專利名稱：抗癌并使創(chuàng)傷愈合的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于使創(chuàng)傷愈合并用作抗腫瘤劑的含基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的制劑。所述抑制劑為肽，肽的序列與基質(zhì)金屬蛋白酶的酶原形式的切割位點(diǎn)有關(guān)。
背景技術(shù)：
在許多對(duì)損傷、中風(fēng)和腫瘤形成的生物學(xué)反應(yīng)中，血管發(fā)生或在體內(nèi)產(chǎn)生新血管的過程，是一個(gè)關(guān)鍵的步驟。當(dāng)進(jìn)行血管發(fā)生刺激時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，遷移，從細(xì)胞周期中撤回以及接著再次分化而形成功能上適于其組織環(huán)境的新血管。進(jìn)行血管發(fā)生的內(nèi)皮細(xì)胞降解在下面的基底膜并遷移，形成伸出到血管周圍基質(zhì)中的毛細(xì)血管芽。Ausprunk等，Microvasc.Rev.，1451-65(1977)。在大多數(shù)細(xì)胞中，血管發(fā)生處于一系列協(xié)同作用的氧敏感蛋白的嚴(yán)格控制之下，從而防止過多的血管形成的。
血管發(fā)生的一種關(guān)鍵蛋白介質(zhì)是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，即血管生長的一種強(qiáng)效刺激劑。血管內(nèi)皮生長因子是一種具有兩個(gè)由二硫鍵連接的23kDa亞基的二聚體糖蛋白。人們認(rèn)為血管內(nèi)皮生長因子影響細(xì)胞內(nèi)鈣的轉(zhuǎn)移、纖溶酶原激活物的誘導(dǎo)、纖溶酶原激活物抑制劑1的合成、內(nèi)皮細(xì)胞中己糖轉(zhuǎn)運(yùn)的刺激以及單核細(xì)胞遷移的體外促進(jìn)。由不同的mRNA剪接變體編碼的四個(gè)VEGF同工型似乎是同樣地能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的發(fā)生。每個(gè)同工型對(duì)細(xì)胞表面的蛋白聚糖具有不同的親和性；所述蛋白聚糖起VEGF的低親和性受體的作用。VEGF的121個(gè)氨基酸的同工型和165個(gè)氨基酸的同工型(VEGF121和VEGF165)以可溶的形式被分泌出來，而189個(gè)氨基酸殘基的同工型和206個(gè)氨基酸殘基的同工型則保持與細(xì)胞表面的結(jié)合，且對(duì)肝素具有強(qiáng)親和性。
已表征了血管內(nèi)皮生長因子的兩種高親和性受體。這些受體是VEGFR-1/Flt-1(fms樣酪氨酸激酶-1)和VEGFR-2/Kdr/Flk-1(包含受體/胎肝激酶-1的激酶插入域)。把這樣的受體分類為PDGF受體家族中的成員；但它們有7個(gè)而非5個(gè)在其胞外域中的免疫球蛋白樣環(huán)，且它們具有比通常在這個(gè)家族中觀察到的激酶插入片段長的激酶插入片段。雖然某些VEGF受體可以出現(xiàn)在單核細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞上，但VEGF受體的表達(dá)主要發(fā)生在血管內(nèi)皮細(xì)胞中。已報(bào)道了僅僅內(nèi)皮細(xì)胞才反應(yīng)于VEGF而增殖，且不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞可顯示出不同的反應(yīng)。
VEGF表達(dá)的方式提示，它參與正常血管系統(tǒng)的發(fā)育與維持，且參與腫瘤的血管發(fā)生。在鼠發(fā)育期間，在性交后(p.c.)的全部7.5天里，內(nèi)胚層表達(dá)VEGF；且室神經(jīng)外胚層在毛細(xì)管向內(nèi)生長階段產(chǎn)生VEGF。參見Breier等，Development，114521-523(1992)。在鵪鶉發(fā)育的第二天，卵黃囊形成血管的區(qū)域以及整個(gè)胚胎都顯示出VEGF的表達(dá)。另外，成年小鼠中的靠近簾式內(nèi)皮膜的表皮細(xì)胞，顯示出VEGF的持續(xù)表達(dá)；這提示一種在保持這種特定內(nèi)皮表型與功能方面的作用。
腫瘤細(xì)胞常常以高于正常細(xì)胞的3至10倍的水平表達(dá)VEGF。除此之外還證明了腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移是依賴血管發(fā)生的。Folkman等，J.Biol.Chem.，26710931-10934(1992)。因此，需要有能夠抑制VEGF表達(dá)及/或活性的試劑。
發(fā)明概述本發(fā)明提供減少血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的抗血管發(fā)生組合物及方法。對(duì)于各種各樣的治療目的，這樣的方法與組合物是有用的。例如，可以用本發(fā)明的組合物與方法來治療包括實(shí)體瘤的癌癥。除此之外還證明了所述組合物與方法對(duì)治療組織損傷是有用的，所述組織損傷包括創(chuàng)傷、手術(shù)切口、慢性創(chuàng)傷、心臟病、中風(fēng)等等。本發(fā)明的肽不僅抑制金屬蛋白酶，而且減少血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)?？紤]了各種各樣的局部洗劑、敷料以及腸胃外和非腸胃外給藥的組合物，以及用所述肽來抑制腫瘤生長和發(fā)生的方法。
因此，本發(fā)明涉及基質(zhì)金屬蛋白酶的肽抑制劑。這些肽抑制劑的氨基酸序列與跨基質(zhì)金屬蛋白酶兩個(gè)球形結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)相同或相關(guān)。某些類型的基質(zhì)金屬蛋白酶及其序列是已知的，包括基質(zhì)金屬蛋白酶-1，基質(zhì)金屬蛋白酶-2，基質(zhì)金屬蛋白酶-3，基質(zhì)金屬蛋白酶-4，基質(zhì)金屬蛋白酶-5，基質(zhì)金屬蛋白酶-6，基質(zhì)金屬蛋白酶-7，基質(zhì)金屬蛋白酶-8，和基質(zhì)金屬蛋白酶-9，基質(zhì)金屬蛋白酶-10，基質(zhì)金屬蛋白酶-11，基質(zhì)金屬蛋白酶-12，和基質(zhì)金屬蛋白酶-13。本發(fā)明考慮了所含氨基酸序列來源于所述基質(zhì)金屬蛋白酶任何一個(gè)的連接區(qū)的抑制劑。例如，本發(fā)明肽抑制劑的氨基酸序列可來源于基質(zhì)金屬蛋白酶-2序列(SEQ ID NO14)中從約氨基酸70到約氨基酸120的任何區(qū)，和所有其它基質(zhì)金屬蛋白酶的類似區(qū)。
本發(fā)明提供式(I)，(II)，(III)任何一個(gè)的肽Xaa-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非極性氨基酸；Xaa2是堿性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸樣氨基酸；Xaa5是極性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或極性氨基酸；Xaa9是脂族，非極性或堿性氨基酸；Xaa10是極性，酸性，堿性或非極性氨基酸；Xaa11是極性或芳族氨基酸；Xaa12是極性，堿性，脂族或非極性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，極性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非極性或極性氨基酸；Xaa15是非極性或酸性氨基酸；Xaa16是堿性，極性或非極性氨基酸；Xaa17是堿性，極性，脂族，非極性或酸性氨基酸；Xaa18是非極性或脂族氨基酸；Xaa19是堿性或脂族氨基酸；且其中所述肽能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1，基質(zhì)金屬蛋白酶-2，基質(zhì)金屬蛋白酶-3，基質(zhì)金屬蛋白酶-4，基質(zhì)金屬蛋白酶-5，基質(zhì)金屬蛋白酶-6，基質(zhì)金屬蛋白酶-7，基質(zhì)金屬蛋白酶-8，或基質(zhì)金屬蛋白酶-9，基質(zhì)金屬蛋白酶-10，基質(zhì)金屬蛋白酶-11，基質(zhì)金屬蛋白酶-12，和基質(zhì)金屬蛋白酶-13的活性。在某些實(shí)施方案中，所述肽可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2，基質(zhì)金屬蛋白酶-3，基質(zhì)金屬蛋白酶-7，基質(zhì)金屬蛋白酶-8，或基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性。
非極性氨基酸可以是，例如，甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。堿性氨基酸，例如，可以是組氨酸，賴氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鳥氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，或2，4-二氨基丁酸。本發(fā)明的半胱氨酸樣氨基酸包括，例如，半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸。
脂族氨基酸包括，例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸。酸性氨基酸包括，例如，天門冬氨酸或谷氨酸。極性氨基酸包括，例如，天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙?；嚢彼幔琢虬彼醽嗧?，或高絲氨酸，或非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。本發(fā)明的芳族氨基酸可以是，例如，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4四氫-異喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸。
本發(fā)明還提供式(IV)的肽(SEQ ID NO18)Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)其中Xaaa是脯氨酸；Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸； Xaa2是精氨酸；Xaac是蘇氨酸；Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸；Xaa4是甘氨酸；Xaae是天門冬氨酸或谷氨酸；Xaa5是纈氨酸或天門冬酰胺；Xaaf是亮氨酸； Xaa6是脯氨酸；Xaag是天門冬氨酸； Xaa7是天門冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或絲氨酸；Xaa8是纈氨酸或亮氨酸；Xaai是天門冬酰胺或丙氨酸； Xaa9是丙氨酸或甘氨酸；Xaaj是蘇氨酸； Xaa10是天門冬酰胺或精氨酸；Xaak是異亮氨酸或亮氨酸；Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸；XaaL是谷氨酸或賴氨酸； Xaa12是天門冬酰胺或谷氨酰胺；Xaam是蘇氨酸或丙氨酸； Xaa13是苯丙氨酸或蘇氨酸；Xaan是甲硫氨酸；Xaa14是苯丙氨酸；Xaao是精氨酸； Xaa15是脯氨酸或谷氨酸；Xaap是賴氨酸或蘇氨酸； Xaa16是精氨酸或甘氨酸；Xaa17是賴氨酸或天門冬氨酸； Xaa18是脯氨酸或亮氨酸；Xaa19是賴氨酸；且其中所述肽能夠抑制金屬蛋白酶的活性。例如，所述基質(zhì)金屬蛋白酶可以是基質(zhì)金屬蛋白酶-1，基質(zhì)金屬蛋白酶-2，基質(zhì)金屬蛋白酶-3，基質(zhì)金屬蛋白酶-4，基質(zhì)金屬蛋白酶-5，基質(zhì)金屬蛋白酶-6，基質(zhì)金屬蛋白酶-7，基質(zhì)金屬蛋白酶-8，和基質(zhì)金屬蛋白酶-9，基質(zhì)金屬蛋白酶-10，基質(zhì)金屬蛋白酶-11，基質(zhì)金屬蛋白酶-12，或基質(zhì)金屬蛋白酶-13。優(yōu)選的肽可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2或基質(zhì)金屬蛋白酶-9。
可以衍生本發(fā)明肽抑制劑的連接區(qū)具有例如SEQ ID NO14的約70-到約120位的氨基酸，和其它基質(zhì)金屬蛋白酶的類似區(qū)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明肽抑制劑具有SEQ ID NO14的約77到約110位的氨基酸序列，和其它基質(zhì)金屬蛋白酶的類似區(qū)。某些肽抑制劑的例子包括含有氨基酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，或SEQID NO13的那些。
本發(fā)明的肽對(duì)不同的基質(zhì)金屬蛋白酶具有不同的親和性。例如，在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽抑制劑可以約1.0μM-約500.0μM的ki值抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2。在另一實(shí)施方案中，所述肽抑制劑可以約1.0μM-400.0μM的ki值抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2。在另一實(shí)施方案中，所述肽抑制劑可以約1.0μM-約50.0μM的ki值抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有治療有效量的本發(fā)明的肽和藥學(xué)上可接受載體的組合物，該組合物能夠減少血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)。所述組合物可用于治療各種癌癥、腫瘤和其它疾病。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于治療創(chuàng)傷或使老化作用逆轉(zhuǎn)的方法，包括給予治療有效量的式I，II，III或IV的肽Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO21)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非極性氨基酸；Xaa2是堿性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸樣氨基酸；Xaa5是極性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸，Xaa8是脂族或極性氨基酸；Xaa9是脂族，非極性或堿性氨基酸；和Xaa10是極性，酸性，堿性或非極性氨基酸；Xaa11是極性或芳族氨基酸；Xaa12是極性，堿性，脂族或非極性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，極性或酸性氨基酸；
Xaa14是芳族，非極性或極性氨基酸；Xaa15是非極性或酸性氨基酸；Xaa16是堿性，極性或非極性氨基酸；Xaa17是堿性，極性，脂族，非極性或酸性氨基酸；Xaa18是非極性或脂族氨基酸；Xaa19是堿性或脂族氨基酸；Xaaa是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸；Xaac是蘇氨酸；Xaad是甘氨酸；Xaae是天門冬氨酸或谷氨酸；Xaaf是亮氨酸；Xaag是天門冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或絲氨酸；Xaai是天門冬酰胺或丙氨酸；Xaaj是蘇氨酸；Xaak是異亮氨酸或亮氨酸；XaaL是谷氨酸或賴氨酸；Xaam是蘇氨酸或丙氨酸；Xaan是甲硫氨酸；Xaao是精氨酸；Xaap是賴氨酸或蘇氨酸；其中所述肽能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。
本發(fā)明肽中的非極性氨基酸可以是，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。堿性氨基酸可以是，例如，組氨酸，賴氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鳥氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸。半胱氨酸樣氨基酸可以是，例如，半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸。脂族氨基酸可以是，例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸。酸性氨基酸可以是，例如，天門冬氨酸或谷氨酸。極性氨基酸可以是天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙?；嚢彼?，甲硫氨酸亞砜，或高絲氨酸，或非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。芳族氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療創(chuàng)傷或改善老化作用的方法，包括給予治療有效量的SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，或SEQ IDNO13的肽。
本發(fā)明的肽的其它可能的臨床應(yīng)用領(lǐng)域包括特征在于過多血管發(fā)生的疾病。所述疾病的例子時(shí)黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病。


圖1提供所選MMP酶原的切割跨越區(qū)的CLUSTAL XTM(1.8版本)多重序列比對(duì)。圖1A提供突出顯示保守殘基的序列比對(duì)，其中‘*’表示序列之間完全相同，‘’表示7/9保守位置，‘.’表示與大多數(shù)保守取代相比，有超過80％的位置相同。圖1B中的粗體表示異質(zhì)性的位置。
圖2提供MMP-1酶原的結(jié)構(gòu)(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檔案1FBL.ENT)。表1所示SEQ ID NOS2-10的區(qū)域跨越了兩個(gè)大結(jié)構(gòu)域之間的短區(qū)。該區(qū)在活化過程中切割。
圖3提供MMP-9的三維模型。產(chǎn)生活性蛋白酶N-末端的切割區(qū)用交叉陰影線表示。兩個(gè)鋅離子用球形表示。切割結(jié)構(gòu)域肽可與其在酶原中的標(biāo)準(zhǔn)位置附近的MMP結(jié)合。這種結(jié)合(也接近催化鋅)可空間位阻性阻斷活性位點(diǎn)的一部分。這種阻斷可阻礙底物結(jié)合。
圖4舉例說明利用19聚體(SEQ ID NO11)切割結(jié)構(gòu)域肽對(duì)MMP-9活性的抑制。MMP-9是在進(jìn)行FRET測定之前與19聚體(SEQ ID NO11)肽混合的。19聚體(SEQ ID NO11)肽的濃度如下0mM(實(shí)心圓形)，0.01mM(空心圓形)，0.03mM(實(shí)心正方形)，0.06mM(空心正方形)，0.125mM(實(shí)心三角形)，0.25mM(空心三角形)，0.5mM(x′s)，1mM(倒實(shí)心三角形)，2mM(倒空心三角形)。
圖5舉例說明利用10聚體(SEQ ID NO13)切割結(jié)構(gòu)域肽對(duì)MMP-9活性的抑制。MMP-9是在進(jìn)行FRET測定之前與10聚體(SEQ ID NO13)肽混合的。10聚體(SEQ ID NO13)肽的濃度如下0mM(實(shí)心三角形)，0.25mM(空心三角形)，0.5mM(空心倒三角形)，1.0mM(實(shí)心倒三角形)，2.0mM(x′s)。
圖6舉例說明利用9聚體(SEQ ID NO12)切割結(jié)構(gòu)域肽對(duì)MMP-9活性的抑制。MMP-9是在進(jìn)行FRET測定之前與9聚體(SEQ ID NO12)肽混合的。9聚體(SEQ ID NO12)肽的濃度如下0mM(實(shí)心三角形)，0.25mM(空心三角形)，0.5mM(空心倒三角形)，1.0mM(實(shí)心倒三角形)，2.0mM(x′s)。
圖7舉例說明利用19聚體(SEQ ID NO11)切割結(jié)構(gòu)域肽對(duì)MMP-9活性的抑制。MMP-9是在進(jìn)行熒光膠原測定之前與19聚體(SEQ IDNO11)肽混合的。19聚體(SEQ ID NO11)肽的濃度如下0mM(實(shí)心圓形)，0.06mM(空心菱形)，0.1mM(空心正方形)，0.25mM(空心圓形)，0.5mM(x′s)。
圖8舉例說明利用19聚體(SEQ ID NO11)切割結(jié)構(gòu)域肽對(duì)MMP-9活性的抑制。MMP-9是在進(jìn)行熒光膠原測定之前與19聚體(SEQ IDNO11)肽混合的。19聚體(SEQ ID NO11)肽的濃度如下0mM(實(shí)心圓形)，0.06mM(空心菱形)，0.1mM(空心正方形)，0.25mM(空心圓形)，0.5mM(x′s)。
