專利名稱：利用切割劑擴增核酸片段的制作方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更特別地涉及包括核酸的方法和組合物，且更加特別地涉及利用切割劑(nicking agent)擴增核酸片段的方法和組合物。
相關(guān)技術(shù)描述通過人類基因組計劃(Human Genome Project)獲得的80,000～100,000個人類基因中每一個的染色體作圖和核酸序列提供了鑒定負(fù)責(zé)遺傳疾病的核苷酸座位的廣泛方法的可能性。150-200種普通的遺傳疾病和約600-800種較稀有的遺傳疾病中的多數(shù)是與一個或多個缺陷基因相關(guān)的。在其中，已知超過200種人類疾病是由單個基因中的缺陷導(dǎo)致的，這經(jīng)常導(dǎo)致單個氨基酸殘基的改變。(Olsen，“BiotechnologyAn Industry Comes of Age”(National AcademicPress，1986))。
體細(xì)胞中發(fā)生的突變?nèi)绻绊懥松婕凹?xì)胞分裂控制的基因時可誘導(dǎo)疾病，從而導(dǎo)致如腫瘤形成。在種系中，許多基因中的功能喪失型突變可導(dǎo)致人類中可探測的表型。雄性種系中從一個配子到后代中的一個配子時種系中的細(xì)胞世代數(shù)比雌性中的多大約20倍。在雌性中，卵子是在第二次減數(shù)分裂之后形成的并持續(xù)40年。因此不同類型種系突變和染色體畸變的發(fā)生率依賴于親本來源。
種系或體細(xì)胞的大部分突變對于生物體具有很小的影響，這是因為基因組的大部分是缺乏編碼功能的(約94％)。即使在外顯子區(qū)域中也對突變有一些耐受性，這是由于遺傳密碼的簡并性及因為氨基酸替代可僅對蛋白質(zhì)功能具有輕微的作用。(參見如Strong等人，NewEngland Journal of Medicine 3251597(1991))。隨著用于在大的DNA區(qū)段中探測突變的日益有效的方法的發(fā)展，對預(yù)測突變的功能結(jié)果(如臨床表型)的需要變得更加重要了。
分子遺傳學(xué)技術(shù)尚未以顯著的程度應(yīng)用于遺傳和惡性疾病中染色體畸變的診斷；細(xì)胞遺傳學(xué)仍然是研究這些重要的遺傳機制的優(yōu)選技術(shù)。在具有腫瘤抑制基因的一個突變拷貝的個體中，每103-104個細(xì)胞中就有一個細(xì)胞其剩余正常等位基因可被第二個拷貝的突變等位基因替代。導(dǎo)致該替代的機制包括染色體不分離、有絲分裂重組和基因轉(zhuǎn)變。相反，破壞剩余基因拷貝的功能的獨立突變估計發(fā)生于106個細(xì)胞中的一個細(xì)胞。
敏感性突變探測技術(shù)提供了用于突變篩選的異?？赡苄浴＠?，即使在受精卵植入之前也可進行分析。(Holding等人，Lancet 3532(1989))。日益有效的遺傳檢驗也允許從與健康體檢有關(guān)的呼吸道或膀胱中剝落的細(xì)胞中篩選致癌突變。(Sidransky等人，Science252706，1991)?？蛇x擇地，當(dāng)未知基因?qū)е逻z傳疾病時，監(jiān)控DNA序列變體的方法對于通過遺傳連鎖分析研究該疾病的遺傳是有用的。盡管有這些在單個基因中探測突變的獨特應(yīng)用，實現(xiàn)這種應(yīng)用的現(xiàn)有方法學(xué)繼續(xù)引起技術(shù)上和經(jīng)濟上的挑戰(zhàn)。盡管已經(jīng)尋求了幾個不同的方法，但沒有一個是充分有效的且對于大規(guī)模應(yīng)用是成本有效的。
在限定的核苷酸座位探測突變的常規(guī)方法包括在家族中用有限的遺傳標(biāo)記組進行耗時的連鎖分析，其中這些遺傳標(biāo)記是難以“讀出(readout)”的。這種方法包括如DNA標(biāo)記單倍型方法(可鑒定具有受影響的基因的染色體)以及用于探測較大的重排如大的缺失、重復(fù)、轉(zhuǎn)位和單堿基對突變的方法。這些方法包括掃描、篩選和基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的技術(shù)。(參見Cotton，“Mutation Detection”(Oxford University Press，1997))。
探測低豐度突變的高靈敏性測定依賴于PCR以擴增目標(biāo)序列。然而，這些測定卻遭受與PCR試劑相關(guān)的高成本的限制。此外，探測和/或表征含有突變的擴增核酸片段的現(xiàn)有方法沒有充分發(fā)展以使得能夠?qū)z傳變異進行高程度的多元鑒定。
部分由于探測遺傳突變的現(xiàn)有方法學(xué)中的缺點，一直需要快速且靈敏地對目標(biāo)核酸的限定核苷酸座位探測突變的方法。本發(fā)明通過提供在目標(biāo)核酸的限定核苷酸座位探測突變的方法而滿足了該需要及其他相關(guān)的需要，該方法還展示了增加的速度和方便性以及降低的成本。如在下文中詳細(xì)公開的，本發(fā)明的方法基于用切割劑在限定的位置擴增含有遺傳變異的核酸片段。此外，本發(fā)明也提供了方法和組合物以用于探測生物學(xué)樣品中特定核酸的存在與否；用于制備單鏈核酸探針；以及用于探測在mRNA分子或cDNA分子中兩個外顯子之間連接(junction)的存在與否。
發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明提供了一種方法，該方法包括(a)使模板核酸分子與切割劑(NA)接觸，其中模板核酸分子(“模板”)包括可由NA識別的切割劑識別序列(NARS)。在一個實施方案中，模板是部分雙鏈的，其中在一個實施方案中NARS是在模板的單鏈部分，而在另一個實施方案中NARS是在模板的雙鏈部分。在另一個實施方案中，模板是完全雙鏈的。(b)如果模板不包括可由NA切割的切割位點(NS)，那么該方法提供模板一條鏈的延伸從而使得形成模板的延伸產(chǎn)物，而該延伸產(chǎn)物包括可由NA切割的NS。(c)在NS切割模板或其延伸產(chǎn)物。這將在NS提供3’和5’末端。如下文描述的，多拷貝的在切割位點具有5’末端的核酸片段將通過下面的步驟進行制備。(d)在NS從3’末端延伸步驟(c)的切割產(chǎn)物。(e)重復(fù)步驟(c)和(d)以擴增單鏈核酸片段。在本發(fā)明的各個實施方案中，該單鏈核酸片段具有不超過50或45或40或35或30或25或24或23或22或21或20或19或18或17或16或15或14或13或12或11或10或9或8或7或6或5或4或3或2或1個核苷酸。通常，形成具有不超過50、45等的核苷酸的單鏈核酸片段相對于形成具有超過50、45等的核苷酸的片段是有利的，這是因為至少下面的原因片段形成的速率和效率是較高的，較小的片段更容易由一些表征方法表征到較高的區(qū)別水平，該方法如質(zhì)譜分析法和液相層析，且延伸步驟可用不必具有鏈置換活性的DNA聚合酶來進行。
下面的標(biāo)準(zhǔn)是可用于進一步描述本發(fā)明的方法的額外標(biāo)準(zhǔn)的例子。任何如在此處所公開的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個等標(biāo)準(zhǔn)(包括下面的標(biāo)準(zhǔn))可組合起來描述本發(fā)明的方法。當(dāng)兩個標(biāo)準(zhǔn)(A和B)相互不一致時，它們可組合在可選擇的方法中，即該方法可描述為包括標(biāo)準(zhǔn)A或標(biāo)準(zhǔn)B。這些標(biāo)準(zhǔn)包括NA是切割性內(nèi)切核酸酶(NE)；NA是限制性內(nèi)切核酸酶(RE)；步驟(c)是在選自下列DNA聚合酶的DNA聚合酶存在時進行的，而對潛在的DNA聚合酶的列表可進行縮減從而包括下面DNA聚合酶的任何2個、3個、4個、5個、6個、7個等exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌體M2 DNA聚合酶、噬菌體phiPRD1 DNA聚合酶、測序酶、PRD1DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶，如步驟(c)可在選自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶的DNA聚合酶存在時進行；步驟(b)、(c)、(d)和(e)中的兩個或多個，優(yōu)選地為3個或4個且更優(yōu)選地為所有4個均是在相同的等溫條件下進行的；該方法包括表征步驟(e)中擴增的單鏈核酸片段的步驟；該方法包括由一種或多種方法表征步驟(e)中擴增的單鏈核酸片段的步驟，所述一種或多種方法選自發(fā)光光譜法、熒光光譜法、質(zhì)譜分析法、液相層析、熒光偏振、電子電離、凝膠電泳和毛細(xì)管電泳，例如該方法包括用質(zhì)譜分析法(即用質(zhì)譜分析法本身或包括質(zhì)譜分析法的方法)表征步驟(e)中擴增的單鏈核酸片段的步驟；模板核酸具有位于NS的3’的遺傳變異，并且該遺傳變異與NS位于同一單鏈上，從而該遺傳變異整合入擴增的單鏈核酸片段中；模板核酸可由包括下面步驟(i)和(ii)以及進一步可包括步驟(iii)的方法形成(i)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，而目標(biāo)核酸包括要研究的遺傳變異，其中如果(a)目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的核苷酸序列和至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且可選擇地包含限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的序列，然而，如果(b)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列和至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且可選擇地包含限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的序列。(ii)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)具有NERS和RERS兩者的片段。該方法可選擇地包括(iii)用識別RERS的限制性內(nèi)切核酸酶切割步驟(ii)的延伸產(chǎn)物；模板核酸可由包括下面步驟(i)和(ii)的方法形成，如下(i)形成包括第一個ODNP、第二個ODNP和包含遺傳變異的目標(biāo)核酸的混合物，其中如果(a)目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含第一個限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的核苷酸序列和至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含第二個RERS的一條鏈的序列和至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，然而，如果(b)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含第一個限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的序列和至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸的核酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含第二個RERS的一條鏈的序列和至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列。(ii)在脫氧核苷三磷酸和至少一種修飾的脫氧核苷三磷酸存在時延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)具有第一個和第二個RERS兩者的片段；模板核酸可由包括(i)和(ii)的方法形成，如下(i)形成包括第一個ODNP、第二個ODNP和包含遺傳變異的目標(biāo)核酸的混合物，其中如果(a)目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，然而，如果(b)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列；而在每一種情況下，第一個和第二個ODNP各自進一步包含NERS的有義鏈的序列。(ii)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)具有兩個NERS的片段；模板核酸分子進一步在含有NS的鏈中包括5’突出端，其中突出端包括至少基本與目標(biāo)核酸互補的核酸序列；模板核酸分子進一步在不含有NS的鏈中包括3’突出端，其中突出端包括至少基本與目標(biāo)核酸互補的核酸序列；在模板含有突出端的情況下，本發(fā)明可選擇地進行下面的額外步驟(i)、(ii)和(iii)(i)在一定條件下使模板核酸與生物學(xué)樣品中的核酸分子混合，而生物學(xué)樣品可能含有目標(biāo)核酸，該條件為當(dāng)目標(biāo)核酸存在于生物學(xué)樣品中時，它可與模板核酸的突出端進行雜交。(ii)在進行步驟(a)之前從步驟(i)的混合物中去除未雜交的模板核酸。(iii)組合雜交的模板核酸與NA；雙鏈模板核酸分子包括IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)；雙鏈模板核酸是以某種方式使核酸連接物與雙鏈目標(biāo)核酸進行連接而提供的，從而(i)根據(jù)本方法形成的擴增的單鏈核酸分子包括目標(biāo)核酸的一部分，(ii)核酸連接物包括IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)，(iii)核酸連接物在不與含有NS的模板鏈連接的連接物鏈上包括NARS，(iv)識別TRERS的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點位于(a)雙鏈目標(biāo)核酸片段和(b)相應(yīng)于NS的位置的5’；模板核酸包括位于NS的3’的上游外顯子(Exon A)和下游外顯子(Exon B)之間的連接，從而在連接兩邊的與連接鄰近的核苷酸可整合入擴增的單鏈核酸片段中；模板核酸是由包括如下(i)和(ii)的方法形成的(i)使第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和cDNA混合，其中第一個ODNP包含至少基本與靠近反義鏈中Exon A的5’末端的Exon A的反義鏈的部分互補的序列，第二個ODNP包含至少基本與靠近有義鏈中Exon B的5’末端的Exon B的有義鏈的部分互補的序列，且第一個ODNP和第二個ODNP中的至少一個進一步包括切割劑識別序列(NARS)的有義鏈的序列。(ii)延伸第一個ODNP和第二個ODNP以提供包含第一個ODNP和第二個ODNP的模板核酸；有時在步驟(e)之前，模板核酸可固定于固體支持體上，而在一個實施方案中不含有切割位點的核酸鏈附著于固體支持體上，可選擇地為在該鏈的3’末端或可選擇地在該鏈的5’末端附著，而在另一個實施方案中包括通過在NS進行切割形成的3’末端的核酸片段的5’末端附著于固體支持體上，而在另外一個實施方案中包括通過在NS進行切割形成的5’末端的核酸片段的3’末端附著于固體支持體上；例如，當(dāng)將cDNA用于制備模板核酸時，則該cDNA分子可附著于固體支持體上；作為另一個例子，當(dāng)將目標(biāo)核酸用于制備模板核酸時，則該目標(biāo)核酸可附著于固體支持體上。在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明提供了一種可用于探測cDNA分子中基因的上游外顯子A(Exon A)和下游外顯子(Exon B)之間的連接存在與否的試劑盒，而該試劑盒包括至少一對如在此處所描述的探測方法中所使用的ODNP。此外，這些試劑盒可進一步包括，或者可進一步表征為包括一種或多種下面的成分/條件識別NARS的切割劑(NA)；限制性內(nèi)切核酸酶(RE)；RE的緩沖液；切割性內(nèi)切核酸酶(NE)；NE的緩沖液；N.BstNB I；第一個ODNP包含NERS和第二個ODNP包含RERS；第一個ODNP包含RERS和第二個ODNP包含NERS；RERS是IIs型限制性內(nèi)切核酸酶可識別的；IIs型限制性內(nèi)切核酸酶；IIs型限制性內(nèi)切核酸酶的緩沖液；已知為Bpm I的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶；識別NERS的NE；DNA聚合酶；DNA聚合酶的緩沖液；exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和exo-Vent聚合酶中的一種或多種；使用試劑盒的說明書；液相層析柱；包含水和與有機或無機酸復(fù)合的仲或叔胺銨鹽的緩沖液A；包含緩沖液A和有機溶劑的緩沖液B；一種銨鹽，其胺成分選自三乙胺、二烯丙基胺、二異丙基胺、N，N-二甲基-N-環(huán)己基胺、N，N-二甲基-N-異丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺；與有機酸復(fù)合的仲或叔胺，且有機酸選自乙酸、丙酸及其鹵化形式；甲醇；乙腈；反相層析柱；海藻糖；脫氧核苷三磷酸；修飾的脫氧核苷三磷酸；寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)；和/或用于設(shè)計或定購ODNP對的軟件存取碼。
