專利名稱：編碼鹿角車前草花粉主要過敏原－pla l1的重組dna及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有鹿角車前草(Plantago lanceolata)主要過敏原Pla l 1的至少一個抗原表位的核酸分子。
背景技術(shù)：
近幾年，I型過敏原影響著世界上成千上萬的人，它在發(fā)達國家中的發(fā)病率有上升的趨勢，導(dǎo)致了死亡人數(shù)上升和經(jīng)濟損失(1)?；ǚ圻^敏原是一些能夠引起IgE介導(dǎo)的過敏性疾病的蛋白質(zhì)或糖蛋白，這些疾病如花粉熱和哮喘，大約有17％的人口在遺傳上易患過敏性疾病。
目前治療這些疾病的方法主要體現(xiàn)在減輕癥狀?；颊呓?jīng)常服用一些抗組胺類以及類固醇藥物以減輕癥狀，然而這些藥物并不能抑制IgE抗體的形成并經(jīng)常會帶來一些副作用。正如WHO Position Paper(2)所述，免疫治療是唯一能夠影響過敏性疾病的自然發(fā)生過程的治療方法，而且它也有可能防止過敏性鼻粘膜炎患者患上哮喘病(2)。免疫治療能夠調(diào)節(jié)患者在給藥(即施加大量適合的過敏反應(yīng)提取物)過程中的免疫應(yīng)答。但是，用于治療的過敏反應(yīng)提取物是從天然來源分離得到的蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)成分的粗混合物，這些資源或者含有大量與過敏原無關(guān)的成分，或者幾乎不含有造成患者高敏感性的過敏原。在最近幾年，隨著雜交瘤技術(shù)的發(fā)展，可以利用基于單克隆抗體的免疫試驗對主要的過敏原含量進行鑒定，由此導(dǎo)致了在過敏反應(yīng)提取物的標準化方面取得了重要進展(3)，所有對一種特定的過敏反應(yīng)提取物敏感的患者都繼續(xù)接受含全部提取物成分的相同的復(fù)雜混合物的治療。但是這有可能導(dǎo)致副作用的產(chǎn)生，這個副作用主要由于對提取物中所有蛋白質(zhì)成分(包括除主要過敏原PLA L 1外的其它過敏原)具有抗性的另外的IgE抗體所引起。
就過敏診斷而言，這種使用整個過敏反應(yīng)提取物來進行皮膚測試的方法妨礙了導(dǎo)致患者敏感的特殊過敏原的檢測。
針對這些缺點，許多研究人員采用生物化學(xué)分離和純化技術(shù)的方法分離得到單獨的過敏原。然而，盡管這個方法對于過敏原的鑒定可能有效，但卻不足以制備工業(yè)規(guī)模上的過敏原，因為這個過程極其耗費人力，并且從昂貴的自然資源中純化出的過敏原產(chǎn)量通常情況下都很低?；谶@些原因，用于合成過敏原蛋白質(zhì)的重組DNA技術(shù)引起了人們的注意。利用可生長在大發(fā)酵罐中的微生物表達系統(tǒng)可以大規(guī)模獲得重組過敏原。因此，這些技術(shù)使得重組過敏原以一致純度大量生產(chǎn)。除此之外，使用rDNA技術(shù)可能表達抗原表位片段或修飾的過敏原以方便應(yīng)用于過敏性疾病的診斷或處理。目前，很多研究人員都采用rDNA技術(shù)來研究過敏原，例如，最近一些來自螨類、草、樹、土壤等的過敏原也都已經(jīng)被克隆并表達了(4)。
車前草屬(Plantago)的植物花粉是空氣過敏原的主要來源，并且可能是世界上許多國家花粉病的發(fā)生的部分原因。車前草屬屬于車前科(Plantaginaceae)，包括250個種。最常見的一個種就是鹿角車前草(英文名為plantain或ribwort)，主要分布在歐洲、澳大利亞以及北美洲的溫帶地區(qū)(5-8)。從本世紀初開始，鹿角車前草花粉就同花粉熱聯(lián)系在了一起(9-11)，而這些雜草則被認為是引起過敏性疾病的一種最重要的雙子葉植物(12)。
在過去的幾年內(nèi)，不同國家所開展的幾項研究均顯示出了這該物種的重要臨床意義。受鹿角車前草過敏原影響最大的地區(qū)為澳大利亞(13)和地中海地區(qū)(14)。例如，Bousquet等人(15)在對患花粉熱的患者檢查時所發(fā)現(xiàn)的，其中36％的患者對蒙彼利埃(法國)的英國車前草(plantain)敏感。在英國，兩項不同的研究均表明超過20％的季節(jié)性呼吸過敏患者對車前草呈現(xiàn)出皮膚陽性反應(yīng)(16，17)。同樣，在西班牙的不同城市也相繼出現(xiàn)對這種花粉的過敏癥狀的流行(18-20)。然而，鹿角車前草在花粉病病原學(xué)上的真正作用還不清楚，因為只對車前草敏感的患者是罕見的。對車前草過敏的患者通常也會對在同一季節(jié)授粉的其它的植物過敏，尤其是草類花粉(17-21)。
盡管上文中提到了一些報道，但是目前還沒有表征車前草的主要過敏原的數(shù)據(jù)的報道，目前僅有的一些關(guān)于鹿角車前草過敏原鑒定方面的研究發(fā)表(17，21，22)。
WO 98/59051公開了從橄欖樹中獲得的Ole e 1過敏原的克隆。眾所周知，這個序列和來自于Pla l 1的一段8個氨基酸的序列同源。
來自于樺樹(疣皮樺Betula verrucosa)的一段序列在數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的登記號為Y14038。此序列編碼的蛋白質(zhì)同Ole e 1過敏原有著很高的同源性。
鹿角車前草花粉的主要過敏原最近已經(jīng)被鑒定、純化并且其物理化學(xué)和免疫化學(xué)方面的特性(23)也已被部分表征了。Pla l 1是一種微不均一性的糖蛋白，其表觀分子量在16-20KDa范圍內(nèi)。它的N端16個氨基酸殘基已經(jīng)被測得。在對車前草敏感的患者中，針對純Pla l 1的特異性IgE流行程度為86％，它占IgE與車前草花粉提取物的總結(jié)合能力的大約80％。這個數(shù)據(jù)表明Pla l 1是鹿角車前草花粉中在臨床上最相關(guān)的過敏原。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供Pla l 1的核苷酸和氨基酸序列。
本發(fā)明涉及編碼包含鹿角車前草的主要過敏原-Pla l 1中至少一個抗原表位的蛋白質(zhì)或肽段的核酸分子，其中此核酸分子a)具有序列SEQ ID NO3，b)是序列SEQ ID NO3的一個片段，c)含有編碼SEQ ID NO4氨基酸序列或其部分的一段序列，d)具有一段在嚴緊條件下與SEQ ID NO3雜交的序列，e)具有通過SEQ ID NO3簡并可衍生的一段序列，f)一條與a)-e)中任一序列互補的序列。
采用分子克隆技術(shù)，分離編碼Pla l 1過敏原的cDNA克隆并測定該克隆的核苷酸順序，然后從上述核苷酸順序中推導(dǎo)出氨基酸序列從而獲得該蛋白質(zhì)的完整化學(xué)結(jié)構(gòu)。這個過程涉及到從鹿角車前草花粉中分離RNA并利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。利用PCR去特異性擴增編碼Plal 1的cDNA，其特異性引物來源于天然過敏原的N末端序列。使用內(nèi)部特異性引物對編碼Pla l 1的cDNA進行5’端延伸能夠測定編碼Plal 1的信號肽和N末端的核苷酸序列。最后，使用對成熟蛋白的N末端和C末端專一的引物PCR擴增Pla l 1 cDNA，然后將編碼Pla l 1的全長克隆插入到載體中，并在轉(zhuǎn)化宿主細胞中表達該重組過敏原。
花粉顆粒有一個堅硬的外殼，其內(nèi)含有幾個細胞，而蛋白質(zhì)過敏原則存在于這些細胞內(nèi)，因此，若要從花粉中分離mRNA，必須首先破碎其堅硬的外殼，然后再裂解細胞并從產(chǎn)生的混合物中提取mRNA。由于mRNA的不穩(wěn)定性，通常其在活細胞中只存活幾分鐘，因此這種分離是很困難的。
在本發(fā)明之前，曾經(jīng)有人嘗試分離鹿角車前草花粉Pla l 1的mRNA，但都沒有成功。特別是，他們使用了大量不同的破碎花粉粒細胞壁、細胞裂解以及mRNA提取的方法，都沒有成功。由本發(fā)明選擇的方法組合分離得到了Pla l 1的mRNA。具體來說，使用一種改進的超聲波處理步驟來破碎花粉粒細胞壁，同以前的超聲波處理技術(shù)比較，本發(fā)明中的這個處理過程要延長許多。這種改進的超聲波處理同含有硫氰酸胍的裂解緩沖液聯(lián)合使用，并同基于苯酚-氯仿的提取試劑聯(lián)合使用。
本發(fā)明提供分離的編碼鹿角車前草主要過敏原抗原表位的核酸分子，這種技術(shù)是過敏性疾病診斷和治療上的一大進步，正如上面所述，它提供的方法克服了純過敏原或其中對應(yīng)于過敏原性部分的肽段的缺乏。盡管這種過敏原是車前草植物花粉中主要的過敏原性成分，但在本發(fā)明前它仍是未被克隆的分子。
