專利名稱：增強細(xì)胞攝取生物分子的配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將生物降解-抗性、均一寡核苷酸結(jié)合物以組織特異方式通過定向配體的、受體介導(dǎo)的、內(nèi)吞途徑傳遞給細(xì)胞。
背景技術(shù)：
肝臟是活體器官且產(chǎn)生許多生物功能。它的一些最重要功能包括去毒和排出其它方式會有毒的物質(zhì)、加工來自消化管道的營養(yǎng)物和藥物以更容易吸收、產(chǎn)生膽汁以協(xié)助消化食物、將食物轉(zhuǎn)變成化學(xué)物用于維持生命的生長和保持。至少已知100種不同類型的肝臟疾病。最重要的肝臟疾病是病毒性肝炎、硬化和癌癥。
當(dāng)前，有五種已知類型的病毒性肝炎甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、丁肝病毒(HDV)和戊肝病毒(HEV)。然而在猖獗研究基礎(chǔ)上，由于肝炎A-E病毒不能說明所有已知的情況，似乎存在其它肝向性(hepatropic)病毒。
HAV和HEV在污染的食物和水中擴散，但不引起慢性肝臟疾病。相反，HBV、HDV和HCV是可引起慢性感染和慢性肝炎的血液攜帶病毒。兩種最重要的肝臟病毒是HBV和HCV。HBV估計每年感染320,000個人(疾病控制中心，數(shù)據(jù)未發(fā)表)，約有1百萬到125萬個患慢性感染的HBV病人(來自第三次全國健康和營養(yǎng)檢驗調(diào)查的血清陽性率數(shù)據(jù)(NHANES III，1996)。世界范圍的評估表明有2億人感染HBV。HDV是缺損性病毒且需要共轉(zhuǎn)染HBV或預(yù)先存在(重復(fù)感染)HBV感染(Smedile等，(1981)，Gastroenterology，81992-997)，它們都引起比單獨HBV感染更嚴(yán)重的癥狀。感染HBV個體中的慢性HDV感染與高肝臟衰竭相連。HCV感染估計影響350萬個攜帶者，每年有150,000個新感染者。HCV感染伴隨著溫和癥狀且直到慢性疾病發(fā)展才被診斷。約80％HCV感染變成慢性并導(dǎo)致肝臟疾病。藥物治療如干擾素治療旨在減少炎癥、癥狀和傳染性，但病毒很少在感染個體中去除。
根據(jù)全國癌癥學(xué)會，在1998年肝細(xì)胞癌(HCC)的新案例在美國導(dǎo)致13,900起死亡。每年全球由于HCC死亡的人從500,000到1百萬。HCC在東南亞分布廣泛，具體是香港?；家腋?、丙肝、丁肝或肝硬化的個體有更大的風(fēng)險發(fā)展出HCC。慢性病毒性肝炎可引起肝硬化、肝細(xì)胞衰竭和HCC。目前，沒有已知有效治療抗HCC。
瘧疾是由一些來自瘧原蟲(Plasmodium)屬的原生動物寄生蟲引起的疾病并通過瘧蚊(Anopheles)屬的雌性蚊子傳播。引起瘧疾的四種瘧原蟲是間日瘧原蟲(P.vivax)、卵形瘧原蟲(P.ovale)、三日瘧原蟲(P.malariae)和惡性瘧原蟲(P.falciparum)。疾病最常發(fā)生在熱帶和亞熱帶如中美洲、南美洲、東南亞、加勒比、南太平洋群島和亞撒哈拉非洲。癥狀在蚊子咬后一周到一個月在任何地方出現(xiàn)，包括高燒、寒顫、出汗、肌肉疼痛、疲勞、貧血以及有時嘔吐和咳嗽。最嚴(yán)重的瘧疾形式特征為發(fā)燒、混亂、脾放大、惡心和貧血，可以是致命的。如果不治療疾病，感染會發(fā)展成肺中流體、肝臟衰竭、腎衰竭、腦膨脹、昏迷和死亡。引起瘧疾的寄生蟲生命周期開始于雌性蚊子叮咬吸收一些配子細(xì)胞的感染個人，配子細(xì)胞在蚊子胃中減數(shù)分裂和成熟。結(jié)果，雄和雌配子融合形成合子，合子在蚊子中移動并在蚊子唾液腺中發(fā)展產(chǎn)生孢子體。這些孢子體感染下一個人類宿主血液，最終到達(dá)宿主肝臟。最后，一些寄生蟲離開肝臟并開始在宿主血細(xì)胞中復(fù)制，導(dǎo)致瘧疾的常見癥狀。
治療病毒和原生動物感染以及癌癥的一種方法是利用反義治療的力量。通過特異寡核苷酸結(jié)合關(guān)鍵mRNA靶序列來選擇性抑制基因表達(dá)是應(yīng)用反義技術(shù)調(diào)節(jié)DNA和蛋白質(zhì)的主要目標(biāo)。通過特異寡核苷酸結(jié)合關(guān)鍵mRNA靶序列來選擇性抑制基因表達(dá)是應(yīng)用反義技術(shù)調(diào)節(jié)遺傳因子如RNA、DNA和蛋白質(zhì)的主要目標(biāo)。用于藥物設(shè)計的反義(反密碼子或反基因)策略是在序列-特異抑制蛋白質(zhì)合成基礎(chǔ)上，這是通過傳遞合成寡脫氧核苷酸(oligo-dN)和它們能結(jié)合及遮蔽靶mRNA或基因組DNA的類似物(Mirabelli等，(1993)，反義研究和應(yīng)用(Antisense Research andApplications)，(Crooke和LeBleu編輯)，CRC出版社，Boca Raton，第7-35頁)。此策略中隱含的是寡脫氧核苷酸穿越細(xì)胞膜的能力，從而能到達(dá)含它們目標(biāo)靶的細(xì)胞區(qū)室且有足夠量用于結(jié)合那些靶。
外源DNA傳遞到胞內(nèi)介質(zhì)是通過偶聯(lián)其吸收到受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用大為提高。Wu和Wu(1987)，J.Biol.Chem.，2624429-4432的開創(chuàng)性工作顯示外源基因(Wu(1987)，同上；Wu(1988)，J.Biol.Chem.，26314621-14624；Wu(1988)，Biochemistry.，27887-892)或寡脫氧核苷酸((1992)，J.Biol.Chem.，26712436-12439)靜電聯(lián)合到連接脫唾液酸血清類粘蛋白的聚-L-賴氨酸，通過直接接觸脫唾液酸糖蛋白來有效和特異地吸收入人肝細(xì)胞癌(Hep G2)細(xì)胞。由于此最初的研究，其它受體介導(dǎo)的DNA傳遞的例子出現(xiàn)在文獻(xiàn)中，包括四-觸角半乳糖新糖肽聚-L-賴氨酸結(jié)合物(Plank等，(1992)，Bioconjugate Chem.，3533-539)；三半乳糖苷化雙吖啶結(jié)合物(Haensler等，(1993)，Bioconjugate Chem.，485-93)；葉酸結(jié)合物(Kamen等，(1988)，J.Biol.Chem.，26313601-13609)；抗體結(jié)合物(Trubetskoy等，(1992)，Bioconjugate Chem.，3323-327)；運鐵蛋白結(jié)合物(Wanger等，(1990)，Proc.Natl.Acad Sci.USA，873410-3414)；和通過二硫鍵連接到反義寡脫氧核苷酸的6-磷酸甘露糖化的蛋白(Bonfils等，(1992)，Nucleic Acids Res.，204621-4629)。近來，三-觸角N-乙酰半乳糖胺新糖肽、YEE(ahGalNAc)3(Lee和Lee(1987)，Glycoconjugate J，4317-328)結(jié)合到人血清-清蛋白并隨后連接到聚-L-賴氨酸，顯示傳遞DNA到Hep G2細(xì)胞(Merwein等，(1994)，Bioconjugate Chem.，5612-620)。
描述了一些產(chǎn)物用于傳遞寡脫氧核苷酸，寡脫氧核苷酸是異源結(jié)合物混合物。例如Bonfils等描述6-磷酸甘露糖化的蛋白和寡核苷酸間結(jié)合物形成，因為蛋白修飾和二硫鍵形成不是化學(xué)區(qū)(regiochemically)控制或位點-特異，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不同分子的異源混合物(Bonfils，同上)。
一些研究描述胞內(nèi)傳遞寡脫氧核苷酸或DNA，它們包含可生物降解的磷酸二酯核苷酸間鍵合。由于磷酸二酯對水解的固有敏感性，含可生物降解磷酸二酯核苷酸間鍵合的有效載荷構(gòu)建物在細(xì)胞內(nèi)可有相對短的半衰期且功效因此降低(Wickstrom(1986)，J.Biochem.Biophys.Meth.1397-102)。例如，在細(xì)胞中幾分鐘后所有磷酸二酯16聚體廣泛降解(Shaw等，(1991)，Nucleic Acids Research.19747-750)。此寡脫氧核苷酸和DNA的劣勢在反義領(lǐng)域中充分意識到。
Merwin等描述了用新糖肽YEE(ahGalNAc)3合成結(jié)合物。它們的傳遞系統(tǒng)不同且包含使DNA靜電結(jié)合到結(jié)合物的聚-L-賴氨酸。此傳遞策略的劣勢是它的結(jié)構(gòu)異源性；由于其聚陽離子電荷的潛在毒性；由于需要根據(jù)經(jīng)驗確定陽離子載體與寡脫氧核苷酸或DNA比例帶來的制成困難。
使用反義寡核苷酸和它們的類似物作為治療劑由于缺乏特異傳遞和導(dǎo)致低胞內(nèi)濃度的有限細(xì)胞吸收而變得復(fù)雜(Loke等，(1989)，Proc.Natl.Acad Sci.USA，863474-3478；Levis等，(1995)，Antisense Res. & Dev.，5251-259。提高這些分子的細(xì)胞吸收通過偶聯(lián)它們的傳遞和受體調(diào)節(jié)內(nèi)吞作用來獲得，用多種結(jié)構(gòu)異源的復(fù)合體(Plank等，(1992)，Bioconj.Chem.，3533-539；Kamen等，(1988)，J.Biol.Chem.，26313602-13609；Wagner等，(1990)，Proc.Natl.Acad Sci.USA，873410-3414)。一些這種復(fù)合體顯示通過肝脫唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)以提高的速度體外特異傳遞小分子到肝臟細(xì)胞(Wu和Wu(1997)，J.Biol.Chem.，2624429-4432；Findeis等，(1994)，Mtds.Enzymol.，247341-351。這些復(fù)合體包括那些用三觸角、N-乙酰半乳糖胺新糖肽、YEE(ahGalNAc)3制成的，表現(xiàn)出對哺乳動物ASGP-R的高親和性(Lee和Lee，(1987)，Glycoconj.J.，4317-328；Merwin等，(1994)，Bioconj.Chem.，5612-620。我們前面證明通過結(jié)構(gòu)確定和異雙功能接頭使甲基膦酸酯共價結(jié)合此新糖肽導(dǎo)致肝細(xì)胞瘤細(xì)胞體外細(xì)胞吸收提高和特異(Hangeland等，(1995)，Bioconj.Chem.，6695-701，以及體內(nèi)特異傳遞給小鼠肝臟(Hangeland等，(1997)，Antisense & Nuc.Acid DrugDev.，7141-149。
廣泛研究了許多作為反義、非離子的寡核苷酸甲基膦酸酯(oligo-MPs)應(yīng)用的寡脫氧核苷酸類似物(Ts’o等，(1992)，Ann.NY Acad.Sci.，600159-177)。寡核苷酸甲基膦酸酯完全抗核酸酶降解(Miller等，(1981)，Biochemistry.，201874-1880)且是有效的反義劑，證明體外有活性抗單純皰疹病毒1型(Smith等，(1986)，Proc.Natl.AcadSci.USA，832787-2791)、水泡性口炎病毒(Agris等，(1986)，Biochemistry，256268-6275)和人免疫缺陷病毒(Sarin等，(1988)，Proc.Natl.Acad Sci.USA，857448-7451)，能抑制表達(dá)ras p21(Brown等，(1989)，Oncogene Res.，4243-252)。然而對于表現(xiàn)出反義活性的寡核苷酸甲基膦酸酯，它們必須以至100μM的濃度存在于細(xì)胞外介質(zhì)(Brown，同上；Sarin，同上；Ts’o，同上；Agris，同上)。達(dá)到和維持這些濃度用于治療目的有一些困難，包括花費、由于非特異結(jié)合寡核苷酸甲基膦酸酯和免疫原性產(chǎn)生的潛在副作用。這些困難可通過增加運輸寡核苷酸甲基膦酸酯穿過靶細(xì)胞類型的膜來克服，從而獲得局部高濃度的寡核苷酸甲基膦酸酯，可通過僅特異傳遞給靶細(xì)胞類型來克服，從而防止對其它組織的毒性副作用。這些策略都用于大量降低產(chǎn)生反義效果和防止組織特異毒性副作用所需的寡核苷酸甲基膦酸酯。
本發(fā)明通過傳遞均一和非生物降解的A-L-P構(gòu)建物來克服這些不足，它們用于胞內(nèi)傳遞有效治療給靶細(xì)胞以提高有效和/或非毒性效果。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是設(shè)計和合成含肝配體的均一A-L-P構(gòu)建物以引導(dǎo)寡聚物或“有效載荷”通過受體介導(dǎo)的、定向配體的途徑胞內(nèi)到達(dá)肝細(xì)胞。
發(fā)明的另一個目的是通過A-L-P構(gòu)建物傳遞定向肝臟病原體的穩(wěn)定有效載荷或寡聚物給肝細(xì)胞。肝臟病原體可以是病毒、寄生蟲或癌。
發(fā)明的又一個目的是提供結(jié)構(gòu)確定和化學(xué)統(tǒng)一的傳遞集合體，由配體-接頭-前體藥物構(gòu)建物組成，通過定向配體的、受體介導(dǎo)的的內(nèi)吞途徑定向于肝細(xì)胞。
發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供均一構(gòu)建物給細(xì)胞內(nèi)分子靶，包括傳遞含生物非降解“P”或水解酶抗性前體藥物的A-L-P構(gòu)建物，其中所述前體藥物含可有效穿越肝細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的寡脫氧核苷酸和/或寡脫氧核苷酸類似物。
發(fā)明的另外目的是傳遞有效載荷的DNA和RNA類型分類，如有效載荷含DNA的甲基膦酸酯、磷酸二酯和硫代磷酸酯聯(lián)接以及RNA的甲基膦酸酯-2’-O-甲基核糖、磷酸二酯-2’-O-甲基核糖和硫代磷酸酯-2’-O-甲基核糖部分。
發(fā)明的另一目的涉及胞內(nèi)傳遞有效載荷給靶細(xì)胞，可包含不同程度生物降解核苷酸間鍵合組合進(jìn)入細(xì)胞靶，如聯(lián)接包括用于DNA的甲基膦酸酯/磷酸二酯(mp/po)聯(lián)接、磷酸二酯/硫代磷酸酯(po/ps)聯(lián)接和甲基膦酸酯/硫代磷酸酯(mp/ps)聯(lián)接；用于RNA的甲基膦酸酯/磷酸二酯-2’-O-甲基核糖(mp/po-OMe)聯(lián)接、磷酸二酯/硫代磷酸酯-2’-O-甲基核糖(po/ps-OMe)聯(lián)接和甲基膦酸酯/硫代磷酸酯-2’-O-甲基核糖(mp/ps-OMe)聯(lián)接。發(fā)明的優(yōu)選目的是將含酶抗性硫代磷酸酯核苷酸間鍵合的寡脫氧核苷硫代磷酸酯(phosphothioroate)結(jié)合物傳遞給肝細(xì)胞。發(fā)明的又一優(yōu)選目的是將含非生物降解甲基膦酸酯核苷酸間鍵合的寡脫氧核苷甲基膦酸酯結(jié)合物傳遞給肝細(xì)胞。將生物穩(wěn)定寡聚物如非離子寡脫氧核苷和寡脫氧核苷類似物胞內(nèi)傳遞給含肝病毒和/或癌的肝細(xì)胞是一種治療肝臟病原體的方法。具體是，發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)是提供寡脫氧核苷嵌合體的合成結(jié)合物，嵌合體含所有2’-O-甲基核糖核苷和甲基膦酸酯與磷酸二酯或其它生物穩(wěn)定寡聚物間交替的核苷酸間鍵合。這些生物穩(wěn)定寡聚物包括但不限于寡脫氧核苷酸類似物，包含所有2’-脫氧核糖核苷和硫代磷酸酯與甲基膦酸酯間交替的核苷酸間鍵合；所有2’-脫氧核糖核苷和硫代磷酸酯核苷酸間鍵合；所有2’-O-甲基核糖和硫代磷酸酯核苷酸間鍵合。
發(fā)明的又一目的涉及合成A-L-P結(jié)合物的方法。一種合成結(jié)合物的具體方法，結(jié)合物包括三-成分結(jié)合方法1用于合成A-L-P結(jié)合物，其中a)2’-O-Me-核苷磷酸二酯鍵被摻入寡核苷酸或寡核苷酸類似物的5’-末端；b)用PNK和ATP，通過酶的作用將寡核苷酸或寡核苷酸類似物的5’-末端磷酸化；c)修飾寡核苷酸或寡核苷酸類似物的5’-磷酸基團以引入二硫鍵形成5’-二硫鍵-修飾的寡核苷酸或寡核苷酸類似物；d)將5’-二硫鍵-修飾的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的5’-二硫基還原成硫醇基團以形成硫醇-修飾的寡核苷酸；e)將異雙功能接頭的一個反應(yīng)基團共價結(jié)合到配體上，并將異雙功能接頭的第二個基團共價結(jié)合到所述硫醇-修飾的寡核苷酸或寡核苷酸類似物，以形成A-L-P結(jié)合物。
另一種方法涉及合成結(jié)合物，包括結(jié)合方法2用于合成A-L-P結(jié)合物，其中a)用雙功能接頭修飾的配體以形成A-L構(gòu)建物；b)將所述A-L構(gòu)建物純化到大于95％的均一性并去除未反應(yīng)的接頭；c)修飾寡核苷酸或寡核苷酸類似物以形成硫醇-修飾的寡聚物；d)所述硫醇-修飾的寡聚物在脫氣條件下純化；e)在兩種-成分結(jié)合反應(yīng)時用純化A-L構(gòu)建物和純化硫醇-寡聚物的結(jié)合反應(yīng)在脫氣條件下進(jìn)行以去除未反應(yīng)試劑和其它低分子量的硫醇-包含雜質(zhì)；其中所述結(jié)合可用過量所述配體支架或所述硫醇-修飾寡聚物形成純化的A-L-P結(jié)合物；f)純化A-L-P結(jié)合物，例如通過層析或電泳。
又一種方法涉及放射性同位素標(biāo)記寡核苷酸-包含結(jié)合物，包括放射性同位素標(biāo)記A-L-P結(jié)合物，其中a)在固相合成中將三核苷示蹤物單元5’-T-3’-ps-3’-T-ps-T-5’加入寡核苷酸或寡核苷酸類似物的3’末端；b)采用多核苷酸激酶(PNK)和含放射性標(biāo)記的磷酸的2-氨基巰基乙醇(ATP)，通過酶的作用將示蹤物單元磷酸化以將放射性標(biāo)記的磷酸摻入A-L-P結(jié)合物；c)化學(xué)修飾現(xiàn)在存在于帶有氨基的A-L-P結(jié)合物中的放射性磷酸以防止它被細(xì)胞酶降解。