在另一方面，本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸中限定位置鑒定遺傳變異的方法，而遺傳變異可為如單核苷酸多態(tài)(SNP)。例如，在一個實施方案中，該方法包括(a)提供一種模板核酸(“模板”)，該模板核酸包括目標(biāo)核酸的一些或全部，且特別地包括在目標(biāo)核酸的限定位置包含遺傳變異的核苷酸序列。模板進一步包括切割劑(NA)的切割位點(NS)，而NS位于遺傳變異的5’。模板可為部分或完全雙鏈的。(b)在DNA聚合酶和在NS進行切割的NA存在時擴增單鏈核酸片段，該單鏈核酸片段具有包括遺傳變異的核苷酸序列。該單鏈核酸片段具有通過在NS切割形成的5’末端。(c)表征單鏈核酸片段以借此鑒定遺傳變異。在另一個實施方案中，本發(fā)明在目標(biāo)核酸的限定位點鑒定遺傳變異(該遺傳變異可為如SNP)的方法包括(a)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中如果(i)目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的核苷酸序列和至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且可選擇地包含限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的序列，然而，如果(ii)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含NERS的有義鏈的核苷酸序列和至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列且可選擇地包含RERS。b)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含第一個ODNP和第二個ODNP的延伸產(chǎn)物。(c)可選擇地用識別RERS的限制性內(nèi)切核酸酶消化步驟(b)中的延伸產(chǎn)物以生產(chǎn)消化產(chǎn)物。(d)用步驟(b)的延伸產(chǎn)物或步驟(c)的消化產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時擴增單鏈核酸片段。(e)表征步驟(d)的單鏈片段以在目標(biāo)核酸中鑒定遺傳變異。作為進一步的例子，本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異的方法，而該遺傳變異可為如SPN，該方法包括(a)形成包括第一個ODNP、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中如果(i)目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含第一個限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的核苷酸序列和至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含第二個RERS的一條鏈的核苷酸序列和至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，然而，如果(ii)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含第一個RERS的一條鏈的核苷酸序列和至少基本與位于遺傳變異互補鏈5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含第二個RERS的一條鏈的序列和至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列。(b)在脫氧核苷三磷酸和至少一種修飾的脫氧核苷三磷酸存在時延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)具有第一個和第二個RERS兩者的延伸產(chǎn)物。(c)用步驟(b)的延伸產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別第一個和第二個RERS的限制性內(nèi)切核酸酶(RE)存在時擴增單鏈核酸片段，其中單鏈核酸片段長度不超過35個核苷酸。(d)表征步驟(c)的單鏈片段以鑒定遺傳變異。另一個方面，本發(fā)明涉及在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異的方法，而該遺傳變異可為如SNP，該方法包括(a)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中如果(i)目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，然而，如果(ii)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，而第一個和第二個ODNP各自進一步包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的核苷酸序列。(b)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含兩個NERS的延伸產(chǎn)物。(c)用步驟(b)的延伸產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別NERS的一種或多種切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時擴增單鏈核酸片段。(d)表征步驟(c)的單鏈片段以鑒定遺傳變異。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了在單鏈目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異的方法，該方法包括(a)形成第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中第一個ODNP包含至少基本與位于限定位置3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，第二個ODNP包含至少基本與目標(biāo)核酸互補鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于限定位置的核苷酸的至少基本互補的核苷酸的3’，第一個和第二個ODNP各自進一步包含中斷的限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(IRERS)(而不是完整的IRERS)的第一條鏈的第一個不變識別序列(CRS)和第二條鏈的第二個CRS，完整的IRERS是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸且包含由可變識別序列(VRS)連接的第一個和第二個CRS，且第一個或第二個ODNP進一步包含位于第一個CRS或第二個CRS的5’的NERS。(b)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)具有NERS和完整IRERS的片段，其中遺傳變異位于VRS中。(c)用步驟(b)的延伸產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時擴增單鏈核酸片段。(d)表征單鏈片段以鑒定遺傳變異。在進一步描述需要CRS、VRS和IRERS的該方法中，可利用一種或多種下面的標(biāo)準(zhǔn)，而下面標(biāo)準(zhǔn)的任何兩個或多個均可進行組合，且這些標(biāo)準(zhǔn)僅是在此處闡明的例示性標(biāo)準(zhǔn)單鏈目標(biāo)核酸是變性的雙鏈核酸的一條鏈；雙鏈核酸是基因組核酸；雙鏈DNA是cDNA；至少基本與目標(biāo)核酸互補的第一個ODNP的核苷酸序列長度至少為12個核苷酸；至少基本與目標(biāo)核酸的互補鏈互補的第二個ODNP的核苷酸序列長度至少為12個核苷酸；第一個ODNP長度為15-85個核苷酸；第二個ODNP長度為15-85個核苷酸；第一個ODNP進一步包含至少基本與第一個CRS的3’末端的目標(biāo)核酸互補的一個或多個核苷酸；第二個ODNP進一步包含至少基本與第二個CRS的3’末端的目標(biāo)核酸互補的一個或多個核苷酸；所有步驟(a)～(d)均在單個容器中進行；IRERS可由選自Bsl I、Mwo I和Xcm I的限制性內(nèi)切核酸酶識別；NERS可由N.BstNB I識別；步驟(d)至少部分是通過用選自質(zhì)譜分析法、液相層析、熒光偏振、電子電離、凝膠電泳和毛細(xì)管電泳的技術(shù)進行的。
在限定位置鑒定遺傳變異的這些方法的每一個(包括遺傳變異是SNP的方法)可根據(jù)本發(fā)明由下面標(biāo)準(zhǔn)的一個或多個進行進一步的描述，而下面標(biāo)準(zhǔn)的任何兩個或多個可進行組合以描述任何方法，且這些標(biāo)準(zhǔn)僅是例示性的，其他標(biāo)準(zhǔn)也可用于進一步描述根據(jù)本發(fā)明在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異的方法遺傳變異是單核苷酸多態(tài)(SNP)；遺傳變異與疾病相關(guān)；遺傳變異與人類遺傳疾病相關(guān)；遺傳變異與病原微生物的藥物抗性相關(guān)；目標(biāo)核酸是基因組核酸；目標(biāo)核酸是cDNA；目標(biāo)核酸源自病原病毒的基因組；目標(biāo)核酸源自病原細(xì)菌的基因組；目標(biāo)核酸源自病原細(xì)菌的附加體；NA是切割性內(nèi)切核酸酶(NE)；NA是N.BstNB I；擴增是在等溫條件下進行的；擴增是在50℃-70℃的溫度范圍內(nèi)進行的；擴增是在60℃進行的；擴增是在55±5℃進行的；擴增是在60±5℃進行的；擴增是在65±5℃進行的；擴增是在70±5℃進行的；擴增是在最高溫度和最低溫度之間的溫度進行的，而最高溫度比最低溫度高20℃之內(nèi)；擴增是在最高溫度和最低溫度之間的溫度進行的，而最高溫度比最低溫度高15℃之內(nèi)；擴增是在最高溫度和最低溫度之間的溫度進行的，而最高溫度比最低溫度高10℃之內(nèi)；擴增是在最高溫度和最低溫度之間的溫度進行的，而最高溫度比最低溫度高5℃之內(nèi)；擴增是在DNA聚合酶的存在下進行的，而DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌體M2 DNA聚合酶、噬菌體phiPRD1 DNA聚合酶、測序酶、PRD1DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶的任何一種，且這些DNA聚合酶的任何兩個或多個可形成所述的可用于擴增的DNA聚合酶組，如DNA聚合酶選自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和exo-Vent聚合酶；單鏈核酸片段是由選自質(zhì)譜分析法、液相層析、熒光偏振和電泳的一種或多種技術(shù)進行表征的，如單鏈核酸片段是由一種或多種包括液相層析的技術(shù)進行表征的，或者如另一個例子，單鏈核酸片段是由一種或多種包括質(zhì)譜分析法的技術(shù)進行表征的，或者如另外一個例子，單鏈核酸片段是由一種或多種包括液相層析和質(zhì)譜分析法兩者的技術(shù)進行表征的；當(dāng)方法包括使用引物即ODNP時，在本發(fā)明的各個實施方案中，方法中所用的每一個ODNP的長度都獨立地為至少8個、或至少9個、或至少10個、或至少11個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個、或至少17個、或至少18個、或至少19個、或至少20個核苷酸；當(dāng)本發(fā)明的方法包括使用引物即ODNP時，那么在本發(fā)明的各個實施方案中，方法中所用的每一個ODNP的長度都獨立地不超過50個、或不超過45個、或不超過40個、或不超過35個、或不超過30個、或不超過29個、或不超過28個、或不超過27個、或不超過26個、或不超過25個、或不超過24個、或不超過23個、或不超過22個、或不超過21個、或不超過20個、或不超過19個、或不超過18個核苷酸；當(dāng)方法包括使用包括至少基本與目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物時，那么在本發(fā)明的各個實施方案中，引物中該核苷酸序列的長度在每一個引物中獨立地為至少4個、或至少5個、或至少6個、或至少7個、或至少8個、或至少9個、或至少10個、或至少11個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個、或至少17個、或至少18個、或至少19個、或至少20個核苷酸；當(dāng)本發(fā)明的方法包括使用包括至少基本與目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物時，那么在本發(fā)明的各個實施方案中，引物中該核苷酸序列的長度在每一個引物中獨立地不超過20個、或不超過19個、或不超過18個、或不超過17個、或不超過16個、或不超過15個、或不超過14個、或不超過13個、或不超過12個、或不超過11個、或不超過10個、或不超過9個、或不超過8個、或不超過7個、或不超過6個、或不超過5個核苷酸；當(dāng)本發(fā)明的方法需要使用含有RERS的核酸分子時，那么在一個實施方案中RERS可由II型限制性內(nèi)切核酸酶識別；當(dāng)本發(fā)明的方法需要使用含有RERS的核酸分子時，那么在一個實施方案中RERS可由IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別；當(dāng)本發(fā)明的方法需要使用含有RERS的核酸分子時，那么在一個實施方案中RERS可由Bpm I識別；當(dāng)本發(fā)明的方法需要使用含有一種或多種RERS的核酸分子時，或者該方法需要使用各自具有RERS的一個或多個分子時，那么在各個實施方案中RERS可由選自Ava I、Bsl I、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4H I、Hinc II、Hind II和Nci I的RE識別，而從這些Re的任何兩個或多個中可形成一個組；當(dāng)本發(fā)明的方法需要使用含有RERS的核酸分子時，那么在一個實施方案中RERS可由間斷的限制性內(nèi)切核酸酶識別；當(dāng)方法包括兩個RERS時，那么在一個實施方案中第一個RERS的核苷酸序列不與第二個RERS相同，而在另一個實施方案中，第一個RERS的核苷酸序列與第二個RERS相同；當(dāng)本發(fā)明的方法需要使用含有NERS的核酸分子時，那么在一個實施方案中NERS具有核苷酸序列為5’GAGTC3’的有義鏈；當(dāng)本發(fā)明的方法需要延伸核酸分子時，那么在一個實施方案中該延伸是通過聚合酶鏈反應(yīng)進行的；該方法利用雙鏈的目標(biāo)核酸；該方法利用單鏈的目標(biāo)核酸；當(dāng)方法包括可選擇的用限制性內(nèi)切核酸酶消化延伸產(chǎn)物的步驟時，那么在本發(fā)明的一個實施方案中，該方法包括用限制性內(nèi)切核酸酶消化延伸產(chǎn)物的步驟，而在另一個實施方案中省略了用限制性內(nèi)切核酸酶消化延伸產(chǎn)物的步驟；有時在表征單鏈核酸片段以獲得有關(guān)遺傳變異的信息之前，模板核酸可固定于固體支持體上，而在一個實施方案中，不含有切割位點的核酸鏈附著于固體支持體上，可選擇地在該鏈的3’末端或者可選擇地在該鏈的5’末端附著，而在另一個實施方案中，包括經(jīng)過在NS進行切割形成的3’末端的核酸片段的5’末端附著于固體支持體上，而在另一個實施方案中，包括經(jīng)過在NS進行切割形成的5’末端的核酸片段的3’末端附著于固體支持體上；在有些情況下，目標(biāo)核酸和第一個和第二個ODNP可用于形成模板，該模板經(jīng)過擴增程序可提供單鏈核酸片段，且在這些情況下，目標(biāo)核酸或第一個ODNP或第二個ODNP可固定于固體支持體上，而進行延伸以形成模板的第一個或第二個ODNP的末端優(yōu)選地不是連接到固體支持體上的ODNP的末端，且目標(biāo)核酸可非特異性地(即在任一個末端)或者更優(yōu)選地在目標(biāo)核酸的3’末端或5’末端進行固定。