已經(jīng)獲得的材料和信息使得我們可以對該核酸分子進行修飾，引起該蛋白中特異氨基酸殘基的改變，進而能夠確定特異的IgE結(jié)合抗原表位。對IgE結(jié)合的抗原表位的鑒定允許生產(chǎn)IgE結(jié)合能力減弱的修飾的重組過敏原。這種經(jīng)修飾導(dǎo)致IgE結(jié)合能力減弱的重組過敏原可用于有效地治療過敏癥患者。以大劑量服用時，不利的副反應(yīng)比較低，例如，過敏反應(yīng)。同樣，可以設(shè)計源自Pla l 1序列的短肽，其可能作為一種疫苗在過敏性患者中調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)，該T細胞反應(yīng)控制IgE抗體的產(chǎn)量。另外，這個重組過敏原也可被化學(xué)修飾。本發(fā)明的另外一個方面是該重組過敏原診斷針對鹿角車前草和交叉反應(yīng)物種的花粉的過敏性反應(yīng)。這種診斷方法基于抗原-抗體反應(yīng)并能夠被設(shè)計用于體內(nèi)和體外檢驗。
本發(fā)明與下列情況進一步相關(guān)重組蛋白質(zhì)或肽，其包含鹿角車前草的主要過敏原-Pla l 1的至少一個抗原表位，其具有根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列相對應(yīng)的氨基酸序列。本發(fā)明放棄由SEQ ID NO4上1-16氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列及其片段。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽用作藥物。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)在生產(chǎn)用于在某一被試者中預(yù)防、減輕或治療過敏性反應(yīng)的藥物中的用途。
適于轉(zhuǎn)化宿主的一種表達載體，其包含根據(jù)本發(fā)明的核苷酸。
宿主細胞，其含有根據(jù)本發(fā)明的表達載體。
生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)或肽的方法，該蛋白質(zhì)或肽包含鹿角車前草的主要過敏原-Pla l 1的至少一個抗原表位，該方法包含在所述Pla l1核酸序列表達、生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)或肽的條件下培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞，并且分離所述蛋白質(zhì)或肽。
一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)或肽作為活性物質(zhì)。
一種能夠在某一被試者中預(yù)防、減輕或治療過敏性反應(yīng)的方法，其包括對受試者施用根據(jù)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)或肽，或者藥物組合物。
一種體外診斷或預(yù)測受試者針對Pla l 1過敏原的過敏反應(yīng)的方法，其中包括從受試者收集樣品并確定其針對根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽的IgE抗體的水平。
一種體內(nèi)診斷或預(yù)測受試者針對Pla l 1過敏原的過敏反應(yīng)的方法，其中包括將本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽施與受試者并且監(jiān)測其反應(yīng)。
一種用于體內(nèi)或體外診斷或預(yù)測受試者針對Pla l 1過敏原的過敏反應(yīng)的試劑，其中該試劑含有根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽。
使用根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽預(yù)測過敏反應(yīng)接種效應(yīng)的一種方法。
序列表SEQ ID NO.1.利用5’RACE系統(tǒng)獲得的3個cDNA克隆的核苷酸序列。星號(*)表明三個序列之間的同一性。在翻譯起始密碼子處加了下劃線，前導(dǎo)肽序列用斜體字表示，并且編碼該成熟蛋白(引物為Pla4，表1)N末端的寡核苷酸用黑體字表示。在每個克隆的序列末端可以觀察到與在5’RACE中所用引物Pla3相互補的核苷酸序列(用不連續(xù)劃線表示)。
SEQ ID NO.2.Pla l 1前導(dǎo)肽的氨基酸序列，衍生自3個cDNA克隆的核苷酸序列。虛線表示與其上一行氨基酸殘基的同一性。
SEQ ID NO.3.編碼Pla l 1 cDNA克隆的核苷酸序列，起始于該成熟蛋白的N末端。星號(*)表明這些克隆之間的同一性。與該成熟蛋白相對應(yīng)的序列用大寫字母表示，而其3’非翻譯區(qū)用小寫字母表示。終止密碼子用黑體字表示。根據(jù)IUIS命名規(guī)則，每個克隆的名稱在該序列末端用黑體字表示。
SEQ ID NO.4.從Pla l 1 cDNA克隆的核苷酸序列翻譯過來的氨基酸序列。虛線表示與其上一行氨基酸殘基的同一性。方框內(nèi)是潛在的N-糖基化位點。根據(jù)IUIS命名規(guī)則，每個克隆的名稱在該序列末端用黑體字表示。
附圖簡述

圖1是SDS-PAGE。純化的nPla l 1(泳道1)和rPla l 1.0101(泳道b)。泳道c用PNGase F處理后的rPla l 1.0101。上樣量為8μg蛋白質(zhì)/每個泳道。用考馬斯亮藍染色。
圖2是天然的和重組的Pla l 1在遠紫外區(qū)的圓二色譜圖。
以Pla l 1中平均殘基重量113為基礎(chǔ)數(shù)值表達為平均殘基橢圓率(θmrw)。
圖3是對特異性IgE同nPla l 1結(jié)合的抑制。將96孔ELISA平板涂上純化的天然Pla l 1，通過添加rPla l 1.0101抑制從車前草過敏性疾病患者免疫血清中獲得的特異性IgE的結(jié)合。天然過敏原抑制曲線用作參照。用辣根過氧化物酶標記的兔抗人IgE抗體以及orto-苯二胺(OPD)檢測結(jié)合態(tài)的IgE。使用650nm的參考濾光器測量490nm處的吸收值。
發(fā)明詳述編碼鹿角車前草花粉(英國車前草)的主要過敏原的3個等位過敏原變體的核苷酸序列，Pla l 1.0101，Pla l 1.0102和Pla l 1.0103均列于SEQ ID NO.3，而它們相應(yīng)的氨基酸序列列于SEQ ID NO.4。等位過敏原變體Pla l 1.0101已被表達、純化并鑒定。Pla l 1變體的核苷酸序列編碼一個131殘基的成熟加工過的蛋白質(zhì)。重組Plal 1.0101顯示出與天然Pla l 1過敏原相似的抗原性。此過敏原誘導(dǎo)合成在敏感個體內(nèi)能夠產(chǎn)生過敏性反應(yīng)的IgE抗體。作為樣品中的活性成分，重組Pla l 1蛋白質(zhì)可被用作診斷和治療車前草屬花粉誘導(dǎo)的過敏性疾病的制劑中的活性成分。
核酸分子本發(fā)明的核酸分子可以是起源于選自車前草科(Plantaginaceae)的一種植物，該車前草科的植物包括Plantaginaceae Arnoglossum S.F.Gray，Plantaginaceae Asterogeum S.F.Gray，PlantaginaceaeBougueria Decne，Plantaginaceae CoronopusMiller，Plantaginaceae Coronopus Reichb.，Plantaginaceaelagopus Fourr.，Plantaginaceae Litorella Aschers.，Plantaginaceae Littanella Roth，Plantaginaceae LittanellaBerg.，Plantaginaceae Plantaginella Fourr.，PlantaginaceaePlantago L.，和Plantaginaceae Plantago Linn.，參見The PlantNames Project(1999)，the International Plant Name Index(IPNI)它們都已在互聯(lián)網(wǎng)上被公布了；http://www.ipni.org(2001年5月21日接收)。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸分子可以是源自于一種植物的分子，這種植物是選自于車前草屬，其包含1759個亞種，參見theInternational Plant Name Index(IPNI；www.ipni.org)。
本發(fā)明核酸分子可以是在嚴緊條件下與SEQ ID NO.3雜交的序列，優(yōu)選的核酸分子為在高嚴緊條件下與SEQ ID NO.3雜交的序列。
