專利名稱：病毒藥物敏感性測試的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒藥物敏感性測試，尤其涉及測試經(jīng)藥物治療的、有包膜病毒感染的哺乳動物個體中的藥物表型敏感性的方法，即通過測試包裝到從所述個體的生物樣品中回收的有包膜病毒中的一種酶，來測試有包膜病毒感染例如逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的(例如人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的)、經(jīng)藥物治療的哺乳動物個體中藥物表型敏感性的方法。
背景HIV藥物敏感性與新治療的病毒學(xué)反應(yīng)有關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)化抗藥性試驗?zāi)壳笆强衫玫模襾碜耘R床試驗的數(shù)據(jù)提示，抗藥性試驗的應(yīng)用可能與改進的病毒學(xué)結(jié)論有關(guān)。然而，抗藥性就性能、實驗結(jié)果分析及臨床應(yīng)用而言是復(fù)雜的。
表型試驗測定HIV分離物在有藥物情況下的生長能力，且采用評價在不同藥物濃度時的病毒復(fù)制抑制程度的測定來進行所述表型試驗。結(jié)果用來計算對分離物50％或90％抑制的藥物濃度。伴隨著經(jīng)典表型分析的一個潛在問題是，在病毒分離期間病毒群體中的遺傳漂變效應(yīng)。在最壞的情況下，所分離的病毒克隆是最適合在體外條件下生長的病毒克隆，而不是患者體內(nèi)最豐富的病毒克隆。
現(xiàn)在，可通過基于重組DNA技術(shù)的自動分析，完成藥物表型敏感性的測定。這些方法涉及編碼HIV蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的血漿RNA的擴增，以及用來自實驗室構(gòu)建體(盒式病毒)的其它基因產(chǎn)生重組病毒[1]。基因型分析測定由抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物靶向的基因中的某些突變的發(fā)生。而表型抗性則測量病毒對藥物的敏感性，基因分型賦予表型抗性的突變。從每毫升含有500-1000個RNA拷貝的血漿中通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增HIV-1序列是這些分析以及重組病毒表型分析中的第一個步驟。根據(jù)所評價的突變和在實驗室進行的實驗，基因型分析可區(qū)分病毒混合物中的含量10-50％的突變體。由序列測定得到的數(shù)據(jù)的復(fù)雜性已導(dǎo)致了解釋結(jié)果方面的困難。關(guān)于由特定突變模式所賦予的表型抗性水平，則可能有各不相同的解釋。由于產(chǎn)生新的數(shù)據(jù)，因而有提供不適當(dāng)解釋乃至錯誤解釋的危險[2]。迄今使用的所有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的反應(yīng)機制是干擾病毒蛋白酶或者逆轉(zhuǎn)錄酶的酶促反應(yīng)。根據(jù)酶測定的能力和所用的病毒分離技術(shù)，藥物敏感性測試在理論上可以或者在來自病毒培養(yǎng)繁殖的上清液、原代病毒分離物或者直接從患者中回收的病毒制備物上進行。
與傳統(tǒng)的病毒復(fù)制抑制實驗相比，用來自原代病毒分離物的逆轉(zhuǎn)錄酶的藥物敏感性測試有兩個優(yōu)點。病毒繁殖的時間被縮短，且更重要的是對病毒群體發(fā)生較少的選擇。理想的情況是，最終應(yīng)該表征直接從患者血液中循環(huán)的病毒提取的酶。這種方法的好處是樣品將反映出在采集血液樣品時存在于患者體內(nèi)的病毒群體。這在實踐中迄今還是不可行的，但通過用基于PCR的Amp RT測定進行抗性試驗仔細(xì)研究了所述構(gòu)思[3]。
HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶以及其它逆轉(zhuǎn)錄酶進行三種不同的酶促反應(yīng)依賴RNA的DNA聚合、依賴DNA的DNA聚合以及DNA-RNA雜合體中的RNA的降解(RNA酶H)。由pol基因編碼的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶是由一個p66亞基和一個p51亞基組成的異二聚體?？慷ㄎ挥趐66亞基中的同一活性位點進行依賴RNA的DNA聚合和依賴DNA的DNA聚合。通過除去p66中對應(yīng)于RNA酶H結(jié)構(gòu)域的C末端片段，產(chǎn)生p51[4]。目前已批準(zhǔn)供臨床使用的所有逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑抑制該酶的聚合酶活性。根據(jù)這些藥物對依賴RNA的DNA聚合反應(yīng)的作用，大體上已確定了這些藥物的反應(yīng)機制。依賴DNA的DNA聚合反應(yīng)的作用則研究得比較少。