另外一種方法涉及合成寡核苷酸-包含結(jié)合物，其中a)在固相合成中將帶有末端二硫化物部分的雙功能接頭L加入寡核苷酸或寡核苷酸類似物以形成二硫化物修飾的寡聚物；b)純化二硫化物修飾的寡聚物；c)將二硫化物修飾寡聚物的二硫化物部分還原成硫醇基團以形成硫醇-修飾的寡聚物；d)在脫氣條件下純化硫醇-修飾的寡聚物；e)在脫氣條件下使配體A與純化的硫醇-寡聚物反應(yīng)以形成A-L-P結(jié)合物；f)純化A-L-P結(jié)合物，例如通過層析。
另一種方法涉及合成放射性同位素標(biāo)記結(jié)合物，包括含寡核苷酸或寡核苷酸類似物的放射性同位素標(biāo)記A-L-P結(jié)合物，其中
a)用固相合成法將二硫化物-末端接頭加入寡核苷酸類似物的5’-末端并將三核苷酸示蹤物單元5’-T-3’-ps-3’-T-ps-T-5’加入寡核苷酸類似物的3’末端；b)純化二硫化物-和包含示蹤物的寡聚物；c)將二硫化物功能基團還原成硫醇基團以形成硫醇-修飾的P；d)例如用大小排阻色譜法在脫氣條件下純化硫醇-修飾的P以去除未反應(yīng)試劑和雜質(zhì)；e)在脫氣條件下將A-L構(gòu)建物結(jié)合到純化的硫醇-修飾的P上以形成A-L-P結(jié)合物；f)用PNK和含放射性標(biāo)記磷酸的ATP，通過酶的作用將示蹤物單元磷酸化以將放射性標(biāo)記的磷酸摻入A-L-P結(jié)合物；g)用胺化學(xué)修飾ATP結(jié)合物的放射性磷酸基團以防止它被細(xì)胞酶降解。
附圖簡述

圖1顯示用于化學(xué)統(tǒng)一結(jié)合物的附著基團。n的值在0和10之間，包含(化合物1-4)。
圖2顯示新糖肽YEE(ahGalNAe)3(5)(圖2a)；寡核苷酸甲基膦酸酯UmpT7(6)和有UmpT7帽的5’-乙二胺(6b)結(jié)構(gòu)(圖2b)；示蹤物、3’結(jié)合物(圖2c)的結(jié)構(gòu)；用5’-修飾物自動合成的反應(yīng)過程(圖2d)；用于合成1c的反應(yīng)過程(圖2e)。
圖3描述用于合成[YEE(ahGalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7(10)的反應(yīng)過程。
圖4顯示合成結(jié)合物10中的中間物的PAGE分析(15％聚丙烯酰胺，4V/cm，2h)。第1道，[5’-32P]-標(biāo)記的6(A帶)。第2道，[5’-32P]-胱胺加合物(B帶)和相應(yīng)胸苷-EDAC加合物(C帶)。第3道，[5’-32P]-醇5(D帶)和相應(yīng)胸苷-EDAC加合物(E帶)。第4道，[5’-32P]-結(jié)合物10(F帶)和相應(yīng)胸苷-EDAC加合物(G帶)。
圖5描述[35S]3’-末端標(biāo)記乙肝病毒(HBV)新糖結(jié)合物(neoglycoconjugate)的結(jié)構(gòu)。
圖6顯示的時程用于Hep G2細(xì)胞單獨(開口圓)和存在100個游離5同等物(閉合圓)時吸收1μM結(jié)合物10，以及單獨(開口三角形)和存在10個游離5同等物(閉合三角形)時吸收寡核苷酸甲基膦酸酯11。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)0、1和2小時且樣品如實驗部分所述收集。各數(shù)據(jù)點代表三次試驗±1個標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。
圖7顯示用于Hep G2細(xì)胞吸收結(jié)合物的24小時時程。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)且樣品如實驗部分所述收集。各數(shù)據(jù)點代表三次實驗±1個標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。
圖8顯示Hep G2、HL-60和HT 1080細(xì)胞組織特異吸收結(jié)合物10。收集細(xì)胞且在3和24小時確定各細(xì)胞系的[32P]量。實驗做三次且數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±1個標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖9顯示Hep G2細(xì)胞吸收含核酸酶抗性主鏈10的新糖結(jié)合物。
圖10顯示Hep G2 2.2.15細(xì)胞吸收含核酸酶抗性主鏈10的新糖結(jié)合物。
圖11顯示結(jié)合物10的組織分布，它通過用N-乙酰-葡糖酰胺酶去除結(jié)合物10的末端GalNAc殘基來產(chǎn)生-每克組織起始劑量百分比對結(jié)合物10注射后時間。
圖12顯示結(jié)合物12的組織分布，它通過用N-乙酰-葡糖酰胺酶去除結(jié)合物10的末端GalNAc殘基來產(chǎn)生。每克組織起始劑量百分比對結(jié)合物12注射后時間。
圖13(a)顯示小鼠中S35標(biāo)記的反義硫代磷酸酯-包含新糖結(jié)合物的組織分布；(b)顯示小鼠中末端galNAc殘基去除的S35標(biāo)記反義硫代磷酸酯-包含新糖結(jié)合物的組織分布。值報導(dǎo)為三次試驗±1個SD的平均值。假定血液是約7％體重且肌肉是40％。
圖14顯示Hep G2細(xì)胞中10的代謝物的放射自顯影分析。道1，1；道2，1用N-乙酰-葡糖酰胺酶處理；道3，1用胰凝乳蛋白酶處理；道4-8，用1分別培養(yǎng)2、4、8、16和24小時后的Hep G2細(xì)胞提取物。
圖15顯示小鼠肝臟中10的代謝物的放射自顯影分析。道1，1；道2，1用N-乙酰-葡糖酰胺酶處理；道3，1用胰凝乳蛋白酶處理；道4用0.1N HCl處理；道5-9，注射后2小時、1小時和15分鐘的肝臟勻漿提取物。注意道5和6以及道7和8是重復(fù)。
圖16顯示10的結(jié)構(gòu)。結(jié)合物用位于寡核苷酸甲基膦酸酯部分5’-OH的放射性磷酸鹽合成。箭頭標(biāo)志32P標(biāo)記位置。10的結(jié)構(gòu)用縮寫形式。結(jié)構(gòu)11和12-15是通過PAGE分析鑒定代謝物的建議結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)12-15分別用N-乙酰-葡糖酰胺酶、胰凝乳蛋白酶或0.1N HCl處理10獲得。
圖17顯示小鼠尿中10的代謝物的放射自顯影分析。道1，1；道2，1用N-乙酰-葡糖酰胺酶處理；道3，1用胰凝乳蛋白酶處理；道4用0.1N HCl處理；道5-8，注射后2小時、1小時和15分鐘的尿提取物。注意道5和6是重復(fù)。
圖18顯示Hep G2 2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中抗HBV新糖結(jié)合物對HBsAG積聚的效果A.抗S；B.抗C；C.抗E；實心柱＝未處理對照；斑點柱(stippled bar)＝新糖結(jié)合物；交叉線柱＝未結(jié)合寡聚物。
圖19顯示Hep G2 2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中抗HBV新糖結(jié)合物對HBV病毒粒子DNA積聚的效果A＝抗S；B＝抗C；C＝抗E；實心柱＝未處理對照；斑點柱＝新糖結(jié)合物；交叉線柱＝未結(jié)合寡聚物。
圖20顯示Hep G2 2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中隨機新糖結(jié)合物和寡聚物對HBsAG和HBV病毒粒子DNA積聚的效果。A＝NG-4對HBs AG積聚的效果；B＝NG-5和相應(yīng)寡聚物對HBs AG積聚的效果；C＝NG-4和相應(yīng)寡聚物對HBV病毒粒子DNA積聚的效果；D＝NG-5相應(yīng)寡聚物對HBV病毒粒子DNA積聚的效果；實心柱＝未處理對照；斑點柱＝新糖結(jié)合物；交叉線柱＝未結(jié)合寡聚物。
為了方便，使用下列縮寫AET，2-氨基巰基乙醇(氨基硫代乙醇)；ATP，三磷酸腺苷；BAP，細(xì)菌堿性磷酸酶；CPG，受控孔隙玻璃支持物；DIPEA，二異丙基乙胺；D-MEM，Dulbecco氏修飾Eagle培養(yǎng)基；DMSO，二甲基亞砜；D-PBS，Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水；DTT，二硫蘇糖醇；EDAC，1-乙基-3-[3(二甲氨基)丙基]碳二亞胺；EDTA，乙二胺四乙酸；FCS，胎牛血清；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺；MEM，有Earle鹽的極限必須培養(yǎng)基；SMCC，N-羥基琥珀酰亞胺4(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)己基-1羧酸鹽；Tris，tris(羥甲基)胺；PNK，苯基核苷激酶。
發(fā)明詳述發(fā)明針對設(shè)計和合成名為配體-接頭-前體藥物構(gòu)建物或“A-L-P”構(gòu)建物的均一分子構(gòu)建物，其中“A”代表特異結(jié)合細(xì)胞受體的配體；“P”代表“有效載荷”；“L”是通過其鍵合連接配體和前體藥物的確定分子橋，其中“A”和“P”共價附著于接頭；進(jìn)一步，A-L-P構(gòu)建物通過受體介導(dǎo)的、定向配體的、內(nèi)吞途徑傳遞“有效載荷”給具體細(xì)胞靶如肝細(xì)胞。
在一個較佳實施方案中，A-L-P構(gòu)建物作為傳遞系統(tǒng)，包括結(jié)構(gòu)式A-L-P的均一結(jié)合物，其中“A”代表特異結(jié)合肝受體的肝配體，從而促進(jìn)結(jié)合物進(jìn)入有此受體的細(xì)胞；“L”代表雙功能接頭，它以區(qū)域特異方式共價連接A形成A-L；A-L以區(qū)域特異方式共價連接P形成A-L-P；“P”代表生物穩(wěn)定寡聚物如寡核苷酸或寡核苷酸衍生物，其中P在水解或還原特定生化鍵后從結(jié)合物中釋放且從結(jié)合物中釋放時包含抗酶水解或生物降解的核苷酸間鍵合。
配體和接頭以及接頭和前體藥物間的鍵是共價的，通過交聯(lián)劑形成，能形成配體和前體藥物的共價鍵。有多種能與配體和前體藥物上存在的不同功能基團反應(yīng)的交聯(lián)劑，因此，可構(gòu)建物許多化學(xué)上不同的鍵。例如，配體YEE(ahGalNAc)3(圖1，1)在其氨基末端包含游離氨基。它會與異生物功能交聯(lián)劑SMCC(表4；入口3)區(qū)特異地反應(yīng)以形成酰胺鍵。如果化學(xué)修飾前體藥物以包含自由巰基(？sulhydryl)基團(表2；例如見入口9-14)，前體藥物與SMCC化學(xué)結(jié)合形成硫醚鍵。在此例子中，配體和前體藥物間形成的鍵可概括為酰胺/硫醚。顯然可通過以所有可能的組合結(jié)合配體、交聯(lián)劑和前體藥物形成數(shù)百種結(jié)構(gòu)(圖1；闡述于表1-4)。因此其它鍵包括但不限于酰胺/酰胺、硫醚/酰胺、二硫化物/酰胺、酰胺/硫醚、酰胺/二硫。鍵可進(jìn)一步分類為生物穩(wěn)定(硫醚，胺)、有點生物穩(wěn)定(酰胺)和生物不穩(wěn)定(二硫)。因此，可結(jié)構(gòu)修飾傳遞系統(tǒng)以在胞外和胞內(nèi)介質(zhì)中面臨的不同化學(xué)環(huán)境中發(fā)揮功能。用于傳遞系統(tǒng)的配體包括但不限于圖1所示的。如本文所用，術(shù)語“附著基團”指這些和其它適當(dāng)配體。配體由合成、化學(xué)確定、結(jié)構(gòu)均一的寡肽支架組成，支架用任意一些糖殘基來糖基化，糖殘基包括但不限于葡萄糖；N-乙酰葡糖胺；半乳糖；N-乙酰半乳糖胺；甘露糖；和海藻糖。
如本文所用，術(shù)語“新糖肽”指這些和類似結(jié)構(gòu)。此外，這些寡肽提供框架用葉酸構(gòu)建物多價配體。
如本文所用，術(shù)語“前體藥物”指一種化合物，在水解或生物降解具體化學(xué)鍵時從結(jié)合物中釋放以活化或活性高于包含作為部分結(jié)合物的時候。
如本文所用，術(shù)語“化學(xué)統(tǒng)一”指至少95％的傳遞聚集體在組成和連通性中是單個種類，99％最優(yōu)選。確定化學(xué)統(tǒng)一性是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳、反相高壓力液相層析、核磁共振、質(zhì)譜和化學(xué)分析。短語“化學(xué)確定和結(jié)構(gòu)均一”與“化學(xué)統(tǒng)一”交換使用。
如本文所用，術(shù)語“有效”指例如，如果結(jié)合物存在于胞外介質(zhì)，接著37℃培養(yǎng)24小時，胞內(nèi)濃度至少約3倍于胞外濃度，約10倍優(yōu)選。

發(fā)明內(nèi)容
中所用術(shù)語“寡聚物”包括寡核苷酸、寡核苷酸類似物或寡核苷酸，或也稱為“有效載荷”或者進(jìn)入細(xì)胞時它也包括前體藥物轉(zhuǎn)變成藥物。術(shù)語“寡核苷酸類似物”指有至少一個非天然產(chǎn)生區(qū)域的部分，功能類似或高于天然產(chǎn)生寡核苷酸。寡核苷酸類似物可改變糖部分或糖間鍵合。有至少一個非磷酸二酯鍵如改變糖間鍵合的寡核苷酸可另外稱為“寡核苷酸”。這些寡核苷酸指由連接基團連接的核苷單位集合，連接基團除了天然產(chǎn)生的磷酸二酯連接基團。寡核苷酸類似物包括的類似物含至少一個“非磷酸二酯核苷酸間鍵合”，即除了一個核苷5’末端和另一個核苷3’末端間磷酸二酯的鍵，其中5’核苷磷酸由任何數(shù)量的化學(xué)基團替換。優(yōu)選的是，A-L-P構(gòu)建物的寡聚物針對肝病原體，其中這種病原體包括任何引起疾病的微生物或過程，如病毒、寄生蟲和癌。更優(yōu)選的是，病毒可包括肝炎病毒，如甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、丁肝病毒(HDV)和戊肝病毒(HEV)。具體是，直接靶向病毒表面抗原、核心抗原、開放閱讀框的序列和包殼序列是本發(fā)明的目標(biāo)。例如，乙肝病毒包括乙肝表面抗原、S-基因、核心抗原、C-基因、前S1開放閱讀框和病毒包殼信號/序列。此外，寄生蟲可包括瘧原蟲。
不同鍵-主鏈如甲基膦酸酯(mp)(所有非離子)、交互甲基膦酸酯/磷酸二酯(mp/po)(一半帶電)和硫代磷酸酯(ps)(完全帶電)，有不同特征包括括號中所示的不同電荷。其它有另外核酸酶抗性主鏈的寡核苷酸包括硫代磷酸酯(ps)和含2’O甲基核糖部分與交替磷酸二酯/甲基膦酸酯(po/mp)鍵的寡聚物。優(yōu)選合成鍵包括烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、亞磷酰胺(phosphoroamidite)、磷酸酯、氨基甲酸鹽、碳酸鹽、磷酸三酯、乙酰胺(acetamidate)和羧甲基酯。任何這些鍵也可用不同化學(xué)基團取代，如氨基烷基磷酸鹽。在發(fā)明的一個較佳實施方案中，所有寡核苷酸的核苷通過硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯酯鍵連接。使用已知方法制備這些鍵(Meth.Mol.Biol.，第20卷(Agrawal編輯)，Humana出版社，新澤西州；Uhlmann，同上)寡核苷酸指一些核苷殘基的聚合體。具體是如本文所用，術(shù)語“寡核苷酸”有本領(lǐng)域平常所用的意義，如至50個核苷的線性序列(“50聚體”)或更優(yōu)選15-30個核苷的序列，最優(yōu)選約20個核苷(“20聚體”)。發(fā)明所用寡核苷酸通常但不總是反義寡核苷酸，寡核苷酸有與靶細(xì)胞中具體細(xì)胞或外源DNA或RNA互補的序列。這些分子也包括指具催化活性RNA分子的核酶，包括但不限于在RNA分子中具體磷酸二酯鍵切開的能力，它們與這些RNA分子雜合如mRNAs、RNA-包含底物和核酶。一般，如果“P”是反義寡核苷酸，優(yōu)選分子量是約5,000到10,000道爾頓；最優(yōu)選分子量是約5,000到7,5000道爾頓。反義RNA指結(jié)合互補mRNA分子的RNA分子，形成抑制mRNA翻譯的雙鏈區(qū)域。一般在此具體情況中，本發(fā)明接頭的分子量小于或相當(dāng)于“P”反義的分子量。
優(yōu)選的是，本發(fā)明寡聚物包括非生物降解的鍵，更具體的是包括完全或部分抗性的任意核酸酶-抗性主鏈。這些寡聚物的例子包括含內(nèi)部磷酸二酯和末端甲基磷酸二酯鍵的嵌合寡核苷酸(Giles等，(1992)，Anticancer Drug Des，737-48)，如甲基磷酸二酯/磷酸二酯嵌合反義寡脫氧核苷酸、糖修飾寡核苷酸或碳水化合物修飾寡核苷酸(Perbost等，(1989)，Biochem.Biophys.Res.Commun，165742-747)和反義磷酸鹽-甲基化寡脫氧核苷酸(Moody等，(1989)，Nucleic Acids Res.，174769-4782)。
如本文所用，術(shù)語“基因特異”指寡核苷酸、寡核苷酸或類似物，序列與結(jié)合物靶向組織或細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)的基因部分或mRNA分子部分互補?；蛱禺惽绑w藥物和靶mRNA間形成序列-特異雙鏈導(dǎo)致mRNA表達(dá)的抑制。用于傳遞系統(tǒng)的配體包括但不限于那些示于圖1的。因此，用適當(dāng)附著基團和寡核苷酸序列可設(shè)計結(jié)合物為有效藥物化合物用于治療肝臟疾病和混亂如肝炎，具體是乙肝和肝癌。此外，如本文所用，術(shù)語“基因特異”指前體藥物是寡核苷酸或寡核苷酸(具體是寡脫氧核苷甲基膦酸酯或其類似物)，序列與結(jié)合物靶向組織或細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)的基因部分或mRNA分子部分互補?；蛱禺惽绑w藥物和靶mRNA間形成序列-特異雙鏈導(dǎo)致mRNA表達(dá)的抑制。
