專利名稱：抗原呈遞細(xì)胞、其制備方法及其用于癌癥疫苗的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及在人或動物體的治療方法中使用的產(chǎn)品、物質(zhì)和組合物，更特別地涉及用于癌癥診斷、治療和預(yù)防的產(chǎn)品、物質(zhì)和組合物。本發(fā)明涉及癌癥疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
由不同組織型的轉(zhuǎn)化細(xì)胞組成型表達(dá)的幾種腫瘤相關(guān)抗原(TAA)最近得到了鑒定(Renkvist N.等.Cancer Immunol.Immunother.503-15，2001).
許多這些TAA能夠提供在特定HLA I型同種特異性(allospecificity)情況下由CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)所識別的多種優(yōu)勢免疫抗原肽(Renkvist N.等.Cancer Immunol.Immunother.503-15，2001)；而且經(jīng)選擇的TAA，例如MAGE(Jager E.等，J.Exp.Med.，187265-270，1998)，NY-ESO-1(Jager E.等，J.Exp.Med.，187265-270，1998)，SSX(Tureci O等，Cancer Res；56(20)4766-72 1996)，酪氨酸酶(Topalian S.L.等，J.Exp.Med.，1831965-1971，1996.)，Melan-A/MART-1(Zarour H.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97400-405，2000)同時包括在特定HLA II型同種特異性情況下由CD4+T淋巴細(xì)胞所識別的表位，因而能夠誘導(dǎo)定向于TAA的體液免疫應(yīng)答(Wang R.F.，Trends Immunol.，22269-276，2001)。
已鑒定出了可起著治療靶向物重要作用的不同類別的TAAi)在多種組織腫瘤中進(jìn)行表達(dá)而不在除睪丸和胎盤以外的正常組織中進(jìn)行表達(dá)的癌-睪丸抗原(CTA)，如MAGE，GAGE，SSX SART-1，BAGE，NY-ESO-1，XAGE-1，TRAG-3和SAGE，其中一些代表多個家族(Traversari C.，Minerva Biotech.，11243-253，1999)；ii)在正常和腫瘤性黑素細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的分化-特異性抗原，如酪氨酸酶，Melan-A/MART-1，gp100/Pme117，TRP-1/gp75，TRP-2(Traversari C.，Minerva Biotech.，11243-253，1999)；iii)在不同組織的惡性組織中進(jìn)行超表達(dá)但也在其良性對應(yīng)組織中存在的抗原，如PRAME(Ikeda H.等，Immunity，6199-208，1997)，HER-2/neu(Traversari C.，Minerva Biotech.，11243-253，1999)，CEA，MUC-1(Monges G.M.等，Am.J.Clin.Pathol.，112635-640，1999)，α-胎蛋白(Meng W.S.等，Mol.Immunol.，37943-950，2001)；iv)得自編碼遍在表達(dá)蛋白的基因的點(diǎn)突變的抗原，如MUM-1，β-連環(huán)蛋白，HLA-A2，CDK4和caspase 8(Traversari C.，MinervaBiotech.，11243-253，1999)；v)病毒抗原(Traversari C.，Minerva Biotech.，11243-253，1999)。
除了TAA以外，對有效免疫原性和被宿主的T淋巴細(xì)胞有效識別起關(guān)鍵作用的細(xì)胞元件包括HLA I型和HLA II型抗原以及共同刺激性/輔助性分子(例如，CD40，CD54，CD58，CD80，CD81)(Fleuren G.J.等，Immunol.Rev.，14591-122，1995)。
在已知類別的TAA中，由于CTA在正常組織中的表達(dá)有限并且其在活體特別是哺乳動物包括人中具有已知的體內(nèi)免疫原性，所以在對癌癥患者進(jìn)行的主動特異性免疫療法當(dāng)中CTA是特別合適的治療靶向物(Jager E.等，J.Exp.Med.，187265-270，1998；Rejnolds S.R.等，Int.J.Cancer，72972-976，1997)。然而，特定的CTA在不同患者的腫瘤性病損中的不均一表達(dá)限制了其對定向于CTA的治療性疫苗接種的生物合適性。事實(shí)上，不同癌癥患者的惡性損傷可經(jīng)常只能表達(dá)選擇性的CTA(Sahin U.等，Clin．Cancer Res.，63916-3922，2000)，另外，還報道了特定CTA在個別腫瘤性損傷中的下調(diào)性(Leth B.等，Melanoma Res.，7S83-S88，1997)和/或不均一(dos Santos N.R.等，Cancer Res.，601654-1662，2000)表達(dá)(Jungbluth A.A.等，Br.J.cancer，83493-497，2000)。這些可以在體內(nèi)分別或同時發(fā)生的事件還可使惡性細(xì)胞的免疫原性組成型低下，促使疾病進(jìn)展(Speiser D.E.等，J.Exp.Med.，186645-653，1997)，并且在針對特定CTA的免疫學(xué)治療過程中還可以引起腫瘤性細(xì)胞在體內(nèi)的免疫選擇，出現(xiàn)CTA-陰性克隆。因此，由于在腫瘤性損傷中靶CTA缺失或可能表達(dá)下調(diào)，所以將重點(diǎn)放在免疫靶向單一CTA的不同免疫原性表位的免疫療法不能施用于大量的癌癥患者；而且，在體內(nèi)免疫靶向單一CTA可能產(chǎn)生喪失CTA的腫瘤變異體，該變異體有效地逃避了治療-誘導(dǎo)的/擴(kuò)增的CTA-特異性免疫應(yīng)答。對靶向單一CTA的治療方法的其它限制來自于其在損傷內(nèi)部的不均一表達(dá)(Schultz-Thater E.等，Br.J.Cancer，83204-208，2000)，而且由特定HLA I型或HLA II型同種特異性對單一CTA的不同免疫原性表位的遞呈只能允許對具有某些限定的HLA表型的患者進(jìn)行治療。
為了部分消除這些限制，最近的治療方案采用單一或多種CTA的一種以上的免疫原性表位，或完整CTA蛋白作為疫苗接種劑(Conference on Cancer Vaccines，編者Ferrantini M.和Belardelli F.，羅馬-意大利，1999年11月15-16日；http//www.cancerresearch.org)。
因此，亟需一種能夠克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷的癌癥疫苗，尤其是能夠克服較差的免疫原性和體內(nèi)免疫選擇，從而能夠?qū)┌Y疫苗應(yīng)用于廣大的癌癥患者，而不限于特定的單一靶向的CTA或TAA，由此癌癥疫苗不會被“限制”到經(jīng)選擇的HLA I型和/或HLA II型抗原。
最近的體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明在目前已知的CTA基因中已研究的全部CTA基因與DNA降低甲基化試劑(hypomethylating agent)接觸后在不同組織的腫瘤性細(xì)胞中的表達(dá)被誘導(dǎo)或上調(diào)(dos Santos N.R.等，Cancer Res.，601654-1662，2000；Weber J.等，Cancer Res.，541766-1771，1994)。發(fā)現(xiàn)CTA誘導(dǎo)現(xiàn)象一直持續(xù)到在處理結(jié)束后的幾個星期仍然能夠檢測到。這些發(fā)現(xiàn)支持了CTA屬于受DNA甲基化綜合調(diào)節(jié)的一類TAA的觀點(diǎn)。而且，利用DNA降低甲基化試劑處理腫瘤性細(xì)胞能夠誘導(dǎo)對其表達(dá)HLA I型抗原和所研究的HLA I型同種特異性的同時并且持續(xù)的上調(diào)，而且還上調(diào)了共同刺激性/輔助性分子CD54和CD58的表達(dá)(Coral S.等，J.Immunother.，2216-24，1999)。
盡管CTA具有治療前景，但是CTA仍然表現(xiàn)出許多不足，諸如迄今為止研究的特定CTA在CTA-陽性和CTA-陰性惡性細(xì)胞共存的不同腫瘤性損傷中進(jìn)行不均一表達(dá)；迄今為止所鑒定的CTA中只有經(jīng)選擇的CTA可以在不受組織來源限制的不同腫瘤性病損上進(jìn)行表達(dá)；特定CTA在腫瘤性細(xì)胞上的表達(dá)閾值水平對其被CTA-特異性CTL識別是必需的以及針對特定CTA的疫苗需要合適的HLA I型表型，并且對于選擇性的CTA來說，還需要患者的HLA II型表型。
