專利名稱：與利什曼原蟲屬寄生蟲毒性相關(guān)的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗利什曼病領(lǐng)域。本發(fā)明起于從碩大利什曼原蟲(Leishmania major)的野生分離株中鑒定到一種基因，該基因編碼的蛋白命名為LmPDI，該蛋白具有兩個與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)潛在活性位點(Cys-Gly-His-Cys)序列相同的區(qū)域。LmPDI蛋白主要在該寄生蟲毒性最強的分離株內(nèi)表達。首先，該蛋白可以成為一個新的治療靶標(biāo)來發(fā)展抗利什曼病藥物，其次，該蛋白還可以作為一個新的元素成為旨在保護人類及動物宿主抗擊利什曼病的免疫原性制劑以及可能地疫苗制劑的組成部分。
影響上百萬個體的利什曼病是一組異質(zhì)性疾病，這些疾病都是由于宿主感染了利什曼原蟲屬原生動物寄生蟲所致。這種感染的臨床表現(xiàn)特征呈現(xiàn)高度多態(tài)性，包括無癥狀的感染，單純或復(fù)發(fā)性皮膚感染形式(cutaneous form)，擴散性或無變應(yīng)性皮膚感染形式，粘膜與皮膚感染形式以及內(nèi)臟感染形式，如果不進行特定的治療，該感染是致命的。通常，根據(jù)該病的地理分布，利什曼病的每個種類或亞類都具有特定的臨床表現(xiàn)，但是，這并不是絕對的規(guī)則。另外，在同樣的地理區(qū)域，相同的寄生蟲物種可能引起不同嚴(yán)重程度的臨床表現(xiàn)。該感染臨床表現(xiàn)的這種多樣性至少部分是由于寄生蟲毒性的多樣性引起的。
此寄生蟲在其生活周期中，在兩個階段之間交替有鞭毛的前鞭毛體階段以及無鞭毛體(amastigote)階段，前者可在昆蟲載體的消化道內(nèi)觀察到，后者則存在于宿主的巨噬細(xì)胞內(nèi)。很難使用抗利什曼病藥物，相當(dāng)重要的原因是這些藥物的毒性以及寄生蟲形成的日益頻繁的抗性(Lira，Sundar et al，1999)。另外，近來開發(fā)的測試疫苗目前并沒有顯現(xiàn)出預(yù)期的效力(Sharifi，F(xiàn)eKri et al，1998；Khalil，E1 Hassanet al，2000)。
未能找到控制利什曼病的方法的一部分原因是該寄生蟲傳播周期的復(fù)雜性以及目前對于此寄生蟲生物知識的缺乏。在近十年中，已經(jīng)鑒定了幾種在寄生蟲的傳染性及生物學(xué)中起重要作用的分子。對于表面糖綴合體，特別是脂磷聚糖(LPG)的修飾與碩大利什曼原蟲和杜氏利什曼原蟲(L.donovani)傳染性和毒性的改變有關(guān)(Beverley和Turco，1998)；Desjardins和Descoteaux，1998；Sacks，Modi et al，2000；Spath，Epstein et al，2000)，而這似乎并不適用于墨西哥利什曼原蟲(L.mexicana)(IIg 2000；IIg，Demar et al，2001)。與LPG的生物合成相關(guān)的分子磷酸甘露糖異構(gòu)酶(Garami and IIg，2001)，LPG1(Sacks，Modi et al，2000；Spath，Epstein et al，2000)，LPG2(Descoteaux，Luoet al，1995)以及半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(De and Roy，1999)也與利什曼原蟲毒性相關(guān)。最近還描述了一些其它的毒性因子。其中包括半胱氨酸蛋白酶家族(Mottram，Brooks et al，1998)，促分裂原活化蛋白(MAP)-激酶(Wiese，1998)，A2基因(Zhang和Matlashewski，1997)，表面糖蛋白gp63(Chakrabarty，Mukherjee et al，1996)，動質(zhì)體(kinetoplastid)膜蛋白(KMP)-11(Mukhopadhyay，Sen et al，1998)，過氧化物歧化酶(Paramchuk，Ismail et al，1997)，trypanothione還原酶(Dumas，Ouellette et al，1997)，以及熱休克蛋白(HSP)家族的某些成員(Hubel，Krobitsch et al，1997)。
表征毒性因子可能對發(fā)展新的抗該病的藥物或疫苗具有重要意義。優(yōu)先篩選出與寄生蟲毒性相關(guān)的蛋白可以避免在危險性較低的株系中抗性的不必要出現(xiàn)，這種抗性隨后是可能傳給其它株系的。另外，導(dǎo)致對藥物產(chǎn)生抗性的目標(biāo)毒性蛋白的突變在那時也可以引起寄生蟲毒性的降低或消除，從而具備一定的治療效果。
在過去的幾十年間，使用了很多方法來研究利什曼原蟲寄生蟲的毒性因子。這些方法均基于遺傳學(xué)研究，例如突變寄生蟲的互補(Ryan，Garraway et al，1993；Descoteaux，Luo et al，1995；Desjardins和Descoteaux，1997；Wiese，1998)，基因失效技術(shù)的應(yīng)用(Titus，Gueiros-Filho et al，1995；Mottram，Souza et al，1996；Dumas，Ouellette et al，1997；Hubel，Krobitsch et al，1997；Mottram，Brooks etal，1998)，或?qū)嶒炇覂?nèi)進行的對寄生蟲藥物抗性基因的分析(Cotrim，Garrity et al，1999；Perez-Victoria，Perez-Victoria et al，2001)。這些研究鑒定了此寄生蟲生物學(xué)中幾種重要的基因，目前這些基因正在被確認(rèn)為新藥物的靶(Selzer，Chen et al，1997；McKerrow，Engel et al，1999)，或者作為靶用于開發(fā)及使用毒性減弱的突變體作為活疫苗(Titus，Gueiros-Filho et al，1995；Streit，Recker et al，2001)。必須指出，到目前為止，幾乎所有已進行的關(guān)于利什曼寄生蟲毒性的研究要么是在經(jīng)長時間培養(yǎng)后喪失了毒性的實驗室克隆基礎(chǔ)上進行的，要么是在那些通過突變試驗、基因失效或基因過表達而被遺傳操作了的寄生蟲基礎(chǔ)上進行的。這樣，那些涉及在該條件下被鑒定基因的毒性的結(jié)論很可能與傳播區(qū)域內(nèi)寄生蟲的天然致病性并不切實相關(guān)。
為了研究寄生蟲毒性的分子基礎(chǔ)，避免與使用實驗室株系相關(guān)聯(lián)的方法學(xué)偏差，本發(fā)明人首先分離得到了具有不同毒性水平的碩大利什曼原蟲(L)野生株。碩大利什曼原蟲(L.major)是人畜共患的皮膚利什曼病(ZCL)的起因，在從毛里塔尼亞到蒙古的綿延廣闊區(qū)域內(nèi)，該病在人類中流行。本發(fā)明人鑒定了從人類ZCL損傷處得到的碩大利什曼原蟲分離株，這些碩大利什曼原蟲分離株都是在同樣的傳播季節(jié)得到的，它們對BALB/c敏感小鼠實驗感染模型的致病性各不相同(實施例1)。這種實驗致病力的差異與體外生長的差異相關(guān)，這反映出這些野生型分離株在生物學(xué)方面的差異。
隨后使用“差異顯示”技術(shù)(Liang和Pardee，1992；Liang，Baueret al，1995)，鑒定在完全不同的分離株之間差異表達的那些基因，所述分離株通過它們在BALB/c小鼠中的實驗致病力而區(qū)分(兩個高毒性的分離株以及兩個低毒性的分離株)。該技術(shù)可以在事先不了解基因的序列的情況下，研究以不同水平表達的這些基因。然后鑒定出了三個在兩個毒性最強的分離株內(nèi)被優(yōu)先表達的轉(zhuǎn)錄物。其中一個轉(zhuǎn)錄物通過篩選碩大利什曼原蟲cDNA文庫得以完全表征。對該序列的分析表明其與真核生物的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族(PDI，Erp60和Erp72)具有同源性。根據(jù)下述理由命名這個新蛋白為LmPDI如同PDI家族的其它成員，(i)LmPDI具有兩個CGHC活性區(qū)域，(ii)該蛋白的N-末端區(qū)域含有一個潛在的信號序列，而C-末端區(qū)域含有一個潛在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留信號(EEDL)；(iii)它能夠自身組織成寡聚結(jié)構(gòu)；(iv)在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組蛋白能夠體外表達活性的PDI。另外，除上面提及的保守區(qū)域之外，在LmPDI和上述的其它PDI之間幾乎沒有相似之處。實際上，PDI家族包括許多高度趨異的分子，其與分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白的成熟有關(guān)(Noiva 1999；Frand，Cuozzo et al，2000)。PDI為多功能蛋白，其與表達的調(diào)控，保持，修復(fù)的復(fù)雜機制相關(guān)；該蛋白能夠促進構(gòu)象的改變從而保證只有正確折疊的蛋白質(zhì)才能離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。除了酶的作用之外(還原和異構(gòu))，最近還發(fā)現(xiàn)PDI具有其它的功能，包括陪伴分子活性，肽結(jié)合及細(xì)胞粘附(Ferrari和Soling，1999)。重要的是，強調(diào)LmPDI主要在那些毒性最強的分離株內(nèi)表達(實施例2)?？傊?，這些結(jié)果暗示LmPDI在利什曼原蟲寄生蟲的天然毒性方面具有重要的作用，因此可以作為化學(xué)治療或疫苗接種的新靶標(biāo)。
另外，最近關(guān)于細(xì)菌PDI等價物(稱為DsbA，二硫鍵)作用的數(shù)據(jù)(Martin，1995；Ostermeier，De Sulter et al，1996)提示了該蛋白可能在不同微生物的致病性中的作用(Yu和Kroll，1999)。DsbA基因的失活能夠強烈地影響弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)的存活及毒性(Yu，1998；Yu，Edwards-Jones et al，2000)。DsbA還參與霍亂弧菌(Vibrio cholerae)腸毒素的產(chǎn)生(Peek和Taylor，1992；Yu，Webb etal，1992)。DsbA對致病性大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)物種的致病性也十分重要在尿道致病性物種中，DsbA可催化菌毛蛋白的特定陪伴分子蛋白形成二硫橋鍵(Zhang和Donnenberg，1996)。在致腸病物種中，仍需要DsbA來穩(wěn)定及形成菌毛(Hultgren，Abraham et al，1993；Wang，Bjes et al，2000)。
本申請第一個說明了PDI作為毒性因子在原生動物寄生蟲中起重要作用。LmPDI通過輔助其他因子的構(gòu)象改變和穩(wěn)定來發(fā)揮作用，這些因子對利什曼原蟲寄生蟲的生物學(xué)及致病性是必要的。鑒定這樣的因子對于從生物學(xué)角度更好地了解這種寄生蟲極為有利，而且對于發(fā)展抗利什曼病的新型治療手段或疫苗也很有益處。
這樣，本發(fā)明的第一個方面涉及與利什曼原蟲(Leishmania)毒性相關(guān)的蛋白，其含有至少一個與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族(PDI)蛋白的潛在活性位點(Cys-Gly-His-Cys)相同的位點。該蛋白優(yōu)選由該寄生蟲本身編碼。
特別地，本發(fā)明涉及碩大利什曼原蟲的LmPDI蛋白，其具有SEQID NO3的序列，并涉及任何與LmPDI具有至少40％同一性，優(yōu)選至少80％同一性的LmPDI功能性變體。
在這里，我們將“LmPDI功能性變體”定義為在利用LmPDI基因已被失活的碩大利什曼原蟲株所進行的感染性試驗中，能夠彌補LmPDI的蛋白。本文所述術(shù)語“感染性試驗”指任何能夠評價通常與毒性有關(guān)的寄生蟲生長相關(guān)生物學(xué)特性的試驗。尤其可以列舉下述三種類型的試驗·寄生蟲前鞭毛體形式在液體培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)，通過例如實施例5第2點所述類型的技術(shù)測試；·感染體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞的能力，使用例如實施例6以及 等，2001所述技術(shù)測試；·通過感染敏感小鼠(例如BALB/c)，測試誘導(dǎo)實驗鼠利什曼病的能力。該技術(shù)在例如實施例5第3點以及 等人，2001年的文獻中均有詳細(xì)描述。