為評估此提高、細(xì)胞特異傳遞的生物效果，整合乙肝病毒(HBV)基因組在一系列體外實驗中由肝臟特異新糖結(jié)合物靶向。HBV是引起急性和慢性肝炎以及肝細(xì)胞癌主要原因的小包膜hepadavirus(Tiollais等，(1985)，Nature.，317489-495)。此病毒范圍廣泛，全球感染超過2億人。HBV復(fù)制的分子生物特征已很好地確定且建立了肝細(xì)胞瘤細(xì)胞加工脫唾液酸糖蛋白受體并用HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(Hep G2 2.2.15)的體外模型系統(tǒng)(參見Sells等，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.，841005-1009；Korba和Milman，(1992)，Antiviral Res.，1955-70)。在確定培養(yǎng)條件下，這些細(xì)胞分泌丹氏粒到細(xì)胞培養(yǎng)基中。顯示這些粒子包括表達(dá)乙肝表面抗原(HBsAG)和病毒DNA核心(病毒粒子DNA)的蛋白質(zhì)外殼，HBsAG和病毒粒子DNA都可在體外容易地分析。證明這些HBV成分的相應(yīng)mRNA可通過硫代磷酸酯反義寡聚物(ps-寡聚物)進(jìn)行修飾(Korba和Gerin，(1995)，Antiviral Res.，28225-242)；Goodarzi等，(1990)，J. Gen.Virology，713021-3025)；Offensperger等，(1995)，Intervirology，38113-119)。最近，證明體外ps-寡聚物非共價結(jié)合用于脫唾液酸糖蛋白受體的DNA載體系統(tǒng)可在轉(zhuǎn)染肝臟細(xì)胞中提高HBV復(fù)制的抑制(Wu和Wu(1992)，J.Biol.Chem.，26712436-12439)；Madon和Blum，(1996)，Hepatology.，24474-481；Yao等，(1996)，Acta.Virologica.，4035-39)。
定向抗整合HBV的反義寡聚物的細(xì)胞吸收和生物功效通過它們經(jīng)結(jié)構(gòu)確定和均一接頭系統(tǒng)結(jié)合到肝臟特異新糖結(jié)合物而顯著增加。在此例子中，新糖結(jié)合物定義為肝臟-特異配體YEE(ahGalNAc)3和所需反義寡核苷酸組成的結(jié)合物，它們由穩(wěn)定的硫醚橋共價連接一起以產(chǎn)生確定和均一的結(jié)構(gòu)。反義RNA指結(jié)合互補mRNA分子的RNA分子，形成雙鏈區(qū)域抑制mRNA翻譯。結(jié)合接頭-修飾配體和前體藥物產(chǎn)生均一、結(jié)構(gòu)確定的結(jié)合物。具體是，接頭-配體整體如SMCC-修飾YEE(ahGalNAc)3共價連接到寡核苷酸以產(chǎn)生均一、結(jié)構(gòu)確定的新糖結(jié)合物。具體來說，以碳水化合物為基礎(chǔ)的肝臟配體YEE(ahGalNAc)3通過異雙功能接頭共價附著于寡核苷酸甲基膦酸酯(ONMP)。這種配體-接頭-前體藥物構(gòu)建物針對小鼠肝臟的寡核苷酸。
一些針對不同靶位點的HBV-特異寡核苷酸例子列于表A(Goodarzi等，(1990)，J.General Virology，713021-3025)；Galibert等，(1979)，Nature，281646-650)。例如，核心基因編碼核心蛋白且對于HBV DNA復(fù)制是必需的并包裝前基因組RNA。核心基因靶是翻譯起始位點重疊多腺苷酸化位置。表面抗原基因編碼病毒外殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白且在肝臟損害的發(fā)病機理中發(fā)揮關(guān)鍵作用。表面抗原基因靶是翻譯起始位點。包殼基因編碼包殼蛋白且包裝DNA和抑制HBV DNA合成。包殼基因在所有HBV菌株中高度保守。它的靶是上部莖煥/未配對環(huán)。可合成其它病毒-特異寡核苷酸以靶向特異病毒位點以及基因-特異靶，包括癌-相關(guān)靶(如raf、ras和蛋白激酶)。
表A-肝炎病毒乙肝病毒(HBV)靶位點 序列(5’-3’)HBx基因TTGGCAGCACACCCTAGCAGCCATGGA(SEQ.ID NO1)HBV表面抗原(S基因)帽位置/SPIIGATGACTGTCTCTTA(SEQ.ID NO2)內(nèi)部/前S2 AGGAGATTGACGAGA(SEQ.ID NO3)起始子/基因S GTTCTCCATGTTCGG(SEQ.ID NO4)起始子/基因S TCTCCATGTTCG(SEQ.ID NO5)內(nèi)部I/基因SGAATCCTGATGTAAT(SEQ.ID NO6)內(nèi)部I/基因SAACATGAGGGAAACA(SEQ.ID NO7)前S1開放閱讀框HBV核心抗原(C基因)丙肝病毒(HCV)序列(5’-3’)TFCTCATGGTGCACGGGTCTACGA(SEQ.ID NO8)CTTTCGCGACCCAACACTAC(SEQ.ID NO9)
CATGATGCACGGTCTACGAGA(SEQ.ID NO10)GCCTTTCGCGACCCAACACT(SEQ.ID NO11)GCCTTTCGCGACCCAAC(SEQ.ID NO12)GCCTTTCGCGACCCAAC(SEQ.ID NO13)GTGCTCATGGTGCACGGTCT(SEQ.ID NO14)GTGCTCATGGTGCACG(SEQ.ID NO15)CTGCTCATGGTGCACGGTCT(SEQ.ID NO16)丁肝病毒(HDV)序列(5’-3’)GCGGCAGTCCTCAGT(SEQ.ID NO17)CTCGGCTAGAGGCGG(SEQ.ID NO18)CTCGGACCGGCTCAT(SEQ.ID NO19)TCTTCCGAGGTCCGG(SEQ.ID NO20)ATATCCTATGGAAATCC(SEQ.ID NO21)TGAGTGGAAACCCGC(SEQ.ID NO22)ATTTGCAAGTCAGGATT(SEQ.ID NO23)使用發(fā)明的方法和其它本領(lǐng)域已知方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能合成靶向這些和其它序列的發(fā)明結(jié)合物。
根據(jù)發(fā)明的化合物、組合物和方法有助于治療贅生和感染性疾病且也包括如碳水化合物-包含配體的變化，它們針對細(xì)胞表面外源凝集素并特異于它們的配體-結(jié)合部分。具體是，可使用任何糖類或糖類-修飾的部分。“生理上可接受載體”包括任何和所有溶劑、散布介質(zhì)、包被、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收-延遲劑以及包括配體-接頭-前體藥物(如寡聚物)構(gòu)建物的試劑。
治療上有效劑量的發(fā)明前體藥物可眼內(nèi)、口頭攝取、吸入或肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射施用并可在沒有熱原、腸胃外可接受的水溶劑中施用。治療上有效量指A-L-P構(gòu)建物或方法的藥物組合物各活性成分的總量足夠表現(xiàn)出對病人有意義的益處，即減少或去除病毒或者減少或去除腫瘤負(fù)荷。當(dāng)應(yīng)用于單獨活性成分如傳遞前體藥物給靶時，術(shù)語指單獨的成分。當(dāng)應(yīng)用于組合物時，術(shù)語指產(chǎn)生治療效果的活性成分組合量，無論組合、連續(xù)或同時施用。治療效果所需量的減少取決于分子和細(xì)胞靶、疾病和病人的健康狀態(tài)。例如，在HBV中，優(yōu)選達(dá)到至少20％減少，至少50％更優(yōu)選，至少70％最優(yōu)選。當(dāng)口頭施用治療上有效量的發(fā)明時，結(jié)合物以片劑、膠囊、粉末、溶液或西也劑形式。溶液中的藥物組合物可包含生理鹽水溶液、右旋糖或其它糖類溶液或乙二醇、丙二醇或聚乙二醇或任何其它藥學(xué)上可接受載體。藥物組合物中施用的結(jié)合物量取決于治療狀態(tài)的性質(zhì)和嚴(yán)重性。最終，參與醫(yī)師會決定治療各單獨病人的本發(fā)明結(jié)合物的劑量和量，這要考慮多種因素如年齡、體重、總體健康、飲食、性別、待施用組合物、施用途徑和治療疾病的嚴(yán)重性。含本發(fā)明A-L-P結(jié)合物的藥物組合物可施用給動物，包括但不限于人和家畜動物(如牛、狗、貓、馬、綿羊和山羊)、鳥和魚。
實施例合成A-L-P結(jié)合物此發(fā)明揭示了兩種一般結(jié)合方法的發(fā)展，結(jié)合方法1和結(jié)合方法2可用于共價連接寡核苷酸類似物和新糖肽以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)確定和均一的結(jié)合物。結(jié)合方法1是三-成分反應(yīng)，在其結(jié)合步驟中使用三種化學(xué)物，配體、功能化寡核苷酸類似物和連接兩者的異雙功能接頭。結(jié)合方法2是二-成分反應(yīng)，也指定量結(jié)合方法，僅使用結(jié)合步驟中的兩種反應(yīng)物；活化配體和功能化寡核苷酸類似物。也揭示了一種用于放射性同位素標(biāo)記寡核苷酸類似物和它們A-L-P結(jié)合物的新方法，包括前面不能通過常規(guī)酶標(biāo)記方法標(biāo)記的類似物。這些發(fā)明使我們合成和放射性同位素標(biāo)記幾乎各類寡核苷酸和寡核苷酸類似物的新糖肽結(jié)合物。兩種結(jié)合方法和與它們相關(guān)的放射性同位素標(biāo)記方法的概述在下面給出，接著是闡明詳細(xì)過程的例子用于在合成多種A-L-P結(jié)合物中使用這些方法。
結(jié)合方法1此方法包括用異生物功能交聯(lián)劑偶聯(lián)功能化寡核苷酸類似物和新糖肽并分類為三-成分反應(yīng)。寡核苷酸類似物在固相合成儀中合成。寡聚物的5’末端在固相合成后酶磷酸化以進(jìn)一步結(jié)合與異生物功能交聯(lián)劑反應(yīng)的功能性基團。對于不能在5’末端酶磷酸化的寡核苷酸類似物如甲基膦酸酯寡聚物，另外的核苷單位2’-O-甲基-核苷在固相合成寡聚物中通過磷酸二酯鍵加入5’末端。例如，如果甲基膦酸酯寡聚物T7結(jié)合配體表1入口1所示類型的寡聚物UmpT7，隨后用固相方法合成。寡聚物合成后進(jìn)一步在其5’末端用硫醇接頭修飾(表2，入口10)并結(jié)合有SMCC(表4，入口3)的YEE(ah-GalNAc)3(表3，入口1)，以獲得有與下列相同鍵的結(jié)合物
與結(jié)合方法1相關(guān)的放射性同位素標(biāo)記方法.當(dāng)選擇結(jié)合方法1用于合成A-L-P結(jié)合物，在酶磷酸化步驟中容易通過γ-32P-ATP取代未標(biāo)記ATP在寡聚物5’末端獲得32P放射性標(biāo)記。當(dāng)結(jié)合結(jié)束時，放射性結(jié)合物可立即用于細(xì)胞吸收和生物分布研究。
此三-成分反應(yīng)的詳細(xì)過程進(jìn)一步描述于名為[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7(10)的32P標(biāo)記A-L-P結(jié)合物的合成中(實施例1)。
結(jié)合方法2在此方法中，新糖肽首先在其N-末端氨基用SMCC修飾以提供與硫醇基團反應(yīng)的馬來酰亞胺-活化配體(表3，入口6)。SMCC-修飾新糖肽在結(jié)合反應(yīng)中使用前純化到均一。在寡核苷酸類似物5’末端引入硫醇基團通過結(jié)合二硫接頭到寡聚物在固相合成階段方便地獲得。隨后用純化的馬來酰亞胺-活化新糖肽和純化的5’硫醇-包含寡核苷酸類似物進(jìn)行最后的結(jié)合。此結(jié)合方法去除所有與結(jié)合方法1相關(guān)的潛在副反應(yīng)，這是通過在結(jié)合反應(yīng)中用純化的活化配體和寡聚物和通過仔細(xì)的實驗設(shè)計和執(zhí)行。結(jié)合寡核苷酸類似物定量進(jìn)行，可容易地純化最終A-L-P結(jié)合物。此反應(yīng)過程分類為二-成分反應(yīng)，其中結(jié)合物的“一半”被修飾并隨后活化用于與另“一半”反應(yīng)。例如，如果相同甲基膦酸酯寡聚物T7用SMCC作為異雙功能接頭來結(jié)合YEE(ah-GalNAc)3，結(jié)合方法2產(chǎn)生有與下列相同鍵的結(jié)合物 此二-成分反應(yīng)的詳細(xì)過程進(jìn)一步描述于實施例2和實施例3。
二-成分反應(yīng)的更多例子可用相似策略實現(xiàn)。例如，新糖肽可如表3入口2-5所示修飾?？捎美?，2’-雙吡啶活化硫醇。如下所示，活化硫醇與任何3’或5’硫醇修飾寡聚物的反應(yīng)會提供寡聚物和新糖肽間的二硫鍵。此過程可接近硫原子周圍不同空間體積的二硫化物，二硫化物用商業(yè)購買的交聯(lián)劑不能接近(表4，入口4-6)。
與結(jié)合方法2相關(guān)的放射性同位素標(biāo)記方法.當(dāng)選擇結(jié)合方法2用于合成A-L-P結(jié)合物，放射性標(biāo)記在合成結(jié)合物后進(jìn)行。放射性標(biāo)記一些寡核苷酸類似物種類的結(jié)合物(如硫代磷酸酯寡核苷酸)可通過常規(guī)3’-或5’-酶標(biāo)記方法來獲得，取決于游離羥基位于哪端。隨后用化學(xué)修飾保護放射性磷酸基團不受細(xì)胞酶降解。
對于不含可參與酶磷酸化的游離羥基的寡核苷酸類似物(如甲基膦酸酯寡聚物)，需要發(fā)展除了酶磷酸化的方法。為了這個考慮，我們發(fā)展了一種全面方法用于在任何類型寡核苷酸類似物和它們A-L-P結(jié)合物的3’末端結(jié)合穩(wěn)定32P標(biāo)記，包括那些前面不能用常規(guī)酶標(biāo)記方法標(biāo)記的。方法使用結(jié)合的化學(xué)和酶方法以完成標(biāo)記并包括下列步驟1.固相合成前，設(shè)計雜合或嵌合寡聚物構(gòu)建物包含三個共價連接部分。5’部分是二硫接頭。中間部分是所需寡核苷酸類似物結(jié)構(gòu)。3’-末端是有反極性的硫代磷酸酯胸苷三核苷酸單位，5’-T-3’-3’-TT-5’。此三核苷酸單位也稱為示蹤物單元，其結(jié)構(gòu)示于圖2c。結(jié)合此三核苷酸單位在寡聚物構(gòu)建物3’-末端引入5’羥基，寡聚物構(gòu)建物可酶磷酸化。
2.固相合成寡聚物構(gòu)建物。
3.用結(jié)合方法2結(jié)合配體。
4.用酶磷酸化32P標(biāo)記A-L-P的3’末端。
5.化學(xué)修飾32P標(biāo)記的磷酸基團以保護標(biāo)記不受細(xì)胞酶的水解。
圖2d和圖2e描述了用于制備32P標(biāo)記A-L-P結(jié)合物的完整合成過程，使用結(jié)合方法2和其相關(guān)放射性同位素標(biāo)記方法。
此發(fā)明發(fā)展的兩種方法可用于合成多種A-L-P結(jié)合物。可結(jié)合到A-L-P結(jié)合物中的寡核苷酸類似物例子示于表1。表2列出寡核苷酸類似物上的3’-和5’-修飾以提供一級氨基或硫醇基團用于進(jìn)一步反應(yīng)。表3顯示含N-末端氨基的新糖肽，以及四種修飾氨基以提供硫醇基團的方法加上另一種提供馬來酰亞胺基團的方法。最后，表4列出一些異生物功能交聯(lián)劑和組織蛋白酶D敏感寡肽，可用于連接前體藥物到配體。顯然有許多其它適當(dāng)試劑。
表1.寡核苷酸類似物 入口 R1R2R3R41 5’-結(jié)合物 H H H2H H H 3’-結(jié)合物3 5’-結(jié)合物 -OCH3-OCH3H4H -OCH3-OCH33’-結(jié)合物B＝A、C、G或T8≤n≤50 入口 R1R2R3R4R555’-結(jié)合物 O- CH3O- H6HO- CH3- O- 3’-結(jié)合物75’-結(jié)合物 CH3-OCH3H8HCH3-OCH33’-結(jié)合物95’-結(jié)合物 S- CH3S- H10HS- CH3S- 3’-結(jié)合物115’-結(jié)合物 CH3S-CH3H12HCH3S-CH33’-結(jié)合物135’-結(jié)合物 S- S- S- H14HS- S- S- 3’-結(jié)合物B＝A、C、G或T8≤n≤50R6＝H、OH或OCH3
表2.用于結(jié)合新糖肽的3’和5’修飾的寡核苷酸類似物入口 結(jié)構(gòu)功能基團反應(yīng)性活性酯異硫氰酸鹽1-3 氨基異氰酸鹽醛4 氨基5 氨基6 氨基7 氨基8 氨基1°鹵化物9 硫醇馬來酰亞胺活化二硫化物10 硫醇11 硫醇12硫醇13 硫醇14 硫醇表3.YEE(ah-GalNAc)3a功能基團修飾的說明入口 修飾劑 配體 功能基團反應(yīng)性活性酯異硫氰酸鹽1 無 H2N-YEE(ah-GalNAc)3氨基異氰酸鹽醛1°鹵化物2b 硫醇 馬來酰亞胺活化二硫化物3 硫醇4 硫醇5 硫醇6 馬來酰亞胺硫醇a這些試劑可用于修飾任何圖1所列配體。
b參見Goff，D.A；Carrol，S.F.(1990)取代的2-亞基硫代化物用于制備穩(wěn)定性提高的二硫化物交聯(lián)結(jié)合物的試劑(Subtituted 2-iminothiolanesregents for thepreparation of disulfide cross-linked conjugates with increased stbility)，BioconjugateChem，1，381-386.