通過使用一種人工模板-引物構(gòu)建體以及標(biāo)記的作為核苷酸底物的脫氧核苷酸三磷酸，來進行常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定。對于測定HIV以及對于其它逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，模板/引物對聚(rA)/寡聚(dT)是最有效最常用的組合。當(dāng)涉及藥物敏感性測試時，這類測定的一個缺點是僅僅能測定非核苷類似物或者與rA能進行堿基配對的類似物。其它核苷酸堿基的類似物將需要一種基于可變聚合物模板的測定。
迄今所批準(zhǔn)的所有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物或者干擾病毒蛋白酶的酶促反應(yīng)，或者干擾病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的酶促反應(yīng)。另外還有影響逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶功能通道的候選藥物。
所述逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或者是核苷類似物，或者是非核苷類似物。所述非核苷抑制劑與活性部位附近但并不與其相鄰的RT酶中的疏水性口袋結(jié)合。HIV-1復(fù)制由于取代了與聚合酶結(jié)合部位相關(guān)的催化性天冬氨酸殘基而在變構(gòu)水平上受到抑制。如果以單一療法的形式給予非核苷藥物，或在存在不完全病毒抑制的情況下給予非核苷藥物，則抗藥性通常快速地出現(xiàn)。目前僅三種非核苷抑制劑奈韋拉平、依法韋侖和地拉韋啶被FDA批準(zhǔn)用于臨床。
當(dāng)前使用的核苷抑制劑由于它們沒有3’-羥基因而終止DNA鏈的延伸。長期用核苷抑制劑治療則通常導(dǎo)致產(chǎn)生抗性病毒。這個過程與病毒pol基因中不斷出現(xiàn)的突變有關(guān)，每個突變導(dǎo)致已確定氨基酸的取代[5]。這些取代的結(jié)果在酶水平方面是復(fù)雜的，且包括增強原始DNA編輯功能。這個反應(yīng)是核苷酸依賴性的，且產(chǎn)生二核苷多磷酸和一個可延伸的DNA 3’端[6]。
當(dāng)前的HIV療法基于多藥療法。其方案基于所有三類可利用的藥物—核苷類似物、非核苷類似物和蛋白酶抑制劑的組合。策略是將突變病毒存活的概率減至最小。面對病毒學(xué)的不足，當(dāng)前的治療指南則建議轉(zhuǎn)到一組完全新的藥物方面來。這是使人感到灰心的，因為許多HIV陽性者并沒有從所述藥物中選出三種或更多種未經(jīng)試用的藥物。另外，除去事實上仍然有效的藥物，還可能是一個不經(jīng)濟的決定。如果有改進的抗藥性測試，則淘汰給定組合中的一種或多種無效藥或許是可能的。
發(fā)明的描述本發(fā)明提供一種用直接從患者血漿樣品中回收的酶來進行表型抗藥性測試的方法。該方法基于一種回收病毒酶即基本上沒有其細(xì)胞對應(yīng)物的病毒酶、繼之以用靈敏的酶測定對其進行測定的技術(shù)組合。對于包裝到有包膜病毒中的任何酶，可使用所描述的酶分離技術(shù)；但在本說明書中，僅僅為了抗藥性測試而通過利用從血漿得到逆轉(zhuǎn)錄酶來探測該技術(shù)的用途。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種測試藥物在有包膜病毒感染的哺乳動物個體中的表型敏感性的方法，即通過測定從所述個體之生物樣品中回收的一種包裝到有包膜病毒中的酶，來測試藥物的所述表型敏感性的一種方法，所述方法包括下述步驟a)向所述樣品中加入一種酶失活劑，以使存在于有包膜病毒體之外的聚合酶活性失活，b)除去所述酶失活劑、酶活性封閉性抗體、內(nèi)源酶活性抑制劑以及抗病毒藥物，c)裂解所述病毒顆粒以釋放所述酶，d)回收由c)產(chǎn)生的、經(jīng)濃縮的純化病毒酶，并且通過用靈敏的酶測定，根據(jù)所回收的酶來確定所述個體的藥物敏感性分布型。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述哺乳動物個體是人類。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述生物樣品為血液樣品，例如血漿樣品。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述有包膜病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)。在最后提到的情況下，所述酶最好是HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)。
可使用借助本發(fā)明方法得到的個體的藥物敏感性分布型，選擇用于個體的藥物療法。實際上，有包膜病毒感染的哺乳動物個體將在幾個時間點經(jīng)受藥物敏感性分布型的測試，從而監(jiān)控所述個體中該感染的發(fā)展以及病毒藥物治療。