使用CLUSTAL W版本1.8軟件(Thompson JD，Higgins DG和Gibson TJ)或BOXSHADE版本3.21軟件(Hoffman K和Baron M)評價與LmPDI的同一性百分比，與幾個物種的PDI家族蛋白比較后，得到LmPDI的同一性百分比在27％-36％之間(實施例2)。
第二方面，本發(fā)明涉及重組多肽，其含有至少一個具有上述定義的蛋白的10個以上氨基酸的片段，并且如果與另一個多肽片段適當(dāng)?shù)厝诤系脑?，那么?dāng)對動物施用該重組多肽時，所述重組多肽就能夠引發(fā)針對LmPDI表位的免疫反應(yīng)。本發(fā)明還涉及如下重組多肽，其含有至少一個具有上述定義的蛋白的10個以上氨基酸的片段，并且如果與另一個多肽片段適當(dāng)?shù)厝诤系脑?，那么該重組多肽就能夠被抗LmPDI蛋白的抗體識別。
在本文中，術(shù)語“多肽”應(yīng)以其廣義理解，即，包括具有至少10個(當(dāng)規(guī)定時可以更多)氨基酸的序列，其可以含有或不含有糖基化部分或糖脂，而且不考慮其一級，二級和三級結(jié)構(gòu)。上述本發(fā)明的重組多肽中存在的LmPDI片段長度可以多于15，20，30，50或100個氨基酸，或者更多。
重組的或從被感染細(xì)胞純化得到的LmPDI以及本發(fā)明的多肽可用于免疫人類或動物宿主，以保護其遠(yuǎn)離利什曼病，或者產(chǎn)生并回收抗LmPDI的抗體，如實施例2所述。
本發(fā)明的一個特定重組多肽為LmPDI-(His)6蛋白，其具有SEQID NO4的序列，如實施例2所述。
本發(fā)明重組多肽的另一實例為LmPDI片段與載體多肽形成的融合蛋白，所述LmPDI片段含有至少一個LmPDI表位，而所述載體多肽有助于該LmPDI片段呈遞給免疫系統(tǒng)。它可以是全長或部分LmPDI與β-內(nèi)酰胺酶片段、或破傷風(fēng)或白喉變性毒素、或任何其它來自病原性微生物(特別是寄生蟲、細(xì)菌或病毒起源的)的多肽形成的融合蛋白。
另一方面，本發(fā)明涉及編碼上述蛋白或多肽的核酸序列。優(yōu)選的核酸序列包含編碼具SEQ ID NO2序列的LmPDI的序列或該序列的片段，所述片段具有30或更多個核苷酸，優(yōu)選具有100個以上核苷酸，并且其編碼的多肽含有至少一個LmPDI特征性表位。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明核酸序列的核酸載體。例如，可以是質(zhì)粒，粘粒，噬菌體或病毒。優(yōu)選本發(fā)明的載體能夠在宿主細(xì)胞中表達本發(fā)明的蛋白或多肽。本發(fā)明的載體尤其能夠在細(xì)菌或真核細(xì)胞中表達LmPDI。
本發(fā)明還涉及含有上述載體的培養(yǎng)細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是細(xì)菌，酵母，昆蟲細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞或任何其它類型細(xì)胞。該細(xì)胞可用于表達并可能地生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白或多肽，或者用于生產(chǎn)其后能夠在其它的培養(yǎng)細(xì)胞類型中或體內(nèi)表達本發(fā)明蛋白或多肽的載體。純粹為非限制性地舉例說明該細(xì)胞，可以例舉CHO、VERO、BHK21細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞作為能夠在本發(fā)明中體外使用的細(xì)胞類型。同樣地，BCG和鼠傷寒沙門氏菌可以作為體內(nèi)使用的細(xì)胞例子。最后，重要的是注意為疫苗接種目的向個體施用編碼上述多肽或蛋白的病毒載體，例如痘苗病毒或DNA也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的一種特定細(xì)胞為細(xì)菌菌株LmPDI-XL1，于2001年1月31日保藏在國立微生物保藏中心[CNCM]，保藏號為I-2621。該菌株來自XL1-blue MRF′細(xì)菌菌株，基因型為Δ(mrcA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1lac[F’proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)]，被質(zhì)粒pBK-CMV-LmPDI轉(zhuǎn)化。該質(zhì)粒相應(yīng)于Stratagene(La Jolla，CA)出售的質(zhì)粒pBK-CMV，在其EcoRI和XhoI限制性位點之間加入了來自LmPDI的cDNA。
本發(fā)明還涉及能夠在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO2的核酸序列特異性雜交的核酸探針，該探針使得可以測定生物樣品中是否存在編碼LmPDI的毒性基因。
本文中，我們將“嚴(yán)格雜交條件”定義為這樣的條件在大約65℃，在例如6X SSC，0.5％SDS，5X Denhanrdt’s溶液以及100μg/ml變性的非特異性DNA的溶液中或者任何具有同等離子強度的溶液中雜交，并且在65℃，在例如具有至多0.2X SSC和0.1％SDS的溶液或者任何具有同等離子強度的溶液中進行洗滌步驟之后，兩個DNA分子能夠特異性雜交的條件。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)待雜交序列的長度，其GC核苷酸含量以及任何其它參數(shù)，依照如Sambrook等，2001(Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdEdition，Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)描述的方案，改變這個條件的嚴(yán)格性。
在上述定義以及在本文中，術(shù)語“特異性”應(yīng)該以其在實驗室中通常所用的最廣泛含義進行理解。這樣，如果在復(fù)雜混合物中，分子A對于分子B的親合性顯著地高于分子A對混合物中其它分子的親合性，以致通過分子A可以將分子B檢測出來，那么分子A即特異性地識別分子B。
本文所用的嚴(yán)格條件是這樣的條件，在此條件下能夠在從LmPDIcDNA合成的放射性標(biāo)記探針存在下，檢測出源自不同利什曼原蟲物種的各種PDI，而不能檢測出源自宿主或其它微生物的PDI。
例如，能夠在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO2序列特異性雜交的本發(fā)明探針可以是這樣的當(dāng)使用所述標(biāo)記探針對來自感染了表達LmPDI的碩大利什曼原蟲株的細(xì)胞的DNA樣品進行Southern印跡時，印跡上會具有至少一條明顯不同的條帶，其密度高于其它條帶(非特異性的)，而在同樣條件下，對來自未感染碩大利什曼原蟲的細(xì)胞的DNA樣品進行Southern印跡時，不會出現(xiàn)這樣的條帶。
另一方面，本發(fā)明涉及核苷酸引物，其允許從利什曼原蟲感染細(xì)胞中特異性地擴增SEQ ID NO1的至少部分序列，這樣就使得可以檢測生物樣品中是否存在編碼LmPDI的毒性基因。如果以未感染利什曼原蟲的對照細(xì)胞進行擴增反應(yīng)沒有導(dǎo)致任何序列被明顯擴增，而以含有SEQ ID NO1核苷酸序列的樣品進行同樣的反應(yīng)卻導(dǎo)致所述序列的至少一個片段被擴增，那么該擴增就稱為“特異性的”。
如果有必要，上述的探針和引物可以被標(biāo)記和/或置于診斷試劑盒內(nèi)，而這也是本發(fā)明的一個部分。如果能夠在利什曼原蟲感染過程中確定LmPDI基因的存在以及可能地該基因的表達水平，例如確定使用LmPDI抑制劑進行的治療的寄生蟲性和/或機會致病性負(fù)載(parastic and/or opportunistic charge)，可能是有利的。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供能夠特異性識別LmPDI的純化抗體。可以是單克隆或多克隆的人抗體，人源化抗體或動物抗體。所述抗體可以使用實驗部分所述的方法，在LmPDI親和性柱上進行純化。所述特異性的LmPDI抗體可以有很多應(yīng)用。
可用其檢測生物樣品中LmPDI的存在，例如以診斷利什曼病和/或確定使用LmPDI抑制劑治療利什曼病的可能性。
這樣，本發(fā)明還涉及體外診斷引發(fā)利什曼病的寄生蟲感染的方法。該方法可使用本發(fā)明的多肽或蛋白，或抗該蛋白的抗體進行，或者使用上述的探針進行。
本發(fā)明的一個特定診斷方法包括以下步驟·將至少一個本發(fā)明的抗體與來自對象的生物樣品在能夠使所述抗體和生物樣品中所含抗原性蛋白形成免疫復(fù)合物的條件下相接觸，其中所述對象局部感染了引發(fā)利什曼病的寄生蟲；·檢測所述復(fù)合物。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法檢測復(fù)合物(酶促反應(yīng)，熒光轉(zhuǎn)移等)。
本發(fā)明的抗體可以以與上述探針或引物相同的方法被包含在診斷試劑盒中。
用于執(zhí)行上述方法的診斷試劑盒也是本發(fā)明的一部分。
以例舉的方式，所述試劑盒可以包含·至少一個本發(fā)明的抗體；·適于使被分析樣品中所含抗原性蛋白與所述抗體形成免疫復(fù)合物的介質(zhì)；·使得能夠檢測到如此形成的復(fù)合物的試劑；·如果適當(dāng)?shù)脑挘瑢φ諛悠贰?br> 或者，本發(fā)明的抗體可以構(gòu)成藥物的組成部分，所述藥物旨在用于預(yù)防，減輕或治療特定利什曼病。
本發(fā)明另一方面涉及含有本發(fā)明上述蛋白和/或重組多肽和/或核酸序列和/或載體和/或細(xì)胞的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物能夠體外刺激單核的細(xì)胞的增殖，所述單核的細(xì)胞來自與利什曼原蟲寄生蟲接觸過的個體。優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物能夠體外刺激來自與碩大利什曼原蟲接觸過的個體的單核的細(xì)胞增殖。
在本發(fā)明免疫原性組合物的一個優(yōu)選實施方案中，所述組合物具有藥物學(xué)上可接受的用于人或動物宿主給藥的制劑。
本發(fā)明人已證明，LmPDI能夠在體外誘導(dǎo)來自與碩大利什曼原蟲接觸過的個體的單核的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，并且這些細(xì)胞因子的表達譜與在Th1型免疫反應(yīng)中所觀察到的一致(實施例3)。如上所述的免疫原性組合物，由于當(dāng)其被施用給人或動物宿主時能夠誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，因此構(gòu)成了本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明上述蛋白和/或重組多肽和/或核酸序列和/或載體和/或細(xì)胞的疫苗組合物，所述疫苗組合物旨在保護人類或動物宿主免于利什曼病。優(yōu)選地，將本發(fā)明的疫苗組合物以藥學(xué)上可接受用于人或動物宿主給藥的方式配制。
所述疫苗組合物可以是液體形式，皮下或肌肉內(nèi)注射到患者體內(nèi)，或者可以是口服疫苗的形式，香膏劑形式，或者與本發(fā)明核苷酸序列結(jié)合的顆粒形式，例如將DNA吸附到顆粒表面。后一種形式使得疫苗可以使用基因槍來施用。應(yīng)當(dāng)注意本文所述的疫苗組合物劑型僅僅為說明性地例舉，而非限制其范圍。
本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗組合物還可以含有一個或多個與利什曼原蟲異源的抗原，和/或一個或多個編碼所述抗原的核酸序列。因此本發(fā)明的組合物可以引發(fā)針對幾種不同病原體的免疫反應(yīng)，如果適當(dāng)?shù)脑?，還可制成多元疫苗(polyvaccine)。
接種方法以及活性劑的劑量必須與所用疫苗的類型以及待施用的哺乳動物相適應(yīng)。
抗利什曼原蟲的疫苗接種方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，其包括給人類或動物宿主施用含有本發(fā)明上述蛋白和/或重組多肽和/或核酸序列和/或載體和/或細(xì)胞的組合物。