表4.活化寡核苷酸類似物、活化配體和交聯(lián)劑可能組合的例子反應(yīng)基團入口 寡聚物配體 交聯(lián)劑 鍵1 -NH2-NH2酰胺/胺2 -SH -NH2 硫醚/酰胺3 -SH -NH2硫醚/酰胺4 -SH -NH2 二硫化物/酰胺5 -SH -NH2 二硫化物/酰胺6 -SH -NH2二硫化物/酰胺酰胺/硫醚或7 -NH2-SH 見入口2-6酰胺/二硫α-citraconyl-K-(ε-FMOC)8 -NH2-NH2PILFFRLa酰胺/酰胺(組織蛋白酶-D敏感接頭)9 -SH -SH 需要用2，2’-雙吡啶二硫化物或相當(dāng)二硫試劑活化a所示試劑不能商業(yè)購買實施例1 用結(jié)合方法1合成A-L-P結(jié)合物[YEE(ah-GalNAc)3a]]-SMCC-AET-pUmpT7(10)材料甲基亞磷酰胺(methylphosphonamidite)合成纖維由JBL Scientific公司慷慨提供并可商業(yè)購買。它們可由普通技術(shù)人員根據(jù)規(guī)定程序從核苷合成。用于自動合成UmpT7(圖3)的所有其它試劑購自Glen Research公司。HiTrap Q陰離子交換柱購自Pharmacia LKB生物技術(shù)有限公司。反相高性能液相層析用購自Rainin儀器公司的Microsorb C-18柱進(jìn)行。鹽酸胱胺、1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亞胺(EDAC)、甲基咪唑、無水二甲基亞砜(DMSO)、二硫蘇糖醇(DTT)和Ellmen試劑購自Aldrich并沒有進(jìn)一步純化就使用。二異丙基乙胺(DIPEA)購自Aldrich且使用前從氫化鈣中復(fù)蒸餾。N-羥基琥珀酰亞胺4(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)己基羧酸鹽(SMCC)購自Pierce。Waters SepPak C-18柱體購自Millipore公司。YEE(ah-GalNAc)3(圖2a)根據(jù)Lee等(1995，同上)合成并作為水溶液保存于4℃。三磷酸腺苷(ATP)和[γ-32P]-ATP分別購自P-L生化公司和Amersham。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)用20cm×20cm×0.75mm膠進(jìn)行，膠含15％聚丙烯酰胺、0.089M Tris、0.089M硼酸、0.2mM EDTA(1×TBE)和7M尿素。樣品溶解在加樣緩沖液中，加樣緩沖液含90％甲酰胺、10％1×TBE、0.2％溴酚藍(lán)和0.2％二甲苯藍(lán)。
合成UmpT7(6)。寡脫氧核苷酸甲基膦酸酯用5’-O-(二甲氧三苯甲基)-3’-O-甲基-N，N-二異丙基(diispropyl)-亞磷酰胺胸苷在受控孔隙玻璃支持物(CPG)上合成并根據(jù)規(guī)定方法去保護(Mileer等，(1991)，寡核苷酸和類似物.一種實踐方法(Oligo-nucleotides and Analogues.A Practical Approach)(Eckstein，E，編輯)，IRL出版社，牛津，137-154頁；Hogrefe等，(1993)，分子生物的方法(Methods on Molecular Biology)，第20卷寡核苷酸和類似物的操作(Protocols for Oligonucleotides and Analogs)(Aragawal編輯)，Humana出版社有限公司，Totown，143-164頁)。在5’末端結(jié)合到寡聚物的最終合成纖維是5’-O-(二甲氧三苯甲基)-2’-O-甲基-3’-[2-氰乙基]-N，N-二異丙基(diispropyl)]亞磷酰胺尿苷。最后的偶聯(lián)步驟位于末端5’核苷和鄰近核苷間的磷酸二酯鍵，使5’末端羥基可用噬菌體T4多核苷酸激酶磷酸化并由于存在2’-O-甲基基團而保證磷酸二酯的合理穩(wěn)定性。原始8聚體通過HiTrap Q陰離子交換柱(用含＜25％乙腈的緩沖液加樣；用0.1M磷酸鈉，pH5.8洗提)和用線性梯度(溶劑A50mM磷酸鈉，pH5.8、2％乙腈；溶劑B50mM磷酸鈉，pH5.8、50％乙腈；梯度30分鐘內(nèi)0-60％B)的預(yù)備反相層析(Microsorb C-18)純化。這樣寡聚物用分析HPLC純化到97％純度，僅有少量的n-1種類被污染。
合成[5’-32p]-5’-O-[(N-2-硫代乙基)氨基磷酸酯]-UmpT7(9)(圖3)。結(jié)合純化的寡聚物(168nmol)、ATP(160nmol)、H2O(75μL)、10XPNK緩沖液(5mM DTT、50mMTris(HCl、5mM MgCl2，pH7.6；10μL)、[γ-32P]-ATP(3000Ci/mmol，100μ Ci，10μL)和PNK(5μL中的150U)并在37℃培養(yǎng)16小時并蒸發(fā)干燥。剩余物再溶解于0.2M1-甲基咪唑，pH7.0(100μL)和含0.3M EDAC(100μL)的1.0M鹽酸胱胺，pH7.2并在50℃加熱2小時(Chu等，(1983)，Nucleic Acid Res.，116513-6529；Chu等，(1988)，Nucleic Acid Res.，163671-3691)。過量試劑通過SepPak去除(用50mM磷酸鈉，pH5.8、5％乙腈加樣；用5％水中的乙腈洗；用50％水中的乙腈洗提)。溶劑在真空蒸發(fā)且原始胱胺加合物再溶解于含50mM DTT的10mM磷酸鹽(200mL)并加熱至37℃1小時。緩沖鹽和過量還原劑如前從反應(yīng)混合物中去除且原始產(chǎn)物在真空干燥。從6以57％產(chǎn)量生成的化合物9沒有進(jìn)一步純化就用于下一步。
合成[5’-32P]-[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7(10)。新糖肽(336nmol)(圖2a)溶解于無水DMSO(4mL)并用DIPEA(336nmol)和SMCC(336nmol)處理。反應(yīng)維持在室溫4小時，隨后加入新鮮制備的硫醇9(圖3)。使反應(yīng)混合物脫氣并在真空室溫緩慢濃縮。原始物溶解于甲酰胺加樣緩沖液(100μL，由PAGE(4V/cm，1.5小時)純化)，通過粉碎和浸泡方法回收(50％水中的乙腈)。純10的總產(chǎn)量是25％。
由于P-N鍵水解用0.1N HCl(37℃，1小時)處理，10產(chǎn)生[5’-32P]-磷酸化6；然而6不與DTT(50mM，pH8，37℃，1小時)、3-馬來酰亞氨基丙酸(50mM，pH8，37℃，1小時)、Ellman試劑(50mM，pH8，37℃，1小時)和BAP(70U，65℃，1小時)反應(yīng)。用0.1N HCl和BAP連續(xù)處理導(dǎo)致[32P]-標(biāo)記如預(yù)期完全失去。以相同方式制備的10的未標(biāo)記樣品化學(xué)計量分析顯示它含3摩爾N-乙酰半乳糖胺用于每摩爾結(jié)合物，與建議結(jié)構(gòu)一致。(UmpT7的摩爾吸光系數(shù)值計算為59,750L/mol-cm，這是結(jié)構(gòu)中所含各核苷的摩爾吸光系數(shù)值總和。此值與結(jié)合物中所含GalNAc殘基摩爾數(shù)很一致)。空氣協(xié)助的電噴射質(zhì)譜在M/Z 4080(計算質(zhì)量為4080.7)產(chǎn)生母離子(負(fù)離子模式)。
方法1的討論合成和純化YEE(ah-GalNAc)3及pUmpT7根據(jù)規(guī)定程序(Lee，(1987)，同上；Miller(1991)，同上)進(jìn)行。為形成YEE(ah-GalNAc)3和UmpT7間的共價鍵，UmpT7的5’-末段用Orgel方法(Chu，(1983&1988)，同上)修飾。這引入二硫化物到寡核苷酸甲基膦酸酯中，隨之可用DTT還原以給出5’-硫醇。新糖肽(圖2a)以互補方式用異生物功能交聯(lián)劑SMCC修飾，SMCC能特異結(jié)合YEE(ah-GalNAc)3的N-末端氨基。偶聯(lián)SMCC引入的馬來酰亞氨基和修飾寡核苷酸甲基膦酸酯的5’-硫醇導(dǎo)致寡核苷酸甲基膦酸酯和新糖肽通過代謝穩(wěn)定硫醚的鍵合(圖3)。
為開始合成，UmpT7用PNK和0.95[32P]-ATP同等物磷酸化。成功的5’-磷酸化通過產(chǎn)物與親代寡核苷酸甲基膦酸酯相比電泳淌度增加來確定，這是由于加入5’-磷酸和結(jié)合32P到結(jié)構(gòu)時從-1到-3負(fù)電荷增加(圖4，A帶)。以此方式形成的末端-標(biāo)記反應(yīng)確保約90％ATP被消耗，有效使用[32P]-ATP以放射性標(biāo)記結(jié)合物。5’-磷酸的修飾在兩步驟中完成。5’-末端標(biāo)記寡核苷酸甲基膦酸酯在50℃用0.5M緩沖液中的鹽酸胱胺在pH7.2存在0.15M EDAC時培養(yǎng)來以65％產(chǎn)量產(chǎn)生5’-鹽酸胱胺，緩沖液含0.1M 1-甲基咪唑。反應(yīng)混合物的PAGE分析顯示產(chǎn)物移動顯著慢于5’-末端標(biāo)記寡核苷酸甲基膦酸酯。此觀察與從-1到-3的變化一致，變化是由于形成P-N鍵和中和第二個負(fù)電荷時在5’-磷酸上單個含氧陰離子的損失，中和是通過胱胺基團末端上存在的正電荷質(zhì)子化伯胺(圖4；比較A和B帶)。在此反應(yīng)中產(chǎn)生直至35％的胸苷-修飾寡核苷酸甲基膦酸酯(圖4，C帶)，盡管嘗試修改反應(yīng)條件(如降低溫度和減少EDAC濃度)，去除它的生成不能沒有所需胱胺加合物產(chǎn)量的共同減少。由于EDAC與胸苷的N-3反應(yīng)以形成胸苷-EDAC加合物，此副產(chǎn)物假定上升(Chu，同上；Gilham，同上)。二硫化物用DTT在pH8還原是定量的并伴隨遷移率變動為更快的遷移種類，這是由于失去正電荷質(zhì)子化一級氨基(圖4；比較B和C帶)。在一個不同反應(yīng)中，YEE(ah-GalNAc)3在無水DMSO中結(jié)合1當(dāng)量各SMCC和DIPEA并在室溫培養(yǎng)。由于5、7和9上存在的反應(yīng)基團區(qū)特異結(jié)合，完成此反應(yīng)混合物和硫醇9的結(jié)合可完全沒有YEE(ah-GalNAc)3消耗SMCC，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)確定和均一的結(jié)合物。如所預(yù)期，由于結(jié)合物10的質(zhì)量顯著大于親代寡核苷酸甲基膦酸酯，加入修飾新糖肽到活化寡核苷酸甲基膦酸酯的5’末端伴隨著其PAGE遷移率顯著變慢(圖4，F(xiàn)帶)。此過程后，當(dāng)使用2當(dāng)量(以新糖肽YEE(ah-GalNAc)3的起始寡核苷酸甲基膦酸酯6為基礎(chǔ))時9完全轉(zhuǎn)變成10。結(jié)合物10的總產(chǎn)量是寡核苷酸甲基膦酸酯6基礎(chǔ)的24％(三種綜合體的平均)。10的均一性通過電噴射質(zhì)譜檢測單個母離子(負(fù)離子模式)來確認(rèn)。
實施例2用結(jié)合方法合成A-L-P結(jié)合物1c此例子描述了詳細(xì)過程用于在從新種類寡核苷酸類似物合成A-L-P結(jié)合物中使用結(jié)合方法2，寡核苷酸類似物是交替甲基-膦酸酯-磷酸二酯主鏈的2’-O-甲基核糖。表5列出三種此類寡聚物(寡聚物1-3)和它們用肝臟配體YEE(ah-GalNAc)3形成的A-L-P結(jié)合物(結(jié)合物1c、2c、3c)。下面描述了合成結(jié)合物1c的過程。另兩個結(jié)合物類似合成。
在合成1c中使用結(jié)合方法2的過程包括下列步驟1)合成SMCC-YEE(ah-GalNAc)3(8)；2)設(shè)計寡聚物構(gòu)建物1b；3)固相合成寡聚物構(gòu)建物1b；4)結(jié)合1b和SMCC-YEE(ah-GalNAc)3-合成1c；5)32P放射性標(biāo)記結(jié)合物1c。
表5.交替甲基膦酸酯類似物的寡核苷酸序列1(n＝7)ApGpUpCpApGpUpCpApGpUpCpApGpU2(n＝7)GpUpUpCpUpCpCpApUpGpUpUpCpApG3(n＝10) UpUpUpApUpApApGpGpGpUpCpGpApUpGpUpCpCpApU其中p磷酸二酯鍵p甲基膦酸酯鍵ps硫代磷酸酯鍵(xxxx40)寡核苷酸 R1R2R3R4a H O-CH33’-結(jié)合物b C6-硫醇-psO-CH33’-結(jié)合物c 5’-結(jié)合物O-CH33’-結(jié)合物d 配體-SMCC-AET O-CH3HeEDAO-CH3H其中配體YEE(ah-GalNAc)35’-結(jié)合物YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-S(CH2)6-ps鍵(圖3)3’-結(jié)合物示蹤物單元(圖9)EDA乙二胺在表5中，寡聚物1-3可連接表示為表底部寡核苷酸a-e的取代基團，用本文下面所述合成方法進(jìn)一步形成發(fā)明的化合物例子。例如，1b由序列1組成，序列1帶根據(jù)發(fā)明的C6-硫醇-ps、O-、CH3和3’-結(jié)合物(結(jié)構(gòu)示于2c)的取代物。如實施例2中詳細(xì)所列，1b(圖2e)和1c所示結(jié)構(gòu)的化合物根據(jù)圖2d和2e所示過程合成。顯然有起始材料的適當(dāng)取代和合成中的變化，可類似合成其它組合。
合成和純化SMCC-YEE(ah-GalNAc)3(8)。約1-2微摩爾的YEE(ah-GalNAc)3在玻璃Reacti-小瓶內(nèi)干燥。對于此溶液，加入無水DMSO(250μL)和無水DIPEA(3μL)，隨后用150μL含真空-干燥SMCC(6mg)的溶液處理，SMCC在無水DMSO中。混合物短暫振動并保持在室溫。反應(yīng)進(jìn)程通過反相HPLC分析以30分鐘間隔監(jiān)控。HPLC方法Microsorb C-18 250×4.6mm.。0-5分鐘，0-40％B；5-20分鐘，40-100％B。A50mM磷酸鈉pH5.8中的2％CAN；B50mM磷酸鈉pH5.8中的50％CAN。流速1mL/分鐘。檢測A280nm。HPLC分析的結(jié)果表明在2小時內(nèi)起始YEE(ah-GalNAc)3(洗提時間7.3分鐘)完全轉(zhuǎn)變成所需產(chǎn)物SMCC-YEE(ah-GalNAc)3(洗提時間9.8分鐘)。反應(yīng)混合物隨后用含2％CH3CN的50mM磷酸鈉(pH5.8)稀釋到10mL并上樣到Sep-Pak柱體。柱體用10mL含2％CH3CN的50mM磷酸鈉(pH5.8)洗且產(chǎn)物用10mL 25％CH3CN/H2O洗提。產(chǎn)物在Speed-vac中降低的壓力下濃縮并進(jìn)一步在半-預(yù)備反相C-18柱上純化。HPLC方法Microsorb C-18 250×7.5mm。0-60分鐘，20-60％B。A50mM磷酸鈉pH5.8中的2％CAN；B50mM磷酸鈉pH5.8中的50％CAN。流速2mL/分鐘。檢測A280nm。收集含純SMCC-YEE(ah-GalNAc)3的部分并在Sep-Pak上脫鹽。最終產(chǎn)物量1.89(O.D.2761.35μmole)。UV(25％CAN)305(br)，282(sh)和276nm。相對強度∶ε305∶ε 282∶ε276＝1∶2.7∶3.0。MS(電噴射，陽離子模式)1565(M+H)+。分析反相HPLC在9.8分鐘的單峰。(HPLC條件Microsorb C-18 250×4.6mm.。0-5分鐘，0-40％B；5-20分鐘，40-100％B。A50mM磷酸鈉pH5.8中的2％CAN；B50mM磷酸鈉pH5.8中的50％CAN。流速1mL/分鐘。檢測A280nm。)設(shè)計寡聚物構(gòu)建物1b(表5)。下列描述闡明了如何設(shè)計寡聚物構(gòu)建物用于使寡核苷酸類似物1結(jié)合YEE(ah-GalNAc)3并形成32p標(biāo)記的A-L-P結(jié)合物。寡聚物1屬于一種新類型寡聚物，包含具交替磷酸二酯和甲基膦酸酯核苷酸間鍵合的2’-O-甲基核糖，寡聚物序列示于表5。寡聚物1b(表5)是設(shè)計用于使寡聚物1結(jié)合配體并使結(jié)合物32p標(biāo)記的構(gòu)建物。寡聚物1b包括三個部分。中間部分包含寡聚物1的精確結(jié)構(gòu)，即A-L-P的P部分。5’-部分包含C6-硫醇接頭，通過硫代磷酸酯鍵附著于寡聚物1的5’-A。硫醇基團用于結(jié)合SMCC-修飾配體，即A-L-P的A部分。3’部分是示蹤物單元，通過甲基膦酸酯鍵共價附著于寡聚物1的3’-U。示蹤物單元是有反極性的硫代磷酸酯胸苷三核苷酸單位，5’-T-3’-3’-TT-5’，其結(jié)構(gòu)示于圖9或2c。沒有此三核苷酸單位，最終的結(jié)合物會在其3’-末端有具5’-甲基膦酸酯鍵的2’-O-甲基尿苷。放射性同位素標(biāo)記此3’-末端用常規(guī)酶方法不可能。結(jié)合此三核苷酸單位在寡聚物構(gòu)建物3’-末端引入5’-羥基，可被酶磷酸化以32p標(biāo)記結(jié)合物。
僅當(dāng)需用32P標(biāo)記最終結(jié)合物時，需要3’-示蹤物單元。對于不需放射性標(biāo)記結(jié)合物的應(yīng)用，省略了示蹤物且寡聚物構(gòu)建物僅包括硫醇接頭和P部分。
固相合成寡聚物構(gòu)建物1b。修飾的寡聚物1b在固相DNA合成儀上合成，使用來自商業(yè)來源(Glen Research)的相應(yīng)亞磷酰胺和甲基-亞磷酰胺s。示蹤物在dT-5’-Lcaa-CPG支持物上用硫代磷酸酯化學(xué)通過偶聯(lián)3’-DMT-dT-5’-CE亞磷酰胺到支持物來聚集，接著用5’-DMT-5-[N-(三氟乙酰)己基-3-丙酰胺]-2’-脫氧尿苷3’-[(2-氰乙基)-(N，N’-二異丙基)]亞磷酰胺(CPG和合成纖維商業(yè)購自Glen Research)。隨后對應(yīng)于寡聚物1的序列通過持續(xù)偶聯(lián)2’-O-甲基甲基亞磷酰胺s合成纖維和2’-O-甲基-氰乙基亞磷酰胺合成纖維來聚集在包含示蹤物CPG上。接著在固相合成的最后偶聯(lián)步驟，5’-二硫化物接頭用硫代磷酸酯化學(xué)通過偶聯(lián)C6-二硫化物氰乙基-亞磷酰胺合成纖維(Glen Research)來引入寡聚物。必要時，Beaucage試劑(GlenResearch)替換低含水量氧化劑以影響亞磷酸鹽的硫化來根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定程序產(chǎn)生硫代磷酸酯。寡聚物合成不去除5-DMT基團。寡聚物在Genta單罐法(one-pot)下去保護(Hogrefe，R.I.，Vaghefi，M.M.，Reynolds，M.A.，Young，K.M和Arnold，L.J.(1993)Nucl.Acids Res.，21，2031-2038)并通過三苯甲基過程純化。二硫化物-包含寡聚物最后用半預(yù)備反相層析C-18柱純化。HPLC條件Microsorb C-18250×7.5mm.。0-50分鐘，20-60％B。A50mM磷酸鈉pH7中的2％CAN；B50mM磷酸鈉pH7中的50％CAN。流速2mL/分鐘。檢測A254nm。