本發(fā)明也涉及一種商業(yè)成套試劑(package)，該商業(yè)成套試劑包括按照本發(fā)明而測試有包膜病毒感染的哺乳動物個體中藥物表型敏感性的書面說明或資料載體說明，以及一種使聚合酶活性失活的酶失活劑、一種靈敏的酶測定和至少一種參照藥物。
現(xiàn)在，通過下面非限制性描述本發(fā)明的實施方案和附圖，舉例說明本發(fā)明。
所引用的文獻的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
附圖簡述

圖1顯示所回收的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶與用RNA PCR測定的病毒RNA之間的關(guān)系。
圖2舉例說明藥物敏感性測定中所用的逆轉(zhuǎn)錄酶量與所得到的IC50值之間的關(guān)系。符號說明(◇)依法韋侖野生型逆轉(zhuǎn)錄酶，(◆)依法韋侖L100I逆轉(zhuǎn)錄酶，(○)AZT-TP野生型逆轉(zhuǎn)錄酶，(●)AZT-TP T215Y逆轉(zhuǎn)錄酶。
實施方案的描述所用的方法包括四個不同的步驟。I)將存在于樣品中的宿主聚合酶活性滅活，而不影響存在于有包膜病毒體中的病毒酶。II)除去所述酶失活劑、酶活性封閉性抗體、內(nèi)源酶活性抑制劑以及抗病毒藥物。III)回收經(jīng)濃縮的純化病毒酶。IV)確定所回收酶的藥物敏感性分布型。
(步驟I-III)基于可溶性細(xì)胞酶破壞后由微型柱分離病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，從含有逆轉(zhuǎn)錄酶封閉性抗體的材料中分離病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的方案。
1)標(biāo)記要使用的4.5ml塑料管。將其置于Nalgene盒中。向每支標(biāo)記管中加入1ml樣品(例如來自HIV感染個體的EDTA血漿)。加入100μl 66mM 5，5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)的緩沖水溶液，渦旋混合，將所述樣品在室溫下溫育1小時。
游離的血漿酶活性在該步驟中遭到破壞，而病毒體內(nèi)所含的酶則仍保持完整。然后可以通過幾個分離步驟，從5，5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)、酶活性封閉性抗體和其它可能干擾病毒RT定量的物質(zhì)中純化所述病毒體。下述方案基于FractogelEMD TMAE Hicap凝膠的應(yīng)用。
2)小心地懸浮分離膠，并轉(zhuǎn)移1500μl凝膠漿至每支樣品預(yù)處理管中。
3)將樣品與凝膠漿在室溫下溫育90分鐘，其中將所述管以水平方向放在定軌搖床上。
4)標(biāo)記所需數(shù)目的10ml塑料微型柱，以識別要分析的樣品。將該柱固定在柱洗滌裝置即Supelco Visiprep固相提取真空歧管上。轉(zhuǎn)移結(jié)合管中的內(nèi)容物至其相應(yīng)的柱中。轉(zhuǎn)移前，將管渦旋一兒會，以使凝膠均勻分布。
5)當(dāng)所有的柱都填滿時，抽真空并將凝膠吸干。關(guān)掉真空，并通過將每個柱裝入9ml緩沖液A開始洗滌。當(dāng)所有的柱已裝滿時，抽真空并將凝膠吸干。
6)重復(fù)步驟5三次以上，總共洗滌4次。每次洗滌后都將凝膠吸干。在第4次洗滌后且將凝膠吸干后，關(guān)掉真空，進行步驟7。
所述洗滌步驟除去系統(tǒng)中未結(jié)合的RT封閉性抗體和5，5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)。
7)向所有干凝膠中加入9ml調(diào)節(jié)緩沖液(B)。1分鐘后，抽真空并將凝膠吸干。
8)重復(fù)步驟7，在關(guān)掉真空之前，檢查是否已從所有凝膠中除去所有調(diào)節(jié)緩沖液(B)。
9)卸下柱洗滌裝置的上層部分。將裝有標(biāo)記管的固定器固定在清潔的容器中。重新裝上該裝置的上層部分?？刂聘髦男」苈淙肫湎鄳?yīng)管中。
10)向每個柱中加入600μl裂解緩沖液(C)。讓所述緩沖液在所述柱中停留5分鐘。然后緩慢抽真空并將凝膠吸干。這將在每支管中得到來自相關(guān)凝膠的約600μl病毒裂解液。
從步驟10的裂解液中回收的RT活性基本上無RT封閉性抗體、藥物和細(xì)胞聚合酶活性，并且可以用靈敏的RT活性測定，即基于Ekstrand等人描述的方法的Cavidi HS-kit Lenti RT[7]進行定量。按照所述方法獲得的25μl裂解液足以測定所述樣品中的RT活性。余下的575μl樣品應(yīng)于-70℃冷凍貯存，以供以后用于藥物敏感性試驗。
請注意對半胱氨酸修飾劑不敏感的RT酶例如野生型HIV 1 RT可以任選地在存在高達5mM 5，5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)的情況下進行測定。另一方面，敏感酶例如MULV RT和來自某些療法的抗HIV1毒株(含有例如突變Y181C)的RT要求向所述裂解緩沖液中加入巰基還原劑即半胱氨酸或半胱胺。