由于其獨(dú)特的生物學(xué)特性，經(jīng)選擇的CTA被用于不同的臨床試驗(yàn)，其目的是誘導(dǎo)或加強(qiáng)患不同組織惡性疾病的患者體內(nèi)的CTA-特異性免疫應(yīng)答。正如該領(lǐng)域的專家所知，不同的方案目前被用于在臨床上進(jìn)行治療性CTA的體內(nèi)施用或被用于在臨床前水平上創(chuàng)建更有效的疫苗接種工具(dos Santos N.R.等，Cancer Res.，601654-1662，2000；Weber J.等，Cancer Res.，541766-1771，1994)。值得注意的是，主要是由于多種技術(shù)和實(shí)踐條件的限制，只有有限數(shù)目的特定CTA的免疫原性表位或單一完整CTA蛋白目前在臨床被用于治療目的。以下列表包括目前已被采用的或迄今為止假設(shè)的將CTA施用于癌癥患者的主要策略；還應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是相同的方案被用來對患者施用屬于其它類型的目前已知的TAA的TAA，并且不同的佐劑和/或載體有時被用來加強(qiáng)治療劑的免疫原性。
·代表由CD8+T細(xì)胞識別的單一CTA或多種CTA的免疫原性表位的合成肽(Conference on Cancer Vaccines，由Ferrantini M.和Belardelli F.編著，羅馬-意大利，1999年11月15-16日；http//www.cancerresearch.org)。
·代表單一CTA或多種CTA的免疫原性表位的脂質(zhì)體包封的合成肽(Steller M.A.等，Clin.Cancer Res.，42103-2109，1998)。
·單一CTA的完整合成蛋白(Conference on Cancer Vaccines，由Ferrantini M.和Belardelli F.編著，羅馬-意大利，1999年11月15-16日；http//www.cancerresearch.org)。
·表達(dá)由CD8+T細(xì)胞識別的單一CTA或多種CTA的表位的重組病毒載體(Jenne L.等.，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
·裸露的DNA shooting(Park J.H.等人，Mol.Cells，9384-391，1999)·離體加載了代表由CD8+T細(xì)胞識別的單一CTA或多種CTA的表位的合成肽的自體PBMC/巨噬細(xì)胞(Conference on CancerVaccines，由Ferrantini M.和Belardelli F.編著，羅馬-意大利，1999年11月15-16日；http//www.cancerresearch.org)。
·離體加載了代表由CD8+T細(xì)胞識別的單一CTA或多種CTA的表位的合成肽或加載了單一CTA的完整合成蛋白或加載了完整腫瘤細(xì)胞制劑的自體樹突細(xì)胞(Conference on Cancer Vaccines，由Ferrantini M.和Belardelli F.編著，羅馬-意大利，1999年11月15-16日；http//www.cancerresearch.org；Jenne L.等，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
·離體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了DNA/RNA以表達(dá)全長CTA或與完整腫瘤細(xì)胞融合的自體樹突細(xì)胞(Jenne L.等，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
·離體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了DNA/RNA以表達(dá)全長CTA的自體T淋巴細(xì)胞。
針對被本發(fā)明當(dāng)作主要目的的自體癌癥疫苗，可以引用許多專利參考文獻(xiàn)。WO99/42128公開了用于測定實(shí)體瘤進(jìn)行HLA轉(zhuǎn)錄或表達(dá)情況的方法、用于選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒ê?或用于監(jiān)控腫瘤進(jìn)展的方法。該參考文獻(xiàn)的目的在于抑制某些同種型的HLA-G從而增強(qiáng)天然抗腫瘤的應(yīng)答反應(yīng)。所述方法包括從腫瘤樣品中提取細(xì)胞，進(jìn)行溶胞并使溶胞產(chǎn)物與針對HLA I型抗原的抗體進(jìn)行反應(yīng)。
DE29913522提供了一種通過使提取自患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞承受200-9000巴的壓力以便殺傷或破壞腫瘤細(xì)胞卻能保持其表面的完整，然后再將所述細(xì)胞重新注入到患者體內(nèi)來制備癌癥疫苗的設(shè)備。
WO00/02581公開了一種能誘導(dǎo)針對癌基因或突變的腫瘤抑制蛋白或肽的T細(xì)胞應(yīng)答的端粒酶蛋白或肽。所述肽被用于癌癥疫苗。
WO00/18933公開了能引起功能上無活性的修飾抗原進(jìn)行表達(dá)的DNA構(gòu)建體，該抗原在DNA、RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率方面或抗原性肽的產(chǎn)生方面沒有發(fā)生改變。通過施用編碼修飾的人癌癥相關(guān)抗原特別是PSMA抗原的RNA或質(zhì)粒DNA來治療患癌癥的患者。在一個不同的實(shí)施方案中，將與RNA或質(zhì)粒DNA進(jìn)行了體外接觸的自體樹突細(xì)胞用作疫苗。
WO00/20581公開了一種含有新的分離的MAGE-A3人白細(xì)胞抗原(HLA)II型-結(jié)合肽的癌癥疫苗。所述肽還可被用來選擇性富集一群T淋巴細(xì)胞，其中CD4+T淋巴細(xì)胞對所述肽特異。所述被富集的淋巴細(xì)胞還被用作癌癥疫苗。
WO00/25813公開了與主要組織相容性復(fù)合體分子結(jié)合的通用腫瘤-相關(guān)抗原(TAA)。治療方法包括施用編碼TAA的核酸分子，該抗原由能夠激活細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞和殺傷表達(dá)TAA的細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行加工。除了特定的hTERT肽，不同TAA的鑒定通過復(fù)雜的計算機(jī)-輔助方法合成計算機(jī)設(shè)計的肽和對該肽的有用性進(jìn)行證實(shí)的生物學(xué)分析來實(shí)現(xiàn)。
WO00/26249公開了人WT-1蛋白或人gata-1蛋白的片段。這些肽片段通過激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)而被用于癌癥疫苗。
US6077519提供了含有T細(xì)胞表位的組合物的癌癥疫苗，所述表位是通過對源自腫瘤組織的表位進(jìn)行酸洗脫而回收的。
WO00/46352提供了一種含有表達(dá)功能性CD86分子的人T淋巴細(xì)胞的癌癥疫苗。所述T淋巴細(xì)胞通過使T細(xì)胞經(jīng)受至少連續(xù)兩次刺激而獲得，其中每次刺激涉及至少一種激活劑(一種抗CD2，3或28的抗體)和一種刺激T細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子(白介素)。
Coral S等.Journal of Immunotherapy 22(1)16-24，1999教導(dǎo)了黑色素瘤細(xì)胞的潛在免疫原性及其被宿主細(xì)胞毒性細(xì)胞的識別取決于人白細(xì)胞抗原(HLA)I型抗原、共同刺激分子和黑色素瘤-相關(guān)抗原(MAA)在腫瘤性細(xì)胞上的存在及其表達(dá)水平?？赡苡幸环N暗示，就是通過全身施用對人黑色素瘤進(jìn)行主動和/或被動特異性免疫治療的5-AZA-CdR可提高細(xì)胞毒性細(xì)胞對黑色素瘤的識別。
Momparler，Anticancer Drugs Apr；8(4)358-68，1997中提到了5-AZA-CdR被用作化學(xué)治療劑。
Shichijo S等，Jpn.J.Cancer Res.87，751-756，1996年7月研究了脫甲基化試劑5-AZA-CdR是否能夠在正常和惡性淋巴樣細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生MAGE1、2、3和6以便更好地理解其在細(xì)胞中的表達(dá)機(jī)制。所述作者顯示了在選擇性測試樣品中誘導(dǎo)所研究的CTA并且討論了脫甲基化不足以在所有情況下刺激誘導(dǎo)MAGE基因，并且其結(jié)果使人能夠更好地理解MAGE基因在細(xì)胞中的表達(dá)機(jī)制。沒有提示可涉及治療。
