專利名稱：用于治療帕金森病的多巴胺能神經(jīng)元和具有增殖能力的前體細(xì)胞的制作方法
相關(guān)申請的參考本申請要求提交于2001年6月21日的美國實(shí)用專利申請09/888,309和提交于2002年5月28目的10/157,288的優(yōu)先權(quán)。為了在獲得許可的美國和其它管轄區(qū)域進(jìn)行申請的目的，這里全文引用了上述兩個(gè)優(yōu)先權(quán)申請以及國際專利申請WO01/51616和WO 01/88104作為參考。
背景對于適合于人類服用的細(xì)胞系的衍生和擴(kuò)展的新的研究有希望引導(dǎo)出一個(gè)美好的新的醫(yī)療世界。如果科學(xué)繼續(xù)從神經(jīng)元和神經(jīng)元前體細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)的重要的新發(fā)現(xiàn)中受益，那么毀滅性的和以前難以治療的病癥就可能產(chǎn)生獲得再生藥物的希望。
病癥中需要臨床治療的是那些有關(guān)神經(jīng)功能異常的疾病。在這些疾病的列表中接近頂部的是帕金森病，一種自發(fā)的、緩慢發(fā)展的、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化性的疾病，特征為運(yùn)動(dòng)緩慢和減少、肌肉僵硬、靜止震顫和姿勢不穩(wěn)。由黑質(zhì)、藍(lán)斑以及其它腦干多巴胺能細(xì)胞中著色的神經(jīng)元的持續(xù)惡化產(chǎn)生的癥狀，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的缺失。帕金森病在中年以上的人群中是第四種最常見的神經(jīng)退化疾病，影響0.4％的年過40歲的人，和1％的年過65歲的人。不管所提出的年齡，對于那些受折磨的患者該疾病常常造成毀滅性的結(jié)果。
造成神經(jīng)系統(tǒng)的痛苦如此難以對付的原因是常常遭受到的破壞是不可逆的。對于這些疾病主要希望是發(fā)展能夠重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞群體，并使神經(jīng)系統(tǒng)的功能恢復(fù)協(xié)調(diào)。有趣的證據(jù)顯示胎兒多巴胺能神經(jīng)元移植可恢復(fù)帕金森病的化學(xué)異常。但是非常缺乏適當(dāng)?shù)慕M織。
由于這個(gè)原因，在神經(jīng)祖細(xì)胞方面具有濃厚的興趣。各種類型的譜系-限制前體細(xì)胞更新它們自己并駐留于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的選擇性的位點(diǎn)(Kalyanl等，BiochemCell Biol，61051，1998)。推斷的神經(jīng)限制前體(Mayer-Proschel等，Neuron，19773，1997)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞粘著分子的聚唾液酸化(polysialylated)同種型(PS-NCAM)。據(jù)說它們具有產(chǎn)生各種類型神經(jīng)元的能力，但不產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。另一方面，推斷的神經(jīng)膠質(zhì)限制前體(Rao等，Dev.Biol，18848，1997)明顯地具有形成神經(jīng)膠質(zhì)而不是神經(jīng)元的能力。推斷的來自胎兒或成人組織的神經(jīng)前體進(jìn)一步描述于美國專利5,852,832；5,654,183；5,849,553；以及5,968,829；以及WO09/50526和WO 99/01159中。
不幸的是，尚未顯示從神經(jīng)組織中分離的祖細(xì)胞具有足夠的復(fù)制能力以產(chǎn)生用于人類臨床治療所必需的細(xì)胞數(shù)量。
另一個(gè)來源是從早期的胚胎組織中分離的多能細(xì)胞。在25年前胚胎干(ES)細(xì)胞最初分離自小鼠的胚胎(G.R.Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.787634，1981)。人們認(rèn)為ES細(xì)胞能夠產(chǎn)生相同種類的實(shí)際上任何組織類型的子代。Li.Smith等(Cur.Biol.8971，1998)報(bào)道了通過譜系選擇從小鼠ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元前體。Bjorklund等報(bào)道了從小鼠ES細(xì)胞生產(chǎn)功能性多巴胺能神經(jīng)元(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.192344，2002)。
僅僅最近才分離出人的ES細(xì)胞(Thomson等，Science 282114，1998)。人ES細(xì)胞需要非常不同的條件來保持它們處于未分化的狀態(tài)，或指導(dǎo)它們沿著具體的分化途徑進(jìn)行分化(美國專利6,090,622和6,200,806；澳大利亞專利AU 729377，和PCT出版物WO 01/51616)。由于這一原因，如何從人的ES細(xì)胞制備相對同源的細(xì)胞群體了解得非常少。
PCT出版物WO 01/88104(Carpenter，Geron Corporation)描述了通過分化人ES細(xì)胞獲得的神經(jīng)祖細(xì)胞群體。獲得的群體中超過90％的呈NCAM陽性，35％呈β-微管蛋白陽性，和75％呈A2B5陽性。Zhang等(Nature Biotech.191129，2001)隨后報(bào)道了神經(jīng)前體從人的ES細(xì)胞的分化。
迫切需要生產(chǎn)用于某些臨床病癥的治療的進(jìn)一步優(yōu)化的神經(jīng)細(xì)胞群體的技術(shù)。
綜述本發(fā)明提供了有效生產(chǎn)已從多能細(xì)胞分化為神經(jīng)譜系細(xì)胞的靈長類細(xì)胞的系統(tǒng)。本發(fā)明的前體和末端分化的細(xì)胞可用于許多重要的應(yīng)用，包括藥物試驗(yàn)和恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)功能的藥物的生產(chǎn)。
本發(fā)明的一個(gè)方面是包括高比例的具有神經(jīng)譜系特征的細(xì)胞的細(xì)胞群體，例如神經(jīng)元細(xì)胞和它們的前體。這些細(xì)胞可基于表型標(biāo)記鑒別，例如A2B5、NCAM、MAP-2、干蛋白、β-微管蛋白III以及本發(fā)明后面列出的其它標(biāo)記，和通過特征形態(tài)學(xué)和功能標(biāo)準(zhǔn)鑒別。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是制備含有來自多能細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞的群體的方法，這些多能細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、初級(jí)胚胎組織、或來自具有分化(或被改編)為含有神經(jīng)表型的細(xì)胞的能力的胎兒或成人組織的干細(xì)胞。該方法包括用可溶性因子和有助于具有某些所需特性的神經(jīng)細(xì)胞生長的環(huán)境條件的組合培養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明包括優(yōu)化用于分化多能干細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞的分化方法的策略，其中候選因子根據(jù)功能分組，并且所述干細(xì)胞或它們的子代用各種組合的因子組培養(yǎng)。鑒別對于生產(chǎn)所欲細(xì)胞類型重要的組，然后將每個(gè)組的各個(gè)成分一個(gè)一個(gè)地除去以確定所需的最小量的組合物。
通過例證，多能干細(xì)胞可通過在含有添加了例如頭蛋白和促濾泡素抑制素的一種或多種TGF-β超家族拮抗物的固體表面上直接分化進(jìn)行生產(chǎn)。另外，多能干細(xì)胞可培養(yǎng)為叢聚的或胚狀體。各種成熟程度的神經(jīng)細(xì)胞的富集包括在含有添加了促細(xì)胞分裂原或生長因子(例如EGF和FGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)或隨后以各種優(yōu)化的組合添加神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(例如NT-3或BDNF)和其它因子(例如EPO)。在某些情況下使用的分化因子的列表在以下概括的描述和說明實(shí)施例中列出。任選地，專業(yè)人員還可使用進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞富集的物理分離技術(shù)或操縱技術(shù)。
根據(jù)本發(fā)明制備的成熟的神經(jīng)元及其前體可表征為細(xì)胞群體的子代或一個(gè)已建立的細(xì)胞系，成熟的神經(jīng)元及其前體從這一細(xì)胞系衍生。這可通過諸如標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋分析等一些適當(dāng)?shù)募夹g(shù)顯示基本上與親本群體一致的神經(jīng)細(xì)胞的基因組得以證實(shí)。另外，可通過檢查神經(jīng)細(xì)胞衍生過程中的記錄建立這一關(guān)系。神經(jīng)細(xì)胞衍生自親本細(xì)胞群體的特征在一些方面是重要的。特別地，未分化的細(xì)胞群體可用于生產(chǎn)具有共有基因組的附加細(xì)胞—或者另一批神經(jīng)細(xì)胞，或者可用于治療的另一種細(xì)胞類型—例如能夠使患者預(yù)先耐受(pretolerize)神經(jīng)異源移植的組織相容性類型的群體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，神經(jīng)細(xì)胞從如所描述的分化為神經(jīng)元前體細(xì)胞的人多能細(xì)胞制備，然后在培養(yǎng)物中傳代。使用胚胎干細(xì)胞作為起始細(xì)胞類型，促進(jìn)快速發(fā)展的群體的產(chǎn)生，盡管如此該群體仍然保持最終分化為功能神經(jīng)元的全部活性—或者當(dāng)用缺乏促細(xì)胞分裂原的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白培養(yǎng)時(shí)，或者當(dāng)給予適當(dāng)?shù)氖軝z者時(shí)。某些前體細(xì)胞群體在培養(yǎng)物中具有進(jìn)行至少10、20或40倍群體加倍的能力，而當(dāng)進(jìn)一步分化時(shí)不會(huì)丟失它們形成高度富集的神經(jīng)元群體的能力。根據(jù)使用的條件，可生產(chǎn)前體群體，該群體具有分化為分化為高比例的酪氨酸羥化酶陽性細(xì)胞的能力。這種表型與多巴胺能神經(jīng)元一致，是治療帕金森病所希望的。
本發(fā)明的細(xì)胞可用于篩選神經(jīng)細(xì)胞毒性的化合物、調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞功能的能力、或輔助神經(jīng)元衍生和增殖的能力。
本發(fā)明的細(xì)胞還可用于在一個(gè)個(gè)體中重建或添加神經(jīng)系統(tǒng)的功能，其中該給予該個(gè)體本發(fā)明的分離的細(xì)胞或細(xì)胞群體。為了這一目的，該分離的細(xì)胞或細(xì)胞群體被配制成為一種用于治療影響神經(jīng)系統(tǒng)的疾病的藥物。
這些和本發(fā)明其它的實(shí)施例將在隨后的描述中揭示。
附1是顯示神經(jīng)元細(xì)胞的熒光顯微照相，該神經(jīng)元細(xì)胞是通過在使用分化因子的混合物的固體基質(zhì)上直接分化ES細(xì)胞獲得的。顯示的三個(gè)區(qū)域都取自包含神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和TNF-β超家族拮抗物頭蛋白和促濾泡素抑制素的處理。觀察到許多細(xì)胞對于神經(jīng)元標(biāo)記物β-微管蛋白-III進(jìn)行神經(jīng)元加工和著色。MAP-2陽性細(xì)胞，同時(shí)也對酪氨酸羥化酶(一種多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物)呈陽性的細(xì)胞比例高達(dá)約15％。
圖2顯示通過直接分化從hES細(xì)胞制備神經(jīng)元的情況。當(dāng)未分化的細(xì)胞在層粘連蛋白上鋪板并用TGF-β超家族拮抗物頭蛋白(N)和促濾泡素抑制素(F)(A組)培養(yǎng)時(shí)β-微管蛋白陽性神經(jīng)元的產(chǎn)量很高。在干細(xì)胞因子存在而促細(xì)胞分裂原不存在的情況下(處理F，B組)產(chǎn)量被進(jìn)一步提高。視黃酸提高了產(chǎn)生的神經(jīng)元的數(shù)量(C組)，但是減少了神經(jīng)元對酪氨酸羥化酶(TH)陽性染色的比例(D組)。
