專利名稱：提純寡核苷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提純寡核苷酸的新方法。更準確地說，本發(fā)明涉及使用物理方法使寡核苷酸從溶液中沉淀和分離的提純寡核苷酸的新方法。
背景技術(shù)：
寡核苷酸及其類似物被開發(fā)和在分子生物學(xué)如在各種方法中用作探針、引物、接頭、銜接物和基因片段。寡核苷酸在諸如治療、診斷和科研領(lǐng)域內(nèi)發(fā)揮重要作用。
已知多細胞有機體的大多數(shù)身體狀態(tài)、包括大多數(shù)疾病狀態(tài)受到蛋白質(zhì)影響。這些蛋白質(zhì)直接起作用或通過它們的酶催化功能或者其它功能起作用，以主要比例促成動物和人類的許多疾病和調(diào)節(jié)功能。對于疾病狀態(tài)而言，經(jīng)典治療通常聚焦在與這些蛋白質(zhì)的相互作用上，進而減輕它們的疾病引發(fā)或者疾病增強功能。在新式治療方法中，希望調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的實際產(chǎn)生。通過干擾蛋白質(zhì)的產(chǎn)生可能獲得具有最小副作用的最大治療效果。因此這些治療方法的一般目標是干擾或以另外的方式調(diào)節(jié)導(dǎo)致非需要蛋白質(zhì)形成的基因表達。
一種用于抑制特異基因表達的方法是使用寡核苷酸、尤其是與特殊靶信使RNA(mRNA)序列互補的寡核苷酸。用于這種用途的幾種寡核苷酸目前正處于臨床試驗階段。硫代磷酸酯寡核苷酸目前在人的臨床試驗中用作反義藥劑、包括用作抗病毒藥用于各種疾病狀態(tài)。人們也提出了其它作用機制。例如，轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中干擾雙鏈DNA。寡核苷酸可用作轉(zhuǎn)錄因子的競爭性抑制劑調(diào)節(jié)它們的作用。幾個最近的報告描述了這些相互作用(參見，Bielinska，A.等人，Science，1990年，250卷，997-1000頁；和Wu，H.等人，Gene，1990年，89卷，203-209頁)，作為參考以全文引入本文。
寡核苷酸及其類似物除了用作蛋白質(zhì)的間接和直接調(diào)節(jié)劑之外，也在診斷性試驗中獲得應(yīng)用。這些診斷性試驗可以使用諸如生物流體、組織、完整細胞或者分離的細胞成分進行。如同基因表達抑制一樣，診斷應(yīng)用利用了寡核苷酸及其類似物與核酸互補鏈雜交的能力。雜交是寡聚化合物通過Watson-Crick和/或Hoogsteen堿基對序列特異性氫鍵鍵合到RNA或者DNA上。這些堿基對的堿基可以說是彼此互補。
寡核苷酸及其類似物也廣泛用作科研試劑。它們用于了解許多其它生物分子的功能以及用于其它生物分子的制備中。例如，在PCR反應(yīng)中使用寡核苷酸及其類似物作為引物擴大了商品化工業(yè)。PCR已經(jīng)成為商業(yè)和科學(xué)研究實驗室的支柱，PCR的應(yīng)用成倍增加。例如，目前PCR技術(shù)在法學(xué)、古生物學(xué)、進化研究和遺傳咨詢中獲得應(yīng)用。商業(yè)上開發(fā)了試劑盒，協(xié)助未經(jīng)過分子生物學(xué)培訓(xùn)的人員應(yīng)用PCR。天然和合成的寡核苷酸及其類似物在這些PCR技術(shù)中都用作引物。
寡核苷酸及其類似物也用于其它實驗室研究方法。部分這些用途的描述參見普通實驗室操作指南，如Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第二版，J.Sambrook等人主編，美國冷泉港實驗室出版社編輯，1989年；和Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn).M.Ausubel等人主編，Current Publications，1993年；每個作為參考以全文被引入本文。這些用途包括諸如合成寡核苷酸探針、用抗體和低聚化合物篩選表達文庫、DNA測序、DNA通過聚合酶鏈式反應(yīng)的體外擴增、和克隆DNA的定向位點誘變。參見Molecular Cloning第二冊，ALaboratory Manual，supra。也參見“DNA-蛋白質(zhì)相互作用和聚合酶鏈式反應(yīng)”(DNA-protein interactions and the polymerase chain reaction)，Current Protocols in MolecularBiology，第二卷，supra；每個作為參考以全文引入本文。
因為廣泛應(yīng)用，寡核苷酸及其類似物被定制以提供所需用途的性質(zhì)。因此，許多化學(xué)修飾被引入到寡聚化合物中作為科學(xué)研究試劑和治療實體增加它們在診斷中的效用。這些修飾包括但不限于下述目的的修飾用來增加與靶點鏈的結(jié)合、幫助識別寡核苷酸或者寡核苷酸-靶點復(fù)合體、增加細胞滲透、穩(wěn)定那些降解或者干擾寡核苷酸及其類似物的結(jié)構(gòu)或活性的核酸酶及其他酶、一旦序列特異性結(jié)合到靶點上提供一種破壞方式(終止事件)、改善寡核苷酸的藥代動力學(xué)性質(zhì)、以及調(diào)節(jié)寡核苷酸的攝取和細胞分布。
對天然存在的寡核苷酸的修飾包括，例如，使用非同位素標記諸如熒光素、生物素、洋地黃毒苷、堿性磷酸酯酶或其它報道分子進行標記。為增加最后得到的類似物的核酸酶穩(wěn)定性，對磷酸核糖主鏈進行了其它修飾。這些修飾的實例包括但不限于膦酸甲酯、硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯鍵連和2′-O-甲基核糖糖單位的引入。
也可修飾反義寡核苷酸使其與親脂分子偶聯(lián)。親脂偶聯(lián)物的存在顯示可改善寡核苷酸的細胞滲透，因此改善了細胞內(nèi)寡核苷酸的分布。更進一步，在細胞培養(yǎng)研究中，寡核苷酸與親脂分子偶聯(lián)能提高寡核苷酸的自由攝取而無需任何轉(zhuǎn)染劑。偶聯(lián)的寡核苷酸也能改善含磷酸二酯鍵連的寡核苷酸的蛋白質(zhì)結(jié)合。隨著這些化合物成功地用于診斷和治療用途，也需要改良的寡核苷酸及其類似物。
化學(xué)文獻公開了許多通過含磷酸共價鍵連偶聯(lián)核苷以生成確定序列的寡核苷酸的方法。最通行的方法之一是亞磷酰胺技術(shù)(例如參見，Advances in the Synthesis of oligonucleotides by the PhosphoramiditeApproach，Beaucage，S.L.；Iyer，R.P.，四面體，1992年，48卷，2223-2311頁及該文引用的參考文獻以全文引入本文作為參考)，其中含游離羥基的核苷或者寡核苷酸與受保護的氰乙基亞磷酰胺單體在弱酸存在下反應(yīng)形成亞磷酸酯鍵合結(jié)構(gòu)。亞磷酸酯鍵連的氧化和隨后氰乙基的水解生成所需要的磷酸二酯鍵連或者硫代磷酸酯鍵連。
酰胺乙基作為某些磷酸二酯的保護基的能力首次被Ziodrou和Schmir.Zioudrou等人，J.Amer.Chem.Soc.，85卷，3258頁，1963年觀察到；作為參考以全文引入本文。這種方法的一種形式被推廣到使用oxaphospholidine核苷構(gòu)件作為常規(guī)亞磷酰胺的代用品進行寡核苷酸二聚體和低聚物的固相合成。Iyer等人，四面體通訊，39卷，2491-2494頁，1998年；1996年12月12日出版的PCT國際公開WO/9639413；每個作為參考以全文引入本文。Wilk等人，有機化學(xué)雜志，62卷，6712-6713頁，1997年，也報道了Wilk等人使用N-三氟乙酰基-氨基鏈烷醇作為磷酸酯保護基的相似方法，J.Org.Chem.62卷，6712-6713頁，1997年；作為參考以全文引入本文。這種脫保護由下述機制所決定N-三氟乙?；某?，然后氨基烷基磷酸三酯環(huán)化成氮雜環(huán)烷烴(azacyclane)，環(huán)化過程伴有磷酸二酯基的釋放。
固相技術(shù)在寡核苷酸合成方法中繼續(xù)發(fā)揮巨大作用。通常將3′-most核苷固著在用羥基或者氨基殘基官能化的載體上，然后以分步方式向其中加入額外的核苷，在引入核苷的3′-官能團和載體結(jié)合核苷的5′-羥基之間形成需要的鍵。不言而喻，這種分步組裝需要審慎選擇合適的保護基。這些保護基用于防護長大的低聚物的核苷堿基部分的磷部分，直到低聚物從載體上切割掉。
切割以后，為生產(chǎn)純化寡核苷酸產(chǎn)品，寡核苷酸在有些情況下通常必須進行處理和加工，如脫保護、沉淀和分離。沉淀方法是用逆溶劑處理溶液中的寡核苷酸產(chǎn)物形成凝聚固體懸浮液。然后從液相中分離該固體產(chǎn)物。全面記載了用于寡核苷酸沉淀和干燥的確定方法。寡核苷酸可以制備如下例如，在Maniatis的Techniques in MolecularBiology中所述技術(shù)。
一種用于提純寡核苷酸的技術(shù)包括，例如用反相HPLC分離和匯集的DMT-保護的全長部分在-20℃的大體積乙醇中沉淀，用恒流高速離心(15K)分離，然后在水中重建。通過酸化使寡核苷酸水溶液的pH值為3.3-4.1除去4，4′-二甲氧基三苯甲基醚保護基。反應(yīng)完成后，用3M乙酸鈉稀釋該溶液，然后在-20℃的乙醇中沉淀，通過高速離心分離并重新溶解在水中。用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)寡核苷酸水溶液的pH值為7.0-7.4，在-20℃的乙醇中沉淀，通過恒流高速離心分離，然后在水中重建。最終重新形成的寡核苷酸水溶液通過冷凍干燥使用56小時干燥周期進行干燥。
然而，上述提純方案要求使用通常僅能加工相對小批量寡核苷酸的昂貴高速離心機。另外，上述方法要需要將大量溶劑冷卻到-20℃。
根據(jù)上文，仍舊需要改良的提純寡核苷酸的方法。尤其是需要迅速而有效地生產(chǎn)高收率的純化寡核苷酸的方法。該方法可優(yōu)選在周圍溫度下進行。另外，該方法優(yōu)選使用節(jié)約成本的分離技術(shù)使純化寡核苷酸能夠從溶液中分離。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于提純寡核苷酸和高收率地生產(chǎn)純化寡核苷酸產(chǎn)品的新方法。更準確地說，本發(fā)明涉及用于聚集寡核苷酸和分離得到的聚集物的新方法。本發(fā)明方法可以在周圍溫度下操作并允許使用節(jié)約成本的物理技術(shù)分離聚集物。本發(fā)明也涉及用于小規(guī)模和大規(guī)模操作的節(jié)約成本的下游加工技術(shù)。
本發(fā)明涉及用于提純寡核苷酸的方法，所述的方法包括步驟在足夠形成寡核苷酸聚集物的條件下，使寡核苷酸與聚集劑和沉淀增強劑反應(yīng)；分離出寡核苷酸聚集物，形成分離的寡核苷酸。在某些實施方案中，聚集劑是醇類，諸如甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇或變性乙醇。在其它實施方案中，沉淀增強劑包括鹽，諸如鈉鹽(Na+)、鋰鹽(Li+)、銨鹽(NH4+)、鉀鹽(K+)、鎂鹽(Mg+)、銫鹽(Cs+)或鋅鹽(Zn+)。例如，沉淀增強劑可以是乙酸鈉(NaOAc)或氫氧化鈉(NaOH)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，寡核苷酸是存在于溶液中的保護的寡核苷酸。保護基包括但不限于三甲氧三苯甲基、二甲氧三苯甲基、一甲氧基三苯甲基、9-苯基呫噸-9-基和9-(對甲氧苯基)呫噸-9-基。寡核苷酸在溶液中的存在濃度優(yōu)選至少約550OD/ml，至少約600OD/ml或者至少約650OD/ml。
在本發(fā)明的其它實施方案中，寡核苷酸是存在于溶液中的脫保護的寡核苷酸。所述寡核苷酸在溶液中的存在濃度優(yōu)選至少約2250OD/ml，約2500OD/ml-約7500OD/ml，或者約4500OD/ml-約6500OD/ml。
盡管可以在寬的反應(yīng)溫度范圍內(nèi)使用聚集劑處理寡核苷酸，然而優(yōu)選在約15℃-約25℃、更優(yōu)選在約18℃-約20℃之間使用所述聚集劑處理寡核苷酸。
在某些實施方案中，用所述沉淀增強劑處理寡核苷酸先于用所述聚集劑處理所述寡核苷酸。另外，用所述聚集劑處理寡核苷酸可以先于用所述沉淀增強劑處理所述的寡核苷酸，或者可以用所述沉淀增強劑和所述聚集劑的混合物處理寡核苷酸。
寡核苷酸可以存在于溶液中。當寡核苷酸存在于溶液中時，優(yōu)選以約1份溶液對至少約1.5份(體積)聚集劑、更優(yōu)選約2份-約4份聚(體積)集劑、甚至更優(yōu)選約2.5份-約4.5份聚集劑(體積)的比率用聚集劑處理寡核苷酸。
在某些實施方案中，通過高速或者低速離心使寡核苷酸從所述溶液中分離。另外，可以通過重力沉降或者過濾使寡核苷酸從所述溶液中分離。
在優(yōu)選方案中，純化寡核苷酸的制備如下在足夠形成第一寡核苷酸聚集物的條件下，用聚集劑處理包含5′-保護的寡核苷酸的第一溶液，分離寡核苷酸，然后將分離的寡核苷酸聚集物溶解，形成第二溶液。用脫保護試劑處理第二溶液除去5′-保護基，在足夠形成第二寡核苷酸聚集物的條件下用聚集劑和沉淀增強劑處理第二溶液，使寡核苷酸聚集物分離和溶解，形成第三溶液。在足夠形成第三寡核苷酸聚集物的條件下，用聚集劑和沉淀增強劑處理第三溶液，形成第三寡核苷酸聚集物，分離第三寡核苷酸聚集物，提供純化寡核苷酸。
在另一個實施方案中，純化寡核苷酸的制備如下在足夠形成第一寡核苷酸聚集物的條件下，用聚集劑和沉淀增強劑處理包含寡核苷酸的第一溶液，分離和溶解分離出的第一寡核苷酸聚集物，形成第二溶液；在足夠形成第二寡核苷酸聚集物的條件下，用聚集劑和沉淀增強劑處理第二溶液，形成第二寡核苷酸聚集物，分離第二寡核苷酸聚集物，生成純化寡核苷酸。
第一溶液可以通過酸化含有5′-保護的寡核苷酸的HPLC洗脫液制備，其中洗脫液是通過切割及堿解封的5′-保護的寡核苷酸的HPLC提純生成。
在其它實施方案中，得到的純化寡核苷酸純度至少約90％、更優(yōu)選至少約98％。在某些實施方案中，第一溶液是得自粗寡核苷酸的高壓液相層析的洗脫液，其中使用裝載反相介質(zhì)或者強陰離子交換樹脂的柱進行高壓液相層析。
附圖簡述