如前文提及的，本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異的方法，而該遺傳變異可為單核苷酸多態(tài)(SNP)。例如，在一方面，本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定SNP的方法，而該方法包括(a)提供部分或完全雙鏈的模板核酸，該模板核酸包含在限定位置包括SNP的目標(biāo)核酸的一部分，并進一步包含位于遺傳變異的5’即SNP的5’的切割位點(NS)。(b)在DNA聚合酶和在NS進行切割的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時在等溫條件下擴增單鏈核酸片段，該單鏈核酸片段包含遺傳變異即SNP、含有不超過17個核苷酸，且其5’末端位于NS。(c)至少用液相層析和/或質(zhì)譜分析法表征單鏈核酸片段以借此鑒定SNP。作為另一個例子，在另一方面，本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸的限定位點鑒定SNP的方法，該方法包括(a)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中如果(i)目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的核苷酸序列和至少基本與位于SNP互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于SNP的3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且進一步包含限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的序列，然而，如果(ii)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含NERS的有義鏈的核苷酸序列和至少基本與位于SNP的5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于SNP的3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列且進一步包含RERS。(b)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含第一個ODNP和第二個ODNP的延伸產(chǎn)物。(c)用識別RERS的限制性內(nèi)切核酸酶(RE)消化步驟(b)中的延伸產(chǎn)物以生產(chǎn)消化產(chǎn)物。(d)用步驟(b)的延伸產(chǎn)物或步驟(c)的消化產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時，于等溫條件下擴增含有不超過17個核苷酸的單鏈核酸片段。(e)至少部分用液相層析和/或質(zhì)譜分析法表征步驟(d)的單鏈片段以借此在目標(biāo)核酸中鑒定SNP。本發(fā)明也提供了在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定單核苷酸多態(tài)(SNP)的方法，該方法包括(a)形成包括第一個ODNP、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中如果(i)目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含第一個限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的核苷酸序列和至少基本與位于SNP互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含第二個RERS的一條鏈的核苷酸序列和至少基本與位于SNP的3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，然而，如果(ii)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含第一個RERS的一條鏈的核苷酸序列和至少基本與位于SNP互補鏈5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含第二個RERS的一條鏈的核苷酸序列和至少基本與位于SNP的3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列。(b)在脫氧核苷三磷酸和至少一種修飾的脫氧核苷三磷酸存在時延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含第一個和第二個RERS兩者的延伸產(chǎn)物。(c)用步驟(b)的延伸產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別第一個RERS和第二個RERS的限制性內(nèi)切核酸酶(RE)存在時，于等溫條件下擴增含有不超過17個核苷酸的單鏈核酸片段。(d)至少部分用液相層析和/或質(zhì)譜分析法表征步驟(c)的單鏈片段以借此鑒定SNP。本發(fā)明也提供了在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定SNP的方法，該方法包括(a)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中如果(i)目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含至少基本與位于SNP互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于SNP的3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，然而，如果(ii)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含至少基本與位于SNP的5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于SNP的3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，而第一個和第二個ODNP各自進一步包含相同切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的核苷酸序列。(b)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含兩個NERS的延伸產(chǎn)物。(c)用步驟(b)的延伸產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時，于等溫條件下擴增含有不超過17個核苷酸的單鏈核酸片段。(d)至少部分用液相層析和/或質(zhì)譜分析法表征步驟(c)的單鏈片段以借此鑒定SNP。在另外一個方面，本發(fā)明提供了在單鏈目標(biāo)核酸的限定位置鑒定單核苷酸多態(tài)(SNP)的方法，該方法包括(a)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中第一個ODNP包含至少基本與位于限定位置3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，第二個ODNP包含至少基本與目標(biāo)核酸互補鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，所述目標(biāo)核酸互補鏈的核苷酸序列位于限定位置的核苷酸的至少基本互補的核苷酸的3’，第一個和第二個ODNP各自進一步包含中斷的限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(IRERS)(而不是完整的IRERS)的第一條鏈的第一個不變識別序列(CRS)和第二條鏈的第二個CRS，完整的IRERS是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸且包含由可變識別序列(VRS)連接的第一個和第二個CRS，且第一個或第二個ODNP進一步包含位于第一個CRS或第二個CRS的5’的NERS。(b)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)具有NERS和完整IRERS的片段，其中SNP位于VRS中。(c)用步驟(b)的延伸產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時，于等溫條件下擴增單鏈核酸片段，其中單鏈片段含有不超過17個核苷酸。(d)至少部分用液相層析和/或質(zhì)譜分析法表征步驟(c)的單鏈片段以借此鑒定SNP。
作為實行在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異如SNP的方法的方便方式，本發(fā)明提供了各種試劑盒。在一方面，當(dāng)目標(biāo)核酸是雙鏈即具有第一和第二鏈時，特別有用的本發(fā)明的試劑盒包括(i)包括切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的核苷酸序列且也包括至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列的第一個寡核苷酸引物(ODNP)。(ii)包括至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列的第二個ODNP。第二個ODNP可選擇地也含有限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的核苷酸序列。在另一方面，當(dāng)目標(biāo)核酸是單鏈時，特別有用的本發(fā)明的試劑盒包括(i)包括與NERS的有義鏈相同的核苷酸序列且進一步包括至少基本與位于遺傳變異互補鏈5’的目標(biāo)核酸中存在的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一個ODNP。(ii)包括至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸中存在的核苷酸序列互補的核苷酸序列的第二個ODNP。第二個ODNP可選擇地包括RERS的一條鏈中存在的核苷酸序列。在另外一個方面，本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異的試劑盒，該試劑盒當(dāng)目標(biāo)核酸是雙鏈即具有第一鏈和第二鏈時特別有用，該試劑盒包括(i)包括至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸的第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列的第一個ODNP。(ii)包括至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列的第二個ODNP。在該試劑盒中，第一個和第二個ODNP各自進一步包括切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列。在另外一個方面，本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異的試劑盒，該試劑盒當(dāng)目標(biāo)核酸是單鏈時特別有用，該試劑盒包括(i)包括至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一個ODNP。(ii)包括至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的第二個ODNP。在該試劑盒中，第一個和第二個ODNP各自進一步包括切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列。本發(fā)明也提供了在具有第一和第二鏈的目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異的試劑盒，包含第一個寡核苷酸引物(ODNP)和第二個寡核苷酸引物(ODNP)，其中(a)第一個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸的第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，(b)第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，(c)第一個和第二個ODNP各自進一步包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列；和(d)由識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶在一條鏈產(chǎn)生的切割位點(NS)和相應(yīng)于由NE在另一條鏈上產(chǎn)生的NS的位置之間的距離不超過25個核苷酸。本發(fā)明也提供了在單鏈目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異的試劑盒，包含第一個寡核苷酸引物(ODNP)和第二個寡核苷酸引物(ODNP)，其中(a)第一個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，(b)第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，(c)第一個和第二個ODNP各自進一步包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列，和(d)由識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶在一條鏈產(chǎn)生的切割位點(NS)和相應(yīng)于由NE在另一條鏈上產(chǎn)生的NS的位置之間的距離不超過25個核苷酸。
可選擇地，在這些在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異如SNP的試劑盒中，可存在下面的標(biāo)準(zhǔn)和/或成分，而任何兩個標(biāo)準(zhǔn)和/或成分可以進行組合以描述試劑盒或其內(nèi)容在根據(jù)本發(fā)明的方法用第一個和第二個ODNP作為引物及用目標(biāo)核酸作為模板進行擴增的雙鏈核酸分子中，由識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)在一條鏈產(chǎn)生的切割位點(NS)和相應(yīng)于由識別RERS的限制性內(nèi)切核酸酶(RE)在另一條鏈上產(chǎn)生的切割位點的位置之間的距離不超過40個、或不超過39個、或不超過38個、或不超過37個、或不超過36個、或不超過35個、或不超過34個、或不超過33個、或不超過32個、或不超過31個、或不超過30個、或不超過29個、或不超過28個、或不超過27個、或不超過26個、或不超過25個、或不超過24個、或不超過23個、或不超過22個、或不超過21個、或不超過20個、或不超過19個、或不超過18個、或不超過17個、或不超過16個、或不超過15個、或不超過14個、或不超過13個、或不超過12個、或不超過11個、或不超過10個、或不超過9個、或不超過8個、或不超過7個、或不超過6個、或不超過5個核苷酸；在用第一個和第二個ODNP作為引物及用目標(biāo)核酸作為模板進行擴增的雙鏈核酸分子中，由識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)在一條鏈產(chǎn)生的切割位點(NS)和相應(yīng)于由NE在另一條鏈上產(chǎn)生的NS的位置之間的距離不超過40個、或不超過39個、或不超過38個、或不超過37個、或不超過36個、或不超過35個、或不超過34個、或不超過33個、或不超過32個、或不超過31個、或不超過30個、或不超過29個、或不超過28個、或不超過27個、或不超過26個、或不超過25個、或不超過24個、或不超過23個、或不超過22個、或不超過21個、或不超過20個、或不超過19個、或不超過18個、或不超過17個、或不超過16個、或不超過15個、或不超過14個、或不超過13個、或不超過12個、或不超過11個、或不超過10個、或不超過9個、或不超過8個、或不超過7個、或不超過6個、或不超過5個核苷酸；NERS具有序列5’GAGTC3’；N.BstNB I；N.BstNB I的緩沖液；識別RERS的限制性內(nèi)切核酸酶(RE)；RE的緩沖液；DNA聚合酶；選自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和exo-Vent聚合酶的DNA聚合酶；DNA聚合酶的緩沖液；NE和DNA聚合酶兩者的緩沖液；使用試劑盒的說明書；液相層析柱；反相液相層析柱；包含水和與有機或無機酸復(fù)合的仲或叔胺銨鹽的緩沖液A，該銨鹽的胺成分可選擇地選自三乙胺、二烯丙基胺、二異丙基胺、N，N-二甲基-N-環(huán)己基胺、N，N-二甲基-N-異丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺，該仲或叔胺可選擇地與有機酸復(fù)合，該有機酸可選擇地選自乙酸、丙酸及其鹵化形式；包含緩沖液A和有機溶劑的緩沖液B，該有機溶劑可選擇地選自甲醇和乙腈；脫氧核苷三磷酸；修飾的脫氧核苷三磷酸；對照模板核酸分子和對照ODNP對；海藻糖；寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)；和/或用于設(shè)計或定購ODNP對的軟件存取碼。例如，試劑盒可進一步包括識別RERS的RE和RE的緩沖液、識別NERS的NE和NE的緩沖液以及DNA聚合酶和DNA聚合酶的緩沖液。