圖3顯示制備神經(jīng)元的情況，其中通過培養(yǎng)hES形成胚狀體引發(fā)分化。然后該細(xì)胞在促細(xì)胞分裂原中培養(yǎng)，進(jìn)行不同的胰蛋白酶消化，然后在含有促細(xì)胞分裂原或神經(jīng)營養(yǎng)因子混合物的培養(yǎng)基中多次傳代。當(dāng)促細(xì)胞分裂原和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白一起使用時(shí)，細(xì)胞可傳代約40倍(A組)，保持增殖的能力和分化為成熟神經(jīng)元的能力(B組)。
圖4顯示在表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(NT)的混合物中傳代細(xì)胞，產(chǎn)生神經(jīng)前體群體，該前體群體依據(jù)分化產(chǎn)生TH-陽性細(xì)胞占群體中所有細(xì)胞的約7％的細(xì)胞群體(A組)。用于前體細(xì)胞末端分化的混合物還可改進(jìn)TH-陽性細(xì)胞的生產(chǎn)(B組)。
詳細(xì)描述人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)多能干細(xì)胞在選擇的分化試劑存在的情況下培養(yǎng)時(shí)，衍生出含有相當(dāng)高比例的具有成熟神經(jīng)細(xì)胞或其前體的表型特征的細(xì)胞的細(xì)胞群體。這些細(xì)胞適合用于藥物篩選和與神經(jīng)系統(tǒng)異常有關(guān)的病癥的治療。
本發(fā)明包含的系統(tǒng)通過從一個(gè)已建立的人胚胎干(hES)細(xì)胞系獲得的細(xì)胞群體說明。可通過下文描述的一些技術(shù)引發(fā)分化，例如形成胚狀體，或通過在一個(gè)具有一種或多種TGF-β超家族拮抗物存在的適當(dāng)?shù)幕|(zhì)上培養(yǎng)hES細(xì)胞。獲得前體細(xì)胞，該前體細(xì)胞屬于神經(jīng)元譜系，并且它可進(jìn)一步分化為成熟神經(jīng)元。
如圖3(A)中所顯示的，從hES細(xì)胞形成的神經(jīng)元前體可在培養(yǎng)基中被傳代約40倍。值得注意的是，如圖3(B)所顯示的，甚至在多次傳代后，這些細(xì)胞仍保持了分化為成熟神經(jīng)元的全部能力。以前在人的神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)中，沒有利用這種增殖能力和分化能力強(qiáng)有力的結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明獲得的成熟神經(jīng)元延伸了這種細(xì)胞類型的特征，顯示對于神經(jīng)元-特異性標(biāo)記物如神經(jīng)絲和MAP-2的著色，并且如通過對突觸小泡蛋白染色檢測到的，顯示突觸形成的證據(jù)。這些細(xì)胞對各種神經(jīng)遞質(zhì)物質(zhì)做出反應(yīng)，并且如在標(biāo)準(zhǔn)膜片鉗系統(tǒng)中測定的具有動(dòng)作電位。在所有這些方面中，該細(xì)胞明顯具有全部的神經(jīng)功能。
特別的重要性是該系統(tǒng)可被調(diào)節(jié)以優(yōu)化能夠產(chǎn)生具有醫(yī)療重要特性的神經(jīng)元的前體的比例的能力。

圖1顯示了對于酪氨酸羥化酶染色為陽性的神經(jīng)元，這是多巴胺能神經(jīng)元的特征。這種類型的細(xì)胞對于帕金森病的治療的特別需要的，但是以前沒有描述過其它來源可提供具有足夠豐度的適當(dāng)種類的細(xì)胞。如圖4中所顯示的，在含有促細(xì)胞分裂原EGF和FGF-2，以及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白BDNF和NT-3的培養(yǎng)基中傳代前體細(xì)胞，產(chǎn)生能夠產(chǎn)生TH-陽性細(xì)胞占群體全部細(xì)胞的約7％的增殖細(xì)胞群體。
既然本發(fā)明的多能干細(xì)胞和一些譜系-限制性前體在培養(yǎng)基中大量增殖，本公開描述的系統(tǒng)提供了神經(jīng)元細(xì)胞無限制的供給?？稍谖捶只亩嗄芨杉?xì)胞水平上，或在屬于神經(jīng)前體的水平上發(fā)生大規(guī)模的擴(kuò)展。本發(fā)明的細(xì)胞在研究、藥物開發(fā)和CNS異常的治療上具有重要的用途。
定義為了本公開的目的，術(shù)語“神經(jīng)祖細(xì)胞”或“神經(jīng)前體細(xì)胞”是指能夠產(chǎn)生或者是神經(jīng)元細(xì)胞(例如神經(jīng)元前體或成熟神經(jīng)元)或者是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(例如膠質(zhì)前體、成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞或成熟少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)的子代的細(xì)胞。典型地，當(dāng)它們自身體外培養(yǎng)時(shí)，它們不產(chǎn)生其它胚胎胚層的子代，除非以某種方式去分化或重編程序。
“神經(jīng)元祖細(xì)胞”或“神經(jīng)元前體細(xì)胞”是能夠產(chǎn)生成熟神經(jīng)元子代的細(xì)胞。這些細(xì)胞也可能或不可能具有產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力。一個(gè)“神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞”或“神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞”是能夠產(chǎn)生成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞或成熟少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞子代的細(xì)胞。這些細(xì)胞也可能或不可能具有產(chǎn)生神經(jīng)元細(xì)胞的能力。
一種“分化試劑”，如本公開中所使用的，是指一種化合物的收集，該化合物用于本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中以產(chǎn)生神經(jīng)譜系的分化細(xì)胞(包括前體細(xì)胞和末端分化的細(xì)胞)。對于化合物的作用方式無意限制。例如，該試劑可通過誘導(dǎo)或輔助表型變化、促進(jìn)具有特殊表型的細(xì)胞生長或延緩其它細(xì)胞的生長、或與其它試劑合作通過未知機(jī)制發(fā)揮作用來輔助分化過程。
原型“靈長類多能干細(xì)胞”(pPS細(xì)胞)是衍生自受精后任一時(shí)間的胚前期、胚胎或胎兒的多能細(xì)胞，并具有能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下生產(chǎn)一些不同的細(xì)胞類型的子代的特征，該不同細(xì)胞類型是所有三個(gè)胚層(內(nèi)胚層，中胚層和外胚層)的衍生物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域已接受的檢驗(yàn)，例如在8-12周大的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力。包含于pPS細(xì)胞定義的是各種類型的胚胎細(xì)胞，例如人胚胎干(hES)細(xì)胞，和人胚胎生殖細(xì)胞(hEG)。該pPS細(xì)胞較佳地不是衍生自惡性來源。細(xì)胞是整倍體的是理想的(但不總是必需的)。
當(dāng)群體中大部分的干細(xì)胞和它們的衍生物顯示未分化細(xì)胞的形態(tài)特征時(shí)pPS細(xì)胞培養(yǎng)物被描述為“未分化的”，將他們與胚胎或成人來源的分化細(xì)胞相區(qū)別。應(yīng)理解群體內(nèi)未分化細(xì)胞的集落常常為鄰近的分化細(xì)胞所包圍。
“飼養(yǎng)細(xì)胞”或“飼養(yǎng)者”是用于描述與另一種類型的細(xì)胞共培養(yǎng)的一種類型的細(xì)胞的術(shù)語，以提供一種環(huán)境，在這種環(huán)境種第二種類型的細(xì)胞可以生長。據(jù)說pPS細(xì)胞群體“基本上不含”飼養(yǎng)細(xì)胞，如果在分裂后這些細(xì)胞生長至少一輪，其中沒有加入新鮮的飼養(yǎng)細(xì)胞以支持pPS細(xì)胞的生長。
術(shù)語“胚狀體”指當(dāng)pPS細(xì)胞在單層培養(yǎng)物上過量生長或保持在懸浮培養(yǎng)物中時(shí)出現(xiàn)的分化的和未分化的細(xì)胞的聚集體。胚狀體是典型地來自幾個(gè)胚層的不同細(xì)胞類型的混合物，可通過形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和使用免疫細(xì)胞化學(xué)可檢測的細(xì)胞標(biāo)記物區(qū)別。
“生長環(huán)境”是一種感興趣的細(xì)胞可以在其中體外增殖、分化或成熟的環(huán)境。環(huán)境的特征包括培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，可存在任何生長因子或分化誘導(dǎo)因子，以及如果存在的話一種支撐結(jié)構(gòu)(例如在固體表面上的基質(zhì))。
當(dāng)一個(gè)多核苷酸通過任何適當(dāng)?shù)娜斯げ僮魇侄无D(zhuǎn)移到細(xì)胞時(shí)，或者其中細(xì)胞是遺傳了該多核苷酸的最初改變的細(xì)胞的子代，細(xì)胞被稱做“遺傳改變”、“轉(zhuǎn)染”或“遺傳轉(zhuǎn)化”。該多核苷酸常常包含編碼感興趣的蛋白質(zhì)的可轉(zhuǎn)錄的序列，它能使細(xì)胞以提高的水平表達(dá)蛋白質(zhì)。如果改變的細(xì)胞的子代具有相同的改變那么遺傳改變是“可遺傳的”。
一般技術(shù)分子遺傳學(xué)和遺傳基因工程的一般方法描述于最近出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)》(Sambrook等，Cold Spring Harbor)；《哺乳動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell)》(Miller & Calos編)；和《分子生物學(xué)現(xiàn)代流程(Current Protocols in MolecularBiology)》(F.M.Ausubel等編，Wiley & Sons)。細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和抗體技術(shù)可在《蛋白質(zhì)科學(xué)現(xiàn)代方案(Current Protocol in Protein Science)》(J.E.Colligan等編，Wiley & Sons)；《細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)代方案(Current Protocol inCell Biology)》(J.S.Bonifacino等，Wiley & Sons)和《免疫學(xué)現(xiàn)代方案(CurrentProtocol in Immunology)》(J.E.Colligan等編，Wiley & Sons)中發(fā)現(xiàn)。
細(xì)胞培養(yǎng)方法通常描述于最近出版的《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)手冊(Cultureof Animal CellsA Manual of Basic Technique)》(R.I.Freshney編，Wiley & Sons)；《細(xì)胞培養(yǎng)一般技術(shù)(General Techniques of Cell Cul ture)》(M.A.Harrison &I.F.Rae，Cambridge Univ.Press)，以及《胚胎干細(xì)胞方法和流程(Embryonic StemCellsMethods and Protocols)》(K.Turksen編，Humana Press)。
關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)異常的詳細(xì)描述、以及各種類型的神經(jīng)細(xì)胞、標(biāo)記物和相關(guān)可溶因子的特征，讀者可參考《CNS再生基礎(chǔ)科學(xué)和臨床進(jìn)展(CNS RegenerationBasic Science and Clinical Advances)》，M.H.Tuszynski & J.H.Kordower編，Academic Press，1999。神經(jīng)細(xì)胞的管理和飼養(yǎng)描述于《神經(jīng)元細(xì)胞和分子生物學(xué)(The NeuronCell and Molecular Biology)》第三版，I.B.Levitan & L.K.Kaczmarek，Oxford U.Press，2001；和《組織培養(yǎng)中的神經(jīng)元(The Neuron in TissueCulture)》，L.W.Haynes編，John Wiley & Son Ltd，1999。