發(fā)明的概述目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種生成抗原呈遞細(xì)胞的方法，該方法包括a)從受試者的體內(nèi)收集所述細(xì)胞；b)激活所述收集的細(xì)胞c)離體培養(yǎng)和任選地擴(kuò)增所述被激活的細(xì)胞；d)用DNA降低甲基化試劑處理所述培養(yǎng)和任選擴(kuò)增的細(xì)胞以使所述細(xì)胞同時表達(dá)多種腫瘤相關(guān)抗原。
可按照本發(fā)明方法獲得的細(xì)胞及其細(xì)胞組分單獨(dú)或與所述細(xì)胞聯(lián)合，被用于預(yù)防和治療尤其是包括人類在內(nèi)的哺乳動物的不同組織型惡性腫瘤，其中所述腫瘤組成型表達(dá)在所述細(xì)胞中表達(dá)的多種腫瘤相關(guān)抗原中的一種或多種。
在本發(fā)明下文中，所述細(xì)胞被簡稱為ADHAPI-細(xì)胞。
最便利的是，可由上述方法得到的細(xì)胞以癌癥疫苗的形式被使用。
在下文中，本發(fā)明還將通過實(shí)施例和附圖的方式得到詳細(xì)的說明，其中

圖1顯示受ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV或?qū)φ誃-EBV細(xì)胞(S)刺激的自體(aMLR)PBMC(R)的增殖情況；圖2顯示受ADHAPI-細(xì)胞/PWM-B或?qū)φ誔WM-B細(xì)胞(S)刺激的自體(aMLR)PBMC(R)的增殖情況；
圖3顯示受ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B或?qū)φ誄D40L-B細(xì)胞(S)刺激的自體(aMLR)PBMC(R)的增殖情況；圖4顯示受ADHAPI-細(xì)胞/PWM-PBMC或?qū)φ誔WM-PBMC細(xì)胞(S)刺激的自體(aMLR)PBMC(R)的增殖情況；圖5顯示受ADHAPI-細(xì)胞/PHA-PBMC和對照PHA-PBMC刺激的自體(aMLR)PBMC(R)的增殖情況；圖 6顯示受ADHAPI-細(xì)胞/PHA-+PWM-PBMC或?qū)φ誔HA-+PWM-PBMC(S)刺激的自體(aMLR)PBMC(R)的增殖情況。
本發(fā)明的詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明，事實(shí)上不存在對能夠被處理以便產(chǎn)生抗原-呈遞細(xì)胞的細(xì)胞類型的限制，只要所述類型的細(xì)胞能被適當(dāng)?shù)丶せ詈陀媒档图谆噭┨幚砭托小?br> 根據(jù)本本明，從受試者，特別是哺乳動物，更特別地是人體內(nèi)收集細(xì)胞。在本發(fā)明的一個可能性實(shí)施方案中，所述人是癌癥患者。
在本發(fā)明的第一個優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過上述方法獲得的抗原-呈遞細(xì)胞是免疫細(xì)胞。
在本發(fā)明的第二個優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過上述方法獲得的抗原-呈遞細(xì)胞是非免疫細(xì)胞。
可根據(jù)本發(fā)明獲得的細(xì)胞能夠表達(dá)共有的優(yōu)勢免疫癌癥抗原或者能夠表達(dá)共有的非優(yōu)勢免疫癌癥抗原。
在本發(fā)明的某些特定實(shí)施方案中，適用于本文所述方法的細(xì)胞是·EB病毒-無限增殖化、DNA降低甲基化試劑處理的B-類淋巴母細(xì)胞系(ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV)，該細(xì)胞系產(chǎn)生自處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的外周血單核的細(xì)胞(PBMC)。
·商陸促分裂原(PWM)激活的、DNA降低甲基化試劑處理的B-淋巴細(xì)胞(ADHAPI-細(xì)胞/PWM-B)，該細(xì)胞產(chǎn)生自從處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的PBMC中純化的B淋巴細(xì)胞。
·CD40激活的、DNA降低甲基化試劑處理的B-淋巴細(xì)胞(ADHAPI-細(xì)胞/CD40-B)，該細(xì)胞產(chǎn)生自從處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的PBMC中純化的B淋巴細(xì)胞。
·商陸促分裂原(PWM)激活的、DNA降低甲基化試劑處理的PBMC(ADHAPI-細(xì)胞/PWM-PBMC)，該細(xì)胞產(chǎn)生自處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的純化PBMC。
·植物凝集素(PHA)+重組人白介素-2(rhIL-2)激活的、DNA降低甲基化試劑處理的PBMC(ADHAPI-細(xì)胞/PHA-rhIL2-PBMC)，該細(xì)胞產(chǎn)生自處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的純化PBMC。
·植物凝集素(PHA)+重組人白介素-2(rhIL-2)+商陸促分裂原(PWM)激活的、DNA降低甲基化試劑處理的PBMC(ADHAPI-細(xì)胞/PHA-rhIL2-PWM-PBMC)，該細(xì)胞產(chǎn)生自處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的純化PBMC。
·樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。
·CD34+細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞(cheratinocyte)。
可由本發(fā)明方法獲得的細(xì)胞適于被用作預(yù)防和治療不同組織型惡性腫瘤的藥劑，其中所述腫瘤組成型表達(dá)一種或多種優(yōu)勢免疫或非優(yōu)勢免疫的癌癥抗原。
本發(fā)明的另一個可能性實(shí)施方案可應(yīng)用于那些其中不希望或不必利用疫苗接種細(xì)胞的直接抗原呈遞能力的情況。在這種實(shí)施方案中，可通過本發(fā)明方法獲得的疫苗接種細(xì)胞或其細(xì)胞組分可被用作混合(pooled)癌癥抗原的“儲存庫(reservoir)”以接種患者。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所選TAA是CTA。
本發(fā)明的該實(shí)施方案為技術(shù)人員提供了下列優(yōu)點(diǎn)由于CTA含有由HLA I型-限制性CTA-特異性CD8+CTL識別的表位，所以CTA是免疫原性的。
由于CTA含有由HLA II型-限制性CTA-特異性CD4+T淋巴細(xì)胞識別的表位，所以CTA是免疫原性的。
被選CTA同時含有由HLA I型和HLA II型抗原呈遞的表位；因此，被選CTA可同時誘導(dǎo)CD8+CTL和CD4+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
CTA不在除睪丸和胎盤之外的良性組織中表達(dá)。
不同CTA可同時在實(shí)體和造血惡性腫瘤的腫瘤性細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，從而提供了在被轉(zhuǎn)化細(xì)胞上共表達(dá)的多個治療性靶向物。
不同CTA在指定患者的同時和順序性轉(zhuǎn)移病損之中進(jìn)行均一性表達(dá)。
不同CTA可在不同組織來源的惡性組織中進(jìn)行表達(dá)從而提供了由人腫瘤共有的而不考慮其特定組織型的共同治療性靶向物。
不同CTA可以編碼在不同HLA I型和HLA II型同種特異性情況下呈遞的多種免疫原性肽。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，組蛋白脫乙?；敢种苿┠軌騾f(xié)同DNA降低甲基化試劑來誘導(dǎo)/上調(diào)CTA、HLA抗原和共同刺激性/輔助性分子在不同組織的腫瘤性細(xì)胞上的表達(dá)。事實(shí)上，DNA甲基化和組蛋白脫乙?；鳛樵诎┌Y中的外遺傳基因沉默的協(xié)同層來發(fā)揮作用(Fuks F.等，Nat.Genet.，2488-91，2000)，對DNA進(jìn)行了初步的最低程度的脫甲基后，接著用組蛋白脫乙?；敢种苿┻M(jìn)行處理，結(jié)果在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中觀察到經(jīng)選的超甲基化的基因被強(qiáng)烈再激活，其具有腫瘤抑制功能(Cameron E.E.等，Nat.Genet.，21103-107，1999)。
按照公知常識實(shí)施本發(fā)明方法中的激活步驟，在任何情況下都可以參考Current.Protocols in Immunology，Coligan J.E.等編輯，Wiley。
本發(fā)明方法中的脫甲基化處理是熟知的并且文獻(xiàn)對該方法加以報道，為了獲得進(jìn)一步的信息還可參照Santini V.等，Ann.Intern.Med.，134573-586，2001.