優(yōu)選的序列與SEQ ID NO.3的序列同一性超過50％，更優(yōu)選超過70％，再優(yōu)選超過85％，進一步優(yōu)選超過90％，最優(yōu)選超過95％。
蛋白質(zhì)或肽同SEQ ID NO.4相比較，上述的蛋白質(zhì)或肽的氨基酸序列可以被修飾，從而部分或完全減弱與IgE結(jié)合的親和力。不具備與IgE結(jié)合親和力的過敏原并不能引起抗體介導(dǎo)的B細胞反應(yīng)。但是，人們認為不具備與IgE結(jié)合的親和力的過敏原仍然可以作為疫苗，因為這種過敏原能夠引起T細胞反應(yīng)。即使它沒有血清學(xué)反應(yīng)活性，仍然可以進行不引起過敏危險的預(yù)防免疫。
根據(jù)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)或肽，可以高純度生產(chǎn)。因此，采用重組技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)或肽與從花粉提取物中獲得過敏原樣品不同，前者所產(chǎn)生的產(chǎn)品能夠完全避免該過敏原的其它同工型。并且，這種產(chǎn)物純度可高達總蛋白的95％。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，該蛋白質(zhì)或肽的純度超過總蛋白的75％，更優(yōu)選超過85％，更優(yōu)選超過90％，最優(yōu)選超過95％。就此而言，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽包括它可能存在的所有形式，包括單體、二聚體、糖基化以及非糖基化形式。
氨基酸序列的修飾可以包括一或更多個氨基酸的置換和/或缺失和/或增加。
優(yōu)選，同SEQ ID NO.3相比較，經(jīng)過修飾的氨基酸序列具有超過50％同一性，更優(yōu)選超過67％，更優(yōu)選超過85％，更優(yōu)選超過90％，最優(yōu)選超過95％。
一旦確定了一個過敏原的氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以利用傳統(tǒng)技術(shù)來確定該過敏原抗原表位的位置、結(jié)構(gòu)和序列。在實施例7中詳細描述了確定該過敏原抗原表位的位置、結(jié)構(gòu)和序列的該實驗過程。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的重組修飾的過敏原必須具有與上述天然存在的過敏原相同的α碳骨架三維結(jié)構(gòu)。
在同來自對來源特異性的IgE反應(yīng)的過敏患者的血清或其集合的血清進行免疫試驗后發(fā)現(xiàn)，同天然存在的同種過敏原(isoallergen)或相似的重組蛋白質(zhì)相比較，修飾的過敏原同特異的IgE的結(jié)合優(yōu)選降低至少5％，更優(yōu)選降低超過25％，更優(yōu)選降低超過50％，更優(yōu)選降低超過75％，最優(yōu)選降低超過90％。
評價降低的IgE結(jié)合的另外一個方法是修飾的過敏原引起組胺釋放(HR)的能力?？梢酝ㄟ^幾種組胺釋放試驗測量組胺釋放量。修飾的過敏原減少的組胺釋放源自于與細胞表面結(jié)合的特異性IgE的親和性的降低以及它們促交聯(lián)能力的降低。同天然存在的過敏原相比較，本發(fā)明中修飾過敏原的HR優(yōu)選減少5-100％，更優(yōu)選25-100％，更優(yōu)選50-100％，最優(yōu)選75-100％。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案的特征在于利用定點突變來實現(xiàn)一或更多個取代。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案的特征在于利用隨機突變來實現(xiàn)或更多個取代。
核酸序列的修飾可以例如根據(jù)WO99/47680和DK專利申請PA200001718中提出的原則得以實現(xiàn)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中蛋白質(zhì)或肽至少含有一個同非Pla l 1的過敏原的抗原表位具有相同結(jié)合特異性的抗原表位。
這樣一個雜合的過敏原展現(xiàn)了Pla l 1和正被討論的其它過敏原的抗原性，它的優(yōu)點是可用于治療或診斷對Pla l 1和其它過敏原同時過敏的過敏性疾病。
比較從蛋白數(shù)據(jù)庫中獲得的序列，發(fā)現(xiàn)在與Pla l 1最相似的蛋白質(zhì)中，來自于油橄欖(Olea europaea)花粉的Ole e 1(同一性約39％，同源性68％)在臨床上最重要，參見實施例8。參考實施例8來了解Pla l 1與其最相關(guān)的過敏原的序列相似性的更詳細說明。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中蛋白質(zhì)或肽含有與來自油橄欖的過敏原Ole e 1具有相同結(jié)合特異性的至少一個抗原表位。
由于根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)或肽顯示出了對Pla l 1和Ole e 1兩者的抗原性，因此它可用于治療或診斷對Pla l 1和Ole e 1同時過敏的癥狀。
文獻30已經(jīng)表明Pla l 1和Ole e 1有交叉反應(yīng)活性。因此，本發(fā)明提供的重組Pla l 1過敏原具有優(yōu)勢在于其可被用于實現(xiàn)對Pla l1和Ole e 1過敏的同時治療或診斷。
使用通過對編碼Pla l 1的核酸分子進行DNA改組(分子增殖)獲得的DNA序列，可生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的重組修飾的過敏原。參照在Punnonen J的文章“過敏疫苗和抗過敏細胞因子的分子增殖”(IntArch Allergy Immunol 2000；121173-182)中公開的操作步驟，以及在該文所提到的文獻中所公開的操作步驟(均在此引為文獻)，可以對編碼Pla l 1的核酸分子進行DNA改組。
DNA改組可在編碼Plal1的核酸分子和任何其它編碼具有潛在的相關(guān)抗原性的過敏原的DNA分子之間進行，以產(chǎn)生編碼引起過敏原性分子的DNA雜合體，其含有來自于兩個或更多不同過敏原的抗原表位，例如來自Pla l 1。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中蛋白質(zhì)或肽是它的衍生物，這種衍生物可能具有一個未改變的或減弱的IgE結(jié)合親和力。
這種衍生物包括化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)和肽，例如，戊二醛交聯(lián)修飾的蛋白質(zhì)和肽。這種化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)和肽可以通過標準的蛋白質(zhì)化學(xué)方法獲得。
對過敏性疾病有潛在治療作用的其它化學(xué)修飾蛋白質(zhì)包括含有上述CpG基序的過敏原-DNA綴合物(J.Allergy Clin.Immunol.2001；107；339-350)。其組成成分可以混合物的形式給出。
藥物組合物和治療方法除了活性成分之外，本發(fā)明的藥物組合物可以含有大量的賦形劑和佐劑。所使用的賦形劑可以是常規(guī)應(yīng)用于蛋白質(zhì)和肽制劑的任何一種賦形劑。而佐劑則可以是常規(guī)應(yīng)用于過敏原制劑的任何一種佐劑。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)先為疫苗。疫苗制劑在本領(lǐng)域內(nèi)所普遍熟知。疫苗通常制備成可注射的液體溶液或懸液。這樣的疫苗也可乳化或制成用于鼻、口給藥的形式，后者包括口腔和舌下給藥。正在討論的具有免疫原性的成分(在這里被定義成重組過敏原)可同賦形劑適當混合，該賦形劑為藥學(xué)可接受的并且與活性成分相容。水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等以及其組合為適合的賦形劑的實例。另外，該疫苗還可以含有其它的物質(zhì)，例如濕潤劑、乳化劑、緩沖劑或提高疫苗效力的佐劑。
疫苗最常見以腸胃外方式通過皮下或肌內(nèi)注射給藥。在這樣的疫苗內(nèi)，活性物質(zhì)可被吸附到固體載體上或是以水溶液形式存在。另一種適合的給藥方式包括口服制劑和栓劑?？诜o藥的疫苗所使用的賦形劑都是這類制劑常用的，例如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂鹽、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。該組合物可被制成固體、懸液、乳化劑、片劑、丸劑、膠囊、微粒，脂質(zhì)體制劑，緩釋制劑，氣霧劑，粉末或顆粒制劑。例如，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可根據(jù)WO00/45847和丹麥專利申請PA200001194中所描述的原理來配制。
