavidiHS kit HTLV RT測(cè)量，PERV和人血漿RT用CavidiHS kit Mn2+RT測(cè)量。結(jié)果列于圖1。
所研究的7種酶顯示了對(duì)硫柳汞處理的敏感性存在顯著差異。HIV 1 Y181C突變體RT和FIV RT是最敏感酶。在人血漿RT、BLV RT和PERV RT中需增加硫柳汞濃度才能有效破壞酶活性。兩種酶即野生型HIV 1 RT和JSV RT是完全抗性。
實(shí)施例4.從摻入FIV的血漿回收病毒RT活性和選擇性破壞內(nèi)源性RT活性。
將來(lái)自健康血液捐獻(xiàn)者的已破壞淋巴細(xì)胞的EDTA血漿和稀釋于滅活胎牛血清的FIV(完全缺乏血漿RT活性)與指定濃度的以下組分于室溫溫育1小時(shí)A)5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，B)硫柳汞。所述樣品按照“用于測(cè)定來(lái)自含RT封閉性抗體的材料的逆轉(zhuǎn)錄病毒RT的方案”進(jìn)行分離。用一種RT測(cè)定(Cavidi HS kit Lenti RT)來(lái)確定回收的RT活性。將每一活性值換算成由不含任何巰基活性物質(zhì)溫育制備的相同步驟的對(duì)照的百分比。相對(duì)于該對(duì)照的FIV RT的回收率是最初樣品活性的74％，人血漿RT的對(duì)應(yīng)數(shù)字是0.015％。見(jiàn)圖2，其中左側(cè)柱是血液捐獻(xiàn)者血漿，右側(cè)柱是胎牛血清中的FIV病毒。
用濃度大于0.4mM的5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溫育完全消除了人血漿RT活性但不減少FIV病毒體相關(guān)性RT的回收。
需要高濃度的硫柳汞(＞3mM)對(duì)血漿RT達(dá)到類似的效果。這一濃度范圍的硫柳汞顯著降低了FIV RT的回收。
實(shí)施例5.來(lái)自健康血液捐獻(xiàn)者的血漿樣品中聚合酶活性的消除。
將兩套來(lái)自21個(gè)健康血液捐獻(xiàn)者的1ml EDTA血漿樣品按照“用于測(cè)定來(lái)自含RT封閉性抗體的材料的逆轉(zhuǎn)錄病毒RT的方案”進(jìn)行處理。5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)處理(步驟A)對(duì)一套樣品省略而用于另一套樣品。采用CavidiHS kit Lenti RT，在過(guò)夜RT測(cè)定中測(cè)定從每種樣品中回收的RT活性的量。見(jiàn)圖3，其中左手組表示按所述方案進(jìn)行的未處理的樣品。右手組是處理后按同樣方法進(jìn)行的樣品。分離對(duì)照，如適合樣品分離的緩沖液給出的值在每小時(shí)262rfu和1100rfu之間。熒光計(jì)的檢測(cè)范圍高達(dá)大約1800 000rfu。
實(shí)施例6.按照本發(fā)明從人血漿回收的HIV RT活性和用RNA PCR測(cè)定的病毒RNA之間的相關(guān)性。
將來(lái)自HIV感染個(gè)體的1ml EDTA血漿樣品按照“用于測(cè)定來(lái)自含RT封閉性抗體的材料的逆轉(zhuǎn)錄病毒RT的方案”進(jìn)行處理，并且采用CavidiHS kit Lenti RT在過(guò)夜RT測(cè)定中測(cè)定從每種樣品中回收的RT活性的量。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所獲得的RT活性換算成pgHIV 1 RT。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)HIV 1 RNA PCR(Roche，Amplicore)測(cè)定每個(gè)樣品中HIV 1 RNA的量。圖4中給出的曲線限于PCR值＞500拷貝/ml的樣品。
發(fā)現(xiàn)按照本發(fā)明回收的血漿RT的量和用PCR測(cè)定的HIV RNA的量之間密切相關(guān)(r＝0.93，n＝33，p＜＜0.001)。
實(shí)施例7.用于處理來(lái)自HIV感染患者的血漿樣品的替代方案。
在“用于測(cè)定來(lái)自含RT封閉性抗體的材料的逆轉(zhuǎn)錄病毒RT方案”中聚合酶滅活步驟以四種方式進(jìn)行A)將血漿和物質(zhì)單獨(dú)溫育。B)病毒體結(jié)合于凝膠的同時(shí)進(jìn)行溫育。C)貯藏期間凝膠漿中包括所述物質(zhì)并且將所述預(yù)處理的凝膠用于RT分離。D)所述物質(zhì)首先結(jié)合于凝膠，未結(jié)合物質(zhì)通過(guò)洗滌除去并且經(jīng)處理的凝膠按照所述方案來(lái)使用。結(jié)果列于圖5。血漿RT活性(◆)，HIV RT活性(●)。
發(fā)現(xiàn)所有四種替代方案都有效，如滅活了血漿RT活性而不影響HIV RT活性，但是需要定量消除人血漿聚合酶活性的物質(zhì)量是不同的。
實(shí)施例8.用不同的半胱氨酸改性劑處理后血漿聚合酶活性的恢復(fù)。