確定利什曼原蟲毒性中LmPDI所起的作用還使得能夠啟動新的策略來鑒定活性分子，所述分子可用于抑制此寄生蟲的生長。已經(jīng)顯示能夠抑制PDI的分子——例如桿菌肽或氯汞基苯磺酸(pCMBS)——可以抑制利什曼原蟲在液體培養(yǎng)基中的生長(實施例4)。因此，本發(fā)明還涉及可以抑制碩大利什曼原蟲生長的分子的篩選方法，包括評價所述分子對LmPDI活性的抑制能力的步驟。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶通常具有多種活性，特別是氧化還原、異構(gòu)酶以及陪伴分子活性。本發(fā)明的篩選方法可以涉及對LmPDI任何功能的抑制。
在本發(fā)明的一個特定篩選方法中，對分子抑制LmPDI活性的能力的評價步驟是在用于使變性的RNaseA(scrambled RNase A)再活化的試驗中進行的，包括下述步驟·在允許變性RNase A再活化的條件下，在LmPDI存在下，孵育此變性RNase A；·加入受試分子，在與允許變性RNase A被LmPDI再活化的條件相同的條件下，孵育此RNase A；·將存在受試分子和不存在受試分子時所獲得的結(jié)果相比較，當(dāng)存在受試分子時RNase A再活化的差錯說明所述分子具有LmPDI抑制活性。
在本發(fā)明的篩選方法中可以使用任何其它的PDI活性試驗，特別是按照Lyles和Gilbert(1991)所描述的原始方案改進的試驗。
本發(fā)明的篩選方法還可以包括用于抑制碩大利什曼原蟲在液體培養(yǎng)基中生長的試驗，以及如果合適的話，用于抑制碩大利什曼原蟲在利什曼病實驗鼠模型中生長的試驗。這種方法的實例在實驗部分實施例5中描述。
按如上定義的方法所篩選出來的活性分子具有抑制或調(diào)節(jié)碩大利什曼原蟲生長的特點。
實施例4所示的用桿菌肽獲得的結(jié)果表明PDI抑制劑能夠抑制利什曼原蟲的生長。因此，一種或多種蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)抑制劑在制備預(yù)防、減輕或治療利什曼原蟲感染的藥物組合物中的應(yīng)用也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明可以使用的具有抗PDI活性的化合物有例如抗PDI或抗LmPDI抗體，桿菌肽，桿菌肽鋅，5，5′-聯(lián)硫基雙(2-硝基苯甲酸)(5，5′-dithiobis(2-nitrobenzoic)acid，DTNB)，對氯汞基苯磺酸(pCMBS)或tocinoic acid。
根據(jù)上述應(yīng)用制備的組合物優(yōu)選局部地，口服地或通過腸胃外途徑施用給人或動物宿主。
本發(fā)明的一個特定方面涉及桿菌肽或桿菌肽鋅作為引發(fā)利什曼病的寄生蟲的生長抑制劑、或作為抗利什曼原蟲感染的活性劑的應(yīng)用。
很顯然，用于治療利什曼原蟲感染的、含有一種或多種蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)抑制劑的藥物組合物是本發(fā)明的一部分。這樣的組合物可特別地含有桿菌肽或桿菌肽鋅。該組合物可制備成局部施用的制劑，例如霜狀，軟膏劑，香膏劑或噴霧劑，該例舉為非限制性的。本發(fā)明人已證明，將這樣的組合物以香膏劑對BALB/c小鼠的寄生蟲感染部位局部給藥后，能夠緩解疾病的發(fā)展(實施例9和圖14)。
本發(fā)明還涉及治療利什曼原蟲感染的藥物組合物，其含有至少一種針對LmPDI的特異性抗體和/或任何能夠抑制PDI活性的分子。這樣的組合物優(yōu)選適于局部，口服或腸道外方式給藥。
治療利什曼病的方法也落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，所述方法包括對人或動物患病個體施用PDI或LmPDI抑制劑，不論該抑制劑是抗體或任何其它類型的分子。
下文的實施例及附圖描述了本發(fā)明所進行的生物學(xué)實驗，其目的為提供所需的實驗支持，而不是限制本發(fā)明的范圍。這些實施例和附圖還以非限制性的方式說明了本發(fā)明的實施方案以及重要性的某些方面。


圖1顯示對兩個毒性最強的分離株(94和67，V)和兩個毒性最弱的分離株(32和07，v)內(nèi)碩大利什曼原蟲基因表達的差異顯示(DD)分析。
圖1A顯示放射自顯影后測序凝膠的一部分，顯示使用隨機十聚體引物以及寡聚dT引物PCR擴增的產(chǎn)物。差異表達的CDNA由箭頭標(biāo)出。p14 cDNA由星號標(biāo)出。
圖1B顯示Northern印跡分析DD技術(shù)所鑒定出的基因在毒性最強的分離株(94和67，V)和毒性最弱的分離株(32和07，v)內(nèi)的表達。從處于穩(wěn)定生長期的不同分離株前鞭毛體提取得到的mRNA與放射性標(biāo)記的探針p14進行了雜交。放射自顯影后，印跡先去雜交(de-hybridized)再與碩大利什曼原蟲α-微管蛋白(α-tub)基因的特異性探針重雜交。
圖2顯示LmPDI cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO1)及推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。以小寫字母表示的核苷酸代表非翻譯域。18nt的前導(dǎo)序列(SL)以下劃線標(biāo)出，而用于多腺苷酸化信號的潛在序列以方框標(biāo)出。肽信號的潛在序列以黑體標(biāo)出。LmPDI潛在的活性位點以雙下劃線標(biāo)出，而使其停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能序列則以虛線標(biāo)出。
圖3顯示布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)(T.brucei，GenBank登錄號P12865)，Hypocrea jecorina(H.Jecorina，074568)，Caemorhabditis elegans(C.elegans，017908)，Chlamydomonasreinhardtii(C.reinhard，048949)，黃果蠅(Drosophila melanogaster)(D.melano，P54399)，Cryptosporidium parvum(C.parvum，Q27553)和人類(H.sapiens，P072237)的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶與LmPDI氨基酸序列進行的比對(alignment)。黑色方框內(nèi)的字母表示相同的氨基酸，灰色方框表示類似氨基酸。導(dǎo)入了“空位(gap)”來獲得比對序列之間的最大相似性，并以短劃線標(biāo)出。
使用兩套軟件程序進行序列比對·CLUSTAL W版本1.8；Thompson，JD，Higgins，DG和Gibson，TJ；·BOXSHADE版本3.21；Hoffman，K和Baron，M。
圖4顯示對重組LmPDI在再活化變性RNase(scrambled RNase)中所起作用的分析結(jié)果。25℃下，在含有4.5mM(cCMP)，1mM谷胱甘肽GSH，0.2mM谷胱甘肽二硫化物(GSSH)，2mM EDTA和100mMTris-HCL，pH8的緩沖液中，在牛血清白蛋白(BSA)(1.4μM)的存在下，或在牛蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶蛋白(1.4μM)的存在下，或在重組LmPDI(1.4μM)的存在下，孵育變性的RNase A(8μm)30分鐘，其中牛血清白蛋白作為陰性對照，而牛蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶作為陽性對照。在30分鐘內(nèi)，每5分鐘測定296nm下的RNase A活性，以此確定RNase A的再活化(Lyles和Gilbert，1991)。
圖5A顯示對碩大利什曼原蟲基因中LmPDI基因拷貝數(shù)目的Southern印跡分析結(jié)果。將8μg分離自碩大利什曼原蟲94的基因組DNA用下述限制性酶消化AvaI，EcoRV，HindIII，PstI，EcoRI，XhoI，NcoI，SacI，SphI。標(biāo)有星號的酶在LmPDI cDNA上可酶切一次。
圖5B顯示對不同利什曼原蟲物種中的LmPDI基因的Southern印跡分析結(jié)果。將8μg分離自碩大利什曼原蟲(94)，嗜皮性嬰兒利什曼原蟲(L.infantum MC)，嗜內(nèi)臟性嬰兒利什曼原蟲(L.infantumVisc)；杜氏利什曼原蟲的基因組DNA用PstI酶切。在這些試驗中基因組DNA與代表LmPDI整個cDNA序列的探針雜交。
圖6顯示用不同抗LmPDI抗體制品對碩大利什曼原蟲中天然LmPDI進行的免疫檢測。將20μg前鞭毛體GLC 94的總蛋白在Laemmli緩沖液(第1道)中或在0.5m DTT存在下(第2道)以及在0.05μg產(chǎn)生自大腸桿菌并已純化的LmPDI(rLmPDI)存在下(第3道)進行電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，并使用抗-LmPDI免疫血清(第1道)或親合柱純化的抗-LmPDI抗體(第2、3道)進行顯示。
圖7顯示兩種毒性最強(94，67，V)和兩種毒性最弱分離株(32，7，v)前鞭毛體中LmPDI表達的Western印跡分析結(jié)果。將20μg來自不同分離株的穩(wěn)定生長期總前鞭毛體蛋白進行電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，在抗-LmPDI多克隆抗體的存在下孵育該膜。箭頭(>)指示由抗LmPDI的免疫血清所識別的3種蛋白。
圖8顯示與LmPDI(5μg/ml)孵育后，來自在突尼斯人獸互傳性皮膚利什曼病區(qū)域生活的個體的單個核細(xì)胞的增殖情況。收集淋巴單核細(xì)胞，用RPMI-PS/Glu培養(yǎng)基連續(xù)進行3次離心(30ml一次，然后10ml兩次)以洗滌，之后計數(shù)并在存在或不存在5μg/ml LmPDI的條件下以106細(xì)胞/ml的濃度孵育。培養(yǎng)5天后，加入氚標(biāo)記的胸苷，評估對淋巴細(xì)胞的刺激作用。結(jié)果以CPM表示。
圖9顯示使用桿菌肽在液體培養(yǎng)基中進行的寄生蟲(L.major)生長抑制試驗的結(jié)果。其是針對在0，1mM，1.5mM或2mM桿菌肽存在下碩大利什曼原蟲前鞭毛體繪制的96小時生長曲線。
圖10顯示桿菌肽(BAC)，桿菌肽鋅(BACZn)，對氯汞基苯甲酸(pCMBA)以及tocinoic acid(TOC)對重組LmPDI體外活性的影響。使用不同濃度的抑制劑(0-2mM)跟蹤PDI抑制劑對LmPDI體外再活化變性RNase A的能力的影響。使用無抑制劑時的LmPDI作為陽性對照(T)。
圖11顯示桿菌肽(BAC)(圖11A)，桿菌肽鋅(BACZn)(圖11B)，5，5′-聯(lián)硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNMB)(圖11C)以及對氯汞基苯甲酸(pCMBA)(圖11D)對利什曼原蟲在液體培養(yǎng)基中的體外生長的影響。使用不同濃度的抑制劑(0-5mM)跟蹤PDI抑制劑對寄生蟲的體外增殖的影響。使用未經(jīng)抑制劑處理的寄生蟲作為這些實驗的對照(T)。
圖12顯示桿菌肽和桿菌肽鋅對于rLmPDI活性的抑制作用。體外測定桿菌肽(BAC)和桿菌肽鋅(BACZn)對于rLmPDI活性的作用。利用不同的BAC和BACZn抑制劑濃度(0-2mM)進行試驗，以此分析其對rLmPDI體外再活化變性RNase A的能力的影響。未經(jīng)抑制劑處理的rLmPDI活性作為陽性對照。
圖13顯示桿菌肽鋅對GCL94前鞭毛體增殖的抑制作用。體外測定桿菌肽鋅(BACZn)對于GCL94前鞭毛體增殖的作用。使用不同抑制劑濃度進行試驗，以此分析其對寄生蟲體外擴增能力的影響。在不含抑制劑的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的寄生蟲作為對照(C)。
圖14顯示桿菌肽鋅對敏感BALB/c小鼠體內(nèi)疾病發(fā)展的影響，所述小鼠已被GCL94分離株前鞭毛體所感染。用106個GCL94分離株前鞭毛體感染敏感BALB/c小鼠的爪墊，并使用桿菌肽處理或不處理。該處理在感染后9周停止(箭頭表示處理終止)。每條曲線顯示單個小鼠在大小上的變化。
實施例下述實施例所顯示的實驗結(jié)果是使用以下材料及方法獲得的寄生蟲和培養(yǎng)條件研究中所用的碩大利什曼原蟲(L major)分離株來自人ZCL病變傷口，該傷口是在實施例1所述研究中獲得的。26℃下，使用NNN培養(yǎng)基(以瓊脂糖和兔血為基礎(chǔ)制備的固體培養(yǎng)基)培養(yǎng)寄生蟲，逐步轉(zhuǎn)移到含有2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和10％滅活胎牛血清的RPMI(SIGMA，St Louis，MO)(完全培養(yǎng)基)上。將對數(shù)生長期的前鞭毛體在恒定體積的完全培養(yǎng)基中調(diào)整到106寄生蟲/ml濃度，26℃孵育。4-6天后達到穩(wěn)定生長期，寄生蟲密度為3×107-8×107個寄生蟲。使用這些穩(wěn)定生長期的前鞭毛體進行RNA和蛋白的提取。