圖1表示可用于本發(fā)明的制備寡核苷酸的固相合成方案。
圖2提供可用于圖1所述合成方案中的亞磷酰胺實例。
圖3表示載體結(jié)合分子的二甲氧三苯甲基脫保護，然后是縮合反應(yīng)，其中載體結(jié)合分子與活化的2′-脫氧或者2′-甲氧基乙基修飾的亞磷酰胺單體反應(yīng)。
圖4表示四唑與載體結(jié)合分子的5′-羥基反應(yīng)生成亞磷酸三酯和1-H-四唑的等價物。
圖5表示將0.2M苯乙酰二硫化物(PADS)在乙腈∶3-甲基吡啶為1∶1的混合物中形成的溶液遞送到反應(yīng)柱中使亞磷酸三酯硫化，該反應(yīng)形成相應(yīng)的硫代磷酸三酯。
圖6表示封端反應(yīng)步驟，其中通過在吡啶/乙腈中遞送乙酸酐與乙腈和N-甲基咪唑形成的混合物，使任何未反應(yīng)的5′-羥基被乙?；?。圖6也表示出最終步驟，其中通過過濾除去載體并用乙醇和水的混合物洗滌。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于提純寡核苷酸的方法，其中在足夠形成寡核苷酸聚集物的條件下，使所述寡核苷酸與至少一種聚集劑和至少一種沉淀增強劑反應(yīng)；然后分離寡核苷酸聚集物，提供分離的寡核苷酸。當寡核苷酸是聚集物形式時，主要由于其大小和質(zhì)量，寡核苷酸的分離變得更為方便。例如，聚集的寡核苷酸更大，因此更容易通過過濾分離。同樣，聚集物更重，在離心或者沉降方法過程中對引力效應(yīng)更敏感。
通過變更反應(yīng)條件，諸如所使用的聚集劑、所使用的沉淀增強劑、溶劑溫度、溶劑與寡核苷酸比、成分添加順序、寡核苷酸濃度和/或溶劑類型，寡核苷酸可以高效聚集，然后分離，得到純化材料。本文公開的本方法提供了常規(guī)提純方法之外的替代節(jié)約成本的方法，因為本發(fā)明方法可以不使用諸如高速離心機、冷卻器和冷凍干燥機的設(shè)備而操作，因此減少生產(chǎn)時間和成本。另外，根據(jù)本發(fā)明使反應(yīng)條件最佳化，可以獲得極高收率的純化寡核苷酸。
本發(fā)明的術(shù)語“寡核苷酸”包括但不限于含有許多通過含磷鍵連諸如亞磷酸酯、磷酸二酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯鍵連連接的單體亞單位的化合物。通過使用硫代磷酸酯核苷間鍵連，可使寡核苷酸具有核酸酶抗性。因此寡聚化合物包括寡核苷酸、其類似物和合成寡核苷酸。
如本文所用，術(shù)語“寡聚核苷”包括含有兩個或更多的具有非磷連接部分的核苷亞單位的低聚物或者聚合物。寡聚核苷可以有具有通過糖基鍵附著于雜環(huán)堿基部分上的呋喃核糖部分的單體亞單位或者核苷。
可以連接寡核苷酸和寡聚核苷，得到嵌合寡聚化合物。除天然存在的磷酸二酯連接基團之外，含磷和非磷的連接基團可用于制備寡核苷酸、寡聚核苷和寡聚嵌合化合物(寡聚化合物)，所述連接基團包括但不限于以下基團含磷鍵連二硫代磷酸酯(-O-P(S)(S)-O-)；硫代磷酸酯(-O-P(S)(O)-O-)；氨基磷酸酯(-O-P(O)(NJ)-O-)；膦酸酯(-O-P(J)(O)-O-)；磷酸三酯(-O-P(OJ)(O)-O-)；氨基磷酸酯(-O-P(O)(NJ)-S-)；硫羰烷基膦酸酯(-O-P(S)(J)-O-)；硫代烷基磷酸三酯(-O-P(O)(OJ)-S-)；硼烷基磷酸酯(-R5-P(O)(O)-J-)；含非磷鍵連硫代二酯(-O-C(O)-S-)；硫代氨基甲酸酯(-O-C(O)(NJ)-S-)；
硅氧烷(-O-Si(J)2-O-)；氨基甲酸酯(-O-C(O)-NH-和-NH-C(O)-O-)；氨基磺酸酯(-O-S(O)(O)-N-和-N-S(O)(O)-N-)；嗎啉代磺酰胺(-O-S(O)(N(嗎啉代)-)；磺酰胺(-O-SO2-NH-)；硫化物(-CH2-S-CH2-)；磺酸酯(-O-SO2-CH2-)；N，N′-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)；硫代甲縮醛(-S-CH2-O-)；甲縮醛(-O-CH2-O-)；酮縮硫醇(-S-C(J)2-O-)；和酮縮醇(-O-C(J)2-O-)；胺(-NH-CH2-CH2-)；羥胺(-CH2-N(J)-O-)；羥基亞胺(-CH＝N-O-)；和肼基(-CH2-N(H)-N(H)-)。
“J”代表通常是氫或者烷基的取代基，但是其可以是一種類型的鍵連與另一種類型的鍵連不同的更復(fù)雜基團。
除了上述包括天然存在鍵連中一種或者多種-O-P(O)2-O-原子被修飾或者取代之外，連接基團可包括5′-亞甲基和天然存在鍵連中一個或多個原子的修飾。無限制地，這種類型的鍵連包括如下鍵連酰胺(-CH2-CH2-N(H)-C(O))和-CH2-O-N＝CH-；和烷基磷(-C(J)2-P(＝O)(OJ)-C(J)2-C(J)2-)。
其中J如上所述。
用于合成上述取代核苷間鍵連的合成方案公開在WO91/08213、WO90/15065、WO91/15500、WO92/20822、WO92/20823、WO91/15500、WO89/12060、EP216860、US92/04294、US90/03138、US91/06855、US92/03385、US91/03680、美國專利申請07/990,848、07,892,902、07/806,710、07/763,130、07/690,786、5,466,677、5,034,506、5,124,047、5,278,302、5,321,131、5,519,126、4,469,863、5,455,233、5,214,134、5,470,967、5,434,257、Stirchak，E.P.等人，Nucleic Acid Res.，1989年，17卷，6129-6141頁；Hewitt，J.M.等人，1992年，11卷，1661-1666頁；Sood，A.等人，J.Am.Chem.Soc.，1990年，112卷，9000-9001頁；Vaseur，J.J.等人，J.Amer.Chem.Soc.，1992年，114卷，4006-4007頁；Musichi，B.，等人，J.Org.Chem.，1990年，55卷，4231-4233頁；Reynolds，R.C.等人，J.Org.Chem.，1992年，57卷，2983-2985頁；Mertes，M.P.等人，J.Med.Chem.，1969年，12卷，154-157頁；Mungall，W. S.等人，J.Org.Chem.，1977年，42卷，703-706頁；Stirchak，E.P.等人，J.Org.Chem.，1987年，52卷，4202-4206頁；Coull，J.M.等人，Tet.Lett.，1987年，28卷，745頁；和Wang，H.，等人，Tet.Lett.，1991年，32卷，7385-7388頁；作為參考以全文引入本文。
可以對核苷酸的糖、堿基、或者磷酸酯基作其它修飾。代表性修飾公開在1991年7月25日公開的WO91/10671、1992年2月20日公開的WO92/02258、1992年3月5日公開的WO92/03568和美國專利5,138,045、5,218,105、5,223,618、5,359,044、5,378,825、5,386,023、5,457191、5,459,255、5,489,677、5,506,351、5,541,307、5,543,507、5,571,902、5,578,718、5,587,361、5,587,469中，所有專利轉(zhuǎn)讓給本申請的受讓人。上面每個引用出版物的公開作為參考引入本文。
本文使用的術(shù)語“寡核苷酸類似物”是指可以含有天然存在(即“天然的”)和非天然存在的合成部分例如含有修飾的糖和/或核堿基(nucleobase)的核苷(nucleosidic)亞單位的化合物。這些寡核苷酸類似物通常在結(jié)構(gòu)上與天然存在或者合成的野生型寡核苷酸有區(qū)別，但是在功能上是可交換的。因此，寡核苷酸類似物包括所有可有效起到模擬所需要的RNA或者DNA鏈結(jié)構(gòu)和/或功能作用、例如通過雜交到靶點上的這些結(jié)構(gòu)。術(shù)語“合成核苷”是指修飾核苷。代表性的修飾包括核苷的雜環(huán)堿基部分的修飾給出非天然存在的核堿基、核苷的糖部分的修飾和/或核苷間鍵連的修飾。
本文使用的“未修飾的”或者“天然的”核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤和鳥嘌呤，及嘧啶堿基胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶。“修飾的”或者“非天然存在的”核堿基包括其它的合成和天然核堿基，諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和5-鹵代胞嘧啶、5-丙炔尿嘧啶和5-丙炔胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫醇基、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代特別是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-脫氮鳥嘌呤和8-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。另外的核堿基包括美國專利3,687,808公開的核堿基以及Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering，858-859頁，Kroschwitz，J，I.主編，John Wiley & Sons，1990年中公開的核堿基、Englisch等人，Angewandte Chemie，國際版，1991年，30卷，613頁公開的核堿基以及Sanghvi Y.S.，第15章，Antisense Research andApplications，289-302頁，Crooke，S.T.和Lebleu，B.主編，CRC出版社，1993年中公開的核堿基，每個作為參考以全文引入本文。