除提供了在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異的方法之外，本發(fā)明還提供了在(多個)目標(biāo)核酸的限定位置多重鑒定(多個)遺傳變異的方法。因而，單個樣品可含有兩個或多個核酸，每一個核酸均具有遺傳變異。通過適當(dāng)選擇引物，可分析具有特定遺傳變異的核酸的存在與否，或特定遺傳變異是否存在于特定核酸樣品中，該樣品含有多個潛在的遺傳變異。例如，在一方面，本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸的限定位置多重鑒定遺傳變異的方法，該方法包括(a)對于所研究的目標(biāo)核酸中的每一個遺傳變異，(i)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中a)如果研究中的目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列和至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的可選擇的序列和至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，而b)如果研究中的目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含NERS的有義鏈的序列和至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含RERS的一條鏈的可選擇的序列和至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列。(ii)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)由第一個和第二個ODNP包圍的片段，其中延伸反應(yīng)可單獨對每一個目標(biāo)核酸或共同對超過一個目標(biāo)核酸來進行。(b)可選擇地，即該步驟可根據(jù)本發(fā)明的方法進行或不進行，用識別RERS的RE切割延伸產(chǎn)物以提供消化產(chǎn)物。(c)用步驟(a)(ii)的每一個延伸產(chǎn)物或步驟(c)的每一個消化產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時擴增單鏈核酸片段。(d)表征擴增的單鏈片段以借此鑒定遺傳變異。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸的限定位置多重鑒定單核苷酸多態(tài)的方法，該方法包括(a)對于每一個目標(biāo)核酸，(i)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中a)如果目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列和至少基本與位于SNP互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的序列和至少基本與位于SNP的3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，或者如果b)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含NERS的有義鏈的序列和至少基本與位于SNP的5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含RERS的一條鏈的序列和至少基本與位于SNP的3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列。(ii)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)由第一個和第二個ODNP包圍的片段，其中延伸反應(yīng)可單獨對每一個目標(biāo)核酸或共同對超過一個目標(biāo)核酸來進行。(b)用識別RERS的RE切割延伸產(chǎn)物以提供消化產(chǎn)物。(c)用步驟(a)(ii)的每一個延伸產(chǎn)物或步驟(c)的每一個消化產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶存在時擴增單鏈核酸片段，優(yōu)選在等溫條件下。(d)至少部分用液相層析和/或質(zhì)譜分析法來表征單鏈片段以借此鑒定遺傳變異。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸的限定位置多重鑒定遺傳變異的方法，該方法包括(a)對于每一個目標(biāo)核酸，(i)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中a)如果且當(dāng)目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸時，那么第一個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，然而，如果且當(dāng)b)目標(biāo)核酸是單鏈核酸時，那么第一個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，在每一種情況下，第一個和第二個ODNP各自進一步包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列，(ii)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)具有兩個NERS的片段，其中延伸反應(yīng)可單獨對每一個目標(biāo)核酸或共同對超過一個目標(biāo)核酸來進行。(b)用每一個延伸產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時擴增單鏈核酸片段。(c)表征步驟(b)的單鏈片段以借此鑒定遺傳變異。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸的限定位置多重鑒定單核苷酸多態(tài)(SNP)的方法，該方法包括(a)對于每一個目標(biāo)核酸，(i)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和目標(biāo)核酸的混合物，其中如果a)目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含至少基本與位于SNP互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于SNP的3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，然而，如果b)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含至少基本與位于SNP的5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與位于SNP的3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，在每一種情況下，第一個和第二個ODNP各自進一步包含同一切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列；且(ii)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)具有兩個NERS的片段，其中延伸反應(yīng)可單獨對每一個目標(biāo)核酸或共同對超過一個目標(biāo)核酸來進行。(b)用每一個延伸產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時，于等溫條件下擴增單鏈核酸片段，其中單鏈核酸片段各自優(yōu)選地含有不超過17個核苷酸。(c)至少部分用液相層析和/或質(zhì)譜分析法來表征步驟(b)的單鏈片段以借此鑒定遺傳變異。
在(多個)目標(biāo)核酸的限定位置多重鑒定(多個)遺傳變異的方法中，一種或多種額外的標(biāo)準(zhǔn)可用于描述該方法，而這些額外的標(biāo)準(zhǔn)在此處公開并包括那些在上文中連同用于在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異如SNP的本發(fā)明的方法一起闡明的標(biāo)準(zhǔn)，這些標(biāo)準(zhǔn)的任何一個或多個可用于描述本發(fā)明的方法。例如，一些可用于描述在(多個)目標(biāo)核酸的限定位置多重鑒定(多個)遺傳變異的方法的標(biāo)準(zhǔn)包括至少一個遺傳變異是SNP；至少一個遺傳變異與疾病如人類遺傳疾病相關(guān)；至少一個遺傳變異與病原微生物的藥物抗性相關(guān)；至少一個目標(biāo)核酸是基因組核酸；至少一個目標(biāo)核酸是cDNA；至少一個目標(biāo)核酸源自病原病毒的基因組；至少一個目標(biāo)核酸源自病原細(xì)菌的基因組；至少一個目標(biāo)核酸源自病原細(xì)菌的附加體；如果目標(biāo)核酸是雙鏈時至少基本與目標(biāo)核酸第一鏈互補的或如果目標(biāo)核酸是單鏈時與目標(biāo)核酸相同的第一個ODNP的核苷酸序列長度為至少8個、或至少9個、或至少10個、或至少11個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個核苷酸；如果目標(biāo)核酸是雙鏈時至少基本與目標(biāo)核酸第二鏈互補的或如果目標(biāo)核酸是雙鏈時與目標(biāo)核酸互補的第二個ODNP的核苷酸序列長度為至少8個、或至少9個、或至少10個、或至少11個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個核苷酸；RERS可由II型限制性內(nèi)切核酸酶識別；RERS可由IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別；RERS可由Bpm I識別；RERS可由間斷的限制性內(nèi)切核酸酶識別；NERS是5’GAGTC3’；延伸是用聚合酶鏈反應(yīng)進行的；擴增是在DNA聚合酶如exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶存在時進行的；擴增是在等溫條件下進行的；步驟(c)的單鏈核酸片段含有不超過20個、或不超過19個、或不超過18個、或不超過17個、或不超過16個、或不超過15個、或不超過14個、或不超過13個、或不超過12個、或不超過11個、或不超過10個核苷酸；表征包括一種或多種選自質(zhì)譜分析法、液相層析、熒光偏振、電子電離、凝膠電泳和毛細(xì)管電泳的技術(shù)；表征是由包括質(zhì)譜分析法的一種或多種方法進行的；該方法進一步包括在進行步驟(c)之前組合步驟(a)(ii)中至少兩個延伸反應(yīng)的產(chǎn)物的步驟；在進行步驟(c)之前組合步驟(a)(ii)中每一個延伸反應(yīng)的產(chǎn)物的步驟；該方法包括用識別RERS的RE切割延伸產(chǎn)物以提供消化產(chǎn)物的步驟；該方法省略了用識別RERS的RE切割延伸產(chǎn)物的步驟，從而未形成消化產(chǎn)物。
在另一套相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明提供了可用于在目標(biāo)核酸的位置多重鑒定遺傳變異的方法的試劑盒。在這些實施方案之一中，對于每一個研究中的目標(biāo)核酸，該試劑盒包括(a)如果目標(biāo)核酸是具有第一和第二鏈的雙鏈核酸，那么試劑盒具有(i)包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列及至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列的第一個寡核苷酸引物(ODNP)，和(ii)可選擇地包括限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的一條鏈的核苷酸序列的且具有至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列的第二個ODNP；且如果(b)一個或多個目標(biāo)核酸是單鏈的，那么對于每一個單鏈目標(biāo)核酸，該試劑盒包括(i)包含NERS的有義鏈的序列和至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一個ODNP，和(ii)第二個ODNP，該ODNP可選擇地包含與RERS的一條鏈相同的核苷酸序列，并且必須含有至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了用于在目標(biāo)核酸的限定位置多重鑒定遺傳變異的方法的試劑盒，對于每一個研究中的目標(biāo)核酸，該試劑盒包括(a)如果特別的目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么對于每一個類型的目標(biāo)核酸，該試劑盒具有(i)包含至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列的第一個寡核苷酸引物(ODNP)，和(ii)包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列的第二個ODNP；然而對于(b)每一個研究中的目標(biāo)核酸是單鏈核酸，該試劑盒包括(i)包含至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一個ODNP，和(ii)包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的第二個ODNP，其中第一個和第二個ODNP進一步包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列。
在目標(biāo)核酸的位置多重鑒定遺傳變異的方法中特別有用的本發(fā)明的試劑盒中，一種或多種下面的標(biāo)準(zhǔn)可用于描述該試劑盒，而這些標(biāo)準(zhǔn)可進行任何組合，且該試劑盒設(shè)計為用于如在此處所描述的多重鑒定遺傳變異的方法中，且這些標(biāo)準(zhǔn)是非限制性的，即其他標(biāo)準(zhǔn)可在文中其它地方出現(xiàn)存在于核酸分子中的NERS具有序列5’GAGTC3’；N.BstNB I存在于試劑盒中；該試劑盒含有N.BstNB I的緩沖液；該試劑盒含有識別RERS的限制性內(nèi)切核酸酶(RE)；該試劑盒含有RE的緩沖液；該試劑盒含有DNA聚合酶；該試劑盒含有一種或多種exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；該試劑盒含有DNA聚合酶的緩沖液；該試劑盒含有適合于切割性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶的緩沖液；該試劑盒含有適合于NE的緩沖液和適合于DNA聚合酶的不同緩沖液；使用試劑盒的說明書；液相層析柱；反相液相層析柱；包含水和與有機或無機酸復(fù)合的仲或叔胺銨鹽的緩沖液A，該銨鹽的胺成分可選擇地選自三乙胺、二烯丙基胺、二異丙基胺、N，N-二甲基-N-環(huán)己基胺、N，N-二甲基-N-異丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺，該仲或叔胺可選擇地與有機酸復(fù)合，該有機酸可選擇地選自乙酸、丙酸及其鹵化形式；包含緩沖液A和有機溶劑的緩沖液B，該有機溶劑可選擇地選自甲醇和乙腈；脫氧核苷三磷酸；修飾的脫氧核苷三磷酸；對照模板核酸分子和對照ODNP對；海藻糖；寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)；和/或用于設(shè)計或定購ODNP對的軟件存取碼。例如，試劑盒可進一步包括識別RERS的RE和RE的緩沖液、識別NERS的NE和NE的緩沖液以及DNA聚合酶和DNA聚合酶的緩沖液。