RNA提取及差異顯示使用″TRIZOL″試劑(Gibco-BRL)提取總RNA。根據(jù)制造商說明書，使用″poly A+RNA分離試劑盒″(Amersham-Pharmacia)，通過寡聚dT/纖維素柱子純化poly A+RNA。在含有1μM寡聚(dT)11MN引物(其中M＝A或C或G，N＝A或C或G或T(Genset))，1X第一鏈緩沖液(Gibco-BRL)，5μM dNTP(Amersham-Pharmacia)，10URNAsin(Promega)以及200U逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco-BRL)的20μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用200ng mRNA。
37℃孵育1小時后，95℃孵育5分鐘以終止反應(yīng)。使用12個寡聚dT和10個隨機十聚體的組合，通過PCR擴增cDNA。PCR反應(yīng)溶液體積為20μl，含有2μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，0.2μM 5′引物，1μM 3′引物，2μM dNTP，10μCi[α35S]ATP，1X Taq DNA多聚酶反應(yīng)緩沖液和1UTaq聚合酶(Amersham-Pharmacia)。該反應(yīng)物在Perkin-Elmer 9600熱循環(huán)儀上孵育40個循環(huán)94℃ 30秒，40℃ 60秒以及72℃ 30秒，再72℃ 6分鐘一個循環(huán)。用6％丙烯酰胺測序凝膠分析PCR產(chǎn)物。在Whatmann 3MM濾紙上真空干燥該凝膠，并放射自顯影。從凝膠中切下差異表達的cDNA，洗脫，并在同樣的寡聚核苷酸存在下在上述條件下再次PCR擴增。使用平末端PCR克隆試劑盒(AmershamPharmacia)，根據(jù)廠商說明書，將擴增產(chǎn)物克隆到pMOSblue載體中。使用Sequencing Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer)測定克隆片段的序列，并使用ABI 377自動測序儀進行分析。
Nothern印跡分析將200ng從處于穩(wěn)定生長期的4株碩大利什曼原蟲分離株前鞭毛體所提取的mRNA變性，在1.2％瓊脂糖/2.2M甲醛凝膠上進行分離，毛細(xì)管轉(zhuǎn)移到″Hybond N+″(Amersham-Pharmacia)膜上。然后80℃加熱2小時固定該核酸。使用Megaprime DNA標(biāo)記體系試劑盒(Amersham-Pharmacia)，用[α32P]dCTP標(biāo)記差異表達的cDNA片段和α-微管蛋白。65℃下，在1X Denhardt’s/6X SSC/0.1％SDS/0.1mg·ml-1鮭魚精子溶液中，進行雜交過夜。65℃下，用含有0.1XSSC/0.1％SDS的溶液清洗該膜，并放射自顯影。
構(gòu)建cDNA文庫以及對LmPDI cDNA的表征根據(jù)廠商說明書(Stratagene)，在ZAPII載體中，利用5μg來自毒性最強株(GCL94)前鞭毛體的mRNA構(gòu)建cDNA文庫。使用Megaprime DNA標(biāo)記體系試劑盒(Amersham-Pharmacia)，用[α32P]dCTP標(biāo)記p14探針，用該探針篩選6×106噬斑(lysis plaques)。回收目的噬斑，并再次篩選，以此從污染克隆中分離出陽性克隆。然后對陽性克隆測序。
Southern印跡分析用圖5所示的限制性酶消化10μg提取自毒性最強株GLC94前鞭毛體的基因組DNA，并在0.6％的瓊脂糖凝膠上分析，然后轉(zhuǎn)移到Hybond N+(Amersham-Pharmacia)膜上。在[α32P]dCTP放射性標(biāo)記的、且與LmPDI的整個cDNA克隆相對應(yīng)的探針存在下，孵育該膜。然后用含有0.1X SSC/0.1％SDS的溶液清洗該膜，并放射自顯影。
重組蛋白LmPDI在大腸桿菌BL21細(xì)菌內(nèi)的表達及純化將去除了信號肽編碼序列、相應(yīng)于LmPDI cDNA開放閱讀框的序列(1371bp)克隆到細(xì)菌表達載體pET-22b(Novagen)中。在LB培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒(pET-22b-LmPDI)的大腸桿菌BL21細(xì)菌，再用1mM異丙基-1-硫代-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)處理4小時誘導(dǎo)重組蛋白的合成。在鎳(Ni2+)柱上(Amersham-Pharmacia)通過親合層析純化重組蛋白LmPDI-(His)6(SEQ ID NO4)。通過SDS-PAGE證實制得的蛋白的純度。
制備抗LmPDI多克隆抗體以及免疫印跡分析天然蛋白的表達通過肌內(nèi)注射500μg純化重組蛋白LmPDI在弗式不完全佐劑(IFA，Sigma)中的乳化液(v/v)以免疫兔子。再給兔子另外注射兩次500μg重組蛋白。第一次是在最初注射后15天進行的肌內(nèi)注射，而第二次是在30天后進行的皮內(nèi)注射。最后一次注射后，采取兔血10天，收集血清保存在-80℃。100℃下，將來自前鞭毛體的蛋白裂解物在Laemmli 1X緩沖液中變性10分鐘，加載在12％的SDS丙烯酰胺凝膠上，并電轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上(Millipore)。室溫下將該膜孵育在飽和PBS/0.1％Tween20/3％脫脂奶溶液中1小時，然后在4℃，用含有1/1000稀釋的抗LmPDI抗體的相同溶液孵育過夜。在PBS/0.1％Tween20中清洗3次后，室溫下，在偶聯(lián)了過氧化物酶的兔抗-IgG二抗(Amersham-Pharmacia，稀釋到1/1000)存在下孵育該膜1小時，之后在PBS/0.1％Tween20中清洗3次。使用″ECL系統(tǒng)″試劑盒(Amersham-Pharmacia)，根據(jù)廠商說明書，通過檢測過氧化物酶的活性來測定蛋白抗體復(fù)合物。
制備變性的RNase A將20mg純化的核糖核酸酶(RNase A)于室溫下置于pH8.6且含有0.15M DTT，6M胍-HCl以及0.1M Tris-HCl的緩沖液中18小時，使其變性，再通過0.01M HCl平衡的Sephadex G-25柱進行純化。在275nm下，使用9200M-1cm-1的消光系數(shù)測定變性RNase A(scrambledRNase A)級分的濃度。-80℃下將此級分保存兩周。
重組LmPDI蛋白對RNase A的再活化作用25℃下，在含有4.5mM cCMP，1mM谷胱甘肽GSH，0.2mM谷胱甘肽二硫化物GSSH，2mM EDTA和100mM Tris-HCl，pH8的緩沖液中，在牛血清白蛋白(BSA)(1.4μM)的存在下，或在牛蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶蛋白(1.4μM)的存在下，或在重組LmPDI(1.4μM)的存在下，孵育變性的RNase A(8μm)30分鐘，其中牛血清白蛋白作為陰性對照，而牛蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶蛋白作為陽性對照。如文獻(Lyles and Gilbert，1991)所述，每5分鐘測定296nm下的RNase A活性，以此確定RNase A的再活化。
實施例1篩選具有不同毒性水平的碩大利什曼原蟲分離株本研究所用的碩大利什曼原蟲分離株來自人ZCL病變傷口，該傷口獲自1994-1995年在突尼斯南部El Guettar進行的前瞻性研究期間(Louzir Melby et al，1998)。根據(jù)其在敏感型BALB/c小鼠感染試驗中的致病力，從19個分離株中進行挑選來自不同分離株的2×106無鞭毛體被注射到BALB/c小鼠后爪墊中，并在9周內(nèi)每周觀察傷口的進展。感染后5周，測定由寄生蟲抗原體外激活的淋巴結(jié)(lymphaticganglia)單個核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4和IFN-γ量。
這些試驗首先顯示了不同碩大利什曼原蟲分離株所誘導(dǎo)的疾病的進展有巨大差異，其次說明了使用單個分離株能夠產(chǎn)生重現(xiàn)性結(jié)果。
感染后5周，毒性最強的株體外誘導(dǎo)產(chǎn)生了最大量的IL-4和最低水平的IFN-γ。
在BALB/c敏感型小鼠的感染實驗?zāi)Ｐ椭?，用碩大利什曼原蟲感染的臨床表現(xiàn)根據(jù)分離株的不同而有所變化，而用其中單個的分離株感染則可以得到重現(xiàn)性結(jié)果，根據(jù)這些觀察結(jié)果，本發(fā)明人建立了這樣的假說當(dāng)比較毒性最強和最弱的分離株時，與毒性相關(guān)的那些基因可能會被差異表達。已經(jīng)由其它作者描述過的與寄生蟲的毒性相關(guān)的一組基因，包括LPG1，LPG2，KMP-11，Cpc，Cpb，Hsp100，Gene B和gp63，其表達情況已通過逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)和定量基因擴增技術(shù)進行了初步分析。在對BALB/c小鼠表現(xiàn)出不同致病力的碩大利什曼原蟲分離株之間，該分析并沒有顯示出任何差異(Kebaier，Louzir et al，2001)。
兩株誘導(dǎo)重度損傷且快速發(fā)展的分離株MHOM/TN/94/GLC94和MHOM/TN/94/GLC67(分別為GLC94和GLC67)代表毒性最強的分離株，而兩株誘導(dǎo)輕度試驗癥狀的分離株MHOM/TN/94/GLC07和MHOM/TN/94/GLC32(分別為GLC07和GLC32)代表毒性較弱的分離株，它們被選擇出來，以繼續(xù)研究在不同株內(nèi)具有潛在不同表達水平的毒性基因。
實施例2差異顯示技術(shù)鑒定碩大利什曼原蟲的新蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶LmPDI，其參與天然寄生蟲毒性1-鑒定那些在碩大利什曼原蟲強毒性分離株和弱毒性分離株內(nèi)差異表達的基因首先，從兩株強毒性分離株(GLC94和GLC67)和兩株弱毒性分離株(GLC32和GLC07)的前鞭毛體純化mRNA，然后使用Oligo(dT)11MN引物，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中M＝A或C或G，N＝A或C或G或T。該差異顯示試驗過程中所用的引物為使用與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所用相同的Oligo-dT引物以及10個隨機引物，按科學(xué)文獻(Liang和Pardee，1992；Liang，Bauer et al 1995；Heard，Lewis et al，1996)所述的，進行PCR擴增反應(yīng)。
總體而言，產(chǎn)生并分析了60種引物組合。使用不同引物組合所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠進行分析，結(jié)果顯示來自碩大利什曼原蟲不同分離株(強毒性和弱毒性)的基因約95％表達相同mRNA并且表達水平相同。僅25個信使RNA在強毒性和弱毒性分離株之間似乎差異表達(圖1A)。先從丙烯酰胺凝膠中分離出差異表達的cDNA，然后使用與第一次PCR所用相同的引物組合再次擴增，最后克隆到pMOS載體中。對不同克隆測序后鑒定了其中一些。
使用差異表達的14個片段作為探針，通過Northern印跡分析碩大利什曼原蟲不同分離株的mRNA，結(jié)果顯示在14個分離株中，有3個克隆在強毒性和弱毒性分離株之間表現(xiàn)出差異表達。其中一個克隆p14已經(jīng)用Northern印跡進行鑒定。相應(yīng)于克隆p14的探針與約2.2kb大小的轉(zhuǎn)錄物特異性地雜交，與兩個弱毒性分離株相比，該轉(zhuǎn)錄物在兩個強毒性分離株內(nèi)優(yōu)勢表達(圖1B)。這證實了由差異顯示技術(shù)獲得的結(jié)果?？寺14全長被測序，該克隆為339bp。該片段核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫(GenBank和EMBL)內(nèi)的各序列之間比較后，未發(fā)現(xiàn)顯著同源的序列。這可能是由于p14克隆對應(yīng)著信使RNA的非翻譯3′末端區(qū)域所致。