某些雜環(huán)堿基部分特別用于增加寡聚化合物與互補靶點的結(jié)合親合力。這些雜環(huán)堿基包括5-取代嘧啶、6-偶氮嘧啶和N-2、N-6和0-6取代嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘌呤和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲胞嘧啶取代表明可使核酸雙螺旋穩(wěn)定性增加0.6-1.2℃(標識符，276-278頁)，該取代目前是優(yōu)選的堿基取代，甚至更特別的是當與選擇性2′-糖修飾如2-甲氧基乙基相結(jié)合時仍優(yōu)選該取代。
指導(dǎo)雜環(huán)堿基部分(修飾核堿基)制備的代表性美國專利包括但不限于US3,687,808、4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941和5,808,027，其中某些專利是共同所有，每個專利作為參考以全文引入本文。
本文使用的術(shù)語“2-取代基”是指選擇性附著在糖的2′-位的基團。然而，取代基團可以另外地或者額外地附著在糖的其它位置(如3′-和/或5′-位)、選定的雜環(huán)堿基部分或者在雜環(huán)堿基與糖部分兩者上。
取代基的代表性列表包括氫、羥基、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C5-C20芳基、O-烷基、O-烯基、O-炔基、O-烷基氨基、O-烷基烷氧基、O-烷基氨基烷基、O-烷基咪唑、S-烷基、S-烯基、S-炔基、NH-烷基、NH-烯基、NH-炔基、N-二烷基、O-芳基、S-芳基、NH-芳基、O-芳烷基、S-芳烷基、NH-芳烷基、N-苯二酰亞氨基、鹵素(尤其是氟)、氨基、硫醇基、酮基、羧基、硝基、亞硝基、腈、三氟甲基、三氟甲氧基、咪唑、疊氮基、肼基、羥氨基、異氰酸根合、亞砜、砜、硫化物、二硫化物、甲硅烷基、芳基、雜環(huán)、碳環(huán)、嵌入劑、報道基團、共軛物、聚胺、聚酰胺、聚二醇和式(O-烷基)m醚，其中m是1-約10。在這些聚醚中，優(yōu)選線形和環(huán)狀的聚乙二醇(PEGs)和含(PEG)基團，如冠醚及Ouchi等人(Drug Design and Discovery，1992年，9卷，93頁)、Ravasio等人(有機化學(xué)雜質(zhì)，1991年，56卷，4329頁)和Delgardo等人(Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1992年，9卷，249頁)公開的聚醚，每個作為參考以全文引入本文。其它糖修飾公開在Cook，P.D.，Anti-Cancer DrugDesign，1991年，6卷，585-607頁中，其作為參考以全文引入本文。氟代、O-烷基、O-烷氨基、O-烷基咪唑、O-烷基氨基烷基和烷氨基取代在美國專利6,166,197中描述，作為參考以全文引入本文。
寡聚化合物包括大量的鍵合核苷，其中優(yōu)選的核苷間鍵連是3′，5′-鍵連。然而，可另外使用2′，5′-鍵連(如1998年7月14日提交的美國專利申請09/115,043)。2′，5′-鍵連是將核苷酸亞單位糖部分的2′-位與臨近核苷酸亞單位糖部分的5′-位共價連接的鍵連。
本文所述寡核苷酸可有不對稱中心。除非另有陳述，所有手性的、非對映的和消旋形式歸入本發(fā)明。幾何異構(gòu)體也可能存在于本文所述化合物中，所有這些穩(wěn)定的異構(gòu)體都被本發(fā)明所預(yù)計到?？梢岳斫夂胁粚ΨQ取代碳原子的化合物可以以旋光活性形式或者消旋形式或者通過合成分離。
所有存在于中間體或者最終化合物中的原子的同位素歸入本發(fā)明。同位素包括具有相同原子序數(shù)和不同質(zhì)量數(shù)的原子。非限制性地舉例來說，氫的同位素包括氚和氘。
一些代表性修飾寡聚化合物包括至少一個含有以下取代基之一的核苷C1-C10低級烷基、取代低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或者O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代甲硅烷基、RNA切割基團、報道基團、嵌入劑、用于改善寡聚化合物藥代動力學(xué)性質(zhì)的基團、或者用于改善寡聚化合物藥效性質(zhì)的基團及其它具有相似性質(zhì)的取代基。優(yōu)選的修飾包括2′-甲氧乙氧基[2′-OCH2CH2OCH3、亦稱′-O-(2-甲氧基乙基)或者2′-MOE](Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995年，78卷，486頁)，即烷氧烷氧基。另外優(yōu)選的修飾是2′-二甲氨氧乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦稱2′-DMAOE。代表性氨氧取代基在1999年6月25日提交的題目為“氨氧-官能化低聚物”的共有美國專利申請09/344,260；以及1999年8月9日提交的題目為“氨氧官能化低聚物及其制造方法”的美國專利申請09/370,541中描述，作為參考以全文引入本文。
其它優(yōu)選的修飾包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。也可以對核苷和低聚物上的其它位置、尤其是3′末端核苷上糖的3′-位或者在具有來自2′-位鍵連如2′-5′鍵合低聚物的核苷的3′位以及在核苷5′末端核苷的5′位進行類似的修飾。低聚物也可具有糖模擬物如環(huán)丁基部分代替戊呋喃妥英基糖。指導(dǎo)這些修飾糖結(jié)構(gòu)制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,0531、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，一種某些專利是共有的，每個作為參考以全文引入本文，并且1995年6月5日提交的共有美國專利申請08/468,037也作為參考引入本文。
本發(fā)明的寡聚化合物可被用于診斷、治療和作為科研試劑和試劑盒。它們通過包括一種合適的可藥用稀釋液或者載體可被用于藥物組合物。另外它們可被用于治療患有以不需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)生為特征的有機體。有機體應(yīng)該與含有能與編碼不需要蛋白質(zhì)的核酸鏈進行特異雜交序列的寡核苷酸接觸?？梢詫膯渭毎松锖驼婧松锏蕉嗉毎婧松锏挠袡C體進行這種類型的治療。任何利用DNA-RNA轉(zhuǎn)錄或者RNA-蛋白質(zhì)翻譯作為其遺傳、代謝或細胞控制基本部分的有機體對本發(fā)明的治療和/或預(yù)防性治療敏感?？雌饋硗耆煌挠袡C體，諸如細菌、酵母、原生動物、海藻、所有植物和所有的高等動物形式，包括恒溫動物，可以進行治療。另外，可以治療多細胞真核生物的每個細胞，因為它們包括DNA-RNA轉(zhuǎn)錄和RNA-蛋白質(zhì)翻譯作為其細胞活動的主要部分。此外，許多真核細胞的細胞器(如線粒體和葉綠體)也包括轉(zhuǎn)錄和翻譯機制。因此，單細胞、細胞群或者細胞器也可以歸入可以用治療或者診斷寡核苷酸治療的有機體的定義內(nèi)。
本文要求保護的合成方法中的反應(yīng)在有機合成領(lǐng)域技術(shù)人員易理解的適當?shù)娜軇┲羞M行，適當?shù)娜軇┩ǔＪ窃诜磻?yīng)進行的溫度，即從溶劑凝固溫度到溶劑沸點溫度之間的溫度內(nèi)，與原始材料(反應(yīng)物)、中間體或者產(chǎn)物基本不反應(yīng)的任何溶劑。給定反應(yīng)可以在一種溶劑或者多于一種溶劑的混合物中進行。用于特殊反應(yīng)步驟的適當?shù)娜軇┛筛鶕?jù)特殊的反應(yīng)步驟選擇。
用于組裝本發(fā)明的低聚物的方法包括液相和固相化學(xué)方法。代表性液相技術(shù)在轉(zhuǎn)讓給本發(fā)明受讓人的美國專利5,210,264中描述，其作為參考以全文引入本文。代表性固相技術(shù)是通常使用的用標準亞磷酰胺化學(xué)的DNA和RNA合成用固相技術(shù)，(例如參見，Protocols ForOligonucleotides And Analogs，Agrawal，S.主編，Humana出版社，Totowa，NJ，1993年，作為參考以全文引入本文)。
本發(fā)明的載體包括本技術(shù)領(lǐng)域通常已知的用在固相方法學(xué)中的載體，例如包括可控孔度玻璃(CPG)、草酰-可控孔度玻璃(例如參見，Alul等人，Nucleic Acids Research，1991年，19卷，1527頁，作為參考以全文引入本文)，TentaGel載體--氨基聚乙二醇衍生化載體(例如參見，Wright等人，四面體通訊，1993年，34卷，3373頁，作為參考以全文引入本文)和Poros--一種聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。
使用一種具體合成方案，固相合成使用亞磷酰胺作為活化磷酸酯化合物。在這種技術(shù)中，亞磷酰胺單體與正在長大的低聚物鏈上的游離羥基反應(yīng)，生成亞磷酸酯化合物中間體，用標準方法使該中間體氧化成PV態(tài)。這種技術(shù)通常用于幾種類型鍵連，包括磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯鍵的合成。