(步驟IV)裂解液中逆轉(zhuǎn)錄酶活性的藥物敏感性的測定方案用改進的比色RT測定(CavidiHS-kit Lenti RT)(可得自CavidiTech，Uppsala，瑞典)，測定RT活性在所研究的病毒制劑中的水平。簡而言之，用與96孔微量滴定板各孔共價結(jié)合的poly(rA)作為模板，以在逆轉(zhuǎn)錄步驟中于33℃摻入5-溴脫氧尿苷5’-三磷酸(BrdUTP)。用堿性磷酸酶(Ap)綴合的抗BrdU單克隆抗體檢測摻入到DNA中的溴脫氧尿苷一磷酸(BrdUMP)量。最后，用Ap底物4-甲基傘形基磷酸酯進行熒光檢測。對于核苷類似物，則使用于IC50測定的分離逆轉(zhuǎn)錄酶的量對相當(dāng)于每孔5fg(4.3×10-20mol)參照HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的活性進行標(biāo)準(zhǔn)化；而對于非核苷類似物，則使用1.7fg(1.5×10-20mol)逆轉(zhuǎn)錄酶。所述裂解液用“模擬裂解液”即由胎牛血清的模擬分離中獲得的裂解液進行稀釋。
用HS Lenti RT測定法的兩種不同的修飾版本進行逆轉(zhuǎn)錄酶抑制研究非核苷類似物用RT反應(yīng)混合物分5個步驟進行連續(xù)稀釋，并將25μl等份樣品轉(zhuǎn)移至微量滴定板的各孔中，與125μl RT反應(yīng)混合物混合，且通過加入25μl裂解物的稀釋液而起始所述酶反應(yīng)。核苷酸底物(BrdUTP)的終濃度為16μM，而引物(odT22)的含量為12ng/孔。dT類似物用鏈終止反應(yīng)混合物分5個步驟進行連續(xù)稀釋，并將25μl等份樣品轉(zhuǎn)移至微量滴定板的各孔中，與125μl RT鏈終止反應(yīng)混合物混合，且通過加入25μl裂解物的稀釋液而起始所述酶反應(yīng)。核苷酸底物(BrdUTP)的終濃度為1.5μM，而引物(odT22)的含量為12ng/孔。不但對于核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，而且對于非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，允許所述逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)進行過夜(16-24小時，于33℃)。其后，通過洗滌該滴定板而終止所述反應(yīng)。將IC50值定義為所研究的逆轉(zhuǎn)錄酶活性達到50％抑制的藥物濃度。
材料分離膠FractogelEMD TMAE或FractogelEMD TMAE Hicap，例如在314mM(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)(MES)pH 5.1、413mM碘化鉀及0.5mg/ml肝素中。
微型柱，例如Biorad Poly-Prep(7311553)。
微型柱洗滌裝置，即Supelco Visiprep固相提取真空歧管。
塑料管，例如Nunc的4.5ml低溫管。
具有固定化prA的微量滴定板即Nalge Nunc NucleoLink。
半胱氨酸修飾劑，例如在用0.87M三羥甲基氨基甲烷(PH 8.3)緩沖的66mM 5，5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)水溶液。
溫和巰基還原劑，例如33mM半胱胺水溶液。
抗病毒藥物3′-疊氮-2′，3′-脫氧胸苷三磷酸(AZT-TP)和(2′，3′-二脫氫-3′-脫氧胸苷三磷酸(d4T-TP)購自加利福尼亞州的Moravek Biochemicals。奈韋拉平(11-環(huán)丙基-5，11-二氫-4-甲基-6H-二吡啶并[3，2-b2’，3’-f][1，4]二氮雜-6-酮)(NVP)、地拉韋啶即1-(5-甲磺酰胺-1H-吲哚-2-基-羰基)-4-[3-(1-甲基乙基-氨基)吡啶基]哌嗪一甲磺酸酯(DLV)以及依法韋侖即(-)6-氯-4-環(huán)丙基乙炔基-4-三氟甲基-1，4-二氫-2H-3，1-苯并噁嗪-2-酮)(EFV)，購自瑞典烏普薩拉(Uppsala)的Apoteksbolaget。
來自HIV感染個體的血漿樣品追溯既往地選擇來自首次處理的患者的血漿樣品或來自用常規(guī)聯(lián)合療法的患者的血漿樣品。以兩個不同組的，冷凍遞送已編號的樣品，所述兩個不同組分別代表對NNRTI具有抗性的患者以及對T-類似物具有抗性的患者。通過標(biāo)準(zhǔn)HIV 1 RNA PCR(Cobas，RocheDiagnostica)，測定每個樣品中HIV-1 RNA的量，而用TRUGENETMHIV-1 Genotyping試劑盒(Visible Genetics)，來分析所存在的病毒基因型。
重組逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶的NNRTI抗性突變體形式(L100I，K103N，L100I/K103N，Y181C)。用由BH10分離物構(gòu)建的pETRT表達載體作為突變的模板。運用市售定點誘變試劑盒QuikChange(Stratagene)，產(chǎn)生突變。所述突變通過DNA序列分析加以證實。如同先前所描述的[8]，分離逆轉(zhuǎn)錄酶的突變形式和天然形式。