該疫苗的給藥方式需符合劑量劑型，并且給藥量也應(yīng)為治療有效的和免疫原性的。疫苗內(nèi)含有的活性成分的量視治療對象而定，包括對象的免疫系統(tǒng)對該治療的應(yīng)答能力、給藥方式以及對象的年齡和體重。適合的劑量范圍在0.0001μg-1000μg之內(nèi)變動。
如上所述，通過向制劑內(nèi)加入佐劑可增加藥效。例如，氫氧化鋁和磷酸緩沖溶液中的0.05％-0.1％的磷酸鹽(鋁)或磷酸鈣、以0.25％溶液使用的糖合成聚合物或聚交酯乙交酯(polyactid glycolid)(PLG)。細菌細胞混合物如C.parvum、革蘭氏陰性細菌的內(nèi)毒素或脂多糖成分，生理上可接受的油載體中如二縮甘露醇monoaleate(Aracel A)的乳化劑或用作封閉替代物的含20％培氟卡波如培氟卡波-DA溶液的乳化劑也可使用。油劑乳化劑如MF-59也可使用。還可使用其它的佐劑如弗氏完全和不完全佐劑，以及皂甙如QuilA、Qs-21、ISCOM和RIBI。
在更多情況下，疫苗需要多次給藥以確保其效力。通常，疫苗以初次給藥方式給藥，接下來采用接種或其它給藥方式。接種次數(shù)一般將在1-50次范圍內(nèi)，通常不會超過35次接種。正常情況下，接種以從兩周一次到兩個月一次進行兩個月到五年，預(yù)計能達到預(yù)防或治療的期望水平。
重組過敏原可用作藥物制劑，其適于在癥狀發(fā)生當年的一定時期內(nèi)對過敏性反應(yīng)提供一定的保護作用(預(yù)防)。在某些情況下，每年必須重復(fù)這種處理以維持其預(yù)防作用。用于鼻、口和舌下的制劑尤其適用于此種目的。
最后，本發(fā)明的重組過敏原可同靶向分子的聯(lián)合提供以傳遞到免疫系統(tǒng)的特異細胞或粘膜表面上。
載體和宿主根據(jù)本發(fā)明的表達載體可以是包括質(zhì)粒和噬菌體在內(nèi)的任何能夠表達Pla l 1的表達載體。根據(jù)本發(fā)明的表達載體優(yōu)選是質(zhì)粒，例如pPIC9、pROEX HT(生產(chǎn)廠商Life Technologies)，pGAPZ(生產(chǎn)廠商Invitrogen)，pSFV1(生產(chǎn)廠商Life Technologies)。
根據(jù)本發(fā)明的宿主可以是任何能夠容納所使用的載體的宿主，包括細菌細胞、哺乳動物細胞和酵母細胞。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞為巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)和細菌大腸桿菌(E.coli)。
診斷的方法本發(fā)明的體外診斷和預(yù)后方法可以是任何能夠測量專一針對過敏原性底物的IgE的水平的免疫學(xué)實驗方法。
優(yōu)選，體外實驗是選自WO94/11734、WO99/67642、WO00/37941中描述的實驗，而它們在此被引用為參考文獻。
本發(fā)明的體內(nèi)診斷和預(yù)后方法可以是任何能夠評價受試者對過敏原性底物敏感性的實驗方法，如皮膚測，例如表皮剌穿試驗、皮內(nèi)試驗和支氣管刺激試驗。
預(yù)測過敏原疫苗療效的方法可以是任何能夠預(yù)計的已知方法，如在WO99/67642中描述的方法。
定義在本發(fā)明中，表達“表位”意指抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)，形式為一級氨基酸序列中至少5個氨基酸長的片段，或者是成熟折疊的蛋白質(zhì)(三維，三級結(jié)構(gòu))中至少5個氨基酸構(gòu)成的表面暴露區(qū)域。術(shù)語“表位”既包括B細胞也包括T細胞的表位。該抗體可以是任何免疫球蛋白，包括分屬于IgA、IgD、IgE、IgG、IgM的各種免疫球蛋白。
表達“SEQ ID NO.3序列的片段”意指含有至少15堿基對的片段。
表達“核酸分子具有編碼…氨基酸序列的序列”意指編碼特定氨基酸序列的任何核苷酸分子序列。
表達“嚴緊條件”指的是下述條件氯化鈉濃度范圍為0.15M-0.9M；溫度范圍為20℃-55℃。
表達“高嚴緊條件”指的是下述條件氯化鈉濃度范圍為0.02M-0.15M；溫度范圍為50℃-70℃。
表達“簡并”意指在核酸序列中所發(fā)生的一個或更多的堿基置換，其結(jié)果并不會改變由此核酸編碼的氨基酸序列。
表達“SEQ ID NO.3的序列”意指在SEQ ID NO.3中顯示的三個序列突變體中的任意一個。同樣的，‘SEQ ID NO.4的序列”意指在SEQ ID NO.4中顯示的三個序列突變體中的任意一個。
表達“重組蛋白質(zhì)或肽”包括合成的蛋白質(zhì)/肽(也就是化學(xué)合成制備的分子)以及利用重組技術(shù)制備的蛋白質(zhì)/肽。
表達“降低的IgE結(jié)合親合力”意指IgE結(jié)合親和力在部分或整體上減弱。
實施例參考下述具體實施例，可以對本發(fā)明有更深入的理解。下文這些實施例僅為闡清楚，且非意在限定本發(fā)明的范圍。這里盡管使用了專業(yè)術(shù)語，但其并不是為了增加限制，而是為了提高理解性。
如果沒有特別指明，重組DNA技術(shù)都按照參考文獻(24)的標準步驟進行。
實施例1這個實施例是用來描述從P.lanceolata花粉中分離RNA、合成cDNA第一鏈以及擴增Pla l 1-特異cDNA的3’片段。
總RNA是通過在變性溶液中對花粉顆粒進行延長的超聲裂解，之后對上懸浮液進行苯酚-氯仿抽提，從鹿角車前草花粉中提取出來的。將花粉(0.6g)懸浮于7mL變性溶液中(含4M硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉pH7.0，0.5％(w/v)肌氨酸月桂酯，100mM β-巰基乙醇)(25)，然后將該懸浮液在Vibracell超聲波儀VC300中超聲處理30min，工作循環(huán)50％超聲波暴露，于設(shè)置9。然后將0.7mL 2mM pH4.0的乙酸鈉溶液、7mL水飽和的苯酚及1.4mL的氯仿∶異戊醇溶液(49∶1，v/v)添加到超聲處理后的懸液中，4℃溫育15分鐘，偶爾震蕩。在10,000g，4℃，離心20分鐘以分離兩相。轉(zhuǎn)移水相到一個干凈的管中，在-20℃下添加相同體積異丙醇以沉淀RNA，并在此溫度下溫育1小時。將沉淀溶解在0.3mL的變性溶液中，并采用相同的方法，再次以異丙醇沉淀RNA。用75％乙醇清洗沉淀并將其晾干。最后，此RNA沉淀溶解在DEPC處理過的水中，等份凍存于-70℃，待用。
按照廠家推薦的使用說明，使用由3’-RACE系統(tǒng)試劑盒(Gibico-BRL公司)提供的Superscript逆轉(zhuǎn)錄酶和AP引物，從10μgRNA合成出cDNA第一鏈。AP引物由在5’端連續(xù)的17個dT殘基和適合于方向性克隆的限制性酶切位點組成(5’GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT3’)。
在RNA酶H處理之后，將Pla l 1-特異cDNA(3’片段)從2μl cDNA第一鏈的合成反應(yīng)混合物擴增出來。該擴增以自Pla l l N-末端5-10的氨基酸序列(23)推導(dǎo)出的簡并的寡核苷酸鏈(Pla 1，表1)作為正義引物；以由3’-RACE 系統(tǒng)試劑盒提供的UAP(5’CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTAC3’)作為反義引物。通常，DNA擴增通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行，引物的濃度為10μM，Taq DNA聚合酶(Gibico-BRL公司)的量為2.5個單位，反應(yīng)混合物終體積為50μl。 DNA擴增的條件就是廠商推薦使用的酶的條件，以各反應(yīng)中所用的特異引物的函數(shù)來調(diào)節(jié)退火溫度。對于這一特定反應(yīng)，退火溫度為51℃。在PCR反應(yīng)中使用的儀器為Gene ATAQ(Pharmacia)程控?zé)峥刂苾x。
通過1.2％瓊脂糖/TAE凝膠電泳分析，同分子量標準(100bp梯，MBI Fermentas公司)相比，PCR產(chǎn)物顯示出分子大小約為700bp的片段，這同由該蛋白質(zhì)的分子量大小推知的相應(yīng)DNA片段大小相一致。
表1為克隆、測序和表達Pla l 1設(shè)計的引物序列。