通常，這種方法的第一步是使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的標準方法和程序進行第一單體或者高級亞單位與載體的附著。載體是在固相合成方法學(xué)中能夠起固相作用的底物，諸如Caruthers的美國專利4,415,732、4,458,066、4,500,707、4,668,777、4,973,679和5,132,418及Koster的美國專利4,725,677和參考34,069中所述的載體。連結(jié)物任選位于末端核苷酸和載體之間。連結(jié)物是本領(lǐng)域已知的用來連結(jié)載體與固相合成技術(shù)中起始合成子分子的官能團(如羥基)的短分子。例如，適當?shù)倪B結(jié)物公開在Oligonucleotides And Analogues A PracticalApproach，Ekstein，F(xiàn).主編，IRL出版社，N.Y.，1991年，第一章，1-23頁，作為參考以全文引入本文。
然后處理載體結(jié)合單體或者高級合成子，從游離終端除去保護基。通常，用酸完成這種處理。然后載體結(jié)合單體或者高級低聚物與各個單體或者高級構(gòu)件(如合成子)反應(yīng)，形成具有亞磷酸酯或者硫代亞磷酸酯鍵連的化合物。在更優(yōu)選實施方案中，合成子在無水條件下在活化劑諸如，例如1H-四唑、5-(4-硝基苯基)-1H-四唑或者二異丙氨基四唑存在下反應(yīng)。
本發(fā)明可以使用保護的和未保護寡核苷酸?！氨Ｗo的寡核苷酸”是指寡核苷酸上的潛在活性基團通過可逆化學(xué)修飾被修飾的寡核苷酸。本文使用的術(shù)語“保護性基團”和“保護基”包括但不限于三甲氧三苯甲基、二甲氧三苯甲基、一甲氧三苯甲基、9-苯基呫噸-9-基和9-(對甲氧基苯基)呫噸-9-基、叔丁氧基羰基、芐氧羰基、三甲苯基(2，4，6-三甲苯基)酯、苯甲酰酯、叔丁基二苯基甲硅烷基酯、三苯基甲基(三苯甲基；Tr)、S-叔丁基、S-p-丁基、S-對硝基芐基和S-對甲氧基芐基和苯二酰亞氨基(例如參見，Greene和Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis；第二版，John Wiley & Sons，紐約，1991年)，作為參考以全文引入本文。
寡核苷酸任選存在于溶液中。適當?shù)娜軇┛扇菀椎乇槐绢I(lǐng)域技術(shù)人員推斷出，包括在所用反應(yīng)溫度與反應(yīng)物、中間體或者產(chǎn)物基本不反應(yīng)的任何溶劑。盡管可以使用任何的各種溶劑，所述溶劑也優(yōu)選起到下面所討論的聚集劑的作用。寡核苷酸在溶液中的濃度在相當大范圍內(nèi)變化。例如，可使用約550OD/mL-約475OD/mL濃度的寡核苷酸。然而，可以理解，寡核苷酸在溶液中的濃度取決于各種因素，包括所使用的溶劑、寡核苷酸性質(zhì)。尤其是，當提純?nèi)芤褐械氖鼙Ｗo寡核苷酸時，寡核苷酸在溶液中的存在濃度優(yōu)選至少為550OD/mL，更優(yōu)選至少約600OD/mL，甚至更優(yōu)選至少約700OD/mL，仍然更優(yōu)選至少約850OD/mL。當寡核苷酸是存在于溶液中的脫保護寡核苷酸時，該寡核苷酸在所述溶液中的存在濃度至少約2250OD/mL，更優(yōu)選至少約2500OD/mL，優(yōu)選至少約3000OD/mL，更優(yōu)選至少約4500OD/mL，甚至更優(yōu)選至少約6500OD/mL，仍然更優(yōu)選至少約7500OD/mL。
本文使用的術(shù)語“OD/mL”是指使用紫外(UV)分光光度計在260nm和1cm路徑長度測量的吸光率。
本發(fā)明的術(shù)語“聚集劑”包括但不限于可用于直接處理寡核苷酸或者處理存在于溶液中的寡核苷酸而形成聚集物或者固體的部分。本發(fā)明適當?shù)木奂瘎┌ǖ幌抻诖贾T如甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇和變性乙醇。
本文使用的術(shù)語“寡核苷酸聚集物”和“聚集物”是指具有通過物理方法可進行分離大小和質(zhì)量的寡核苷酸簇。用于分離寡核苷酸聚集物的物理方法包括但不限于離心、重力沉降和過濾。
本文使用的術(shù)語“沉淀增強劑”是指對沉淀產(chǎn)生有利效應(yīng)的物質(zhì)。在一個實施方案中，沉淀增強劑包括鹽。適合用作沉淀增強劑的鹽包括但不限于鈉鹽(Na+)、鋰鹽(Li+)、銨鹽(NH4+)、鉀鹽(K+)、鎂鹽(Mg+)、銫鹽(Cs+)和鋅鹽(Zn+)。有用鈉鹽的具體實例包括乙酸鈉(NaOAc)和氫氧化鈉(NaOH)。
寡核苷酸在足夠形成寡核苷酸聚集物的條件下與聚集劑和沉淀增強劑反應(yīng)。得到的純化寡核苷酸產(chǎn)物純度至少約90％、更優(yōu)選至少約98％。使用本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)，諸如毛細管凝膠電泳或者質(zhì)譜法確定得到的寡核苷酸的純度％。
可單獨選擇每個反應(yīng)物(如寡核苷酸、聚集劑、沉淀增強劑和/或溶劑)的溫度、反應(yīng)物的添加順序、寡核苷酸濃度與聚集劑濃度的比使得寡核苷酸聚集物的形成最優(yōu)化。
反應(yīng)物的溫度可以在很寬范圍內(nèi)變動。例如，可以冷卻一種或者多種反應(yīng)物。然而，甚至當本發(fā)明在環(huán)境溫度或者室溫使用反應(yīng)物時可以得到高產(chǎn)率的分離寡核苷酸。因此，避免使用昂貴的冷凝器及其相關(guān)時間限制，優(yōu)選在室溫(優(yōu)選約15℃-約25℃，更優(yōu)選約18℃-約20℃)使用該反應(yīng)物。
另外，反應(yīng)物的混合順序可以變化。具體地說，反應(yīng)物可以進行如下混合(a)用沉淀增強劑處理寡核苷酸先于用聚集劑處理；(b)用聚集劑處理寡核苷酸先于用沉淀增強劑處理；和(c)可以用沉淀增強劑和聚集劑的混合物處理寡核苷酸。優(yōu)選用沉淀增強劑處理寡核苷酸先于用聚集劑處理。
寡核苷酸濃度與聚集劑濃度的比也可以變化。例如，當寡核苷酸在溶液中時，寡核苷酸溶液與聚集劑的體積比優(yōu)選是1份溶液對至少約1.5份、更優(yōu)選至少約2份和甚至更優(yōu)選至少約2.5份的聚集劑。盡管可以使用超過約1∶2.5的溶液對聚集劑的比，仍優(yōu)選該比保持在1份溶液對低于約4.5份的、更優(yōu)選對低于約4份的聚集劑，因為使用更多聚集劑的成本低于所得到的收益。
一旦形成寡核苷酸聚集物，則分離寡核苷酸聚集物，形成分離的寡核苷酸。由于寡核苷酸聚集物的大小和質(zhì)量，可有利地使用用于分離寡核苷酸聚集物的物理方法。例如，寡核苷酸可以通過高速離心、低速(如優(yōu)選低于每分鐘約3000轉(zhuǎn)、更優(yōu)選低于約2500轉(zhuǎn))離心、重力沉降和/或過濾分離。
所使用的具體分離方法至少在某種程度上可能影響其它反應(yīng)條件(如所使用的聚集劑和/或溶液對聚集劑濃度的比)的選擇。例如，當使用離心或者重力沉降時，優(yōu)選用聚集劑以1份寡核苷酸對約5份聚集劑的體積比處理寡核苷酸。更準確地說，當使用離心來分離用乙醇處理過的寡核苷酸時，寡核苷酸溶液對聚集劑的體積比優(yōu)選1份寡核苷酸溶液對約2-約4份聚集劑。同樣地，當使用離心來分離用1-丙醇、異丙醇和/或變性乙醇處理過的寡核苷酸時，寡核苷酸溶液對聚集劑的體積比優(yōu)選1份寡核苷酸對約3份的聚集劑。當使用重力沉降分離用乙醇處理過的寡核苷酸時，寡核苷酸溶液對聚集劑的體積被優(yōu)選1份寡核苷酸對約2-約4.5份的聚集劑。另外，當使用重力沉降處理用1-丙醇、異丙醇和/或變性乙醇處理過的寡核苷酸時，寡核苷酸溶液對聚集劑的體積比優(yōu)選1份寡核苷酸對約3份聚集劑。
將理解本發(fā)明方法可以用作寡核苷酸制備和/或處理過程的一部分。因此，本發(fā)明方法可與各種預(yù)處理和/或后處理步驟結(jié)合。例如，在聚集劑和沉淀增強劑與寡核苷酸反應(yīng)之前，寡核苷酸反應(yīng)可是受保護的、脫保護的和/或重建的。另外，被分離的寡核苷酸在另外使用之前可以被重建。另外，將理解可以連續(xù)使用多個沉淀步驟。
本說明書言及或者提到的每一專利、申請、印刷出版物及其它公開文獻將作為參考以全文引入本文。
本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，可以對本發(fā)明的更優(yōu)實施方案進行各種改變和修改，所作的這些改變和修改未脫離本發(fā)明的精神。因此，所附的權(quán)利要求書覆蓋所有這些屬于本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的對等變異。
實施例本發(fā)明方法的效果在下面實施例闡述。尤其是，該實施例表示各種影響寡核苷酸的沉淀性質(zhì)包括溫度溶劑、溶劑與寡核苷酸的比、成分的添加順序、寡核苷酸濃度和溶劑類型的因素效應(yīng)。
寡核苷酸沉淀使用的溶劑是乙醇、用5％甲醇變性的乙醇、1-丙醇和異丙醇(IPA)。在DMT-脫去的寡核苷酸沉淀過程中使用3.0M的NaOAc誘導(dǎo)相變。使用序列、嘌呤對嘧啶的比和化學(xué)修飾不同的寡核苷酸得到例子。所使用的寡核苷酸如表1所述。例如，寡核苷酸6<SEQID NO6>(ISIS104838)是2′-O-(2-甲氧基乙基)修飾的含有10-堿基的2′-脫氧缺口(gap)、也稱5-10-5MOE缺口體(gapmer)的硫代磷酸酯寡核苷酸。生產(chǎn)寡核苷酸6(ISIS104838)使用的方法是使用固相有機合成、制備反相層析提純、酸性脫保護、固-液分離和真空干燥來生產(chǎn)藥物的多步驟方法。
表1