干細(xì)胞的來源本發(fā)明可使用各種類型的干細(xì)胞進(jìn)行。具體適用于本發(fā)明的是衍生自懷孕后形成的組織的靈長類多能干(pPS)細(xì)胞，例如胚泡、或胎兒或取自懷孕過程中的任何時(shí)間的胚胎組織。如下文所描述的，非限制性的例子是胚胎干細(xì)胞或胚胎生殖細(xì)胞的初級(jí)培養(yǎng)物或已建立的細(xì)胞系。本發(fā)明的技術(shù)還可用初級(jí)胚胎或胎兒組織直接進(jìn)行，直接從初級(jí)胚胎細(xì)胞衍生神經(jīng)細(xì)胞，而不需要最初建立一個(gè)未分化的細(xì)胞系。
胚胎干細(xì)胞可從靈長類成員的胚泡中分離(美國專利5,843,780；Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)?？墒褂肨homson等(美國專利6,200,806；Science 2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38133 ff.，1998)和Reubinoff等(Nature Biotech.18399，2000)描述的技術(shù)從人的胚泡細(xì)胞中制備人的胚胎干(hES)細(xì)胞。與hES細(xì)胞等價(jià)的細(xì)胞類型包括它們的多能衍生物，例如原始外胚層樣(EPL)細(xì)胞，描述于WO 01/51610(Bresagen)。
人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞可從存在于取自末次月經(jīng)后約8-11周的人胎兒材料中的原生殖細(xì)胞制備。適當(dāng)?shù)闹苽浞椒枋鲇赟hamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513726，1998和美國專利6,090,622。
使用促進(jìn)增殖而不是促進(jìn)分化的培養(yǎng)條件，PPS細(xì)胞可在培養(yǎng)物中連續(xù)繁殖。典型的含血清的ES培養(yǎng)基用80％的DMDM(如敲除DMEM(Knockout DMEM)，Gibco)、20％的或者限定的胎牛血清(FBS，Hyclone)或者血清替代物(WO 98/30679)、1％的非必需氨基酸、1mM的L-谷氨酰胺和0.1mM的β-巰基乙醇制備。當(dāng)使用前，加入人的bFGF至4ng/ml(WO 99/20741，Geron公司)。
常規(guī)地，ES細(xì)胞在一層飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)，典型地一個(gè)混合的細(xì)胞群體衍生自胚胎或胎兒組織(美國專利6,200,806)。在Geron的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)即使沒有飼養(yǎng)細(xì)胞pPS細(xì)胞也能保持未分化的狀態(tài)?？稍诩?xì)胞外的基質(zhì)上(例如Matrigel或?qū)诱尺B蛋白)支撐不含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物，并在含有支持細(xì)胞的增殖而不支持分化的因子的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。典型的是通過用分泌這種因子的細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)獲得調(diào)整的培養(yǎng)基，例如照射初級(jí)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(或衍生自人胚胎干細(xì)胞的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞)，在調(diào)整前和調(diào)整后添加8ng/ml的堿性FGF。在顯微鏡下，ES細(xì)胞出現(xiàn)高的核/胞質(zhì)比、顯著的核仁和緊密的群體形成，典型地表達(dá)例如SSEA 3和4的特征表型標(biāo)記物。在國際專利申請WO 99/20741和WO 01/51616中提供了關(guān)于胚胎干細(xì)胞的管理和飼養(yǎng)的進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
描述于本發(fā)明的一些技術(shù)還可用于保持或推進(jìn)從胎兒或成體組織獲得的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)前體的分化(美國專利5,852,832；5,654,183；5,849,553；和5,968,829；和WO 09/50526和WO 99/01159)。除非特別指出，本發(fā)明可使用任何脊椎動(dòng)物種類的細(xì)胞進(jìn)行，包括人、非-人靈長類、家畜和其它非-人哺乳動(dòng)物。
制備神經(jīng)前體和末端分化細(xì)胞的材料和步驟本發(fā)明的神經(jīng)祖細(xì)胞和成熟神經(jīng)元可通過使用適當(dāng)?shù)姆只纠只杉?xì)胞。
典型地，分化過程是在含有適當(dāng)?shù)幕|(zhì)和添加了分化試劑的營養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行。適當(dāng)?shù)幕|(zhì)包括包被有正電荷的固體表面，例子為聚-L-賴氨酸和聚鳥氨酸?；|(zhì)可用細(xì)胞外基質(zhì)成分包被，例子為粘連蛋白和層粘連蛋白。其它允許的細(xì)胞外基質(zhì)包括Matrigel(來自Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì))。還有適當(dāng)?shù)幕|(zhì)是組合基質(zhì)，例如聚-賴氨酸結(jié)合粘連蛋白、層粘連蛋白或二者都結(jié)合。
本發(fā)明的神經(jīng)譜系細(xì)胞是在支持所欲的細(xì)胞類型增殖或存活的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的。常常需要使用提供如游離氨基酸而不是血清的營養(yǎng)素的限定的培養(yǎng)基。向培養(yǎng)基中添加開發(fā)用于神經(jīng)細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)的添加劑也是有益的。例子是N2和B27添加劑，從Gibco商業(yè)購得。
沿神經(jīng)分化途徑發(fā)展細(xì)胞通過包含于培養(yǎng)基中得以促進(jìn)，該培養(yǎng)基是一種增加所欲的細(xì)胞類型生長的分化試劑的混合物。這可能涉及指導(dǎo)細(xì)胞或它們的子代接受分化的細(xì)胞類型的表型特征，促進(jìn)具有所欲表型的細(xì)胞的生長或抑制其它細(xì)胞類型的生長。為了實(shí)施本發(fā)明通常不需要理解試劑的作用方式。
適當(dāng)?shù)姆只噭┌ǜ鞣N類型的生長因子，例如表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、任何類型的成纖維細(xì)胞生長因子(例子為FGF-4、FGF-8，和堿性成纖維細(xì)胞生長因子＝bFGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子1(IGF-1和其它)、高濃度的胰島素、sonic hedgehog、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族的成員(例如神經(jīng)生長因子＝NGF、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3＝NT-3、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子＝BDNF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(特別是BMP-2和BMP-4)、視黃酸(RA)和于gp130混合的受體的配體(例如LIF、CNTF和IL-6)。還有其它適當(dāng)?shù)姆只噭┦橇硪环N與前面提到的因子的各個(gè)細(xì)胞-表面受體結(jié)合的配體和抗體。典型地，使用了許多分化試劑，它們可含有2、3、4或更多上文列出的或下文實(shí)施例中所描述的試劑。
在一種分化方法中，pPS細(xì)胞在一個(gè)適當(dāng)?shù)幕|(zhì)上直接鋪板，例如粘著的玻璃或塑料表面，例如用聚賴氨酸包被、具有或不具有例如纖連蛋白和層粘連蛋白的神經(jīng)元-友好基質(zhì)蛋白的蓋玻片。然后該細(xì)胞培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)基中，該營養(yǎng)基適合于促進(jìn)向神經(jīng)細(xì)胞的分化。這被稱做“直接分化”方法，它進(jìn)一步描述于國際專利申請WO 01/51616和具有優(yōu)先權(quán)的美國專利申請09/888,309。TGF-β超家族拮抗物例如頭蛋白和促濾泡素抑制素在指導(dǎo)神經(jīng)分化和增加帶有通過直接分化獲得的神經(jīng)細(xì)胞的表型特征的細(xì)胞比例中特別有用(實(shí)施例4)。
在另一種分化方法中，pPS細(xì)胞首先通過形成細(xì)胞簇預(yù)分化為異源細(xì)胞群體。在一個(gè)典型的變化中，通過在懸浮液中培養(yǎng)pPS細(xì)胞形成胚狀體。任選地，前面列出的一種或多種分化試劑(例如視黃酸)可包含于培養(yǎng)基中以促進(jìn)胚狀體內(nèi)的分化。胚狀體達(dá)到足夠大小或成熟后(典型地3-4天)，它們在分化培養(yǎng)的基質(zhì)上鋪板。胚狀體可直接鋪板于基質(zhì)上而不分散細(xì)胞。這使得神經(jīng)細(xì)胞前體移出胚狀體并到達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)上。在一些步驟中，該細(xì)胞首先培養(yǎng)于促細(xì)胞分裂原混合物中，例如EGF、bFGF、PDGF和IGF-1，然后在促細(xì)胞分裂原和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的組合物中傳代以選擇出神經(jīng)祖細(xì)胞。
本發(fā)明包括鑒別有效產(chǎn)生具體神經(jīng)表型的因子組合物的策略。根據(jù)對來自其它組織或種類的神經(jīng)細(xì)胞的已知作用，已知的受體結(jié)合活性，與其它已知功能的因子的結(jié)構(gòu)同源性或其它適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)，將已知或懷疑增強(qiáng)神經(jīng)分化或生長的各種因子分為各種功能類別。各個(gè)類別中的因子以適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛燃?。然后以各種組合，用各個(gè)因子類別一起培養(yǎng)細(xì)胞，并且評(píng)估因子促進(jìn)前體細(xì)胞或所欲類型的成熟神經(jīng)元生長的能力。鑒別必需的因子類別，當(dāng)這些因子缺乏時(shí)導(dǎo)致混合物丟失其促進(jìn)所欲表型的能力。一旦鑒定了必需因子并除去其它因子，那么通過除去單一的成分仔細(xì)分析各個(gè)類別直到鑒定出最低限度的混合物。實(shí)施例4中舉例說明了這一策略的實(shí)施。
如果需要，分化的細(xì)胞可被分類以富集某些群體。例如，細(xì)胞可用與神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物特征(例如NCAM)結(jié)合的抗體或配體接觸，隨后使用適當(dāng)?shù)拿庖呒夹g(shù)，例如固項(xiàng)吸附或熒光-活化細(xì)胞分類，分離特異性識(shí)別的細(xì)胞。還適合的是差別鋪板或收獲技術(shù)，其中使用所欲細(xì)胞類型的粘附或可釋放性從一個(gè)異源群體的其它細(xì)胞中分離所欲的細(xì)胞。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)前體表型可使用促細(xì)胞分裂原(例如bFGF和EGF)的組合，加之一種或多種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(例如BDNF、NT-3或二者)，在增殖培養(yǎng)物中傳代。這在實(shí)施例2、4和5中舉例說明。根據(jù)本方法，該細(xì)胞可被傳代達(dá)40倍(圖3)，而保持增殖的能力和制成成熟神經(jīng)元的能力。