N表示A，T，G，C中任何一個均可出現(xiàn)在該位置Y表示C或T中任何一個均可出現(xiàn)在該位置R表示A或G中任何一個均可出現(xiàn)在該位置實施例2這個實施例描述了Pla l 1-cDNA 3’片段的克隆與測序。
將通過3’-RACE PCR擴增出的Pla l 1-cDNA 3’片段從瓊脂糖凝膠中純化出來，然后將之克隆入攜帶有T核苷懸掛末端的pGEM Easy載體中(Promega公司)[26]，該質(zhì)粒攜帶有可用于篩選轉(zhuǎn)化株的氨芐青霉素抗性基因以及位于克隆位點兩側(cè)的多個限制性酶切位點。在T4DNA連接酶的作用下，4℃孵育16小時進行連接反應(yīng)。之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。利用Wizard Plus Minipreps(Promega公司)的方法將質(zhì)粒DNA從重組轉(zhuǎn)化株中制備出來。為了證實篩選出的轉(zhuǎn)化株含有目的插入序列，將質(zhì)粒DNA的樣品用EcoR I(Boehringer公司)消化，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分析。利用雙脫氧核苷酸鏈末端終止法[27]測定幾個克隆的完全雙鏈核苷酸序列。DNA測序工作是利用ABI PRISM Dye Terminator系統(tǒng)和ABI377自動測序儀(AppliedBiosystem公司)進行。
編碼Pla l 1的cDNA序列含有3’非翻譯區(qū)序列和多聚腺苷酸尾(Poly A)。不同克隆之間編碼區(qū)和非編碼區(qū)都存在一些差異。當提到編碼完整的Pla l 1過敏原克隆序列時，這些差異將被公開和廣泛的討論(實施例4)。上文所得到的序列允許我們從無多態(tài)性位置的序列延伸部分去設(shè)計特異性的引物。如下述實施例中所描述的，為了清晰的闡明蛋白質(zhì)N-末端和信號肽相對應(yīng)的核苷酸序列(Pla 2和Pla3，表1)，將這些引物用于5’-RACE。
實施例3這個實施例描述了Pla l 1的5’片段的合成、擴增、克隆和測序過程，該5’部分包括編碼該蛋白質(zhì)的前導(dǎo)肽和N-末端片段的核酸序列。
cDNA第一鏈的合成和Pla 1-cDNA的5’片段擴增利用5’-RACE系統(tǒng)試劑盒(Gibico-BRL公司)進行，特異引物來自于在實施例2描述中得到的Pla l 1的cDNA的3’部分核酸序列(Pla 2和Pla 3，表1)。簡單的說，cDNA第一鏈從10μgRNA合成，以基因特異的反義引物(Pla2，表1)，在Superscript逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibico-BRL公司)作用下合成出來的。在cDNA第一鏈合成之后，用RNase Mix(RNase H和RNase T1，Gibico-BRL公司)處理以去除原始的mRNA模板。用試劑盒中的GlassMax Spin Cartridge將未參入的dNTPs、Pla 2以及蛋白同cDNA分離。使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和dCTP向cDNA的3’末端加上多聚尾巴。該加尾反應(yīng)在冰上孵育1個小時得以完成。由于該反應(yīng)在PCR兼容緩沖液中進行，所以等份該反應(yīng)液可不經(jīng)過任何中間純化步驟直接用于PCR擴增。dC-cDNA的擴增利用Taq DNA聚合酶、一個嵌套的Pla l 1特異引物(Pla 3，表1)和一個由試劑盒提供的含脫氧次黃苷的錨引物(AP2，5’GGCCACGCGTCGACTAGTACGG GIIGGGIIGGGIIG3’)來進行。該反應(yīng)的退火溫度為65℃。通過1.2％瓊脂糖/TAE凝膠電泳分析，同分子量標準對比，PCR產(chǎn)物顯示出一個分子大小約為300bp的片段，這同預(yù)計的DNA片段大小相一致。將通過PCR的方法擴增出的Pla l 1-cDNA的5’片段從瓊脂糖凝膠中純化出來，之后將之克隆入pGEM T Easy載體中(Promega公司)。然后采用實施例2所述方法進行測序。利用雙脫氧核苷酸鏈末端終止法測定三個克隆的雙鏈完全核苷酸序列，這些序列示于SEQ ID.1中。在所有的測序克隆中，編碼前導(dǎo)肽的核苷酸序列具有相同的長度(相應(yīng)于25個氨基酸殘基的75堿基)。僅僅在克隆14的前導(dǎo)肽的核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)了一個堿基置換情況，這暗示了一個氨基酸改變(SEQ ID.2)。關(guān)于相應(yīng)于成熟蛋白質(zhì)的延伸序列，前86個堿基沒有發(fā)生突變。在克隆14中第87個堿基發(fā)生了變化。該變化將在實施例4中深入討論。根據(jù)成熟蛋白質(zhì)N-末端建立的確定序列，設(shè)計出非簡并的20個核苷酸長的引物(Pla 4，表1)。該引物被用于3’擴增以獲得編碼成熟蛋白質(zhì)的全長克隆，該基因在實施例4和5的描述中將被用于測序和Pla l 1的表達。
實施例4這個實施例描述了以成熟蛋白質(zhì)N-末端起始的Pla l 1-特異cDNA的克隆和序列。
以花粉RNA進行cDNA第一鏈的合成和Pla l 1-特異cDNA的3’RACE擴增，除了擴增的退火溫度為55℃和使用的引物為相應(yīng)于成熟的Pla l 1過敏原氨基酸序列上1-7位的Pla 4(表1)，其它步驟均按照實施例1中的描述操作進行。采用實施例2描述的方法，將PCR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠中純化出來，克隆入pGEM T Easy載體，然后對其進行測序。利用雙脫氧核苷酸鏈末端終止法測定這幾個克隆的雙鏈完全核苷酸序列。核苷酸序列的長度從674-704bp不等。這些差異可能是由于每個克隆中的Poly A長度的不同以及3’非翻譯區(qū)中存在的一些差異造成的。根據(jù)核酸序列的分析，可將這些cDNA克隆分為三組，每一組均編碼Pla l 1同種過敏原性(isoallergenic)變體。在SEQID.3中，給出了各組代表克隆的核苷酸序列。這些克隆序列顯示，它們都編碼了一個131個氨基酸殘基的成熟蛋白質(zhì)。在編碼區(qū)，序列的多態(tài)性在四個位置(87，173，244，297)被觀察到。在利用5’RACE擴增所得到的克隆中可以觀察到87位置處的序列多態(tài)性(實施例3)。在87和297位置發(fā)生的核苷酸替換均未導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸(由核苷酸序列推導(dǎo)出的)的突變。然而，在173和244位置處發(fā)生的多態(tài)性分別導(dǎo)致了在氨基酸序列上58和82位置處的氨基酸的變化。SEQ ID.4描述了由這三組已測過序列的克隆中的典型克隆編碼的成熟蛋白質(zhì)氨基酸序列的比較結(jié)果。克隆1.2編碼的是一個在58位置上為谷氨酸、在82位置上為絲氨酸的氨基酸序列?？寺?.6編碼的是一個在58位置上為甘氨酸、在82位置上為絲氨酸的氨基酸序列?？寺?.4編碼的是一個在58位置上和在82位置上均為甘氨酸的氨基酸序列。根據(jù)IUIS對過敏原命名的規(guī)則，由這些基因編碼的蛋白質(zhì)均應(yīng)被認為是變體。因此，它們被命名如下Pla l 1.0101是指由Pla l 1.2代表的那組克隆編碼的過敏原。Pla l 1.0102是指由Pla l 1.6代表的那組克隆編碼的過敏原。Pla l 1.0103是指由Pla l 1.4代表的那組克隆編碼的過敏原。所有突變體在序列中都含有6個半胱氨酸殘基，并且在107位置處還含有一個潛在的N-糖基化位點。成熟的Pla l 1過敏原突變體0101、0102、0103肽骨架分子量分別為14521、14463、14433。由Pla l 1過敏原突變體的氨基酸序列推導(dǎo)出的親水性的比較結(jié)果顯示氨基酸序列的改變并沒有顯著改變它們的表面性質(zhì)，因而它們也可能并沒有改變該蛋白的抗原特征。
實施例5這個實施例描述的是重組Pla l 1過敏原變體0101在巴斯德畢赤氏酵母中的表達。
巴斯德畢赤氏酵母是一種甲基營養(yǎng)酵母，只要環(huán)境中沒有其他可利用的碳源，它就可以利用甲醇作為碳源。編碼具有醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)的兩個基因AOX1和AOX2存在于巴斯德畢赤氏酵母基因組中。當甲醇為唯一可利用的碳源時，AOX1產(chǎn)物占總表達蛋白的80％。利用這一優(yōu)點，巴斯德畢赤氏酵母表達系統(tǒng)基本上以目的基因替代AOX1，另一方面，所使用的酵母菌株GS115his4的生長要依賴于培養(yǎng)基中的組氨酸。