用于本發(fā)明目的的降低甲基化試劑，已知在本技術(shù)領(lǐng)域中還被稱為脫甲基化試劑，在本技術(shù)領(lǐng)域中是熟知的。DNA脫甲基化試劑被廣泛公開于文獻(xiàn)中，例如參見WO 01/29235，US5851773。一種優(yōu)選的DNA脫甲基化試劑是5-氮雜-胞苷，或更優(yōu)選地是5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-AZA-CdR)。
本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞適于制備癌癥疫苗。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗是自體疫苗。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗是同種異體疫苗。在該實(shí)施方案中，可按照上述方法獲得的細(xì)胞既可以被用作抗原呈遞細(xì)胞又可以被用作混合癌癥抗原的“儲存庫”形式，其可以是細(xì)胞也可以是細(xì)胞組分。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞和/或細(xì)胞組分可被用于生成效應(yīng)免疫細(xì)胞的方法當(dāng)中，所述效應(yīng)免疫細(xì)胞被用于制備在眾所周知的過繼免疫治療中使用的產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，本文公開的疫苗可與采用降低甲基化試劑如decitabine對癌癥患者進(jìn)行全身預(yù)處理聯(lián)合使用。該實(shí)施方案可采用一種商品，例如一種含有本發(fā)明疫苗和適于全身施用降低甲基化試劑如decitabine的藥物組合物的試劑盒來進(jìn)行。
可按照本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)，只遵循公知常識，來制備疫苗。例如，在本說明書中提到的專利參考文獻(xiàn)對癌癥疫苗的制備方法作了充分的公開，例如參見WO00/25813或WO00/46352。
技術(shù)人員毫無困難地就能建立使用本發(fā)明疫苗的合適方式，特別是用藥方案。
下列實(shí)施例對本發(fā)明作出了進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1ADHAPI-細(xì)胞/B-EBVPBMC純化通過標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll-Hypaque密度梯度離心從處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的肝素化的外周血中提純PBMC。
利用EB病毒(EBV)使PBMC無限增殖來產(chǎn)生自體B-類淋巴母細(xì)胞系B-EBV+類淋巴母細(xì)胞系通過以下方法來制備在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下，于添加了10％熱滅活的胎牛血清(或人AB血清)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基中將PBMC與得自B95.8絨猴細(xì)胞系的上清液一起培養(yǎng)。
ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV和對照B-EBV細(xì)胞的制備在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下，于添加了10％熱滅活的胎牛血清(或10％熱滅活的人AB血清)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)B-EBV+類淋巴母細(xì)胞系(7.5×105細(xì)胞/ml)，并且每12小時用1μM 5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-AZA-CdR)脈沖四次；然后，將一半的培養(yǎng)基換成新鮮培養(yǎng)基并再培養(yǎng)48小時。而后將細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)過程和/或在存活條件下冷凍起來。在類似的但不進(jìn)行5-AZA-CdR脈沖的實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)對照細(xì)胞(B-EBV細(xì)胞)。
ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV和對照B-EBV細(xì)胞的最終回收結(jié)果見表I。
自體混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(aMLR)和MLR收集ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV和對照B-EBV細(xì)胞(刺激物＝S)，用Hanks’平衡鹽溶液(HBSS)沖洗兩次并進(jìn)行X-射線處理(75Gy)。針對aMLR和MLR，將標(biāo)量濃度(從1×106細(xì)胞/ml至6×104細(xì)胞/ml)的ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV或?qū)φ誃-EBV細(xì)胞加到在Basal Iscove’s培養(yǎng)基中的自體或同種異體PBMC(1×106細(xì)胞/ml)(反應(yīng)物＝R)中，并且接種到96孔U-底平板上，使終體積達(dá)到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培養(yǎng)基中添加了10％的熱滅活的人AB血清、2 mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素。在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)24小時后，收集100μl的培養(yǎng)上清液并立即保存在-80℃下直至被用于進(jìn)行細(xì)胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鮮培養(yǎng)基并且再培養(yǎng)5天，此時用3H-TdR(1μLCi/孔)對培養(yǎng)物進(jìn)行脈沖O/N；然后對平板進(jìn)行收獲并利用β-計數(shù)器測定摻入到R細(xì)胞當(dāng)中的3H-TdR。
在aMLR中受ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV或?qū)φ誃-EBV細(xì)胞(S)刺激的自體PBMC(R)的增殖見圖1。
ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV和對照B-EBV細(xì)胞的表型譜結(jié)果見表II.
RT-PCR分析由ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV和對照B-EBV細(xì)胞表達(dá)的CTA被用來評估CTA在被研究細(xì)胞上的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)條件和引物如下所示對于MAGE-1、-2、-3、-4，Brasseur，F(xiàn).等，Int.J.Cancer 63375-380，1995；對于GAGE 1-6，Van den Eynde，B.等，J.Exp.Med.182689-698，1995；對于NY-ESO-1，Stockert，E.等，J.Exp.Med.187265-270，1998；對于SSX-2；Sahin，U.等，Clin.Cancer Res.63916-3922，2000。
a陽性的/被測試的；NT，未測試；ELISA評價由在aMLR中被ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV或?qū)φ誃-EBV細(xì)胞(S)刺激的PBMC(R)釋放的IFN-γ結(jié)果見表III。
實(shí)施例2ADHAPI-細(xì)胞/PWM-BB-淋巴細(xì)胞的純化通過標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll-Hypaque密度梯度離心從處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的肝素化的外周血中提純PBMC，并且利用神經(jīng)氨酸酶-處理的羊血紅細(xì)胞通過常規(guī)的E玫瑰花結(jié)技術(shù)獲得純化的B淋巴細(xì)胞。
PWM-激活的B細(xì)胞的制備向純化的B-淋巴細(xì)胞(1.5×106細(xì)胞/ml)中加入PWM(3μg/ml)并在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下于添加了10％的熱滅活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素的BasalIscove’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。
ADHAPI-細(xì)胞/PWM-B和對照PWM-B細(xì)胞的制備每12小時用1μM 5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-AZA-CdR)對PWM-激活的B-淋巴細(xì)胞脈沖四次；然后，將一半的培養(yǎng)基換成新鮮培養(yǎng)基并再培養(yǎng)48小時。而后將細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)過程和/或在存活條件下冷凍起來。在類似但不進(jìn)行5-AZA-CdR脈沖的實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)對照細(xì)胞(PWM-B細(xì)胞)。
ADHAPI-細(xì)胞/PWM-B和對照PWM-B細(xì)胞的最終回收結(jié)果見表I。
自體混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(aMLR)和MLR收集ADHAPI-細(xì)胞/PWM-B和對照PWM-B細(xì)胞(刺激物＝S)，用添加了0.5％的α-甲基甘露吡喃糖苷的Hanks’平衡鹽溶液(HBSS)沖洗三次并進(jìn)行X-射線處理(30Gy)。針對aMLR和MLR，將標(biāo)量濃度(從1×106細(xì)胞/ml至6×104細(xì)胞/ml)的ADHAPI-細(xì)胞/PWM-B或?qū)φ誔WM-B細(xì)胞加到在Basal Iscove’s培養(yǎng)基中的自體或同種異體PBMC(從1×106細(xì)胞/ml)(反應(yīng)物＝R)中，并且接種到96孔U-底平板上，使終體積達(dá)到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培養(yǎng)基中添加了10％的熱滅活的人AB血清、2 mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素。在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)6天后，從每孔收集100μl的培養(yǎng)上清液并立即存在-80℃下直至被用于進(jìn)行細(xì)胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鮮培養(yǎng)基并且用3H-TdR(1μCi/孔)對培養(yǎng)物進(jìn)行脈沖O/N；然后對平板進(jìn)行收獲并利用β-計數(shù)器測定摻入到R細(xì)胞當(dāng)中的3H-TdR。
ADHAPI-細(xì)胞/PWM-B和對照PWM-B細(xì)胞的表型譜結(jié)果見表II.