圖9舉例說明利用10聚體(SEQ ID NO13)切割結(jié)構(gòu)域肽對(duì)MMP-9活性的長時(shí)間抑制。MMP-9是在進(jìn)行熒光膠原測定之前，與10聚體(SEQ ID NO13)肽混合的。10聚體(SEQ ID NO13)肽的濃度如下0mM(空心圓形)，0.1mM(空心菱形)，0.2mM(空心正方形)，0.4mM(x′s)。
圖10舉例說明利用9聚體(SEQ ID NO12)切割結(jié)構(gòu)域肽對(duì)MMP-9活性的長時(shí)間抑制。MMP-9是在進(jìn)行熒光膠原測定之前與9聚體(SEQID NO12)肽混合的。9聚體(SEQ ID NO12)肽的濃度如下0mM(實(shí)心圓形)，0.06mM(空心菱形)，0.1mM(空心正方形)，0.25mM(空心圓形)，0.5mM(x′s)。
圖11提供典型剪接反應(yīng)的HPLC洗脫曲線。箭頭表示隨著反應(yīng)過程的進(jìn)行，第一個(gè)峰(MMP-9酶原的峰)的面積減少，其次的兩個(gè)峰(分別為成熟的MMP-9和N-末端切割產(chǎn)物)的面積增加。
圖12舉例說明利用基質(zhì)溶素(stromilysin)將MMP-9酶原轉(zhuǎn)化成N-末端和C-末端結(jié)構(gòu)域。MMP-9酶原與基質(zhì)溶素在0(實(shí)心圓形)，0.5μM(空心正方形)或1.0μM(實(shí)心正方形)19聚體(SEQ ID NO11)肽存在的條件下反應(yīng)。在指定時(shí)間除去等分試樣，然后進(jìn)行HPLC。求MMP酶原峰面積的積分，并把零時(shí)間點(diǎn)的樣品設(shè)為100％?？招膱A形表示在沒有基質(zhì)溶素或19聚體(SEQ ID NO11)肽的緩沖液中溫育的MMP酶原。
圖13A提供19聚體(SEQ ID NO11)抑制劑肽與MMP-9相互作用的等溫滴定量熱分析。各峰表示通過注射以及隨后的結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的熱量。圖13B提供通過相對(duì)于時(shí)間求圖13A各注射峰值的積分所產(chǎn)生的結(jié)合等溫線。
圖14提供19聚體(SEQ ID NO11)抑制劑肽與MMP-2相互作用的等溫滴定量熱分析。圖14A提供25℃時(shí)，在20mM二甲胂酸鹽(pH6.8)，10mM NaCl中，將19聚體(SEQ ID NO11)(1mM)滴定成MMP2(20μM)的原始等溫量熱數(shù)據(jù)。各峰表示通過注射以及隨后的結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的熱量。圖14B提供通過相對(duì)于時(shí)間求圖14A各注射峰值的積分所產(chǎn)生的結(jié)合等溫線。
圖15提供當(dāng)19聚體(SEQ ID NO11)肽在固定的MMP-9的表面上流過時(shí)，所產(chǎn)生的表面等離子共振結(jié)合等溫線。
圖16提供用兩種濃度的肽進(jìn)行治療后，與陽性對(duì)照組相比，皮膚模型中活細(xì)胞百分比的柱狀圖。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)處理過的第一份樣品為陽性對(duì)照，可用于確立代表100％存活的細(xì)胞數(shù)。第二份樣品是陰性對(duì)照，其中的細(xì)胞與1％Triton-X100接觸，表示該測定法可檢測細(xì)胞的死亡。接下來的三份樣品是濃度為500μM的19聚體(SEQ IDNO11)，10聚體(SEQ ID NO13)，和9聚體(SEQ ID NO12)肽。最后三份樣品是濃度為2mM的19聚體(SEQ ID NO11)，10聚體(SEQ IDNO13)，和9聚體(SEQ ID NO12)肽。所給出的數(shù)據(jù)代表三次試驗(yàn)的平均值。
圖17以圖形的形式描述了db/db糖尿病小鼠中，創(chuàng)傷愈合的時(shí)間過程。該圖表示對(duì)于用標(biāo)準(zhǔn)鹽水(空心圓形)或20μg/mL 19聚體肽(SEQID NO11)(實(shí)心圓形)處理過的小鼠而言，相對(duì)的平均創(chuàng)傷面積與創(chuàng)傷后的天數(shù)。所給出的數(shù)據(jù)表示10只受試動(dòng)物的平均相對(duì)創(chuàng)傷直徑。
圖18舉例說明，與未處理細(xì)胞相比，19聚體(SEQ ID NO11)肽顯著抑制或阻遏VEGF表達(dá)。該圖提供了含有用19聚體(SEQ ID NO11)肽和已知刺激或抑制VEGF表達(dá)的試劑處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠的照片。第1道提供了DNA標(biāo)記。第2道提供了未處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物(陰性對(duì)照)。第3道提供了用已知刺激VEGF表達(dá)的5μL 100μM的氯化鈷(CoCl2)處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物，并且因此用作陽性對(duì)照。第4道提供了用來自已知增加血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)表達(dá)的缺氧可誘導(dǎo)的因子1α的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(ODD)的肽處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物。第5道提供了用用于將來自缺氧可誘導(dǎo)的因子1α的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(ODD)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)至成纖維細(xì)胞中的TAP ExpressTM(Gene TherapySystems，CA)處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物。第6道提供了用200μL 10mg/ml的19聚體(SEQ ID NO11)處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物。如圖中所示，陰性對(duì)照(未處理的成纖維細(xì)胞)產(chǎn)生了微弱但容易分辨的VEGF帶。氯化鈷的使用與對(duì)照組相比提供了增加的VEGF表達(dá)。然而，出乎意料的結(jié)果是用19聚體(SEQ ID NO11)肽處理的成纖維細(xì)胞中的VEGF表達(dá)被完全抑制。
圖19進(jìn)一步舉例說明，與未處理細(xì)胞相比，19聚體(SEQ ID NO11)肽顯著抑制或阻遏VEGF表達(dá)。該圖提供了含有用19聚體(SEQ ID NO11)肽和已知刺激或抑制VEGF表達(dá)的試劑處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠的照片。第1道提供了DNA標(biāo)記。第2和3道提供了來自未處理的成纖維細(xì)胞的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的PCR RT產(chǎn)物(陰性對(duì)照)。第4和5道提供了用已知刺激VEGF表達(dá)的5μL 100μM的氯化鈷(CoCl2)處理的成纖維細(xì)胞的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的PCR RT產(chǎn)物，并且因此用作陽性對(duì)照。第6和7道提供了用來自已知增加血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)表達(dá)的缺氧可誘導(dǎo)的因子1α的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(ODD)的肽處理的成纖維細(xì)胞的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的PCR RT產(chǎn)物。第8和9道提供了用200μL 10mg/ml的19聚體(SEQ ID NO11)處理的成纖維細(xì)胞的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的PCR RT產(chǎn)物。如圖中所示，19聚體(SEQ ID NO11)肽再次完全抑制了成纖維細(xì)胞中的VEGF表達(dá)。
圖20也舉例說明，與未處理細(xì)胞相比，19聚體(SEQ ID NO11)肽顯著抑制或阻遏VEGF表達(dá)。該圖提供了含有用19聚體(SEQ ID NO11)肽和已知刺激或抑制VEGF表達(dá)的試劑處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠的照片。第1道提供了DNA標(biāo)記。第2道提供了用已知刺激VEGF表達(dá)的5μL 100μM的氯化鈷(CoCl2)處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物，并且因此用作陽性對(duì)照，其中使用了由VEGF、β肌動(dòng)蛋白和GAPDH組成的引物混合物。第3道提供了未處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物(陰性對(duì)照)。第4道提供了用已知刺激VEGF表達(dá)的5μL 100μM的氯化鈷(CoCl2)處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物，并且因此用作陽性對(duì)照。第5道提供了用用于將來自缺氧可誘導(dǎo)的因子1α的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(ODD)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)至成纖維細(xì)胞中的TAP ExpressTM(Gene Therapy Systems，CA)處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物。第6道提供了用來自已知增加血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)表達(dá)的缺氧可誘導(dǎo)的因子1α的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(ODD)的肽處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物。第7道提供了用用于將來自缺氧可誘導(dǎo)的因子1α的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(ODD)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)至成纖維細(xì)胞中的TAP ExpressTM(Gene Therapy Systems，CA)處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物。第8道提供了用200μL 10mg/ml的19聚體(SEQ ID NO11)處理的成纖維細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物。如圖中所示，19聚體(SEQ ID NO11)肽再次完全抑制了成纖維細(xì)胞中的VEGF表達(dá)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供可用于阻遏血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，用于抑制腫瘤生長和發(fā)展并且用于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。
基質(zhì)金屬蛋白酶是作為無活性的酶原在體內(nèi)產(chǎn)生的。酶原的蛋白酶切割可導(dǎo)致成熟基質(zhì)金屬蛋白酶的活化及形成。切割下來的肽序列是在蛋白的最氨基末端發(fā)現(xiàn)的，長度約為100-110個(gè)氨基酸的酶原前導(dǎo)序列。根據(jù)本發(fā)明，這些酶原前導(dǎo)肽可阻斷基質(zhì)金屬蛋白酶的活性位點(diǎn)并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。基質(zhì)金屬蛋白酶的酶原前導(dǎo)肽的給藥可降低胞外基質(zhì)破壞的速度，并提供更快速的創(chuàng)傷愈合。
大多數(shù)抑制策略都包括使用有機(jī)小分子阻礙基質(zhì)金屬蛋白酶的酶活性。這些化合物對(duì)于機(jī)體常常是有毒的，而且不是天然存在的分子。使用天然肽抑制活化的基質(zhì)金屬蛋白酶可提供更高程度的蛋白酶控制，而且沒有毒副作用。與小分子抑制策略不同，本發(fā)明的肽可用于同時(shí)抑制全部或單個(gè)基質(zhì)金屬蛋白酶種類的活化。所述肽可被隨意引入到皮膚上，引入到創(chuàng)傷環(huán)境中，或通過皮膚遮蓋物或創(chuàng)傷敷料而被固定，或遞送。
本發(fā)明提供對(duì)酶原活性水平的更高程度控制，從而使慢性創(chuàng)傷愈合并改善老化作用。例如，由于在慢性創(chuàng)傷愈合過程中需要一定量的蛋白酶水平(Agren等，1999)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可選擇僅僅部分抑制蛋白酶活性。通過調(diào)節(jié)所用抑制劑肽的類型和量，可控制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制的程度。
肽根據(jù)本發(fā)明，所含序列與切割位點(diǎn)區(qū)中的基質(zhì)金屬蛋白酶酶原前導(dǎo)序列有關(guān)的肽可用于抑制許多類型基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。基質(zhì)金屬蛋白酶酶原前導(dǎo)序列的切割位置在酶原氨基酸序列的大約110位氨基酸處。本發(fā)明肽抑制劑的序列與酶原氨基酸70位-大約120位內(nèi)的任何區(qū)有關(guān)。這種肽可抑制許多類型基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。本發(fā)明的肽還可阻礙酶原基質(zhì)金屬蛋白酶的活化，并抑制成熟基質(zhì)金屬蛋白酶的酶活性。所含序列在各種基質(zhì)金屬蛋白酶中更加保守的肽，例如，所含序列朝向切割區(qū)N-末端側(cè)的肽，可用于提供普遍有效拮抗各種基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑。然而，所含序列保守程度較低的肽，例如，所含序列朝向切割區(qū)C-末端側(cè)的肽，可用于提供對(duì)單個(gè)基質(zhì)金屬蛋白酶特異的抑制劑。
因此，本發(fā)明考慮了可作為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的，所含序列來源于基質(zhì)金屬蛋白酶任何酶原前導(dǎo)區(qū)的肽，還考慮了其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代了天然存在于基質(zhì)金屬蛋白酶中的氨基酸的變體肽。還考慮了具有不同序列的肽的混合物。
通常，配制肽，肽變體和肽混合物，并以使防止腫瘤形成、腫瘤減少、創(chuàng)傷愈合或健康組織再生達(dá)到最佳的方式使用。因此，只要能夠抑制腫瘤發(fā)展并且促進(jìn)愈合，就可改變本發(fā)明的肽組合物和制劑，從而獲得更低或更高水平的抑制。
肽抑制劑的大小可以改變。通常，僅僅約有5個(gè)氨基酸的肽太小，以致不能提供最佳的抑制。然而，超過大約8-9個(gè)氨基酸的肽就足夠長，以提供抑制。因此，雖然全長并不是關(guān)鍵性的，但本發(fā)明中常使用長于8個(gè)氨基酸的肽。本發(fā)明所用的其它肽長于9個(gè)氨基酸。本發(fā)明使用的其它肽長于10個(gè)氨基酸。此外，本發(fā)明還使用了長于約15個(gè)氨基酸的肽。
肽的大小沒有特定的上限。然而一般說來，使用較短的肽比使用較長的肽更便宜。因此，本發(fā)明的肽抑制劑通常短于約100個(gè)氨基酸。本發(fā)明所用的許多肽抑制劑都短于約50個(gè)氨基酸。本發(fā)明所用的其它肽抑制劑短于約30個(gè)氨基酸。還可使用短于約25個(gè)氨基酸的肽。同樣，本發(fā)明還可使用短于約23個(gè)氨基酸的肽。用于進(jìn)行本發(fā)明的肽的例子是具有19個(gè)氨基酸的SEQ ID NO11。
表1提供了來源于酶原氨基酸約70位-約120位的若干代表性基質(zhì)金屬蛋白酶的序列。
表1基質(zhì)金屬蛋白酶切割區(qū)的序列

表1所列的各個(gè)肽，以及具有SEQ ID NO1，11，12和13的肽被考慮為本發(fā)明的肽抑制劑。此外，具有SEQ ID NO1-13任何一個(gè)的肽變體和肽衍生物也可用作肽抑制劑。這種肽變體和衍生物可具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，缺失，插入或其它修飾，只要所述肽變體或衍生物可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶。
分離肽的氨基酸殘基可以是上述任何一個(gè)的，遺傳編碼的L-氨基酸，天然存在的非遺傳編碼的L-氨基酸，合成的L-氨基酸或D-對(duì)映異構(gòu)體。這里所用的20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸和通用非編碼的氨基酸的符號(hào)是傳統(tǒng)約定的，并在表2中列出。
表2


可使用具有相似化學(xué)和/或物理性質(zhì)的氨基酸取代包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，只要這些變體或衍生的肽仍保留有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，刺激成纖維細(xì)胞或角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞生長，或刺激成纖維細(xì)胞的細(xì)胞遷移的能力。
彼此可以取代的氨基酸通常存在于相似的種類或亞類中。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，氨基酸可分成三個(gè)主要的種類親水氨基酸，疏水氨基酸和半胱氨酸樣氨基酸，這主要取決于氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)。這些主要種類又可進(jìn)一步分成亞類。親水氨基酸包括具有酸性，堿性或極性側(cè)鏈的氨基酸，疏水氨基酸包括具有芳族或非極性側(cè)鏈的氨基酸。非極性氨基酸又可進(jìn)一步細(xì)分成，包括除其它之外的脂族氨基酸。這里所用氨基酸種類的定義如下“疏水氨基酸”是指側(cè)鏈在生理pH值下不帶電，而且被水溶液排斥的氨基酸。遺傳編碼的疏水氨基酸的例子包括Ile，Leu和Val。非遺傳編碼的疏水氨基酸的例子包括t-BuA。
“芳族氨基酸”是指側(cè)鏈含有至少一個(gè)具有共軛π-電子體系的環(huán)(芳基)的疏水氨基酸。芳基可進(jìn)一步被取代基，如烷基，烯基，炔基，羥基，磺酰基，硝基和氨基等取代。遺傳編碼的芳族氨基酸的例子包括苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。常見的非遺傳編碼的芳族氨基酸包括苯甘氨酸，2-萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
“非極性氨基酸”是指側(cè)鏈在生理pH值下通常不帶電，而且是非極性的疏水氨基酸。遺傳編碼的非極性氨基酸的例子包括甘氨酸，脯氨酸和甲硫氨酸。非編碼的非極性氨基酸的例子包括Cha。
“脂族氨基酸”是指具有飽和或不飽和的直鏈，支鏈或環(huán)狀烴側(cè)鏈的非極性氨基酸。遺傳編碼的脂族氨基酸的例子包括Ala，Leu，Val和Ile。非編碼的脂族氨基酸的例子包括Nle。
“親水氨基酸”是指側(cè)鏈被水溶液吸引的氨基酸。遺傳編碼的親水氨基酸的例子包括Ser和Lys。非編碼的親水氨基酸的例子包括Cit和hCys。
“酸性氨基酸”是指側(cè)鏈pK值小于7的親水氨基酸。酸性氨基酸通常具有因?yàn)槭潆x子而在生理pH值下帶負(fù)電的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸的例子包括天門冬氨酸(天門冬氨酸鹽)和谷氨酸(谷氨酸鹽)。
“堿性氨基酸”是指側(cè)鏈pK值大于7的親水氨基酸。堿性氨基酸通常具有因?yàn)榕c水合氫離子締合而在生理pH下帶正電的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸的例子包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。非遺傳編碼的堿性氨基酸的例子包括非-環(huán)狀氨基酸鳥氨酸，2，3二氨基丙酸，2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“極性氨基酸”是指側(cè)鏈在生理pH值下不帶電的親水氨基酸，但在它所具有的鍵中，通常由兩個(gè)原子共有的電子對(duì)被其中一個(gè)原子更緊密地占有。遺傳編碼的極性氨基酸的例子包括天門冬酰胺和谷氨酰胺。非遺傳編碼的極性氨基酸的例子包括瓜氨酸，N-乙?；嚢彼岷图琢虬彼醽嗧俊?br> “半胱氨酸樣氨基酸”是指側(cè)鏈能夠與另外一個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈形成共價(jià)鍵，如二硫鍵的氨基酸。通常，半胱氨酸樣氨基酸的側(cè)鏈含有至少一個(gè)巰基(SH)。遺傳編碼的半胱氨酸樣氨基酸的例子包括半胱氨酸。非遺傳編碼的半胱氨酸樣氨基酸的例子包括高半胱氨酸和青霉胺。