表達載體pPIC9(invitrogen公司)被用于在巴斯德畢赤氏酵母菌株中的表達。該載體攜帶有編碼啤酒糖醇母(Saccharomycescerevisiae)α-交配因子信號肽的DNA序列，該序列位于插入基因的多克隆位點的上游。這個信號肽可被酵母有效識別，從而導(dǎo)致異源蛋白質(zhì)在酵母菌中的大量分泌表達。編碼這一信號肽的DNA和多克隆位點均位于AOX1位點的3’端和5’端之間，從而引發(fā)DNA重組。不僅如此，該載體還含有一個細菌復(fù)制起點、一個氨芐青霉素抗性基因(用于篩選細菌中的轉(zhuǎn)化株)、一個組氨脫氫酶基因HIS4，使細胞可生長在不含組氨酸的培養(yǎng)基中，用于篩選酵母中的轉(zhuǎn)化株。
為了表達，首先利用PCR(使用Gibico-BRL公司生產(chǎn)的商品3’RACE系統(tǒng)試劑盒)擴增Pla l 1基因編碼區(qū)。以來自花粉mRNA的cDNA第一鏈作為模板、兩個非簡并引物為正義引物CTCGAGAAAAGAGAGACACAAACATCTCATCCCGC(Pla 5)，反義引物GGGAATTCTTAACACCCAGGGGC(Pla 6)。它們各自同蛋白質(zhì)編碼區(qū)3’末端和5’末端相雜交，與編碼α-交配因子前原序列(preprosequence)的DNA序列同框，存在于質(zhì)粒pPIC9中。Pla 5還含有一個Xho I限制性酶切位點(下劃線的部分)和一個谷氨酸的密碼子，該谷氨酸能夠使酵母對信號肽進行加工。反義引物含有一個終止密碼子和一個EcoR I限制性酶切位點(下劃線的部分)。擴增的退火溫度設(shè)置為65℃。
如實施例2所述那樣，將PCR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠中純化出來，直接將之克隆入帶有兼容的T核苷懸掛末端的pGEM T Easy載體中。之后將這個構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α細胞中。然后利用氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化株。利用雙脫氧核苷酸鏈末端終止法[27]測定幾個克隆的完全雙鏈核苷酸序列，從而確定了前導(dǎo)序列和Pla l 1基因符合同一閱讀框的安排，并且證明了從起始序列沒有發(fā)生任何改變。
分離上述質(zhì)粒DNA并將之用Xho I-EcoR I限制性酶消化，消化后的DNA片段被亞克隆入質(zhì)粒pPIC9的相同限制性酶切位點而構(gòu)成pPIC9/Pla l 1.0101。
用限制性酶BgI II將質(zhì)粒pPIC9/Pla l 1.0101線性化，利用電穿孔法將純化的大片段轉(zhuǎn)化入GS115細胞中。在30℃時，將轉(zhuǎn)化后的細胞在最低限度的右旋糖平板上培養(yǎng)4-6天直到克隆的出現(xiàn)。篩選通過在AOX1座位處同源重組發(fā)生基因置換的構(gòu)建物，其具有(His+Muts)表型，將His+克隆補(patch)在最低限度葡萄糖對最低限度甲醇的復(fù)制平板上。選擇生長受阻的轉(zhuǎn)化株用于rPla l 1的生產(chǎn)。
將所選的(His+Muts)轉(zhuǎn)化株在30℃時在緩沖甘油復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。通過離心收集細胞，為了誘導(dǎo)AOX1啟動子的表達，細胞被重懸于十五分之一原始體積的緩沖甲醇復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，并且每天要向每升培養(yǎng)物中補充5mL甲醇。然后在4℃、3000g條件下離心除去培養(yǎng)基中GS115誘導(dǎo)的的酵母細胞。用SDS-PAGE和ELISA反應(yīng)(使用專門為Pla l 1特異設(shè)計的單克隆抗體)分析不同時間培養(yǎng)基上清中的rPla l 1的生產(chǎn)(29)。重組Pla l 1在培養(yǎng)4天后可達到最大表達水平。
使用在小規(guī)模實驗產(chǎn)生最高產(chǎn)量的克隆在相似條件下進行大規(guī)模的rPla l 1的生產(chǎn)。重組過敏原的產(chǎn)量最后可達到20mg/L培養(yǎng)基。
實施例6這個實施例描述重組Pla l 1過敏原-突變體0101從培養(yǎng)基中的純化以及純化蛋白質(zhì)的表征。
將如實施例5所述獲得的培養(yǎng)基經(jīng)水透析，剩余的物質(zhì)作為純化rPla l 1的原始材料。首先使用DEAE-5PW柱(Waters Chromatography公司)和溶于Tris緩沖液的乙酸鈉梯度進行陰離子交換色譜層析。離子交換純化后的重組過敏原經(jīng)廣泛的水透析。文獻報道，其它應(yīng)用于天然過敏原純化的方法如凝膠過濾色譜法(23)和使用單克隆抗體的親和層析色譜法(29)，也用于重組過敏原的高純度的生產(chǎn)。純化的重組Pla l 1過敏原的SDS-PAGE分析顯示，它同天然Pla l 1過敏原具有類似的電泳圖案膠上有兩條明顯的分子量為17和22KDa的主帶，分別對應(yīng)的是過敏原單體的糖基化和非糖基化形式(圖1)，這也被使用PNGase F(Boehringer Mannheim公司)進行的過敏原去糖基化實驗所證實。用PNGase F處理可使22KDa帶轉(zhuǎn)變?yōu)?7KDa(非糖基化)的條帶(圖1)。同時，這些結(jié)果也被MALDI-TOF質(zhì)譜所證實。質(zhì)譜也證實了在SDS-PAGE膠上32-36KDa之間較寬的彌散的條帶為過敏原單體形成的二聚體。純化的重組Pla l 1過敏原的N-末端氨基酸測序結(jié)果和氨基酸組成分析結(jié)果也證實了在巴斯德畢赤氏酵母中表達的蛋白質(zhì)為Pla l 1。在蛋白質(zhì)N-末端處產(chǎn)生的額外谷氨酸是為了讓重組DNA構(gòu)建體在酵母中表達對重組DNA進行修飾的結(jié)果。
表征已表達的重組過敏原的技術(shù)也能夠提供關(guān)于它的純度的一些信息。考馬斯亮蘭染色的SDS-PAGE膠的密度計量顯示rPla l 1的純度大于95％。HPLC色譜和MALDI-TOF質(zhì)譜也給出了類似的結(jié)果。另外，通過埃德曼降解該蛋白質(zhì)得到了一個沒有污染的唯一序列。這事實上證明了該蛋白質(zhì)的純度已經(jīng)達到了99％以上。
另外，也可通過單克隆抗體和來自車前草過敏的患者的血清對重組Pla l 1過敏原進行免疫化學(xué)表征。重組蛋白質(zhì)可被由天然過敏原產(chǎn)生的單克隆抗體2A10(29)所識別，表明了其含有相同抗原決定簇。這也暗示了重組蛋白質(zhì)的折疊同天然過敏原是非常相似的。圓二色譜的測定結(jié)果反過來又證實這個推測。在圓二色譜的遠紫外區(qū)，重組過敏原和天然過敏原的譜圖幾乎是相同的(圖2)。另一方面，對重組Plal 1進行的一組抗來自車前草過敏的患者的血清的實驗結(jié)果顯示，大部分患者的血清都顯示出了陽性反應(yīng)。不僅如此，在一個來自于患者血清的特異IgE同天然Pla l 1結(jié)合的抑制實驗中，重組過敏原給出了一個同天然過敏原平行的抑制曲線，可以達到80％的IgE-結(jié)合抑制率(圖3)。所有這些結(jié)果都表明了大多數(shù)存在于天然過敏原中引起過敏的抗原決定部位也都存在于重組過敏原中，因此它是診斷車前草過敏的患者的一個足夠的工具。
實施例7這個實施例描述了過敏原Pla l 1抗原決定部位的序列、結(jié)構(gòu)和位置的鑒定方法。
過敏原Pla l 1序列抗原決定部位的序列和位置的鑒定是通過部分重疊肽段的方法得到整個氨基酸序列。這些肽段的氨基酸序列是由SEQ ID.4中顯示出的序列中推導(dǎo)出來的。這些肽段由化學(xué)法合成或作為重組蛋白而合成，具體講就是通過在合適載體中插入相應(yīng)的核酸序列并在宿主細胞表達。利用免疫實驗或其它免疫化學(xué)技術(shù)來檢測有能力同特異抗體(取自于過敏性患者血清的IgE或單克隆抗體等)結(jié)合的肽，從而鑒定B細胞抗原表位。不僅如此，還可利用T細胞增殖實驗來檢測上述肽段中哪些能夠形成T細胞抗原表位部分。
能得到Pla l 1核酸序列及表達出的重組過敏原有助于對過敏原上構(gòu)象表位進行鑒定。使用X射線晶體衍射法和核磁共振技術(shù)對重組過敏原結(jié)構(gòu)進行分析，我們已經(jīng)得到了抗原表位的三維結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)。或者，使用計算機預(yù)測算法分析氨基酸序列去尋找潛在的可形成抗原表位的表面殘基。另外，利用定點突變來產(chǎn)生Pla l 1變體，置換可能參與形成B細胞抗原表位的氨基酸殘基。分析這些變體對抗體的結(jié)合能力來確定組成抗原表位的那些殘基。