寡核苷酸6(ISIS104838)的化學(xué)合成應(yīng)用亞磷酰胺化學(xué)過程并包括活化單體與延伸聚合物的順序偶聯(lián)，延伸聚合物的一個末端共價附著于載體基質(zhì)上。固相方法通過對載體進行簡單的溶劑洗滌使得每個合成步驟中反應(yīng)產(chǎn)物的提純變得容易。20-聚體的合成在封閉反應(yīng)器中進行，無需中間寡核苷酸的分離?；瘜W(xué)合成方法使得規(guī)定體積的試劑和溶劑的遞送往返于載體化學(xué)反應(yīng)器。計算機控制下的閥和泵調(diào)節(jié)試劑和溶劑的流動。
附圖1表示從3′端向5′端順序組裝的寡核苷酸。寡核苷酸用二氯乙酸在甲苯中通過載體結(jié)合分子5′端的脫保護進行組裝(步驟1)，使得載體結(jié)合分子與引入的活化亞磷酰胺單體縮合(步驟2)，將得到的亞磷酸三酯氧化硫化成硫代磷酸三酯(步驟3)，任何未反應(yīng)的羥基通過酰化封端，防止與后面引入的單體進行無序偶聯(lián)(步驟4)。重復(fù)這一系列步驟用于隨后的偶聯(lián)反應(yīng)(步驟5)，除去O-氰乙基保護基(步驟6)，然后寡核苷酸6(ISIS104838)從載體切割掉并同時發(fā)生環(huán)外胺脫保護(步驟7)。最后的處理包括制備型反相HPLC(步驟8)、5′-O-4，4’-二甲氧基三苯甲基醚的酸脫保護(步驟9)、產(chǎn)品的分離(步驟10)及藥物的真空干燥(步驟11)。
附圖3至6說明生產(chǎn)線路圖，其中使用適當?shù)膩喠柞０分貜?fù)合成反應(yīng)(步驟1-4)，合成藥物?？捎糜诒痉椒ǖ膩喠柞０返膶嵗绺綀D2所示。
附圖3描述二甲氧三苯甲基脫保護步驟(附圖1的步驟1)，其中根據(jù)化學(xué)合成進度，使用10％v/v的二氯乙酸(DCA)在甲苯中的溶液處理，首先從2′-甲氧基乙基核糖核苷上除去5′-O-二甲氧基三苯甲基，然后從2′-脫氧或者2′-甲氧基乙基核糖核苷低聚物上除去5′-O-二甲氧基三苯甲基，這給出部分受保護的載體結(jié)合分子和相對穩(wěn)定的碳正離子。然后通過乙腈洗滌除去過量的酸和釋放的二甲氧基三苯甲基碳正離子。
完整周期中的第二步是載體結(jié)合分子的新釋放出的5′-羥基與活化的2′-脫氧基或者2′-甲氧基乙基修飾的亞磷酰胺單體之間的縮合反應(yīng)(附圖1的步驟2)。通過亞磷酰胺的乙腈溶液與過量弱酸1-H-四唑混合完成原位活化。形成的四唑化物(tetrazolide)迅速與載體結(jié)合分子的5′-羥基反應(yīng)，以接近定量的收率給出亞磷酸三酯和1-H-四唑的等價物。用乙腈洗滌從柱式反應(yīng)器中除去過量試劑和副產(chǎn)物。
附圖4描述通過向反應(yīng)柱中遞送0.2M苯乙酰二硫化物(PADS)在乙腈∶3-甲基吡啶為1∶1的混合物中形成的溶液進行亞磷酸三酯的硫化，形成相應(yīng)的硫代磷酸三酯。用乙腈洗滌載體結(jié)合材料除去過量反應(yīng)物和副產(chǎn)物。
附圖5描述任何給定周期中的最后反應(yīng)，該反應(yīng)是封端步驟，其中未反應(yīng)的5′-羥基通過在吡啶/乙腈中遞送乙酸酐與乙腈和N-甲基咪唑的混合物進行乙酰化。得到的5’-O-乙酸酯在余下的整個合成期間一直保持穩(wěn)定直到經(jīng)過最后的氨解而切割。用乙腈洗滌除去過量反應(yīng)物。
在19次5′-羥基脫保護、偶聯(lián)、硫化和封端順序的周期后，附圖6表示氰乙基保護基用三乙胺的乙腈溶液處理從核苷酸間鍵連除去，生成硫代磷酸二酯，而寡核苷酸仍然與載體結(jié)合。這使得在堿基介導(dǎo)的β-消除過程中產(chǎn)生的丙烯腈被清除。在這些條件下，生成的丙烯腈不與存在的胸苷殘余物反應(yīng)并且可簡單地從載體結(jié)合材料洗掉。然后在高溫用氫氧化銨保溫處理完成切割和堿基脫保護。過濾和用乙醇和水的混合物洗滌除去載體。合并的濾液和洗滌液濃縮，通過反相(RP)HPLC進行5′-DMT保護的寡核苷酸6(ISIS104838)粗品的脫保護。
在一個用于制備純化寡核苷酸的方法中，通過RP-HPLC完成5′-脫保護產(chǎn)物粗品的層析提純。RP-HPLC步驟除去由于不完全單體偶聯(lián)所產(chǎn)生的DMT脫去的錯誤序列(步驟2)。該方法在使全長DMT保護產(chǎn)物從更短的DMT脫去的錯誤序列分離中有效。該效力應(yīng)歸于全長DMT保護產(chǎn)物與更短DMT脫去的錯誤序列所具有的疏水性差異。由于WatersHC-C18 HA“Bonda-Pak”十八烷基甲硅烷基二氧化硅(37-55μm，125)徑向壓縮柱的流動特性、效力、耐用性和高填充能力，選擇其進行RP-HPLC步驟。徑向壓縮柱使用Biotage Kiloprep 100 HPLC系統(tǒng)用水/甲醇/2.5M乙酸鈉平衡。
寡核苷酸6(ISIS104838)粗品在起始溶劑混合物中的溶液被裝載到柱上，用甲醇在乙酸鈉緩沖液(pH7.2)中的溶液逐步梯度洗脫該柱，通過連續(xù)UV吸收分光光度法監(jiān)測洗脫圖。以級分形式取DMT保護產(chǎn)物峰并進行分析。符合規(guī)格的級分匯集到一起并用于分析全長面積％。將含有主要產(chǎn)物的RP-HPLC洗脫液轉(zhuǎn)移到沉淀器并溶解在0.01M乙酸鈉(pH3)中。測定得到溶液的pH值，以測定結(jié)果為基準，計算所需的脫三苯甲基作用時間。在室溫下在規(guī)定時間保溫處理后，沉淀脫三苯甲基的寡核苷酸，分離得到的沉淀物。以類似方法制備寡核苷酸1-5，7和8。
在另一用于制備純化寡核苷酸的方法中，計算需要量的室溫乙醇，將其轉(zhuǎn)移到沉淀器中并開始攪拌。將反相HPLC提純得到的三苯甲基洗脫液材料轉(zhuǎn)移到沉淀器的乙醇中，在離心過程中，沉淀寡核苷酸，并使不需要的HPLC流動相成分(如甲醇和鹽)撇入廢液中。以約3000RPM的速度開始低速離心，使用3000ml/分鐘或者更小流速的蠕動泵將沉淀的寡核苷酸泵入離心機中。由于離心力，寡核苷酸粘附在轉(zhuǎn)筒表面，而液體被撇去直接進入廢液中。完成離心之后，使用氬氣流干燥離心機轉(zhuǎn)筒中沉淀的寡核苷酸。轉(zhuǎn)筒中的寡核苷酸通過添加計算量的水并調(diào)整離心RPMs使水與寡核苷酸餅達到最大接觸被重新溶解。將重新溶解的材料轉(zhuǎn)移回到脫三苯甲基反應(yīng)用沉淀器中。
將計算量的酸化溶液即0.01MNaOAc(pH＝2.9-3.1)添加到含有寡核苷酸溶液的沉淀器中，以測量的pH為基準使反應(yīng)在計算時段內(nèi)進行。加入計算量的3.0 MNaOAc(pH＝8.0)停止脫三苯甲基反應(yīng)。
然后加入計算量的室溫乙醇，該乙醇使寡核苷酸沉淀，但是使現(xiàn)已切割的5′-二甲氧基三苯甲基保留在溶液中，將該溶液直接導(dǎo)入廢液中。以約3000RPM的速度進行離心，使用3000ml/分鐘或者更小流速的蠕動泵將沉淀的寡核苷酸泵入離心機中，完成離心后，寡核苷酸通過添加計算量的水并調(diào)整離心的轉(zhuǎn)數(shù)(RPMs)使水與寡核苷酸餅發(fā)生最大接觸而重建寡核苷酸。
將重建的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適大小的容器中，其中用冰醋酸和/或1.0N的NaOH調(diào)整該重建物質(zhì)的pH值到7.2-7.5。向調(diào)整pH的寡核苷酸溶液中加入計算量的3.0M的NaOAc溶液。向沉淀器中加入計算量的室溫乙醇，然后向該乙醇中加入脫三苯甲基溶液/NaOAc的混合物，乙醇使寡核苷酸沉淀并使調(diào)整pH步驟中生成的鹽保留在溶液中，該溶解被直接引入廢液中。
以約3000RPM的速度開始離心，使用3000ml/分鐘或者更小流速的蠕動泵將沉淀的寡核苷酸泵入離心機中。完成離心后，使用氬氣流干燥離心機轉(zhuǎn)筒中沉淀的寡核苷酸。寡核苷酸通過添加計算量的水并調(diào)整離心轉(zhuǎn)數(shù)使水與寡核苷酸餅達到最大接觸而重建寡核苷酸。將重建的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到適當?shù)倪^濾用和凍干用容器中。
寡核苷酸通過重力沉降、離心或者過濾分離。使用10mL和50mL的尖底離心管進行長凳面重力沉降。在Sorvall固定角度旋轉(zhuǎn)離心機中(E.I.DuPont de Nemours&公司，配備有SLA3000轉(zhuǎn)片，能容納10和25mL離心管)進行小規(guī)模旋管實驗。使用最大容量為250g的CarrPowerfuge Pilot產(chǎn)生補充數(shù)據(jù)。使用20Kg容量的小型Robatel，Slab 320沉積離心機證明可量測性。在裝有10μm或者20μm的316不銹鋼過濾器的43mm、100mm和213mm的布氏漏斗中進行真空過濾實驗。較大的過濾實驗使用裝有10μm底部燒結(jié)A 1/8 hp Gast真空泵的Pharmacia細線(fine line)350柱幫助過濾過程中的流動。
在以下的一種設(shè)備中進行干燥實驗NAPCO真空烤箱、Leybold凍干機、LabLine烤箱或者按用戶需要設(shè)計的裝有進氣口的水套真空過濾器。通過氣相層析法分析干燥粉末的殘余乙醇含量。
通過紫外(U.V.)分光光度計確定溶液中寡核苷酸的百分比。本文使用的術(shù)語“OD”是指使用1cm通路長度在260毫微米測量的吸光度。與特殊試驗參數(shù)對應(yīng)的殘留在液相中的懸浮固體或者寡核苷酸的百分比是被強調(diào)因子有效性的標準量度。導(dǎo)致產(chǎn)物在溶液中低水平殘留的變量被認為是有效的。
實施例1溶劑溫度對全長二甲氧基三苯甲基(DMT)保護的級分沉淀的影響。
將3mL初始濃度為1263OD/mL的寡核苷酸2<SEQ.ID No2>(ISIS2302)沉淀到3體積的冷(-20℃)或周圍溫度(18-20℃)的乙醇、1-丙醇、異丙醇或者變性乙醇(溶劑)中。得到的混合物進行簡單攪拌，然后進行重力沉降1.5小時或者以2,000RPM的速度離心2分鐘。使用紫外(UV)分光光度計分析液相的等分試樣(1mL)，分析液相中寡核苷酸的濃度。確定液相中殘留的寡核苷酸百分比(液相中寡核苷酸％)。用冷溶劑或者周圍溫度溶劑處理然后進行重力沉降和低速離心的結(jié)果如表2和3所示。
表2