通過把突變引入克隆到表達載體pKK233-2(Amersham Biotech)中的野生型HXB2-DEcoRI-Ndel限制性酶片段的逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)中，產(chǎn)生具有AZT特異性突變的重組逆轉(zhuǎn)錄酶。運用市售定點誘變試劑盒QuikChange(Stratagene)，產(chǎn)生突變。將突變型克隆表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XL1-B1ue中，且其基因型通過DNA序列分析加以證實。
所用的緩沖液A)洗滌緩沖液20mM MES pH 5.4，500mM醋酸鉀(KAc)。
B)調(diào)節(jié)緩沖液適合于逆轉(zhuǎn)錄酶測定的緩沖液，例如50mM的(N-(2-羥乙基哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(Hepes)pH 7.6，25mM KAc，20mM氯化鎂(MgCl2)，0.2mM乙二醇-雙(β-氨基乙醚)N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)，2mM精胺以及0.5mg/ml熱滅活牛血清白蛋白(BSA)。
C)裂解緩沖液適合于逆轉(zhuǎn)錄酶測定的緩沖液，該緩沖液包括去污劑例如1.25％的聚氧乙烯4十二烷基醚(Brij 30)、13ng/ml的odT22以及與調(diào)節(jié)緩沖液(B)中一樣的組分。當(dāng)處理用對SH氧化/修飾敏感的逆轉(zhuǎn)錄酶處理病毒時，可任擇地加入巰基還原劑即0.2mM半胱胺。
D)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)混合物例如10mM Hepes pH 7.6，19μMBrdUTP，80ng/ml odT22，4mM MgCl2，0.5g/l硫酸葡聚糖，2mM精胺，0.5％(v/v)Triton-X 100，0.2mM EGTA以及0.5mg/ml BSA。
E)鏈終止反應(yīng)混合物10mM Hepes pH 7.0，BrdUTP 1.75μM，80ng/ml odT22，10mM MgCl2，7mMATP，0.05g/l硫酸葡聚糖，2mM精胺，0.5％(v/v)Triton-X 100，0.2mM EGTA以及0.5mg/ml BSA。
實施例實施例1.所回收的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶與用RNA PCR測定的病毒RNA之間的關(guān)系按照“基于可溶性細(xì)胞酶破壞后由微型柱分離病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，從含有逆轉(zhuǎn)錄酶封閉性抗體的材料中分離病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的方案”，處理1ml來自HIV感染個體的EDTA血漿樣品，且用CavidiHS-kit LentiRT，在一種過夜RT測定中測定從每個樣品中回收的逆轉(zhuǎn)錄酶活性的量。根據(jù)內(nèi)標(biāo)曲線，將所得到的逆轉(zhuǎn)錄酶活性換算成fg HIV 1 RT/ml血漿。通過標(biāo)準(zhǔn)HIV 1 RNA PCR(Roche Amplicor)，測定每個樣品中HIV 1 RNA的量。該圖只限于PCR值＞500拷貝/ml的樣品。在所回收的血漿逆轉(zhuǎn)錄酶量與用PCR測定的HIV RNA量之間發(fā)現(xiàn)了強相關(guān)性(r＝0.93，n＝33，p＜＜0.001)。參見圖1。
根據(jù)該實例可推斷出處理1ml來自每毫升血漿具有50 000個HIV RNA拷貝之個體的血漿，將導(dǎo)致回收大約200fg逆轉(zhuǎn)錄酶活性。每次測定用1.7fg逆轉(zhuǎn)錄酶，該量對應(yīng)于118個試驗，可使用所述試驗測定所分離的逆轉(zhuǎn)錄酶的藥物敏感性分布型。
實施例2.用于藥物敏感性試驗的逆轉(zhuǎn)錄酶量的影響按照“裂解液中逆轉(zhuǎn)錄酶活性的藥物敏感性的測定方案”，用指定逆轉(zhuǎn)錄酶濃度，測定NNRTI、AZT-TP和d4T-TP對指定重組HIV 1逆轉(zhuǎn)錄酶的影響。圖2舉例說明用于藥物敏感性測定中逆轉(zhuǎn)錄酶量與所得出的IC50值之間的關(guān)系。在所研究的范圍內(nèi)，像依法韋侖那樣的NNRTI的IC50值，則根本不受逆轉(zhuǎn)錄酶量變化的影響。在所研究的NRTI中，相對于所述測定中包括的逆轉(zhuǎn)錄酶量，AZT-TP顯示出最大變化。對于野生型逆轉(zhuǎn)錄酶，該變化最大，如果逆轉(zhuǎn)錄酶量從2fg/孔增加至162fg/孔，則所述IC50從0.13μM增加到0.22μM(圖2)。