本領(lǐng)域那些技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，上述分類不是絕對(duì)的。很多氨基酸都具有不止一種性質(zhì)，并因此可被包括在不止一個(gè)種類中。例如，酪氨酸既具有芳環(huán)又具有極性羥基。因此，酪氨酸具有雙重性質(zhì)，可包括在芳族和極性類中。同樣，除了能夠形成二硫鍵外，半胱氨酸還具有非極性的特性。因此，雖然不能被嚴(yán)格分為疏水或非極性氨基酸，但在很多情況下，半胱氨酸可用于賦予肽疏水性。
一些常見的氨基酸，即，它不是遺傳編碼的，而且存在于本發(fā)明的肽及肽類似物中，或取代本發(fā)明肽及肽類似物中的氨基酸，包括，但不限制于，β-丙氨酸(b-Ala)和其它ω-氨基酸，如3-氨基丙酸(Dap)，2，3-二氨基丙酸(Dpr)，4-氨基丁酸等；α-氨基異丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；甲基甘氨酸(MeGly)；鳥氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔-丁基丙氨酸(t-BuA)；叔-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基異亮氨酸(MeIle)；苯甘氨酸(Phg)；環(huán)己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亞砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙?；嚢彼?AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，3-二氨基丁酸(Dbu)；ρ-氨基苯丙氨酸(Phe(ρNH2))；N-甲基纈氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高絲氨酸(hSer)。這些氨基酸也落在上面定義的種類中。
上述遺傳編碼的和非編碼的氨基酸的分類在下面的表3中概括。應(yīng)當(dāng)理解表3僅僅用于舉例說明，而不意味著對(duì)可構(gòu)成這里所述的肽和肽類似物的氨基酸殘基的窮舉。用于制備這里所述的肽和肽類似物的其它氨基酸殘基可在，例如，F(xiàn)asman，1989，CRC Practical Handbookof Biochemistry and Molecular Biology，CRC Press，Inc.，和這里引用的參考文獻(xiàn)中找到。對(duì)于這里沒有具體提到的氨基酸，可通過與具體鑒定過的氨基酸的已知行為和/或它們的化學(xué)和/或物理性質(zhì)進(jìn)行比較而常規(guī)分到上述種類中。
表3

本發(fā)明肽的任何氨基酸都可被任何相似分類的氨基酸取代，從而產(chǎn)生變體或衍生肽，只要肽的變體或衍生物仍保留有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的能力。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽抑制劑包括肽式I，II或III的任何一個(gè)。
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非極性氨基酸，例如，甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸；Xaa2是堿性氨基酸，例如，組氨酸，賴氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鳥氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸；Xaa3是半胱氨酸樣氨基酸，例如，半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸；Xaa5是極性或脂族氨基酸，例如，極性氨基酸，如天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙?；嚢彼?，甲硫氨酸亞砜，或高絲氨酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸；Xaa7是酸性氨基酸，例如，天門冬氨酸或谷氨酸；Xaa8是脂族或極性氨基酸，例如脂族氨基酸，如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸，或極性氨基酸，如天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基賴氨酸，甲硫氨酸亞砜，或高絲氨酸；Xaa9是脂族，非極性或堿性氨基酸，例如，脂族氨基酸，如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸，非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸，或堿性氨基酸，如組氨酸，賴氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鳥氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸；Xaa10是極性，酸性，堿性或非極性氨基酸，例如，極性氨基酸，如天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙?；嚢彼?，甲硫氨酸亞砜，或高絲氨酸，酸性氨基酸，如天門冬氨酸或谷氨酸，堿性氨基酸，如組氨酸，賴氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鳥氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸，或非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸；Xaa11是極性或芳族氨基酸，例如，極性氨基酸，如天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙?；嚢彼幔琢虬彼醽嗧浚蚋呓z氨酸，或芳族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸；Xaa12是極性，堿性，脂族或非極性氨基酸，例如，極性氨基酸，如天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基賴氨酸，甲硫氨酸亞砜，或高絲氨酸，或堿性氨基酸，如組氨酸，賴氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鳥氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸，或非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸；Xaa13是芳族，脂族，極性或酸性氨基酸，例如，芳族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸，或極性氨基酸，如天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙?；嚢彼?，甲硫氨酸亞砜，或高絲氨酸，或酸性氨基酸，如天門冬氨酸或谷氨酸；Xaa14是芳族，非極性或極性氨基酸，例如，芳族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸，或非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸，或極性氨基酸，如天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙?；嚢彼?，甲硫氨酸亞砜，或高絲氨酸；Xaa15是非極性或酸性氨基酸，例如，非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸，或酸性氨基酸如天門冬氨酸或谷氨酸；Xaa16是堿性，極性或非極性氨基酸，例如，堿性氨基酸，如組氨酸，賴氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鳥氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸，或極性氨基酸，如天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙?；嚢彼幔琢虬彼醽嗧?，或高絲氨酸，或非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸；Xaa17是堿性，極性，脂族，非極性或酸性氨基酸，例如，堿性氨基酸，如組氨酸，賴氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鳥氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸，或極性氨基酸，如天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙?；嚢彼?，甲硫氨酸亞砜，或高絲氨酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸，或非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸，酸性氨基酸，如天門冬氨酸或谷氨酸；Xaa18是非極性或脂族氨基酸，例如，非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸；Xaa19是堿性或脂族氨基酸，例如，堿性氨基酸，如，組氨酸，賴氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鳥氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸，或脂族氨基酸，如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸；在某些實(shí)施方案中Xaa1是脯氨酸，Xaa2是精氨酸，Xaa3是半胱氨酸，Xaa4是甘氨酸，Xaa5是纈氨酸或天門冬酰胺，Xaa6是脯氨酸，Xaa7是天門冬氨酸，Xaa8是纈氨酸，亮氨酸或絲氨酸，Xaa9是丙氨酸，甘氨酸或組氨酸，Xaa10是天門冬酰胺，天門冬氨酸，組氨酸，精氨酸，谷氨酰胺或甘氨酸，Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸，Xaa12是天門冬酰胺，絲氨酸，精氨酸，谷氨酰胺，纈氨酸，或甲硫氨酸，Xaa13是苯丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，或谷氨酸，Xaa14是苯丙氨酸，甲硫氨酸或蘇氨酸，Xaa15是脯氨酸或谷氨酸，Xaa16是精氨酸，天門冬酰胺或甘氨酸，Xaa17是賴氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，天門冬氨酸或天門冬酰胺，Xaa18是脯氨酸或亮氨酸，Xaa19是賴氨酸，纈氨酸或精氨酸。
本發(fā)明理想的肽包括由SEQ ID NO1-13限定的序列。例如，具有SEQ ID NO11的19個(gè)氨基酸的肽(PRCGNPDVANYNFFPRKPK)是理想的。該肽(SEQ ID NO11)跨越MMP-2的切割位點(diǎn)。兩個(gè)較小的肽(PRCGNPDVA(SEQ ID NO12))和NYNFFPRKPK(SEQ ID NO13))代表了SEQ ID NO11肽的一半，也是理想的肽。所有這三個(gè)肽都可抑制MMP-9的活性并抑制其它基質(zhì)金屬蛋白酶至不同的程度。
所含序列與基質(zhì)金屬蛋白酶切割區(qū)的序列相同的單一肽可用于抑制單個(gè)或僅僅幾個(gè)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。這種單一肽的制劑可抑制一個(gè)或多個(gè)，但不是全部的基質(zhì)金屬蛋白酶?；|(zhì)金屬蛋白酶活性的這種部分抑制促進(jìn)愈合?？蛇x擇性地，可把兩個(gè)或多個(gè)肽組合，從而針對(duì)兩個(gè)或多個(gè)基質(zhì)金屬蛋白酶，提供對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶活性的更完全抑制。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用現(xiàn)有的教導(dǎo)和這里提供的教導(dǎo)，設(shè)計(jì)一種適宜的肽抑制劑或肽抑制劑的組合，從而獲得所需的抑制質(zhì)量和數(shù)量。抑制“質(zhì)量”是指所抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的類型。不同的基質(zhì)金屬蛋白酶可具有多少不同的底物及活性位點(diǎn)。抑制的“數(shù)量”是指抑制所有基質(zhì)金屬蛋白酶的總體量。通過調(diào)節(jié)所用肽抑制劑的類型和量，可調(diào)節(jié)抑制的質(zhì)量和數(shù)量。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可很容易地對(duì)本發(fā)明提供的肽進(jìn)行修飾，并觀察被抑制的基質(zhì)金屬蛋白酶的類型和程度。
例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對(duì)圖1所示的肽序列進(jìn)行比較和比對(duì)，并設(shè)計(jì)出一種肽抑制劑，從而獲得所需的抑制質(zhì)量和數(shù)量。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，通過實(shí)施例提供了對(duì)三處創(chuàng)傷位點(diǎn)的基質(zhì)金屬蛋白酶，mmp2，mmp9和mmp1的比對(duì)的氨基酸序列進(jìn)行的比較，從而鑒定序列中的同源區(qū)和趨異區(qū)。
MMP序列SEQ ID NOmmp2MQKFFGLPQTGDLDQNTIETMRKPRCGNPDVANYNFFPRKPKW NO15mmp9LQKQLSLPETGELDSATLKAMRTPRCGVPDLGRFQTFEGDLKW NO16mmp1MQEFFGLKVTGKPDAETLKVMKQPRCGVPDVAQFVLTEGNPRW NO17在該序列比對(duì)中，粗體表示在MMP-1中找到，但在MMP-2或MMP-9中沒有找到的氨基酸，下劃線表示在MMP-1中找到，并僅在MMP-2或MMP-9中找到的氨基酸。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，希望能夠抑制MMP-2和9，但保持MMP-1的水平相對(duì)不被調(diào)節(jié)，從而使慢性創(chuàng)傷愈合。根據(jù)上述序列比對(duì)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可設(shè)計(jì)出一種肽，該肽的氨基酸可在MMP2和MMP9的酶原序列中找到，但沒有在MMP1的酶原序列中找到，從而產(chǎn)生一種抑制MMP-2和9，但使MMP-1不受抑制的肽。這種肽由式IV提供。
Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO18)其中Xaaa是脯氨酸；Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸； Xaa2是精氨酸；Xaac是蘇氨酸；Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸；Xaa4是甘氨酸；Xaae是天門冬氨酸或谷氨酸；Xaa5是纈氨酸或天門冬酰胺，理想是天門冬酰胺；Xaaf是亮氨酸；Xaa6是脯氨酸；Xaag是天門冬氨酸；Xaa7是天門冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或絲氨酸； Xaa8是纈氨酸或亮氨酸，理想是亮氨酸；Xaai是天門冬酰胺或丙氨酸；Xaa9是丙氨酸或甘氨酸，理想是甘氨酸；Xaaj是蘇氨酸；Xaa10是天門冬酰胺或精氨酸；Xaak是異亮氨酸或亮氨酸， Xaa11是酪氨酸或苯丙氨理想是異亮氨酸； 酸，理想是酪氨酸；XaaL是谷氨酸或賴氨酸，Xaa12是天門冬酰胺或谷理想是谷氨酸； 氨酰胺；Xaa13是苯丙氨酸或蘇氨酸；Xaam是蘇氨酸或丙氨酸；Xaa14是苯丙氨酸；Xaan是甲硫氨酸； Xaa15是脯氨酸或谷氨酸，理想是脯氨酸；Xaao是精氨酸；Xaa16是精氨酸或甘氨酸，理想是精氨酸；Xaap是賴氨酸或蘇氨酸；Xaa17是賴氨酸或天門冬氨酸；
Xaa18是脯氨酸或亮氨酸，理想是亮氨酸；并且Xaa19是賴氨酸。
肽的修飾本發(fā)明還考慮對(duì)肽抑制劑進(jìn)行修飾，從而使它們穩(wěn)定，促進(jìn)它們的攝取和吸收，改善本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，肽的任何其它特性和性質(zhì)。例如，可將肽抑制劑環(huán)化，中和肽抑制劑的電荷，還可將肽抑制劑與其它化學(xué)部分連接。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何方法將肽環(huán)化。例如，通過已知的過程使N-末端和C-末端稠合形成肽鍵。還可將存在于肽中氨基酸側(cè)鏈上的官能團(tuán)連接，從而使本發(fā)明的肽環(huán)化。例如，可形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)包括--COOH和--OH；--COOH和-NH2；和--COOH和--SH?？捎糜谑闺沫h(huán)化的氨基酸對(duì)包括Asp和Lys；Glu和Lys；Asp和Arg；Glu和Arg；Asp和Ser；Glu和Ser；Asp和Thr；Glu和Thr；Asp和Cys；及Glu和Cys。能夠彼此形成共價(jià)鍵的氨基酸殘基的其它例子包括半胱氨酸樣氨基酸，如Cys，hCys，β-甲基-Cys和Pen，它們可彼此形成二硫鍵。理想的半胱氨酸樣氨基酸殘基包括Cys和Pen。可用于使肽環(huán)化的其它氨基酸對(duì)是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員顯而易見的。
用于使肽環(huán)化的基團(tuán)不一定是氨基酸。能夠與肽氨基末端形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)的例子包括羧酸和酯。能夠與肽羧基末端形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)的例子包括--OH，--SH，--NH2和--NHR，其中R是(C1-C6)烷基，(C1-C6)烯基和(C1-C6)炔基。
適于在帶有官能團(tuán)的兩個(gè)側(cè)鏈之間形成這種鍵的反應(yīng)種類，以及適于形成這種連接的反應(yīng)條件，對(duì)于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員而言是顯而易見的。用于使肽環(huán)化的理想反應(yīng)條件要足夠溫和，這樣才不致使肽降解或?qū)﹄脑斐蓳p害。用于保護(hù)各種官能度所必需的適宜基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(見，例如，Greene & Wuts，1991，2nded.，JohnWiley & Sons，NY)，用于制備這種保護(hù)性分子的各反應(yīng)流程也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，將N-末端和C-末端的電荷有效除去。這一點(diǎn)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過任何可獲得的方法進(jìn)行，例如，使N-末端乙酰化，并使C-末端酰胺化。
制備環(huán)狀肽和以其它方式對(duì)肽進(jìn)行修飾的方法是本領(lǐng)域熟知的(見，例如，Spatola，1983，Vega Data 1(3)，一般性綜述)；Spatola，1983，“肽主鏈的修飾”Chemistry and Biochemistry of AminoAcids Peptides and Proteins(Weinstein ed.)，Marcel Dekker，New York，p.267(一般性綜述)；Morley，1980，TrendsPharm.Sci.1463-468；Hudson等，1979，Int.J.Prot.Res.14177-185(--CH2NH--，--CH2CH2--)；Spatola等，1986，Life Sci.381243-1249(--CH2--S)；Hann，1982，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.1307-314(--CH＝CH--，順式和反式)；Almquist等，1980，J.Med.Chem.231392-1398(--COCH2--)；Jennings-White等，Tetrahedron.Lett.232533(--COCH2--)；歐洲專利申請EP 45665(1982)CA9739405(--CH(OH)CH2--)；Holladay等，1983，Tetrahedron Lett.244401-4404(--C(OH)CH2--)；和Hruby，1982，Life Sci.31189-199(--CH2--S--)。