在另一方面，本發(fā)明提供了確定樣品中目標(biāo)核酸存在與否的方法。這些方法在診斷中是特別有用的，在該診斷中，想要的是確定特定樣品如來自病人的樣品是否含有特定目標(biāo)核酸，如在致病生物體中通常發(fā)現(xiàn)的核酸。在一個實施方案中，該方法包括(a)使存在于樣品中的核酸分子與部分雙鏈的寡核苷酸探針混合。使核酸分子與探針在允許探針與可能存在于樣品中的目標(biāo)核酸進行雜交的條件下混合。該探針特征在于具有(i)可由切割劑(NA)識別的切割劑識別序列(NARS)，該切割劑在切割位點(NS)進行切割，和(ii)含有NS或進行延伸能含有NS的一條鏈中的5’突出端，或者不含有NS或不能進行延伸以含有NS的一條鏈中的3’突出端，其中在每一種情況下，突出端包括至少基本與存在于目標(biāo)核酸中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。(b)從步驟(a)的混合物中去除未雜交的探針。(c)在NA和DNA聚合酶存在時進行擴增反應(yīng)以提供擴增產(chǎn)物，該擴增反應(yīng)優(yōu)選地是在與目標(biāo)核酸雜交的探針上進行的。(d)探測步驟(c)的擴增產(chǎn)物的存在與否以借此確定樣品中目標(biāo)核酸的存在與否。在相關(guān)的涉及確定生物學(xué)樣品中目標(biāo)核酸存在與否的方法的方面，該方法包括(a)使樣品的核酸分子與部分雙鏈的寡核苷酸探針混合以使得探針與目標(biāo)核酸進行雜交，該探針包含(i)可由切割性內(nèi)切核酸酶(NE)識別的切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)，當(dāng)識別了NERS之后，NE在雙鏈核酸的稱作切割位點(NS)的位置上產(chǎn)生了切口，和(ii)含有NS的探針鏈中的或進行延伸并在延伸后含有NS的探針鏈中的5’突出端，或者不含有NS的或不能進行延伸以含有NS的鏈中的3’突出端，其中突出端(不論5’還是3’)包含至少基本與目標(biāo)核酸互補的核苷酸序列。(b)從步驟(a)的混合物中去除未雜交的探針。(c)在NA和DNA聚合酶存在時，優(yōu)選地于等溫條件下進行擴增反應(yīng)以提供擴增產(chǎn)物，該擴增產(chǎn)物優(yōu)選地含有不超過17個核苷酸。(d)優(yōu)選地至少部分用液相層析和/或質(zhì)譜分析法探測步驟(c)的擴增產(chǎn)物的存在與否，該探測步驟使得能夠確定目標(biāo)核酸是否存在于樣品中。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了確定樣品中是否存在目標(biāo)核酸的方法，該方法包括(A)形成混合物，該混合物包括(i)來自目標(biāo)樣品的核酸分子，這些核酸分子可包括或不包括目標(biāo)核酸；(ii)單鏈核酸探針，該探針從3’到5’包含(a)至少基本與存在于目標(biāo)核酸中的核苷酸序列互補的第一個核苷酸序列，(b)切割劑識別序列(NARS)反義鏈的核苷酸序列，和(c)第二個序列；(iii)識別NARS的切割性內(nèi)切核酸酶(NA)、DNA聚合酶和一種或多種脫氧核苷三磷酸。(B)在一定條件下維持步驟(A)中的混合物，在該條件下如果目標(biāo)核酸存在于樣品中則可用單鏈核酸探針作為模板擴增單鏈核酸片段。在一個實施方案中，單鏈核酸片段長度最多為25個核苷酸。(C)探測步驟(B)中擴增的單鏈核酸片段的存在與否以確定樣品中目標(biāo)核酸的存在與否。在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明提供了確定樣品中是否存在目標(biāo)核酸的方法，該方法包括(A)形成混合物，該混合物包括(i)來自樣品的核酸分子；(ii)單鏈核酸探針，該探針從3’到5’包含(a)至少基本與存在于所研究的目標(biāo)核酸中的核苷酸序列互補的核苷酸序列，(b)切割劑識別序列(NARS)有義鏈的核苷酸序列，和(iii)識別第一個NARS的切割性內(nèi)切核酸酶(NA)、DNA聚合酶和一種或多種脫氧核苷三磷酸。(B)在一定條件下維持混合物，該條件使得如果目標(biāo)核酸存在于樣品中則能夠擴增至少基本與目標(biāo)核酸互補的單鏈核酸片段。在一個實施方案中，單鏈核酸片段長度最多為25個核苷酸。(C)探測步驟(B)中擴增的單鏈核酸片段的存在與否以確定樣品中目標(biāo)核酸的存在與否。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了確定樣品中是否存在目標(biāo)核酸的方法，該目標(biāo)核酸包括切割劑識別序列(NARS)。該方法包括(A)形成混合物，該混合物包括(i)樣品的核酸分子，和(ii)識別NARS的切割劑(NA)、DNA聚合酶和一種或多種脫氧核苷三磷酸。(B)在一定條件下維持(A)中的混合物，該條件使得如果目標(biāo)核酸存在于樣品中則可用目標(biāo)核酸的部分作為模板擴增單鏈核酸片段。(C)探測步驟(B)中擴增的單鏈核酸片段的存在與否以確定樣品中目標(biāo)核酸的存在與否。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了確定目標(biāo)核酸是否存在的方法，該目標(biāo)核酸具有包括第一個切割劑識別序列(NARS)的核苷酸序列的核苷酸序列。該方法包括(A)形成混合物，該混合物包括(i)樣品的核酸分子，(ii)基本與目標(biāo)核酸的一條鏈相同且包含與NARS的反義鏈核苷酸序列相同的核苷酸序列的單鏈核酸探針，和(iii)識別NARS的切割劑(NA)、DNA聚合酶和一種或多種脫氧核苷三磷酸。(B)在一定條件下維持混合物，該條件使得在目標(biāo)核酸存在于樣品中的情況下可用探針的部分作為模板擴增單鏈核酸片段。(C)探測步驟(B)中單鏈核酸片段的存在與否以確定樣品中目標(biāo)核酸的存在與否。在相關(guān)的方法中，本發(fā)明提供了確定樣品中是否存在目標(biāo)核酸的方法。該方法包括(A)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和樣品核酸分子的混合物，其中(i)如果目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含第一個限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)的有義鏈的核苷酸序列和至少基本與目標(biāo)核酸第一鏈的第一部分互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與目標(biāo)核酸第二鏈的第二部分互補的核苷酸序列且包含第二個RERS的有義鏈的序列，其中該第二部分位于目標(biāo)核酸第二鏈中第一部分互補鏈的3’，然而，如果(ii)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含第一個RERS的有義鏈的核苷酸序列和至少基本與目標(biāo)核酸第一部分相同的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與目標(biāo)核酸第二部分互補的核苷酸序列且包含第二個RERS的有義鏈的序列，其中該第二部分位于目標(biāo)核酸中第一部分的5’。(B)將(A)的混合物置于一定條件下，如果目標(biāo)核酸存在于樣品中，該條件將(i)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含第一個和第二個RERS兩者的延伸產(chǎn)物；和(ii)用步驟(B)(i)的延伸產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別第一個和第二個RERS的一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶(RE)存在時擴增單鏈核酸片段。在一個實施方案中，單鏈核酸片段長度最多為25個核苷酸。(C)探測步驟(B)中擴增的單鏈核酸片段的存在與否以確定樣品中目標(biāo)核酸的存在與否?？蛇x擇地，第一個RERS與第二個RERS相同。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了確定樣品中是否存在目標(biāo)核酸的方法。該方法包括(A)形成包括第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和樣品核酸分子的混合物，其中(i)如果目標(biāo)核酸是具有第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸，那么第一個ODNP包含存在于第一個切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈中的核苷酸序列和至少基本與目標(biāo)核酸第一鏈的第一部分互補的核苷酸序列，且第二個ODNP包含至少基本與目標(biāo)核酸第二鏈的第二部分互補的核苷酸序列且進一步包含第二個NERS的有義鏈的核苷酸序列，其中該第二部分位于目標(biāo)核酸第二鏈中第一部分互補鏈的3’，或者，如果(ii)目標(biāo)核酸是單鏈核酸，那么第一個ODNP包含第一個NERS的有義鏈的核苷酸序列和至少基本與目標(biāo)核酸第一部分相同的核苷酸序列，而第二個ODNP包含至少基本與目標(biāo)核酸第二部分互補的核苷酸序列且進一步包含第二個NERS的有義鏈的序列，其中該第二部分位于目標(biāo)核酸中第一部分的5’。(B)將混合物置于一定條件下，如果目標(biāo)核酸存在于樣品中，則(i)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含第一個和第二個NERS兩者的延伸產(chǎn)物；和(ii)用步驟(B)(i)的延伸產(chǎn)物的一條鏈作為模板，在識別第一個和第二個NERS的一種或多種切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時擴增單鏈核酸片段。在一個實施方案中，單鏈核酸片段長度為最多25個核苷酸。(C)探測步驟(B)中擴增的單鏈核酸片段的存在與否以確定樣品中目標(biāo)核酸的存在與否。在一個實施方案中，第一個NERS與第二個NERS相同。在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供了確定樣品中是否存在目標(biāo)核酸的方法，該方法包括(A)形成混合物，該混合物包括(i)來自樣品的核酸分子，和(ii)單鏈核酸探針，該探針從3’到5’包含至少基本與位于或靠近目標(biāo)核酸5’末端的目標(biāo)核酸部分互補的核苷酸序列和切割劑識別序列(NARS)反義鏈的序列。(B)將與目標(biāo)雜交的探針分子如果存在與那些未與目標(biāo)雜交的進行分離。(C)在與目標(biāo)雜交的探針分子(如果存在)和識別NARS的切割劑(NA)存在時進行擴增反應(yīng)。(D)探測步驟(C)中用單鏈核酸探針作為模板擴增的單鏈核酸片段的存在與否以確定樣品中目標(biāo)核酸的存在與否。在本發(fā)明涉及確定樣品中是否存在目標(biāo)核酸的方法的另一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供了方法，包括(A)形成混合物，該混合物包括(i)樣品的核酸分子，(ii)經(jīng)由其5’末端固定于固體支持體上的單鏈核酸探針，該探針從3’到5’的方向包含(a)至少基本與位于或靠近目標(biāo)的3’末端的目標(biāo)部分互補的核苷酸序列，和(b)切割劑識別序列有義鏈的序列。(B)去除樣品中未與探針進行雜交的核酸分子，使其不與固體支持體接觸。(C)在固定于步驟(B)的固體支持體上的探針和識別切割劑識別序列的切割劑存在時進行擴增反應(yīng)。(D)探測步驟(C)中用目標(biāo)核酸的部分作為模板擴增的單鏈核酸片段的存在與否以確定樣品中目標(biāo)核酸的存在與否。
在本發(fā)明涉及確定樣品中目標(biāo)核酸存在與否的各個實施方案中，一種或多種下面的標(biāo)準(zhǔn)可用于描述實施方案，而任何2個、3個、4個等標(biāo)準(zhǔn)可進行組合以描述實施方案，且這些實施方案是附加于其他在別處描述的實施方案的步驟(d)至少部分由選自發(fā)光光譜法、熒光光譜法、質(zhì)譜分析法、液相層析、熒光偏振、凝膠電泳和毛細(xì)管電泳的技術(shù)進行，而表征可由這些技術(shù)的1種、2種、3種或更多來進行，和/或表征可用其他適當(dāng)?shù)暮?或易于采用的表征技術(shù)加上這些技術(shù)的1種、2種、3種或更多來進行；樣品中的目標(biāo)核酸均為單鏈的；樣品中的目標(biāo)核酸均為雙鏈的；樣品中的目標(biāo)核酸是單鏈和雙鏈目標(biāo)核酸的混合物；含有目標(biāo)核酸或目標(biāo)核酸所源自的生物學(xué)樣品源自哺乳動物，如人類、母牛、馬、狗、綿羊、鹿、豬，或可描述為來自患者的；目標(biāo)核酸是源自宿主的核酸分子，該宿主選自細(xì)菌、和/或病毒、和/或真菌、和/或寄生物；NA是N.BstNB I；擴增是在DNA聚合酶存在時進行的，下面是示例性的適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶，且下面的DNA聚合酶中的任何兩個或更多可進行組合以形成本發(fā)明所用的DNA聚合酶所選自的組合exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌體M2 DNA聚合酶、噬菌體phiPRD1 DNA聚合酶、測序酶、PRD1DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶，例如，聚合酶可選自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；擴增是在等溫條件下進行的；擴增是在標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸存在時進行的；擴增是在標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸存在時進行的，該標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸是與標(biāo)記連接的脫氧核苷三磷酸，該標(biāo)記可為放射性標(biāo)記和/或酶和/或熒光染料和/或洋地黃毒苷和/或生物素，這些是示例性的標(biāo)記；探測擴增產(chǎn)物是否已形成，且如果已形成了，則進一步探測擴增產(chǎn)物的一些或全部核苷酸序列，這是至少部分由一種或多種包括發(fā)光光譜法、熒光光譜法、質(zhì)譜分析法、液相層析、熒光偏振、凝膠電泳和毛細(xì)管電泳的技術(shù)實現(xiàn)的，例如，分析可用發(fā)光光譜法、熒光光譜法或質(zhì)譜分析法實現(xiàn)；如果存在，擴增產(chǎn)物含有不超過3個、或4個、或5個、或6個、或7個、或8個、或9個、或10個、或11個、或12個、或13個、或14個、或15個、或16個、或17個、或18個、或19個、或20個、或21個、或22個、或23個、或24個、或25個、或26個、或27個、或28個、或29個、或30個、或31個、或32個、或33個、或34個、或35個、或36個、或37個、或38個、或39個、或40個、或41個、或42個、或43個、或44個、或45個、或46個、或47個、或48個、或49個、或不超過50個核苷酸；存在于樣品中的核酸分子固定于固體支持體上；擴增產(chǎn)物在探測之前固定于固體基質(zhì)上；單鏈核酸探針固定于固體支持體上。
作為進行確定特定目標(biāo)核酸是否存在于樣品中的方法的方式，本發(fā)明提供了各種試劑盒。在各個實施方案中，試劑盒包括一種或多種下面的成分，而這些成分的任何兩個或多個可進行組合以描述根據(jù)本發(fā)明的試劑盒如在前文描述的涉及確定樣品中目標(biāo)核酸是否存在的方法中的部分雙鏈寡核苷酸探針；兩個單鏈寡核苷酸，當(dāng)它們相互退火時，產(chǎn)生如在前文涉及確定樣品中目標(biāo)核酸是否存在的方法中描述的雙鏈寡核苷酸探針；其中NARS由N.BstNB I識別的試劑盒；包括N.BstNB I的試劑盒；N.BstNB I的緩沖液；識別NARS的NA；DNA聚合酶；DNA聚合酶的緩沖液；適合于NE和DNA聚合酶兩者的緩沖液；適合于NE的緩沖液和適合于DNA聚合酶的不同緩沖液；exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和exo-Vent聚合酶中的至少一種；標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸，該標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸可為如與放射性標(biāo)記連接的、與酶連接的、與熒光染料連接的、與洋地黃毒苷連接的或與生物素連接的脫氧核苷三磷酸；使用試劑盒的說明書；液相層析柱；反相液相層析柱；包含水和與有機或無機酸復(fù)合的仲或叔胺銨鹽的緩沖液A，該銨鹽的胺成分可選擇地選自三乙胺、二烯丙基胺、二異丙基胺、N，N-二甲基-N-環(huán)己基胺、N，N-二甲基-N-異丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺，該仲或叔胺可選擇地與有機酸復(fù)合，該有機酸可選擇地選自乙酸、丙酸及其鹵化形式；包含緩沖液A和有機溶劑的緩沖液B，該有機溶劑可選擇地選自甲醇和乙腈；脫氧核苷三磷酸；修飾的脫氧核苷三磷酸；對照模板核酸分子和對照ODNP對；海藻糖；寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)；用于設(shè)計或定購探針的軟件存取碼；用可結(jié)合核酸分子的化學(xué)層包被的針，例如用聚乙烯亞胺層包被的針，或用PDADMAC即聚二烯丙基二甲基氯化銨(polydiallyldimethylammonium chloride)包被的針；和/或海藻糖。