首先將一套人血漿樣品(60％血漿溶液)和3mM指定的半胱氨酸-改性物質(zhì)或水(對(duì)照)于室溫溫育1小時(shí)。然后加入5種潛在的再活化物的系列稀釋物，并且將樣品再溫育1小時(shí)。每種樣品最終以1∶20稀釋并用CavidiHS kit Lenti RT測(cè)定殘余RT活性。在樣品溫育和RT測(cè)定之間物質(zhì)濃度共減少200倍。回收的RT活性換算成兩步溫育期間由不存在添加物的溫育血漿對(duì)照的活性百分比。結(jié)果列于表3。
三種測(cè)試的半胱氨酸改性劑都有能力完全滅活血漿RT活性。然而在需要恢復(fù)活性的聚合酶中用不同試劑處理的情況存在明顯差異。用硫柳汞處理的酶非常容易恢復(fù)活性而用5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)或氯胺T處理的酶需要硫醇類低分子量強(qiáng)還原劑來(lái)活化。
從表3可明顯看出，有必要避免使用很強(qiáng)的拮抗劑來(lái)滅活聚合酶改性劑。因?yàn)榇嬖诨謴?fù)血漿聚合酶活性的危險(xiǎn)！實(shí)施例9.不用純化的具高內(nèi)源性RT活性的樣品中病毒RT的定量。
將A)來(lái)自健康血液捐獻(xiàn)者的EDTA血漿，B)以加熱滅活的FCS稀釋的FIV病毒(缺乏RT活性)或C)含5％FCS的Dulbeco必需培養(yǎng)基以1∶1稀釋并與指定濃度的5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)于室溫(20℃)溫育1小時(shí)。然后將每種樣品以調(diào)節(jié)緩沖液(B)連續(xù)稀釋四倍。然后向所有樣品中加入半胱胺至終濃度為20mM，將該套樣品于室溫再溫育1小時(shí)。接著用CavidiHS kit Lenti RT測(cè)定每種樣品的RT活性。向135μl反應(yīng)混合物中加入15μl的每種樣品，使得測(cè)定中半胱胺的終濃度為2mM。經(jīng)RT測(cè)定相當(dāng)于7.5，1.9和0.5μl的三個(gè)初始樣品稀釋物中回收的RT活性，換算成不存在物質(zhì)溫育對(duì)照的百分比并對(duì)物質(zhì)濃度作圖，見(jiàn)圖6。
用濃度大于0.47mM的5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溫育后消除了人血漿聚合酶活性。用濃度小于1.88mM的物質(zhì)溫育對(duì)FIV病毒RT的回收沒(méi)有不利影響。因此天然樣品中的FIV RT可以用濃度范圍在2mM左右的5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溫育后進(jìn)行選擇性測(cè)定。
表1.人血漿中未鑒定RT的一些性質(zhì)odTRT測(cè)定所示酶的活性(％)加入指定成分量(ng)HIVFIV 血漿1 血漿2無(wú) 0 0 0 0 0無(wú) 3 95 93 47 51無(wú)*12100100100 100KCl(0.1M)a1287 11017 20ddTTP(2.5 10-6M)a1218 28 7 9ddCTP(2.5 10-6M)a1289 75 94 103ddGTP(2.5 10-6M)a1294 93 103 109ddATP(2.5 10-6M)a1290 79 94 105PFA(1mM)a121 ND 92 94*100％RT活性的對(duì)照條件a在RT測(cè)定中的終濃度PFA＝磷酸甲酸三鈉(trisodium phosophonoformate)
表2.能夠破壞人血漿RT活性的物質(zhì)HIV病毒體對(duì)血漿RT的作物質(zhì)名稱 RT的回收率用ED50(mM)*(％)a醋酸苯汞0.11 69硫柳汞 0.25 130對(duì)羥基汞基苯甲酸酯 0.12 72N-乙基順丁烯二酰亞胺0.18 1575，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 0.018 1202-氨乙基2’-氨基乙烷硫代磺酸酯 0.18 1122，2’-二硫代吡啶 0.04 1002-硝基-5-硫代氰基苯甲酸 0.272甲基甲烷硫代磺酸酯 0.184*ED50有效劑量50。減小血漿RT活性50％所需的物質(zhì)濃度。a用5mM指定的物質(zhì)溫育并按方案I純化從人血漿病毒體中回收的HIV RT。
表3.用半胱氨酸-改性劑處理后血漿聚合酶活性的恢復(fù)首次溫育中 用指定物質(zhì)第二次溫育后的聚合酶活性(對(duì)照a的％)的破壞試劑 濃度(mM) 半胱氨酸 半胱胺 DTTbMSAc谷胱甘肽 水無(wú)30198 6 8607 13 10010145 6 76764 80 1003.3 829 61311078 1001.1 7215 26010972 1003mM硫柳汞 30681 4483.47 010372 3777.337 03.3 140 24819 21 01.1 4 0 84 17 12 03mM DNBAd307 1 1220 2 0100 0 1430 1 03.3 1 0 1 0 0 01.1 0 0 0 0 0 03mM氯胺T 309 0 94 0 0 0104 0 80 1 3 03.3 2 0 51 0 0 01.1 1 0 2 6 0 0a沒(méi)有破壞試劑溫育的對(duì)照。b二硫蘇糖醇。c巰基琥珀酸。d5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)