假定定向祖細(xì)胞在人的治療中具有特別的價(jià)值，因?yàn)樗鼈儾僮髌饋砀哂袕椥?，并且將保持遷移到靶組織的更大的能力并以功能相容的形式整合。祖細(xì)胞可在如實(shí)施例5中說明的固體表面上或懸浮液培養(yǎng)物中生長，在那里它們傾向于形成簇或球形結(jié)構(gòu)。通過舉例說明當(dāng)接近融合時(shí)使用胰蛋白酶收集神經(jīng)祖細(xì)胞。然后細(xì)胞以約一半的密度在無粘著力的加樣孔中接種，并培養(yǎng)于含有10ng/ml的BDNF、NT-3、EGF和bGFG的補(bǔ)充培養(yǎng)基中，每周更換3次。
在神經(jīng)祖細(xì)胞衍生或保持過程中培養(yǎng)基其它成分的明智選擇可影響它們能產(chǎn)生的成熟細(xì)胞的范圍和特征。如實(shí)施例4中所描述的，在神經(jīng)祖細(xì)胞直接分化過程中包含于培養(yǎng)基中的視黃酸提高了最終分化時(shí)產(chǎn)生的MAP-2細(xì)胞的比例-但是降低了與多巴胺能神經(jīng)元有關(guān)的對酪氨酸羥化酶(TH)呈陽性的細(xì)胞的比例。另一方面，人們發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)祖細(xì)胞形成過程中包含于培養(yǎng)基中的紅細(xì)胞生成素(EPO)或提高環(huán)狀A(yù)MP水平的試劑增強(qiáng)了形成TH陽性神經(jīng)元的能力。另外，細(xì)胞可用活化EPO途徑的某些抗體或拮抗物培養(yǎng)，或細(xì)胞可在適度的含氧量低的條件下培養(yǎng)(低O2水平指3-6％)。使用EPO增加多巴胺能表型的形成描述于實(shí)施例3中。
根據(jù)這些步驟中的任一步驟制備的神經(jīng)前體細(xì)胞可進(jìn)一步分化為成熟成熟神經(jīng)元。完全分化的細(xì)胞是本發(fā)明的各種應(yīng)用所希望的，例如體外評(píng)估和篩選各種化合物對神經(jīng)組織的作用。對于使完全分化的細(xì)胞表征產(chǎn)生完全分化的細(xì)胞的神經(jīng)祖細(xì)胞的功能性也是有用的。
可通過使用成熟因子培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞形成成熟神經(jīng)元，成熟因子例如毛喉素(或其它提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的化合物，例如霍亂毒素、異丁基甲基黃嘌呤、二丁基腺苷環(huán)狀一磷酸)、c-試劑盒配體(c-kit ligand)、視黃酸或來自神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族的任何因子或因子組合物。特別有效的是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)與腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)結(jié)合。其它候選物是GDNF、BMP-2和BMP-4。另外，可通過除去一些或全部促進(jìn)神經(jīng)前體增殖的因子增進(jìn)成熟，例如EGF、FGF或其它預(yù)先用于維持培養(yǎng)的促神經(jīng)分裂素。
進(jìn)一步的合理修改本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞前體群體具有相當(dāng)大的增殖能力。如果需要，可通過提高細(xì)胞中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的水平，或者通過從內(nèi)源基因提高轉(zhuǎn)錄，或通過導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因進(jìn)一步增強(qiáng)復(fù)制能力。特別適合的是國際專利申請WO 98/14592提出的人端粒酶(hTERT)催化成分。人的細(xì)胞中端粒酶的轉(zhuǎn)染和表達(dá)描述于Bodnar等，Science279349，1998和Jiang等，Nat.Genet.21111，1999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，遺傳改變的細(xì)胞可通過TR-PCR評(píng)估hTERT的表達(dá)，端粒酶的活性(TRAP測定)，hTERT的免疫細(xì)胞化學(xué)染色或復(fù)制能力。
為了在治療和其它應(yīng)用中使用，常常需要前體或成熟神經(jīng)細(xì)胞的群體為基本上游離的未分化的pPS細(xì)胞。從群體中減少未分化的干細(xì)胞的一條途徑是用載體轉(zhuǎn)染它們，在這個(gè)載體中一個(gè)在啟動(dòng)子控制下的效應(yīng)基因引起未分化的細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)。適當(dāng)?shù)膯?dòng)子包括TERT啟動(dòng)子和OCT-4啟動(dòng)子。效應(yīng)基因可直接溶解于細(xì)胞(例如編碼一種毒素或編程性細(xì)胞死亡的介質(zhì))。另外，效應(yīng)基因可使細(xì)胞對外部試劑的毒性效應(yīng)敏感，例如一種抗體或一種前體藥物。典型的例子是單純皰疹胸苷激酶(tK)基因，它引起它被表達(dá)的細(xì)胞對鳥嘌呤的敏感。適當(dāng)?shù)膒TERT-tK構(gòu)建物描述于國際專利申請WO 98/14593(Morin等)中。
神經(jīng)前體和末端分化的細(xì)胞的特征細(xì)胞可依據(jù)許多表型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行表征，例如形態(tài)學(xué)特征、表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)記物的檢測或定量、酶活、或神經(jīng)遞質(zhì)及它們的受體和電生理機(jī)能。
包含于本發(fā)明的某些細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。這些特征為那些熟練評(píng)估這種細(xì)胞存在的技術(shù)人員是容易地理解。例如，神經(jīng)元的特征是小細(xì)胞體，多數(shù)具有軸突和樹突。本發(fā)明的細(xì)胞還可根據(jù)它們是否表達(dá)各種神經(jīng)細(xì)胞的表型標(biāo)記物特征進(jìn)行表征。
感興趣的標(biāo)記物包括但不限于β-微管蛋白III、微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)、或神經(jīng)絲，神經(jīng)元的特征；存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞中的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)；半乳糖腦苷(GalC)或髓磷脂堿性蛋白(MBP)，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特征；Oct-4，未分化的hES細(xì)胞的特征；和干蛋白，神經(jīng)前體和其它細(xì)胞的特征。已經(jīng)描述了A2B5(一種糖脂)和聚唾液酸化(polysialylated)的神經(jīng)細(xì)胞粘著分子(簡寫為NCAM)。而當(dāng)研究神經(jīng)譜系細(xì)胞時(shí)，A2B5和NCAM是指示標(biāo)記物，應(yīng)理解有時(shí)這些標(biāo)記物可在其它細(xì)胞類型上顯示，例如肝或肌肉細(xì)胞。以前認(rèn)為β-微管蛋白III對神經(jīng)細(xì)胞是特異性的，但已發(fā)現(xiàn)hES細(xì)胞的亞群體也呈β-微管蛋白III陽性。MAP-2對于全部各種類型的分化神經(jīng)元是更加嚴(yán)格的標(biāo)記物。根據(jù)本發(fā)明制備的某些細(xì)胞群體含有至少30％、50％、75％、90％或更多的對這些標(biāo)記物具有檢驗(yàn)陽性的細(xì)胞，這些標(biāo)記物或者是單一的或者是以各種組合存在。
列于本公開的和本領(lǐng)域已知的組織-特異性標(biāo)記物可使用任何適當(dāng)?shù)拿庖呒夹g(shù)檢測—例如用于細(xì)胞表面標(biāo)記物的流式免疫細(xì)胞化學(xué)，用于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面標(biāo)記物的免疫組織學(xué)(例如，固定細(xì)胞或組織切片的免疫組織學(xué))，細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)印跡分析，和用于細(xì)胞提取物或分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的產(chǎn)物的酶-聯(lián)免疫分析。如果任選地在細(xì)胞固定后，和任選地使用標(biāo)記的第二抗體或其它偶聯(lián)物(例如生物素-抗生物素蛋白偶聯(lián)物)擴(kuò)增標(biāo)記物，在標(biāo)準(zhǔn)免疫細(xì)胞化學(xué)或流式細(xì)胞儀分析中明顯的可檢測數(shù)量的抗體將與抗原結(jié)合，那么通過細(xì)胞的抗原的表達(dá)被稱做“可檢測的抗體”。
組織特異性基因產(chǎn)物的表達(dá)還可通過RNA印跡分析、斑點(diǎn)印跡雜交分析，或使用標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增方法中的序列特異性引物通過逆轉(zhuǎn)錄酶引發(fā)的聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)在mRNA水平上檢測。關(guān)于更詳細(xì)的描述參見美國專利5,843,780。列于本公開中的具體的標(biāo)記物的序列數(shù)據(jù)可從公共數(shù)據(jù)庫例如GenBank(URL www.ncbi.nlm.nih.gov80/entrez)獲得。根據(jù)本公開描述的分析方法中的一種，如果在一個(gè)典型的控制試驗(yàn)中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行對細(xì)胞樣品的分析產(chǎn)生明顯可鑒別的雜交或擴(kuò)增產(chǎn)物，那么在mRNA水平上的表達(dá)被稱做“可檢測的”。如果表達(dá)水平至少為2倍，和較佳地大于對照細(xì)胞10或50倍，例如未分化的pPS細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或其它無關(guān)的細(xì)胞，那么當(dāng)在蛋白質(zhì)或mRNA水平上檢測時(shí)，組織特異性標(biāo)記物的表達(dá)被認(rèn)為是陽性的。
還是神經(jīng)細(xì)胞的特征的是，具體是末端分化的細(xì)胞，涉及生物合成、釋放和神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取的受體和酶，和涉及有關(guān)突觸傳遞的去極化和復(fù)極化事件的離子通道。突觸形成的證據(jù)可通過突觸小泡蛋白的染色獲得。某些神經(jīng)遞質(zhì)的感受性的證據(jù)可通過檢測γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸、多巴胺、3，4-二羥苯丙氨酸(DOPA)、去甲腎上腺素、乙酰膽堿和血清素的受體獲得。
本發(fā)明具體的神經(jīng)前體細(xì)胞群體的分化(例如使用NT-3和BDNF)可產(chǎn)生至少為20％、30％或40％的MAP-2陽性的細(xì)胞群體。一個(gè)基本的比例，如5％、10％、25％或更多的NCAM或MAP-2陽性的細(xì)胞(在細(xì)胞計(jì)數(shù)的基礎(chǔ)上)將能夠合成神經(jīng)遞質(zhì)，例如乙酰膽堿、甘氨酸、谷氨酸、去甲腎上腺素、血清素或GABA。本發(fā)明的某些細(xì)胞群體含有NCAM或MAP-2陽性細(xì)胞，通過免疫細(xì)胞化學(xué)或mRNA表達(dá)測定，該細(xì)胞中1％、5％、10％或更多對酪氨酸羥化酶(TH)呈陽性—或者作為NCAM或MAP-2陽性細(xì)胞的百分比，或者存在于群體中的所有細(xì)胞。本領(lǐng)域中通常認(rèn)為TH是多巴胺能細(xì)胞的標(biāo)記物。
為了進(jìn)一步闡明存在于分化群體中的成熟神經(jīng)元，可根據(jù)功能標(biāo)準(zhǔn)測定細(xì)胞。例如，可使用任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)、對神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)、或已知影響體內(nèi)神經(jīng)元的其它環(huán)境條件測定鈣通量。首先，通過形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)、或通過例如NCAM的標(biāo)記物鑒別群體中的神經(jīng)元樣細(xì)胞。然后神經(jīng)遞質(zhì)或條件應(yīng)用于細(xì)胞，并監(jiān)測反應(yīng)。還可對細(xì)胞運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)膜片鉗技術(shù)，以測定是否有動(dòng)作電位的證據(jù)，以及外加電勢和反應(yīng)之間的滯后時(shí)間是怎樣的。