本發(fā)明也提供了多重確定生物學(xué)樣品中多個目標(biāo)核酸存在與否的方法。在一個實施方案中，該方法包括(a)使來自生物學(xué)樣品中的核酸分子與部分雙鏈的寡核苷酸探針混合以使得探針與可能存在于樣品中的任何目標(biāo)核酸進行雜交，其中每一個探針包含(1)可由NA識別的切割劑識別序列(NARS)，當(dāng)識別了NARS之后，NA將在位于稱作切割位點(NS)的位置切割核酸的雙鏈部分，(2)含有NS或能延伸以含有NS的鏈中的5’突出端，或者不含有NS且根據(jù)本發(fā)明的方法不能進行延伸以形成NS的鏈中的3’突出端，該突出端(不論是5’還是3’)包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸互補的核苷酸序列，和(3)位于不含有NS且根據(jù)本發(fā)明的方法不能進行延伸以形成NS的鏈中的序列，該序列位于相應(yīng)于NS的位置的5’，且該序列唯一地與目標(biāo)核酸(其中突出端與該目標(biāo)核酸至少基本互補)相關(guān)。(3)的序列有效地提供了對于特定目標(biāo)核酸唯一的信號，從而對該信號的探測表示由(3)的序列“編碼”的特定目標(biāo)核酸的存在。(b)從步驟(a)的混合物中去除未雜交的探針。(c)在NA和DNA聚合酶存在時進行擴增反應(yīng)。(d)探測步驟(c)的擴增產(chǎn)物的存在與否以借此確定生物學(xué)樣品中與擴增產(chǎn)物序列相關(guān)的目標(biāo)核酸的存在與否。在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供了多重確定生物學(xué)樣品中目標(biāo)核酸存在與否的方法，該方法包括(a)使生物學(xué)樣品中的核酸分子與部分雙鏈的寡核苷酸探針在使得探針能夠與目標(biāo)核酸進行雜交的條件下混合，其中每一個探針包含(1)可由切割性內(nèi)切核酸酶(NE)識別的切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)，該NE可在靠近NERS的稱作切割位點(NS)的位點切割雙鏈核酸分子，(2)不含有NS且根據(jù)本發(fā)明的方法不能進行延伸以形成NS的鏈中的5’突出端，或者不含有NS且根據(jù)本發(fā)明的方法不能進行延伸以形成NS的鏈中的3’突出端，該突出端(不論是5’還是3’突出端)包含至少基本與目標(biāo)核酸互補的核苷酸序列，和(3)位于不含有NS且根據(jù)本發(fā)明的方法不能進行延伸以形成NS的鏈中的序列，該序列位于相應(yīng)于NS的位置的5’，且該序列唯一地與目標(biāo)核酸(其中突出端與該目標(biāo)核酸至少基本互補)相關(guān)。(3)的序列有效地提供了對于特定目標(biāo)核酸唯一的信號，從而對該信號的探測表示由(3)的序列“編碼”的特定目標(biāo)核酸的存在。(b)從步驟(a)的混合物中去除未雜交的探針。(c)在NE和DNA聚合酶存在時，優(yōu)選地于等溫條件下進行擴增反應(yīng)以提供擴增產(chǎn)物。在各個實施方案中，擴增產(chǎn)物各自含有不超過17、16、15、14、13或12個核苷酸。(d)探測步驟(c)的擴增產(chǎn)物的存在與否以確定生物學(xué)樣品中與擴增產(chǎn)物的序列相關(guān)的目標(biāo)核酸的存在?？蛇x擇地，探測步驟需要至少部分使用液相層析和/或質(zhì)譜分析法。
在進一步描述本發(fā)明涉及多重確定生物學(xué)樣品中目標(biāo)核酸存在與否的方法中，可利用一個或多個額外的標(biāo)準(zhǔn)。部分地，在上文中連同本發(fā)明涉及確定樣品中目標(biāo)核酸存在與否的方法一起闡明的標(biāo)準(zhǔn)也可以任何組合用于進一步表征本發(fā)明涉及多重確定生物學(xué)樣品中目標(biāo)核酸存在與否的方法。例如，樣品可來自患者。其他適合于進一步表征多重確定生物學(xué)樣品中目標(biāo)核酸存在與否的標(biāo)準(zhǔn)可出現(xiàn)于文中別處。同樣地，該方法可用固定于固體支持體上的核酸分子來進行。例如，可將探針以任何陣列形式固定于固體支持體上的唯一位置?？蛇x擇地，可將探針無區(qū)別地固定于固體支持體上。在每一種情況下，含有目標(biāo)核酸的樣品將與固定的探針接觸?？蛇x擇地，可將目標(biāo)核酸固定于固體支持體上，然后將探針添加到支持體上以使其與固定的目標(biāo)接觸。
本發(fā)明也提供了可用于如在此處所描述的多重確定生物學(xué)樣品中幾個目標(biāo)核酸存在與否的方法中的試劑盒。這些試劑盒可包括前文中對用于非多重方法中的試劑盒描述的成分中的一些或全部，該非多重方法為確定一個生物學(xué)樣品中一個目標(biāo)核酸存在與否的方法。對于多重方法特別有用的該試劑盒可簡單地包括更多探針，或更多可用于制備探針的單鏈寡核苷酸，從而檢驗多個目標(biāo)的存在。同樣地，當(dāng)試劑盒含有多個探針(或探針成分)時，設(shè)計該多個探針或其成分以對不同目標(biāo)提供獨特信號。在一方面，該試劑盒含有2個不同的探針(或探針成分)，而在另一方面，試劑盒含有3個、或4個、或5個、或6個、或7個、或8個、或9個、或10個、或11個、或12個、或13個、或14個、或15個、或16個、或17個、或18個、或19個、或20個、或22個、或24個、或26個、或28個、或30個、或35個、或40個、或45個、或50個、或55個、或60個、或65個、或70個、或75個、或80個、或85個、或90個、或95個、或100個不同的探針或探針成分。該試劑盒可包括固定的探針，如在固體表面固定于唯一位置的探針，或在固體表面無區(qū)別地固定的探針。
當(dāng)核酸根據(jù)本發(fā)明的方法或組合物或試劑盒固定于固體支持體上時，適當(dāng)?shù)墓腆w支持體包括完全或部分由硅、玻璃、紙、陶瓷、金屬、準(zhǔn)金屬(metalloid)和塑料形成的材料。在一個實施方案中，固體支持體是用結(jié)合核酸分子的化學(xué)層包被的。一種適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)層由聚乙烯亞胺形成。另一種適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)層由PDADMAC即聚二烯丙基二甲基氯化銨形成。
在另一方面，本發(fā)明提供了確定核酸分子群體中第一個核酸分子的數(shù)目與第二個核酸分子的數(shù)目之間的比率的方法，其中第一個和第二個核酸分子的核苷酸序列除限定的位置之外是相同的。該方法包括(a)混合第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和核酸群體，其中如果(i)第一個和第二個核酸是雙鏈的，均具有第一鏈和第二鏈，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與存在于第一個核酸分子第一鏈的核酸序列互補的核苷酸序列，該序列位于限定位置的3’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與存在于第一個核酸第二鏈的核酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列也位于限定位置的3’，然而，如果(ii)第一個和第二個核酸是單鏈的，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與存在于第一個核酸分子中的核酸序列相同的核苷酸序列，該核苷酸序列位于限定位置的5’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與存在于第一個核酸中的核酸序列互補的核苷酸序列，該序列位于限定位置的3’。此外，第一個ODNP和第二個ODNP的至少一個進一步包含切割劑識別序列(NARS)的有義鏈的核苷酸序列。(b)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含第一個和第二個ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和識別NARS的切割劑(NA)存在時擴增單鏈核酸片段。(d)確定源自第一個核酸的步驟(c)的單鏈核酸片段的數(shù)目相對于源自第二個核酸的單鏈核酸片段數(shù)目的比率。本發(fā)明也提供了確定核酸分子群體中第一個核酸分子的數(shù)目與第二個核酸分子的數(shù)目之間的比率的方法，其中第一個和第二個核酸分子的核苷酸序列除限定的位置之外是相同的。該方法包括(a)混合第一個ODNP、第二個ODNP和核酸群體，其中如果(i)第一個和第二個核酸是雙鏈的(即每一個均具有第一鏈和第二鏈)，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與第一個核酸分子第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于限定位置的3’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與第一個核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于限定位置的3’，或者，如果(ii)第一個和第二個核酸各自是單鏈的，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與存在于第一個核酸分子中的核酸序列相同的核苷酸序列，該核苷酸序列在第一個核酸中位于限定位置的5’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與存在于第一個核酸中的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于第一個核酸中限定位置的3’。此外，第一個ODNP和第二個ODNP的至少一個進一步包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的核苷酸序列。(b)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含第一個和第二個ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時，優(yōu)選地于等溫條件下擴增單鏈核酸片段。在各個實施方案中，單鏈核酸片段各自含有不超過20個、或18個、或18個、或17個、或16個、或15個、或14個、或13個、或12個、或11個、或10個等核苷酸。(d)確定源自第一個核酸分子的步驟(c)的單鏈核酸片段的數(shù)目相對于源自第二個核酸分子的數(shù)目的比率。該確定可用如液相層析和質(zhì)譜分析法的一種或兩種來進行。在相關(guān)方法中，本發(fā)明提供了對在限定位置具有遺傳變異的目標(biāo)核酸分子的等位基因頻率的確定，該目標(biāo)核酸分子存在于核酸群體中。該方法包括(a)混合第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和核酸群體，其中如果(i)目標(biāo)核酸是雙鏈的，從而具有第一鏈和第二鏈，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于目標(biāo)核酸中限定位置的3’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于目標(biāo)核酸中限定位置的3’，然而，如果(ii)目標(biāo)核酸是單鏈的，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸中的核苷酸序列相同的核苷酸序列，該核苷酸序列位于目標(biāo)核酸中限定位置的5’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸中的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于目標(biāo)核酸中限定位置的3’，且不論目標(biāo)核酸是單鏈的還是雙鏈的，第一個ODNP和第二個ODNP的至少一個進一步包含切割劑識別序列(NARS)的有義鏈的序列。(b)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含第一個和第二個ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和識別NARS的切割劑(NA)存在時擴增單鏈核酸片段。(d)確定具有遺傳變異的目標(biāo)核酸分子相對于存在于樣品中的所有目標(biāo)核酸分子的等位基因頻率。該確定為通過確定步驟(c)中形成的含有可選擇地存在于目標(biāo)核酸中的遺傳變異的單鏈核酸片段(產(chǎn)物A)相對于步驟(c)中與產(chǎn)物A相同(除研究的遺傳變異之外)的所有單鏈核酸片段的百分比以借此確定目標(biāo)核酸的等位基因頻率。在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明提供了確定在限定位置具有遺傳變異的目標(biāo)核酸分子的等位基因頻率的方法，該目標(biāo)核酸包含于核酸群體中。該方法包括(a)混合第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和核酸分子群體(其中一些為目標(biāo)核酸)，其中如果(i)目標(biāo)核酸是雙鏈的，從而具有第一鏈和第二鏈，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于限定位置的3’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于限定位置的3’，或者，如果(ii)目標(biāo)核酸是單鏈的，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸中的核苷酸序列相同的核苷酸序列，該核苷酸序列位于限定位置的5’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸中的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于目標(biāo)核酸中限定位置的3’。此外，第一個ODNP和第二個ODNP的至少一個進一步包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列。(b)延伸第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含第一個和第二個ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時，優(yōu)選地于等溫條件下擴增單鏈核酸片段。在一個實施方案中，單鏈核酸片段各自含有不超過20個、或19個、或18個、或17個、或16個、或15個、或14個、或13個、或12個、或11個、或10個等核苷酸。(d)確定目標(biāo)核酸中遺傳變異的等位基因頻率。該確定為通過如確定步驟(c)中形成的含有可選擇地存在于目標(biāo)核酸中的遺傳變異的單鏈核酸片段(產(chǎn)物A)相對于步驟(c)中與產(chǎn)物A相同(除遺傳變異之外)的所有單鏈核酸片段的百分比。這種確定可用液相層析和質(zhì)譜分析法之一或二者來進行，這些技術(shù)僅僅是示例性的。