對于治療車前草過敏癥來說，具有減弱的IgE結(jié)合能力的肽和重組Pla l 1變體是一種安全有效的備選藥物。
實施例8利用蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)庫，比較了Pla l 1的三個變體同已知蛋白質(zhì)的序列，結(jié)果在表2中給出。
表2
表2Pla l 1過敏原同源物的分子特征。序列同一性(％I)和相似性(％S)的百分比。PI，等電點；Mm，分子量；N°R，殘基數(shù)量。前三個過敏原的氨基酸序列在Swiss-Prot Data Bank中列出。登記號049813代表樺樹推測的Ole e 1，082016代表Lig v l，P19963代表Ole e 1。Lol p 11序列在NCBI Data Bank中列出，登記號為A54002。
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序列表SEQ ID NO.1Clon12GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAGCATAAACAAATAAATAAAG 60Clon 3GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGGG--ATAAACAAATGAATAAAG 55Clon 14 GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGA--------AAAAAAAG 43********************* ** *****Clon 12ACAACTATAAAAGAAAAAAAAGGAATAAATTAAAAAAATGGTAAAGCTCACACAAGTTGC 119Clon 3ACAACTAAAAAAGAAAAAAAAGGAATAAATTAAAAAAATGGTAAAGCTCACACAAGTTGC 115Clon 14 A-----AAAAAAGAAAAAAAGAA--AAAAATATGGTAAAGCTCACACAAGTTGC 90* **** * ****** ******** *******Clon12AGCAATACTCTTAATCGGGGCCTTCTTCTTGATAGCCTCCCCTTCCATAGCTACACAAAC 179Clon 3AGCAATACTCTTAATCGGGGCCTTCTTCTTGATAGCCTCCCCTTCCATAGCTACACAAAC 175Clon14AGCAATACTCTTAATCGGGGCCTTCTTCTTGATAGCCTCCACTTCCATAGCTACACAAAC 150********************* ************
Clon12ATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGAGGTATACTGCAATGTTTGTCACAGCAG 239Clon 3ATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGAGGTATACTGCAATGTTTGTCACAGCAG 235Clon14ATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGAGGTATACTGCAATGTTTGTCACAGCAG 210*********************************Clon12AAATTTAATCAATGAACTCA 292Clon 3AAATTTAATCAATGAACTCA 288Clon14AAATTTAATCAATGAACTTA 263****************** *****************************
SEQ ID NO.2-20 -10Clon12M V K L T Q V A A I L L I G A F F L I A S P S I AClon3 ----------------------------------Clon14-----------------------------T--
SEQ ID NO.3Pla | 1.2ACACAAACATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGAGGTATACTGCAATGTTTGT 60Pla | 1.6ACACAAACATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGAGGTATACTGCAATGTTTGTPla | 1.4ACACAAACATCTCATCCCGCAAAATTCCACGTTGAGGGAGAGGTATACTGCAATGTTTGT**********************************Pla | 1.2CACAGCAGAAATTTAATCAATGAACTCAGCGAACGCATGGCAGGGGCACAAGTGCAATTG 120Pla | 1.6CACAGCAGAAATTTAATCAATGAACTTAGCGAACGCATGGCAGGGGCACAAGTGCAATTGPla | 1.4CACAGCAGAAATTTAATCAATGAACTTAGCGAACGCATGGCAGGGGCACAAGTGCAATTG****************** **************Pla | 1.2GATTGCAAAGATGATTCTAAAAAAGTCATATACTCTATAGGGGGTGAGACTGATCAAGAT 180Pla | 1.6GATTGCAAAGATGATTCTAAAAAAGTCATATACTCTATAGGGGGTGAGACTGGTCAAGATPla | 1.4GATTGCAAAGATGATTCTAAAAAAGTCATATACTCTATAGGGGGTGAGACTGGTCAAGAT***************************** ******
Pla | 1.2GGTGTTTACCGCCTGCCTGTTGTAGGCTATCACGAAGATTGTGAAATCAAACTAGTGAAG 240Pla | 1.6GGTGTTTACCGCCTGCCTGTTGTAGGCTATCACGAAGATTGTGAAATCAAACTAGTGAAGPla| 1.4GGTGTTTACCGCCTGCCTGTTGTAGGCTATCACGAAGATTGTGAAATCAAACTAGTGAAG**********************************Pla| 1.2AGCAGCAGGCCCGATTGTAGTGAAATTCCGAAACTTGCAAAGGGAACAATTCAAACCTCG 300Pla| 1.6AGCAGCAGGCCCGATTGTAGTGAAATTCCGAAACTTGCAAAGGGAACAATTCAAACCTCGPla| 1.4AGCGGCAGGCCCGATTGTAGTGAAATTCCGAAACTTGCAAAGGGAACAATTCAAACATCG*** ************************** ***Pla | 1.2AAAGTGGACCTTTCAAAAAACACAACCATCACCGAAAAAACACGTCATGTCAAGCCACTG 360Pla | 1.6AAAGTGGACCTTTCAAAAAACACAACCATCACCGAAAAAACACGTCATGTCAAGCCACTGPla | 1.4AAAGTGGACCTTTCAAAAAACACAACCATCACCGAAAAAACACGTCATGTCAAGCCACTG**********************************