抗血管發(fā)生和創(chuàng)傷愈合用途根據(jù)本發(fā)明，此處提供的肽可用于使創(chuàng)傷愈合并且用作抗血管發(fā)生劑。作為抗血管發(fā)生劑，該肽可以用于治療涉及不適當(dāng)血管發(fā)生的任何疾病。例如，涉及不適當(dāng)血管發(fā)生的疾病包括癌癥、腫瘤、某些眼病等。此處使用的術(shù)語“癌癥或腫瘤”是指任何贅生性疾病，包括癌、肉瘤和癌-肉瘤。癌癥和腫瘤可以是轉(zhuǎn)移性的，非轉(zhuǎn)移性的、血管化的、硬的或軟的。
特定類型的癌癥包括，但不限于，神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤、退行性星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、脊索瘤、咽喉癌、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、睪丸腫瘤、腎母細(xì)胞瘤、尤因瘤、膀胱癌、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、腺癌、汗腺癌、皮脂腺肉瘤、乳頭肉瘤、乳頭腺肉瘤、囊腺肉瘤、支氣管肺癌、髓樣癌、肥大細(xì)胞瘤、間皮瘤、滑膜瘤、黑色素瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、寡突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、成血管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、松果體瘤、室管膜瘤、顱咽管瘤、上皮癌、胚胎癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、纖維肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、白血病和這些原發(fā)腫瘤繼發(fā)的轉(zhuǎn)移性病變。概言之，可以根據(jù)本發(fā)明治療任何贅生性病變，包括肉芽腫。因此，本發(fā)明中的術(shù)語“癌癥”也包括支持腫瘤血管發(fā)生等功能的癌癥，以及腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞。
本發(fā)明的肽也可以用于治療以過多的血管發(fā)生為特征的疾病。血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的一個(gè)例子是眼部新血管疾病。該疾病的特征在于新血管侵入眼部結(jié)構(gòu)，如視網(wǎng)膜或角膜。在年齡相關(guān)的黃斑變性中，相關(guān)的視覺問題是由于脈絡(luò)膜毛細(xì)血管向內(nèi)生長通過Bruch膜的缺陷，纖維血管組織在視網(wǎng)膜色素上皮下增殖。血管發(fā)生損害也與糖尿病視網(wǎng)膜病、早發(fā)性視網(wǎng)膜病、角膜移植物排斥、新血管性青光眼和晶體后纖維組織增生相關(guān)。其它與角膜新血管化相關(guān)的疾病包括，但不限于流行性角結(jié)膜炎、維生素A缺乏、隱形眼鏡佩戴過度、特應(yīng)性角膜炎、上緣(superior limbic)角膜炎、干燥性翼狀胬肉角膜炎(pterygium keratitis sicca)、干燥綜合征、紅斑痤瘡、phylectenulosis、梅毒、分支桿菌感染、脂變性、化學(xué)灼傷、細(xì)菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純皰疹感染、帶狀皰疹感染、原生動(dòng)物感染、卡波西肉瘤、莫倫潰瘍、Terrien邊緣變性、邊緣角質(zhì)層分離、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性狼瘡、多動(dòng)脈炎、創(chuàng)傷、Wegener結(jié)節(jié)病、鞏膜炎、Steven′s Johnson病、類天皰瘡、放射狀角膜切開術(shù)和角膜移植物排斥。
與視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜的新血管化相關(guān)的疾病包括，但不限于，糖尿病視網(wǎng)膜病、黃斑變性、鐮狀細(xì)胞貧血、結(jié)節(jié)病、梅毒、彈性膜假黃瘤、佩吉特病、靜脈阻塞、動(dòng)脈阻塞、頸動(dòng)脈阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃體炎、分支桿菌感染、萊姆病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、早發(fā)性視網(wǎng)膜病、伊爾斯病、貝切特病、導(dǎo)致視網(wǎng)膜炎或脈絡(luò)膜炎的感染、推定的眼部組織胞漿菌病、貝斯特病、近視、視凹陷(optic pits)、斯塔加特病、pars planitis、慢性視網(wǎng)膜脫落、高粘度綜合征、弓形體病、創(chuàng)傷和激光治療后并發(fā)癥。其它疾病包括，但不限于，與潮紅(角新血管化)相關(guān)的疾病以及纖維血管或纖維組織異常增殖導(dǎo)致的疾病，包括所有形式的增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病。
在黃斑變性中，黃斑(視網(wǎng)膜的一部分，負(fù)責(zé)最敏銳的視覺)下的進(jìn)展性脈絡(luò)膜血管發(fā)生干擾視覺。在糖尿病視網(wǎng)膜中，視網(wǎng)膜中的血管發(fā)生干擾視覺。盡管目前還不了解起始黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病中的血管生長的初始刺激，VEGF似乎是關(guān)鍵的血管發(fā)生誘導(dǎo)劑(Lopez，P.F.et al.(1996)Invest.Ophthalmol.Visual Science37，855-868；Kliffen，M.et al.(1997)Br.J.Ophthalmol.81，154-162；Kvanta，A.et al.(1996)Invest.Ophthalmol.VisualScience 37，1929-1934；Paques et al.(1997)Diabetes &Metabolism 23125-130)。作為VEGF表達(dá)的抑制劑，本發(fā)明的肽抑制劑因此可以用于減少黃斑變性和其它疾病中的血管發(fā)生。
涉及血管發(fā)生的另一種疾病被認(rèn)為是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)的滑膜覆蓋物中的血管進(jìn)行血管發(fā)生。除形成新血管網(wǎng)外，內(nèi)皮細(xì)胞釋放導(dǎo)致血管翳生長和軟骨破壞的因子和反應(yīng)性氧。參與血管發(fā)生的因子可以主動(dòng)有助于，并且?guī)椭S持類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的慢性炎癥狀態(tài)。
因此，本發(fā)明的肽可以用于抑制腫瘤生長和發(fā)展，從而治療眼病和愈合慢性創(chuàng)傷。各個(gè)肽，肽變體，肽衍生物及具有不同序列的肽混合物都可在制劑中組合，從而促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，抑制血管發(fā)生和/或防止腫瘤生長和/或發(fā)展。最理想的愈合、血管發(fā)生抑制和腫瘤抑制可能需要某些基質(zhì)金屬蛋白酶活性。因此，本發(fā)明的組合物及制劑無需促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的最大抑制。相反，可根據(jù)需要改變肽抑制劑制劑的活性，從而使愈合情況達(dá)到最佳，并且抑制血管發(fā)生或腫瘤生長和發(fā)展。通過改變肽抑制劑的類型，內(nèi)含物及量可獲得更低或更高水平的抑制，從而抑制血管發(fā)生并且促進(jìn)愈合和腫瘤破壞。
為了抑制腫瘤發(fā)展和血管發(fā)生，促進(jìn)腫瘤破壞，治療眼病和幫助創(chuàng)傷愈合，可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇的任何方式將本發(fā)明的肽給予哺乳動(dòng)物。例如，可把肽配制成治療組合物，該治療組合物含有治療有效量的一種或多種肽及藥學(xué)上可接受的載體。這種組合物可以口服、腸胃外或局部給藥?？梢灾苽渌鲭牡目勺⑸淙芤夯驊腋∫??？梢允褂每煽诜o藥或可以植入腫瘤或創(chuàng)傷位點(diǎn)的持續(xù)釋放制劑?？梢栽谥踩氤Ｒ?guī)位點(diǎn)中的藥物遞送裝置中給予肽，所述位點(diǎn)例如，腫瘤附近或被認(rèn)為是癌癥性的或容易形成癌癥或腫瘤的器官。組合物可以作為乳膏，噴霧劑，泡沫狀物，凝膠或任何其它制劑形式而被引入到皮膚上或眼中或創(chuàng)傷中。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可被配制成皮膚遮蓋物或敷料，其中含有浸滲到治療裝置、藥物遞送裝置、皮膚遮蓋物或敷料中，與治療裝置、藥物遞送裝置、皮膚遮蓋物或敷料共價(jià)連接或以其它方式締合的治療有效量的一種或多種肽。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物遞送裝置、皮膚遮蓋物或敷料可釋放肽抑制劑。肽抑制劑的釋放可以不受控制或受控制的方式進(jìn)行。因此，本發(fā)明的藥物遞送裝置、皮膚遮蓋物或創(chuàng)傷敷料可將肽抑制劑緩慢或計(jì)時(shí)釋放到組織中。皮膚遮蓋物和敷料可以是本領(lǐng)域使用的任何材料，包括繃帶，紗布，無菌包扎材料，水凝膠，水膠體以及類似材料。
在一種實(shí)施方案中，治療有效量的本發(fā)明肽是指肽的量可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶至促進(jìn)健康皮膚發(fā)育和/或創(chuàng)傷愈合所需的程度。在另一種實(shí)施方案中，治療有效量的本發(fā)明肽是指肽的量可抑制VEGF表達(dá)。VEGF表達(dá)的抑制程度可以不同。在一些實(shí)施方案中，VEGF表達(dá)的抑制程度足以抑制血管發(fā)生或顯著血管化的發(fā)展或顯著的血管形成。
例如，存在于治療或藥物組合物中的本發(fā)明肽的量占組合物重量的約0.001％-約75％。例如，所述肽可占組合物重量的約0.5％-約60％?？蛇x擇性地，所述肽可占組合物重量的約1.0％-約50％。
肽抑制劑的治療有效量可隨給藥途徑而改變。例如，30-112,000μg/kg體重的治療量對(duì)于靜脈內(nèi)給藥是有效的。然而，用于健康皮膚發(fā)育或創(chuàng)傷治療所需的肽抑制劑的量不僅隨給藥途徑而改變，而且還根據(jù)所治療疾病的性質(zhì)以及患者的年齡和健康狀況而改變，并最終由主治醫(yī)師或臨床醫(yī)師決定。
給藥劑量和方法視所治療皮膚或組織的位置和/或創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度而定。肽以及肽偶聯(lián)物的有效劑量可由它們相關(guān)的體外活性，以及在這里所述的動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性而定。所述化合物可以單位劑型給藥；例如，每個(gè)單位劑型含有約0.001μg-約10mg，優(yōu)選約0.01μg-約5mg，更優(yōu)選約0.10μg-約1mg，甚至更優(yōu)選約1.0μg-500μg的肽。所需劑量可以單一劑量，分割劑量，或連續(xù)輸注給出。所需劑量還可間隔適當(dāng)?shù)臅r(shí)間給藥，例如，每天兩次，三次，四次或更多個(gè)亞劑量給藥。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用這里提供的教導(dǎo)，根據(jù)所得到的信息，很容易地制備并給予有效制劑。
本發(fā)明的肽抑制劑可配制成藥物組合物，并以適合所選給藥途徑，即，口服或腸胃外，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，局部或皮下途徑的不同劑量形式給予哺乳動(dòng)物宿主，如人類患者。
因此，所述肽抑制劑可以全身給藥，例如，通過輸注或注射靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。肽抑制劑的溶液可在水中制備，任選與無毒的表面活性劑混合。也可在甘油，液態(tài)聚乙二醇，三乙酸甘油酯及其混合物和油中制備分散液。在普通的貯藏和使用條件下，這些制劑含有防止微生物生長的防腐劑。
適于注射或輸注或局部涂抹的藥物劑型包括含有活性成分的無菌水溶液或分散液或無菌粉末，其中所述活性成分適于無菌可注射或可輸注的溶液或分散液的臨時(shí)制備，任選地，所述活性成分還可包在脂質(zhì)體中。在所有情況下，最終的劑型在制備和貯藏條件下必須是無菌，可流動(dòng)且穩(wěn)定的。液態(tài)載體或賦形劑可以是含有，例如，水，乙醇，多元醇(丙三醇，丙二醇，液態(tài)聚乙二醇等)，植物油，無毒甘油酯，及其適宜混合物的溶劑或液態(tài)分散介質(zhì)。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可通過形成脂質(zhì)體，維持分散液的必須粒徑，或使用表面活性劑而維持。通過使用各種抗細(xì)菌劑或抗真菌劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫汞撒等可防止微生物的作用。在某些情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可選擇使用等滲劑，例如，糖，緩沖液或氯化鈉。在組合物中使用延遲吸收劑，例如，一硬脂酸鋁和明膠，可延長可注射組合物的吸收。
無菌可注射溶液是通過把所需量的肽或肽偶聯(lián)物摻入含有上面所列各種其它成分的溶劑中而制備的，如果需要還可進(jìn)行過濾滅菌。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末情況下，制備方法包括真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，從而產(chǎn)生含有活性成分以及存在于先前無菌過濾溶液中的任何其它所需成分的粉末。
在某些情況下，肽抑制劑還可與藥學(xué)上可接受的賦形劑，如惰性稀釋劑或可同化的食用載體聯(lián)合口服給藥。還可把它們裝入硬殼或軟殼的明膠膠囊中，還可把它們壓制成片劑，或直接摻入患者的飲食。對(duì)于口服治療給藥而言，肽抑制劑可與一種或多種賦形劑組合，并以可攝取的片劑，頰片，錠劑，膠囊劑，酏劑，混懸液，糖漿劑，薄膜片等形式使用。這種組合物和制劑可以含有至少0.1％的活性化合物。當(dāng)然，組合物和制劑的百分比可發(fā)生改變，占已知單位劑型重量的約2％-約75％。這種治療有效組合物中的活性化合物的量可獲得有效的劑量水平。
片劑，錠劑，丸劑，膠囊劑等還可含有下列成分粘合劑，如黃芪膠，阿拉伯膠，玉米淀粉或明膠；賦形劑，如磷酸二鈣；崩解劑，如玉米淀粉，馬鈴薯淀粉，海藻酸等；潤滑劑，如硬脂酸鎂；和甜味劑，如蔗糖，果糖，乳糖或天冬甜素；或調(diào)味劑，如薄荷，冬青油或櫻桃味的調(diào)味劑。當(dāng)單位劑型為膠囊劑時(shí)，除了上述類型的材料之外，它還可含有液態(tài)載體，如植物油或聚乙二醇。各種其它物質(zhì)還可作為包衣存在，或改變固態(tài)單位劑型的物理形式。例如，片劑，丸劑或膠囊劑可用明膠，蠟，蟲膠或糖等包衣。糖漿劑或酏劑可含有活性化合物，作為甜味劑的蔗糖或果糖，作為防腐劑的甲基和丙基對(duì)羥基苯甲酸酯，染料和調(diào)味劑，如櫻桃味或橙味的調(diào)味劑。當(dāng)然，制備任何單位劑型所用的任何材料都應(yīng)當(dāng)是藥學(xué)上可接受的，而且所用的量應(yīng)基本無毒。此外，還可把肽抑制劑摻入到持續(xù)釋放制劑和裝置中。
有用的固態(tài)載體包括精細(xì)分割的固體，如滑石粉，粘土，微晶纖維素，二氧化硅，氧化鋁等。有用的液態(tài)載體包括水，醇或二醇或水-醇/二醇混合物，其中可將存在的化合物以有效水平溶解或分散在其中，任選地，還可借助于無毒的表面活性劑。此外，還可加入佐劑，如香料和其它抗菌劑，從而優(yōu)化已知用途的性質(zhì)。
增稠劑，如合成聚合物，脂肪酸，脂肪酸鹽和酯，脂肪醇，改性纖維素或改性礦物質(zhì)也可與液態(tài)載體一起使用，從而形成容易涂抹的糊劑，凝膠，軟膏劑，肥皂等，用于直接涂抹在使用者的皮膚上。
通常，可局部給予本發(fā)明的肽，用于創(chuàng)傷的治療并促進(jìn)健康皮膚的發(fā)育?；钚噪目梢匀魏畏绞骄植拷o藥，例如以噴霧劑，泡沫狀物，粉劑，乳膏劑，膠凍，糊劑，栓劑或溶液直接或間接給予所選擇的組織。本文件中使用的術(shù)語“糊劑”包括乳膏劑和其它粘性、容易涂抹的組合物，例如常常直接涂在皮膚上或攤在繃帶或敷料上的組合物。本發(fā)明的肽還可與皮膚遮蓋物或創(chuàng)傷敷料共價(jià)連接，穩(wěn)定吸附或以其它方式涂在皮膚遮蓋物或創(chuàng)傷敷料上。為了促進(jìn)手術(shù)后的愈合，可把本發(fā)明的活性肽直接涂在目標(biāo)組織或假體裝置或可植入的持續(xù)釋放裝置上。所述組合物還可利用氣溶膠，作為泡沫狀物或煙霧給藥，其中可有或沒有其它藥劑，直接涂在皮膚或創(chuàng)傷處。
所述肽可以制劑的形式給藥，該制劑包括肽在蠟，油，乳化劑，水，和/或在水存在下形成凝膠、又基本上不溶于水的物質(zhì)中的乳狀液。該制劑可提供理想的乳狀液性質(zhì)，它易于分散，并具有乳狀液的乳脂狀稠度，當(dāng)經(jīng)歷標(biāo)準(zhǔn)滅菌過程，例如，蒸汽滅菌時(shí)不會(huì)分解，這是因?yàn)槟z可使乳狀液穩(wěn)定。它還顯示出與傳統(tǒng)凝膠相比，更好的水保留性，這是因?yàn)樗瑫r(shí)保存在乳狀液和凝膠中。
該制劑還可含有濕潤劑，從而減少乳膏或洗液中水的部分蒸汽壓，降低乳膏或洗液干燥的速度。適宜的濕潤劑可與水很大程度地混溶，通常適于涂在皮膚上。多元醇尤其適于這個(gè)目的，適宜的多元醇可包括一丙二醇或丙三醇(甘油)。多元醇可占總制劑(重量)的20-50％；優(yōu)選30-40％。相對(duì)較高比例的多元醇可確保在糊劑干燥至任何程度時(shí)，最終的糊劑仍然保持柔軟并可塑，這是因?yàn)楦视涂勺鳛榫酆衔锏脑鏊軇┢鹱饔?。?dāng)把糊劑涂在繃帶上時(shí)，例如，可很容易地把它從皮膚上除去，當(dāng)糊劑失去水份時(shí)，無需撕下繃帶。當(dāng)與皮膚或創(chuàng)傷，特別是感染的創(chuàng)傷接觸時(shí)，多元醇還具有防止糊劑中的細(xì)菌增殖的作用。
所述制劑可含有其它成分?？捎玫某煞职ㄑ趸\，魚石脂，爐甘石，silver suphadiazine，醋酸洗必太，煤焦油，葡萄糖酸洗必太，水楊酸，甲硝唑或其它抗菌劑，或其組合。另外還可找到適于摻入到乳膏中的其它成分。
這些成分可以有利的量加入，例如，可加入多至約15重量％的氧化鋅；通常使用6-10％的氧化鋅，還可與其它成分，如魚石脂(0-3重量％)和/或爐甘石(0-15重量％)混合。魚石脂或爐甘石也可單獨(dú)使用。醋酸洗必太的使用濃度為1重量％；通常為0.5重量％。
乳狀液蠟的例子是甘油一硬脂酸酯，或甘油一硬脂酸酯與PEG100硬脂酸酯的組合，PEG100硬脂酸酯是作為CITHROLGMS/AS/NA從CrodaUniversal Ltd.獲得的。這種組合可同時(shí)提供蠟和乳化劑(PEG100硬脂酸酯)，所述乳化劑尤其可與蠟相容，用于在水中形成乳狀液。制劑中還可含有第二種乳化劑，從而增加乳狀液的穩(wěn)定性，例如，PEG20硬脂酸酯，如Croda Universal Ltd.提供的CITHROL 10MS。乳膏中的乳化劑總濃度通常應(yīng)為3-15％。當(dāng)使用兩種乳化劑時(shí)，其中一種的濃度可能比另外一種要高。
水不溶性物質(zhì)可與制劑中的水形成凝膠。因此該物質(zhì)是親水的，但不能在水中溶解至任何較大的程度。所述物質(zhì)可以是聚合物，吸水的水不溶性聚合物。然而，也可使用與水形成凝膠并在較高溫度下穩(wěn)定的非聚合物，例如，粘土，如高齡土或膨潤土。用于本發(fā)明中的某些聚合物是超級(jí)-吸收性的聚合物，如在WO-92/16245中公開的那些，它們含有已經(jīng)部分交聯(lián)，從而形成三維結(jié)構(gòu)的親水性纖維素衍生物。適宜的交聯(lián)纖維素衍生物包括羥低級(jí)烷基纖維素的那些，其中所述烷基含有1-6個(gè)碳原子，例如，羥乙基纖維素或羥丙基纖維素，或羧基纖維素，例如，羧甲基羥乙基纖維素或羧甲基纖維素。本發(fā)明所用聚合物的例子是Akzo Chemicals B.V.作為AKUCELL X181提供的部分交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉聚合物。這種聚合物是超級(jí)吸收性聚合物，它可吸收至少為自身重量10倍的水。聚合物的交聯(lián)結(jié)構(gòu)可防止它在水中溶解，但水又很容易吸收到其中，并在聚合物的三維結(jié)構(gòu)內(nèi)保持，形成凝膠。水從這種凝膠損耗的速度要比從溶液損耗的速度慢，這對(duì)于減緩或防止乳膏制劑干燥十分有利。制劑的聚合物含量通常低于10％，例如，聚合物含量可占重量的約0.5-約5.0％，或占重量的約1.0％-2％。