二硫化物部分還原成硫醇受含DTT的5’-二硫化物-包含寡聚物處理影響。因此，2.5 O.D.260(～16納摩)二硫化物寡聚物溶解于400μL新鮮制備并脫氣的50mM DTT溶液中，溶液在10mM磷酸鈉，pH8中?；旌衔?7℃培養(yǎng)2小時。定量減少通過反相HPLC分析確定，顯示硫醇寡聚物洗提快于親代二硫化物寡聚物。硫醇寡聚物隨后在Sephadex G-25柱(10×300mm)上純化以去除DTT和鹽類。柱填充和樣品洗提受使用脫氣的2％乙醇-水影響。含純硫醇寡聚物的G-25部分在下一個反應(yīng)中立即使用以最小化不需要的氧化。合成YEE(ah-GalNAc)3-包含寡聚物1c。
含1.8O.D.260(12納摩)純硫醇寡聚物(1b)的G-25部分收集后立即與SMCC-YEE(ah-GalNAc)3(50納摩)混合?；旌衔镌趕peed-vac中濃縮干燥。剩余物溶解于100μL脫氣的50％CH3CN，CH3CN含0.1M磷酸鈉pH7。溶液在speed-vac中通過抽真空約5分鐘進(jìn)一步脫氣。溶液隨后蓋緊并室溫培養(yǎng)過夜以使結(jié)合完全。另外，結(jié)合可通過混合新鮮收集的硫醇寡聚物G25部分和50％CH3CN中的SMCC-YEE(ah-GalNAc)3溶液進(jìn)行，CH3CN含0.1M磷酸鈉pH7。溶液立即置于speed-vac中并濃縮至約1mL。溶液隨后蓋緊并室溫培養(yǎng)過夜以使結(jié)合完全。發(fā)現(xiàn)兩個過程都產(chǎn)生硫醇-包含寡聚物的定量結(jié)合。
為確定結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)量，干燥約0.5μL的反應(yīng)部分并用[γ-32P]-ATP和PNK磷酸化，通過20％變性PAGE分析。結(jié)合物的遷移率與相同膠中未結(jié)合寡聚物相比。未標(biāo)記結(jié)合物也可以類似方式通過UV影像分析。PAGE結(jié)果指示硫醇寡聚物與新糖肽的定量結(jié)合。確認(rèn)結(jié)合物是通過其在胰凝乳蛋白酶消化下的顯著膠遷移率和DTT處理下不能變動。結(jié)合物最后由Sephadex G-25柱純化，用20％乙醇洗提。純化的1c可直接用于生物功效實驗和其它不需放射性標(biāo)記結(jié)合物的實驗。
32P放射性標(biāo)記結(jié)合物1c。為在細(xì)胞吸收和生物分布實驗中使用1c，用γ-32PATP和PNK根據(jù)常規(guī)5’-酶放射性標(biāo)記過程標(biāo)記1c。結(jié)合純化的結(jié)合物1c(10納摩)、ATP(10納摩)、H2O(70μL)、10×PNK緩沖液(5mM DTT、50mM Tris(HCl、5mM MgCl2，pH7.6；10μL)、[γ-32P]-ATP(3000Ci/mmol，150μCi，15μL)和PNK(10μL中的300U)并在37℃培養(yǎng)16小時并蒸發(fā)干燥。32P結(jié)合到結(jié)合物通過15％PAGE和放射自顯影分析。隨后將0.2M 1-甲基咪唑，pH7.0(100μL)和含0.3MEDAC(100μL)的1.0M鹽酸乙二胺，pH7.2加入標(biāo)記溶液。溶液接著在50℃加熱2小時(Chu等，(1983)，Nucleic Acid Res.，116513-6529；Chu等，(1988)，Nucleic Acid Res.，163671-3691)。過量試劑通過NAP-25柱去除，柱用20％含水乙醇洗提。隨后含純32P標(biāo)記結(jié)合物的部分用UV吸光率測定和scientilation計算分析。特異活性計算為約5-8Ci/微摩。純化的32P標(biāo)記結(jié)合物再次用15％PAGE和放射自顯影分析，沒有任何低分子量的32P雜質(zhì)。
實施例3用結(jié)合方法2合成A-L-P結(jié)合物NG1到NG5如本發(fā)明實施例2中所述，結(jié)合方法2是可用于形成任意寡核苷酸類似物的A-L-P結(jié)合物的一般方法。下列描述是使用結(jié)合方法2的另一個例子，用于合成不同類型的A-L-P結(jié)合物。在此例子中，待結(jié)合的寡核苷酸類似物屬于寡脫氧核糖核苷硫代磷酸酯類型，是當(dāng)前全球反義藥物發(fā)展中所用的一種主要類似物。因為寡脫氧核糖核苷硫代磷酸酯容易通過經(jīng)典3’-酶標(biāo)記過程在3’-末端標(biāo)記，例子2所用的3’-示蹤物單元在這里不需要用于放射性標(biāo)記結(jié)合物。因此，待設(shè)計的寡聚物構(gòu)建物僅包含兩個部分，硫代磷酸酯寡聚物部分和5’-二硫化物接頭部分。
這些5’-二硫化物-包含硫代磷酸酯寡聚物通過自動硫代磷酸酯寡核苷酸合成方法在ABI 392 DNA/RNA合成儀上合成，使用標(biāo)準(zhǔn)3’-CPG支持物、5’-DMT-核苷3’-氰乙基亞磷酰胺和C6-硫醇接頭-氰乙基亞磷酰胺。(所有這些試劑購自GlenResearch，Sterling，VA)寡聚物合成沒有去除5-DMT基團。寡聚物用濃縮的氫氧化銨55℃去保護16-20個小時。三苯甲基-包含寡聚物隨后通過帶Microsorb C-18柱的預(yù)備反相層析純化，用50mM磷酸鈉pH7.5中的線性梯度乙腈。純化的三苯甲基-包含寡聚物在Sep-Pak(Water，Milford，MA)上用0.5％TFA去三苯甲基。所有寡核苷酸在后續(xù)實驗使用前在Sep-Pak柱上脫鹽。
與實施例2所述類似，純化的二硫化物-包含寡聚物隨后用于結(jié)合SMCC-YEE(ah-GalNAc)3。大部分結(jié)合反應(yīng)通過使用1.5-2當(dāng)量SMCC-YEE(ah-GalNAc)3到硫醇寡聚物進(jìn)行。這導(dǎo)致在所有進(jìn)行反應(yīng)中的寡聚物定量結(jié)合。過量配體和緩沖鹽容易通過G-25柱去除，用20％乙醇洗提，產(chǎn)生高純度結(jié)合物。結(jié)合反應(yīng)也用過量硫醇寡聚物代替進(jìn)行，即1.5當(dāng)量硫醇寡聚物到配體。在這些情況中，所有配體在反應(yīng)中消耗且剩余過量硫醇寡聚物通過預(yù)備反相高壓液相層析(HPLC)去除。下面是上述方法合成的5種寡脫氧核糖核苷硫代磷酸酯A-L-P結(jié)合物的序列(圖5)。NG1YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-5’GTTCTCCATGTTCAG3’，靶向HBV sa-基因，NG2YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-5’TTTATAAGGGTCGATGTCCAT3’，靶向HBV c-基因，NG3YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-5’AAAGCCACCCAAGGCA3’，靶向HBV e-基因和隨機對照，NG4YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-5’TGAGCTATGCACATTCAGATTT3’和NG5YEE(ah-GalNAc)3-SMCC-5’TCCAATTAGATCAG3’。
使用一些方法確定寡聚物結(jié)合產(chǎn)量和結(jié)合物純度。1)PAGE分析35S標(biāo)記的結(jié)合反應(yīng)混合物。干燥約0.5μL的反應(yīng)部分并用[35S]-ATP-S標(biāo)記3’末端(見下述3’-標(biāo)記過程)，通過20％變性分析；2)PAGE分析UV影像顯現(xiàn)的未標(biāo)記結(jié)合反應(yīng)混合物；3)HPLC分析未標(biāo)記結(jié)合反應(yīng)混合物。所有樣品接受上述三種分析前用DTT處理。平行處理和分析未結(jié)合的硫醇寡聚物用于比較目的。PAGE分析發(fā)現(xiàn)結(jié)合物都在膠上表現(xiàn)出顯著慢于相應(yīng)硫醇寡聚物的遷移率，所有硫醇寡聚物完全轉(zhuǎn)變成相應(yīng)結(jié)合物。在反相HPLC分析中，所有結(jié)合物顯示單峰且它們的保持比未結(jié)合硫醇寡聚物長約2-3分鐘。
用一些方法表現(xiàn)最終結(jié)合物的特征。結(jié)合物接受下列處理并接著用PAGE和HPLC分析來分析1)胰凝乳蛋白酶消化；2)NAGA消化；3)DTT處理。胰凝乳蛋白酶消化產(chǎn)生一種在膠上遷移快于結(jié)合物和硫醇寡聚物的寡聚物種類，確定結(jié)合物中三-肽結(jié)構(gòu)的存在。HPLC分析也指示消化帶來的保持時間變化。糖部分的存在通過NAGA消化確定，產(chǎn)生一種在膠上遷移僅稍快于結(jié)合物的寡聚物種類，但此種類在HPLC中表現(xiàn)出比結(jié)合物顯著長的保持。DTT處理不導(dǎo)致結(jié)合物結(jié)構(gòu)的任何變化，此結(jié)構(gòu)是在膠和HPLC分析基礎(chǔ)上，表明結(jié)構(gòu)中缺乏二硫化物且所有硫醇基團參與結(jié)合反應(yīng)。結(jié)合物結(jié)構(gòu)也通過空氣協(xié)助的電噴射質(zhì)譜來確定。
35S放射性標(biāo)記結(jié)合物NG1。代表(NG1)結(jié)合物用35S標(biāo)記并分析Hep G2和HepG2 2.2.15細(xì)胞中的細(xì)胞吸收。35S放射性標(biāo)記用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(LifeTechnologies，Grand Islang，NY)和[35S]dATP S(＞1000 Ci/微摩)(AmershamBiotech，Piscataway，NJ)的組合作用在3’-末端結(jié)合。所有35S標(biāo)記寡聚物在用于細(xì)胞實驗前通過Sephadex G25柱或Sep-Pak柱體純化。
比較結(jié)合方法1和結(jié)合方法2。
結(jié)合方法1是發(fā)展早于本發(fā)明的綜合結(jié)合方法。它成功用于從寡核苷酸甲基膦酸酯(如結(jié)合物10)和它們含交替磷酸二酯-甲基膦酸酯主鏈的類似物(如結(jié)合物1d，表5)中合成A-L-P結(jié)合物。它提供了方法用于構(gòu)建物這些化學(xué)-確定和結(jié)構(gòu)均一的A-L-P結(jié)合物并在本發(fā)明中發(fā)揮重要作用。然而，此方法需要一些改進(jìn)1)需要最小化副反應(yīng)。這些副反應(yīng)包括EDAC-加合物形成、未反應(yīng)SMCC和硫醇寡聚物的結(jié)合、水解SMCC和硫醇寡聚物的結(jié)合。這些副反應(yīng)減少產(chǎn)物形成量并產(chǎn)生需要使用PAGE作為一種純化方法的混合物，這進(jìn)一步使總產(chǎn)量減少到約25％。2)需要精確化學(xué)以使用此方法合成有其它主鏈寡聚物的A-L-P結(jié)合物，如硫代磷酸酯。在修飾5’-磷酸中使用EDAC和胱胺不適于此類寡聚物。3)32P標(biāo)記不能在完成配體結(jié)合后進(jìn)行。由于此標(biāo)記相對短的半衰期，當(dāng)需要新的32P標(biāo)記結(jié)合物時，必須重復(fù)整個結(jié)合過程。
結(jié)合方法2提供對方法1的顯著改進(jìn)，改進(jìn)是在其寡聚物和配體的定量結(jié)合、所有寡聚物主鏈類型的通用相容性、結(jié)合物的簡單純化和放射性標(biāo)記結(jié)合物中的靈活性。這些改進(jìn)通過完成下列方法2中的獨特過程來獲得1)在固相合成中通過結(jié)合硫醇接頭到寡聚物構(gòu)建物，防止寡核苷酸類似物的合成后修飾。這去除了方法1中發(fā)現(xiàn)的EDAC-加合物形成。這也使合成一些主鏈類型的寡核苷酸結(jié)合物有可能，結(jié)合物對EDAC-修飾敏感如硫代磷酸酯寡核苷酸。因此有可能合成所有寡核苷酸類似物類型的A-L-P結(jié)合物，硫醇接頭可結(jié)合到它們的結(jié)構(gòu)中。
2)通過合成活化配體支架、YEE(ah-GalNAc)3-SMCC并在用于結(jié)合反應(yīng)前純化到均一，去除了不需要的結(jié)合物如有未反應(yīng)SMCC和水解SMCC的結(jié)合物。純化的活化配體可大量制備，保存-20℃冰箱，在結(jié)合時可使用。因此防止了重復(fù)合成活化配體的必需。
3)通過在嚴(yán)格脫氣條件下進(jìn)行硫醇寡聚物純化和結(jié)合反應(yīng)來最小化硫醇寡聚物的二聚化到無法檢測的水平。本發(fā)明脫氣條件指溫和的厭氧情況，指低氧更優(yōu)選，指沒有氧存在最優(yōu)選。優(yōu)選去除任何未反應(yīng)試劑和其它低分子量硫醇-包含雜質(zhì)的痕跡。這通過脫氣G-25純化硫醇寡聚物中所用溶劑、使用結(jié)合反應(yīng)中立即新收集的硫醇寡聚物G-25部分、在真空條件中進(jìn)行結(jié)合來完成。這些預(yù)防措施在結(jié)合反應(yīng)中結(jié)合純SMCC-修飾配體和純硫醇寡聚物的使用，形成獲得定量結(jié)合寡聚物的基礎(chǔ)。
4)去除副反應(yīng)和所得定量結(jié)合反應(yīng)使利用簡單G-25純化方法獲得純結(jié)合物有可能。因此，去除了方法1中必須的PAGE純化。這使總產(chǎn)量中純結(jié)合物大于95％。
5)任選結(jié)合3’-示蹤物單元到寡聚物構(gòu)建物，在放射性標(biāo)記所有主鏈類型的最終結(jié)合物中產(chǎn)生極端靈活性?？芍苽浣Y(jié)合物并同時大量保存，需要時可被稍后標(biāo)記如在用于細(xì)胞吸收和生物分布實驗前。如方法1中的情況，這去除了反復(fù)合成相同結(jié)合物用于放射性標(biāo)記的需要。
由于結(jié)合方法2的這些優(yōu)勢，它成為我們自發(fā)明后的常規(guī)結(jié)合方法。我們的生物功效研究中所用的A-L-P結(jié)合物都通過此方法合成。
細(xì)胞吸收實驗實施例4此例子描述了用于細(xì)胞吸收實驗Hep G2細(xì)胞、Hep G2 2.2.15細(xì)胞、HT 1080或HL-60細(xì)胞的材料和方法。
材料添加L-谷氨酰胺的Earle鹽極限必須培養(yǎng)基(MEM)、Dulbecco氏修飾Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)、添加L-谷氨酰胺的RPMI培養(yǎng)基1640(RPMI)、Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS)、胎牛血清(FCS)、丙酮酸鈉(100mM)、非必須氨基酸(10mM)、水合碳酸氫鈉(7.5％)和胰蛋白酶(0.25％；在有1.0mM EDTA的HBSS中制備)購自GIBCO BRL。人肝細(xì)胞癌(Hep G2)(ATCC HB 8065)、人纖維肉瘤(HT 1080)和人前髓細(xì)胞白血病(HL-60)細(xì)胞購自ATCC。Hep G2 2.2.15，一種用人乙肝病毒DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(Hep G2 2.2.15)(Sell等，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.，841005-1009)是G.Y.Wu博士的饋贈。其它適當(dāng)細(xì)胞系對本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例如PLC/PRF/5(Alexander細(xì)胞)、人肝細(xì)胞瘤分泌乙肝表面抗原被描述(Jacinta，S.，(1979)，Nature.，282617-618)且可從American Type Culture Collection獲得。
細(xì)胞維持在添加10％胎牛血清(FCS)、1mM丙酮酸鈉和0.1mM非必須氨基酸的1xMEM或添加10％FCS(Hep G2)的1xRPMI、添加10％FCS(Hep G2 2.2.15)的1xRPMI、添加10％FCS(HT 1080)的1xD-MEM或添加10％FCS(HL-60)的1xRPMI中。硅油開始獲增自General Electric(#SF1250)且隨后購自Nye Lubricant有限公司(#98-0704)。細(xì)胞用購自Coulter ElectronicsCoulter的細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。
方法Hep G2、Hep G2 2.2.15和HT 1080細(xì)胞傳代到2cm孔中并在合適培養(yǎng)基生長到約2-4×105個細(xì)胞每孔的密度。吸出維持液且細(xì)胞用0.5mL含2％FCS的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)并在[5’-32P]-標(biāo)記10中達(dá)到1μM。規(guī)定時間過去后，保存5μL等分培養(yǎng)基用于閃爍計數(shù)且剩余物從孔中吸出。細(xì)胞用D-PBS(2×0.5mL)洗，0.25％胰蛋白酶處理(37℃，2分鐘)并懸浮于含10％FCS的新配生長培養(yǎng)基。懸浮細(xì)胞在1.7mL錐形微離心管中的硅油(0.5mL)上鋪層并通過14,000rpm(12,000g)離心30秒沉淀。小心倒出上清且細(xì)胞用100μL溶液裂解，溶液含0.5％NP40、100mM氯化鈉、14mM Tris(HCl和30％乙腈)。放射性的量通過閃爍計數(shù)推斷與細(xì)胞裂解物相聯(lián)10的量來確定。
添加2％FCS并在[32P]-10中達(dá)到1μM的RPMI培養(yǎng)基用7.5×106個HL60細(xì)胞室溫預(yù)處理5分鐘。細(xì)胞通過離心(5分鐘)取出。倒出培養(yǎng)基并加入7.5×106個新HL60細(xì)胞。細(xì)胞均勻懸浮且細(xì)胞懸浮液分成六個0.4mL部分。剩余物棄去。細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)定時間，隨后通過離心(5分鐘)收集，重懸浮于0.5mL D-PBS并鋪層于1.7mL錐形微離心管中的硅油上。細(xì)胞通過離心(12,000g，30秒)沉淀，裂解，細(xì)胞相關(guān)的[32P]-標(biāo)記物質(zhì)通過閃爍計數(shù)確定。
實施例5此例子闡述了體外Hep G2細(xì)胞對10的攝取。在此情況中，10用結(jié)合方法1合成。