RT-PCR分析由ADHAPI-細(xì)胞/PWM-B和對照PWM-B細(xì)胞表達(dá)的CTA
a陽性的/被測試的；NT，未測試；在aMLR中受ADHAPI-細(xì)胞/PWM-B或?qū)φ誔WM-B細(xì)胞(S)刺激的自體PBMC(R)的增殖結(jié)果見圖2。
ELISA評價由被ADHAPI-細(xì)胞/PWM-B或?qū)φ誔WM-B細(xì)胞(S)刺激的同種異體(MLR)和自體(aMLR)PBMC(R)釋放的IFNγ結(jié)果見表III。
實(shí)施例3ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-BPBMC純化通過標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll-Hypaque密度梯度離心從處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的肝素化或酸式檸檬酸葡萄糖(ACD)-抗凝的外周血中提純PBMC。
NIH3T3-CD40L-激活的PBMC的制備在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下，于添加了10％的熱滅活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、2ng/ml重組人(rh)白介素4(rhIL-4)、50μg/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白、5μg/ml rh胰島素、5.5×10-7M環(huán)孢菌素A(CsA)、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素的Basal Iscove’s培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中將PBMC(2×106細(xì)胞/ml)與半?yún)R合度的、X-射線處理的(75Gy)NIH3T3-CD40L進(jìn)行共同培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后，收集PBMC，用HBSS沖洗兩次，以1×106細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮在完全培養(yǎng)基中并且與如上所述新鮮制備的NIH3T3-CD40L在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下再共同培養(yǎng)3天。每2-3天就重復(fù)該過程直至16-18天的最長培養(yǎng)時間。
生成ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B和對照CD40L-B細(xì)胞培養(yǎng)16-18天后，收集被激活的PBMC并按照上述方法用NIH3T3-CD40L進(jìn)行再刺激；在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下進(jìn)行O/N培養(yǎng)后，每12小時用1μM 5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-AZA-CdR)將培養(yǎng)物脈沖四次；然后，收獲細(xì)胞并按照上述方法用NIH3T3-CD40L進(jìn)行再刺激并再培養(yǎng)48小時。而后將細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)過程和/或在存活條件下冷凍起來。在類似但不進(jìn)行5-AZA-CdR脈沖的實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)對照細(xì)胞(CD40L-B細(xì)胞)。
ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B和對照CD40L-B細(xì)胞的最終回收結(jié)果見表I。
自體混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(aMLR)和MLR收集ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B和對照CD40L-B細(xì)胞(刺激物＝S)，用Hanks’平衡鹽溶液(HBSS)沖洗三次并進(jìn)行X-射線處理(50Gy)。針對aMLR和MLR，將標(biāo)量濃度(從1×106細(xì)胞/ml至6×104細(xì)胞/ml)的ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B或?qū)φ誄D40L-B細(xì)胞加到在BasalIscove’s培養(yǎng)基中的自體或同種異體PBMC(1×106細(xì)胞/ml)(反應(yīng)物＝R)中，并且接種到96孔U-底平板上，使終體積達(dá)到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培養(yǎng)基中添加了10％的熱滅活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素。在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)24小時后，收集100μl的培養(yǎng)上清液并立即保存在-80℃下直至被用于進(jìn)行細(xì)胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鮮培養(yǎng)基并且再培養(yǎng)5天，此時用3H-TdR(1μCi/孔)對培養(yǎng)物進(jìn)行脈沖O/N；然后對平板進(jìn)行收獲并利用β-計數(shù)器測定摻入到R細(xì)胞當(dāng)中的3H-TdR。
ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B和對照CD40L-B細(xì)胞的表型譜結(jié)果見表II.
RT-PCR分析由ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B和對照CD40L-B細(xì)胞表達(dá)的CTA
a陽性的/被測試的。
在aMLR中受ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B或?qū)φ誄D40L-B細(xì)胞(S)刺激的自體PBMC(R)的增殖結(jié)果見圖3。
ELISA評價由在aMLR中被ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B或?qū)φ誄D40L-B細(xì)胞(S)刺激的PBMC(R)釋放的IFN-γ結(jié)果見表III。
實(shí)施例4ADHAPI-細(xì)胞/PWM-PBMCPRMC純化通過標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll-Hypaque密度梯度離心從處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的肝素化的外周血中提純PBMC。
PWM-激活的PBMC的制備向PBMC(1.5×106細(xì)胞/ml)中加入PWM(3μg/ml)并在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下于添加了10％的熱滅活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素的Basal Iscove’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。
ADHAPI-細(xì)胞/PWM-PBMC和對照PWM-PBMC細(xì)胞的制備每12小時用1μM 5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-AZA-CdR)將PWM-激活的PBMC脈沖四次；然后，將一半的培養(yǎng)基換成新鮮培養(yǎng)基并再培養(yǎng)48小時。而后將細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)過程和/或在存活條件下冷凍起來。在類似但不進(jìn)行5-AZA-CdR脈沖的實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)對照細(xì)胞(PWM-PBMC細(xì)胞)。
ADHAPI-細(xì)胞/PWM-PBMC和對照PWM-PBMC細(xì)胞的最終回收結(jié)果見表I。
自體混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(aMLR)和MLR收集ADHAPI-細(xì)胞/PWM-PBMC和對照PWM-PBMC細(xì)胞(刺激物＝S)，用添加了0.5％的α-甲基甘露吡喃糖苷的Hanks’平衡鹽溶液沖洗三次并進(jìn)行X-射線處理(30Gy)。針對aMLR和MLR，將標(biāo)量濃度(從1×106細(xì)胞/ml至6×104細(xì)胞/ml)的ADHAPI-細(xì)胞/PWM-PBMC或?qū)φ誔WM-PBMC細(xì)胞加到在Basal Iscove’s培養(yǎng)基中的自體或同種異體PBMC(1×106細(xì)胞/ml)(反應(yīng)物＝R)中，并且接種到96孔U-底平板上，使終體積達(dá)到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培養(yǎng)基中添加了10％的熱滅活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素。在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)6天后，從每孔收集100μl的培養(yǎng)上清液并立即保存在-80℃下直至被用于進(jìn)行細(xì)胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鮮培養(yǎng)基并且用3H-TdR(1μCi/孔)對培養(yǎng)物進(jìn)行脈沖O/N；然后進(jìn)行收獲并利用β-計數(shù)器測定摻入到R細(xì)胞當(dāng)中的3H-TdR。
ADHAPI-細(xì)胞/PWM-PBMC和對照PWM-PBMC細(xì)胞的表型譜結(jié)果見表II.
RT-PCR分析由ADHAPI-細(xì)胞/PWM-PBMC和對照PWM-PBMC細(xì)胞表達(dá)的CTA
a陽性的/被測試的；NT，未測試；在aMLR中受ADHAPI-細(xì)胞/PWM-PBMC或?qū)φ誔WM-PBMC細(xì)胞(S)刺激的自體(aMLR)PBMC(R)的增殖結(jié)果見圖4。
ELISA評價由在aMLR中被ADHAPI-細(xì)胞/PWM-PBMC或?qū)φ誔WM-PBMC細(xì)胞(S)刺激的自體PBMC(R)釋放的IFN-γ結(jié)果見表III。
實(shí)施例5ADHAPI-細(xì)胞/PHA-PBMCPBMC純化通過標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll-Hypaque密度梯度離心從處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的肝素化的外周血中提純PBMC。
PHA-激活的PBMC的制備向PBMC(1.5×106細(xì)胞/ml)中加入PHA(10μg/ml)和100 UI/mlrhIL-2并在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下于添加了10％的熱滅活的胎牛血清(或在添加了10％的熱滅活的人AB血清的Basal Iscove’s培養(yǎng)基中)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)48小時。
ADHAPI-細(xì)胞/PHA-PBMC和對照PHA-PBMC的制備每12小時用1μM 5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-AZA-CdR)將PHA-激活的PBMC脈沖四次；然后，將一半的培養(yǎng)基換成無PHA-M的新鮮完全培養(yǎng)基并再培養(yǎng)48小時。而后將細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)過程和/或在存活條件下冷凍起來。在類似但不進(jìn)行5-AZA-CdR脈沖的實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)對照細(xì)胞(PHA-PBMC)。
ADHAPI-細(xì)胞/PHA-PBMC和對照PHA-PBMC的最終回收結(jié)果見表I。
自體混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(aMLR)和MLR收集ADHAPI-細(xì)胞/PHA-PBMC和對照PHA-PBMC(刺激物＝S)，用添加了0.5％的α-甲基甘露吡喃糖苷的Hanks’平衡鹽溶液沖洗三次并進(jìn)行X-射線處理(50Gy)。針對aMLR和MLR，將標(biāo)量濃度(從1×106細(xì)胞/ml至6×104細(xì)胞/ml)的ADHAPI-細(xì)胞/PHA-PBMC或?qū)φ誔HA-PBMC加到在Basal Iscove’s培養(yǎng)基中的自體或同種異體PBMC(1×106細(xì)胞/ml)(反應(yīng)物＝R)中，并且接種到96孔U-底平板上，使終體積達(dá)到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培養(yǎng)基中添加了10％的熱滅活的人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素。在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)24小時后，從每孔收集100μl的培養(yǎng)上清液并立即保存在-80℃下直至被用于進(jìn)行細(xì)胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鮮培養(yǎng)基并且再培養(yǎng)5天，此時用3H-TdR(1μCi/孔)對培養(yǎng)物進(jìn)行脈沖O/N；然后對平板進(jìn)行收獲并利用β-計數(shù)器測定摻入到R細(xì)胞當(dāng)中的3H-TdR。
ADHAPI-細(xì)胞/PHA-PBMC和對照PHA-PBMC的表型譜結(jié)果見表II.