表3

表2數(shù)據(jù)表明，當使用冷溶劑時，殘留在液相中的溶解寡核苷酸總量為4.8-5.4％。根據(jù)觀察，觀察到用冷溶劑處理的寡核苷酸產(chǎn)生均勻分散的微細沉淀物，該沉淀物懸浮在液相中，1.5小時后未從溶劑中沉淀出來。相比之下，環(huán)境溫度的溶劑立即生成大聚集物，該聚集物迅速沉淀，使液相得以澄清。對于被檢驗的每種溶劑而言，周圍溫度處理的寡核苷酸的上層清液中產(chǎn)物留有率為0.25-0.31％。
表3數(shù)據(jù)同樣表明，通過冷溫度沉淀法生成的淤漿液相中殘留2.8-4.4％的懸浮固體，而當使用周圍溫度醇時，殘留有小于0.3％的產(chǎn)物。在等量的寡核苷酸No.4<SEQ.ID No.4>(ISIS2503)在冷乙醇或者室溫乙醇中沉淀然后以低速(2000RPM)離心或者通過沉降分離的平行實驗中獲得相似結(jié)果。
實施例2溶劑比對DMT保護的全長級分沉淀的影響。
將3mL等份的初始濃度為1785OD/mL的DMT保護的寡核苷酸4<SEQ.ID No4>(ISIS2503)在1-4.5體積的周圍溫度乙醇中沉淀。將得到的混合物簡單攪拌1分鐘，然后沉降1.5小時。沉降后，收集約1mL液相，測量在液相中殘留的寡核苷酸的濃度和百分比(液相中寡核苷酸％)。結(jié)果如表4所示。
表4

表4數(shù)據(jù)表明對于2.5倍-3.5倍于寡核苷酸體積的乙醇而言，液相寡核苷酸含量小于0.58％；4倍、4.5倍和5倍于寡核苷酸體積的乙醇對沉淀沒有顯著的額外影響，但注意到液相中殘留產(chǎn)物有輕微的增加。當使用1-丙醇和IPA時，結(jié)果與用乙醇觀察到的結(jié)果幾乎相同。使用變性醇的結(jié)果表明液相中寡核苷酸的百分比稍微增加。另外，觀察到1-1.5倍體積的乙醇不足夠誘導(dǎo)完全沉淀，而2倍于寡核苷酸體積的乙醇生成立即開始沉降的大聚集物。聚集物迅速變成膠狀，不能通過攪拌再懸浮。未觀察到用2.5-3.5倍于寡核苷酸體積的醇誘導(dǎo)沉淀之間的區(qū)別。另外，在沉降過程中形成的聚集物通過緩和的攪拌容易再懸浮。
除了迅速將淤漿轉(zhuǎn)移到Sorvall離心機中并以2,000RPM離心2分鐘之外，重復(fù)前述方案。離心后測量液相中寡核苷酸的殘留量(液相中寡核苷酸％)，如表5所示。
表5

表5數(shù)據(jù)表明使用約2.5倍于寡核苷酸體積的過量乙醇沒有顯著益處。實際上，用約4.5倍于寡核苷酸體積的過量乙醇處理、然后離心后，溶液中寡核苷酸的殘留量輕微增加。當使用1-丙醇、IPA和變性醇時，結(jié)果與使用乙醇產(chǎn)生的結(jié)果相比有輕微改善。
實施例3DMT-保護的全長寡核苷酸濃度對沉淀和過濾的影響。
從寡核苷酸2和4<SEQ.ID NO2；SEQ.ID NO4>(ISIS2302；ISIS2503)的產(chǎn)物中保留小體積的DMT-保護的寡核苷酸，進行如下檢驗將3mL寡核苷酸在3體積的周圍溫度乙醇中沉淀的同時攪拌1分鐘。目測檢查游漿性質(zhì)，得到的淤漿用裝有5.5cm、Whatman No.4過濾器的小布氏漏斗真空過濾。根據(jù)游漿可濾過性評定游漿等級(A-D)。假設(shè)生成的游漿能夠保留在過濾器上，收集小體積的濾液，測量液相中寡核苷酸的殘留百分比(液相中寡核苷酸％)。結(jié)果如表6所示。
表6

A＝不能完成過濾。B＝完成部分過濾。C＝產(chǎn)物保留在過濾器上。D＝產(chǎn)物保留在過濾器上，具有極慢的速率291、344、365、384、392和426OD/mL濃度的DMT-保護的洗脫液在沉淀過程中產(chǎn)生大聚集物。然而，聚集物在整個濾膜表面形成柔軟的膠狀薄膜，不能進行過濾。561、573和689OD/mL濃度的DMT-保護的洗脫液在沉淀過程中產(chǎn)生半堅硬粒狀聚集物，該聚集物的過濾相當慢。當洗脫液濃度增加到706OD/mL及更大時，聚集物變得干而脆。過濾流速表明這些脆的聚集物可容易地從液相分離。分析表明小于0.3％的產(chǎn)物保留在廢濾液中。使用周圍溫度1-丙醇、IPA和變性乙醇的方法與用乙醇得到結(jié)果相似。
實施例4溶劑溫度對全長DMT-脫去的寡核苷酸沉淀的影響。
使脫三苯甲基的全長寡核苷酸1和2<SEQ.ID NO.1；SEQ.ID NO2>(ISIS5132和ISIS2302)(25mL)在3體積的-20℃和周圍溫度(18-20℃)的乙醇、1-丙醇、IPA和變性醇中沉淀。然后簡單攪拌得到淤漿并沉降1.5小時。完成沉降后，提取1mL等分的液相，測量液相中寡核苷酸的殘留百分比(液相中寡核苷酸％)。結(jié)果如表7所示。
表7