這里衍生自己建立的pPS細(xì)胞系的本發(fā)明的細(xì)胞群體和分離的細(xì)胞可表征為具有與它們衍生自的細(xì)胞系相同的基因組。這意味著在pPS細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞之間染色體DNA將具有超過90％的同一性，如果神經(jīng)細(xì)胞是通過正常的有絲分裂過程從未分化的細(xì)胞系獲得的，那么這是可以推斷的。既然保留了所有非-操作的遺傳因子，用重組方法以導(dǎo)入一個(gè)轉(zhuǎn)基因(例如TERT)或敲除一個(gè)內(nèi)源基因處理的神經(jīng)細(xì)胞仍被認(rèn)為與它們衍生自的細(xì)胞系具有相同的基因組。
神經(jīng)前體和末端分化的細(xì)胞的應(yīng)用本發(fā)明提供了生產(chǎn)大量的神經(jīng)前體細(xì)胞和成熟神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法。這些細(xì)胞群體可用于重要的研究、開發(fā)和商業(yè)目的。
本發(fā)明的細(xì)胞可用于制備cDNA文庫，該cDNA文庫相對地沒有為來自其它譜系的細(xì)胞中優(yōu)選表達(dá)的cDNA所污染。例如，通過在1000rpm離心5分鐘收集多能神經(jīng)祖細(xì)胞，然后制備mRNA，逆轉(zhuǎn)錄，并任選地減去來自成熟神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、或少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或未分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞的cDNA。神經(jīng)元的表達(dá)模式可通過顯微排列分析與其它細(xì)胞類型相比較，通常參考Fritz等，Science 288316，2000；《微陣列生物芯片技術(shù)(Microarray Biochip Technology)》，L Shi，www.Gene-Chips.com。
本發(fā)明分化的細(xì)胞還可用于制備抗體，該抗體對多能神經(jīng)祖細(xì)胞、屬于神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞譜系的細(xì)胞和成熟神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物具有特異性?？梢悦庖咴缘男问接帽景l(fā)明的細(xì)胞注射脊椎動(dòng)物制備多克隆抗體。單克隆抗體的生產(chǎn)描述于如Harrow和Lane(1988)，美國專利4,491,632，4,472,500和4,444,887，和《酶法(Methods in Enzymology)》73B3(1981)的標(biāo)準(zhǔn)參考書中。
商業(yè)興趣的應(yīng)用包括使用細(xì)胞篩選小分子藥物，和制備含有用于臨床治療的神經(jīng)元的藥物組合物。
藥物篩選本發(fā)明的神經(jīng)前體細(xì)胞可用于篩選影響神經(jīng)前體細(xì)胞和它們的各種子代的特征的因子(如溶劑、小分子藥物、肽、多核苷酸)或環(huán)境條件(例如培養(yǎng)條件或操作)。
在一些應(yīng)用中，pPS細(xì)胞(未分化的或分化的)用于篩選促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞成熟或促進(jìn)這種細(xì)胞在長期培養(yǎng)中增殖和保持的因子。例如，通過在不同的加樣孔中向細(xì)胞中加入候選成熟因子或生長因子檢驗(yàn)它們，然后測定獲得的任何表型變化，根據(jù)所需的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步培養(yǎng)和使用細(xì)胞。
本發(fā)明的其它篩選應(yīng)用涉及檢驗(yàn)藥物化合物對神經(jīng)組織或神經(jīng)傳導(dǎo)的影響。進(jìn)行篩選可能或者是由于設(shè)計(jì)的化合物具有對神經(jīng)細(xì)胞的藥物作用，或者是由于設(shè)計(jì)的化合物在別處有作用，可能對神經(jīng)系統(tǒng)具有意想不到的副作用?？墒褂帽景l(fā)明的任何神經(jīng)前體細(xì)胞或末端分化的細(xì)胞進(jìn)行篩選，例如多巴胺能、5’-羥色胺能、膽堿能、感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。
讀者通常參考標(biāo)準(zhǔn)教科書《藥物研究的體外方法(In vitro Methods inPharmaceutical Research)》，Academic Press，1997，和美國專利5,030,015。候選藥物化合物活性的評(píng)估通常包括將本發(fā)明分化的細(xì)胞與候選化合物結(jié)合，或者單獨(dú)的或者與其它藥物結(jié)合。研究者測定可歸因于化合物的細(xì)胞的形態(tài)、標(biāo)記物表型或功能活性的任何變化(與未處理的細(xì)胞或用無活性的化合物處理的細(xì)胞比較)，然后把化合物的作用與觀察到的變化聯(lián)系起來。
首先通過對細(xì)胞生活力、存活、形態(tài)和某些標(biāo)記物和受體的表達(dá)的影響確定細(xì)胞毒性。藥物對染色體DNA的影響可通過測定DNA合成或修復(fù)確定。尤其是在細(xì)胞周期中以不定期的次數(shù)，或者在超出細(xì)胞復(fù)制所需要的水平上，[3H]-胸苷或BrdU的摻入與藥物的作用一致。副作用還可包括通過中期擴(kuò)散測定的姊妹染色單體交換的異常比率。關(guān)于進(jìn)一步詳細(xì)的描述讀者可參考A.Vickers的《藥物研究的體處方法(In vitro Methods in Pharmaceutical Research)》375-410頁，Academic Press1997)。
細(xì)胞功能的作用可使用任何標(biāo)準(zhǔn)分析觀察神經(jīng)細(xì)胞的表型或活性進(jìn)行評(píng)估，例如受體結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)合成、釋放或吸收、電生理和神經(jīng)元突起和髓鞘的生長—或者在細(xì)胞培養(yǎng)物中或者在一個(gè)適當(dāng)?shù)哪Ｐ椭小＠?，藥物改變突觸性接觸和可塑性的能力可通過突觸或突觸小泡蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)染色在培養(yǎng)物中測定。電生理可通過測定IPSP和EPSP(抑制和刺激突觸后電位)進(jìn)行評(píng)估。另外，使用雙電極系統(tǒng)，刺激一個(gè)細(xì)胞，評(píng)估系統(tǒng)中第二個(gè)細(xì)胞的反應(yīng)。有候選藥物存在的系統(tǒng)的行為與藥物不存在的系統(tǒng)的行為進(jìn)行比較，并與藥物影響突觸性接觸或細(xì)胞可塑性的能力聯(lián)系起來。
治療用途本發(fā)明還對可能是由于功能上的先天性障礙、疾病的影響或外傷的結(jié)果造成的需要這種治療的受檢者提供了使用神經(jīng)前體細(xì)胞恢復(fù)一定程度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)功能的用途。
為了確定用于治療給予的神經(jīng)前體細(xì)胞的適用性，首先可在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型中檢驗(yàn)該細(xì)胞。首先，評(píng)估細(xì)胞體內(nèi)存活和保持它們的表型的能力。神經(jīng)前體細(xì)胞在可觀察的位點(diǎn)，例如在腦腔中或脊髓中給予免疫缺乏的動(dòng)物(例如裸鼠、或通過化學(xué)或輻射致使免疫缺乏的動(dòng)物)。在幾天到幾周或更多的一段時(shí)間后收集組織，并評(píng)估是否pPS衍生細(xì)胞仍然存在。
這可通過給予表達(dá)被預(yù)標(biāo)記(例如用BrdU或[3H]-胸苷)的可檢測的標(biāo)記物(例如綠色熒光蛋白、或β-半乳糖苷酶)的細(xì)胞進(jìn)行；或通過構(gòu)成細(xì)胞標(biāo)記物的隨后檢測(例如使用人特異性抗體)進(jìn)行。在嚙齒類動(dòng)物模型中檢驗(yàn)神經(jīng)前體細(xì)胞時(shí)，給予的細(xì)胞的存在和表型可使用人特異性抗體通過免疫組織化學(xué)或ELISA評(píng)估，或使用引起對人的多核苷酸序列具有特異性的擴(kuò)增的引物和雜交條件通過RT-PCR分析評(píng)估。在本公開的其它地方提供了用于在mRNA或蛋白質(zhì)水平上評(píng)估基因表達(dá)的適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物。
用于檢驗(yàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能的各種動(dòng)物模型描述于《CNS再生基礎(chǔ)科學(xué)和臨床進(jìn)展(CNS RegenerationBasic Science and Clinical Advances)》，M.H.Tuszynski和Kordower編，Academic Press，1999。帕金森病可通過外傷誘導(dǎo)黑質(zhì)紋狀體損傷，從而阻礙腦中主要的多巴胺途徑在大鼠中建立模型。另一種標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型是在具有MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)的小鼠或非人靈長類的黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的化學(xué)損傷。在Furns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804546，1983；Freed等，Appl.Neurophysiol.4716，1984；和Bjorklund等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 192344，2002中提供了例證。
在需要治療的人類患者中，本發(fā)明分化的細(xì)胞還可用于組織重建或再生。這些細(xì)胞以允許它們移植或遷移到預(yù)定的組織位點(diǎn)并重建或再生功能缺乏區(qū)域的方式給予。通過例證，依據(jù)所治療的疾病，神經(jīng)干細(xì)胞直接移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的實(shí)質(zhì)或鞘內(nèi)位點(diǎn)。使用單一的細(xì)胞懸浮液或密度為25,000-500,000細(xì)胞/μL的小的聚集體進(jìn)行移植(美國專利5,968,829)。包含于本發(fā)明的某些神經(jīng)祖細(xì)胞設(shè)計(jì)用于神經(jīng)系統(tǒng)急性或慢性損傷的治療。例如，興奮性神經(jīng)毒性為各種條件所影響，這些條件包括癲癇、中風(fēng)、局部缺血和阿爾茨海默病?？膳渲贫喟桶纺苌窠?jīng)元用于治療帕金森病，GABA能神經(jīng)元用于治療亨庭頓氏病，和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元用于治療脊髓損傷或肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。
根據(jù)本發(fā)明，神經(jīng)祖細(xì)胞和末端分化的細(xì)胞可以藥物組合物的形式供給，該組合物含有在充分消毒的條件下制備的用于人的給予的等滲的賦形劑。關(guān)于藥物配制的一般原則讀者可參考由G.Morstyn和W.Sheridan編的《細(xì)胞療法干細(xì)胞移植，基因療法和細(xì)胞免疫療法(Cell TherapyStem Cell Transplantation，GeneTherapy，and Cellular Immunotherapy)》，劍橋大學(xué)出版社，1996；和《造血干細(xì)胞療法(Hematopoietic Stem Cell Therapy)》，E.D.Ball，J.Lister和P.Law，Churchill Livingstone，2000。
該組合物可任選地包裝于適當(dāng)?shù)娜萜髦?，該容器上寫出了對于所需目的的用法說明，例如CNS功能的重建以改善某些神經(jīng)異常。