RT-PCR分析由ADHAPI-細(xì)胞/PHA-PBMC和對照PHA-PBMC表達(dá)的CTA
a陽性的/被測試的；NT，未測試；在aMLR中受ADHAPI-細(xì)胞/PHA-PBMC和對照PHA-PBMC刺激的自體PBMC(R)的增殖結(jié)果見圖5。
ELISA評價由被ADHAPI-細(xì)胞/PHA-PBMC或?qū)φ誔HA-PBMC(S)刺激的同種異體(MLR)和自體(aMLR)PBMC(R)釋放的IFN-γ結(jié)果見表III。
實(shí)施例6ADHAPI-細(xì)胞/PHA+PWM-PBMCPBMC純化通過標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll-Hypaque密度梯度離心從處于疾病晚期的癌癥患者或健康受試者的肝素化或ACD-抗凝的外周血中提純PBMC。
PHA+PWM-激活的PBMC的制備向PBMC(1.5×106細(xì)胞/ml)中加入PHA-M(10μg/ml)、PWM(3μg/ml)和100 UI/ml rhIL-2并在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下于添加了10％的熱滅活的人AB血清(或添加10％的熱滅活的自體血清)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素的BasalIscove’s培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)48小時。
ADHAPI-細(xì)胞/PHA+PWM-PBMC和對照PHA+PWM-PBMC的制備每12小時用1μM 5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-AZA-CdR)將PHA+PWM-激活的PBMC脈沖四次；然后，將一半的培養(yǎng)基換成不含PHA或PWM的新鮮完全培養(yǎng)基并再培養(yǎng)48小時。而后將細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)過程和/或在存活條件下冷凍起來。在類似但不進(jìn)行5-AZA-CdR脈沖的實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)對照細(xì)胞(PHA+PWM-PBMC)。
ADHAPI-細(xì)胞/PHA+PWM-PBMC和對照PHA+PWM-PBMC的最終回收結(jié)果見表I。
自體混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(aMLR)和MLR收集ADHAPI-細(xì)胞/PHA+PWM-PBMC和對照PHA+PWM-PBMC(刺激物＝S)，用添加了0.5％的α-甲基甘露吡喃糖苷的Hanks’平衡鹽溶液沖洗三次并進(jìn)行X-射線處理(50Gy)。針對aMLR和MLR，將標(biāo)量濃度(從1×106細(xì)胞/ml至6×104細(xì)胞/ml)的ADHAPI-細(xì)胞/PHA-rhIL2-+PWM-PBMC或?qū)φ誔HA+PWM-PBMC細(xì)胞加到在Basal Iscove’s培養(yǎng)基中的自體或同種異體PBMC(1×106細(xì)胞/ml)(反應(yīng)物＝R)中，并且接種到96孔U-底平板上，使終體積達(dá)到200μl/孔，其中Basal Iscove’s培養(yǎng)基中添加了10％的熱滅活的人AB血清、2 mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素。在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)6天后，從每孔收集100μl的培養(yǎng)上清液并立即保存在-80℃下直至被用于進(jìn)行細(xì)胞因子分析。然后，向每孔中加入100μl的新鮮培養(yǎng)基并且用3H-TdR(1μCi/孔)對培養(yǎng)物進(jìn)行脈沖O/N；然后對平板進(jìn)行收獲并利用β-計數(shù)器測定摻入到R細(xì)胞當(dāng)中的3H-TdR。
ADHAPI-細(xì)胞/PHA+PWM-PBMC和對照PHA+PWM-PBMC的表型譜結(jié)果見表II。
RT-PCR分析由ADHAPI-細(xì)胞/PHA+PWM-PBMC和對照PHA+PWM-PBMC表達(dá)的CTA
a陽性的/被測試的。
在aMLR中受ADHAPI-細(xì)胞/PHA+PWM-PBMC或?qū)φ誔HA+PWM-PBMC刺激的自體(aMLR)PBMC(R)的增殖結(jié)果見圖6。
ELISA評價由被ADHAPI-細(xì)胞/PHA+PWM-PBMC或?qū)φ誔HA+PWM-PBMC(S)刺激的同種異體(MLR)和自體(aMLR)PBMC(R)釋放的IFN-γ結(jié)果見表III。
ADHAPI-細(xì)胞的體內(nèi)致瘤作用施用ADHAPI-細(xì)胞后180天，單次皮下異種移植活的ADHAPI細(xì)胞/PHA-rhIL2-PWM-PBMC(12×106)及其對照細(xì)胞(14×106)，ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B(8×106)及其對照細(xì)胞(8×106)或x-射線-處理的(30Gy)ADHAPI-細(xì)胞/PHA-rhIL2 PWM-PBMC(12×106)及其對照細(xì)胞(14×106)，x-射線處理的(50Gy)ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B(15×106)及其對照細(xì)胞(18×106)既不在注射或遠(yuǎn)距(臨床可探測的)位點(diǎn)誘導(dǎo)腫瘤形成，也不影響B(tài)ALB/c nu/nu小鼠的整體健康狀況和體重。第一次施用后180天，重復(fù)進(jìn)行的皮下異種移植活的ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV(5×106/1st注射；1×107/2nd和后繼注射)和對照B-EBV細(xì)胞(5×106/1st注射；1×107/2nd和后繼注射)或x-射線處理的ADHAPI-細(xì)胞/B-EBV(75Gy)(5×106/1st注射；1×107/2nd和后繼注射)和x-射線處理的(75Gy)對照B-EBV細(xì)胞(5×106/1st注射；1×107/2nd和后繼注射)在第0，33，63和96天既不在注射或遠(yuǎn)距(臨床可探測)位點(diǎn)誘導(dǎo)腫瘤形成，也不影響B(tài)ALB/c nu/nu小鼠的整體健康狀況和體重。ADHAPI-細(xì)胞-處理的動物的總體健康狀況和體重與對照動物(未處理或移植B-EBV細(xì)胞)相當(dāng)。
ADHAPI-細(xì)胞作為多價細(xì)胞CTA疫苗的優(yōu)點(diǎn)與已經(jīng)利用的，或迄今為止假設(shè)的最有效地對癌癥患者施用已知CTA的主要方案相比，ADHAPI-細(xì)胞代表全新的和改進(jìn)的方法并且具有許多突出/顯著的優(yōu)點(diǎn)。在這些當(dāng)中ADHAPI-細(xì)胞相對于未遺傳修飾的細(xì)胞CTA疫苗由于能同時表達(dá)多種/所有甲基化-調(diào)節(jié)的CTA，所以ADHAPI-細(xì)胞是新型的和獨(dú)一無二的APC疫苗；由于是內(nèi)源性合成的，所以CTA能夠直接和同時進(jìn)入ADHAPI-細(xì)胞中的HLA I型和HLA II型抗原加工途徑(Jenne L等，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
因此，由于其組成型細(xì)胞膜表達(dá)HLA I型和HLA II型抗原，ADHAPI-細(xì)胞能夠同時將內(nèi)源性合成的CTA的免疫原性表位呈遞給CD8+和CD4+自體T淋巴細(xì)胞；因此，ADHAPI-細(xì)胞能同時誘導(dǎo)/擴(kuò)增定向于CTA的CTL和體液免疫應(yīng)答。另外，ADHAPI-細(xì)胞可以表達(dá)和向宿主T細(xì)胞呈遞還沒有得到鑒定和表征的甲基化調(diào)節(jié)的CTA(以及已知和仍然未知的CTA的非優(yōu)勢免疫表位)。
與ADHAPI-細(xì)胞相反，合成CTA肽-脈沖的、合成CTA全蛋白-脈沖的或完整腫瘤細(xì)胞制品-脈沖的自體APC疫苗(例如樹突細(xì)胞，PBMC)，以及電融合-產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞-樹突細(xì)胞雜交細(xì)胞(Kugler A.等，Nat.Med.，6332-336，2000.TureciO.等，Cancer Res.，564766-4772，1996.編輯)共有的主要限制包括i)離體加載的合成CTA肽、完整合成CTA蛋白或源自腫瘤的CTA在體內(nèi)的命運(yùn)未知，這可顯著地影響抗原向宿主免疫系統(tǒng)的呈遞的持續(xù)時間；ii)可離體加載到細(xì)胞疫苗的HLA I型和/或HLA II型抗原上的有限量的合成CTA肽、完整合成CTA蛋白或源自腫瘤的CTA，可以顯著地阻礙被施用的CTA的免疫原性；iii)受患者HLA表型的限制和迄今為止所鑒定的CTA的數(shù)目仍比較有限的已知HLA I型抗原-以及甚至更為有限的HLA II型抗原限制性免疫原性表位；iv)可利用足量的新鮮腫瘤組織，這也充分表明了在腫瘤性損傷中表達(dá)的不同CTA(Jenne L.等，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