在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明方法涉及(i)確定存在于核酸分子群體中的第一個核酸分子的數(shù)目與存在于核酸分子群體中的第二個核酸分子的數(shù)目之間的比率，和(ii)確定核酸分子群體中具有遺傳變異的目標(biāo)核酸分子的等位基因頻率。這些方法可各自同時在超過一個目標(biāo)核酸分子上進行，即該方法可通過多重確定而進行。例如，在一方面，本發(fā)明提供了多重確定各自在限定位置具有遺傳變異的目標(biāo)核酸分子的等位基因頻率的方法，其中這些目標(biāo)核酸分子存在于核酸群體中，該方法包括(a)混合核酸群體和ODNP對，每一個ODNP對相應(yīng)于目標(biāo)核酸之一并包含第一個ODNP和第二個ODNP，其中如果(i)研究中的目標(biāo)核酸是雙鏈的，從而具有第一鏈和第二鏈，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于目標(biāo)核酸中限定位置的3’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于目標(biāo)核酸中限定位置的3’，或者，如果(ii)研究中的目標(biāo)核酸是單鏈的，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸中的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且該核苷酸序列位于目標(biāo)核酸中限定位置的5’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸中的核苷酸序列互補的核苷酸序列，并且該核苷酸序列位于目標(biāo)核酸中限定位置的3’。此外，第一個ODNP和第二個ODNP的至少一個進一步包含切割劑識別序列(NARS)的有義鏈的序列。(b)延伸每一個ODNP對的第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含第一個和第二個ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和識別NARS的切割劑(NA)存在時，用步驟(b)的延伸產(chǎn)物作為模板擴增單鏈核酸片段。(d)對于每一個目標(biāo)核酸，確定步驟(c)的含有目標(biāo)核酸中的遺傳變異的單鏈核酸片段(產(chǎn)物A)相對于步驟(c)中與產(chǎn)物A在遺傳變異之外的部分相同的所有單鏈核酸片段的百分比以借此確定目標(biāo)核酸的等位基因頻率。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了多重確定在限定位置具有遺傳變異的目標(biāo)核酸分子的等位基因頻率的方法，這些目標(biāo)核酸分子包含于核酸群體中，且該方法包括(a)混合核酸群體和ODNP對，每一個ODNP對相應(yīng)于目標(biāo)核酸之一并包含第一個ODNP和第二個ODNP，其中如果(i)研究中的目標(biāo)核酸是雙鏈的(從而具有第一鏈和第二鏈)，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸第一鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于限定位置的3’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于限定位置的3’，或者，如果(ii)研究中的目標(biāo)核酸是單鏈的，那么(a)第一個ODNP包含至少基本與目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且該核苷酸序列位于限定位置的5’，和(b)第二個ODNP包含至少基本與目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，該核苷酸序列位于限定位置的3’。此外，第一個ODNP和第二個ODNP的至少一個進一步包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的序列。(b)延伸每一個ODNP對的第一個和第二個ODNP以生產(chǎn)包含第一個和第二個ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時，用步驟(b)的延伸產(chǎn)物作為模板，優(yōu)選地于等溫條件下擴增單鏈核酸片段。可選擇地，單鏈核酸片段各自含有不超過20個、或19個、或18個、或17個、或16個、或15個、或14個、或13個、或12個、或11個、或10個等核苷酸。(d)對于每一個目標(biāo)核酸，確定步驟(c)中的含有可選擇地存在于目標(biāo)核酸中的遺傳變異的單鏈核酸片段(產(chǎn)物A)相對于步驟(c)中與產(chǎn)物A在遺傳變異之外的部分相同的所有單鏈核酸片段的百分比，以借此確定目標(biāo)核酸的等位基因頻率。
在本發(fā)明這些涉及(i)確定存在于核酸分子群體中的第一個核酸分子的數(shù)目與存在于核酸分子群體中的第二個核酸分子的數(shù)目之間的比率，和(ii)確定核酸分子群體中具有遺傳變異的目標(biāo)核酸分子的等位基因頻率的方法中，可利用一種或多種下面的標(biāo)準(zhǔn)來描述該方法，下面標(biāo)準(zhǔn)中的任何2個、3個、4個、5個等可進行組合以描述該方法，且下面標(biāo)準(zhǔn)中的任何1個、2個、3個、4個等可與在此處闡明的其他標(biāo)準(zhǔn)進行組合以描述本發(fā)明的方法由擴增步驟形成的且含有進行等位基因頻率測量或確定上述比率所需的信息的單鏈核酸片段具有至少1個、或至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少6個、或至少7個、或至少8個、或至少9個、或至少10個、或至少11個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個、或至少17個、或至少18個、或至少19個、或至少20個；由擴增步驟形成的單鏈核酸片段具有不超過3個、或4個、或5個、或6個、或7個、或8個、或9個、或10個、或11個、或12個、或13個、或14個、或15個、或16個、或17個、或18個、或19個、或20個、或21個、或22個、或23個、或24個、或25個、或26個、或27個、或28個、或29個、或30個、或31個、或32個、或33個、或34個、或35個、或36個、或37個、或38個、或39個、或40個、或41個、或42個、或43個、或44個、或45個、或46個、或47個、或48個、或49個、或50個核苷酸；該方法中所用的NARS是限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)；延伸反應(yīng)是在至少一種修飾的脫氧核苷三磷酸存在時進行的；該方法中所用的NARS是切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)；第一個ODNP和第二個ODNP兩者均包含NARS有義鏈的序列；NARS是可由N.BstNB I識別的NERS；第一個ODNP包含RERS一條鏈的核苷酸序列，但不包含NERS的有義鏈的核苷酸序列；第二個ODNP包含RERS一條鏈的核苷酸序列，但不包含NERS的有義鏈的核苷酸序列；由延伸步驟產(chǎn)生的片段不含有半修飾的RERS；RERS可由IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別；在進行步驟(c)之前步驟(b)的片段是由識別RERS的RE消化的；限定位置的核苷酸是與疾病相關(guān)的；核酸群體來自哺乳動物如人類、狗、貓、豬、馬或兔，DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌體M2 DNA聚合酶、噬菌體phiPRD1 DNA聚合酶、測序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶中的任何一種，所用的DNA聚合酶的任何兩種或多種可進行組合以形成所闡明的用于本發(fā)明的可能的DNA聚合酶組合，如DNA聚合酶是exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；延伸反應(yīng)由聚合酶鏈反應(yīng)進行；擴增是在等溫條件下進行的；擴增是在50℃-70℃的溫度范圍內(nèi)進行的；擴增是在60℃進行的；擴增是在55±5℃進行的；擴增是在60±5℃進行的；擴增是在65±5℃進行的；擴增是在70±5℃進行的；擴增是在最高溫度和最低溫度之間的溫度進行的，而最高溫度比最低溫度高20℃之內(nèi)；擴增是在最高溫度和最低溫度之間的溫度進行的，而最高溫度比最低溫度高15℃之內(nèi)；擴增是在最高溫度和最低溫度之間的溫度進行的，而最高溫度比最低溫度高10℃之內(nèi)；擴增是在最高溫度和最低溫度之間的溫度進行的，而最高溫度比最低溫度高5℃之內(nèi)；在本發(fā)明的各個實施方案中，該方法中所用的每一個ODNP的長度都獨立地為至少8個、或至少9個、或至少10個、或至少11個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個、或至少17個、或至少18個、或至少19個、或至少20個核苷酸；該方法中所用的每一個ODNP的長度都獨立地且可選擇地不超過50個、或不超過45個、或不超過40個、或不超過35個、或不超過30個、或不超過29個、或不超過28個、或不超過27個、或不超過26個、或不超過25個、或不超過24個、或不超過23個、或不超過22個、或不超過21個、或不超過20個、或不超過19個、或不超過18個核苷酸；當(dāng)方法包括使用包括至少基本與目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物時，那么在本發(fā)明的各個實施方案中，引物中該核苷酸序列的長度在每一個引物中獨立地為至少4個、或至少5個、或至少6個、或至少7個、或至少8個、或至少9個、或至少10個、或至少11個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個、或至少17個、或至少18個、或至少19個、或至少20個核苷酸；當(dāng)本發(fā)明的方法包括使用包括至少基本與目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的引物時，那么在本發(fā)明的各個實施方案中，引物中該核苷酸序列的長度在每一個引物中獨立地不超過20個、或不超過19個、或不超過18個、或不超過17個、或不超過16個、或不超過15個、或不超過14個、或不超過13個、或不超過12個、或不超過11個、或不超過10個、或不超過9個、或不超過8個、或不超過7個、或不超過6個、或不超過5個核苷酸；為獲得想要的信息而對擴增產(chǎn)物上進行的測量包括下面分析方法中的1種、或任何2種、或任何3種或更多，而額外的分析方法也依賴于特定情況而采用，如儀器的可用性發(fā)光光譜法、熒光光譜法、質(zhì)譜分析法、液相層析、熒光偏振、凝膠電泳和毛細(xì)管電泳，如測量可至少部分由質(zhì)譜分析法進行，或測量可至少部分由液相層析進行，且測量可由包括質(zhì)譜分析法和液相層析兩者的分析技術(shù)來進行。
在另一方面，本發(fā)明提供了探測cDNA分子中基因的上游外顯子(Exon A)和下游外顯子(Exon B)之間的連接存在與否的方法，該方法包括(a)混合第一個ODNP、第二個ODNP和cDNA。第一個ODNP包括至少基本與靠近反義鏈中Exon A的5’末端的Exon A反義鏈的部分互補的核苷酸序列。第二個ODNP包括至少基本與靠近有義鏈中Exon B的5’末端的Exon B有義鏈的部分互補的核苷酸序列。此外，第一個ODNP和第二個ODNP的至少一個進一步包括切割劑識別序列(NARS)的有義鏈的核苷酸序列。(b)在如果Exon A和Exon B均存在于cDNA中時可產(chǎn)生由第一個ODNP和第二個ODNP包圍的片段的條件下進行延伸反應(yīng)。(c)在DNA聚合酶和識別NARS的切割劑(NA)存在時進行擴增反應(yīng)。(d)表征步驟(c)的擴增產(chǎn)物以借此確定ExonA和Exon B之間連接的存在與否。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了探測cDNA分子中基因的上游外顯子(Exon A)和下游外顯子(Exon B)之間的連接存在與否的方法，該方法包括(a)混合第一個ODNP、第二個ODNP和cDNA。第一個ODNP包括至少基本與靠近反義鏈中Exon A的5’末端的Exon A反義鏈的部分互補的核苷酸序列。第二個ODNP具有包括至少基本與靠近有義鏈中Exon B的5’末端的Exon B有義鏈的部分互補的序列的核苷酸序列。此外，第一個ODNP和第二個ODNP的至少一個進一步包括切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的核苷酸序列。(b)在如果Exon A和Exon B均存在于cDNA中時可產(chǎn)生由第一個ODNP和第二個ODNP包圍的片段的條件下進行延伸反應(yīng)。(c)在DNA聚合酶和識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時，優(yōu)選地于等溫條件下進行擴增反應(yīng)。(d)表征步驟(c)的擴增產(chǎn)物以借此確定Exon A和Exon B之間連接的存在與否。該表征可至少部分用液相層析和/或質(zhì)譜分析法進行。在這些方法可選擇的實施方案中，一種或多種下面的標(biāo)準(zhǔn)可用于描述該方法NARS是限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)且延伸反應(yīng)是在至少一種修飾的脫氧核苷三磷酸存在時進行的；NARS是切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)；第一個ODNP和第二個ODNP兩者均包含NARS有義鏈的序列；NARS是RERS且延伸是在至少一種修飾的脫氧核苷三磷酸存在時進行的；NARS是NERS；NARS可由N.BstNB I識別；第一個ODNP不含有NERS有義鏈的核苷酸序列，但包括RERS的一條鏈的核苷酸序列；第二個ODNP不含有NERS有義鏈的核苷酸序列，但包括RERS的一條鏈的核苷酸序列；由延伸反應(yīng)產(chǎn)生的片段不含有半修飾的RERS；RERS可由IIs型限制性內(nèi)切核酸酶(RE)識別；在進行步驟(c)之前步驟(b)的延伸產(chǎn)物是由識別RERS的RE消化的；基因與疾病相關(guān)；基因與人類疾病相關(guān)；DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的K1enow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌體M2 DNA聚合酶、噬菌體phiPRD1 DNA聚合酶、測序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶，這些DNA聚合酶的任何兩種或多種可組合在一起以形成本發(fā)明方法中所用的DNA聚合酶所選自的組合，如DNA聚合酶是exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；延伸反應(yīng)由聚合酶鏈反應(yīng)進行；擴增是在等溫條件下進行的；擴增產(chǎn)物如果存在則是含有不超過35個、或不超過17個、或不超過12個核苷酸的單鏈核酸片段；表征是至少部分由選自發(fā)光光譜法、熒光光譜法、質(zhì)譜分析法、液相層析、熒光偏振、凝膠電泳和毛細(xì)管電泳的分析技術(shù)來實現(xiàn)的，如表征可至少部分由質(zhì)譜分析法進行。
在另一方面，本發(fā)明提供了在cDNA分子或cDNA群體中探測包含n個外顯子的基因的每兩個外顯子之間的連接存在與否的方法，其中n是等于或大于2的整數(shù)，Exon A是存在于基因中的外顯子中最上游的外顯子，而Exon N是最下游的外顯子，該方法包括(a)混合第一套寡核苷酸引物(ODNP)、第二套ODNP和cDNA分子或cDNA群體。第一套ODNP包括n-1個ODNP，該套中的每一個成員相應(yīng)于基因中除ExonA之外的n個外顯子之一，且此外每一個ODNP包含至少基本與靠近該鏈中相應(yīng)外顯子5’末端的該外顯子有義鏈的部分互補的核苷酸序列。第二套ODNP包括相應(yīng)于除Exon N之外的每一個外顯子的n-1個ODNP，而每一個ODNP包含至少基本與靠近該鏈中相應(yīng)外顯子5’末端的該外顯子反義鏈的部分互補的核苷酸序列。在本發(fā)明的第一個實施方案中是第一套ODNP成員的、或在本發(fā)明的第二個實施方案中是第二套ODNP成員的、或在本發(fā)明的第三個實施方案中是第一套或第二套ODNP成員的每一個ODNP進一步包含切割劑識別序列(NARS)的有義鏈的核苷酸序列。(b)擴增包含來自第一套ODNP的一個ODNP和來自第二套ODNP的另一個ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和識別NARS的切割劑(NA)存在時進行擴增反應(yīng)。(d)探測來自步驟(c)的擴增產(chǎn)物的存在與否以借此確定每一個潛在連接的存在與否。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了在cDNA分子或cDNA群體中探測包含n個外顯子的基因的每兩個外顯子之間的連接存在與否的方法，其中n是等于或大于2的整數(shù)，Exon A是存在于基因中的外顯子中最上游的外顯子，而Exon N是最下游的外顯子，該方法包括(a)混合第一套寡核苷酸引物(ODNP)、第二套ODNP和cDNA分子或cDNA群體。第一套ODNP包括n-1個ODNP，該套中的每一個成員相應(yīng)于除Exon A之外的唯一一個外顯子，且每一個ODNP也包含至少基本與靠近該鏈中相應(yīng)外顯子5’末端的該外顯子有義鏈的部分互補的核苷酸序列。第二套ODNP包括n-1個ODNP，該套中的每一個成員相應(yīng)于除Exon N之外的唯一一個外顯子，且每一個ODNP進一步包含至少基本與靠近該鏈中相應(yīng)外顯子5’末端的該外顯子反義鏈的部分互補的核苷酸序列。此外，在本發(fā)明的第一個實施方案中是第一套ODNP成員的、或在本發(fā)明的第二個實施方案中是第二套ODNP成員的、或在本發(fā)明的第三個實施方案中是第一套或第二套ODNP成員的每一個ODNP進一步包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)的有義鏈的核苷酸序列。(b)擴增由來自第一套ODNP的一個ODNP和來自第二套ODNP的另一個ODNP包圍的片段。(c)在DNA聚合酶和識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)存在時，優(yōu)選地于等溫條件下進行擴增反應(yīng)。(d)探測步驟(c)的擴增產(chǎn)物的存在與否。在一個實施方案中，該探測是由液相層析和/或質(zhì)譜分析法進行的。該探測使得隨后能夠確定研究中的每一個潛在連接的存在與否。在一個實施方案中，步驟(c)的擴增產(chǎn)物如果存在則含有不超過17個核苷酸。在本發(fā)明的各個實施方案中，一種或多種下面的標(biāo)準(zhǔn)可用于描述該實施方案NARS是限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)且步驟(b)是在至少一種修飾的脫氧核苷三磷酸存在時進行的；NARS是切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)；第一套ODNP和第二套ODNP兩者均包含NARS有義鏈的序列；NARS是RERS且步驟(b)是在至少一種修飾的脫氧核苷三磷酸存在時進行的；NARS是NERS；NERS可由N.BstNB I識別；第一套中的ODNP或第二套中的ODNP含有RERS一條鏈的核苷酸序列，但不包含NERS的有義鏈的序列；由步驟(b)產(chǎn)生的片段不含有半修飾的RERS；RERS可由IIs型限制性內(nèi)切核酸酶(RE)識別；在進行步驟(c)之前步驟(b)的擴增片段是由識別RERS的RE消化的；基因與疾病相關(guān)；基因與人類疾病相關(guān)；步驟(b)是由聚合酶鏈反應(yīng)進行的；步驟(c)是在等溫條件下進行的；步驟(c)中的擴增產(chǎn)物如果存在則是含有不超過35個核苷酸的單鏈核酸片段；該單鏈核酸片段含有不超過17個核苷酸；該單鏈核酸片段含有不超過12個核苷酸；步驟(d)是至少部分由選自發(fā)光光譜法、熒光光譜法、質(zhì)譜分析法、液相層析、熒光偏振、凝膠電泳和毛細(xì)管電泳的分析技術(shù)來實現(xiàn)的；步驟(d)至少部分由質(zhì)譜分析法進行。