檢測單獨和存在100當(dāng)量游離新糖肽5時結(jié)合物10的細(xì)胞組合，Hep G2細(xì)胞證明細(xì)胞吸收是10的新糖肽部分結(jié)合肝碳水化合物受體的結(jié)果。作為對照，5’-末端乙二胺修飾的寡核苷酸甲基膦酸酯(圖2)也在相同條件下用Hep G2細(xì)胞培養(yǎng)。乙二胺修飾5’-磷酸是通過在含0.1M咪唑的pH7緩沖液中用0.1M EDAC培養(yǎng)5’-磷酸化的2來完成，培養(yǎng)在37℃進(jìn)行2小時，接著用緩沖到pH7.0的水溶液0.3M鹽酸乙二胺過夜培養(yǎng)(Miller，P.S.；Levis，J.T.，結(jié)果未發(fā)表)。此修飾防止細(xì)胞磷酸酶活性去除5’-磷酸。
在各情況中，修飾的寡核苷酸甲基膦酸酯以1μM濃度存在于含2％胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中且培養(yǎng)在37℃進(jìn)行。單獨培養(yǎng)時結(jié)合物迅速結(jié)合細(xì)胞，僅兩小時后以線性方式將細(xì)胞加入至7.8pmol每106細(xì)胞程度(圖6)。相反，當(dāng)100倍過量的游離5與1μM結(jié)合物一起存在時，10的結(jié)合僅為0.42pmol每106細(xì)胞，此值與對照寡核苷酸甲基膦酸酯6b獲得的值基本相同，寡核苷酸甲基膦酸酯6b不包含新糖肽(0.49pmol每106細(xì)胞)。作為另外的對照，Hep G2細(xì)胞在存在10倍過量的5時用6b培養(yǎng)，從而盡管缺乏5和6b間的共價建，5可引起Hep G2細(xì)胞吸收6b。兩小時培養(yǎng)后細(xì)胞相聯(lián)6b的量僅為0.60pmol每106細(xì)胞，顯著少于用結(jié)合物10的。此外，檢測更長時間Hep G2細(xì)胞對10的攝取(1μM結(jié)合物，37℃)，發(fā)現(xiàn)它線性增長至約24小時，到達(dá)26.6pmol每106細(xì)胞的值(圖7)。這些實驗結(jié)果表明(1)結(jié)合物10通過特異結(jié)合至脫唾液酸糖蛋白受體來與Hep G2細(xì)胞相聯(lián)；(2)寡核苷酸甲基膦酸酯和新糖肽間的共價建對于顯著提高寡核苷酸甲基膦酸酯與Hep G2細(xì)胞聯(lián)合是必須的；(3)Hep G2細(xì)胞對10的攝取在此研究所用條件下直到24小時才飽和。
實施例6此例子闡述了10對肝來源細(xì)胞(Hep G2)的特異性。
也檢測了化合物的細(xì)胞-類型特異性。已很好確定脫唾液酸糖蛋白受體發(fā)現(xiàn)于肝細(xì)胞表面并代表選擇性靶向此組織的一種有效方法用于傳遞多種治療劑(Wu和Wu(編輯)，(1991)，肝臟疾病，用特異受體和配體的靶診斷和治療(LiverDisease，Target Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands)，MarcelDekker有限公司，紐約)。通過在含1μM結(jié)合物10和2％FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)三種人細(xì)胞系Hep G2、HL-60和HT 1080來檢測組織特異性，培養(yǎng)在37℃進(jìn)行3和24小時。表現(xiàn)出顯著吸收10的唯一細(xì)胞系是Hep G2。培養(yǎng)3和24小時后，8.5和26.7pmol每106細(xì)胞分別與Hep G2細(xì)胞相聯(lián)(圖8)。相反，24小時后僅0.10和0.53pmol每106細(xì)胞分別與HL-60細(xì)胞和HT 1080細(xì)胞相聯(lián)。
實施例7(圖9)此例子闡述了含寡聚物的肝臟特異新糖結(jié)合物的攝取，寡聚物包括其它核酸酶抗性主鏈。
上述例子說明OMNP’s可結(jié)合肝特異配體YEE(ahGalNAc)3以產(chǎn)生均一和確定的新糖結(jié)合物。此外，該新糖結(jié)合物由肝-獲得細(xì)胞(Hep G2)特異吸收且在體外速度增加。上述結(jié)果擴展到考慮有其它核酸酶抗性主鏈修飾的寡核苷酸，如含2’O甲基核糖部分和交替磷酸二酯/甲基膦酸酯鍵(2’Ome-po/mp)的硫代磷酸酯(ps)寡聚物。實驗方法與實施例4和5中所用相同。這些實驗結(jié)果非常類似于用含新糖結(jié)合物的OMNP所觀察到的。根據(jù)結(jié)合方法2合成含硫代磷酸酯寡聚物的新糖結(jié)合物。YEE(ahGalNAc)3-SMCC-ps5’GTTCTCCATGTTCAG3’(NG-1)用結(jié)合方法2中所述3’-末端標(biāo)記方法來35S-標(biāo)記，表現(xiàn)出的線性增長在24小時達(dá)到17.25皮摩/106細(xì)胞程度。相反，Hep G2細(xì)胞以降低的速度吸收相應(yīng)未結(jié)合寡聚物ps5’GTTCTCCATGTTCAG3’，在24小時達(dá)到1.01皮摩/106細(xì)胞。以類似方式，含2’OMe交替po/mp寡聚物的新糖結(jié)合物(YEE(ahGalNAc)3-SMCC-2’OMe5’AGpUCpAGpUCpAGpUCpAGpU3’)表現(xiàn)出線性增長，在24小時達(dá)到24.3皮摩/106細(xì)胞程度。相應(yīng)未結(jié)合寡聚物(2’OMe5’AGpUCpAGpUCpAGpUCpAGpU3’)在所有試驗時間點表現(xiàn)出小于1皮摩/106細(xì)胞的最小吸收。所有寡聚物和新糖結(jié)合物在細(xì)胞培養(yǎng)基中穩(wěn)定至24小時。這些結(jié)果表明獨特配體-接頭復(fù)合體的傳遞效用并給我們將此系統(tǒng)擴展至傳遞其它治療劑的平臺。
實施例8(圖10)此例子闡述了體外Hep G2 2.2.15細(xì)胞對含寡聚物的肝臟特異新糖結(jié)合物的攝取，寡聚物包括核酸酶抗性主鏈。
Hep G2 2.2.15細(xì)胞是用乙肝病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞瘤細(xì)胞。通過結(jié)合方法2合成和標(biāo)記實施例7中所引用2’OMe po/mp和ps，它們的細(xì)胞吸收用實施例4和5中所述方法分析。結(jié)果非常類似于實施例7中所述細(xì)胞吸收實驗。含ps寡聚物的新糖結(jié)合物表現(xiàn)出線性和迅速的攝取，在24小時達(dá)到20皮摩/106細(xì)胞，而相應(yīng)未結(jié)合ps-寡聚物聯(lián)合較差，在24小時小于1.0皮摩/106細(xì)胞(圖10)。以類似方式，Hep G2 2.2.15細(xì)胞以迅速和線性速度吸收含2’OMe po/mp寡聚物的新糖結(jié)合物到28.52皮摩/106細(xì)胞程度，24小時培養(yǎng)后吸收少于1.0皮摩/106細(xì)胞的相應(yīng)未結(jié)合寡聚物。細(xì)胞培養(yǎng)基中的新糖結(jié)合物和未結(jié)合寡聚物穩(wěn)定性通過聚丙烯酰胺凝膠電泳確定。37℃培養(yǎng)至96小時都沒有檢測到降解產(chǎn)物。
前述用32P-標(biāo)記寡核苷酸甲基膦酸酯結(jié)合物的Hep G2細(xì)胞吸收實驗擴展到檢測含新糖肽5的新糖結(jié)合物與具其它核酸酶抗性主鏈的寡聚物的聯(lián)合，最顯著的是ps和2’OMe po/mp。含硫代磷酸酯寡聚物的新糖結(jié)合物、YEE(ahGalNAc)3-SMCC-ps5’GTTCTCCATGTTCAG3’(NG-1)用結(jié)合方法2標(biāo)記，表現(xiàn)出的線性增長在24小時達(dá)到17.25皮摩/106細(xì)胞程度。相反，Hep G2細(xì)胞以降低的速度吸收相應(yīng)未結(jié)合寡聚物ps5’GTTCTCCATGTTCAG3’，在24小時達(dá)到1.01皮摩/106細(xì)胞。以類似方式，含2’OMe交替po/mp寡聚物的新糖結(jié)合物(YEE(ahGalNAc)3-SMCC-2’OMe5’AGpUCpAGpUCpAGpUCpAGpU3’)表現(xiàn)出線性增長，在24小時達(dá)到28.52皮摩/106細(xì)胞程度(圖9；標(biāo)6)。相應(yīng)未結(jié)合寡聚物(2’OMe5’AGpUCpAGpUCpAGpUCpAGpU3’)表現(xiàn)出小于1皮摩/106細(xì)胞的最小吸收。這些結(jié)果表明獨特配體-接頭復(fù)合體的傳遞效用產(chǎn)生將此系統(tǒng)擴展至傳遞其它治療劑的平臺。
Hep G2細(xì)胞中觀察到的細(xì)胞吸收增加也在Hep G2 2.2.15細(xì)胞中明顯(圖10a)。含ps寡聚物的新糖結(jié)合物表現(xiàn)出線性和迅速的攝取，在24小時達(dá)到20皮摩/106細(xì)胞，而相應(yīng)未結(jié)合ps-寡聚物聯(lián)合較差，在24小時小于1.0皮摩/106細(xì)胞(圖10)。以類似方式，Hep G2 2.2.15細(xì)胞以迅速和線性速度吸收含2’OMe po/mp寡聚物的新糖結(jié)合物到28.97皮摩/106程度(圖10b；表7)，24小時培養(yǎng)后吸收少于1皮摩/106細(xì)胞的相應(yīng)未結(jié)合寡聚物。研究者用其它肝臟特異配體觀察到類似結(jié)果且得出用HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不改變這些細(xì)胞中受體活性的結(jié)論(Wands等，1997，同上)。然而證明這些傳遞系統(tǒng)僅傳遞帶電sa-寡聚物。此報導(dǎo)中所用肝臟特異配體顯示有提高的效用，它可以類似有效程度增加細(xì)胞吸收無電荷ONMP’s、帶電sa-寡聚物和一半帶電的2’OMe ONMP/磷酸二酯交替寡聚物。
表6-培養(yǎng)中Hep G2 2.2.15細(xì)胞對結(jié)合YEE(ahGalNAc)3-SMCC-AET-2’O-Me5’AGpUCpAGpUCpAGpUCpAGpU3’(1d)和EDA-2’O-Me-5’AGpUCpAGpUCpAGpUCpAGpU3’(1e)的攝取(皮摩/106細(xì)胞)

表7-培養(yǎng)中Hep G2 2.2.15細(xì)胞對YEE(ahGalNAc)3-SMCC-S(CH2)6-ps-2’O-Me-5’AGpUCpAGpUCpAGpUCpAGpU3’-UMdT*3’-3’(dT-T)-32P-EDA(1c)(皮摩/106細(xì)胞)

整體動物分布和藥物動力學(xué)實施例9此例子闡述了用32P-標(biāo)記的A-L-P結(jié)合物(10)作為例子的整體動物實驗中所用材料和方法。
材料Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水pH7.2購自Meditech(Stefling，VA)?？扇艿慕M織增溶劑購自Life Technologies(Grand Island，NY)。細(xì)胞閃爍流體購自(ICNCostaMesa，CA)。閃爍小瓶購自Kimble Glass(Vineland，NJ)。無水乙醚購自J.T.Baker，Sanford，ME。CD-1雄性小鼠(22-35克體重)獲得自Charles River(Wilmington，MA)。Centricon過濾器(30,000MWC)獲得自(Millipore，Bedford，MA)。組織樣品用Polytron勻漿器PCU2-110型(Brinkman Inst.，Westbury，NY)勻漿化。
方法簡言之，親代寡脫氧核苷甲基膦酸酯(寡核苷酸甲基膦酸酯)、UmpT7用[32P]-ATP和ATP標(biāo)記5’-末端以產(chǎn)生有300μCi/14nmol特異活性的p*UmpT7(*指示放射性核素的位置)。5’磷酸在1-甲基咪唑和水可溶碳二亞胺存在時用胱胺修飾。所得二硫化物用過量二硫蘇糖醇還原并用異生物功能交聯(lián)劑SMCC結(jié)合配體YEE(ahGalNAc)3。結(jié)合物10即YEE(ahGalNAc)3-SMCC-AET-pUmpT7通過凝膠電泳純化，從膠提取并用SepPak柱體脫鹽。確定純結(jié)合物的酶和化學(xué)特征。部分結(jié)合物用N-乙酰氨基葡糖酰胺酶處理以完全去除GalNAc殘基來產(chǎn)生11即[YEE(ah)3]-SMCC-AET-pUmpT7(Trubestskoy等，(1992)，Bioconjugate Chem.，3323-327)。10和11通過PAGE分析都認(rèn)為＞99％純度。在制備整體動物生物分布和藥物動力學(xué)中，含結(jié)合物的溶液置于無菌試驗管并在無菌條件下凍干。
結(jié)合物10和11在無菌水中復(fù)蒸餾。體重22到35g的雄性CD-1小鼠(CharlesRiver)接受經(jīng)靜脈末端的單次注射7-30皮摩爾的[32P]-YEE(ahGalNAc)3-SMCC-AET-pUmpT7(10)或7皮摩的[32P]-[YEE(ah)3]SMCC-AET-pUmpT7(11)，它們包含在0.2mL鹽水中。小鼠在15、30和60分鐘以及2、4、6和24小時通過頸脫臼殺死。收集血液、肝臟、腎、脾、肌肉、上和下胃腸道及糞并稱重。稱重來自這些器官和組織的代表樣品并置于玻璃小瓶。為收集尿(注射后2小時)，在短暫乙醚麻醉下結(jié)扎小鼠的外尿道，殺死后取出膀胱并置于玻璃小瓶。將Solvables(NEN；1mL)加入各樣品。樣品隨后置于玻片溫?zé)嵫b置上以過夜消化并在第二天早上取出冷卻。消化樣品用3到7滴H2O2(30％w/v)脫色，加入10mL Formula989(NEN)閃爍混合物。放射性量通過閃爍計數(shù)確定(Packard 1900 TR；＜3％誤差)。注射劑量的等分樣品和樣品一起計數(shù)以計算百分比劑量每器官或克組織。
體重22到35g的雄性CD-1小鼠接受經(jīng)靜脈末端的單次注射40皮摩的[32P]-YEE(ahGalNAc)3-SMCC-AET-pUmpT7(10)。動物在15、60和120分鐘后殺死。如前收集肝臟和膀胱，置于塑料小瓶且立即冷凍于-80℃。肝臟樣品解凍到0℃并稱重(平均質(zhì)量0.25g)。組織在4體積乙腈/水(1∶1)中勻漿化(Polytron PCU-2-110組織勻漿器)。組織碎片通過離心(10,000g，20分鐘，0℃；Sorval RC-5B型冷卻超速離心機)去除。取出上清且重復(fù)提取過程。通過比較脫色勻漿和上清的等分樣品，來自肝臟樣品放射性的一般回收確定為90％。部分上清通過Centricon過濾器(30,000MWC；20分鐘，0℃，10,000g；Hermal Z 360K冷卻微離心機)過濾并凍干。剩余物在制備中復(fù)蒸餾于10mL甲酰胺加樣緩沖液(90％甲酰胺、10％1×TBE、0.2％溴酚藍(lán)和0.2％二甲苯藍(lán))中用于通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE；15％，20×20×0.75cm，2V/cm，45分鐘)分析。尿收集自解凍到0℃的膀胱，用0℃乙醇(1∶2v/v)脫蛋白質(zhì)30分鐘。沉淀的蛋白質(zhì)通過離心(16,000g，20分鐘，0℃)去除。通過比較上清和蛋白質(zhì)沉淀，放射性回收估計為90％。部分上清凍干，再溶解于甲酰胺加樣緩沖液中并通過PAGE(15％，20×20×0.75cm，2V/cm，45分鐘)分析。在不同反應(yīng)中用50mM檸檬酸鈉pH5.0中的N-乙酰-葡糖酰胺酶、含200mM KCl的10mM Tris(HCl pH8.0中的胰凝乳蛋白酶和0.1N HCl 37℃培養(yǎng)全長結(jié)合物1030分鐘來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)。
細(xì)胞(約105)在含1μM[32P]-標(biāo)記10的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2、4、8、16和24小時，用PBS(2x)洗，通過硅油沉淀并裂解(0.5％NP 40、100mM氯化鈉、14mM Tris-HClpH7.5和30％CAN)。裂解物用50％水合乙腈(v/v)提取兩次。提取物凍干，再溶解于甲酰胺加樣緩沖液中并通過PAGE(15％，2V/cm，30分鐘)分析。
實施例10此例子闡述的整體動物實驗用于試驗傳遞載體特異傳送合成寡核苷酸甲基膦酸酯到小鼠肝臟的能力，載體含脫唾液酸糖蛋白配體、YEE(ahGalNAe)3且用32P放射性標(biāo)記(圖11和12)。
為了比較，也合成和測試缺乏三個末端GalNAc殘基的結(jié)合物。此無糖結(jié)合物用作小鼠中配體(GalNAc)-特異吸收研究的對照。
為研究體內(nèi)結(jié)合物10的組織和器官分布，如上所述小鼠經(jīng)靜脈末端注射放射性標(biāo)記的結(jié)合物且各器官相聯(lián)放射性的量通過閃爍計數(shù)確定。表8顯示結(jié)合物與肝臟相聯(lián)程度最大，注射后15分鐘值達(dá)到69.9％的注射劑量。注射后15分鐘其它組織中測得總放射性的降序排列是肌肉＞腎＞血液＞脾。尿的放射性峰值是28％的注射劑量且在30分鐘后達(dá)到。腎和血液相聯(lián)的放射性量隨著時間減少。值得注意的是，盡管預(yù)期肝臟中產(chǎn)生的結(jié)合物的代謝物會通過膽汁分泌沉淀在胃腸道，少量放射性與膽囊、上和下胃腸道和糞相聯(lián)。當(dāng)小鼠注射低劑量(7皮摩)新糖結(jié)合物10時，觀察到類似結(jié)果(圖11；表9)。
表10顯示缺乏三個末端GalNAc殘基的結(jié)合物11分布順序為肌肉＞血液＞腎＞肝臟＞脾。盡管與血液和腎相聯(lián)，肌肉和肝臟放射性的量保持恒定，且在24小時的研究中降低。注射后30分鐘尿中放射性的峰值為39.9％(圖12)。
實施例11此例子闡述的整體動物實驗用于試驗發(fā)明的傳遞載體特異傳送合成、核酸酶抗性硫代磷酸酯寡聚物到小鼠肝臟的能力，載體含脫唾液酸糖蛋白配體、YEE(ahGalNAc)3且用35S放射性標(biāo)記(圖13)。
雄性CD-1小鼠如實施例9所述注射30皮摩的新糖結(jié)合物YEE(ahGalNAc)3-SMCC-ps-(TTTATAAGGGTCGATGTCCAT)-{35S}(psA)n，新糖結(jié)合物用結(jié)合方法2中所述3’-末端標(biāo)記方法標(biāo)記。為了比較，也合成缺乏三個末端GalNAc殘基的結(jié)合物YEE(ah)3-SMCC-ps-(TTTATAAGGGTCGATGTCCAT)-(psA)n{35S}。此無糖結(jié)合物用作小鼠中配體(GalNAc)-特異吸收研究的對照。實驗結(jié)果非常類似于實施例10中所觀察到的。含末端糖基的結(jié)合物與肝臟相聯(lián)程度最大，注射后15分鐘值達(dá)到46.19％的注射劑量。注射后15分鐘其它組織中測得總放射性的降序排列是肌肉＞血液＞腎＞脾。尿的放射性峰值是4.51％的注射劑量且在30分鐘后達(dá)到。腎和血液相聯(lián)的放射性量隨著時間減少。