提供下面的實(shí)施例用于進(jìn)一步無限制地說明本發(fā)明具體的實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1胚胎干細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元如以前所描述的(AU 729377；WO 01/51616)，從不含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中獲得人胚胎干細(xì)胞(hES)。如下生產(chǎn)胚狀體。hES細(xì)胞的融合的單層培養(yǎng)物通過在1mg/ml的膠原酶中培養(yǎng)5-20分鐘獲得，隨后從平板上刮下細(xì)胞。然后細(xì)胞被分離成簇，并在包含80％的KO(“敲除”)DMEM(Gibco)和20％的非-加熱-滅活的FBS(Hyclone)，添加有1％的非必需氨基酸，1mM的谷氨酰胺，0.1mM的β-巰基乙醇的培養(yǎng)基中的非-粘著細(xì)胞培養(yǎng)平板(Costar)中鋪板。細(xì)胞在每孔2ml的培養(yǎng)基中(6孔平板)以1∶1或1∶2的比例接種。
在懸浮液中4天后，在添加了10ng/mL的人EGF、10ng/mL的人bFGF、1ng/mL的PDGF-AA和1ng/mL的人IGF-1的限定的培養(yǎng)基中，胚狀體在纖連細(xì)胞包被的平板上鋪板。胚狀體粘著到平板上，并且細(xì)胞開始遷移到塑料上，形成單細(xì)胞層。
3天后，觀察到許多具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞。神經(jīng)前體被鑒別為對BrdU摻入、干蛋白染色和譜系特異性分化標(biāo)記物缺乏呈陽性的細(xì)胞。推定的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞被鑒定為對聚唾液酸化的NCAM和A2B5呈陽性。如通過流式細(xì)胞儀測定的，41-60％的細(xì)胞表達(dá)NCAM，20-66％的細(xì)胞表達(dá)A2B5。發(fā)現(xiàn)NCAM-陽性細(xì)胞的亞群體表達(dá)β-微管蛋白III和MAP-2。這里沒有與例如GFAP或GalC的神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)記物的協(xié)同定位。A2B5陽性細(xì)胞似乎生產(chǎn)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)。A2B5細(xì)胞的亞群體表達(dá)β-微管蛋白III或MAP-2，而另一個(gè)分離的亞群體表達(dá)GFAP。具有神經(jīng)元形態(tài)的一些細(xì)胞對A2B5和NCAM進(jìn)行雙重染色。NCAM陽性和A2B5陽性群體含有的神經(jīng)元都遠(yuǎn)比神經(jīng)膠質(zhì)多。
通過在不含促細(xì)胞分裂原，但是含有10ng/mL的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)和10ng/mL的腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的培養(yǎng)基中將細(xì)胞重復(fù)鋪板進(jìn)一步分化細(xì)胞群體。約7天后觀察到具有大量突起的神經(jīng)元。衍生自保存于視黃酸(RA)的胚狀體的培養(yǎng)物比那些衍生自保存于不含RA的胚狀體的培養(yǎng)物(約5％)顯示更多的MAP-2陽性細(xì)胞(約26％)。觀察到GFAP陽性細(xì)胞呈斑點(diǎn)狀。鑒別到GalC陽性細(xì)胞，但是該細(xì)胞大而扁平而不具有復(fù)雜的突起。
評(píng)估神經(jīng)遞質(zhì)合成的存在。鑒定到GABA-免疫活性細(xì)胞共表達(dá)β-微管蛋白III或MAP-2，并具有神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)特征。鑒定到偶爾有些GABA-陽性細(xì)胞不共表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物，但卻具有星形膠質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)。鑒定到神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)酪氨酸羥化酶(TH)和MAP-2。通過用突出小泡蛋白抗體染色鑒定到突出的形成。
在從人的ES細(xì)胞的H9細(xì)胞系分化的培養(yǎng)物中觀察TH染色。胚狀體保存于10μM的視黃酸中4天，然后在EGF、堿性FGF、PDGF和IGF中、在纖連蛋白包被的平板上鋪板3天。接著它們在添加了10ng/mL的NT-3和10ng/mL的BDNF的N2培養(yǎng)基中的層粘連蛋白上傳代，并使之進(jìn)一步分化14天。分化的細(xì)胞用4％的多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，然后使用抗體對TH顯影，TH是多巴胺能細(xì)胞的標(biāo)記物。
實(shí)施例2多巴胺能細(xì)胞的富集群體胚狀體培養(yǎng)于具有10μm的視黃酸的懸浮液中4天，然后鋪板于添加了EGF、bFGF、PDGF和IGF-1的限定的培養(yǎng)基中3-4天。接著，通過磁珠分選或免疫淘選將細(xì)胞分離為A2B5-陽性或NCAM-陽性富集的群體。
免疫-選擇的細(xì)胞保存于添加了10ng/mL的NT-3和10ng/mL的BDNF的限定的培養(yǎng)基中。14天后，25±4％的NCAM-分選的細(xì)胞為MAP-2陽性—其中1.9±0.8％的細(xì)胞為GABA-陽性，3±1％的細(xì)胞對酪氨酸羥化酶(TH)呈陽性用于多巴胺合成的速度限制酶，常常被認(rèn)為是多巴胺合成細(xì)胞的代表。
在對于NCAM分選的細(xì)胞群體中，NCAM陽性的細(xì)胞不表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)記物，例如GFAP或GalC。這些資料表明含有神經(jīng)元限制前體的群體可從hES細(xì)胞培養(yǎng)物直接分離，基本上不含神經(jīng)膠質(zhì)前體雜質(zhì)。
另一方面，對于A2B5分選的細(xì)胞具有產(chǎn)生神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力。富集后，細(xì)胞放入添加了NT-3和BDNF的限定的培養(yǎng)基中，并使之分化14天。鋪板后最初1-2天內(nèi)，A2B5富集群體中的細(xì)胞開始延伸突觸。兩周后，細(xì)胞呈現(xiàn)成熟神經(jīng)元的形態(tài)，并且32±3％的細(xì)胞為MAP-2陽性。重要的是，3±1％的MAP-2細(xì)胞為TH-陽性，而只有0.6±0.3％具有GABA免疫反應(yīng)性。這些資料表明可從含有星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的祖細(xì)胞的hES細(xì)胞中獲得細(xì)胞群體，包括合成多巴胺的細(xì)胞群體。
關(guān)于獲得TH-表達(dá)神經(jīng)元的條件的進(jìn)一步詳細(xì)的說明如下。胚狀體通過在1mg/mL的膠原酶中培養(yǎng)(37℃，5-20分鐘)傳代32次時(shí)從H7細(xì)胞系的融合hES細(xì)胞產(chǎn)生，刮削培養(yǎng)皿，并將細(xì)胞放入非-粘著培養(yǎng)平板中(Costar)。獲得的EB培養(yǎng)于含有FBS和10μM的全-反(all-trans)視黃酸的培養(yǎng)基中的懸浮液中。4天后，收集聚集體并使之沉淀于離心管中。然后吸出上清液，并且聚集體在增殖培養(yǎng)基中(添加N2的DMEM/F12 1∶1，半強(qiáng)度B27，10ng/mL的EGF(R&D系統(tǒng))，10ng/mL的bFGF(Gibco)，1ng/mL的PDGF-AA(R和D系統(tǒng))，和1ng/mL的IGF(R和D系統(tǒng)))的聚L-賴氨酸和纖連蛋白包被的平板上鋪板。
使EB附著并增殖3天；然后通過胰蛋白酶消化約1分鐘(Sigma)收集并以1.5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪板于增殖培養(yǎng)基中的聚L-賴氨酸和層粘連蛋白包被的4-孔分室玻片上1天。然后將培養(yǎng)基改為Neural Basal培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基添加了B27，以及下面的生長混合物之一·10ng/mL的bFGF(Gibco)，10ng/mL的BDNF，和10ng/mL的NT-3·10ng/mL的bFGF，5000ng/mL的sonic hedgehog，和100ng/mL的FGF8b·僅10ng/mL的bFGF細(xì)胞保存于這些條件下6天，隔天飼養(yǎng)。在第7天，培養(yǎng)基改為具有B27的NeuralBasal培養(yǎng)基，添加了如下的混合物之一·10ng/mL的BDNF，10ng/Mld NT-3·1μM的cAMP，200μM的抗壞血酸·1μM的Camp，200μM的抗壞血酸，10ng/mL的BDNF，10ng/mL的NT-3培養(yǎng)物隔天飼養(yǎng)直到第12天，這時(shí)固定它們并用抗-TH或MAP-2進(jìn)行標(biāo)記用于免疫細(xì)胞化學(xué)。標(biāo)記物的表達(dá)通過使用40X的物鏡計(jì)數(shù)3個(gè)孔的每一個(gè)孔中的4個(gè)區(qū)域定量。
結(jié)果顯示于表1中。最初培養(yǎng)于bFGF、BDNF和NT-3的產(chǎn)生最高比例的TH陽性細(xì)胞。
表1生產(chǎn)多巴胺能神經(jīng)元的條件培養(yǎng)條件MAP-2陽性 TH陽性的MAP-1-6天 6-12天細(xì)胞的％2細(xì)胞的％BDNF，NT-3，bFGFBDNF，NT-3 26％ 5.5％BDNF，NT-3，bFGFcAMP，AA(抗壞血酸) 35％ 4.0％BDNF，NT-3，bFGFcAMP，AA，BDNF，NT-3 25％ 8.7％bFGF，F(xiàn)GF8，SHH BDNF，NT-3 37％ 3.7％bFGF，F(xiàn)GF8，SHH cAMP，AA 34％ 3.9％bFGF，F(xiàn)GF8，SHH cAMP，AA，BDNF，NT-3 21％ 5.8％bFGFBDNF，NT-3 28％ 3.5％bFGFcAMP，AA 26％ 4.1％bFGFcAMP，AA，BDNF，NT-3 22％ 5.7％實(shí)施例3通過用促紅細(xì)胞生成素培養(yǎng)提高多巴胺能細(xì)胞的比例在后來的實(shí)驗(yàn)中，胚狀體在聚賴氨酸纖連蛋白包被的加樣孔上鋪板，并用10ng/mL的EGF、1ng/mL的PDGF-AA、10ng/mL的bFGF和1ng/mL的IGF-1培養(yǎng)。第四天，向混合物中添加5U/mL的EPO、700μM的cAMP，或二者。細(xì)胞被重新鋪板，并用10ng/mL的BDNF、10ng/mL的NT-3，和任選的EPO、cAMP和200μM的抗壞血酸處理7天。結(jié)果顯示于表2中。在這個(gè)試驗(yàn)中培養(yǎng)物中MAP-2陽性的總的細(xì)胞比例異常地低。
表2生產(chǎn)多巴胺能神經(jīng)元的條件培養(yǎng)條件TH陽性MAP-2細(xì)胞的％(SD)1-3天 4-5天 6-12天EGF，bFGF，PDGF，IGF-1 EGF，bFGF，PDGF，IGF-1BDNF，NT-3 20％(13％)(相同) (相同)BDNF，NT-3，EPO，cAMP，AA 24％(3％)(相同) 相同+EPO BDNF，NT-3，EPO，cAMP，AA 31％(13％)(相同) 相同+cAMP BDNF，NT-3，EPO，cAMP，AA 47％(2％)(相同) 相同+EPO和cAMPBDNF，NT-3，EPO，cAMP，AA 57％(7％)這些數(shù)據(jù)提供了最初的證據(jù)，即在神經(jīng)前體細(xì)胞衍生的過程中加入cAMP和EPO提高了最終獲得的表達(dá)酪氨酸羥化酶的神經(jīng)元的百分比。Studer等報(bào)道在EPO存在或低氧分壓的情況下中腦前體的增殖或分化產(chǎn)生較高數(shù)量的多巴胺能神經(jīng)元(J.Neurosci.207377，2000)。人們認(rèn)為EPO在含氧量低的條件下具有神經(jīng)保護(hù)作用，推動(dòng)多能祖細(xì)胞趨向神經(jīng)元通路(Shingo等，J.Neurosci，219733，2001)。這一作用可能是Janus激酶-2和核因子卡巴(NF-KB)之間通訊、Bcl-x(L)表達(dá)的正調(diào)節(jié)、或AP-1(Jun/Fos)通路的活化的結(jié)果。在pPS衍生的神經(jīng)細(xì)胞中通過其它方法調(diào)節(jié)這些通路可模擬EPO的作用。
實(shí)施例4hES細(xì)胞直接分化為多巴胺能神經(jīng)元這一研究評(píng)估用于分化人的ES細(xì)胞成為神經(jīng)元而不形成胚狀體的各種例子。