血漿樣品中可獲得的逆轉(zhuǎn)錄酶活性量決定當(dāng)前測定的限度。需要至少5倍于本底的信號，來獲得所測定藥物的可再現(xiàn)IC50值。如果在試驗中加入逐漸增加的逆轉(zhuǎn)錄酶量的IC50值變化范圍小使得藥物敏感性測定成為可能，而不用將每個測定中所用的逆轉(zhuǎn)錄酶量預(yù)先標(biāo)準(zhǔn)化。
實施例3.非核苷抑制劑對具有已確定突變的重組HIV 1逆轉(zhuǎn)錄酶的影響的比較按照“裂解液中逆轉(zhuǎn)錄酶活性的藥物敏感性的測定方案”，測定三種非核苷抑制劑對所指定重組HIV 1逆轉(zhuǎn)錄酶的影響。將各逆轉(zhuǎn)錄酶的量標(biāo)準(zhǔn)化至相當(dāng)于我們的標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄酶的1.7fg/孔的活性。逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的持續(xù)時間為19小時，并將所獲得的活性換算成占在沒有抑制劑的情況下溫育同一逆轉(zhuǎn)錄酶所獲得到的活性的百分比(％)。
所述表型數(shù)據(jù)摘自文獻(國際抗病毒新聞以及http//stanford.edu/hiv數(shù)據(jù)庫)(表1)。
在來自逆轉(zhuǎn)錄酶抑制測定的IC50值與根據(jù)所述文獻的表型數(shù)據(jù)之間總的來講有強相關(guān)性。鑒別高抗性病毒或中等抗性病毒逆轉(zhuǎn)錄酶總是可能的(表1)。
實施例4.dT類似物對具有已確定突變的重組HIV 1逆轉(zhuǎn)錄酶的影響的比較按照“裂解液中逆轉(zhuǎn)錄酶活性的藥物敏感性的測定方案”，測定AZT-TP與d4T對指定重組HIV 1逆轉(zhuǎn)錄酶的影響。將各逆轉(zhuǎn)錄酶的量標(biāo)準(zhǔn)化至相當(dāng)于與我們的標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄酶的5fg/孔的活性。逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的持續(xù)時間為19小時，并將所獲得的活性換算成占在沒有抑制劑的情況下溫育同一逆轉(zhuǎn)錄酶所獲得到的活性的百分比(％)。
所述表型數(shù)據(jù)摘自文獻(國際抗病毒新聞以及http//stanford.edu/hiv數(shù)據(jù)庫)(表2)。
為測定對T-類似物藥物的敏感性而使用的鏈終止反應(yīng)混合物，應(yīng)該能夠支持能量依賴性磷酸解反應(yīng)?？上в捎诰酆戏磻?yīng)速度的下降以及檢測靈敏度也因此下降，迅速地反映出有效磷酸解反應(yīng)。因此，與NNRTI的相應(yīng)測定相比，該測定需要更高的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。另一個結(jié)果是，在抗性逆轉(zhuǎn)錄酶和敏感逆轉(zhuǎn)錄酶之間的間距小于NNRTI測定中的間距。然而，在來自逆轉(zhuǎn)錄酶抑制測定的IC50值與根據(jù)所述文獻的表型數(shù)據(jù)之間總的來講有強相關(guān)性。鑒別高抗性病毒或中等抗性病毒逆轉(zhuǎn)錄酶則總是可能的(表2)。
實施例5.用從血漿得到的逆轉(zhuǎn)錄酶來測定對NNRTI的敏感性按照“基于可溶性細(xì)胞酶破壞后由微型柱分離病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，從含有逆轉(zhuǎn)錄酶封閉性抗體的材料中分離病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的方案”，處理17位來自瑞典斯德哥爾摩的HIV感染個體的各1ml血漿樣品。這些樣品中的15個樣品含有足夠逆轉(zhuǎn)錄酶，從而允許進行藥物敏感性測試。這些樣品的PCR值為17 000個拷貝/ml或更大些。按照“裂解液中逆轉(zhuǎn)錄酶活性的藥物敏感性的測定方案”，使每種血漿逆轉(zhuǎn)錄酶和兩種對照之酶對一組連續(xù)稀釋的奈韋拉平、地拉韋啶和依法韋侖進行滴定。
使用來自每種逆轉(zhuǎn)錄酶提取物的、相當(dāng)于1.7fg/孔標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄酶HIV-1 RT的活性，我們發(fā)現(xiàn)15個樣品中的7個含有對所有三種NNRTI具有高抗性的逆轉(zhuǎn)錄酶(表3)。在它們的逆轉(zhuǎn)錄酶基因中，全部都有取代即K103N或者在一個病例(樣品656)中有A98G取代和Y181C取代的組合。8個樣品對所有三種NNRTI敏感。所述敏感樣品中的六個在其逆轉(zhuǎn)錄酶基因中沒有相關(guān)突變，而剩余的二個卻或者有V179I突變，或者有V179T/A/I突變；影響對NNRTI的敏感性的這些突變尚不了解。