2-克隆并分析p14全長cDNA序列為分離得到相應(yīng)于p14克隆的全長cDNA序列，使用339bp片段來篩選GLC94分離株前鞭毛體的cDNA文庫。從被分析的6×105重組克隆中分離得到2個陽性克隆。圖2顯示最長克隆的核苷酸序列，其為2094bp(SEQ ID NO1)。該克隆具有編碼477個氨基酸(aa)多肽的開放閱讀框，所述多肽的理論分子量為52.4kDa，等電點為5.22。該蛋白的N末端相應(yīng)于向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運送所需的潛在信號肽，20aa長度。非翻譯的5′區(qū)域含有一個利什曼原蟲特有的剪切前導(dǎo)序列，而非翻譯的3′區(qū)域含有多聚A尾巴，其前邊即為潛在的聚腺苷酸化位點(圖2)。
該分離克隆的多肽序列與幾種物種的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族蛋白(PDI和Erp)具有27-36％的同一性(圖3)。另外，該蛋白在47-52和381-386位殘基處含有兩個與PDI、Erp和硫氧還蛋白家族蛋白的潛在活性位點(Cys-Gly-His-Cys，或CGHC)相同的區(qū)域。C末端區(qū)域在474-477位殘基處顯示出潛在的KDEL(EEDL)型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號，這說明，如同PDI和Erp一樣，該蛋白可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。這樣，P14就是一種來自碩大利什曼原蟲蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族的蛋白。其被命名為LmPDI(圖2和3)。
為確定LmPDI是否具有大多數(shù)已描述的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶顯示出的氧化還原酶巰基-二硫化物活性(oxido-reductase thiodisulfideactivity)，我們研究了重組蛋白LmPDI使變性RNase A復(fù)性的能力。在大腸桿菌中合成重組LmPDI，然后純化，并用于再活化RNase A的體外試驗。獲得的結(jié)果顯示LmPDI能夠恢復(fù)RNase A活性，其再活化作用的方式類似于牛PDI的，試驗使用牛PDI作為對照(圖4)。
為鑒定編碼LmPDI的基因的拷貝數(shù)目，本發(fā)明人使用32P標(biāo)記的LmPDI cDNA片段作為探針，進行了Southern印跡類型的雜交。所獲的結(jié)果基本上顯示出單一的帶，除了在LmPDI cDNA內(nèi)部帶有切割位點的那些酶(圖5A)。因此，編碼LmPDI的基因很可能在碩大利什曼原蟲基因組內(nèi)以單拷貝存在。另外，在受試的各種利什曼原蟲物種(嗜皮性嬰兒利什曼原蟲(L.infantum MC)，嗜內(nèi)臟性(viscerotropic)嬰兒利什曼原蟲(L.infantum Visc)和杜氏利什曼原蟲)中，LmPDI基因似乎是保守的(圖5B)。
3-LmPDI表達的免疫印跡分析為表征天然蛋白的表達，用大腸桿菌內(nèi)合成再通過親合層析純化的重組LmPDI蛋白免疫兔子。通過免疫印跡，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，所獲的抗LmPDI多克隆抗體極有效地識別GLC94穩(wěn)定生長期前鞭毛體裂解物中預(yù)期大小(55kDa)的蛋白(圖6)。另外，還檢測到另兩種蛋白。第一種蛋白分子量為105kDa，相應(yīng)于LmPDI的約2倍，第二種蛋白的分子量為35kDa。為證實105kDa蛋白是否對應(yīng)于LmPDI二聚體，在高濃度DTT(0.5mM)存在下，分析變性的GLC94前鞭毛體裂解物。該條件下，抗LmPDI抗體未能檢測到105kDa蛋白。這些結(jié)果說明LmPDI被組裝成寡聚物。35kDa蛋白似乎是污染物。事實上，親合柱(Sepharose 4B-LmPDI)上純化的抗LmPDI抗體不再識別35kDa蛋白(圖6)。
為了比較毒性最強和毒性最弱的分離株內(nèi)LmPDI的表達水平，提取穩(wěn)定生長期的前鞭毛體蛋白并定量。在12％聚丙烯酰胺-SDS凝膠上分析5μg蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。使用抗LmPDI抗體進行的Western印跡顯示LmPDI(55kDa)及其二聚體(105kDa)在毒性最強的分離株內(nèi)表達更強烈(圖7)。相反，35kDa的污染蛋白在各個受試株內(nèi)以同等方式表達。這些結(jié)果說明LmPDI的表達水平和被研究分離株的致病力之間存在相關(guān)性。
實施例3LmPDI誘導(dǎo)有活動性損傷或ZCL前驅(qū)癥狀的個體的單核細(xì)胞體外增殖由于碩大利什曼原蟲LmPDI在寄生蟲感染階段會高度表達，因此可以作為細(xì)胞免疫反應(yīng)的靶標(biāo)。為證實該假說是否中肯，通過獲自有活動性損傷或ZCL前驅(qū)癥狀的個體的單核細(xì)胞的增殖試驗來評價LmPDI誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。
該研究通過37名E1 Guettar(突尼斯南部)居民進行，針對這些個體獲得了相對于寄生蟲全部抗原的細(xì)胞增殖試驗(SLA，一種能夠顯示與寄生蟲事前有接觸的試驗)結(jié)果。按下述將這些個體分組1組8名SLA試驗陰性的個體；2組29名SLA試驗陽性的個體。
通過Ficoll/Hypaque梯度離心(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，從外周血中分離出含有淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的單核的細(xì)胞。
結(jié)果(圖8)顯示對于免疫的個體有顯著增殖。
將單核的細(xì)胞與同濃度的LmPDI孵育48小時，誘導(dǎo)PBMC培養(yǎng)物上清液內(nèi)的細(xì)胞因子(IFN-β，IL-4)，使用人抗IL-4和抗IFN-β單克隆抗體(Pharmingen，San Diego，CA)進行ELISA檢測以評價這些細(xì)胞因子。
結(jié)果來自個體的小樣品。它們清楚地顯示在LmPDI刺激過的細(xì)胞上清液中，不存在IL-4而存在顯著量的IFN-β。
該結(jié)果顯示基本上是Th1型反應(yīng)，說明LmPDI能夠作為抗利什曼病的疫苗備選物質(zhì)。
實施例4PDI抑制劑的存在可以抑制液體培養(yǎng)基中碩大利什曼原蟲的生長桿菌肽是一種已知的PDI抑制劑。使用桿菌肽進行的試驗表明終濃度為2mM的桿菌肽完全抑制了碩大利什曼原蟲在液體培養(yǎng)基內(nèi)的生長(圖9)。
這些試驗在下述試驗條件下進行a)制備變性的RNase A將20mg純化的核糖核酸酶(RNase A)于室溫下置于pH8.6的含有0.15M DTT，6M胍-HCl以及0.1M Tris-HCl的緩沖液中18小時，使其還原變性，再通過0.01M HCl平衡的Sephadex G-25柱進行純化。在275nm下，使用9200M-1cm-1的消光系數(shù)測定變性RNase A級分的濃度。-80℃下將這些級分保存兩周。
b)重組LmPDI蛋白對RNase A的再活化作用25℃下，在含有4.5mM cCMP，1mM谷胱甘肽GSH，0.2mM谷胱甘肽二硫化物GSSH，2mM EDTA和100mM Tris-HCl，pH8的緩沖液中，在牛血清白蛋白(BSA)(1.4μM)的存在下，或在牛蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(1.4μM)的存在下，或在重組LmPDI(1.4μM)的存在下，孵育變性的RNase A(8μM) 30分鐘，其中牛血清白蛋白作為陰性對照，而牛蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶作為陽性對照。如文獻(Lylesand Gilbert，1991)所述，每5分鐘測定296nm下的RNase A活性30分鐘，以此確定RNase A的再活化。
c)體外測試不同PDI抑制劑對于重組LmPDI的巰基-二硫化物氧化還原酶活性的抑制作用對重組LmPDI進行的巰基-二硫化物氧化還原酶活性(thio-disulfide oxido-reductase activity)抑制試驗的試驗條件與“重組LmPDI蛋白對RNase A的再活化作用”段所述的條件完全一致，除了反應(yīng)在0.01mM，0.1mM，0.5mM，和2mM下述PDI抑制劑存在下進行·桿菌肽·桿菌肽鋅·對氯汞基苯甲酸(pCMBA)·tocinoic acidd)抑制寄生蟲(碩大利什曼原蟲)在液體培養(yǎng)基中生長為測定桿菌肽(BAC)，桿菌肽鋅(BACZn)，對氯汞基苯甲酸(pCMBA)，5，5′-聯(lián)硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)對利什曼原蟲在液體培養(yǎng)基內(nèi)的體外生長的影響，上述抑制劑以不同的濃度，即0mM，0.05mM，0.1mM，0.2mM，0.5mM，1mM，1.5mM，2mM，2.5mM，和5mM，加入到含有5％胎牛血清和2×106/ml指數(shù)生長期寄生蟲的RPMI中。26℃孵育該寄生蟲，并在96小時內(nèi)，每24小時進行計數(shù)。在Mallassez單元(cell)上計數(shù)寄生蟲。
實施例5就其抑制碩大利什曼原蟲生長的能力評價LmPDI抑制分子對于LmPDI在利什曼原蟲毒性中所起作用的評價可以開發(fā)出新的策略來鑒定在利什曼病治療過程中有效的分子。桿菌肽之外的已知具有抗PDI活性的分子可能能夠抑制該寄生蟲的生長。在此提出了一種評價分子抗利什曼原蟲的潛在有效性的方案實例。
可分三個步驟評價已知分子的抗PDI活性或那些將要被新鑒定的分子。第一個步驟中，體外測試該分子對大腸桿菌中合成的重組LmPDI蛋白的作用。然后進行抑制寄生蟲在液體培養(yǎng)基內(nèi)的生長的試驗，最后利用利什曼原蟲的試驗鼠模型試驗這些分子。
1-評價對重組LmPDI的抑制作用分析LmPDI的PDI活性的技術(shù)在實施例2和上面的材料和方法部分已詳細(xì)描述。可使用同樣的技術(shù)，通過向反應(yīng)液中加入不同濃度的潛在抑制劑來評價某個已知或待鑒定的PDI抑制劑的能力(使用LmPDI分子模型)。將結(jié)果表示為相對于僅僅緩沖液的抑制作用百分比。只保留那些具有明顯的且劑量依賴性的LmPDI抑制活性的分子。
為了確定文獻中所述的各種PDI抑制劑是否能夠抑制LmPDI的巰基-二硫化物氧化還原酶活性，以不同的濃度體外試驗這些抑制劑阻斷LmPDI的該酶活性的能力，所述LmPDI由大腸桿菌合成并已被純化。抑制劑為·桿菌肽·桿菌肽鋅·對氯汞基苯甲酸(pCMBA)·tocinoic acid結(jié)果如圖10所示，該結(jié)果表明0.01mM pCMBA和2mM桿菌肽或桿菌肽鋅的存在就會完全抑制LmPDI的活性。與此相反，在所采用的濃度下(該濃度能夠完全抑制人類PDI的活性)，tocinoic acid似乎對于LmPDI的活性并沒有太大作用。
2-抑制寄生蟲(碩大利什曼原蟲)在液體培養(yǎng)基內(nèi)生長。將試驗分子溶解在溶劑中，溶劑的適合性取決于其物理化學(xué)性質(zhì)(在水溶液或有機溶劑中的溶解度)。所有試驗中使用單獨溶劑作為對照。例如，試驗可以利用碩大利什曼原蟲GLC94分離株進行。培養(yǎng)基的組分已在上面給出(實施例2及材料和方法)。26℃孵育培養(yǎng)物，并定期重新接種以使寄生蟲維持在穩(wěn)定生長期。在某些試驗中使用了無鞭毛體樣階段的寄生蟲。這種情況下，離心穩(wěn)定生長期的寄生蟲(前鞭毛體)，將培養(yǎng)基替換為pH5.0且補充了胎牛血清(FCS)的Schneider Drosophila培養(yǎng)基。然后在35℃，5％CO2下孵育培養(yǎng)物。
碩大利什曼原蟲前鞭毛體生長的抑制試驗是采用指數(shù)生長期的寄生蟲進行的，將其初始濃度調(diào)整為106寄生蟲/ml完全培養(yǎng)基，在存在或不存在各種濃度受試分子的條件下，在96孔培養(yǎng)板上以100μl/孔的量孵育。26℃，5％CO2下孵育寄生蟲，并在96小時內(nèi)每24小時計數(shù)。在Mallassez單元上進行寄生蟲計數(shù)?；蛘呤褂醚?xì)胞計數(shù)器。所有的測定均一式三份。以抑制濃度來確定分子的抑制能力，所述濃度為與對照相比能夠?qū)⒓?xì)胞分裂降低50％的濃度(IC50)。
使用Almar Blue作為生存/生長指示劑，通過熒光測定試驗評價無鞭毛體生存力的降低。