所述制劑可以是滅菌的，此外應(yīng)當(dāng)對(duì)制劑的成分進(jìn)行選擇，通過改變聚合物含量而提供具有所需流動(dòng)性的終產(chǎn)物。也就是說，如果產(chǎn)物是滅菌的，那么應(yīng)當(dāng)在滅菌前對(duì)制劑進(jìn)行選擇，從而提供粘度/彈性相對(duì)較高的產(chǎn)物。如果沒有對(duì)制劑的某些成分進(jìn)行滅菌，那么可在加入那些成分之前對(duì)制劑滅菌，或?qū)⒚總€(gè)成分單獨(dú)滅菌。所述制劑還可通過在無菌條件下，將分別滅菌的成分混合而制備。當(dāng)對(duì)各成分單獨(dú)滅菌，然后混合在一起時(shí)，可調(diào)節(jié)聚合物的含量，從而產(chǎn)生具有所需流動(dòng)性的終產(chǎn)物。乳狀液的含量決定了加工性質(zhì)和制劑的感覺，乳狀液含量越高，就越容易涂抹，而且是乳脂狀的。
此外，還可把制劑裝到管，桶或其它適宜的貯存容器形式中，或把它涂在基質(zhì)上，然后包裝。適宜的基質(zhì)包括敷料，如薄膜敷料，和繃帶。
通過下列實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實(shí)施例是用于舉例說明，而不是對(duì)所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1肽抑制劑通用材料所有肽都是由Sigma-Genosys，Inc.合成的。由公司利用RP-HPLC把釋放的肽純化至均一性＞95％。除去所收集的洗脫峰物質(zhì)中的鹽分，并將其冷凍干燥。質(zhì)譜分析證實(shí)可證實(shí)肽的分子量和純度。除非另有說明，所有化學(xué)品都是從Sigma Chemical Corp.或Fluka Chemical Co購買的?；钚訫MP-9酶是從Calbiochem購買的。
分子模型分子模型利用了兩個(gè)可視程序，Swiss PDB Viewer(Guex andPeitsch，1997)和Rasmol(Sayle and Milner-White，1995)。建立模型的工作是在Compaq PC running Windows 95，以及SiliconGraphics，Inc.Octane UNIX工作站上進(jìn)行的。此外，在Octane上利用了Molecular Simulations，Inc.的Cerius2分子包。三維結(jié)構(gòu)的文件是從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下載的，(文件名，參考文獻(xiàn))如下MMP-1(1FBL，Li等，1995)，MMP-2(1GEN，Libson等，1995)，MMP-8(1JAO，1JAN，Grams等，1995；Reinemer等，1994)，MMP-9(1MMQ，Browner等，1995)，TIMP-2/MT-1MMP復(fù)合物(1BUV，F(xiàn)ernandez-Catalan等，1998)，TIMP-2(1BR9，Tuuttila等，1998)，和TIMP-1/MMP復(fù)合物(1UEA，Gomis-Ruth等，1997；Huang等，1996；Becker等，1995)。這些文件用于分析蛋白的三維結(jié)構(gòu)，而且是原始序列數(shù)據(jù)的來源。
抑制測定法這里進(jìn)行了兩個(gè)酶測定法。第一個(gè)測定法測量作為時(shí)間的函數(shù)的MMP-9對(duì)熒光化膠原的酶水解。將5μM濃度的熒光化膠原(MolecularProbes，Inc.)加入到反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.6)，150mMNaCl，5mM CaCl2，0.1mM NaN3)中，然后放在Spectrosil石英熒光計(jì)的比色杯中。將0.1μM濃度的MMP與不同量的肽混合，25℃溫育10分鐘，從而引起結(jié)合。將蛋白混合物加入到膠原底物中，迅速混合。在Shimadzu RF5301熒光計(jì)中測量作為時(shí)間的函數(shù)(激發(fā)波長495nm)的520nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度(Lakowicz，1983)。熒光素釋放測定法可用于測定肽抑制劑([I])的抑制常數(shù)(Ki)，它是按照Segel(1993)利用Dixon圖(1/v vs.[I])獲得的斜率＝Km/(Vmax Ki[S])(1)其中，Km是Michaelis常數(shù)，Vmax是反應(yīng)最大速率，[S]是底物濃度。
第二個(gè)測定法利用了熒光共振能轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)。使7個(gè)氨基酸的底物肽(Calbiochem)與羧基末端的二硝基苯受體，和氨基末端的2-氨基苯并氨茴酰(Abz)部分供體偶聯(lián)。利用MMP-9切割該底物，釋放出熒光產(chǎn)物(365nm激發(fā)，450nm發(fā)射)。將5μM濃度的肽加入到反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.6)，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1mM NaN3)中，并放在先前已經(jīng)用1％BSA封閉的黑色96-孔微量滴定平板的孔中。將0.1μM濃度的MMP與不同濃度的9聚體(SEQ ID NO12)，10聚體(SEQ ID NO13)，或19聚體(SEQ ID NO11)肽混合，25℃溫育10分鐘，從而引起結(jié)合。將蛋白混合物加入到熒光肽底物中，迅速混合。用Dynex MFX熒光微量滴定平板閱讀器測量作為時(shí)間的函數(shù)的熒光強(qiáng)度。通過使用含非-FRET肽的Abz產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，熒光強(qiáng)度與切割的肽摩爾數(shù)有關(guān)。抑制常數(shù)就是從該曲線得到的。其它基質(zhì)金屬蛋白酶是以類似方法，利用特異性的底物FRET肽(全部來源于Calbiochem)測試的。
抗活化測定法該測定法用于測量有多少酶原轉(zhuǎn)化為成熟的基質(zhì)金屬蛋白酶。將酶原MMP-9酶原(100μg)與0.5μg基質(zhì)溶素在PBS中混合。35℃溫育該反應(yīng)物。80分鐘后，除去反應(yīng)物中的等分試樣。將各等分試樣與EDTA混合至1mM的終濃度，然后注射到BioSelect 125 HPLC柱上，在PBS中進(jìn)行層析。0(注射)時(shí)間點(diǎn)是一個(gè)單峰，它是在大約750秒時(shí)從柱子上洗脫下來的。該峰的大小隨時(shí)間而降低，并出現(xiàn)了兩個(gè)新的峰。第一個(gè)峰是在大約800秒時(shí)洗脫下來的，代表MMP-9的成熟形式。第二個(gè)峰是在大約1100秒時(shí)洗脫下來的，與N-末端的酶原結(jié)構(gòu)域片段相對(duì)應(yīng)。峰面積是通過求洗脫曲線的積分而測定的，并繪制了面積改變的百分比圖。
等溫滴定量熱法等溫滴定量熱法(ITC)是用MicroCal，Inc.的VP-ITC儀器進(jìn)行的。滴定是通過將5μL抑制劑肽溶液(濃度為0.5mM-2.0mM)注射到1.4mL攪拌的反應(yīng)細(xì)胞中進(jìn)行的。細(xì)胞中MMP-9的濃度為50-80μM。抑制劑和酶存在于20mM二甲胂酸鈉(pH5.5-7.0)，40mM NaCl，或20mMTris-HCl(pH7.0-7.5)，40mM NaCl中。滴定是在20℃-40℃進(jìn)行的。進(jìn)行滴定的典型實(shí)驗(yàn)條件為10秒的注射周期，在總共40次的注射之間有240秒的延遲。將抑制劑肽空白滴定到緩沖液中，從而校正稀釋和混合的熱量。
對(duì)于結(jié)合實(shí)驗(yàn)評(píng)估而言，多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的獨(dú)立設(shè)置是最常見的模型。分析溶液的總熱量是通過下列公式(Freire等，1990)測定的Q=VΔH×[[L]+1+[M]nK-(1+[M]nK-[L]K)2+4K[L]2K]---(2)]]>其中Q是總熱量，V是細(xì)胞體積，ΔH是焓，M是大分子(細(xì)胞中的結(jié)合配偶體)濃度，n是結(jié)合化學(xué)計(jì)量，L是配體(注射器中的結(jié)合配偶體)濃度，K是締合常數(shù)。利用Origin版本5(MicroCal，Inc.)使數(shù)據(jù)擬合于該模型。
表面等離子共振利用BiaCore-X表面等離子共振(SPR)裝置(BiaCore，Inc.)測量19聚體(SEQ ID NO11)肽(P)與MMP-9之間的相互作用。在這些實(shí)驗(yàn)中，羧甲基葡聚糖傳感器芯片(CM-5，Lofas等，1993)是用50mM N-羥基琥珀酰亞胺，0.2M N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)-碳二亞胺活化的，流速為10μL/分鐘，共進(jìn)行了10分鐘。使75ng/μL濃度的MMP-9以10μL/分鐘的流速與活化表面偶聯(lián)10分鐘。終表面是以10μL/分鐘的速率，使1M乙醇胺-HCl在傳感器表面流動(dòng)5分鐘而滅活的。使?jié)舛葹?0-50nM的19聚體(SEQ ID NO11)肽以20μL/分鐘的速率在傳感器表面流動(dòng)。結(jié)合等溫線的締合與解離相是在模擬速率常數(shù)前，利用自動(dòng)化FFT程序校正的。通過使正向(ka)和反向(kd)速率常數(shù)同時(shí)配合評(píng)估結(jié)合等溫線d[P～MMP-9]/dt＝(ka[P][MMP-9])-(kd[P～MMP-9])(3)(Karlsson和Falt，1997)，其中[P]，[MMP-9]，和[P～MMP-9]分別為游離肽，游離MMP-9，及復(fù)合物的濃度。平衡親和力常數(shù)(KA)的定義如下KA＝ka/kd (4)以SPR信號(hào)正確表達(dá)等式3為(Morton等，1995)dR/dt＝ka C Rmax-(ka C+kd)R(5)其中R是t時(shí)間的SPR信號(hào)(反應(yīng)單位，RU)，Rmax是RU的最大MMP-9結(jié)合能力，C是螯合肽的濃度。動(dòng)力學(xué)分析是使用Microcal，Inc.的Origin進(jìn)行的(O’Shannessy等，1993)。
存活力測定法9聚體(SEQ ID NO12)，10聚體(SEQ ED NO13)和19聚體(SEQ IDNO11)肽的相對(duì)毒性是使用MatTek Corp.的皮膚模型Epiderm測定的。在加入肽之前，將裝有各皮膚樣品的容器在37℃，5％CO2的培養(yǎng)基中預(yù)溫育2小時(shí)。把含樣品的容器轉(zhuǎn)移到含有新鮮培養(yǎng)基的6孔平板中。將所有的肽都溶解在PBS中，使其最終濃度達(dá)到10mM，然后將100μl各肽溶液吸移到Epiderm樣品容器的表面上。在37℃，5％CO2的條件下溫育12小時(shí)。溫育期后，用PBS洗滌樣品容器3次，然后把含樣品的容器轉(zhuǎn)移到每個(gè)孔含有300μL MTT(MTT濃度為1mg/mL)測定培養(yǎng)基的24孔平板中。進(jìn)行比色測定使顯色進(jìn)行3小時(shí)(37℃，5％CO2溫育)。然后把含樣品的容器轉(zhuǎn)移到每個(gè)孔含有2mL異丙醇的24孔培養(yǎng)平板中。室溫提取有色沉淀物4小時(shí)。在570nm和650nm處閱讀各樣品的吸光度。然后按照下列公式計(jì)算各樣品相對(duì)于PBS對(duì)照組的存活力百分比100×(OD570sam-OD650sam)/(OD570con-OD650con)(6)通常，肽樣品是一式三份測定的。
結(jié)果基質(zhì)金屬蛋白酶-2的序列(SEQ ID NO14)在下面提供，從而幫助限定基質(zhì)金屬蛋白酶中的不同結(jié)構(gòu)域和區(qū)。
1 MEALMARGAL TGPLRALCLL GCLLSHAAAA PSPIIKFPGD41 VAPKTDKELA VQYLNTFYGC PKESCNLFVL KDTLKKMQKF81 FGLPQTGDLD QNTIETMRKP RCGNPDVANY NFFPRKPKWD121 KNQITYRIIG YTPDLDPETV DDAFARAFQV WSDVTPLRFS161 RIHDGEADIM INFGRWEHGD GYPFDGKDGL LAHAFAPGTG201 VGGDSHFDDD ELWTLGEGQV VRVKYGNADG EYCKFPFLFN241 GKEYNSCTDT GRSDGFLWCS TTYNFEKDGK YGFCPHEALF281 TMGGNAEGQP CKFPFRFQGT SYDSCTTEGR TDGYRWCGTT321 EDYDRDKKYG FCPETAMSTV GGNSEGAPCV FPFTFLGNKY361 ESCTSAGRSD GKMWCATTAN YDDDRKWGFC PDQGYSLFLV401 AAHEFGHAMG LEHSQDPGAL MAPIYTYTKN FRLSQDDIKG441 IQELYGASPD IDLGTGPTPT LGPVTPEICK QDIVFDGIAQ481 IRGEIFFFKD RFIWRTVTPR DKPMGPLLVA TFWPELPEKI521 DAVYEAPQEE KAVFFAGNEY WIYSASTLER GYPKPLTSLG541 LPPDVQRVDA AFNWSKNKKT YIFAGDKFWR YNEVKKKMDP601 GFPKLIADAW NAIPDNLDAV VDLQGGGHSY FFKGAYYLKL641 ENQSLKSVKF GSIKSDWLGC9個(gè)MMP氨基酸序列切割區(qū)的加強(qiáng)成對(duì)序列比對(duì)是使用CLUSTALTM(Higgins等，1992)程序計(jì)算的。該比對(duì)限定了活化蛋白酶切割位點(diǎn)側(cè)翼的保守及非保守氨基酸的位置。挑選活化切割位點(diǎn)的任意數(shù)量的N-末端氨基酸和C-末端氨基酸數(shù)進(jìn)行比對(duì)。MMP序列(表1)的比對(duì)在圖1中給出，表明所有MMP活化區(qū)都可以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的方式進(jìn)行比對(duì)。為了進(jìn)行比對(duì)所選擇的區(qū)大體上與氨基酸70-120相對(duì)應(yīng)，假定MMP結(jié)構(gòu)的平均信號(hào)序列為氨基酸1-20，前肽結(jié)構(gòu)域?yàn)榘被?1-100，成熟活性酶則來源于氨基酸101到末端。為了進(jìn)行研究而選擇的19聚體(SEQ ID NO11)序列包含在比對(duì)區(qū)內(nèi)。具體而言，在MMP-2中，19聚體(SEQ ID NO11)與氨基酸100-118相對(duì)應(yīng)。
MMP序列的比對(duì)表明，活化結(jié)構(gòu)域的中心區(qū)PRCGVPDV(SEQ ID NO1)是高度保守的，該區(qū)域側(cè)翼有較大程度的序列變異。序列異質(zhì)性可用于設(shè)計(jì)能夠抑制特異性MMP酶，或MMP組合的肽序列，這一點(diǎn)是通過選擇氨基酸(以所述比對(duì)為基礎(chǔ))進(jìn)行的。此外，改變特定肽的長度以調(diào)節(jié)效力。
MMP-1酶原的三維結(jié)構(gòu)在圖2中提供，表明表1和圖1所示的活化區(qū)各自構(gòu)成一個(gè)橋，從而將兩個(gè)大的球形結(jié)構(gòu)域相互連接起來。切割區(qū)被定義為一種短的非結(jié)構(gòu)化的結(jié)構(gòu)域，它將前肽結(jié)構(gòu)域連接于活性酶結(jié)構(gòu)域。作為活化步驟的一部分，該序列被切割為兩半。它還是對(duì)HgCl2介導(dǎo)的體外活化敏感的區(qū)域。
活化可除去露出成熟酶活性位點(diǎn)的空間阻斷(即，前肽的結(jié)構(gòu)域)。N-末端接近催化鋅離子，該離子通常是酶活性所需的。活性MMP-9的結(jié)構(gòu)在圖3中給出，鋅離子以實(shí)心的球形表示。第二個(gè)鋅離子是一種結(jié)構(gòu)性離子，即，它有助于蛋白的穩(wěn)定，但不能催化。19聚體(SEQ IDNO11)肽的C-末端部分現(xiàn)在成為酶的極端氨基末端，如圖3左側(cè)所示，作為最后一個(gè)環(huán)的上升部分(交叉線陰影部分)。從活化結(jié)構(gòu)域肽到活化MMP的表面的模型化表明，該肽(特別是，如果包括較長的N-末端區(qū))可與活性位點(diǎn)區(qū)相互作用，實(shí)際上，阻斷底物接近活性位點(diǎn)。以此方式，它可起到微型酶原結(jié)構(gòu)域或酶的“帽”的作用。
已知酶可被蛋白水解成片段，這些片段進(jìn)行重構(gòu)，從而再生活性酶。各種肽結(jié)構(gòu)域重新聚集，并被非共價(jià)分子間力結(jié)合在一起。這種肽-蛋白相互作用的典型例子包括核糖核酸酶S-肽/核糖核酸酶S-蛋白的相互作用(Levit和Berger，1976)。核糖核酸酶S-肽在適當(dāng)?shù)奈恢门cS-蛋白結(jié)合，所得復(fù)合物恢復(fù)了RNASE-S的酶活性。
根據(jù)本發(fā)明，活化結(jié)構(gòu)域肽可與區(qū)域中的活化MMP再次結(jié)合，其中它們存在于形成非活性復(fù)合物的MMP酶原中。這種結(jié)合是可以測量的(見下文)。此外，19聚體(SEQ ID NO11)肽可通過其半胱氨酸殘基與鋅離子配合，防止催化。
MMP酶活性的抑制第一項(xiàng)抑制研究是用來源于MMP-2切割結(jié)構(gòu)域區(qū)的19氨基酸肽(SEQ ID NO11)進(jìn)行的。該肽是從CLUSTAL序列比對(duì)區(qū)中選擇的，證實(shí)了最高程度的保守。所選擇的19聚體(SEQ ID NO11)在N-末端是嚴(yán)格保守的，但在C-末端部分則顯示出較高程度的變異性。此外，還對(duì)代表該肽N-末端和C-末端部分的兩個(gè)較小的肽進(jìn)行了試驗(yàn)。這兩個(gè)部分大致把肽分成保守的N-末端部分(9聚體(SEQ ID NO12))和非-保守的C-末端部分(10聚體(SEQ ID NO13))。這不僅可以測試抑制的總體有效性，而且還可以測試選擇性。
19聚體PRCGNPDVANYNFFPRKPK (SEQ ID NO11)9聚體 PRCGNPDVA(SEQ ID NO12)
10聚體NYNFFPRKPK(SEQ ID NO13)在熒光測定法中，所有這3個(gè)肽都能抑制MMP-9。在所有研究情況下，與兩個(gè)一半的肽相比，19聚體(SEQ ID NO11)是更好的酶抑制劑。9聚體(SEQ ID NO12)與C-末端的10聚體(SEQ ID NO13)肽相比，是更有效的抑制劑。這些結(jié)果表明，半胱氨酸作為鋅配體是必需的，或者需要N-末端區(qū)來影響酶活性位點(diǎn)的空間阻斷。這個(gè)假設(shè)可通過生產(chǎn)含有更多N-末端序列(殘基100之前的有效氨基酸)的抑制劑肽而加以測試。使用19聚體(SEQ ID NO11)滴定MMP-9的典型抑制圖在圖4中給出。
使用10聚體(SEQ ID NO13)和9聚體(SEQ ID NO12)肽進(jìn)行的類似抑制分析分別在圖5和6中表示。在FRET測定法中，各肽都能夠抑制MMP-9，抑制常數(shù)(Ki)為45.2-327.7μM(見表4)。與三個(gè)肽的相對(duì)抑制相比，底物選擇(FRET肽或熒光膠原)的差異較小，但具有一致的趨勢，即19聚體(SEQ ID NO11)＞9聚體(SEQ ID NO12)＞10聚體(SEQ ID NO13)。用肽滴定MMP-9的典型反應(yīng)圖在圖7-9中給出。
總的說來，膠原底物的抑制常數(shù)稍低，膠原為30.3-221.3μM，F(xiàn)RET-肽為45.2-327.7μM。這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)使用膠原底物時(shí)，肽在一定程度上是更有效的抑制劑，表明抑制劑肽可阻斷活性位點(diǎn)，且因?yàn)槟z原明顯比FRET-肽底物更大，因此更容易阻止它接近酶活性位點(diǎn)。較小的FRET-肽底物可能更容易接近活性位點(diǎn)，甚至是在抑制劑肽存在的情況下也是如此。
典型的酶測定(如圖4-7所示)通常進(jìn)行30-40分鐘。延時(shí)測定顯示，19聚體(SEQ ID NO11)可有效抑制MMP-9催化的膠原水解直至超過1000分鐘(圖8)。與9聚體(SEQ ID NO12)肽相比，10聚體(SEQID NO13)肽在長時(shí)間阻止膠原破壞方面不是很有效(圖9)。此外，19聚體(SEQ ID NO11)肽顯示出最大程度的抑制。
對(duì)其它MMP酶進(jìn)行類似的酶研究，從而測試19聚體(SEQ ID NO11)肽的有效性。這些測定法使用的是FRET肽，所述肽把特異性MMP切割位點(diǎn)插入到它們的序列中。19聚體(SEQ ID NO11)肽能夠有效抑制多個(gè)MMP。19聚體(SEQ ID NO11)肽對(duì)各MMP的有效性如下MMP-2＞MMP-3＞MMP-8＞MMP-7＞MMP-9＞MMP-1，抑制劑常數(shù)為3.1μM(MMP-2)-41.1μM(MMP-1)。這些數(shù)據(jù)在表2中總結(jié)。
表4.抑制劑數(shù)據(jù)的總結(jié)