開發(fā)了一種策略，其中根據(jù)同源性和/或功能的重復(fù)性將檢驗(yàn)因子分成幾組(表3)。分組因子提高了組內(nèi)相關(guān)活性在ES細(xì)胞群體上將被引發(fā)的可能性。假設(shè)混合物中的某些因子將引發(fā)分化級(jí)聯(lián)。當(dāng)分化進(jìn)行并細(xì)胞的受體表達(dá)特征改變時(shí)，它們將開始對混合物中的其它因子作出反應(yīng)。
在整個(gè)治療期間持續(xù)地提供復(fù)雜的因子混合物避免精確地限定如何和何時(shí)改變細(xì)胞的反應(yīng)的需要。當(dāng)混合物被鑒定引起所欲的分化過程時(shí)，它可被系統(tǒng)地簡化以獲得最小量的最佳的混合物。進(jìn)一步檢驗(yàn)后，最少量的處理可能最終包括一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多所列出的因子，根據(jù)依據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的步驟同時(shí)或者依次使用。
表3檢驗(yàn)因子組組1 組2 組3神經(jīng)營養(yǎng)蛋白促細(xì)胞分裂原 干細(xì)胞因子30ng/mL的NGF30ng/mL的EGF 8ng/mL的LIF30ng/mL的NT-3 30ng/mL FGF-2(堿性FGF)3ng/mL的IL-630ng/mL的NT-4 37ng/mL的FGF-8b 3ng/mL的IL-1130ng/mL的BDNF 30ng/mL的IGF-13ng/mL的SCF30ng/mLPDGF-AA30ng/mL的CNTF組4 組5 組6分化因子TGF-β超家族TGF-β超家族拮抗物分化因子30ng/mL的BMP-2 150ng/mL的頭蛋白 37ng/mL的SHH37ng/mL的GDF-5 30ng/mL的促濾泡素抑制素3ng/mL的GDNF30ng/mL的Neurturin組7 組8 組9神經(jīng)營養(yǎng)因子分化因子 存活因子/抗氧化劑37ng/mL的中期因子 17μM的視黃酸 166μM的抗壞血酸組10組11分化因子/神經(jīng)遞質(zhì) 存活因子10μM的多巴胺 100μM的聯(lián)丁?；鵦AMP如下進(jìn)行試驗(yàn)。通過培養(yǎng)于膠原酶IV 5-10分鐘收獲人ES細(xì)胞系的單層培養(yǎng)物，然后從平板上刮落細(xì)胞。通過研磨將細(xì)胞分離，并使其幾乎鋪滿用減少了生長因子的Matrigel預(yù)處理的96孔組織培養(yǎng)平板，該平板置于敲除DMEM(Knock DMEN)培養(yǎng)基(Gibco BRL)中，培養(yǎng)基中含有用小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)節(jié)了24小時(shí)的敲除血清替換物(Knockout Serum Replacement)(Gibco BRL)。鋪板1天后，該培養(yǎng)基為添加了0.5mM的谷氨酰胺、B27補(bǔ)充物(Gibco BRL)和如下文描述的檢驗(yàn)因子組的神經(jīng)基礎(chǔ)(Neurobasal)(NB)培養(yǎng)基(Gibco BRL)取代。每天用含有谷氨酰胺、B27和檢驗(yàn)因子的新鮮神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞，飼養(yǎng)11天。
11天后，通過在胰蛋白酶中培養(yǎng)5-10分鐘收獲細(xì)胞，在用層粘連蛋白預(yù)處理的96孔組織培養(yǎng)平板上以1∶6的稀釋重新鋪板，并每天用含有谷氨酰胺、B27和檢驗(yàn)因子的新鮮神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基再飼養(yǎng)5天。細(xì)胞在4％的多聚甲醛中固定20分鐘，并用抗體對早期神經(jīng)元標(biāo)記物-β-微管蛋白-III、晚期神經(jīng)元標(biāo)記物-MAP-2和酪氨酸羥化酶—一種與多巴胺能神經(jīng)元有關(guān)的酶進(jìn)行染色。細(xì)胞核用DAPI標(biāo)記，并通過目視檢查定量。結(jié)果顯示于表4中。
表4hES細(xì)胞直接分化為神經(jīng)元B-微管蛋白-IIIMAP-2 酪氨酸羥化酶包含于細(xì)胞培養(yǎng)物中的檢驗(yàn)化合陽性 陽性 陽性物組細(xì)胞/孔 ％總量 細(xì)胞/孔 細(xì)胞/孔 ％總量對照 102 - 21 -處理A 1，2，3，4，6，7，8，9，10，1100 00 -處理B 1，2，3，5，6，7，8，9，10，11362 6％ 13214 0.2％處理C 1，2，4，6，7，8，9，10，11 -- -- -處理D 1，2，5，6，7，8，9，10，11 378 11％ 162 16 0.5％處理E 1，3，4，6，7，8，9，10，11 6- 24 -處理F 1，3，5，6，7，8，9，10，11 282 12％ 92 4 0.2％處理G 1，4，6，7，8，9，10，11 17-02 --＝未測定在另一個(gè)試驗(yàn)中，細(xì)胞象前面一樣培養(yǎng)于添加有谷氨酰胺、B27和檢驗(yàn)因子組的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在第8天時(shí)用胰蛋白酶收獲，并重新鋪板5天。結(jié)果顯示于表5中。
表5hES細(xì)胞直接分化為神經(jīng)元β微管蛋白 酪氨酸羥化 對TH也呈MAP-2陽性包含于細(xì)胞培養(yǎng)物中的-III陽性酶陽性陽性的MAP-檢驗(yàn)化合物組2陽性細(xì)胞細(xì)胞/孔 細(xì)胞/孔 細(xì)胞/孔的百分比對照 4 4 0處理 1，2，3，4，6，7，8，9，10，11 12 8 3處理 1，2，3，5，6，7，8，9，10，11 268 12 4處理 1，2，4，6，7，8，9，10，1112 0 0處理 1，2，5，6，7，8，9，10，11372 48 7 15％處理 1，3，4，6，7，8，9，10，110 0 0處理 1，3，5，6，7，8，9，10，11196 56 0處理 1，4，6，7，8，9，10，11 16 0 9一些處理范例誘導(dǎo)神經(jīng)元的直接分化。包括第5組因子的處理(頭蛋白和促濾泡素抑制素)是最有效的。
圖1顯示了使用處理B、處理D和處理F獲得、并對β-微管蛋白-III染色的直接分化的細(xì)胞的典型區(qū)域。根據(jù)形態(tài)學(xué)和β-微管蛋白-III染色，大約5-12％的細(xì)胞是神經(jīng)元。根據(jù)MAP-2染色，其中大約1/3是成熟的神經(jīng)元。神經(jīng)元總量的大約2-5％(5-15％的MAP-2陽性神經(jīng)元)也對酪氨酸羥化酶染色，這與多巴胺能表型一致。
進(jìn)行隨后的試驗(yàn)以進(jìn)一步說明某些因子混合物的作用和分化動(dòng)力學(xué)。
圖2(A)顯示一個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果，其中TGF-β超家族拮抗物頭蛋白和促濾泡素抑制素用于不同的時(shí)間周期。H7細(xì)胞系的分會(huì)合hES細(xì)胞用處理D(除cAMP濃度為700μg外)處理15天。結(jié)果表明頭蛋白和促濾泡素抑制素都會(huì)促成神經(jīng)元的分化，并相互協(xié)作。頭蛋白明顯地在約1周時(shí)(第5-8天)重要，而促濾泡素抑制素在約2周時(shí)(第13-15天)重要，最大化的生產(chǎn)成熟神經(jīng)元而不是小的軸突。
圖2(B)顯示使用表4中含有TGF-β超家族拮抗物的處理混合物的神經(jīng)元誘導(dǎo)的時(shí)程。圖2(C)進(jìn)一步說明了頭蛋白和促濾泡素抑制素在直接分化中的作用。由第一個(gè)條形代表的hES細(xì)胞用組1、4、6、7、9、10和11的因子(表3)處理，其中具有700μM的Camp、5U/mL的EPO，加上30ng/mL的FGF-8(組2)。實(shí)際上，在缺乏頭蛋白和促濾泡素抑制素的情況下沒有形成β-微管蛋白陽性神經(jīng)元。然而，僅頭蛋白和促濾泡素抑制素或與視黃酸結(jié)合通過神經(jīng)元誘導(dǎo)的第一步直接誘導(dǎo)hES細(xì)胞。假定最初的頭蛋白/促濾泡素抑制素誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)祖細(xì)胞，隨后可通過加入其它因子誘導(dǎo)它形成神經(jīng)元。
圖2(D)顯示從需要得到多巴胺能神經(jīng)元的混合物中除去視黃酸(RA)的好處。細(xì)胞根據(jù)前面描述的處理F(左邊2個(gè)條形)或除去視黃酸(右邊2個(gè)條形)進(jìn)行分化。包含視黃酸稍微提高了β-微管蛋白陽性神經(jīng)元的百分比，但是降低了那些神經(jīng)元對酪氨酸羥化酶的陽性著色的比例。
實(shí)施例5通過系列傳代神經(jīng)前體的增殖再生本發(fā)明的神經(jīng)祖細(xì)胞可在培養(yǎng)物中傳代和擴(kuò)展，表明它們的一些獨(dú)特的和有益的特性。
在一個(gè)典型的實(shí)施例中，收獲人胚胎干細(xì)胞并放置于懸浮培養(yǎng)物中以在含有20％的FBS加上10μM的視黃酸的基因敲除DMEM中形成胚狀體。4天后，胚狀體在DMEM/F12培養(yǎng)基中在聚-L-賴氨酸/層粘連蛋白包被的平板上鋪板，該DMEM/F12培養(yǎng)基添加了N2添加物、通常量的一半的B27、10ng/mL的人EGF、10ng/mL的人bFGF、1ng/mL的人PDGF-AA和1ng/mL的人IGF-1。
培養(yǎng)細(xì)胞3天，通過如下簡單的胰蛋白酶處理收獲細(xì)胞。0.53mM的EDTA(Gibco#25300-054)中的0.5mL的0.5％的胰蛋白酶鋪在6孔平板的各個(gè)孔中，然后立即從平板上除去。等待15秒鐘后(室溫)，將加有B27添加物的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基放置在加樣孔中，然后除去并離心以回收釋放的細(xì)胞(在細(xì)胞的1和10％之間)。
6孔平板用1mL/孔的15μg/mL的聚-L-賴氨酸(Sigma # 1274)包被，隨后是1mL/孔的20μg/mL的人胎盤層粘連蛋白(Gibco # 23017-015)過夜。從不同的胰蛋白酶化獲得的細(xì)胞顆粒在含有B27添加物、10ng/mL的NT-3和10ng/mL的BDNF的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重懸浮，并以500,000-750,000細(xì)胞/孔在包被的孔上鋪板。
5天后，細(xì)胞通過完全胰蛋白酶化回收，計(jì)數(shù)，并以100,000-500,000細(xì)胞/孔在有各種因子混合物存在的新的聚-賴氨酸/層粘連蛋白包被的孔中重新鋪板。使用的濃度如下各種組合的10ng/mL的NT-3、10ng/mL的BDNF、10ng/mL的人EGF、10ng/mL的人bFGF、或10ng/mL的LIF。每周更換三次培養(yǎng)基，每次更換一半以飼養(yǎng)細(xì)胞。每7天，細(xì)胞被胰蛋白酶化，計(jì)數(shù)，并在含有相同因子的新鮮培養(yǎng)基中再次傳代。
圖3(A)顯示本試驗(yàn)的生長曲線。僅在BDNF和NT-3中傳代的細(xì)胞約1周后停止了生長，主要分化成神經(jīng)元。然而，向培養(yǎng)基中加入EGF和bFGF使細(xì)胞以前體的形式繼續(xù)增殖。這些細(xì)胞的標(biāo)記物特征顯示于表5中。
表5神經(jīng)祖細(xì)胞的表型標(biāo)記物混合物 傳代 β-微管細(xì) 酪氨酸干蛋白 PS-NCAM A2B5GFAPMAP2胞III 羥化酶NT-3，BDNF，p4+++ +++ ++ ++ - -EGF，bFGF，LIF P8+++ +++ + ++ - -NT-3，BDNF，p4+++ +++ + ++ - -EGF，bFGF， P8+++ +++ - ++ - -p4++ ++ + ++ - -EGF，bFGF，LIFP8++ ++ - +- - -p4++ ++ - -- - -EGF，BfgfP8+ +- -- - -因此，在BDNF、NT-3、EGF和bFGF的組合物中傳代的細(xì)胞大量地表達(dá)神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記物干蛋白和NCAM。
圖3(B)顯示當(dāng)僅在BDNF和NT-3中這些細(xì)胞被誘導(dǎo)進(jìn)行最終分化時(shí)獲得的結(jié)果。在BDNF、NT-3、EGF和bFGF的組合物中傳代的細(xì)胞在最終分化時(shí)產(chǎn)生更多的神經(jīng)元，與在分化前較高比例的神經(jīng)前體一致。
圖4(A)顯示對酪氨酸羥化酶染色陽性的細(xì)胞的比例。在檢驗(yàn)的組合物中BDNF、NT-3、EGF和bFGF的組合物又一次提供了最佳的收獲量。
圖4(B)顯示甚至更多的TH-陽性神經(jīng)元可通過誘導(dǎo)最終分化生產(chǎn)，這種分化不是僅由BDNF和NT-3誘導(dǎo)，還包括添加的因子，例如NT-4、神經(jīng)生長因子、抗壞血酸、cAMP和多巴胺(以表3中顯示的濃度)。群體中相當(dāng)于細(xì)胞總量的5％的細(xì)胞顯示多巴胺能標(biāo)記物的表型。