缺乏三個末端GalNAc殘基的結(jié)合物以降低的速度被肝臟吸收，30分鐘時達(dá)到23.67％注射劑量的峰值。此結(jié)合物4小時內(nèi)從血液和尿中清除。
實施例12此例子闡述了聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)合物10的代謝物，10分離自小鼠肝臟和Hep G2細(xì)胞。
圖14顯示用Hep G2細(xì)胞培養(yǎng)2到24小時后PAGE分析結(jié)合物10代謝物的結(jié)果。根據(jù)它們相對對照反應(yīng)的電泳遷移率鑒定了三種代謝物(圖14；標(biāo)為I-III)。I型似乎由四種化學(xué)上不同的種類組成，其中I和II在所有時間點占優(yōu)勢。I和II的分布在最早時間點約為1∶1，在較長培養(yǎng)時間轉(zhuǎn)變成II占優(yōu)勢。此類型的第三種代謝物也在各時間點觀察到，它與胰凝乳蛋白酶消化I產(chǎn)生的物質(zhì)共移動。此種類的相對量保持恒定至最終的時間點(24小時)，在最終時間點只有少量剩余。在所有時間點除了最后觀察到第四種未鑒定種類，遷移率稍低于3。所有類型I的代謝物量到最終時間點逐漸減少。類型II的代謝物由放射性標(biāo)記種類組成，此種類與類型I相比電泳遷移率高許多。觀察到至少五條帶，然而不是所有都存在于各時間點。例如，最高和最低遷移率位置的帶增加到16小時時間點，接著在24小時減少。在占優(yōu)勢種類中觀察到相同表現(xiàn)。此帶的最大強度出現(xiàn)在8小時，接著到24小時逐步降低。如用類型I的代謝物所觀察到的，所有類型II的代謝物量在24小時時間點減少。類型II的代謝物在膠基質(zhì)中很穩(wěn)定，大部分保持在聚丙烯酰胺膠的孔中。此帶的強度隨著時間增加，在24小時到達(dá)最大值。
表8.以30pmol劑量水平靜脈內(nèi)注射的小鼠中[32P]-[YEE(ahGalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7的動力學(xué)

a值報導(dǎo)為三個動物中平均百分比注射劑量每器官±一個標(biāo)準(zhǔn)偏差。約0.5微Ci(30pmol)靜脈內(nèi)進(jìn)入各小鼠。各器官的質(zhì)量單獨確定并用于從注射的結(jié)合物百分比劑量每克組織中測定百分比劑量每器官。各器官或組織質(zhì)量的典型值為血液＝0.07×體重；肝臟＝1.6+0.21g；脾＝0.17+0.05g；腎＝0.6+0.1g；肌肉＝1.4×體重。平均體重是32.4±2.0g(標(biāo)準(zhǔn)偏差；n＝21)。尿中放射性的峰值為27.7±20.2％的的注射劑量。大標(biāo)準(zhǔn)偏差反映了尿生成和各動物間收集完全中的變化。
b值來自單次測定。
c值是兩個獨立測定的平均值。
表9.靜脈內(nèi)注射[32P]-[YEE(ah-GalNAc)3]-SMCC-AET-pUmpT7后各器官積聚的百分比注射劑量

a值報導(dǎo)為三個動物中平均百分比注射劑量每器官±一個標(biāo)準(zhǔn)偏差。約0.1微Ci(7pmol)靜脈內(nèi)進(jìn)入各小鼠。下列值用于從百分比劑量每克組織中測定百分比劑量每器官；血液質(zhì)量＝0.07×體重；肝臟質(zhì)量＝1.14g；脾質(zhì)量＝0.124g；腎＝0.4g；肌肉質(zhì)量＝0.4×體重。平均體重是23.7±1.2g(標(biāo)準(zhǔn)偏差；n＝15)。30分鐘時尿中放射性的峰值為17.1±10.2％的注射劑量。大標(biāo)準(zhǔn)偏差反映了尿生成和各動物間收集完全中的變化。
表10.靜脈內(nèi)注射后[32P]-[YEE(ah)3]-SMCC-AET-pUmpT7的動力學(xué)

a值報導(dǎo)為三個動物的平均值±一個標(biāo)準(zhǔn)偏差。約0.1微Ci(7pmol)結(jié)合物靜脈內(nèi)進(jìn)入各小鼠。下列值用于從百分比劑量每克組織中測定百分比劑量每器官；血液質(zhì)量＝0.07×體重；肝臟質(zhì)量＝1.14g；脾質(zhì)量＝0.124g；腎＝0.4g；肌肉質(zhì)量＝0.4×體重。平均體重是23.7±1.2g(標(biāo)準(zhǔn)偏差；n＝15)。30分鐘時尿中放射性的峰值為36.9+13.5％的注射劑量。大標(biāo)準(zhǔn)偏差反映了尿生成和各動物間收集完全中的變化。b值是兩個獨立測定的平均值。
完整小鼠肝臟中10的代謝命運分析以類似方式進(jìn)行。圖15顯示獲得自小鼠肝臟樣品的肝臟勻漿提取物的PAGE分析結(jié)果，小鼠用[32P]-標(biāo)記的結(jié)合物10注射。
注射后15分鐘，剩余顯著量的完整結(jié)合物10(圖14；類型I代謝物)。膠的分辨率不足以分辨兩種類型。此樣品中放射性標(biāo)記種類的剩余物移動顯著快于不與任何對照共移動的I和II。這些代謝物有更寬范圍的遷移率且最慢的移動顯著低于用Hep G2細(xì)胞鑒定的類型II代謝物(類型II’)。在稍后時間點幾乎所有完整的10(圖16)消失，其中類型II代謝物量增加。
圖17顯示靜脈內(nèi)施用放射性標(biāo)記結(jié)合物10后小鼠尿中觀察到的代謝物模式。類型I的代謝物是唯一檢測到的放射性標(biāo)記種類。結(jié)合物大部分完整，有少但顯著量的物質(zhì)轉(zhuǎn)變成兩種不與任何對照共移動的類型。各種類的相對量在實驗進(jìn)程中保持恒定。在小鼠尿中沒有觀察到類型II、II’、III代謝物。
本文所述證據(jù)表明化學(xué)確定和均一的[32P]-標(biāo)記結(jié)合物10能以配體和細(xì)胞類型都特異的方式穿過Hep G2細(xì)胞的細(xì)胞膜。這些研究的邏輯延伸用于確定體內(nèi)I的組織分布并比較10體外和體內(nèi)的代謝命運，比較此數(shù)據(jù)和用缺乏三個末端GalNAc殘基的結(jié)合物11獲得的數(shù)據(jù)。
體內(nèi)組織分布數(shù)據(jù)確認(rèn)通過培養(yǎng)人細(xì)胞獲得的結(jié)果。高度選擇性靶向寡脫氧核苷甲基膦酸酯到肝臟(70±10％的i.d.)通過共價附著寡聚物和脫唾液酸糖蛋白受體(ASGP)配體YEE(ah)3來有效獲得。確實在整體組織測量中，肝臟中結(jié)合物濃度比血液中高25倍且比肌肉中約高10倍(圖11)。由于脾、肺和腎也聚集放射性標(biāo)記的寡脫氧核苷酸，復(fù)合體對肝臟的優(yōu)先性很小(如注射后5分鐘各組織分布分別為約6、4、2和2％的注射劑量每克；(Lu等，1994，同上)。進(jìn)一步的興趣是比較我們的結(jié)果和Eichler等(1992，同上)報導(dǎo)的結(jié)果，其中肝臟吸收的生物分布和速度在鼠中確定用于hypolipidaemic劑ansamycin，單獨和共價連接到另一個三-觸角ASGP配體N-[tris(β-D-吡喃型半乳糖苷(galactopyranosylosyl)甲基)-甲基]-N-d-(乙酰)甘氨酰胺(tris-乙酸半乳糖(galacetate))。作者報導(dǎo)游離藥物和結(jié)合物的肝臟吸收大致相同，使他們得出結(jié)論三觸角ASGP配體不提高大鼠肝臟吸收藥物。此結(jié)果與我們的發(fā)現(xiàn)相反，我們發(fā)現(xiàn)小鼠肝細(xì)胞的攝取通過共價附著配體YEE(ahGalNAc)3大為促進(jìn)。
作為對照，小鼠注射缺乏三個末端GalNAc殘基的結(jié)合物11，因此不能由ASGP配體識別。如所預(yù)期，肝臟中檢測到少量放射性且大許多的放射性量與其它組織相聯(lián)(圖12)。此結(jié)果擴展了我們前面的發(fā)現(xiàn)，放射性標(biāo)記寡核苷酸甲基膦酸酯靶向肝細(xì)胞是其共價附著配體的結(jié)果。
氚標(biāo)記12聚體(d-Tp*TCCTCCTGCGG)除了最后的5’末端磷酸二酯鍵都由甲基膦酸酯主鏈組成，此12聚體在小鼠中以單劑量靜脈內(nèi)注射。藥物施用后器官在2、5、10、30、60和120分鐘收集。數(shù)據(jù)顯示放射性不分布在肝臟、肺、肌肉或脾中，且從血漿中迅速消失進(jìn)入腎和尿。HPLC研究顯示完整12聚體通過酶裂解末端核苷代謝成11聚體且靜脈內(nèi)注射后都迅速消除進(jìn)入尿。因此，本文所報導(dǎo)結(jié)果與前面所得結(jié)果很一致，證明GalNAc末端在指導(dǎo)寡聚物結(jié)合物吸收入肝臟中的重要性。
上述結(jié)果擴展到考慮傳遞帶電、核酸酶抗性硫代磷酸酯寡聚物到CD-1小鼠的肝臟。結(jié)果證明含末端糖殘基的結(jié)合物以兩倍高于缺乏末端GalNAc殘基結(jié)合物的水平傳遞。與ONMP’s相比肝臟中高濃度含結(jié)合物的硫代磷酸酯是硫代磷酸酯寡聚物本身的特征且在文獻(xiàn)中注釋，結(jié)合物缺乏末端GalNAc殘基。然而結(jié)合物傳遞這些寡聚物到肝臟增加闡明了此方法用于特異傳遞不同電荷構(gòu)象的生物分子的效用，結(jié)合物含末端GalNAc殘基。
為了解結(jié)合物10在體外和體內(nèi)的代謝命運，我們通過PAGE分析檢測了獲得自Hep G2細(xì)胞以及小鼠肝臟和尿的提取物，細(xì)胞生長在培養(yǎng)物中。我們注意到三種代謝物(類型I-III)在Hep G2細(xì)胞和小鼠肝臟中產(chǎn)生，在小鼠肝臟中類型I代謝物分離自小鼠尿。由于配體降解產(chǎn)生類型I代謝物。兩種酶反應(yīng)用于模擬生成這些種類N-乙酰-葡糖酰胺酶和胰凝乳蛋白酶。前種處理產(chǎn)生移動稍快于1的2，這是由于失去三個末端GalNAe殘基導(dǎo)致質(zhì)量稍為減少。后一種處理導(dǎo)致遷移率顯著提高，這是由于失去大部分配體和從-1到-2總電荷的增加(圖16)。這兩種模式反應(yīng)產(chǎn)生有修飾配體的化合物，保持共價連接于完整的放射性標(biāo)記寡核苷酸甲基膦酸酯。因此合理推斷移動到相同膠區(qū)域的其它種類來自于配體降解而不是來自I其它不穩(wěn)定位點的鍵裂解。例如，水解單個氨基己基側(cè)鏈酰胺鍵產(chǎn)生質(zhì)量在2和3之間的5(圖16)且導(dǎo)致從-1到-2負(fù)電荷的增加。在此例子中，通過PAGE分析預(yù)期得到遷移率在2和3之間的種類。類型II代謝物移動顯著快于鑒定為類型I的。我們推測它們的產(chǎn)生是由于位于寡核苷酸甲基膦酸酯5’-末端單個磷酸二酯鍵的未預(yù)期水解。我們預(yù)見此位點在通過核酸內(nèi)切酶活性裂解時穩(wěn)定(Sproat等，1989，同上)，這是在用蛇毒磷酸二酯酶進(jìn)行的模式反應(yīng)基礎(chǔ)上，其中沒有觀察到裂解。此位點的裂解釋放來自10剩余物的寡核苷酸甲基膦酸酯的末端七個核苷，最重要的是生成攜帶單個核苷的相對低分子量種類，核苷含放射性標(biāo)記磷酸(圖16；15)配體的進(jìn)一步降解產(chǎn)生鑒定為類型II代謝物的多種類型。僅在Hep G2細(xì)胞中觀察到的類型III代謝物是含放射性磷的高分子量種類，在膠中移動距離短。放射性磷酸從I中釋放和它隨后結(jié)合到高分子量細(xì)胞結(jié)構(gòu)(核酸或蛋白質(zhì))引起了這條帶。有文獻(xiàn)記載內(nèi)體區(qū)室隨著成熟而酸化，與溶酶體融合前pH低至5.5(Schwartz，1985，同上)。此外，結(jié)合寡核苷酸甲基膦酸酯到配體的氨基磷酸酯鍵在酸性條件下傾向水解以產(chǎn)生13(圖16)。為測試內(nèi)體區(qū)室酸化導(dǎo)致P-N鍵水解的可能性，I在50mM檸檬酸鈉中pH5.5和6.037℃培養(yǎng)。我們觀察到I在pH6穩(wěn)定但24小時后在pH5.5大量水解成13(＞50％)且通過PAGE分析確定水解在氨基磷酸酯P-N鍵特異發(fā)生(數(shù)據(jù)未列出)。因此合理推斷結(jié)合放射性磷酸到細(xì)胞結(jié)構(gòu)是通過水解P-N鍵發(fā)生，水解由于含I的內(nèi)體區(qū)室酸化和通過磷酸酶活性釋放末端磷酸到細(xì)胞周圍環(huán)境。
在Hep G2細(xì)胞提取物中觀察到的代謝物分布包括各種代謝物。在早期時間點，大部分放射性包含在類型1種類中，主要是I和II。在較后時間點代謝物分布從類型I轉(zhuǎn)變成類型II和III，其中在取樣的最后時間點帶類型III代謝物的大部分放射性磷殘基指示實驗進(jìn)程中發(fā)生大量P-N鍵水解。顯然I一旦吸收到Hep G2細(xì)胞會被大幅代謝，表明胞內(nèi)傳遞反義寡核苷酸甲基膦酸酯或其它試劑通過此方法變得可行。
由于僅N-P鍵上的磷標(biāo)記32P，不可能測定寡核苷酸類似物的代謝物命運。因為寡核苷酸的廣泛代謝會不利地影響與胞內(nèi)互補核酸序列特異反應(yīng)的能力，將來需要進(jìn)行的研究使用在其它位置標(biāo)記的寡核苷酸序列。
來自小鼠肝臟和尿提取物的PAGE分析結(jié)果證明小鼠肝臟中代謝物生成在兩方面不同于用Hep G2細(xì)胞觀察到的。首先，產(chǎn)生類型II’代謝物的10的消化在肝臟中顯著加快，僅1小時后大部分放射性發(fā)現(xiàn)于這些種類中。第二，肝臟中類型II’代謝物的遷移率和分布不同于培養(yǎng)細(xì)胞中的類型II代謝物，表明小鼠肝臟和HepG2細(xì)胞遇到的酶活性不同。在2小時進(jìn)程中少量或沒有類型III代謝物產(chǎn)生，此結(jié)果與來自Hep G2細(xì)胞的結(jié)果一致。與小鼠肝臟中1的廣泛降解相反，尿中代謝物模式復(fù)雜性更小且僅由類型I代謝物組成。肝臟和尿觀察到的代謝物不同模式說明結(jié)合物傳遞入肝臟細(xì)胞且不僅位于器官的胞間隙。
化學(xué)確定、結(jié)構(gòu)均一的新糖肽-寡脫氧核苷甲基膦酸酯結(jié)合物10的體內(nèi)分布和代謝證明此結(jié)合物的傳遞高度有效，注射后15分鐘肝臟中達(dá)到約百分之70(70％)的注射劑量水平。與配體迅速和廣泛降解一起，這些結(jié)果表明此用于傳遞反義試劑甲基膦酸酯或其它類似物以及另外治療上有用試劑的方法非常有用。此外，這些結(jié)果證明診斷成像過程的可能性，過程利用與反義部分核酸特異性偶聯(lián)的配體組織特異性，提供了用迄今未實現(xiàn)的特異性在體內(nèi)測定細(xì)胞功能區(qū)域異常性的方法。
抗-HBV新糖結(jié)合物的生物功效實施例13此例子闡述了評估抗-HBV新糖結(jié)合物的生物功效中所用材料和方法。
材料Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水pH7.2、胰蛋白酶/EDTA(0.5％胰蛋白酶0.53mm EDTA)、RPMI和FCS購自Mediatech，(Sterling，VA)。G418和缺口翻譯試劑盒購自Life Technologies，(Grand Islang，NY)。Ausyme單克隆HBsAG檢測試劑盒購自Abbott實驗室(Napierville，IL)。HBsAG標(biāo)準(zhǔn)獲得自Chemicon(Temacia，CA)，32P dCTP獲得自Amersham，(Piscataway，NJ)且Probequant微旋轉(zhuǎn)柱購自PharmaciaBiotech，(Piscataway，NJ)。48孔組織培養(yǎng)處理平板購自Costar(Cambridge，MA)、1.5mL微離心管來自Sarstadt(Newton，NC)、GeneScreen尼龍膜來自NEN(Boston，MA)、BioTek EIA平板讀出器和-492nm波長過濾器來自BioTek，(Burlington，VT)且FujixBas 1000磷圖像儀(phosphoimager)和成象平板來自Fujix Medical Systems，(Stamford，CN)。Hep G2 2.2.15細(xì)胞是G.Wu博士的饋贈并維持在添加4％FCS的RPMI培養(yǎng)基上。細(xì)胞用Coulter計數(shù)器-模型ZBI(Coulter Electronics，Hialeah，F(xiàn)L)計數(shù)。HBV特異探針(AM-12的3.2kb片斷)是Georgetown University的Brent Korba博士的饋贈。
方法本研究中所用三種治療新糖結(jié)合物的合成通過結(jié)合下列前面顯示體外抑制HBV復(fù)制(Korba和Gerin，1995，同上)的ps-寡聚物和肝臟特異配體YEE(ah-GalNAc)3(1)5’GTTCTCCATGTTCAG3’，靶向表面抗原基因(sa-基因)的翻譯起始位置，(2)5’TTTATAAGGGTCGATGTCCAT3’，靶向核心基因(c-基因)的翻譯起始位置且與HBV多腺苷酸化位點重疊，(3)5’AAAGCCACCCAAGGCA3’，靶向HBV基因組包殼位置(e-位置)的未配對莖環(huán)。用于合成本研究寡聚物的堿基序列是HBV亞類ayw(Galibert等，(1979)，Nature(London)，281646-650)，通過HepG2 2.2.15體外表達(dá)相同亞類(Acs等，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.，844641-4644。此外，制備兩種與HBV基因不互補的其它ps-寡聚物NG45’TGAGCTATGCACATTCAGATTT3’和NG55’TCCAATTAGATCAG3’作為對照以試驗新糖結(jié)合物的非特異效果。
寡核苷酸的抗病毒活性用鋪滿培養(yǎng)的HepG2 2.2.15細(xì)胞評估。HBV轉(zhuǎn)染的人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2 2.2.15維持在RPMI+含4mM谷氨酰胺的4％胎牛血清上(并在37℃，5％濕潤大氣中的CO2培養(yǎng)。2-3次/周重流入培養(yǎng)物。細(xì)胞用G418選擇并每2-3次傳代再選擇。細(xì)胞在RPMI+含4mM谷氨酰胺的2％胎牛血清中以3-5×104個細(xì)胞/孔的密度接種到48孔板，生長3-4天直到達(dá)到鋪滿。在此點，處理用含上述ps-寡聚物的新糖結(jié)合物或相應(yīng)未結(jié)合寡聚物單獨在1.0μM到20μM濃度范圍來起始。用ZBI型Coulter定量細(xì)胞數(shù)。由于顯示HBV復(fù)制僅以此密度在HepG2 2.2.15細(xì)胞中到達(dá)穩(wěn)定、最大水平，使用鋪滿培養(yǎng)(Sells等，(1988)，J.Virology，62836-844)。所有處理重復(fù)三次進(jìn)行并持續(xù)96小時?？共《拘Ч缦略斒龇治霾⑴c未處理的對照培養(yǎng)物相比較以確定抑制程度。值報導(dǎo)為6次試驗的平均值±一個標(biāo)準(zhǔn)偏差。
抗病毒處理對HepG2 2.2.15細(xì)胞的HBV表面抗原表達(dá)(HBsAG)的效果用Ausyme單克隆試劑盒通過半定量EIA分析(Muller等，(1992)，J.Infect.Dis.，62929-933)確定(稀釋試驗樣品從而值在分析的線性動態(tài)范圍內(nèi))。用HBsAG(Chemicon，Temacia，CA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線包括在各組分析中。值在Bio-Tek EIA平板讀出器上以492nm的固定波長定量。