19聚體(SEQ ID NO11)肽的抗剪接活性MMP是以非活性酶原的形式生物合成產(chǎn)生的。利用各類膜結(jié)合MMP對(duì)酶原進(jìn)行蛋白切割可導(dǎo)致MMP活化。酶原前導(dǎo)序列的長度大約為100個(gè)氨基酸(根據(jù)MMP不同它也會(huì)改變)，而且它是在蛋白的最氨基末端被找到的。抑制酶原活化對(duì)于降低慢性創(chuàng)傷中的MMP酶活性而言，可能是一種富有成效的方法。如果這些酶不能發(fā)揮作用，那么ECM降解的速率就會(huì)降低，從而導(dǎo)致慢性創(chuàng)傷愈合的速度加快。
很明顯，活化結(jié)構(gòu)域肽(19聚體(SEQ ID NO11)，9聚體(SEQ IDNO12)，和10聚體(SEQ ID NO13))可抑制各種MMP的酶活性。除這種活性之外，19聚體(SEQ ID NO11)肽還可阻礙MMP-9的酶原(非活性)形式的活化。因此，19聚體(SEQ ID NO11)肽可通過抑制已經(jīng)活化的MMP或通過防止新合成的MMP酶原的活化而降低皮膚和慢性創(chuàng)傷滲出物內(nèi)的總體MMP活性水平。
圖11表示典型的剪接測定。在大約700秒時(shí)洗脫的第一個(gè)峰是MMP-9酶原。隨著剪接反應(yīng)的進(jìn)行，該峰的強(qiáng)度降低(用向下的箭頭標(biāo)記)，并出現(xiàn)了兩個(gè)新的峰。在大約800秒時(shí)洗脫下來的第一個(gè)新的峰是成熟的活性MMP-9。在大約1050秒時(shí)洗脫下來的第二個(gè)新的峰是酶原結(jié)構(gòu)域。隨著剪接反應(yīng)的進(jìn)行，這兩個(gè)峰的強(qiáng)度增加(用向上的箭頭標(biāo)記)。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，沒有檢測到剩余的MMP-9酶原。使用19聚體(SEQ ID NO11)肽滴定標(biāo)準(zhǔn)剪接反應(yīng)可防止MMP-9酶原轉(zhuǎn)化成酶原結(jié)構(gòu)域及活性酶。圖12表示這次滴定的結(jié)果。剪接可使用微摩爾的19聚體(SEQ ID NO11)肽以劑量依賴性的方式抑制。
等溫滴定量熱法量熱法可用于測定19聚體(SEQ ID NO11)肽是否能與活性MMP-9形成穩(wěn)定的非-共價(jià)復(fù)合物。這些數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步理解酶抑制的機(jī)理和19聚體(SEQ ID NO11)肽的抗活化性。圖13表示19聚體(SEQ IDNO11)MMP抑制劑與MMP-9之間相互作用的等溫量熱實(shí)驗(yàn)。將肽溶解在20mM二甲胂酸鹽(pH6.8)，20mM NaCl中，使終濃度達(dá)到1mM。將MMP-9透析到相同的緩沖液中，終濃度為20μM。一系列標(biāo)準(zhǔn)注射是按照上面所述進(jìn)行的。MMP-9與19聚體(SEQ ID NO11)之間相互作用的結(jié)果如下化學(xué)計(jì)量 0.975±0.02ΔH(kcal/mol)-26.1±1.45ΔS(cal mol-1K-1) -11.6±2.2KA(M-1) 1.65×106±4.5×104這些結(jié)果表明19聚體(SEQ ID NO11)肽與MMP-9之間的相互作用是焓驅(qū)動(dòng)的，ΔH為負(fù)值。通過ΔS為負(fù)值可證實(shí)該反應(yīng)不是熵促進(jìn)的。然而，焓這個(gè)術(shù)語的數(shù)量級(jí)比術(shù)語TΔS要大，因此，總的自由能(ΔG)都是負(fù)值。
我們觀察到了19聚體(SEQ ID NO11)與MMP-2的反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)是焓驅(qū)動(dòng)的，并且是熵不利的。圖14所示的等溫量熱分析是通過使用MMP-2滴定19聚體(SEQ ID NO11)產(chǎn)生的。下列值就是從這些實(shí)驗(yàn)獲得的。
化學(xué)計(jì)量 0.99±0.03ΔH(kcal/mol) -15.4±2.05ΔS(cal mol-1K-1)-21.1±1.8KA(M-1)2.40×106±3.7×104因此，結(jié)合反應(yīng)是熵不利的。這大概是由于結(jié)合后構(gòu)型熵的損耗造成的。完全柔韌的肽含有大量自由度。在所有結(jié)合情況中，肽與MMP化學(xué)計(jì)量為1∶1，表明單一的19聚體(SEQ ID NO11)肽可與單一的MMP分子相互作用。
表面等離子共振19聚體(SEQ ID NO11)與MMP-9結(jié)合的動(dòng)力學(xué)研究是使用表面等離子共振(SPR)技術(shù)進(jìn)行的。傳感器芯片是按照制造商推薦的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)把活性MMP-9連接在BIACore，Inc.的CM-5芯片的表面而構(gòu)造的。使19聚體(SEQ ID NO11)在BIACore-XTM儀器中的MMP-9表面上流動(dòng)，并實(shí)時(shí)監(jiān)測結(jié)合及解離。典型的結(jié)合等溫線在圖15中表示。締合相(30-430秒)與單一的結(jié)合位點(diǎn)模型最佳擬合，并產(chǎn)生2.2×104M-1s-1的締合速率常數(shù)。解離相(440-700秒)同樣擬合，并產(chǎn)生4.1×10-3s-1的解離速率常數(shù)(kd)。計(jì)算出來的5.3×106的平衡締合常數(shù)(Ka＝ka/kd)與熱力學(xué)數(shù)據(jù)非常一致。在解離開始時(shí)，觀察到約100個(gè)反應(yīng)單位的批量轉(zhuǎn)運(yùn)作用，它沒有模型化。因此，19聚體(SEQ ID NO11)肽與MMP-9的結(jié)合是動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)促進(jìn)的。
存活力測定法與很多小分子MMP抑制劑不同，當(dāng)把本研究中的三個(gè)肽給予EpiDermTM皮膚模型時(shí)，它們對(duì)細(xì)胞是無毒的。圖16表示，與PBS對(duì)照組相比，兩個(gè)濃度(500μM和2mM)的肽都僅導(dǎo)致存活力稍稍降低。肽的總平均存活力為97.6％(19聚體(SEQ ID NO11))，89.6％(10聚體(SEQ ID NO13))，和95.8％(9聚體(SEQ ID NO12))。這些結(jié)果表明，用于慢性創(chuàng)傷愈合的這種肽治療方法對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞是無毒的。圖16中標(biāo)繪的數(shù)據(jù)是三份樣品的平均值。該研究存活力的標(biāo)準(zhǔn)差為2.2-3.7，而且與劑量或肽的同一性無關(guān)。肽濃度較高時(shí)，存活力稍低。
這些結(jié)果顯示，EpiDermTM皮膚模型中的肽是無毒的，它們是動(dòng)力學(xué)和熵促進(jìn)的，從而與MMP形成結(jié)合復(fù)合物，而且它們可抑制酶活性并防止基質(zhì)金屬蛋白酶活化。
實(shí)施例2利用肽抑制劑使創(chuàng)傷愈合方法創(chuàng)傷是用4mm的活檢鉆孔器在C57BL6/KsJ db/db小鼠中制造的。小鼠從Jackson Laboratories獲得，在開始進(jìn)行創(chuàng)傷方案前，年齡為3-7個(gè)月。在制造創(chuàng)傷前，將所有小鼠麻醉。將皮膚拉離下面的結(jié)構(gòu)，并使鉆孔器穿過分離開的皮膚，從而在每只動(dòng)物的上背部引入兩處創(chuàng)傷。通常，所制造創(chuàng)傷的平均深度為1.7mm，范圍在1.3-2.2mm。在制造創(chuàng)傷的過程中沒有累及肌肉。創(chuàng)傷形成后，立即用標(biāo)準(zhǔn)鹽水(作為非治療對(duì)照組)或5μL 20μg/mL的19聚體肽(SEQ ID NO11)治療。
每天都要對(duì)創(chuàng)傷進(jìn)行數(shù)字照相，并通過使用計(jì)算機(jī)求照片的積分而測定創(chuàng)傷面積。所有創(chuàng)傷的治療和隨后的數(shù)據(jù)分析都是以盲法進(jìn)行的(見，例如，Brown等，1994)。對(duì)所有創(chuàng)傷而言，將形成創(chuàng)傷時(shí)(第0天)的創(chuàng)傷面積任意設(shè)置為1的相對(duì)值；這樣就可通過用第n天的創(chuàng)傷面積除以第0天的創(chuàng)傷面積而把后來的創(chuàng)傷面積轉(zhuǎn)化成相對(duì)創(chuàng)傷面積。
結(jié)果從圖17可看出，單一劑量19聚體肽的使用(在形成創(chuàng)傷時(shí)，第0天)可大大促進(jìn)糖尿病小鼠模型中全部創(chuàng)傷閉合的時(shí)間。用19聚體肽處理過的創(chuàng)傷平均在形成創(chuàng)傷后的9天內(nèi)閉合，而用鹽水對(duì)照組處理過的創(chuàng)傷則在14天內(nèi)閉合。此外，用19聚體肽(SEQ ID NO11)處理過的創(chuàng)傷顯示出，炎癥在創(chuàng)傷形成后的第1天減輕。此外還觀察到，與鹽水對(duì)照組處理過的相比，用19聚體肽(SEQ ID NO11)處理過的創(chuàng)傷開始收縮的過程更快(5天∶8天)。
實(shí)施例3肽抑制劑抑制VEGF表達(dá)在該實(shí)驗(yàn)中，檢驗(yàn)了19聚體(SEQ ID NO11)肽以確定其是否可以刺激血管發(fā)生，允許其建立血管而作為創(chuàng)傷愈合的一種手段，或者其是否具有抑制血管形成的抗血管發(fā)生特性。將19聚體(SEQ ID NO11)肽或其亞單位加入在完全和堿性培養(yǎng)基中生長的人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞(NHDF)，并且溫育24小時(shí)。然后用VEGF引物在細(xì)胞樣品上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，用β肌動(dòng)蛋白的引物作為對(duì)照。如果19聚體(SEQ ID NO11)促進(jìn)血管化而作為創(chuàng)傷愈合的一種手段，VEGF的表達(dá)水平將增加。然而，如果19聚體(SEQ ID NO11)不誘導(dǎo)血管化，與未處理的陰性對(duì)照相比，VEGF的水平將降低。也用作為刺激VEGF表達(dá)的陽性對(duì)照的氯化鈷(CoCl2)處理的細(xì)胞。
材料和方法用于RT-PCR的引物如下
β肌動(dòng)蛋白的PCR引物(Hs.288061)β肌動(dòng)蛋白編碼鏈-20nt5′-AGT CGG TTG GAG CGA GCA TC-3′(SEQ ID NO19)β肌動(dòng)蛋白非編碼鏈-20nt5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′(SEQ ID NO20)VEGF的PCR引物(Hs.334842)VEGF編碼鏈-20nt5′-GCC ACC ACA CCA TCA CCA TC-3′(SEQ ID NO22)VEGF非編碼鏈-20nt5′-CCC AAA GCA CAG CAA TGT CC-3′(SEQ ID NO23)為檢驗(yàn)19聚體(SEQ ID NO11)的體外血管發(fā)生特性，在T25燒瓶中的含有胰島素、hFGF-β、GA-1000和胎牛血清(10mL)的完全FBM培養(yǎng)基(500 mL，Biowhittaker)中增殖正常人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞(NHDF，Biowhittaker，Walkersville，Maryland)。在cFBM和轉(zhuǎn)變至僅含有GA-100的FBM(500mL，Biowhittaker)的培養(yǎng)基中生長至60％匯合后檢驗(yàn)成纖維細(xì)胞。然后在堿性培養(yǎng)基中使這些細(xì)胞生長24小時(shí)，然后引入對(duì)照19聚體(SEQ ID NO11)肽和對(duì)照試劑。
通過Sigma Genesis合成和純化肽，并且在HPLC后通過質(zhì)譜分析純度。用大約20mg肽制備含有溶于PBS的濃度為10mg/mL的新鮮原液，用200μl該原液向每個(gè)T25燒瓶中定量加入成纖維細(xì)胞。在達(dá)到75％匯合后定量加入成纖維細(xì)胞，并且在37℃/5％CO2下溫育過夜。
在所述肽抑制劑存在下溫育后，使用無苯酚總RNA分離試劑盒(Ambion，Austin，TX)從成纖維細(xì)胞提取RNA。為了從成纖維細(xì)胞提取RNA，將來自該試劑盒的750μl裂解緩沖液加入每個(gè)T25燒瓶。用小細(xì)胞刮刀刮燒瓶，并且收集在微量離心管中。按照制造商的程序從細(xì)胞提取總RNA。
為了將RNA轉(zhuǎn)化至cDNA，使用來自于Genisphere(Montvale，NJ)的3DNA表達(dá)陣列檢測試劑盒的部分。使用的程序如下將按上述方法分離的3μL總RNA與3μL RT引物(0.2pmole)(Cy5 RT Primer Oligo 0.067pMole/ml)和4μL DEPC處理的水(Ambion)混合。將該混合物加熱至80℃10分鐘，放置在冰上10分鐘，然后離心。在另一試管中混合以下試劑4μL 5X RT緩沖液、1μL dNTP混合物、4μL DEPC處理的水(Ambion)和1μL逆轉(zhuǎn)錄酶(200單位/ml)。將10μL RNA加引物的混合物與10μL逆轉(zhuǎn)錄酶溶液混合，產(chǎn)生20μL反應(yīng)混合物。在42℃下溫育反應(yīng)混合物2小時(shí)。該反應(yīng)的產(chǎn)物是用于PCR的cDNA。
將兩組引物用于PCR。對(duì)照引物包括β肌動(dòng)蛋白(Hs.288061)編碼鏈引物5′-AGT CGG TTG GAG CGA GCA TC-3′(SEQ ID NO19)和β肌動(dòng)蛋白非編碼鏈引物5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′(SEQ ID NO20)。VEGF引物組(Hs.334842)包括VEGF編碼鏈5′-GCC ACC ACA CCA TCACCA TC-3′(SEQ ID NO22)和VEGF非編碼鏈5′-CCC AAA GCA CAG CAATGT CC-3′(SEQ ID NO23)。將β肌動(dòng)蛋白引物用作通用對(duì)照，因?yàn)棣录?dòng)蛋白R(shí)NA在大多數(shù)細(xì)胞類型中以顯著量存在。在使用的測定中，β肌動(dòng)蛋白R(shí)NA產(chǎn)生了約300bp的RT-PCR帶，而VEGF RNA產(chǎn)生了約760bp的RT-PCR帶。
對(duì)于每個(gè)PCR反應(yīng)，混合以下試劑2μL cDNA、38μL PCR級(jí)水、5μL 10X AdvantageTM2 PCR緩沖液(Clonetech)、1μL 50X AdvantageTM2 dNTP混合物(Clonetech)。渦旋含該P(yáng)CR反應(yīng)混合物的試管，反轉(zhuǎn)，然后置于熱循環(huán)儀中。熱循環(huán)儀程序如下熱起始(95℃，5min.)，然后是一系列可變循環(huán)(15-25)，95℃((30sec.)，65℃(1min.)，68℃(3min.)，最后是68℃下10分鐘的補(bǔ)齊步驟。當(dāng)完成PCR反應(yīng)時(shí)，在2％瓊脂糖凝膠上對(duì)10μL反應(yīng)混合物進(jìn)行電泳，以進(jìn)行顯現(xiàn)。帶的強(qiáng)度與VEGF基因和β肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平成比例。
為進(jìn)一步證實(shí)所觀察到的VEGF表達(dá)的改變，用QuantikineTM人VEGF免疫測定(R & D Systems，MN)檢驗(yàn)在19聚體(SEQ ID NO11)處理的cFBM中生長并且溫育過夜的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液存在可檢測水平的分泌的VEGF時(shí)，該免疫測定產(chǎn)生了顏色改變。采用此免疫測定，陽性試劑盒對(duì)照正確工作并且提供顏色改變。然而，來自于CoCl2陽性對(duì)照的上清液樣品、陰性對(duì)照和19聚體(SEQ ID NO11)處理的細(xì)胞沒有表現(xiàn)出任何可檢測的VEGF活性。這被認(rèn)為是與培養(yǎng)基中的低VEGF濃度相聯(lián)系，因此隨后在CentriconTM過濾裝置(Micon)上濃縮上清液，并且用更濃縮的上清液再次嘗試QuantikineTM測定。該測定再次表現(xiàn)出相同的陰性結(jié)果。
結(jié)果成纖維細(xì)胞(NHDF)對(duì)用于該實(shí)驗(yàn)是理想的，因?yàn)樗鼈冊趧?chuàng)傷愈合的增殖期是常見的。未處理的成纖維細(xì)胞用作陰性對(duì)照。在相同的條件下(37℃/50CO2)在溫育箱中維持所有細(xì)胞。對(duì)于處理過的樣品，在培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變過程中將200μL 19聚體(SEQ ID NO11)肽與5mL cFBM一起加入T25燒瓶。在取樣前溫育過夜。為了作為這些實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照，用5μL 100μM氯化鈷(CoCl2)處理NHDF細(xì)胞4小時(shí)。已知氯化鈷誘導(dǎo)或上調(diào)VEGF的表達(dá)但隨時(shí)間對(duì)細(xì)胞有毒性。
當(dāng)用19聚體(SEQ ID NO11)肽處理時(shí)，在cFBM中標(biāo)準(zhǔn)條件下生長的成纖維細(xì)胞顯著降低VEGF表達(dá)水平，這是由RT-PCR所指示的。這些水平甚至顯著低于陰性對(duì)照所觀察到的VEGF表達(dá)水平。在含有19聚體(SEQ IDNO11)肽處理的細(xì)胞的PCR RT產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠的照片中，VEGF帶幾乎不可見(圖18)。相反，陰性對(duì)照產(chǎn)生了微弱但可分辨的帶(圖18)。通過RT-PCR觀察時(shí)，氯化鈷的使用提供了與陰性對(duì)照相比的預(yù)料到的VEGF表達(dá)的上調(diào)。
圖19和20進(jìn)一步說明，使用200μL 10mg/ml的19聚體(SEQ IDNO11)，19聚體(SEQ ID NO11)肽顯著基本抑制了成纖維細(xì)胞中的所有VEGF表達(dá)。
為了比較并計(jì)算19聚體(SEQ ID NO11)與陰性對(duì)照的表達(dá)水平，使用了稱作Image Quant(Molecular Dynamics，Amersham Pharmacia)的程序?qū)У谋磉_(dá)水平進(jìn)行定量。采用此程序，在感興趣的帶周圍畫一個(gè)框，并且從總體背景中扣除，然后與陰性對(duì)照相比。對(duì)陰性對(duì)照、CoCl2和19聚體(SEQ ID NO11)進(jìn)行計(jì)算。這三種樣品的表達(dá)水平見表5。
表5定量的表達(dá)水平

如表5中所見，CoCl2上調(diào)VEGF的表達(dá)，而19聚體(SEQ ID NO11)顯著下調(diào)表達(dá)水平-甚至低于對(duì)照組。在不同日中使用從不同T25燒瓶中得到的在cFBM中生長的NHDF細(xì)胞重復(fù)該實(shí)驗(yàn)數(shù)次，以獲得用于取樣的新的總RNA。該結(jié)果是高度可重復(fù)的，總是表示與未處理的和陰性對(duì)照處理的細(xì)胞相比，VEGF在19聚體(SEQ ID NO11)處理的成纖維細(xì)胞中下調(diào)。
如實(shí)施例2中所示，19聚體(SEQ ID NO11)肽的應(yīng)用顯著加速了實(shí)驗(yàn)的糖尿病小鼠模型中的完全創(chuàng)傷閉合。在成年動(dòng)物中，除創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育和腫瘤形成時(shí)，通常沒有血管發(fā)生。出乎意料的是，該19聚體(SEQ ID NO11)肽似乎沒有血管發(fā)生特性，相反，甚至與已知降低VEGF表達(dá)水平的陰性對(duì)照化合物相比也提供了顯著阻遏的VEGF水平。
目前抗血管發(fā)生肽和分子被用于在腫瘤和其它血管發(fā)生疾病的調(diào)節(jié)中抑制血管發(fā)生。EndostatinTM和AngiostatinTM是用于腫瘤生長調(diào)節(jié)的兩種有效蛋白(Kim，Y.et al.EndostatinT″blocks VEGF-mediatedsignaling via direct interaction with KDR/Flk-1.J Biol Chem2002；May 23)。19聚體(SEQ ID NO11)肽也可以阻遏血管形成，因?yàn)樗抡{(diào)VEGF血管發(fā)生基因的表達(dá)。
參考文獻(xiàn)以下參考文獻(xiàn)和此處引用的任何其它參考文獻(xiàn)都在此引入作為參考。
Agren，M.S.(1999).Matrix metalloproteinases(MMPs)are required for re-epithelialization of cutaneous wounds.Arch.Dermatol.Res.291，583-590.