實施例6.用從血漿得到的逆轉(zhuǎn)錄酶測定對AZT-TP和d4T-TP的敏感性按照“基于可溶性細(xì)胞酶破壞后由微型柱分離病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，從含有逆轉(zhuǎn)錄酶封閉性抗體的材料中分離病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的方案”，處理27位來自瑞典斯德哥爾摩的HIV感染個體的各1ml血漿樣品。這些樣品中僅13個樣品含有足夠逆轉(zhuǎn)錄酶，從而允許進行藥物敏感性測試。這些樣品的PCR值為43 000個拷貝/ml或更大些。按照“裂解液中逆轉(zhuǎn)錄酶活性的藥物敏感性的測定方案”，使每種血漿逆轉(zhuǎn)錄酶和兩種對照之酶對一組連續(xù)稀釋的AZT-TP和d4T-TP進行滴定。參見表4。
使用來自每種逆轉(zhuǎn)錄酶提取物的、相當(dāng)于5fg/孔標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄酶HIV-1 RT的活性和鏈終止反應(yīng)混合物，我們發(fā)現(xiàn)這兩種藥物的IC50值隨著與對NRTI抗性有關(guān)的已知突變的積聚而平行地增大(表4)。正如所料到的，單獨的突變D69N或突變M184V并不導(dǎo)致IC50值增加。樣品656和樣品1320含有既對AZTT-TP、又對d4T-TP顯示出中等IC50值的逆轉(zhuǎn)錄酶，盡管所述逆轉(zhuǎn)錄酶中存在幾個已知影響對NRTI抗性的氨基酸取代。發(fā)現(xiàn)這些分離物也含有Y181C取代或M184V取代，它們這些取代導(dǎo)致對T-類似物藥物重新敏感是已知的。與野生型對照逆轉(zhuǎn)錄酶相比，在當(dāng)前之組中的兩種逆轉(zhuǎn)錄酶顯示出升高至少20倍的IC50值(表4)。這些逆轉(zhuǎn)錄酶中的一種具有表現(xiàn)Q151M復(fù)合體[8]的一組氨基酸(aa)插入，而另一種含有典型的K70R取代且另外還含有L210S取代?？煞謩e用IC50值1μM和0.1μM作為AZT-TP、d4T-TP之值的等級，將所述提取物分為含有9種敏感逆轉(zhuǎn)錄酶和4種抗性逆轉(zhuǎn)錄酶的類型，這和由基因型測定得出的結(jié)果相一致。
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表1.非核苷抑制劑對具有已確定突變的重組HIV 1 RT的影響的比較。
所分析的RT RT測定中指定抑制劑的IC50(μM)相應(yīng)病毒的敏感性*中的修飾 奈韋拉平地拉韋啶依法韋侖奈韋拉平地拉韋啶依法韋侖L100I 32 9.5 ＞4 L I IK103N ＞100 3.0 ＞4 H H HL100I/K103N ＞100 ＞100 ＞4 H H HY181C ＞100 3.0 0.5 H H L野生型BH100.2 0.5 0.04S S S野生型HxB21.7 1.6 0.12S S S*表型數(shù)據(jù)S＝敏感，L＝低水平抗性(抑制劑量增加2-10倍)，I＝中等抗性(增加10-100倍)，H＝高水平抗性(增加＞100倍)。and未測定。
表2.AZT-TP和d4T對具有已確定突變的重組HIV 1 RT的影響的比較。
所分析RT RT測定中AZT-TP RT測定中相應(yīng)病毒的敏感性*中的修飾*的IC50(μM) d4T-TP的IC50(μM)AZT d4TT215Y0.69 0.15 I LM41L/T69S-SS/L210W/R211K/L214F/T215Y4.0 0.49 H H野生型HXB2 0.19 0.050S S野生型BH10 0.16 0.033S SY181C0.15 0.033RS RS*表型數(shù)據(jù)RS＝所述突變引起抗性病毒的再敏感。S＝敏感，L＝低水平抗性，I＝中等抗性，H＝高水平抗性。and未測定。
表3.NNRTI對從患者血漿中回收的HIVRT的影響患者 PCR fgRT/mlIC50NVPIC50EPV IC50DLV 氨基酸的突變編號 值 血漿 (μM) (μM)(μM) 98 101 103 106 108 179 181AL K V V V Y3980 542 000 1056 0.65 0.09 7.51 *1177 73 000 83 0.81 0.17 4.541412 17 000 40 0.80 0.21 3.601784 17 000 69 0.97 0.15 8.22 I1885 465 000 1032 0.97 0.17 8.971572 105 000 1462.16 0.21 9.541424 245 000 3752.92 0.42 8.211639 431 000 71 3.14 0.33 12.7494 18 000 39 ＞100 ＞4 ＞100 SI N622 529 000 400＞100 ＞4 ＞100I N2098 ＞750 000 5533 ＞100 ＞4 ＞100 N H2883 71 000 517＞100 ＞4 ＞100I N3807 764 000 683＞100 ＞4 ＞100I N656 ＞75 0001921 ＞100 ＞4 ＞100 G C1517 353 000 268＞100 ＞4 ＞100 N重組RT對照L100I32 ＞4 9.5 I野生型RT 1.70.12 1.6*序列V179T/A/I中的異質(zhì)性(Hetrogenicity)。