表7數(shù)據(jù)表明當使用每種醇時，結(jié)果是一致的。冷溫度沉淀生成非常微細的、均勻分散的顆粒，沉降后溶液中殘留4.2-5.8％的顆粒。然而，周圍溫度沉淀立即生成大聚集物，該聚集物迅速沉淀，沉降后液相中殘留0.26-0.33％的產(chǎn)物。這一結(jié)果對應(yīng)于使用周圍溫度溶劑的產(chǎn)物損失減少90％。
除了沉淀后旋管以2,000rpm離心2分鐘之外，重復(fù)前述方案，測量液相中寡核苷酸的殘留百分比(液相中寡核苷酸％)。結(jié)果如表8所示。
表8

表8數(shù)據(jù)表明當使用溫度為-20℃的溶劑進行沉淀時，液相中殘留2.8-4.0％的寡核苷酸。當使用周圍溫度(18-21℃)溶劑進行沉淀時，液相中殘留0.21-0.25％的產(chǎn)物。
實施例5溶劑比對全長DMT-脫去的寡核苷酸沉淀的影響。
使兩種寡核苷酸，寡核苷酸1和2<SEQ.ID NO1；SEQ.ID NO2>(ISIS5132和ISIS2302)(25mL)在1-5體積的乙醇、1-丙醇、IPA或者變性乙醇中沉淀，渦流25秒，沉降1.5小時。沉降后，收集1mL試樣，測量液相中寡核苷酸百分比。結(jié)果如表9所示。
表9

觀察到1-1.5倍體積的乙醇不足夠誘導(dǎo)完全沉淀。2倍體積的乙醇產(chǎn)生大聚集物，該聚集物迅速沉降，在離心管底部上形成發(fā)粘層。用2.5倍、3倍和3.5倍于體積寡核苷酸的乙醇生成的聚集物沒有顯著區(qū)別。測量液相中殘留的產(chǎn)物小于約0.39％。4倍、4.5倍和5倍體積的乙醇生成大聚集物，但是，沉降后液相中寡核苷酸的殘留量輕微增加(大于約0.39％)。因此，大于約2.5倍于寡核苷酸體積的乙醇看起來不能改善產(chǎn)物回收。
除了使游漿以2,000rpm離心1分鐘之外，重復(fù)前述方案，測量液相中寡核苷酸的殘留百分比，結(jié)果如表10所示。
表10

表10數(shù)據(jù)表明2.5倍、3倍和3.5倍于寡核苷酸體積的醇產(chǎn)生的結(jié)果與沉降后觀察到的結(jié)果相似。特別是，在那些寡核苷酸溶劑比的情況下，在液相中殘留的寡核苷酸小于0.35％。當溶劑的相對比例從4倍增加到5倍時，液相中寡核苷酸的殘留百分比從0.46增加到0.70％。然而，觀察到每體積寡核苷酸使用2.5-3.5體積溶劑所形成的沉淀物略顯凝膠狀。
實施例6加入順序的影響。
改變?nèi)N沉淀成分(如醇、DMT-脫去的寡核苷酸和乙酸鈉)的添加順序，然后使得到的淤漿沉降1.5小時，此時收集1mL液相試樣，測量液相中寡核苷酸的殘留百分比(液相中寡核苷酸％)，結(jié)果如表11所示。
根據(jù)A步驟，將145μL的3.0M的NaOAc加入到25mL濃度為2750OD/mL的DMT-脫去的寡核苷酸1或者2<SEQ.ID NO1；SEQ.ID NO2>(ISIS5132；ISIS2302)中，然后將得到的鹽/寡核苷酸混合物加入到三種體積的乙醇、1-丙醇、IPA或者變性乙醇中并混合30秒。使得到的淤漿沉降1.5小時，收集1mL液相試樣，測量液相中寡核苷酸的濃度(液相中寡核苷酸％)。觀察到在將鹽/寡核苷酸混合物加入到任何所用醇中時，形成大聚集物并立即開始沉降。表11數(shù)據(jù)表明沉降后液相殘留小于約0.35％的寡核苷酸。
B步驟包括將145μL的NaOAc轉(zhuǎn)移到75mL乙醇、1-丙醇、IPA或者變性乙醇中并混合2分鐘。向該混合物中加入25mL的寡核苷酸溶液，得到的淤漿混合30秒。然后使該混合物沉降1.5小時，收集1mL液相試樣測量液相中寡核苷酸的濃度。觀察到使用這個方案產(chǎn)生的聚集物小，液相變得混濁。表11數(shù)據(jù)表明6.5-9.2％的寡核苷酸殘留在液相中。
根據(jù)C步驟，將25mL寡核苷酸溶液轉(zhuǎn)移到75mL乙醇中并混合1分鐘。向該混合物中加入145μL的3.0M的NaOAc，將得到的淤漿混合30秒。然后如前所述使淤漿沉降并取樣。這個方案產(chǎn)生大聚集物和小聚集物的混合物，1.5小時后小聚集物仍保持懸浮。收集液相試樣，測量液相中寡核苷酸濃度。液相含有7.3-10.0％的產(chǎn)物。
表11

實施例7全長DMT-脫去的寡核苷酸濃度對聚集物形成和過濾的影響。
使用凍干粉末形式的寡核苷酸1或者5<SEQ.ID NO1或者SEQ.IDNO5>(ISIS5132或者ISIS3521)制備含有寡核苷酸濃度為1000OD/mL-4750OD/mL的溶液。向這些儲液中加入3.0M的NaOAc，得到的混合物進行渦旋。使該混合物在3體積的乙醇中沉淀，得到的淤漿通過裝有5.5cm的Whatman No.4過濾器的布氏漏斗真空過濾，以過濾難易為基準，評定游漿等級(A-D)。過濾后測量濾液中寡核苷酸的殘留百分比(濾液中寡核苷酸％)。過濾結(jié)果如表12所示。
表12

*A＝不能完成過濾；B＝完成部分過濾；C＝產(chǎn)品殘留在過濾器上；和D＝產(chǎn)品殘留在過濾器上并具有優(yōu)異流速。
觀察到1000-2000OD/mL的寡核苷酸濃度生成大聚集物，該聚集物形成膠質(zhì)層。因此，它們不能過濾。最初為2,250OD/mL的寡核苷酸濃度可以部分過濾并且3.5-3.9％的產(chǎn)物殘留在液相中。
表12數(shù)據(jù)表明當寡核苷酸的初始濃度從2500增加到2750OD/mL時，過濾速率有顯著改善并且液相中產(chǎn)物的殘留百分比減小到0.6-1.3％。通過沉淀濃度為3000-4500OD/mL的寡核苷酸溶液可達到最佳過濾。過濾含有這些濃度的溶液使液相中產(chǎn)物的殘留量減少到小于約0.3％。
實施例8根據(jù)FDA藥品生產(chǎn)管理規(guī)范使用室溫乙醇生產(chǎn)的批數(shù)使用室溫乙醇和Carr離心機成功加工了六批寡核苷酸3-7<SEQ.IDNos3-7<SEQ.ID NOS3-7>(ISIS14803、ISIS2503、ISIS3521、ISIS104838和ISIS107248)。
實施例9小規(guī)模低速離心在Robatel Slab 320沉積離心機中以2,500rpm加工寡核苷酸2和3<SEQ.ID NOS 2，3>(ISIS2302、ISIS14803)。結(jié)果如表13所示。根據(jù)前述方案制備寡核苷酸。
表13

表13數(shù)據(jù)表明用低速離心在生產(chǎn)規(guī)模上可以獲得良好收率。
實施例10小規(guī)模過濾和干燥使用50g-2.5Kg的DMT-脫去的寡核苷酸溶液進行幾種檢驗。該方法如下1)將最終的DMT-脫去的寡核苷酸重建到120mg/mL-150mg/mL；2)攪拌的同時向DMT-脫去的寡核苷酸溶液加入2％-4％v/v的3.0M的NaOAc溶液；3)在溫和攪拌下將得到的溶液轉(zhuǎn)移到2.7-3.0體積的周圍溫度乙醇中；4)將淤漿轉(zhuǎn)移到真空過濾器器械中，通過10或者20μm的316ss過濾器過濾；和5)用烘箱、真空烘箱進行真空干燥或者過濾干燥。如表14所示，得到的濾餅床高度范圍從幾個毫米到11厘米。收率數(shù)據(jù)顯示產(chǎn)物的損失范圍是0.18-0.30％。結(jié)果如表14所示。
表14