胞外HBV DNA用修改的前述過程(Korba和Milman，(1991)，Antiviral Res.，15217-228；Korba和Gerin，(1992)，同上)通過定量點印跡雜交分析。離心實驗和對照培養(yǎng)基樣品并用相同體積的1N NaOH-10X SSC處理，室溫培養(yǎng)30分鐘。樣品隨后通過點印跡儀器直接用于預(yù)浸透(0.4 Tris-HCl；pH7.5)的尼龍膜。膜用0.5MNaCl-0.5M Tris-HCl(pH7.5)中和，2X SSC沖洗并在80℃烘2小時。
純化的3.2Kb Eco R1 HBV片斷(Kobra等，1989)用缺口翻譯試劑盒標(biāo)記[32P]dCTP且用Probequant微旋轉(zhuǎn)柱純化。印記在溶液中42℃預(yù)雜交3-4小時，溶液含6x SSC、5x Denhardts溶液、50％甲酰胺、0.5％SDS和125μg/ml變性、剪切的鮭精DNA。雜交在相同組成的溶液中進(jìn)行18-22小時，溶液加入10％硫酸葡聚糖。點在42℃連續(xù)洗且光密度測定用Fujix Bas 1000磷圖像儀定量。病毒粒子DNA水平通過比較這些測量和用于各點的已知量的HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)來確定。
實施例14此例子闡述了體外在HepG2 2.2.15中靶向HBV復(fù)制關(guān)鍵元件的肝臟特異新糖結(jié)合物的生物功效。
為評估新糖結(jié)合物對HBV基因表達(dá)的效果，鋪滿單層的HepG2 2.2.15細(xì)胞在存在單劑量新糖結(jié)合物或相應(yīng)寡聚物時培養(yǎng)96h，新糖結(jié)合物或寡聚物單獨靶向表面抗原基因、核心基因或包殼信號。分析了這些處理對培養(yǎng)基中HbsAG和HBV病毒粒子DNA積聚的效果。結(jié)合特異性通過用含隨機ps-寡聚物的新糖結(jié)合物或單獨隨機ps-寡聚物處理細(xì)胞來確定。
抗病毒處理對細(xì)胞培養(yǎng)基中HBsAG積聚的效果可變化，這取決于靶向的基因(圖18-A.抗S；B.抗C；C.抗E-實心柱＝未處理對照；斑點柱＝新糖結(jié)合物；交叉線柱＝未結(jié)合寡聚物)。用靶向HBV表面抗原基因的NG1處理使培養(yǎng)基中HbsAG積聚降低，在20μM濃度時從1163ng/106細(xì)胞到342ng/106降低70％且在10μM濃度時降低47％到662ng/106細(xì)胞。相反，相應(yīng)未結(jié)合寡聚物在20μM時使HBsAG表達(dá)減少43％到500ng/106細(xì)胞且在10μM減少24％到885ng/106細(xì)胞。新糖結(jié)合物或寡居物單獨在10μM濃度以下對HBsAG表達(dá)沒有任何顯著效果。也檢測了對HBV復(fù)制靶向抗核心基因的新糖結(jié)合物的效果。用NG2處理導(dǎo)致HBsAG適度減少，從1061ng/106到699.49ng/106細(xì)胞，相對未處理對照抑制35％。在更低濃度沒有觀察到顯著抑制。用靶向c-基因的未結(jié)合寡聚物處理沒有導(dǎo)致顯著抑制HbsAg。用靶向E-位置上部莖環(huán)結(jié)構(gòu)的NG3處理Hpe G2.2.2.15細(xì)胞在任何濃度沒有導(dǎo)致HBsAG顯著下降。用相應(yīng)未結(jié)合寡聚物觀察到類似結(jié)果。
更驚人的是抗病毒處理對HBV病毒粒子DNA在細(xì)胞培養(yǎng)基中積聚的效果(圖19-A.抗S；B.抗C；C.抗E-實心柱＝未處理對照；斑點柱＝新糖結(jié)合物；交叉線柱＝未結(jié)合寡聚物)。在此情況中各新糖結(jié)合物抑制病毒粒子DNA積聚到顯著高于相應(yīng)未結(jié)合寡聚物的程度。在所有情況中觀察到劑量反應(yīng)。
用NG3處理對培養(yǎng)基中HBV病毒粒子DNA減少有最大的效果。在下降到1的所有濃度觀察到相較未處理對照超過80％的減少。證明更低濃度NG3效率更低直到在0.1μM沒有觀察到顯著抑制。用相應(yīng)未結(jié)合寡聚物分別在20和10μM濃度使減少DNA＜80％。在更低濃度病毒粒子DNA增加直到未處理對照水平達(dá)到1-2μM濃度間。
靶向核心基因的NG-2顯著減少病毒粒子DNA積聚，但程度小于NG-3。在此情況中DNA減少超過80％，下降到5μM濃度。相應(yīng)未結(jié)合寡聚物在20μM濃度也使病毒粒子DNA生成減少超過80％。然而其后證明新糖結(jié)合物在所有濃度約4倍更有效，直到未處理對照水平達(dá)到1μM。
用NG-1處理也導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基中病毒粒子DNA顯著減少。水平與未處理對照相比減少超過70％到10μM濃度。在更低處理濃度，病毒粒子DNA水平增加直到對照水平達(dá)到1-2μM間。再一次，未結(jié)合寡聚物抑制病毒粒子DNA水平到與20μM濃度類似的程度。然而，證明新糖結(jié)合物在所有下降到2μM的濃度約4-5倍更有效。
為確認(rèn)上述處理的特異性，合成與HBV基因組任何部分不互補的隨機ps-寡聚物(NG4和NG5)。用NG4和NG5在至30μM濃度處理寡聚物或新糖結(jié)合物形式對細(xì)胞培養(yǎng)基中HBsAG或病毒粒子DNA積聚沒有顯著效果(圖20-A＝NG-4對HBs AG積聚的效果；B＝NG-5和相應(yīng)寡聚物對HBs AG積聚的效果；C＝NG-4和相應(yīng)寡聚物對HBV病毒粒子DNA積聚的效果；D＝NG-5相應(yīng)寡聚物對HBV病毒粒子DNA積聚的效果。實心柱＝未處理對照；斑點柱＝新糖結(jié)合物；交叉線柱＝未結(jié)合寡聚物)。
實施例15此例子闡述了細(xì)胞培養(yǎng)基中硫代磷酸酯新糖結(jié)合物的穩(wěn)定性研究。
本研究所用新糖結(jié)合物和未結(jié)合硫代磷酸酯寡聚物的體外穩(wěn)定性通過PAGE分析確定。新糖結(jié)合物NGI-5和它們未結(jié)合形式用RPMI+2％FCS在37C培養(yǎng)24、48和96小時。含2μl新糖結(jié)合物或未結(jié)合寡聚物的等分樣品加入10μl膠加樣緩沖液并在含7M尿素的2％聚丙烯酰胺膠上800V電泳20分鐘。所得膠用Fuiix Bas1000磷圖像儀(Fujix Medical Systems，(Stamford，CT)分析。所有新糖結(jié)合物和寡聚物在細(xì)胞培養(yǎng)基中保持到96小時。
實施例16此例子闡述了硫代磷酸酯新糖結(jié)合物的毒性分析。
本研究所用各處理的毒性通過錐蟲藍(lán)排除確定。測量在用于抗病毒實驗的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。在用于實驗的任何濃度沒有注意到顯著毒性。處理階段后，活細(xì)胞數(shù)量通過錐蟲藍(lán)排除顯微確定。計數(shù)到了來自各孔至少200個細(xì)胞的最小值。所有確定在三倍孔上進(jìn)行。
發(fā)明可以其它具體形式進(jìn)行，而不離開其精神或本質(zhì)特征。因此本實施方案在所有方面認(rèn)為是描述而不是限制。因而要理解大量化合物可用本文所述方法合成。所有本文所述方法可以任何適當(dāng)順序進(jìn)行，除非本文另有說明或與內(nèi)容明顯矛盾。專利、專利申請和其它本文所引用文獻(xiàn)通過參考相同范圍完全納入，各文獻(xiàn)單獨且特別指出納入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)并全部列于本文。
除非本文另有說明或與內(nèi)容明顯矛盾，描述發(fā)明內(nèi)容中使用的術(shù)語“一”、“一個”和“這個”及類似指示涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。除非本文另有說明，本文值范圍的描述僅用作單獨指范圍內(nèi)各不同值的簡化方法，且各不同值納入說明書，本文單獨描述值。
使用本文所提供的任何和所有例子或示范語言(如“例如”)僅用于更好闡述發(fā)明且不限制發(fā)明的范圍，除非另有權(quán)利要求。說明書中沒有語言指示任何非權(quán)利要求要素為發(fā)明實踐所必需。如申請法所允許，此發(fā)明包括附加權(quán)利要求書中所述主題物質(zhì)的所有修飾和相當(dāng)物。此外，上述要素所有可能變化的任意結(jié)合包括在發(fā)明中，除非本文另有說明或與內(nèi)容明顯矛盾。
權(quán)利要求
1.一種包括結(jié)構(gòu)式A-L-P的均一結(jié)合物的構(gòu)建物，其特征在于，A代表特異結(jié)合肝受體的肝配體，從而促進(jìn)結(jié)合物進(jìn)入有此受體的細(xì)胞；L代表雙功能接頭，它以區(qū)域特異方式共價連接A形成A-L；A-L以區(qū)域特異方式共價連接P形成A-L-P；P代表結(jié)合肝病毒包殼序列的生物穩(wěn)定寡聚物，其中P在至少一個特定生化鍵水解或還原后從結(jié)合物中釋放，并在從結(jié)合物中釋放時包含抗酶水解或生物降解的核苷酸間鍵合。
2.一種包括結(jié)構(gòu)式A-L-P的均一結(jié)合物的構(gòu)建物，其特征在于，A代表特異結(jié)合肝受體的肝配體，從而促進(jìn)結(jié)合物進(jìn)入有此受體的細(xì)胞；L代表雙功能接頭，它以區(qū)域特異方式共價連接A形成A-L；A-L以區(qū)域特異方式共價連接P形成A-L-P；P代表結(jié)合肝病毒序列的生物穩(wěn)定DNA寡聚物，其中P在至少一個特定生化鍵水解或還原后從結(jié)合物中釋放，并在從結(jié)合物中釋放時包含抗酶水解或生物降解的核苷酸間鍵合。
3.一種包括結(jié)構(gòu)式A-L-P均一結(jié)合物的構(gòu)建物，其特征在于，A代表特異結(jié)合肝受體的肝配體，從而促進(jìn)結(jié)合物進(jìn)入有此受體的細(xì)胞；L代表雙功能接頭，它以區(qū)域特異方式共價連接A形成A-L；A-L以區(qū)域特異方式共價連接P形成A-L-P；P代表結(jié)合肝病毒序列的生物穩(wěn)定寡聚物，其中P在至少一個特定生化鍵水解或還原后從結(jié)合物中釋放，并包含一種或更多類型的選自磷酸二酯、硫代磷酸酯、2’-O-甲基核糖甲基膦酸酯、2’-O-甲基核糖硫代磷酸酯和2’-O-甲基核糖磷酸二酯的核苷酸間鍵合。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述寡聚物是寡核苷酸、寡核苷酸類似物或寡核苷酸。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述病毒是肝炎病毒。
6.如權(quán)利要求1或3所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述寡聚物結(jié)合RNA前S1開放閱讀框序列。
7.如權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物包括選自GTTCTCCATGTTCAG、TTTATAAGGGTCGATGTCCAT和AAAGCCACCCAAGGCA的序列。
8.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物包括序列AAAGCCACCCAAGGCA。
9.如權(quán)利要求1、2或4所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述寡聚物進(jìn)一步包括脫氧核糖甲基膦酸酯核苷酸間鍵合。
10.如權(quán)利要求1、2或4所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述寡聚物包括脫氧核糖硫代磷酸酯核苷酸間鍵合。
11.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述寡聚物包括磷酸二酯鍵。
12.如權(quán)利要求1、2或4所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述寡聚物包括脫氧核糖甲基膦酸酯/硫代磷酸酯核苷酸間鍵合的組合、脫氧核糖甲基膦酸酯/磷酸二酯核苷酸間鍵合的組合、脫氧核糖硫代磷酸酯/磷酸二酯核苷酸間鍵合的組合、2’-O-甲基核糖甲基膦酸酯核苷酸間鍵合、2’-O-甲基核糖硫代磷酸酯核苷酸間鍵合、2’-O-甲基核糖磷酸二酯核苷酸間鍵合、2’-O-甲基核糖甲基膦酸酯/2’-O-甲基核糖磷酸二酯核苷酸間鍵合的組合、2’-O-甲基核糖甲基膦酸酯/2’-O-甲基核糖硫代磷酸酯核苷酸間鍵合的組合或2’-O-甲基核糖硫代磷酸酯/2’-O-甲基核糖磷酸二酯核苷酸間鍵合的組合。
13.一種合成如權(quán)利要求4所述的結(jié)合物的方法，其特征在于，所述方法包括a)形成A-L構(gòu)建物；b)純化A-L構(gòu)建物以使均一性大于95％并去除未反應(yīng)的接頭；c)修飾寡核苷酸或寡核苷酸類似物P以形成硫醇-修飾的寡聚物；d)在脫氣條件下純化硫醇-修飾的寡聚物以去除未反應(yīng)的試劑和雜質(zhì)；e)在雙成分結(jié)合反應(yīng)中使A-L構(gòu)建物在脫氣條件下與硫醇-寡聚物反應(yīng)；其中，反應(yīng)可用過量的配體支架或硫醇-修飾寡聚物進(jìn)行以形成A-L-P結(jié)合物；并純化A-L-P結(jié)合物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述A-L-P結(jié)合物通過大小排阻色譜法純化。
15.一種放射性同位素標(biāo)記如權(quán)利要求4所述的結(jié)合物的方法，其特征在于，所述方法包括a)在固相合成中將三核苷示蹤物單元5’-T-3’-ps-3’-T-ps-T-5’加入寡核苷酸或寡核苷酸類似物P的3’末端；b)采用多核苷酸激酶(PNK)和含放射性標(biāo)記的磷酸的2-氨基巰基乙醇(ATP)，通過酶的作用將示蹤物單元磷酸化以將放射性標(biāo)記的磷酸摻入A-L-P結(jié)合物；c)化學(xué)修飾現(xiàn)在存在于帶有氨基的A-L-P結(jié)合物中的放射性磷酸以防止它被細(xì)胞酶降解。
16.一種合成如權(quán)利要求4所述結(jié)合物的方法，其特征在于，所述方法包括a)在固相合成中將帶有末端二硫化物部分的雙功能接頭L加入寡核苷酸或寡核苷酸類似物P以形成二硫化物修飾的寡聚物；b)純化二硫化物修飾的寡聚物；c)將二硫化物修飾寡聚物的二硫化物部分還原成硫醇基團以形成硫醇-修飾的寡聚物；d)在脫氣條件下純化硫醇-修飾的寡聚物；e)在脫氣條件下使配體A與純化的硫醇-寡聚物反應(yīng)以形成A-L-P結(jié)合物；f)純化A-L-P結(jié)合物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，步驟b)-f)用大小排阻色譜法完成。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述A-L-P結(jié)合物用電泳純化。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述A-L-P結(jié)合物用HPLC純化。
20.如權(quán)利要求16-19中任一項所述的方法，其特征在于，所述二硫化物修飾的寡聚物被純化到大于95％的均一性以去除任何痕量的低分子量硫醇污染物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述二硫化物修飾的寡聚物被純化到大于99％的均一性。
22.一種放射性同位素標(biāo)記如權(quán)利要求4所述的結(jié)合物的方法，其特征在于，所述方法包括a)用固相合成法將二硫化物-末端接頭加入P的5’-末端并將三核苷酸示蹤物單元5’-T-3’-ps-3’-T-ps-T-5’加入P的3’末端；b)純化二硫化物-和包含示蹤物的寡聚物；c)將二硫化物功能基團還原成硫醇基團以形成硫醇-修飾的P；d)用大小排阻色譜法在脫氣條件下純化硫醇-修飾的P以去除未反應(yīng)試劑和雜質(zhì)；e)在脫氣條件下將A-L構(gòu)建物結(jié)合到純化的硫醇-修飾的P上以形成A-L-P結(jié)合物；f)用PNK和含放射性標(biāo)記磷酸的ATP，通過酶的作用將示蹤物單元磷酸化以將放射性標(biāo)記的磷酸摻入A-L-P結(jié)合物；g)化學(xué)修飾現(xiàn)在存在于帶有氨基的A-L-P結(jié)合物中的放射性磷酸以防止它被細(xì)胞酶降解。
23.一種藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有權(quán)利要求1-12中任一項所述的構(gòu)建物和至少一種藥學(xué)上可接受賦形劑或載體。
24.如權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其特征在于，所述構(gòu)建物是YEE(ahGalNAc)3-SMCC-5’AAAGCCACCCAAGGCA3’。
25.一種包含結(jié)構(gòu)式A-L-P的均一結(jié)合物的構(gòu)建物，其特征在于，A代表特異結(jié)合肝受體的肝配體，從而促進(jìn)結(jié)合物進(jìn)入有此受體的細(xì)胞；L代表雙功能接頭，它以區(qū)域特異方式共價連接A形成A-L；A-L以區(qū)域特異方式共價連接P形成A-L-P；P代表結(jié)合肝病原體的生物穩(wěn)定寡聚物，其中P在至少一個特定生化鍵水解或還原后從結(jié)合物中釋放，并在從結(jié)合物中釋放時包含抗酶水解或生物降解的核苷酸間鍵合。
26.一種藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含權(quán)利要求25所述的構(gòu)建物和至少一種藥學(xué)上可接受賦形劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及均一A－L－P構(gòu)建物的設(shè)計和合成，此構(gòu)建物包含肝配體以引導(dǎo)寡聚物或“有效載荷”通過受體介導(dǎo)的、定向配體的途徑胞內(nèi)到達(dá)肝細(xì)胞。
文檔編號C12N15/09GK1555385SQ02816365
公開日2004年12月15日 申請日期2002年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月22日
發(fā)明者P·O·P·特索, R·德夫, Y·周, S·迪蒙德, C·羅比, P O P 特索, 傻 申請人:明因股份有限公司, 約翰－霍普金斯大學(xué)