Pla | 1.2AGCTTTCGCGCAAAGACGGATGCCCCTGGGTGTTAAaggatgctgcagagggcgattaat 420Pla | 1.6AGCTTTCGCGCAAAGACGGATGCCCCTGGGTGTTAAaggatgctgcagagggcgattaatPla | 1.4AGCTTTCGCGCAAAGACGGATGCCCCTGGGTGTTAAaggatgctgcagagggcgattaat********************************Pla l 1.2tgtacaagtccaattttcataataacaagcgttcaatgtgattcctttttcttgttttct 480Pla l 1.6tgtacaagtccaattttcttaataacaagcgttcaatgtgattcctttttcttgttttctPla l 1.4tgtacaagtccaattttcttaataacaagcgttcaatgtgattcctttttcttgttttct*************** ************************************Pla l 1.2tgttttctttttgttcccccagttttgtagtagtattcaaagttcaataaggtgtttcc 540Pla l 1.6tgttttcttttttgttcccccagttttgtagtagtattcaaagttcaataaggtgtttccPla l 1.4tgttttcttttttgttcccccagttttgtagaagtattcaaagttcaataaggtgtttcc******************************* *********************Pla l 1.2agaccctggttgaggttggtttctcaggatactgatgaacctttttattatctatgagta 600Pla l 1.6agaccctggttgaggttggtttctcaggatactgatgaacctttttattatctatgagtaPla l 1.4agaccctggttgaggttggtttctcaggatactgatgaacctttttattatctatgagta******************************** ******************Pla l 1.2gttatacgcaaaagtttggatagt-------------gtttatatttaaatggaat 643Pla l 1.6gttatacgcaaaagttttgcaagcagtgagaaatcactgtagtttatatttaaatggaat660Pla l 1.4gttatacgcaaaagtttggatagt-----------gtttatatttaaatggaat 643************* * ** ****************Pla l 1.2 ttgatgttcttacaattcg(a)42704 Pla l 1.0101
Pla l 1.6ttgatgttcttac(a)19692Pla l 1.0102Pla l 1.4ttgatgttcttac(a)23679Pla l 1.0103*************
SEQ ID NO.410 2030 40 5060Pla l 1.2 TQTSHPAKFH VEGEVYCNVC HSRNLINELS ERMAGAQVQLDCKDDSKKVI YSIGGETDQDPla l 1.6 ----- ----- ----- ----- ----- -----G--Pla l 1.4 ----- ----- ----- ----- ----- -----G--70 80 90100110 120Pla l 1.2 GVYRLPVVGY HEDCEIKLVK SSRPDCSEIP KLAKGTIQTSKVDLSK TEKTRHVKPLPla l 1.6 ----- ----- -S----- ----- ----- -----Pla l 1.4 ----- ----- -G----- ----- ----- -----130Pla l 1.2 SFRAKTDAPG CPla l 1.0101Pla l 1.6 ----- - Pla l 1.0102Pla l 1.4 ----- - Pla l 1.010權(quán)利要求
1.編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸分子，該蛋白質(zhì)或肽含有鹿角車前草主要過敏原-Pla l 1的至少一個抗原表位，其中核酸分子a)具有SEQ ID NO.3的序列，b)是SEQ ID NO.3序列的一個片段，c)具有編碼SEQ ID NO.4的氨基酸序列或其片段的序列，d)具有在嚴緊條件下與SEQ ID NO.3序列雜交的序列，e)具有由SEQ ID NO.3簡并可衍生的序列，或f)序列a)-e)中任一的互補鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子，其中核酸分子源自選自于車前科的植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核酸分子，其中序列d)是在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3序列雜交的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一的核酸分子，其中序列d)與SEQ ID NO.3有至少67％的序列同一性。
5.重組蛋白質(zhì)或肽，其含有鹿角車前草的主要過敏原-Pla l 1的至少一個抗原表位，其含有相應(yīng)于權(quán)利要求1-4中任一的核酸序列的氨基酸序列，并排除由SEQ ID NO4上1-16氨基酸及其片段構(gòu)成的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)或肽，其同SEQ ID NO.4相比較包含修飾的氨基酸序列以及具有減弱的IgE結(jié)合親和力。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的蛋白質(zhì)或肽，其包含至少一個與源自于油橄欖的Ole e l過敏原的抗原表位具有相同的IgE結(jié)合親和力的抗原表位。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一的蛋白質(zhì)或肽，其中該蛋白質(zhì)或肽是其衍生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一的蛋白質(zhì)或肽，其用作一種藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一的蛋白質(zhì)在生產(chǎn)在受試者中預(yù)防、減輕或治療過敏性反應(yīng)的藥物中的用途。
11.適于轉(zhuǎn)化宿主的表達載體，此載體含有根據(jù)權(quán)利要求1-4任一的核酸分子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的表達載體，其中此載體是一種質(zhì)粒。
13.含有根據(jù)權(quán)利要求11或12的表達載體的宿主細胞。
14.生產(chǎn)包含鹿角車前草的主要過敏原-Pla l 1的至少一個抗原表位的重組蛋白質(zhì)或肽的方法，其包括在適合的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求13的宿主細胞，從而表達所述Pla l 1核苷酸序列、生產(chǎn)以及分離所述蛋白質(zhì)或肽。
15.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求5-8任一的重組蛋白質(zhì)或肽作為活性物質(zhì)。
16.在受試者中預(yù)防、減輕或治療過敏性反應(yīng)的方法，包括對受試者施用根據(jù)權(quán)利要求5-8任一的重組蛋白質(zhì)或肽，或者根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物。
17.體外診斷或預(yù)測受試者針對Pla l 1過敏原的過敏反應(yīng)的方法，其包括從受試者收集樣品并確定針對根據(jù)權(quán)利要求5-8任一的蛋白質(zhì)或肽的IgE抗體水平。
18.體內(nèi)診斷或預(yù)測受試者Pla l 1過敏原的過敏反應(yīng)的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求5-8任一的蛋白質(zhì)或肽施與受試者進而監(jiān)測受試者反應(yīng)。
19.用于體內(nèi)或體外診斷或預(yù)測受試者針對Pla l 1過敏原的過敏反應(yīng)的試劑，其中該試劑含有根據(jù)權(quán)利要求5-8任一的蛋白質(zhì)或肽。
20.使用根據(jù)權(quán)利要求5-8任一的蛋白質(zhì)或肽預(yù)測過敏反應(yīng)疫苗效應(yīng)的方法。
全文摘要
一個編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸分子，該蛋白質(zhì)或肽含有鹿角車前草(Plantago lanceolata)主要過敏原－Pla l 1的至少一個抗原表位，其中核酸分子a)具有SEQ ID NO3的序列，b)是SEQ ID NO3序列的一個片段，c)含有一個編碼SEQ ID NO4的氨基酸序列或其片段的序列，d)具有一個在嚴緊條件下與序列SEQ ID NO3雜交的序列，e)具有通過SEQ ID NO3簡并可衍生的一段序列，f)序列a)－e)中任一的互補鏈。
文檔編號C12N1/15GK1596309SQ02813000
公開日2005年3月16日 申請日期2002年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月30日
發(fā)明者B·C·弗賴爾, A·D·佩拉萊斯, D·B·赫爾南德茲, G·S·杜蘭, F·P·克拉萊斯 申請人:阿爾克-阿貝洛有限公司