Baker，E.，et al.Proteinases，their inhibitors，and cytokine profiles in acute wound fluid.
Wound Repair Regen.2000 Sep-Oct；8(5)392-8.
Becker，J.W.，Marcy，A.I.，Rokosz，L.L.，Axel，M.G.，Burbaum，J.J.，F(xiàn)itzgerald，P.M.，Cameron，P.M.，Esser，C.K.，Hagmann，W.K.，Hermes，J.D.，and Springer，J.P.(1995).
Stromelysin-1Three dimensional structure of the inhibited catalytic domain andof the C-truncated proenzyme.Protein Sci.4，1966-76.
Brown，RL.，Breeden，MP.，and Greenhalgh，MD.，(1994).PDGF and TGF-a actsynergistically to improve wound healing in the genetically diabetic mouse.J.Surg.
Res.56，562-570.
Browner，M.F.，Smith，W.W.，Castelhano，A.L.(1995).Matrilysin-inhibitor complexesCommon themes among 18 metalloproteinases.Biochemistry 34，6602-10.
Calvin，M.Cutaneous wound repair.Wounds 1998；10(1)12-32.
Di Colandrea，T.，Wang，L.，Wille，J.，D’Armiento，J.，and Chada，K.K.(1998).Epidermalexpression of collagenase delays wound healing in transgenic mice.J.Invest.
Dermatol.111，1029-1033.
Duivenvoorden，W.C.M.，Hirte，H.W.，and Singh，G.(1997).Use of tetracycline as aninhibitor ofmatrix metalloproteinase activity secreted by human bonemetastasizing cancer cells.Invasion and Metas.17，312-322.
Fernandez-Catalan，C.，Bode，W.，Huber，R.，Turk，D.，Calvete，J.J.，Lichte，A.，Tschesche，H.，and Maskos，K.(1998).Crystal structure of the complex formed bymembrane type-1 matrix metalloproteinase with the tissue inhibitor ofmetalloproteinases-2，the soluble progelatinase A receptor.EMBO J.17，5238-48.
Freire，E.，van Osdol，WW.，Mayorga，OL，and Sanchez-Ruiz，JM.(1990).
Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins.
Annu Rev Biophys Biophys Chem.19，159-88.
Gomis-Ruth，F(xiàn).X.，Maskos，K.，Betz，M.，Bergner，A.，Huber，R.，Suzuki，K.，Yoshida，N.，Nagase，H.，Brew，K.，Bourenkov，G.P.，Bartunik，H.，and Bode，W.(1997).
Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by
TIMP-1.Nature 389，77-81.
Grams，F(xiàn).，Reinemer，P.，Powers，J.C.，Kleine，T.，Pieper，M.，Tschesche，H.，Huber，R.，Bode，W.(1995).X-ray structures of human neutrophil collagenase complexed withpeptide hydroxamate and peptide thiol inhibitorsImplications for substrate bindingand rational drug design.Eur.J.Biochem.228，830-834.
Guex，N.and Peitsch，M.C.(1997).Swiss Model and the Swiss-Pdb ViewerAnenvironment for comparative protein modeling.Electrophoresis 18，2714-2723.
Higgins，DG.，Bleasby，AJ.，and Fuchs，R.(1992).CLUSTAL Vimproved software formultiple sequence alignment.Comput Appl Biosci.，8(2)，189-91.
Howard，E.W.，Bullen，E.C.，and Banda，M.J.(1991).Preferential inhibition of 72 and 92kDa gelatinase by tissue inhibitor of metalloproteinase-2.J.Biol.Chem.266，13070-13075.
Huang，W.，Suzuki，K.，Nagase，H.，Arumugam，S.，Van Doren，S.R.，and Brew，K.(1996).
Folding and characterization of the amino terminal domain of human tissueinhibitor of metalloproteinases-1(TIMP-1)expressed at high yield in E.coli.
FEBS Lett.384，155-161.
Karlsson，R.，and Falt，A.(1997).Experimental design for kinetic analysis of protein-protein interactions with surface plasmon resonance biosensors.J.Immunol.
Meths.200，121-33.
Kim，Y.et al.Endostatin blocks VEGF-mediated signaling via direct interaction withKDR/Flk-1.J Biol Chem 2002；May 23.
Lakowicz，J.R.(1983).Principles of Fluorescence Spectroscopy，Chapter 10，PlenumPress，New York，London.
Levenson，S.，et al.The Healing of Rat Skin Wounds.Ann.Surg.1965；161293-308.
Levit，S.，and Berger，A.(1976).Ribonuclease S-peptide.A model for molecularrecognition.J.Biol.Chem.251，1333-9.
Levy，D.E.，Lapierre，F(xiàn).，Liang，W.，Ye，W.，Lange，C.W.，Li，X.，Grobelny，D.，Casabonne，M.，Tyrrell，D.，Holme，K.，Nadzan，A.，and Galardy，R.E.(1998).
Matrix metalloproteinase inhibitorsA structure activity study.J.Med.Chem.41，199-223.
Li，J.，Brick，P.，O’Hare，M.C.，Skarzynski，T.，Lloyd，L.F.，Curry，V.A.，Clark，I.M.，Bigg，H.F.，Hazleman，B.L.，Cawston，T.E.et al.(1995).Structure of full-lengthporeine synovial collagenase reveals a C-terminal domain containing a calcium-
linked，four-bladed beta-propeller.Structure 3，pp.541-49.
Libson，A.M.，Gittis，A.G.，Collier，I.E.，Marmer，B.L.，Goldberg，G.I.，and Lattman，E.E.
(1995).Crystal structure of the haemopexin-like C terminal domain of gelatinase A.
Nat.Struct.Biol.2，938-42.
Lofas，S.，Johnsson，B.，Tegendahl，K.，and Ronnberg，I.(1993).Dextran modified goldsurfaces for surface plasmon resonance biosensors；immunoreactivity ofimmobilized antibodies and antibody-surface interaction studies.J.ColloidInterface Sci.65，423-431.
Morton，T.A.，Myska，D.G.，and Chaiken，I.M.(1995).Interpreting complex bindingkinetics from optical biosensorsA comparison of analysis by linearization，theintegrated rate equation，and numerical integration.Anal.Biochem.227，176-185.
Moses，M.A.，Marikovsky，M.，Harper，J.W.，Vogt，P.，Eriksson，E.，Klagsbrun，M.andLanger，R.(1996).Temporal study of the activity of matrix metalloproteinases andtheir endogenous inhibitors during wound healing.J.Cell.Biochem.60，379-386.
Nwomech，B.，et al.Dynamics of the matrix metalloproteinases MMP-1 and MMP-8 inacute open human dermal wounds.Wound Repair Regen.1998 Mar-Apr；6(2)127-34.
Odake，S.，Morita，Y.，and Morikawa，T.(1994).Inhibition of matrix metalloproteinases bypeptidyl hydroxamic acids.Biochem.Biophys.Res.Comm.199，1442-1446.
Olson，M.W.，Gervasi，D.C.，Mobashery，S.，and Fridman，R.(1997).Kinetic analysis ofthe binding of human matrix metalloproteinase 2 and 9 to tissue inhibitor ofmetalloproteinase(TIMP)-1 and TIMP-2.J.Biol.Chem.272，29975-29983.
O’Shannessy，D.J.，Brigham-Burke，M.，Soneson，K.K，Hensley，P.，and Brooks，I.(1993).
Determination of rate and equilibrium binding constants for macromolecularinteractions using surface plasmon resonanceuse of non linear least squaresanalysis methods.Anal. Biochem.212，457-468.
Reinemer，P.，Grams，F(xiàn).，Huber，R.，Kleine，T.，Schnierer，S.，Pieper，M.，Tschesche，H.，Bode，W.(1994).Structural implications for the role of the N terminus in thesuperactivation of collagenasesA crystallographic study.FEBBS Lett.338，227-33.
Saarialho-Kere，U.K.(1998).Patterns of matrix metalloproteinase and TIMP expression inchronic ulcers.Arch.Dermatol.Res.290(suppl)，47-54.
Sayle，R.A.and Milner-White，E.J.(1 995).RasMolBiomolecular graphics for all.Trends
in Biochemical Sciences 20，374-376.Segel，IH.(1993)Enzyme KineticsBehavior and analysis of rapid equilibrium andsteady-state enzyme systems.Wiley Classics Library，John Wiley and Sons，Inc.
New York.Singer，A.J.，et al.Cutaneous Wound Healing.New Eng.J.of Med.1999；Vol.341，No.
10738-746.Su，J-L.，Becherer，D.，Edwards，C.，Bukhart，W.，McMgeehan，G.M.，and Champion，B.R.
(1995).Monoclonal antibodies against human collagenase and stromelysin.
Hybridoma.14，383-390.Taylor，K.B.，Windsor，J.L.，Caterina，N.C.M.，Bodden，M.K.，and Engler，J.A.(1996).
The mechanism of inhibition of collagenase by TIMP-1.J.Biol.Chem.271，2393823945.Tuuttila，A.，Morgunov，E.，Bergmann，U.，Lindqvist，Y.，Maskos，K.，F(xiàn)ernandez-Catalan，C.，Bode，W.，Tryggvason，K.，and Schneider，G.(1998).Three dimensionalstructure of human tissue inhibitor of metalloproteinases-2 at 2.1  resolution.J.
Mol.Biol.284，1133-1140.U.S.markets for wound management products.Irvine，CalifMedical Data International，Aug.1997.Vaalamo，M.，Weckroth，M.，Puolakkainen，P.，Kere，J.，Saarinen，P.，Lauharanta，J.，andSaarialho-Kere，U.K.(1996).Patterns of matrix metalloproteinase and TIMP-1expression in chronic and normally healing human cutaneous wounds.Brit.J.
Dermatol.135，52-59.Vaalamo，M.，Mattila，L.，Johansson，N.，Kariniemi，A-L.，Karjalainen-Lindsberg，L.，Kahari，V-M.，and Saarialho-Kere，U.K.(1997).Distinct populations of stromal cellsexpress collagenase-3(MMP-13)and collagenase-1(MMP-1)in chronic ulcers，butnot in normally healing wounds.J.Investig.Dermatol.109，96-101.Weckroth，M.，Vaheri，A.，Lauharanta，J.，Sorsa，T.，and Konttinen，Y.T.(1996).Matrixmetalloproteinases，gelatinases，and collagenases in chronic leg ulcers.J.Investig.
Dermatol.108，1119-1124.Wojtowicz-Praga，S.M.，Dickson，R.B.，and Hawkins，M.J.(1997).Matrixmetalloproteinase inhibitors.Investigational new Drugs.15，61-75.