為測定在(1-)段中所述的PDI抑制劑對寄生蟲體外生長的抑制能力，對其進行試驗。向含有2×106指數(shù)生長期的寄生蟲/ml的RPMI中加入不同量的抑制劑。26℃下孵育寄生蟲，并在96小時內(nèi)每24小時計數(shù)。在Mallassez單元上進行寄生蟲計數(shù)。所獲結(jié)果如圖11所示，該結(jié)果顯示濃度分別為5mM，2mM和0.5mM的桿菌肽、桿菌肽鋅和PCMBA完全抑制了利什曼原蟲的生長。與此相反，在所采用的濃度下(該濃度能夠完全抑制人類PDI的活性)，5，5′-聯(lián)硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)似乎對于利什曼原蟲的生長并沒有太大作用。
3-測定預(yù)先選擇的抑制劑在碩大利什曼原蟲感染敏感型BALB/c小鼠試驗?zāi)Ｐ椭械男Я?。該體內(nèi)試驗取決于受試分子的毒性和理化特性?？梢杂?06穩(wěn)定生長期的碩大利什曼原蟲前鞭毛體感染BALB/c小鼠，并注射(50μl體積)到右后爪墊內(nèi)。使用游標(biāo)卡尺每周測量傷口的直徑。
總的說來，根據(jù)情況，可以使用三種治療方案·對于易擴散且低毒或無毒的疏水分子，可使用不同的方案，以不同的濃度，腹膜內(nèi)注射該產(chǎn)品。注射的頻率視該分子的生物利用率和半衰期而定。所有試驗中，該方案均在注射后9周末尾結(jié)束。
·對于水溶性的且相對具有毒性的分子，可在傷口內(nèi)部通過至少4次對硬化區(qū)的注射(通?？蓪⒒钚詣┝砍?0)來完成注射。
·對于脂溶性分子，對試驗傷口每周施用香膏劑進行測試。
總之，不論受試產(chǎn)品的注射方式如何，可以進行兩種類型的方案·注射寄生蟲后隨即開始的方案；·注射寄生蟲后4-5周才開始的方案，在該起始時間點上，損傷已經(jīng)建立。
所有試驗中，在方案結(jié)束后，處死小鼠并在注射位點以及引流損傷的結(jié)中估計寄生蟲負(fù)荷。
實施例6利什曼原蟲體外感染鼠巨噬細(xì)胞從雌性BALB/c小鼠股骨或脛骨內(nèi)抽出骨髓并從中分離鼠骨髓巨噬細(xì)胞(MBMM)。在多孔板上以1.5×103細(xì)胞/孔的量在500μl完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)MBMM。為刺激MBMM的生長和成熟，向培養(yǎng)基內(nèi)補充20％的L-929成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，其作為巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)的來源。37℃，5％CO2下培養(yǎng)6天后，去除培養(yǎng)基，清洗MBMM，加入含有10％胎牛血清但不含L-929成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基的新鮮RPMI。通過差速離心法，從未潰爛的損傷中純化出傷口內(nèi)的無鞭毛體，并使用錐蟲藍(lán)病毒染色計數(shù)。使用這些寄生蟲，以4個寄生蟲/巨噬細(xì)胞的終比例感染MBMM。加入寄生蟲后2小時，用PBS洗滌巨噬細(xì)胞5次，以去除未被吞噬的無鞭毛體。然后在37℃，95％空氣和5％CO2下孵育該培養(yǎng)物。在不同的時間點進行試驗30min，及2，24和72小時。在各個時間點，用PBS洗滌各孔，去除覆蓋物，室溫下用乙醇固定被感染的巨噬細(xì)胞1小時。然后清洗該板之后用Giemsa染色以追蹤感染。
在每孔中央計數(shù)被感染的巨噬細(xì)胞，在孔中央細(xì)胞分散良好，可以容易地計數(shù)寄生蟲。在板的這種水平，寄生蟲/巨噬細(xì)胞的比例可以高于4。
實施例7通過蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶抑制劑抑制重組LmPDI的酶活性已有文獻描述了幾種蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)抑制劑(Ryseret al，1994，Orlandi 1997，Mou et al，1998)。其中，桿菌肽和桿菌肽鋅是由枯草桿菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenformis)產(chǎn)生的多肽抗生素復(fù)合物。桿菌肽A是商業(yè)桿菌肽的主要化合物，其為至少9種桿菌肽的混合物。該抗生素能夠抑制許多革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，還能夠抑制許多蛋白酶的活性，所述蛋白酶如PDI，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，木瓜蛋白酶以及神經(jīng)肽酶。這些蛋白酶的大多數(shù)都在其活性位點具有半胱氨酸殘基。
第一步，本發(fā)明人檢驗這些抑制劑的作用以驗證它們體外改變重組LmPDI(rLmPDI)酶活性的可能能力。
使用上述變性RNase技術(shù)(Lyles和Gilbert，1991)來說明LmPDI的活性。將20mg RNase A(Amersham-Pharmacia)于室溫下置于pH8.6的含有0.15M二硫蘇糖醇，6M胍HCl以及0.1M Tris-HCl的緩沖液中18小時，使其變性。再通過0.01M HCl平衡的Sephadex G-25柱進行純化，并在275nm下用分光光度法定量。
在基于谷胱甘肽的還原緩沖液中，PDI可以催化變性RNase復(fù)性(Gilbert，1998)。以2′-3′-環(huán)胞苷單磷酸(cCMP)為底物，分光光度法測定RNase活性的恢復(fù)。將8μM變性RNase，單獨或在1.4μM牛血清白蛋白(BSA)或1.4μM rLmPDI的存在下，與含有4.5mM cCMP，1mM還原型谷胱甘肽(GSH)，200μM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，2mM EDTA和100mM Tris-HCl，pH8的緩沖液混合。室溫下反應(yīng)30分鐘。通過在反應(yīng)的半小時內(nèi)每5分鐘測定一次296nm下的吸光度來記錄由RNase復(fù)性導(dǎo)致的cCMP水解。
在不同濃度桿菌肽(BAC 0.01mM-2mM)和桿菌肽鋅(BACZn，0.01mM-2mM)的存在下，測定重組LmPDI(rLmPDI)的活性。結(jié)果如圖12所示。
這些結(jié)果顯示，桿菌肽和桿菌肽鋅具有類似的效果。在這兩種產(chǎn)品存在下，0.1mM時觀察到了50％抑制，在0.5mM下為70％，2mM下為100％。抑制rLmPDI的這些濃度與文獻中描述的作為其它物種PDI的抑制劑時的濃度相當(dāng)。
實施例8在桿菌肽鋅存在下碩大利什曼原蟲前鞭毛體的體外生長動力學(xué)本發(fā)明人隨后測試了桿菌肽鋅對碩大利什曼原蟲前鞭毛體的體外生長動力學(xué)的影響。該研究中僅試驗了桿菌肽鋅，首先是由于它對rLmPDI酶活性的抑制譜與桿菌肽的相同，其次是由于桿菌肽與桿菌肽鋅相比更加穩(wěn)定且毒性更低。
為此，在凝結(jié)的兔血清為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)GLC94分離株前鞭毛體2天。然后將寄生蟲(2×106寄生蟲/ml)轉(zhuǎn)移到含有濃度為1，1.5，2.5mM的桿菌肽鋅BACZn的完全培養(yǎng)基中。將在不含有抑制劑的完全培養(yǎng)基中生長的前鞭毛體作為對照。通過在48，72和96小時計數(shù)寄生蟲來進行監(jiān)測。結(jié)果如圖13所示。
這些結(jié)果說明，當(dāng)桿菌肽鋅濃度為1.5mM時，寄生蟲的生長被部分抑制，而當(dāng)濃度為2mM和5mM時則被完全抑制，而濃度在1mM時不起作用。因此，非常重要的是注意到，該分子能夠阻斷培養(yǎng)的碩大利什曼原蟲寄生蟲的增殖。
實施例9桿菌肽鋅存在下對BALB/c小鼠中碩大利什曼原蟲前鞭毛體生長的抑制作用桿菌肽鋅已經(jīng)成為一種治療手段，桿菌肽鋅的可獲得性允許測試其對BALB/c小鼠的碩大利什曼原蟲感染進展的影響。用GLC94分離株處于穩(wěn)定生長期的前鞭毛體(106前鞭毛體爪)感染小鼠后爪爪墊，并用基于5mM或25mM BACZn(制備在凡士林中)的香膏處理。注射寄生蟲后48小時開始施用藥膏，每天一次，一周5天。以同樣的方式感染小鼠并用凡士林處理作為對照。每周測量傷口的大小。結(jié)果如圖14所示。
盡管是初步研究，但這些結(jié)果仍顯示當(dāng)以香膏劑形式在注射部位局部使用桿菌肽鋅時，其能夠緩解BALB/c小鼠的疾病進程。應(yīng)該強調(diào)在處理組小鼠中，用5mM桿菌肽處理的3只小鼠中，有2只出現(xiàn)損傷減輕，而用25mM桿菌肽處理的4只小鼠中，有2只出現(xiàn)損傷減輕。由于BALB/c小鼠不能完全滅除寄生蟲，預(yù)期在終止治療后會出現(xiàn)臨床疾病復(fù)發(fā)，即使是用于人類的治療方法(銻酸葡胺和paramomycin)對于BALB/c小鼠中誘導(dǎo)的疾病也幾乎無效，在BALB/c小鼠中從未觀察到寄生蟲的完全消失。
因此，我們認(rèn)為LmPDI可以作為抵抗利什曼原蟲的化學(xué)療法的潛在靶標(biāo)，而且桿菌肽似乎對碩大利什曼原蟲具有潛在效力。
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序列表<110>INSTITUT PASTEURINSTITUT PASTEUR DE TUNIS<120>與利什曼原蟲屬寄生蟲毒性相關(guān)的基因<130>B4866A-AD/VMA<140>
<141>
<150>FR 0107985<151>2001-06-18<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2094<212>DNA<213>碩大利什曼原蟲<220>
<221>CDS<222>(241)..(1674)<223>LmPDI編碼序列(orf)<400>1ggcaccagcg gcaccagagt ttctgtactt tattgtcttt ctctattcta cccacacttg 60cctctctgcg ctctctgtgc ctgtgcgggc gcgcaacgtg cctttctctc cgtattgccc 120agctgtgagc tgctgcctac tggcaacgtg tacgccattc ccgtttcttg attctggtgc 180agtgctcagc tctaccctat ttgtattgat accgttttcc ttttcgtttt gcaaagaaaa 240atg cag cgc tca ttc ctt gtt ttt gtt ctg tgc gcc ctt ctc ttc tgc 288Met Gln Arg Ser Phe Leu Val Phe Val Leu Cys Ala Leu Leu Phe Cys1 5 10 15gtc gcg tcc gca gag gtg cag gtg gcc act aag gac aac ttt gac aag 336Val Ala Ser Ala Glu Val Gln Val Ala Thr Lys Asp Asn Phe Asp Lys20 25 30gtc gta atc ggg gat ctc acg ttg gtc aag ttt tat gct ccg tgg tgc 384Val Val Ile Gly Asp Leu Thr Leu Val Lys Phe Tyr Ala Pro Trp Cys35 40 45ggc cac tgc aag aca ctc gcc ccg gag ttt gta aag gcc gct gac atg 432Gly His Cys Lys Thr Leu Ala Pro Glu Phe Val Lys Ala Ala Asp Met50 55 60ctg gcc ggc atc gcg acc ctt gca gag gtc gat tgc acc aaa gaa gag 480Leu Ala Gly Ile Ala Thr Leu Ala Glu Val Asp Cys Thr Lys Glu Glu65 70 75 80