這些實驗結(jié)果如表15所示。根據(jù)前述方案進行沉淀和過濾步驟。
表15

真空烘箱干燥收集大布氏漏斗中的203g寡核苷酸2<SEQ.ID No2>(ISIS2302)后，將濾餅和漏斗轉(zhuǎn)移到真空烘箱中，將烘箱加熱到30℃和壓力為25in/Hg真空度。25小時后，從烘箱中取出干燥濾餅，通過#20篩篩選，混合，稱重，檢驗試樣的殘余乙醇。最后干燥濾餅中乙醇含量是0.32％。干燥產(chǎn)品的重量是202.6g，表明產(chǎn)品損失小于0.2％。
真空盤式干燥在大布氏漏斗中收集177g寡核苷酸2<SEQ.ID No2>(ISIS2302)的濕濾餅，將其轉(zhuǎn)移到316ss凍干盤中并迅速置于凍干器中。將擱板加熱到30℃并且真空度為100微米。干燥24小時后，產(chǎn)品通過#10篩，混合并稱重。最終干燥產(chǎn)品中的乙醇含量是0.056％。干燥材料的最終重量是178g，表明在加工期間產(chǎn)品基本無損失。
烘箱干燥制備、沉淀和在布氏漏斗中收集160g寡核苷酸1<SEQ.ID No1>(ISIS5132)實物模型溶液；迅速將得到的濾餅轉(zhuǎn)移到預(yù)熱為55℃的烘箱中，濾餅干燥12小時后通過#20篩，稱重，混合。測量干燥產(chǎn)品的最終重量是159.6g，乙醇含量是0.33％。該方法約有0.2％的產(chǎn)品損失。
過濾器真空干燥通過真空過濾在特殊設(shè)計的水套過濾器中收集120g濕濾餅寡核苷酸1<SEQ.ID No1>(ISIS5132)。過濾后立即用氬氣洗吹濾餅同時使30℃的水循環(huán)通過外套管。用氬氣吹洗干燥15小時后，濾餅通過#20篩，混合并稱重。產(chǎn)物的最終重量是119.5g。
實施例11寡核苷酸特異性修飾。
對下列序列，計算使5′-二甲氧基三苯甲基水平減小一半所需的產(chǎn)品特異性反應(yīng)時間(以分鐘表示)，其中x等于酸化后的pH值。
2302t1/2＝0.0148*100.6773(x)2503t1/2＝0.0031*100.9235(x)3521t1/2＝0.0074*100.7195(x)5132t1/2＝0.0147*100.7696(x)14803t1/2＝0.0103*100.6554(x)104838t1/2＝0.0072*100.8093(x)107248t1/2＝0.0200*100.7516(x)將半衰期計算得到的分鐘數(shù)乘以15，得到的數(shù)是總反應(yīng)時間。反復(fù)15次使5′-二甲氧基三苯甲基水平減少一半，檢測到水平為零。
權(quán)利要求
1.一種用于制備純化寡核苷酸的方法，該方法包括a)提供包含寡核苷酸的溶液；b)在足夠形成寡核苷酸聚集物的條件下用聚集劑和沉淀增強劑處理所述溶液；和c)分離所述的寡核苷酸聚集物，形成所述的純化寡核苷酸。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶液包含脫保護的寡核苷酸。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述溶液是酸性的。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述溶液通過使用可有效除去5′-保護基的脫保護劑處理溶液中的5′-保護的寡核苷酸來制備。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的5′-保護基選自三甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、一甲氧基三苯甲基、9-苯基呫噸-9-基和9-(對甲氧基苯基)呫噸-9-基。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的保護基是二甲氧基三苯甲基。
7.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的脫保護的寡核苷酸在所述溶液中的濃度是至少約2250OD/mL。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的脫保護的寡核苷酸在所述溶液中的濃度是約2250-約7500OD/mL。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的脫保護的寡核苷酸在所述溶液中的濃度是約4500-約6500OD/mL。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶液是通過在水中重建分離出的脫保護的寡核苷酸制備的。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的聚集劑包括醇。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的從醇選自甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇和變性乙醇。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的沉淀增強劑包括鹽。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的鹽選自鈉鹽、鋰鹽、銨鹽、鉀鹽、鎂鹽、銫鹽和鋅鹽。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的鹽是醋酸鈉。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的鹽是氫氧化鈉。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸在約15℃-約25℃的溫度下用所述的聚集劑處理。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸在約18℃-約20℃的溫度下用所述的聚集劑處理。
19.權(quán)利要求1所述的方法，其中在用所述聚集劑處理所述的寡核苷酸之前用所述的沉淀增強劑處理所述的寡核苷酸。
20.權(quán)利要求1所述的方法，其中在用所述沉淀增強劑處理所述的寡核苷酸之前用所述聚集劑處理所述的寡核苷酸。
21.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸用所述沉淀增強劑和所述聚集劑的混合物處理。
22.權(quán)利要求1所述的方法，其中以約1份溶液對至少約1.5份聚集劑的體積比用所述聚集劑處理所述的溶液。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中以約1份溶液對約2-約4份聚集劑的體積比用所述聚集劑處理所述的溶液。
24.權(quán)利要求22所述的方法，其中以約1份溶液對約2.5-約4.5份聚集劑的體積比用所述聚集劑處理所述的溶液。
25.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸聚集物通過離心分離。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的離心以每分鐘小于約3000轉(zhuǎn)的速度進行。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的離心以每分鐘小于約2500轉(zhuǎn)的速度進行。
28.權(quán)利要求25所述的方法，其中以1份寡核苷酸對約5份聚集劑的體積比用所述聚集劑處理所述的寡核苷酸。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的聚集劑是乙醇，以及以1份寡核苷酸對約2-約4份聚集劑的體積比用所述聚集劑處理所述的寡核苷酸。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的聚集劑選自1-丙醇、異丙醇和變性乙醇，以及以1份寡核苷酸對約3份聚集劑的體積比用所述聚集劑處理所述的寡核苷酸。
31.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸通過重力沉降分離。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中以1份寡核苷酸對5份聚集劑的體積比用所述的聚集劑處理所述的寡核苷酸。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的聚集劑是乙醇，以及以1份寡核苷酸對約2-約4.5份聚集劑的體積比用所述聚集劑處理所述的寡核苷酸。
34.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的聚集劑是乙醇，以及以1份寡核苷酸對約2-約3.5份聚集劑的體積比用所述聚集劑處理所述的寡核苷酸。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的聚集劑選自1-丙醇、異丙醇和變性乙醇，以及以1份寡核苷酸對約3份聚集劑的體積比用所述聚集劑處理所述的寡核苷酸。
36.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸通過過濾分離。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的寡核苷酸從所述溶液中分離后，所述的寡核苷酸在所述溶液中的殘留量不大于約3.5％。
38.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的寡核苷酸從所述溶液中分離后，所述的寡核苷酸在所述溶液中的殘留量不大于約1.5％。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的寡核苷酸從所述溶液中分離后，所述的寡核苷酸在所述溶液中的殘留量不大于約1％。
40.一種用于制備純化寡核苷酸的方法，該方法包括步驟a)提供包含寡核苷酸的溶液；b)在足夠形成寡核苷酸聚集物的條件下，用乙醇和鈉鹽處理所述溶液，其中所述的乙醇的溫度為約15-約25℃；和c)分離所述的寡核苷酸聚集物，形成所述的純化寡核苷酸。
41.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述的鈉鹽是醋酸鈉或者氫氧化鈉。
42.一種用于制備純化寡核苷酸的方法，該方法包括步驟a)提供包含寡核苷酸的溶液；b)在足夠形成寡核苷酸聚集物的條件下，用沉淀增強劑處理所述溶液，然后用聚集劑處理所述溶液；和c)分離所述的寡核苷酸聚集物，形成所述的純化寡核苷酸。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的沉淀增強劑是醋酸鈉。
44.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的聚集劑選自甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇和變性乙醇。
45.一種用于制備純化寡核苷酸的方法，該方法包括步驟在足夠形成第一寡核苷酸聚集物的條件下，用聚集劑處理含有5’-保護的寡核苷酸的第一溶液；分離所述的第一寡核苷酸聚集物；使分離出的第一寡核苷酸聚集物溶解在溶劑中，從而形成第二溶液；使用可有效除去所述的5’-保護基的脫保護劑處理所述的第二溶液；在足夠形成第二寡核苷酸聚集物的條件下，用聚集劑和沉淀增強劑處理所述的第二溶液；分離所述的第二寡核苷酸聚集物；使所述的第二寡核苷酸聚集物溶解在溶劑中，得到第三溶液；在足夠形成第三寡核苷酸聚集物的條件下，用聚集劑和沉淀增強劑處理所述的第三溶液；和分離所述的第三寡核苷酸聚集物，得到所述的純化寡核苷酸。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的第一溶液通過寡核苷酸粗品的層析得到的洗脫液。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述的層析是高壓液相層析。
48.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的高壓液相層析使用裝載反相介質(zhì)或強陰離子交換樹脂的柱進行。
49.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的第一寡核苷酸聚集物或者第二寡核苷酸聚集物的分離通過重力沉降或者離心進行。
50.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的第三寡核苷酸聚集物的分離通過過濾進行。
51.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的純化寡核苷酸的純度是至少約90％。
52.權(quán)利要求51所述的方法，其中所述的純化寡核苷酸的純度是至少約98％。
53.一種用于制備純化寡核苷酸的方法，該方法包括步驟在足夠形成第一寡核苷酸聚集物的條件下，用聚集劑和沉淀增強劑處理含有寡核苷酸的第一溶液；分離所述的第一寡核苷酸聚集物；使分離出的第一寡核苷酸聚集物溶解在溶劑中，從而形成第二溶液；在足夠形成第二寡核苷酸聚集物的條件下，用聚集劑和沉淀增強劑處理所述的第二溶液；分離所述的第二寡核苷酸聚集物，得到所述的純化寡核苷酸。
54.權(quán)利要求53所述的方法，其中所述的純化寡核苷酸的純度是至少約90％。
55.權(quán)利要求54所述的方法，其中所述的純化寡核苷酸的純度是至少約98％。
56.權(quán)利要求53所述的方法，其中所述的第一溶液的寡核苷酸是5’-脫保護的寡核苷酸。
57.權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的第一溶液是通過酸化含有5’-保護的寡核苷酸的HPLC洗脫液制備的。
58.權(quán)利要求57所述的方法，其中所述的HPLC洗脫液得自切割和堿基解封的5’-保護的寡核苷酸的HPLC提純。
59.權(quán)利要求53所述的方法，其中所述的第一寡核苷酸聚集物的分離通過重力沉降或者離心進行。
60.權(quán)利要求53所述的方法，其中所述的第二寡核苷酸聚集物的分離通過過濾進行。
61.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的溶劑是水。
全文摘要
制備純化寡核苷酸的方法，該方法是在足夠形成寡核苷酸聚集物的條件下，用聚集劑和沉淀增強劑處理含寡核苷酸的溶液、分離寡核苷酸而生產(chǎn)純化寡核苷酸。
文檔編號C12Q1/68GK1514842SQ02811413
公開日2004年7月21日 申請日期2002年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月7日
發(fā)明者馬克恩·N·穆爾, 約翰·查爾斯·阿瑟, 肯特·萬索伊, 安東尼·N·斯科扎里, N 斯科扎里, 萬索伊, 查爾斯 阿瑟, 馬克恩 N 穆爾 申請人:Isis藥物公司