序 列 表序列表<110>S.夸克I.F.沃特<120>抗癌并使創(chuàng)傷愈合的化合物<130>17950<150>US 10/032,376<151>2001-12-21<150>US 60/312,726<151>2001-08-16<160>23<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>8<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val1 5<210>2<211>44<212>PRT<213>人<400>2Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn1 5 10 15Thr Ile Glu Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala20 25 30Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Asp35 40<210>3<211>50<212>PRT<213>人
<400>3Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Asp Asn1 5 10 15Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Lys Met Asn Leu35 40 45Thr Tyr50<210>4<211>56<212>PRT<213>人<400>4Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Glu Thr Gly Lys Leu Ser Pro Arg1 5 10 15Val Met Glu Ile Met Gln Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala20 25 30Glu Phe Ser Leu Met Pro Asn Ser Pro Lys Trp His Ser Arg Thr Val35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Ser Tyr Thr50 55<210>5<211>54<212>PRT<213>人<400>5Met Gln Lys Phe Leu Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Ser Asp1 5 10 15Thr Leu Glu Val Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30His Phe Arg Thr Phe Pro Gly Ile Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Asn50<210>6<211>55<212>PRT<213>人<400>6Met Gln Lys Phe Leu Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Thr Asp1 5 10 15
Thr Leu Glu Val Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30His Phe Ser Ser Phe Pro Gly Met Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr50 55<210>7<211>54<212>PRT<213>人<400>7Met Gln His Phe Leu Gly Leu Lys Val Thr Gly Gln Leu Asp Thr Ser1 5 10 15Thr Leu Glu Met Met His Ala Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val His20 25 30His Phe Arg Glu Met Pro Gly Gly Pro Val Trp Arg Lys His Tyr Ile35 40 45Thr Tyr Arg Ile Asn Asn50<210>8<211>47<212>PRT<213>人<400>8Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala1 5 10 15Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly20 25 30Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys Trp His His His Asn35 40 45<210>9<211>54<212>PRT<213>人<400>9Met Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu1 5 10 15Thr Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala20 25 30Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp Glu Gln Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Glu Asn
50<210>10<211>55<212>PRT<213>人<400>10Met Gln Arg Phe Phe Gly Leu Asn Val Thr Gly Lys Pro Asn Glu Glu1 5 10 15Thr Leu Asp Met Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Ser Gly20 25 30Gly Phe Met Leu Thr Pro Gly Asn Pro Lys Trp Glu Arg Thr Asn Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Arg Asn Tyr50 55<210>11<211>19<212>PRT<213>人<400>11Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg1 5 10 15Lys Pro Lys<210>12<211>9<212>PRT<213>人<400>12Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala1 5<210>13<211>10<212>PRT<213>人<400>13Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys1 5 10<210>14<211>660
<212>PRT<213>人<400>14Met Glu Ala Leu Met Ala Arg Gly Ala Leu Thr Gly Pro Leu Arg Ala1 5 10 15Leu Cys Leu Leu Gly Cys Leu Leu Ser His Ala Ala Ala Ala Pro Ser20 25 30Pro Ile Ile Lys Phe Pro Gly Asp Val Ala Pro Lys Thr Asp Lys Glu35 40 45Leu Ala Val Gln Tyr Leu Asn Thr Phe Tyr Gly Cys Pro Lys Glu Ser50 55 60Cys Asn Leu Phe Val Leu Lys Asp Thr Leu Lys Lys Met Gln Lys Phe65 70 75 80Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn Thr Ile Glu Thr85 90 95Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn Tyr Asn Phe100 105 110Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Asp Lys Asn Gln Ile Thr Tyr Arg Ile115 120 125Ile Gly Tyr Thr Pro Asp Leu Asp Pro Glu Thr Val Asp Asp Ala Phe130 135 140Ala Arg Ala Phe Gln Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Arg Phe Ser145 150 155 160Arg Ile His Asp Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Asn Phe Gly Arg Trp165 170 175Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala180 185 190His Ala Phe Ala Pro Gly Thr Gly Val Gly Gly Asp Ser His Phe Asp195 200 205Asp Asp Glu Leu Trp Thr Leu Gly Glu Gly Gln Val Val Arg Val Lys210 215 220Tyr Gly Asn Ala Asp Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Leu Phe Asn225 230 235 240Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys Thr Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly Phe245 250 255Leu Trp Cys Ser Thr Thr Tyr Asn Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr Gly260 265 270Phe Cys Pro His Glu Ala Leu Phe Thr Met Gly Gly Asn Ala Glu Gly275 280 285Gln Pro Cys Lys Phe Pro Phe Arg Phe Gln Gly Thr Ser Tyr Asp Ser290 295 300Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr305 310 315 320Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala325 330 335Met Ser Thr Val Gly Gly Asn Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe Pro340 345 350
Phe Thr Phe Leu Gly Asn Lys Tyr Glu Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg355 360 365Ser Asp Gly Lys Met Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Asp Asp370 375 380Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val385 390 395 400Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Met Gly Leu Glu His Ser Gln Asp405 410 415Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg420 425 430Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Glu Leu Tyr Gly Ala Ser435 440 445Pro Asp Ile Asp Leu Gly Thr Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Val450 455 460Thr Pro Glu Ile Cys Lys Gln Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gln465 470 475 480Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr485 490 495Val Thr Pro Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe500 505 510Trp Pro Glu Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln515 520 525Glu Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser530 535 540Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly545 550 555 560Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys565 570 575Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn580 585 590Glu Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp595 600 605Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln610 615 620Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu625 630 635 640Glu Asn Gln Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp645 650 655Trp Leu Gly Cys660<210>15<211>43<212>PRT<213>人<400>15Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn
1 5 10 15Thr Ile Glu Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala20 25 30Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp35 40<210>16<211>43<212>PRT<213>人<400>16Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala1 5 10 15Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly20 25 30Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys Trp35 40<210>17<211>43<212>PRT<213>人<400>17Met Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu1 5 10 15Thr Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala20 25 30Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp35 40<210>18<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>能夠抑制金屬蛋白酶活性的肽<221>位點(diǎn)<222>2<223>Xaa＝谷氨酰胺或谷氨酸<221>位點(diǎn)<222>5<223>Xaa＝天門冬氨酸或谷氨酸
<221>位點(diǎn)<222>8<223>Xaa＝谷氨酰胺或絲氨酸<221>位點(diǎn)<222>9<223>Xaa＝天門冬酰胺或丙氨酸<221>位點(diǎn)<222>11<223>Xaa＝異亮氨酸或亮氨酸<221>位點(diǎn)<222>(12)...(12)<223>Xaa＝谷氨酸或賴氨酸<221>位點(diǎn)<222>(13)...(13)<223>Xaa＝蘇氨酸或丙氨酸<221>位點(diǎn)<222>(16)...(16)<223>Xaa＝賴氨酸或蘇氨酸<221>位點(diǎn)<222>(21)...(21)<223>Xaa＝纈氨酸或天門冬酰胺<221>位點(diǎn)<222>(24)...(24)<223>Xaa＝纈氨酸或亮氨酸<221>位點(diǎn)<222>(25)...(25)<223>Xaa＝丙氨酸或甘氨酸<221>位點(diǎn)<222>(26)...(26)<223>Xaa＝天門冬酰胺或精氨酸<221>位點(diǎn)<222>(27)...(27)<223>Xaa＝酪氨酸或苯丙氨酸<221>位點(diǎn)<222>(28)...(28)<223>Xaa＝天門冬酰胺或谷氨酰胺
<221>位點(diǎn)<222>(29)...(29)<223>Xaa＝苯丙氨酸或蘇氨酸<221>位點(diǎn)<222>(31)...(31)<223>Xaa＝脯氨酸或谷氨酸<221>位點(diǎn)<222>(32)...(32)<223>Xaa＝精氨酸或甘氨酸<221>位點(diǎn)<222>(33)...(33)<223>Xaa＝賴氨酸或天門冬氨酸<221>位點(diǎn)<222>(34)...(34)<223>Xaa＝脯氨酸或亮氨酸<400>18Pro Xaa Thr Gly Xaa Leu Asp Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Met Arg Xaa1 5 10 15Pro Arg Cys Gly Xaa Pro Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Lys35<210>19<211>20<212>DNA<213>人<400>19agtcggttgg agcgagcatc20<210>20<211>20<212>DNA<213>人<400>20gggcacgaag gctcatcatt20<210>21<211>35<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>能夠抑制金屬蛋白酶活性的肽<221>位點(diǎn)<222>2<223>Xaa＝谷氨酰胺或谷氨酸<221>位點(diǎn)<222>5<223>Xaa＝天門冬氨酸或谷氨酸<221>位點(diǎn)<222>8<223>Xaa＝谷氨酸或絲氨酸<221>位點(diǎn)<222>9<223>Xaa＝天門冬酰胺或丙氨酸<221>位點(diǎn)<222>11<223>Xaa＝異亮氨酸或亮氨酸<221>位點(diǎn)<222>(12)...(12)<223>Xaa＝谷氨酸或賴氨酸<221>位點(diǎn)<222>(13)...(13)<223>Xaa＝蘇氨酸或丙氨酸<221>位點(diǎn)<222>(16)...(16)<223>Xaa＝賴氨酸或蘇氨酸<221>位點(diǎn)<222>(17)...(17)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(18)...(18)<223>Xaa＝任何堿性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(19)...(19)<223>Xaa＝任何半胱氨酸樣氨基酸
<221>位點(diǎn)<222>(20)...(20)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(21)...(21)<223>Xaa＝任何極性或脂族氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(22)...(22)<223>Xaa＝任何非極性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(23)...(23)<223>Xaa＝任何酸性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(24)...(24)<223>Xaa＝任何脂族或極性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(25)...(25)<223>Xaa＝任何脂族、非極性或堿性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(26)...(26)<223>Xaa＝任何極性、酸性、堿性或非極性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(27)...(27)<223>Xaa＝任何極性或芳族氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(28)...(28)<223>Xaa＝任何極性、堿性、脂族或非極性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(29)...(29)<223>Xaa＝任何芳族、脂族、極性或酸性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(30)...(30)<223>Xaa＝任何芳族、非極性或極性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(31)...(31)<223>Xaa＝任何非極性或酸性氨基酸
<221>位點(diǎn)<222>(32)...(32)<223>Xaa＝任何堿性、極性或非極性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(33)...(33)<223>Xaa＝任何堿性、極性、脂族、非極性或酸性氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(34)...(34)<223>Xaa＝任何極性或脂族氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(35)...(35)<223>Xaa＝任何堿性或脂族氨基酸<400>21Pro Xaa Thr Gly Xaa Leu Asp Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Met Arg Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa35<210>22<211>20<212>DNA<213>人<400>22gccaccacac catcaccatc20<210>23<211>20<212>DNA<213>人<400>23cccaaagcac agcaatgtcc20
權(quán)利要求
1.一種用于抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)的組合物，含有有效量的式I的肽和藥學(xué)上可接受的載體Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非極性氨基酸；Xaa2是堿性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸樣氨基酸；Xaa5是極性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或極性氨基酸；Xaa9是脂族，非極性或堿性氨基酸；且其中所述肽可抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)。
2.一種用于抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)的組合物，含有有效量的式II的肽和藥學(xué)上可接受的載體Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)其中Xaa10是極性，酸性，堿性或非極性氨基酸；Xaa11是極性或芳族氨基酸；Xaa12是極性，堿性，脂族或非極性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，極性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非極性或極性氨基酸；Xaa15是非極性或酸性氨基酸；Xaa16是堿性，極性或非極性氨基酸；Xaa17是堿性，極性，脂族，非極性或酸性氨基酸；Xaa18是非極性或脂族氨基酸；Xaa19是堿性或脂族氨基酸；且其中所述肽可抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)。
3.一種用于抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)的組合物，含有有效量的式III的肽和藥學(xué)上可接受的載體Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非極性氨基酸；Xaa2是堿性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸樣氨基酸；Xaa5是極性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或極性氨基酸；Xaa9是脂族，非極性或堿性氨基酸；Xaa10是極性，酸性，堿性或非極性氨基酸；Xaa11是極性或芳族氨基酸；Xaa12是極性，堿性，脂族或非極性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，極性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非極性或極性氨基酸；Xaa15是非極性或酸性氨基酸；Xaa16是堿性，極性或非極性氨基酸；Xaa17是堿性，極性，脂族，非極性或酸性氨基酸；Xaa18是非極性或脂族氨基酸；Xaa19是堿性或脂族氨基酸；且其中所述肽可抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)。
4.一種用于抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)的組合物，含有有效量的式IV的肽和藥學(xué)上可接受的載體Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO18)Xaaa是脯氨酸； Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸；Xaa2是精氨酸；Xaac是蘇氨酸； Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸； Xaa4是甘氨酸；Xaae是天門冬氨酸或谷氨酸； Xaa5是纈氨酸或天門冬酰胺；Xaaf是亮氨酸； Xaa6是脯氨酸；Xaag是天門冬氨酸；Xaa7是天門冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或絲氨酸； Xaa8是纈氨酸或亮氨酸；Xaai是天門冬酰胺或丙氨酸；Xaa9是丙氨酸或甘氨酸；Xaaj是蘇氨酸；Xaa10是天門冬酰胺或精氨酸；Xaak是異亮氨酸或亮氨酸； Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸；XaaL是谷氨酸或賴氨酸；Xaa12是天門冬酰胺或谷氨酰胺；Xaam是蘇氨酸或丙氨酸；Xaa13是苯丙氨酸或蘇氨酸；Xaan是甲硫氨酸； Xaa14是苯丙氨酸；Xaao是精氨酸；Xaa15是脯氨酸或谷氨酸；Xaap是賴氨酸或蘇氨酸；Xaa16是精氨酸或甘氨酸；Xaa17是賴氨酸或天門冬氨酸； Xaa18是脯氨酸或亮氨酸；Xaa19是賴氨酸；且其中所述肽可抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的組合物，其中非極性氨基酸是甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的組合物，其中堿性氨基酸是組氨酸，賴氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鳥氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸。根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的組合物，其中半胱氨酸樣氨基酸是半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的組合物，其中脂族氨基酸是丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的組合物，其中酸性氨基酸是天門冬氨酸或谷氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的組合物，其中極性氨基酸是天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙酰基賴氨酸，甲硫氨酸亞砜，或高絲氨酸，或非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的組合物，其中芳族氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述肽還可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1，基質(zhì)金屬蛋白酶-3，基質(zhì)金屬蛋白酶-4，基質(zhì)金屬蛋白酶-5，基質(zhì)金屬蛋白酶-6，基質(zhì)金屬蛋白酶-7，基質(zhì)金屬蛋白酶-8，和基質(zhì)金屬蛋白酶-9，基質(zhì)金屬蛋白酶-10，基質(zhì)金屬蛋白酶-11，基質(zhì)金屬蛋白酶-12，或基質(zhì)金屬蛋白酶-13中任何一種的蛋白酶活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的組合物，其中抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)抑制腫瘤生長。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的組合物，其中抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)減少腫瘤大小。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的組合物，其中該腫瘤是轉(zhuǎn)移的、非轉(zhuǎn)移的、血管化的、非血管化的、硬的或軟的。
15.根據(jù)權(quán)利要求12或13的組合物，其中該腫瘤是血管化的或可以成為血管化的。
16.根據(jù)權(quán)利要求12或13的組合物，其中該腫瘤是神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤、退行性星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、脊索瘤、咽喉癌、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、睪丸腫瘤、腎母細(xì)胞瘤、尤因瘤、膀胱癌、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、腺癌、汗腺癌、皮脂腺肉瘤、乳頭肉瘤、乳頭腺肉瘤、囊腺肉瘤、支氣管肺癌、髓樣癌、肥大細(xì)胞瘤、間皮瘤、滑膜瘤、黑色素瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、寡突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、成血管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、松果體瘤、室管膜瘤、顱咽管瘤、上皮癌、胚胎癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、纖維肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤或白血病。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述肽含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，或SEQ ID NO13。
18.一種抗腫瘤組合物，含有治療有效量的含有SEQ ID NO1，ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ IDNO11，SEQ ID NO12，或SEQ ID NO13的肽和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述肽可抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)。
19.一種降低血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的方法，該方法包括使含有血管內(nèi)皮生長因子的基因的細(xì)胞接觸有效量的式I的肽Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非極性氨基酸；Xaa2是堿性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸樣氨基酸；Xaa5是極性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或極性氨基酸；Xaa9是脂族，非極性或堿性氨基酸；且其中所述肽可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。
20.一種降低血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的方法，該方法包括使含有血管內(nèi)皮生長因子的基因的細(xì)胞接觸有效量的式II的肽Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)其中Xaa10是極性，酸性，堿性或非極性氨基酸；Xaa11是極性或芳族氨基酸；Xaa12是極性，堿性，脂族或非極性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，極性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非極性或極性氨基酸；Xaa15是非極性或酸性氨基酸；Xaa16是堿性，極性或非極性氨基酸；Xaa17是堿性，極性，脂族，非極性或酸性氨基酸；Xaa18是非極性或脂族氨基酸；Xaa19是堿性或脂族氨基酸；且其中所述肽可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。
21.一種降低血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的方法，該方法包括使含有血管內(nèi)皮生長因子的基因的細(xì)胞接觸有效量的式III的肽Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1，Xaa4，和Xaa6各自是非極性氨基酸；Xaa2是堿性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸樣氨基酸；Xaa5是極性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或極性氨基酸；Xaa9是脂族，非極性或堿性氨基酸；Xaa10是極性，酸性，堿性或非極性氨基酸；Xaa11是極性或芳族氨基酸；Xaa12是極性，堿性，脂族或非極性氨基酸；Xaa13是芳族，脂族，極性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族，非極性或極性氨基酸；Xaa15是非極性或酸性氨基酸；Xaa16是堿性，極性或非極性氨基酸；Xaa17是堿性，極性，脂族，非極性或酸性氨基酸；Xaa18是非極性或脂族氨基酸；Xaa19是堿性或脂族氨基酸；且其中所述肽可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。
22.一種降低血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的方法，該方法包括使含有血管內(nèi)皮生長因子的基因的細(xì)胞接觸有效量的式IV的肽Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-Xaal-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO18)Xaaa是脯氨酸； Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸； Xaa2是精氨酸；Xaac是蘇氨酸； Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸；Xaa4是甘氨酸；Xaae是天門冬氨酸或谷氨酸；Xaa5是纈氨酸或天門冬酰胺；Xaaf是亮氨酸；Xaa6是脯氨酸；Xaag是天門冬氨酸；Xaa7是天門冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或絲氨酸； Xaa8是纈氨酸或亮氨酸；Xaai是天門冬酰胺或丙氨酸；Xaa9是丙氨酸或甘氨酸；Xaaj是蘇氨酸；Xaa10是天門冬酰胺或精氨酸；Xaak是異亮氨酸或亮氨酸； Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸；XaaL是谷氨酸或賴氨酸；Xaa12是天門冬酰胺或谷氨酰胺；Xaam是蘇氨酸或丙氨酸；Xaa13是苯丙氨酸或蘇氨酸；Xaan是甲硫氨酸； Xaa14是苯丙氨酸；Xaao是精氨酸；Xaa15是脯氨酸或谷氨酸；Xaap是賴氨酸或蘇氨酸；Xaa15是精氨酸或甘氨酸；Xaa17是賴氨酸或天門冬氨酸； Xaa18是脯氨酸或亮氨酸；Xaa19是賴氨酸；且其中所述肽可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述肽含有SEQ ID NO1，ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，或SEQ ID NO13。
24.根據(jù)權(quán)利要求19-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述肽含有SEQ ID NO11。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中非極性氨基酸是甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求19-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中堿性氨基酸是組氨酸，賴氨酸，精氨酸，2，3-二氨基丙酸，鳥氨酸，高精氨酸，ρ-氨基苯丙氨酸，和2，4-二氨基丁酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求19-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中半胱氨酸樣氨基酸是半胱氨酸，高半胱氨酸，青霉胺，或β-甲基半胱氨酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求19-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中脂族氨基酸是丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，叔-丁基丙氨酸，叔-丁基丙氨酸，N-甲基異亮氨酸，正亮氨酸，N-甲基纈氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，N-甲基甘氨酸，或α-氨基異丁酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求19-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中酸性氨基酸是天門冬氨酸或谷氨酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求19-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中極性氨基酸是天門冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，瓜氨酸，N-乙?；嚢彼?，甲硫氨酸亞砜，或高絲氨酸，或非極性氨基酸，如甲硫氨酸，甘氨酸或脯氨酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求19-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中芳族氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯甘氨酸，萘丙氨酸，β-2-噻吩丙氨酸，1，2，3，4-四氫-異喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸，2-氟苯丙氨酸，3-氟苯丙氨酸，4-氟苯丙氨酸，吡啶丙氨酸，或3-苯并噻吩丙氨酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求19-22任何一項(xiàng)所述的方法，該方法進(jìn)一步包括將肽局部給予哺乳動(dòng)物中的腫瘤。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中該腫瘤是轉(zhuǎn)移的、非轉(zhuǎn)移的、血管化的、非血管化的、硬的或軟的。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中該腫瘤是血管化的或可以成為血管化的。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中該腫瘤是神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤、退行性星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、脊索瘤、咽喉癌、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、睪丸腫瘤、腎母細(xì)胞瘤、尤因瘤、膀胱癌、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、腺癌、汗腺癌、皮脂腺肉瘤、乳頭肉瘤、乳頭腺肉瘤、囊腺肉瘤、支氣管肺癌、髓樣癌、肥大細(xì)胞瘤、間皮瘤、滑膜瘤、黑色素瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、寡突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、成血管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、松果體瘤、室管膜瘤、顱咽管瘤、上皮癌、胚胎癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、纖維肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤或白血病。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)抑制腫瘤生長。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)減少腫瘤大小。
38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中抑制血管內(nèi)皮生長因子的抑制腫瘤的血管化。
39.根據(jù)權(quán)利要求19-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中給予所述肽以防止或治療過多的血管發(fā)生。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中過多的血管發(fā)生包括糖尿病視網(wǎng)膜病、早發(fā)性視網(wǎng)膜病、角膜移植物排斥、新血管性青光眼、晶體后纖維組織增生、流行性角結(jié)膜炎、維生素A缺乏、隱形眼鏡佩戴過度、特應(yīng)性角膜炎、上緣角膜炎、干燥性翼狀胬肉角膜炎、干燥綜合征、紅斑痤瘡、phylectenulosis、梅毒、眼部新血管疾病、分支桿菌感染、脂變性、化學(xué)灼傷、細(xì)菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純皰疹感染、帶狀皰疹感染、原生動(dòng)物感染、莫倫潰瘍、卡波西肉瘤、Terrien邊緣變性、邊緣角質(zhì)層分離、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性狼瘡、多動(dòng)脈炎、創(chuàng)傷、Wegener結(jié)節(jié)病、鞏膜炎、Steven′s Johnson病、類天皰瘡、放射狀角膜切開術(shù)、角膜移植物排斥、黃斑變性、鐮狀細(xì)胞貧血、結(jié)節(jié)病、梅毒、彈性膜假黃瘤、佩吉特病、靜脈阻塞、動(dòng)脈阻塞、頸動(dòng)脈阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃體炎、萊姆病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、伊爾斯病、貝切特病、視網(wǎng)膜炎、脈絡(luò)膜炎、眼部組織胞漿菌病、貝斯特病、近視、視凹陷、斯塔加特病、pars planitis、慢性視網(wǎng)膜脫落、高粘度綜合征、弓形體病、激光治療后并發(fā)癥、潮紅或增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病。
全文摘要
本發(fā)明提供用作抗腫瘤劑并用于治療創(chuàng)傷的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。所述抑制劑為肽，肽的序列與基質(zhì)金屬蛋白酶的酶原形式的切割區(qū)有關(guān)。本發(fā)明的肽抑制劑可配制成抑制血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)并促進(jìn)愈合的治療組合物，洗液，乳膏，皮膚遮蓋物和創(chuàng)傷敷料。
文檔編號(hào)C12N9/99GK1549722SQ02815135
公開日2004年11月24日 申請日期2002年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月16日
發(fā)明者S·奎爾克, I·F·沃特, S 奎爾克, 沃特 申請人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司