表4.AZT-TP和d4T-TP對從患者血漿回收的HIV RT的影響患者 PCRfgRT AZT-TP d4T-TP 氨基酸的突變編號 值 /ml血漿 IC50(μM)/ IC50(μM)/41 44 67 69 70 210 215 219 75 116 118 151 181 184增加倍數(shù)增加倍數(shù) M E D T K LTKV FVQYM3507*54 000 83 0.13 0,8 0.020 0.6622529 000400 0.23 1,4 0.028 0.8N160363 000350 0.27 1.7 0.043 1.32098 ＞750 000 5533 0.35 2.2 0.048 1.548 189 00030.8 0.47 2.9 0.085 2.6181550 000831 0.50 3.1 0.049 1.5807420 000294 0.50 3.1 0.070 2.7662750 0004567 0.50 3.1 0.065 2.01144 110 00076.7 0.56 3.5 ND# V656*＞75 000 1921 1.25 7.8 0.17 5.2 L D N WY I C1320*43 000 420 1.32 8.3 0.59 19.6WY I V393750 000388 3.2 200.42 12.7 X Y M1030 207 000173 3.2 201.1 33 R S重組RT對照野生型RT 0.16 1.0 0.033 1.0T69S→SSa4.00 250.49 15 L S-SS WY#由于分布型方面的不規(guī)則而未測定。*樣品656中的RT既有L100I取代、又有181C取代，已知這些取代引起再敏感(參見參考文獻10和11)。樣品1320中的RT具有已知引起再敏感的M184V取代(參見參考文獻12)。a這種RT含有一種T69S→SS插入。
a這種RT含有一種T69S→SS插入。
權(quán)利要求
1.一種測試藥物表型敏感性的方法，所述方法通過測試一種從所述個體的生物樣品中回收的、包裝到有包膜病毒中的酶，來測試藥物在有包膜病毒感染的哺乳動物個體中的表型敏感性，所述方法包括下述步驟a)向所述樣品中加入一種酶失活劑，以使存在于有包膜病毒體之外的聚合酶活性失活，b)除去所述酶失活劑、酶活性封閉性抗體、內(nèi)源酶活性抑制劑以及抗病毒藥物，c)裂解所述病毒顆粒以釋放所述酶，d)回收由c)產(chǎn)生的、經(jīng)濃縮的純化病毒酶，并且通過用靈敏的酶測定，根據(jù)所回收的酶來確定所述個體的藥物敏感性分布型。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物個體是人類。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述生物樣品為血液樣品。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述血液樣品為血漿樣品。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述有包膜病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)，而所述酶是HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述個體的藥物敏感性分布型用來選擇所述個體的藥物療法。
8.一種商業(yè)成套試劑，所述商業(yè)成套試劑包括依照權(quán)利要求1-7中任一項用于測試藥物在有包膜病毒感染的哺乳動物個體中的表型敏感性的書面說明或資料載體說明，和一種使聚合酶活性失活的酶滅活劑，一種靈敏的酶測定，和至少一種參照藥物。
全文摘要
描述了一種通過測試一種從所述個體的生物樣品例如血液或血漿中回收的、包裝到有包膜病毒例如HIV中的酶，來測試藥物在有包膜病毒感染的哺乳動物個體中的表型敏感性的方法。所述方法包括下述步驟a)向所述樣品中加入一種酶失活劑，以使存在于有包膜病毒體之外的聚合酶活性失活，b)除去所述酶失活劑、酶活性封閉性抗體、內(nèi)源酶活性抑制劑和抗病毒藥物，c)裂解所述病毒顆粒以釋放所述酶，d)回收由c)產(chǎn)生的、經(jīng)濃縮的純化病毒酶例如HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)，并且通過用靈敏的酶測定，根據(jù)所回收的酶來確定所述個體的藥物敏感性分布型。所述藥物敏感性分布型可以用于選擇藥物療法。包括一種商業(yè)成套試劑。
文檔編號C12QGK1539022SQ02815597
公開日2004年10月20日 申請日期2002年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月14日
發(fā)明者C·凱蘭德爾, A·馬姆斯藤, S·格羅諾維茨, 邵興無, C 凱蘭德爾, 匪固, 夼滴 申請人:卡維迪技術(shù)有限公司