agc ctt gct gag aag tac gaa atc aag ggg ttc ccc acg ctg tac atc 528Ser Leu Ala Glu Lys Tyr Glu Ile Lys Gly Phe Pro Thr Leu Tyr Ile85 90 95ttc cgt aac ggt gag aaa gtg aag atc tac gat ggt ccc cgc act gcc 576Phe Arg Asn Gly Glu Lys Val Lys Ile Tyr Asp Gly Pro Arg Thr Ala100 105 110gcc ggc arc gcg tcg tac atg aag gcg cat gtc ggt cca tcg atg aag 624Ala Gly Ile Ala Ser Tyr Met Lys Ala His Val Gly Pro Ser Met Lys115 120 125gcc atc tca acg gct gaa gag ctg gag gag ctc aag aag gag act ttc 672Ala Ile Ser Thr Ala Glu Glu Leu Glu Glu Leu Lys Lys Glu Thr Phe130 135 140ccg gtg tgc gtg gtg aag aca gcg agc acc gac tcg gag atg gcg tcg 720Pro Val Cys Val Val Lys Thr Ala Ser Thr Asp Ser Glu Met Ala Ser145 150 155 160atg ata acc aag gtg gcg gac tct ctc cgc tcg cag atg aac ttt gtg 768Met Ile Thr Lys Val Ala Asp Ser Leu Arg Ser Gln Met Asn Phe Val165 170175ctc gtg acg gat gcg gcc atc tct ccg aat gat gcc atg gag tcg gtt 816Leu Val Thr Asp Ala Ala Ile Ser Pro Asn Asp Ala Met Glu Ser Val180 185 190acg gtg tat cgc aag aat gcg gag cgc gag gcg tac acc ggc gct aca 864Thr Val Tyr Arg Lys Asn Ala Glu Arg Glu Ala Tyr Thr Gly Ala Thr195 200 205cca atg acg gca gag tcg gtg aag agc ttt ctc acg agt gct gtg ttg 912Pro Met Thr Ala Glu Ser Val Lys Ser Phe Leu Thr Ser Ala Val Leu210 215 220gac tac ttt ggc gag ctc ggc cag gag agc ttt cag aag tac atg gaa 960Asp Tyr Phe Gly Glu Leu Gly Gln Glu Ser Phe Gln Lys Tyr Met Glu225 230 235 240gcg aac aag gat aaa cct ctt ggg tgg gtg ttc atc gac aag aac acg 1008Ala Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Trp Val Phe Ile Asp Lys Asn Thr245 250 255gat tct gcg ttg aag ggg tca ctt gtg gcg gtg gcg gag aag tac cgc 1056Asp Ser Ala Leu Lys Gly Ser Leu Val Ala Val Ala Glu Lys Tyr Arg260 265 270tcg cag gtg ttg cta acc tac att gac ggc gat cag tac cgc ccc gtc 1104Ser Gln Val Leu Leu Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Gln Tyr Arg Pro Val275 280 285tcg cgc cag ctg ggc att cot gag gat gcg aag ttc ccg gcg ttt gtg 1152Ser Arg Gln Leu Gly Ile Pro Glu Asp Ala Lys Phe Pro Ala Phe Val290 295 300gtc gat ttc gag cgc cgc cat cac gtg atg ggg acg gac acc cca gtc 1200Val Asp Phe Glu Arg Arg His His Val Met Gly Thr Asp Thr Pro Val305 310 315 320
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<400>2Met Gln Arg Ser Phe Leu Val Phe Val Leu Cys Ala Leu Leu Phe Cys1 5 10 15Val Ala Ser Ala Glu Val Gln Val Ala Thr Lys Asp Asn Phe Asp Lys20 25 30Val Val Ile Gly Asp Leu Thr Leu Val Lys Phe Tyr Ala Pro Trp Cys35 40 45Gly His Cys Lys Thr Leu Ala Pro Glu Phe Val Lys Ala Ala Asp Met50 55 60Leu Ala Gly Ile Ala Thr Leu Ala Glu Val Asp Cys Thr Lys Glu Glu65 70 75 80Ser Leu Ala Glu Lys Tyr Glu Ile Lys Gly Phe Pro Thr Leu Tyr Ile85 90 95Phe Arg Asn Gly Glu Lys Val Lys Ile Tyr Asp Gly Pro Arg Thr Ala100 105 110Ala Gly Ile Ala Ser Tyr Met Lys Ala His Val Gly Pro Ser Met Lys115 120 125Ala Ile Ser Thr Ala Glu Glu Leu Glu Glu Leu Lys Lys Glu Thr Phe130 135 140Pro Val Cys Val Val Lys Thr Ala Ser Thr Asp Ser Glu Met Ala Ser145 150 155 160Met Ile Thr Lys Val Ala Asp Ser Leu Arg Ser Gln Met Asn Phe Val165 170 175Leu Val Thr Asp Ala Ala Ile Ser Pro Asn Asp Ala Met Glu Ser Val180 185 190Thr Val Tyr Arg Lys Asn Ala Glu Arg Glu Ala Tyr Thr Gly Ala Thr195 200 205Pro Met Thr Ala Glu Ser Val Lys Ser Phe Leu Thr Ser Ala Val Leu210 215 220Asp Tyr Phe Gly Glu Leu Gly Gln Glu Ser Phe Gln Lys Tyr Met Glu225 230 235 240Ala Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Trp Val Phe Ile Asp Lys Asn Thr245 250 255Asp Ser Ala Leu Lys Gly Ser Leu Val Ala Val Ala Glu Lys Tyr Arg260 265 270Ser Gln Val Leu Leu Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Gln Tyr Arg Pro Val275 280 285Ser Arg Gln Leu Gly Ile Pro Glu Asp Ala Lys Phe Pro Ala Phe Val290 295 300
Val Asp Phe Glu Arg Arg His His Val Met Gly Thr Asp Thr Pro Val305 310 315 320Thr Ser Glu Ser Val Ala Ala Phe Val Glu Lys Tyr Val Lys Gly Glu325 330 335Thr Lys Gln Thr Val Met Ser Asp Ala Ile Pro Ala Lys Glu Thr Val340 345 350Asn Gly Leu Thr Thr Val Val Gly Gln Thr Phe Ala Lys Tyr Thr Asp355 360 365Gly Thr Gln Asn Val Met Leu Leu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His370 375 380Cys Lys Lys Leu His Pro Val Tyr Asp Lys Val Ala Lys Ser Phe Glu385 390 395 400Ser Glu Asn Val Ile Ile Ala Lys Met Asp Ala Thr Thr Asn Asp Phe405 410 415Asp Arg Glu Lys Phe Glu Val Ser Gly Phe Pro Thr Ile Tyr Phe Ile420 425 430Pro Ala Gly Lys Pro Pro Ile Val Tyr Glu Gly Gly Arg Thr Ala Asp435 440 445Glu Ile Gln Val Phe Val Lys Ser His Leu Thr Ala Ser Ala Ala Pro450 455 460Ser Gly Gly Pro Ser Gly Asn Ser Glu Glu Glu Asp Leu465 470 475<210>3<211>467<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明重組蛋白<400>3Met Ala Glu Val Gln Val Ala Thr Lys Asp Asn Phe Asp Lys Val Val1 5 10 15Ile Gly Asp Leu Thr Leu Val Lys Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His20 25 30Cys Lys Thr Leu Ala Pro Glu Phe Val Lys Ala Ala Asp Met Leu Ala35 40 45Gly Ile Ala Thr Leu Ala Glu Val Asp Cys Thr Lys Glu Glu Ser Leu50 55 60Ala Glu Lys Tyr Glu Ile Lys Gly Phe Pro Thr Leu Tyr Ile Phe Arg65 70 75 80
Asn Gly Glu Lys Val Lys Ile Tyr Asp Gly Pro Arg Thr Ala Ala Gly85 90 95Ile Ala Ser Tyr Met Lys Ala His Val Gly Pro Ser Met Lys Ala Ile100 105 110Ser Thr Ala Glu Glu Leu Glu Glu Leu Lys Lys Glu Thr Phe Pro Val115 120 125Cys Val Val Lys Thr Ala Ser Thr Asp Ser Glu Met Ala Ser Met Ile130 135 140Thr Lys Val Ala Asp Ser Leu Arg Ser Gln Met Asn Phe Val Leu Val145 150 155 160Thr Asp Ala Ala Ile Ser Pro Asn Asp Ala Met Glu Ser Val Thr Val165 170 175Tyr Arg Lys Asn Ala Glu Arg Glu Ala Tyr Thr Gly Ala Thr Pro Met180 185 190Thr Ala Glu Ser Val Lys Ser Phe Leu Thr Ser Ala Val Leu Asp Tyr195 200 205Phe Gly Glu Leu Gly Gln Glu Ser Phe Gln Lys Tyr Met Glu Ala Asn210 215 220Lys Asp Lys Pro Leu Gly Trp Val Phe Ile Asp Lys Asn Thr Asp Ser225 230 235 240Ala Leu Lys Gly Ser Leu Val Ala Val Ala Glu Lys Tyr Arg Ser Gln245 250 255Val Leu Leu Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Gln Tyr Arg Pro Val Ser Arg260 265 270Gln Leu Gly Ile Pro Glu Asp Ala Lys Phe Pro Ala Phe Val Val Asp275 280 285Phe Glu Arg Arg His His Val Met Gly Thr Asp Thr Pro Val Thr Ser290 295 300Glu Ser Val Ala Ala Phe Val Glu Lys Tyr Val Lys Gly Glu Thr Lys305 310 315 320Gln Thr Val Met Ser Asp Ala Ile Pro Ala Lys Glu Thr Val Asn Gly325 330 335Leu Thr Thr Val Val Gly Gln Thr Phe Ala Lys Tyr Thr Asp Gly Thr340 345 350Gln Asn Val Met Leu Leu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys355 360 365Lys Leu His Pro Val Tyr Asp Lys Val Ala Lys Ser Phe Glu Ser Glu370 375 380Asn Val Ile Ile Ala Lys Met Asp Ala Thr Thr Asn Asp Phe Asp Arg385 390 395 400