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權(quán)利要求
1.一種從包含非保護(hù)性酶的生物樣品中的包膜病毒回收酶活性的方法，所述方法包括以下步驟a)將所述生物樣品和半胱氨酸改性物質(zhì)溫育以破壞非保護(hù)性酶活性而保留病毒包膜內(nèi)的病毒酶活性，b1)從所述溫育混合物中取出所述包膜病毒顆粒，或b2)用一種滅活物質(zhì)滅活所述半胱氨酸改性物質(zhì)，而保持所述病毒包膜不被裂解，c)用一種裂解緩沖液溶解所述病毒包膜而釋放所述病毒酶，e)從所述裂解緩沖液中回收所釋放的病毒酶。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述包膜病毒選自逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中病毒選自慢病毒屬(Lentiviruses)、HTLV/BLV病毒、哺乳動(dòng)物D-型逆轉(zhuǎn)錄病毒和哺乳動(dòng)物C-型逆轉(zhuǎn)錄病毒。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述慢病毒是人類免疫缺陷性病毒(HIV)。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述回收的病毒酶活性是逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物樣品是一種體液樣品。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述體液樣品是血液樣品、血漿樣品或血清樣品。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述半胱氨酸-改性物質(zhì)是一種水溶性非親脂物質(zhì)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述水溶性非親脂物質(zhì)選自N-乙基順丁烯二酰亞胺、硫柳汞、對(duì)羥基汞基苯甲酸酯、5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、2-氨乙基2’-氨基乙烷硫代磺酸酯、2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸和甲基甲烷硫代磺酸酯。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述滅活物質(zhì)是一種溫和還原劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述溫和還原劑選自半胱氨酸、半胱胺、巰基琥珀酸和谷胱甘肽。
12.一種商業(yè)包裝盒，所述包裝盒包含用于從生物樣品中存在的包膜病毒中回收酶活性的實(shí)驗(yàn)步驟的書(shū)面說(shuō)明書(shū)和/或數(shù)據(jù)載體說(shuō)明書(shū)以及一種半胱氨酸改性物質(zhì)，以及任選一種病毒結(jié)合基質(zhì)，或一種滅活所述半胱氨酸-改性物質(zhì)而保持所述病毒包膜不被裂解的物質(zhì)，以及一種裂解緩沖液。
13.權(quán)利要求12的商業(yè)包裝盒，其中所述半胱氨酸-改性物質(zhì)選自N-乙基順丁烯二酰亞胺、硫柳汞、對(duì)羥基汞基苯甲酸酯、5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、2-氨乙基2’-氨基乙烷硫代磺酸酯、2-硝基-5-硫代氰基苯甲酸和甲基甲烷硫代磺酸酯，所述病毒結(jié)合基質(zhì)是一種陰離子交換基質(zhì)，所述滅活物選自半胱氨酸、半胱胺、巰基琥珀酸和谷胱甘肽，并且所述裂解緩沖液是一種適合于酶測(cè)定的包含去污劑的緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種從存在于含非保護(hù)性酶的生物樣品中的包膜病毒(如HIV)中回收酶活性(例如逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性)的方法。一種半胱氨酸改性物質(zhì)用于破壞所述非保護(hù)性的酶活性，接著取出所述包膜病毒體或用化學(xué)物質(zhì)滅活所述半胱氨酸改性物質(zhì)。然后裂解所述病毒包膜并回收釋放的酶。本發(fā)明還公開(kāi)了商業(yè)包裝盒，該包裝盒含有用于從包膜病毒回收酶活性的實(shí)驗(yàn)步驟的書(shū)面說(shuō)明書(shū)和/或數(shù)據(jù)載體說(shuō)明書(shū)以及一些化學(xué)試劑。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1513116SQ02811088
公開(kāi)日2004年7月14日 申請(qǐng)日期2002年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月5日
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