來自H7 hES細(xì)胞系的神經(jīng)祖細(xì)胞在含有B27添加物、30％的血清替代物和10％的DMSO的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中在傳代10次時(shí)冷凍(5×105細(xì)胞/冷凍瓶)。約6個(gè)半月后細(xì)胞解凍。解凍的細(xì)胞具有許多與它們冷凍前相同的特征60-80％的β-微管蛋白和MAP-2陽性，約5％的對酪氨酸羥化酶呈陽性。
在一個(gè)相關(guān)試驗(yàn)中，細(xì)胞呈簇生長和傳代，而不是在培養(yǎng)基上。當(dāng)接近融合時(shí)使用胰蛋白酶從6孔平板中收獲神經(jīng)祖細(xì)胞(約3或4×105細(xì)胞/孔)。然后它們以約2.5×105細(xì)胞/孔在非粘著的加樣孔中接種，并培養(yǎng)于2mL的含有B27添加物、10ng/mL的BDNF、10ng/mL的EGF和10ng/mL的bFGF的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。隨后的一天通過更換一半培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞，并繼續(xù)培養(yǎng)4天。然后它們在含有10ng/mL的BDNF和10ng/mL的NT-3但不含有促細(xì)胞分裂原的培養(yǎng)基中分化。
本公開中描述的發(fā)明的適應(yīng)是常規(guī)優(yōu)化的問題，并且可在不偏離本發(fā)明的精神或下文權(quán)利要求的范圍的情況下進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種體外培養(yǎng)的分化的細(xì)胞群體，其特征在于，所述細(xì)胞群體中至少約30％的MAP-2陽性細(xì)胞具有它們是靈長類多能干(pPS)細(xì)胞子代的特征，并具有一個(gè)或多個(gè)如下特性·它們表達(dá)酪氨酸羥化酶；·它們一經(jīng)活化就釋放多巴胺。
2.一種體外培養(yǎng)的分化的細(xì)胞群體，其特征在于，至少群體所有細(xì)胞的約5％具有它們是靈長類多能干(pPS)細(xì)胞子代的特征，并具有一個(gè)或多個(gè)如下特性·它們表達(dá)酪氨酸羥化酶；·它們一經(jīng)活化就釋放多巴胺；·它們在帕金森病的黑質(zhì)紋狀體損傷模型中提供臨床改善。
3.一種體外培養(yǎng)的神經(jīng)元前體細(xì)胞群體，其特征在于，所述細(xì)胞群體中至少約60％的細(xì)胞表達(dá)A2B5、聚唾液酸化的NCAM或干蛋白，并用附加的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(NT-3)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4(NT-4)和神經(jīng)生長因子(NGF)，但不加入促細(xì)胞分裂原培養(yǎng)7天，產(chǎn)生如權(quán)利要求1或2所述的分化的細(xì)胞群體。
4.如權(quán)利要求3所述的神經(jīng)元前體細(xì)胞群體，其特征在于，所述細(xì)胞群體能在培養(yǎng)物中至少進(jìn)行20次群體加倍，并且在其20次加倍后，用NT-3、BDNF、NT-4和NGF但不加入促細(xì)胞分裂原培養(yǎng)時(shí)，保持形成如權(quán)利要求1或2所述的分化的細(xì)胞群體的能力。
5.一個(gè)兩種細(xì)胞群體的組，其特征在于，所述組由上述任一權(quán)利要求所述的細(xì)胞群體和獲得該細(xì)胞群體的未分化的pPS細(xì)胞系組成。
6.如權(quán)利要求1-4所述的細(xì)胞群體，其特征在于，所述細(xì)胞群體屬于如權(quán)利要求5所述的一組細(xì)胞群體。
7.一種制備神經(jīng)元前體細(xì)胞群體的方法，其特征在于，所述方法包括a)在含有一種或多種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和一種或多種促細(xì)胞分裂原的培養(yǎng)基中培養(yǎng)靈長類多能干(pPS)細(xì)胞或它們的子代，和b)從培養(yǎng)物中收獲一個(gè)細(xì)胞群體，其中至少約60％的細(xì)胞表達(dá)A2B5、聚唾液酸化的NCAM或干蛋白；它在培養(yǎng)基中至少能20次加倍，并在20次加倍后保持分化成含有至少20％MAP-2陽性細(xì)胞的群體的能力。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括在用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和促細(xì)胞分裂原培養(yǎng)前通過形成胚狀體預(yù)分化pPS細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求7-8所述的方法，其特征在于，所述方法包括在用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白培養(yǎng)前用一種或多種附加的促細(xì)胞分裂原培養(yǎng)細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求7-9所述的方法，其特征在于，所述方法包括選擇粘著到固體基質(zhì)上但通過簡單的酶消化便從基質(zhì)上釋放的細(xì)胞。
11.一種制備神經(jīng)元前體細(xì)胞群體的方法，其特征在于，所述方法包括a)在含有一種或多種附加的TGF-β超家族拮抗物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)pPS細(xì)胞的子代，和b)從培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞群體，其中至少50％的細(xì)胞表達(dá)聚唾液酸化的NCAM或者β-微管蛋白III。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含一種或多種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和一種或多種促細(xì)胞分裂原。
13.如權(quán)利要求11-12所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞群體是通過將pPS細(xì)胞平鋪在固體表面制造的，而無需形成胚狀體或細(xì)胞聚集體。
14.如權(quán)利要求12-13所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞群體是通過在含有頭蛋白和促濾泡素抑制素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)pPS細(xì)胞的子代制造的。
15.如權(quán)利要求7-14所述的方法，其特征在于，所述附加的促細(xì)胞分裂原選自表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)和胰島素樣生長因子1(IGF-1)，所述附加的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白包括神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(NT-3)或腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。
16.如權(quán)利要求7-15所述的方法，其特征在于，所述附加的促細(xì)胞分裂原包括紅細(xì)胞生成素(EPO)。
17.如權(quán)利要求7-16所述的方法，其特征在于，所述方法包括在含有附加的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和附加的促細(xì)胞分裂原的培養(yǎng)基中傳代細(xì)胞至少6次。
18.如權(quán)利要求7-17所述的方法，其特征在于，所述經(jīng)20次加倍后的神經(jīng)元前體細(xì)胞保持形成分化的細(xì)胞群體的能力，其中，在用NT-3、BDNF、NT-4和NGF而不用促細(xì)胞分裂原培養(yǎng)時(shí)，至少約30％的MAP-2陽性細(xì)胞表達(dá)酪氨酸羥化酶。
19.如權(quán)利要求7-18所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)元前體細(xì)胞經(jīng)20次加倍后的保持形成分化的細(xì)胞群體的能力，其中，在用NT-3、BDNF、NT-4和NGF而不用促細(xì)胞分裂原培養(yǎng)時(shí)，至少群體所有細(xì)胞的約5％表達(dá)酪氨酸羥化酶。
20.一種制造分化細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括，在含有一種或多種選自神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、cAMP和抗壞血酸的因子，而不含有附加的促細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用權(quán)利要求7-19所述方法制備的神經(jīng)元前體細(xì)胞。
21.一種鑒定因子的方法，所述因子適合用權(quán)利要求7-20中任一項(xiàng)所述方法制備的神經(jīng)元前體細(xì)胞衍生、維持或分化，其特征在于，所述方法包括用按照功能分組的因子的組合培養(yǎng)細(xì)胞，用已除去一些官能團(tuán)的較小組合培養(yǎng)細(xì)胞，然后鑒定細(xì)胞衍生、維持或分化需要哪些因子。
22.一種篩選化合物對神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞活性的作用的方法，其特征在于，所述方法包括a)將化合物與權(quán)利要求1-4所述的細(xì)胞群體，或用權(quán)利要求7-20所述方法制造的細(xì)胞群體結(jié)合；b)確定由于與化合物結(jié)合而產(chǎn)生的群體中細(xì)胞表型或活性的任何變化；和c)將該變化與化合物對神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞活性的作用相聯(lián)系。
23.如權(quán)利要求22所述的篩選方法，其特征在于，所述方法包括以下一項(xiàng)或多項(xiàng)·確定該化合物對細(xì)胞是否具有毒性；·確定該化合物是否影響細(xì)胞在培養(yǎng)物中維持的能力；·確定該化合物是否改變神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放或被細(xì)胞攝取；或·確定該化合物是否改變細(xì)胞的電生理學(xué)。
24.一種藥物，其特征在于，所述藥物含有如權(quán)利要求1-4所述的細(xì)胞群體，或用權(quán)利要求7-20所述方法制造的細(xì)胞群體，用于通過外科手術(shù)或療法進(jìn)行人或動(dòng)物體的治療。
25.如權(quán)利要求1-4所述的細(xì)胞群體、或用權(quán)利要求7-20所述方法制造的細(xì)胞群體在制備用于在個(gè)體中重建或補(bǔ)充中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)功能的藥物中的應(yīng)用。
26.如權(quán)利要求1-4所述的細(xì)胞群體、或用權(quán)利要求7-20所述方法制造的細(xì)胞群體在制備用于治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用。
27.如任何前述權(quán)利要求所述的細(xì)胞群體、方法或應(yīng)用，其特征在于，所述pPS細(xì)胞分離自人胚泡，或是這種細(xì)胞的子代。
28.如任何前述權(quán)利要求所述的細(xì)胞群體、方法或用途，其特征在于，所述pPS細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
全文摘要
本公開提供了改進(jìn)的從多能干細(xì)胞獲得神經(jīng)祖細(xì)胞和分化的神經(jīng)元群體的方法。該技術(shù)可用于制造通過至少40次加倍增殖，但卻保持分化成為各種不同神經(jīng)表型的能力的祖細(xì)胞。獲得的細(xì)胞群體含有高比例的對酪氨酸羥化酶著色的細(xì)胞，這是多巴胺能神經(jīng)元的一個(gè)特征?？纱罅可a(chǎn)本發(fā)明的神經(jīng)祖細(xì)胞和末端分化的神經(jīng)元以用于藥物篩選和臨床上重要的神經(jīng)疾病，例如帕金森病的治療。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1630713SQ02815144
公開日2005年6月22日 申請日期2002年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月21日
發(fā)明者M·K·卡朋特, J·J·鄧漢姆, M·S·因諾庫馬, S·R·希斯 申請人:杰龍公司