ADHAPI-細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性合成的CTA持續(xù)很長時間；因此，與離外合成CTA肽脈沖的或合成CTA完整蛋白脈沖的或完整的腫瘤細(xì)胞制劑脈沖的自體APC疫苗不同，ADHAPI-細(xì)胞能夠在體內(nèi)持續(xù)刺激宿主的免疫應(yīng)答而對患者的施用次數(shù)較少。由于ADHAPI-細(xì)胞沒有長期的體內(nèi)致瘤作用，所以該假說通過預(yù)見到以活的、未經(jīng)x-射線處理的細(xì)胞疫苗形式來施用ADHAPI-細(xì)胞的可能性而得到進(jìn)一步的支持。而且一旦ADHAPI-細(xì)胞在體內(nèi)經(jīng)歷生理性死亡，它們?nèi)詫⑵鹬鴥?nèi)源性合成的CTA肽和蛋白的″儲存庫″的作用，這將進(jìn)一步并有效地強(qiáng)化患者的樹突細(xì)胞通過交叉致敏的免疫機(jī)制將HLA I型-限制性CTA表位呈遞給CD8+T細(xì)胞，以及通過充分明確的抗原加工的外源途徑將HLA II型-限制性CTA表位呈遞給CD4+T細(xì)胞。
ADHAPI-細(xì)胞保留了它們的APC功能；事實(shí)上，它們有效地刺激了自體和同種異體PBMC的增殖和對IFN-γ的釋放；而且，與其各自的對照細(xì)胞相比，ADHAPI-細(xì)胞在大多數(shù)情況下是更強(qiáng)的刺激物。在這方面，相關(guān)的是除了CTA以外，與其各自的對照細(xì)胞相比，ADHAPI細(xì)胞可同時表達(dá)更高水平的HLA I型抗原和/或不同的共同刺激性/輔助性分子。這些證據(jù)清楚地說明了與免疫原性差而且不能組成型表達(dá)幾種共同刺激性/輔助性分子的自體腫瘤細(xì)胞相比，ADHAPI-細(xì)胞作為自體細(xì)胞疫苗具有很大的優(yōu)勢。而且，與離體產(chǎn)生和擴(kuò)增的自體樹突細(xì)胞相比，ADHAPI-細(xì)胞疫苗由完全成熟的和免疫活性的APC產(chǎn)生；這一點(diǎn)克服了用于制備細(xì)胞疫苗的樹突細(xì)胞成熟階段所帶來的潛在限制，而這可能影響其耐受原性而不影響其免疫原性。
與其它的細(xì)胞疫苗相比，離體產(chǎn)生同時表達(dá)多種/所有甲基化-調(diào)節(jié)的CTA的ADHAPI-細(xì)胞疫苗是簡單的，在大多數(shù)情況下是快速的，不需要繁瑣的體外細(xì)胞操作，不涉及遺傳操作，不需要自體腫瘤組織，而且由健康個體和癌癥患者的PBMC高度可重復(fù)。
而且，近100％的ADHAPI-細(xì)胞制劑表達(dá)所有被研究的CTA，該CTA在APC中可誘導(dǎo)脫甲基化。由于具有這些特性，ADHAPI-細(xì)胞疫苗的制備更易于標(biāo)準(zhǔn)化和控制質(zhì)量(例如對被選擇的細(xì)胞表面分子進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析并對經(jīng)選擇的CTA進(jìn)行RT-PCR)以及效力(例如對經(jīng)選擇的CTA進(jìn)行定量RT-PCR)。此外，與迄今為止必須在每次對患者施用時新鮮制備，因而產(chǎn)生顯著的制劑間差異(例如，細(xì)胞存活性、疫苗接種細(xì)胞的表型譜、所加載的合成CTA肽或合成CTA完整蛋白或完整的腫瘤細(xì)胞制劑的量、通過電融合生成腫瘤細(xì)胞-樹突細(xì)胞雜合體的效力)的其它細(xì)胞疫苗相比，ADHAPI-細(xì)胞疫苗一旦制成并檢測了存活率、質(zhì)量和效力，就能進(jìn)行等分，適當(dāng)?shù)乩鋬銎饋聿⒈４嬖诖婊顥l件下一直到被用于治療目的。而且，由于它們不需要獲得自體腫瘤組織來脈沖自體細(xì)胞疫苗或離體制備腫瘤細(xì)胞-樹突細(xì)胞的雜合體，而且它們能從重復(fù)的leukaphereses進(jìn)行快速的大量制備，所以ADHAPI-細(xì)胞疫苗為每位患者提供了實(shí)際上不受限制的治療劑來源。
鑒于ADHAPI-細(xì)胞能同時表達(dá)多種/所有甲基化-調(diào)節(jié)的CTA，其中所述CTA是內(nèi)源性合成的并且能直接和同時進(jìn)入HLA I型和HLAII型抗原加工途徑，由于ADHAPI-細(xì)胞有可能對還沒有被鑒定和表征的甲基化-調(diào)節(jié)的CTA(以及已知的和仍然未知的CTA的非優(yōu)勢免疫表位)進(jìn)行表達(dá)并呈遞給宿主的T細(xì)胞，和由于迄今為止所鑒定的CTA的已知HLA I型抗原-和HLA II型抗原-限制性免疫原性表位數(shù)目仍然有限(所述CTA表位由此可根據(jù)患者的HLA表型而被用于治療目的)，ADHAPI-細(xì)胞的其它優(yōu)勢是它們很可能能夠在任何以及多種HLA I型和HLA II型同種特異性情況下同時呈遞不同CTA的已知和仍然未知的免疫原性表位。因此，與合成CTA肽脈沖的或合成CTA完整蛋白脈沖的細(xì)胞疫苗相比，采用ADHAPI-細(xì)胞疫苗的治療不限于具有明確HLA表型的患者；因此腫瘤性損傷表達(dá)一種或多種CTA的所有癌癥患者都可以作為進(jìn)行ADHAPI-細(xì)胞疫苗治療的候選對象，而不用考慮他們的HLA表型。在這方面，在迄今為止已知的CTA中，其一種或多種通常在大多數(shù)被研究的不同組織型惡性腫瘤中表達(dá)；因此接種ADHAPI-細(xì)胞對于絕大多數(shù)的癌癥患者來說是合適的。一條有意義的信息是MAGE，GAGE或NY-ESO-1在96％的人類腫瘤中表達(dá)(Cancer Immunol.Immunother.503-15，2001)。
與合成CTA肽脈沖的或合成CTA完整蛋白脈沖的細(xì)胞疫苗(其中可以將有限量的蛋白離體加載到細(xì)胞疫苗的HLA I型和/或HLA II型抗原上，顯著地阻礙了所施用的CTA的免疫原性)相比，并且由于ADHAPI-細(xì)胞同時表達(dá)多種/所有甲基化-調(diào)節(jié)的CTA，ADHAPI-細(xì)胞疫苗能夠克服在針對單一或數(shù)種CTA的治療過程中出現(xiàn)的CTA-陰性腫瘤變異體的免疫選擇，并且克服在特定腫瘤性損傷中不同CTA的組成型不均一表達(dá)和時而下調(diào)的表達(dá)。
ADHAPI-細(xì)胞疫苗由自體功能性APC構(gòu)成，其同時表達(dá)多種/所有已知的甲基化-調(diào)節(jié)的CTA以及很可能表達(dá)仍未得到鑒定的CTA，該CTA的表達(dá)通過DNA甲基化來進(jìn)行調(diào)節(jié)；而且，ADHAPI-細(xì)胞疫苗能被用于患不同組織型CTA-陽性腫瘤的患者。這些功能性和表型特征比目前采用的同種異體腫瘤細(xì)胞疫苗(例如，完整的混合腫瘤性細(xì)胞系的溶胞產(chǎn)物或其未純化的提取物、從混合腫瘤性細(xì)胞系脫落下的抗原)具有明顯的優(yōu)勢，事實(shí)上，這些腫瘤細(xì)胞疫苗可能不含或可能含有不足量的已知和仍然未知的免疫學(xué)相關(guān)CTA，含有可與CTA競爭免疫應(yīng)答的非相關(guān)細(xì)胞組分，由于是同種異體而可能毒性增加，需要由患者免疫系統(tǒng)進(jìn)行有效加工，并且可僅僅用于患相同組織型惡性腫瘤的患者。
ADHAPI-細(xì)胞相對于遺傳修飾的細(xì)胞CTA疫苗ADHAPI-細(xì)胞的制備不包括對自體樹突細(xì)胞或其它自體APC的離體遺傳操作，該操作是生產(chǎn)遺傳修飾的細(xì)胞疫苗所需要的，在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后，該疫苗表達(dá)經(jīng)選的CTA。而且，與ADHAPI/細(xì)胞相比，許多限制因素影響了遺傳修飾的細(xì)胞疫苗；這些限制因素有i)可利用的轉(zhuǎn)染方法的效率較低；ii)誘導(dǎo)針對被用于細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒載體的抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致對遺傳修飾的疫苗接種細(xì)胞造成了破壞；iii)存在預(yù)先就存在的或接種疫苗-誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾疫苗施用的中和抗體；iv)病毒載體對被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的存活、成熟和抗原-呈遞能力的直接影響(Jenne L.等，Trends Immunol.，22102-107，2001)。
表IADHAPI-細(xì)胞和對照細(xì)胞的回收
a數(shù)據(jù)表示在3(a)，4(b)，4(c)，4(d)，7(e)和5(f)次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，與被用于其產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)目(100％)相比，被回收細(xì)胞的平均值％±SD。