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<210>5<211>502<212>PRT<213>H.jecorina<400>5Met Gln Gln Lys Arg Leu Thr Ala Ala Leu Val Ala Ala Leu Ala Ala1 5 10 15Val Val Ser Ala Glu Ser Asp Val Lys Ser Leu Thr Lys Asp Thr Phe20 25 30Asn Asp Phe Ile Asn Ser Asn Asp Leu Val Leu Ala Glu Ser Phe Ala35 40 45Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Glu Glu Ala50 55 60Ala Thr Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ile Lys Leu Ala Lys Val Asp Cys65 70 75 80Val Glu Glu Ala Asp Leu Cys Lys Glu His Gly Val Glu Gly Tyr Pro85 90 95Thr Leu Lys Val Phe Arg Gly Leu Asp Lys Val Ala Pro Tyr Thr Gly100 105 110Pro Arg Lys Ala Asp Gly Ile Thr Ser Tyr Met Val Lys Gln Ser Leu115 120 125Pro Ala Val Ser Ala Leu Thr Lys Asp Thr Leu Glu Asp Phe Lys Thr130 135 140Ala Asp Lys Val Val Leu Val Ala Tyr Ile Ala Ala Asp Asp Lys Ala145 150 155 160Ser Asn Glu Thr Phe Thr Ala Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Thr Tyr165 170 175Leu Phe Gly Gly Val Asn Asp Ala Ala Val Ala Glu Ala Glu Gly Val180 185 190Lys Phe Pro Ser Ile Val Leu Tyr Lys Ser Phe Asp Glu Gly Lys Asn195 200 205Val Phe Ser Glu Lys Phe Asp Ala Glu Ala Ile Arg Asn Phe Ala Gln210 215 220Val Ala Ala Thr Pro Leu Val Gly Glu Val Gly Pro Glu Thr Tyr Ala225 230 235 240Gly Tyr Met Ser Ala Gly Ile Pro Leu Ala Tyr Ile Phe Ala Glu Thr245 250 255Ala Glu Glu Arg Glu Asn Leu Ala Lys Thr Leu Lys Pro Val Ala Glu260 265 270
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1.與利什曼原蟲(Leishmania)毒力相關(guān)的蛋白質(zhì)，其包含至少一個與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族(PDI)蛋白質(zhì)的潛在活性位點相同的位點(Cys-Gly-His-Cys)。
2.與利什曼原蟲毒力相關(guān)的利什曼原蟲蛋白質(zhì)，其包含至少一個與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族(PDI)蛋白質(zhì)的潛在活性位點相同的位點(Cys-Gly-His-Cys)。
3.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)，其特征在于它是碩大利什曼原蟲(Leishmania major)的LmPDI蛋白，具有SEQ ID NO2的序列，或者是與LmPDI具有至少40％同一性，優(yōu)選至少80％同一性的任何LmPDI功能性變體。
4.重組多肽，其含有至少一個權(quán)利要求1-3任一項所述蛋白的多于10個氨基酸的片段，當(dāng)對人或動物宿主施用該重組多肽時，所述重組多肽能夠引發(fā)針對LmPDI的表位的免疫反應(yīng)。
5.權(quán)利要求4的重組多肽，其特征在于，它是具有SEQ ID NO3序列的LmPDI-(His)6蛋白。
6.含有與另一多肽片段融合的權(quán)利要求4的重組多肽的融合蛋白，當(dāng)對人或動物宿主施用該融合蛋白時，所述融合蛋白能夠引發(fā)針對LmPDI的表位的免疫反應(yīng)。
7.編碼權(quán)利要求1-6任一項的蛋白質(zhì)或多肽的重組核酸序列。
8.權(quán)利要求7的核酸序列，其特征在于，其含有相應(yīng)于SEQ IDNO1第241-1674位核苷酸的編碼序列，或者所述序列的大小為100個或更多個核苷酸的片段。
9.核酸載體，其特征在于其含有權(quán)利要求7或8的核酸序列。
10.權(quán)利要求9的載體，其特征在于其為質(zhì)粒，粘粒，噬菌體或病毒。
11.含有權(quán)利要求9或10的載體的培養(yǎng)細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞，其特征在于其為細(xì)菌菌株LmPDI-XL1，于2001年1月31日保藏在國立微生物保藏中心[CNCM，the NationalCollection of Microorganism Cultures]，保藏號為I-2621。
13.在高嚴(yán)格條件下能夠與SEQ ID NO2核酸序列特異性雜交的核酸探針在確定生物樣品中編碼LmPDI的毒力基因存在與否中的應(yīng)用。
14.核苷酸引物，其特征在于其允許從利什曼原蟲感染細(xì)胞特異性地擴增SEQ ID NO1序列的至少部分序列，由此允許確定生物樣品中是否存在編碼LmPDI的毒力基因。
15.純化的抗體，其特異性地識別LmPDI。
16.免疫原性組合物，其含有權(quán)利要求1、2、3或6的蛋白質(zhì)和/或權(quán)利要求4或5的重組多肽，和/或權(quán)利要求7或8的核酸序列，和/或權(quán)利要求9或10的載體，和/或權(quán)利要求11的細(xì)胞，所述免疫原性組合物能夠在體外刺激單核的細(xì)胞的增殖，所述單核的細(xì)胞來源于與利什曼原蟲寄生蟲接觸過的個體。
17.權(quán)利要求16的免疫原性組合物，其能夠在體外刺激單核的細(xì)胞增殖，所述單核的細(xì)胞來源于與碩大利什曼原蟲接觸過的個體。
18.權(quán)利要求16或17的免疫原性組合物，其為對人類或動物宿主施用的藥學(xué)上可接受的制劑。
19.權(quán)利要求16至18的免疫原性組合物，當(dāng)施用給人類或動物宿主時，其能夠誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答。
20.免疫接種組合物，含有權(quán)利要求1，2，3或6的蛋白質(zhì)和/或權(quán)利要求4或5的重組多肽，和/或權(quán)利要求7或8的核酸序列，和/或權(quán)利要求9或10的載體，和/或權(quán)利要求11的細(xì)胞，所述免疫接種組合物旨在保護人類或動物宿主免患利什曼病。
21.權(quán)利要求20的免疫接種組合物，其為對人類或動物宿主施用的藥學(xué)上可接受的制劑。
22.權(quán)利要求16-21任一項的免疫原性和/或疫苗組合物，還含有利什曼原蟲的外源抗原和/或編碼利什曼原蟲外源抗原的核酸序列。
23.能夠抑制碩大利什曼原蟲生長的分子的篩選方法，包括評價所述分子抑制LmPDI活性的能力的步驟。
24.權(quán)利要求23的篩選方法，其中，評價所述分子抑制LmPDI活性的能力的步驟是在再活化變性RNase A的試驗中進行的，所述試驗包括以下步驟·在允許變性RNase A再活化的條件下，在LmPDI存在下，孵育變性的RNase A；·加入受試分子，在與允許變性RNase A被LmPDI再活化的條件相同的條件下，孵育變性的RNase A；·將存在受試分子和不存在受試分子時所獲得的結(jié)果相比較，當(dāng)存在受試分子時RNase A再活化的差錯說明所述分子具有抑制LmPDI的活性。
25.權(quán)利要求23或24的篩選方法，進一步包括抑制碩大利什曼原蟲在液體培養(yǎng)基中生長的試驗，如果合適的話，還包括抑制碩大利什曼原蟲在利什曼病試驗鼠模型中生長的試驗。
26.一種或多種蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)抑制劑在制備旨在用于預(yù)防、緩解或治療利什曼原蟲感染的藥物組合物中的應(yīng)用。
27.權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中PDI抑制劑為抗PDI或抗LmPDI的抗體，桿菌肽，桿菌肽鋅，5，5′-聯(lián)硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，對氯汞基苯磺酸(pCMBS)或tocinoic acid。
28.權(quán)利要求26或27的應(yīng)用，用于制備對人或動物宿主進行局部、口服或腸胃外給藥的組合物。
29.桿菌肽或桿菌肽鋅作為引起利什曼病的寄生蟲生長的抑制劑的應(yīng)用，或者作為抗利什曼病感染的活性劑的應(yīng)用。
30.用于治療利什曼病感染的藥物組合物，其含有權(quán)利要求15的抗體。
31.權(quán)利要求30的組合物，其適于局部、口服或腸胃外給藥。
32.用于治療利什曼原蟲感染的藥物組合物，其含有一種或多種蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)抑制劑。
33.權(quán)利要求32的藥物組合物，其含有桿菌肽或桿菌肽鋅。
34.一種體外診斷可引發(fā)利什曼病的寄生蟲感染的方法，其特征在于其包括·將至少一種權(quán)利要求15的抗體與患者的生物樣品在允許所述抗體和生物樣品中所含抗原性蛋白形成免疫復(fù)合物的條件下相接觸，其中所述患者部分地感染了引發(fā)利什曼病的寄生蟲；·檢測所述復(fù)合物。
35.用于實施權(quán)利要求34的方法的診斷試劑盒，其特征在于其含有·至少一種權(quán)利要求15的抗體；·適于形成與所述抗體的免疫復(fù)合物的介質(zhì)；·允許檢測所形成的任何復(fù)合物的試劑；·如果適當(dāng)?shù)脑?，對照樣品?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及抗利什曼病領(lǐng)域。本發(fā)明從野生型碩大利什曼原蟲分離株中分離出了被稱為LmPDI的蛋白編碼基因，該蛋白具有兩個與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)蛋白潛在活性位點序列(Cys－Gly－His－Cys)相同的區(qū)域。LmPDI蛋白主要在毒性最強的寄生蟲分離株內(nèi)表達。該蛋白可用于制備抗利什曼病藥物，可用于制備免疫原性組合物以及疫苗制劑，使人和動物宿主免受利什曼原蟲感染。
文檔編號C12N9/90GK1526017SQ02813849
公開日2004年9月1日 申請日期2002年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月18日
發(fā)明者Y·本阿喬爾, Y 本阿喬爾, M·喬尼克, 崢, H·羅茲爾, 榷, K·德拉吉 申請人:突尼斯巴斯德研究所, 巴斯德研究所