表IIADHAPI-細(xì)胞與自體對照細(xì)胞*進(jìn)行比較的表型譜 *通過Student’s配對t檢驗(yàn)比較在6(a)，6(b)，4(c)，4(d)，6(e)和2(f)次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中利用流式細(xì)胞儀獲得的平均熒光強(qiáng)度的平均值來獲取數(shù)據(jù)。統(tǒng)計學(xué)顯著差異不變地代表與自體對照細(xì)胞相比被研究抗原在ADHAPI-細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)。
f不顯著；gp值；h未檢測的；
ADHAPI-細(xì)胞/CD40L-B＝82-100％CD20+；對照CD40L-B細(xì)胞＝87-99％CD20+。
表III酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)評估由受ADHAPI-細(xì)胞(S)或?qū)φ占?xì)胞(S)刺激的自體(R)(aMLR)和同種異體(MLR)PBMC(R)釋放的IFN-γ。*
*數(shù)據(jù)代表在2(a)，4(b)，4(c)，4(d)，3(e)和4(f)次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中釋放的IFN-γ的平均值±SD(pg/ml)。S/R比值是3∶1(a)，1∶1(b)，1∶2(e)，1∶1(d)，1∶1(e)，1∶2(f)。在培養(yǎng)開始后的24小時(a)，6天(b)，24小時(c)，6天(d)，24小時(e)和6天(f)檢測IFN-γ的釋放；g通過Student’s配對t-檢驗(yàn)獲得的相對于對照細(xì)胞的p值；h未檢測的。
權(quán)利要求
1.一種生成抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括a)從受試者收集所述細(xì)胞；b)激活所述收集的細(xì)胞；c)離體培養(yǎng)和任選地擴(kuò)增所述被激活的細(xì)胞；d)用DNA降低甲基化試劑處理所述培養(yǎng)和任選擴(kuò)增的細(xì)胞以使所述細(xì)胞同時表達(dá)多種腫瘤相關(guān)抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述受試者是人。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述受試者是癌癥患者。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是免疫細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是非免疫細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)共有的優(yōu)勢免疫癌癥抗原。
8.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)共有的非優(yōu)勢免疫癌癥抗原。
9.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)和權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是EB病毒-無限增殖化的B-類淋巴母細(xì)胞系。
10.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)和權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是商陸促分裂原(PWM)激活的B-淋巴細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)和權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是CD40激活的B-淋巴細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)和權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是植物凝集素(PHA)+重組人白介素-2(rhIL-2)激活的PBMC。
13.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)和權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是植物凝集素(PHA)+重組人白介素-2(rhIL-2)+商陸促分裂原(PWM)激活的PBMC。
14.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)和權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)和權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是CD34+細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和cheratinocyte。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中組蛋白脫乙酰酶抑制劑被用于步驟d)。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述DNA降低甲基化試劑選自5-氮雜胞苷或5-氮雜-2’-脫氧胞苷。
18.可由權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法獲得的細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18所述細(xì)胞和/或其細(xì)胞組分在預(yù)防和治療不同組織型惡性腫瘤中的用途，所述惡性腫瘤組成型表達(dá)一種或多種癌癥抗原。
20.如權(quán)利要求19所述的用途，其中所述共有癌癥抗原是優(yōu)勢免疫癌癥抗原。
21.如權(quán)利要求18所述的用途，其中所述共有的癌癥抗原是非優(yōu)勢免疫的。
22.如權(quán)利要求18所述的用途，其中所述癌癥抗原是癌癥睪丸抗原。
23.如權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述細(xì)胞被貯存為混合抗原的儲存庫。
24.如權(quán)利要求23中所指的混合抗原用作癌癥疫苗。
25.含有權(quán)利要求18所述細(xì)胞的癌癥疫苗。
26.如權(quán)利要求25所述的疫苗，所述疫苗是自體的。
27.如權(quán)利要求25所述的疫苗，所述疫苗是同種異體的。
28.如權(quán)利要求27所述的疫苗，其中所述細(xì)胞按照權(quán)利要求23所述被使用。
29.如權(quán)利要求27或28所述的疫苗，其中使用了權(quán)利要求19所述的細(xì)胞組分。
30.權(quán)利要求18所述的細(xì)胞和/或其細(xì)胞組分在用于生成效應(yīng)免疫細(xì)胞的方法中的用途，所述效應(yīng)免疫細(xì)胞被用于制備在過繼免疫療法中有用的產(chǎn)品。
31.一種商品，其含有如權(quán)利要求25-29中任一項(xiàng)所述的疫苗和適于全身施用降低甲基化試劑的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生成抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括a.從受試者的體內(nèi)收集所述細(xì)胞；b.激活所述收集的細(xì)胞；c.離體培養(yǎng)和任選地擴(kuò)增所述被激活的細(xì)胞；d.用DNA降低甲基化試劑處理所述培養(yǎng)和任選擴(kuò)增的細(xì)胞以使所述細(xì)胞同時表達(dá)多種腫瘤相關(guān)抗原?？砂凑毡景l(fā)明方法獲得的細(xì)胞，以及其細(xì)胞組分單獨(dú)或與所述細(xì)胞相聯(lián)合，用于預(yù)防和治療不同組織型惡性腫瘤，所述惡性腫瘤組成型表達(dá)在所述細(xì)胞中表達(dá)的多種腫瘤相關(guān)抗原中的一種或多種。便利地是，所述細(xì)胞和/或細(xì)胞組分為疫苗的形式。由于所述疫苗能同時表達(dá)多種/所有甲基化－調(diào)節(jié)的腫瘤相關(guān)抗原，所以該疫苗優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。
文檔編號C12N15/85GK1537161SQ02815007
公開日2004年10月13日 申請日期2002年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月30日
發(fā)明者R·德桑提斯, R 德桑提斯 申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司