在其他方面，本發(fā)明提供了探測cDNA群體中基因的可變剪接的方法。在一個實施方案中，該方法包括(a)根據(jù)在此處描述的本發(fā)明的方法確定基因的任何兩個外顯子之間每一個潛在連接的存在與否。(b)對于基因的至少一個外顯子來說，如果在該外顯子的至少一個末端存在超過一個的連接，則顯示cDNA群體中存在基因可變剪接。在相關(guān)的實施方案中，該方法提供了對cDNA群體中基因可變剪接的多重探測，對于每一個基因，該方法包括(a)根據(jù)在此處描述的本發(fā)明的方法確定基因的任何兩個外顯子之間每一個潛在連接的存在與否。(b)對于基因的至少一個外顯子來說，如果在該外顯子的至少一個末端存在超過一個的連接，則顯示cDNA群體中存在基因的可變剪接。在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明提供了探測兩個生物學(xué)樣品之間基因的可變剪接的方法，該方法包括(a)通過進行根據(jù)本發(fā)明的方法對每一個生物學(xué)樣品確定基因的任何兩個外顯子之間每一個潛在連接的存在與否。(b)如果在一個生物學(xué)樣品中存在至少一個連接，而在另一個生物學(xué)樣品中不存在，則顯示兩個生物學(xué)樣品之間存在基因的可變剪接。在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明提供了多重探測兩個生物學(xué)樣品之間基因的可變剪接的方法，對于每一個基因，該方法包括(a)根據(jù)在此處描述的本發(fā)明的方法對每一個生物學(xué)樣品確定基因的任何兩個外顯子之間每一個潛在連接的存在與否。(b)如果在一個生物學(xué)樣品中存在至少一個連接，而在另一個生物學(xué)樣品中不存在，則顯示兩個生物學(xué)樣品之間存在基因的可變剪接。在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明提供了用于探測cDNA分子中基因的上游外顯子(Exon A)和下游外顯子(Exon B)之間是否存在連接的寡核苷酸引物(ODNP)對，其中(a)第一個ODNP包含至少基本與靠近反義鏈中Exon A的5’末端的Exon A反義鏈的部分互補的核苷酸序列。第二個ODNP包含至少基本與靠近有義鏈中Exon B的5’末端的Exon B有義鏈的部分互補的核苷酸序列。此外，第一個ODNP和第二個ODNP的至少一個進一步包含切割劑識別序列(NARS)有義鏈的核苷酸序列。在本發(fā)明的該ODNP對的各個實施方案中，下面的標(biāo)準(zhǔn)可用于描述該ODNP對，而下面的標(biāo)準(zhǔn)的任何兩個或多個可以可選擇地與在文中別處描述的其他標(biāo)準(zhǔn)進行組合NARS是限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)；NARS是切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)；第一個ODNP和第二個ODNP兩者均包含NARS有義鏈的序列；NARS是RERS；NARS是NERS；NERS可由N.BstNB I識別；第一個ODNP包含NERS有義鏈的核苷酸序列，且第二個ODNP包含RERS一條鏈(在一個實施方案中為有義鏈，而在另一個實施方案中為反義鏈)的核苷酸序列；第一個ODNP包含RERS一條鏈的核苷酸序列，且第二個ODNP包含NERS有義鏈的核苷酸序列；RERS可由IIs型限制性內(nèi)切核酸酶(RE)識別；基因與疾病相關(guān)；第一個ODNP長度至少為12個核苷酸；第二個ODNP長度至少為12個核苷酸。
在另一方面，本發(fā)明提供了制備用于合成單鏈cDNA分子的模板核酸分子的方法，該方法包括(a)提供雙鏈cDNA分子。(b)使雙鏈cDNA分子與包含切割劑識別序列(NARS)的核酸連接物連接，從而在識別NARS的切割劑(NA)和DNA聚合酶存在時，用連接產(chǎn)物作為模板擴增的單鏈核酸分子包含雙鏈cDNA分子一條鏈的至少一部分。另一方面，本發(fā)明提供了制備cDNA文庫的方法，該方法包括(a)提供從生物學(xué)樣品中分離的mRNA分子。(b)用分離的mRNA分子作為模板制備雙鏈cDNA分子。(c)使雙鏈cDNA分子與包含切割劑識別序列(NARS)的核酸連接物連接，從而在(i)識別NARS的切割劑和(ii)DNA聚合酶存在時，用連接產(chǎn)物作為模板擴增的單鏈核酸分子包含雙鏈cDNA分子一條鏈的至少一部分。在可選擇的實施方案中，本發(fā)明的這些方法可進一步由下面標(biāo)準(zhǔn)的一種或多種進行表征，這些標(biāo)準(zhǔn)的任何兩個或多個可進行組合以表征本發(fā)明的方法，且這些標(biāo)準(zhǔn)是非排它性的所述部分長度為至少40個、或至少38個、或至少36個、或至少34個、或至少32個、或至少30個、或至少28個、或至少26個、或至少24個、或至少22個、或至少20個、或至少19個、或至少18個、或至少17個、或至少16個、或至少15個、或至少14個、或至少13個、或至少12個、或至少11個、或至少10個、或至少9個、或至少8個、或至少7個、或至少6個、或至少5個、或至少4個核苷酸；所述部分長度不超過100個、或不超過90個、或不超過80個、或不超過70個、或不超過60個、或不超過50個、或不超過40個、或不超過38個、或不超過36個、或不超過34個、或不超過32個、或不超過30個、或不超過28個、或不超過26個、或不超過24個、或不超過22個、或不超過20個、或不超過18個、或不超過17個、或不超過16個、或不超過15個、或不超過14個、或不超過13個、或不超過12個、或不超過11個、或不超過10個、或不超過9個、或不超過8個、或不超過7個、或不超過6個、或不超過5個核苷酸；雙鏈cDNA分子是經(jīng)由不參與雙鏈cDNA分子和核酸連接物的連接的末端固定的；核酸連接物是經(jīng)由不參與雙鏈cDNA分子和核酸連接物的連接的末端固定的；NA是切割性內(nèi)切核酸酶(NE)；NA是N.BstNB I；NARS是半修飾的限制性內(nèi)切核酸酶識別序列；當(dāng)包括連接物時，那么雙鏈cDNA分子或核酸連接物是通過固定材料的末端固定的，其中該末端不參與雙鏈cDNA分子和核酸連接物之間的連接。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，包括(a)提供一種雙鏈核酸分子，該雙鏈核酸分子包括(i)作為可選擇地存在的序列的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)，(ii)切割劑識別序列(NARS)和(iii)目標(biāo)核酸的片段。在該雙鏈核酸中，特別是在不含有識別NARS的切割劑(NA)的切割位點(NS)的鏈中，(1)目標(biāo)核酸片段位于NARS的5’，和(2)如果存在TRERS，那么識別TRERS的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點位于目標(biāo)核酸片段內(nèi)和相應(yīng)于NS的位置的5’。(b)作為可選擇的步驟，用識別TRERS的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈核酸。(c)在識別NARS的NA存在時擴增單鏈核酸片段。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種方法，包括(a)提供一種雙鏈核酸分子，該雙鏈核酸分子包括(i)IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)，(ii)切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)和(iii)目標(biāo)核酸的片段。在該雙鏈核酸分子中，特別是在不含有識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)的切割位點(NS)的鏈中，(1)目標(biāo)核酸片段位于NERS的5’，和(2)識別TRERS的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點位于目標(biāo)核酸片段內(nèi)和相應(yīng)于NS的位置的5’。(b)用識別TRERS的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈核酸。(c)在識別NARS的NA存在時可選擇地于等溫條件下擴增單鏈核酸片段。在一個實施方案中，單鏈核酸片段含有不超過17個核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供了制備多個單鏈核酸探針的方法，該方法包括(a)提供雙鏈核酸分子，每一個雙鏈核酸分子包括(i)IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)，而這是雙鏈核酸分子中的可選擇的成分；(ii)切割劑識別序列(NARS)，和(iii)目標(biāo)核酸的片段。此外，在不含有識別NARS的切割劑(NA)的切割位點(NS)的鏈中，(1)目標(biāo)核酸片段位于NARS的5’，和(2)如果存在TRERS，那么識別TRERS的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點位于目標(biāo)核酸片段內(nèi)和相應(yīng)于NS的位置的5’。(b)該方法包括用識別TRERS的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈核酸的可選擇的步驟。(c)在識別NARS的NA存在時擴增單鏈核酸片段。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了制備多個單鏈核酸探針的方法，該方法包括(a)提供多個雙鏈核酸分子，每一個雙鏈核酸分子包括(i)IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)，(ii)切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)，和(iii)目標(biāo)核酸的片段。在這些雙鏈核酸分子中，特別是在不含有識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)的切割位點(NS)的鏈中，(1)目標(biāo)核酸片段位于NERS的5’，和(2)識別TRERS的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點位于目標(biāo)核酸片段內(nèi)和相應(yīng)于NS的位置的5’。(b)用識別TRERS的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈核酸。(c)在識別NERS的NE存在時，優(yōu)選地于等溫條件下擴增單鏈核酸片段。可選擇地，該單鏈核酸片段各自含有不超過25個或不超過17個核苷酸。本發(fā)明的這些方法可進一步由下面標(biāo)準(zhǔn)的一種或多種進行描述，下面標(biāo)準(zhǔn)的任何兩種或多種可進行組合以描述本發(fā)明的這些方法NA是切割性內(nèi)切核酸酶(NE)；NA是N.BstNB I；NARS是半修飾的限制性內(nèi)切核酸酶識別序列；NARS可由選自Ava I、Bsl I、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4H I、Hinc II、Hind II和Nci I的限制性內(nèi)切核酸酶(RE)識別；TRERS可由Bpm I或Mme I識別；雙鏈核酸分子是至少部分通過向雙鏈目標(biāo)核酸片段連接在此處描述的連接物分子并整合NARS而進行的，且可選擇地，雙鏈目標(biāo)核酸片段在與連接物連接之前用限制性內(nèi)切核酸酶(RE)進行切割，且同樣可選擇地，雙鏈目標(biāo)核酸片段是cDNA片段，該cDNA片段可選擇地固定于固體支持體上，且該固定的cDNA可選擇地是通過一定方法產(chǎn)生的，該方法包含(i)用固定的寡核苷酸引物從生物學(xué)樣品中分離mRNA；和(ii)用mRNA作為模板合成雙鏈cDNA；擴增是在DNA聚合酶的存在下進行的，該DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌體M2 DNA聚合酶、噬菌體phiPRD1 DNA聚合酶、測序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶的一種或由其兩種或更多組成的任何組合，如聚合酶是exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；擴增是在等溫條件下進行的；擴增的單鏈核酸片段含有不超過25個核苷酸；單鏈核酸片段長度為15-50個核苷酸；單鏈核酸片段長度為51-20,000個核苷酸。
另一方面，本發(fā)明提供了擴增單鏈核酸分子的方法，該方法包括(A)形成混合物，該混合物包括(i)目標(biāo)核酸；和(ii)寡核苷酸引物，該寡核苷酸引物(a)包括可由切割劑(NA)識別的雙鏈切割劑識別序列(NARS)有義鏈的核苷酸序列，該切割劑在位于識別序列之外的切割位點(NS)進行切割，和(b)包括至少基本與目標(biāo)核酸互補的核苷酸序列。(B)用目標(biāo)核酸的部分作為模板，在切割劑存在時擴增單鏈核酸分子。可選擇地，雙鏈切割劑識別序列可由N.BstNB I識別?？蛇x擇地，當(dāng)寡核苷酸引物與目標(biāo)核酸退火時，雙鏈切割劑識別序列有義鏈的核苷酸序列內(nèi)的一個核苷酸與目標(biāo)核酸的另一個核苷酸不形成常規(guī)的堿基配對?？蛇x擇地，當(dāng)寡核苷酸引物與目標(biāo)核酸退火時，雙鏈切割劑識別序列有義鏈的核苷酸序列內(nèi)的兩個或更多核苷酸與目標(biāo)核酸的核苷酸不形成常規(guī)的堿基配對?？蛇x擇地，目標(biāo)核酸是固定的?？蛇x擇地，寡核苷酸引物是在其5’末端固定的。
另一方面，本發(fā)明提供了方法，包括(A)形成混合物，該混合物包括(i)目標(biāo)核酸；(ii)寡核苷酸引物，該寡核苷酸引物(a)包括可由切割劑識別的NARS有義鏈的核苷酸序列，該切割劑在識別序列之外進行切割，和(b)是至少基本與目標(biāo)核酸的第一個區(qū)域互補的；和(iii)部分雙鏈的核酸，該部分雙鏈的核酸(a)包含雙鏈的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列，和(b)至少基本與位于第一個區(qū)域5’的目標(biāo)核酸的第二個區(qū)域互補的3’突出端。這些成分在一定條件下進行組合，該條件使得寡核苷酸引物和目標(biāo)的第一個區(qū)域之間及部分雙鏈的核酸的3’突出端和目標(biāo)的第二個區(qū)域之間能夠進行雜交。(B)消化與寡核苷酸引物和第二個區(qū)域中的部分雙鏈的核酸雜交的目標(biāo)核酸。(C)用步驟(B)中消化的目標(biāo)核酸的部分作為模板，在切割劑存在時擴增單鏈核酸分子。在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明提供了方法，包括(A)形成混合物，該混合物包含(i)目標(biāo)核酸；(ii)寡核苷酸引物，該寡核苷酸引物(a)包含可由切割劑識別的NARS有義鏈的核苷酸序列，該切割劑在識別序列之外進行切割，和(b)是至少基本與目標(biāo)核酸的第一個區(qū)域互補的；和(iii)單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子(1)是至少基本與位于第一個區(qū)域5’的目標(biāo)核酸的第二個區(qū)域互補的。這些成分在一定條件下進行組合，該條件使得寡核苷酸引物和目標(biāo)的第一個區(qū)域之間及單鏈核酸分子和目標(biāo)的第二個區(qū)域之間能夠進行雜交。(B)用目標(biāo)核酸的部分作為模板，在切割劑和DNA聚合酶存在時擴增單鏈核酸分子。優(yōu)選地，該DNA聚合酶不具有鏈置換活性，從而實際上單鏈核酸分子阻斷了由DNA聚合酶進行的進一步的延伸反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的這些方面，優(yōu)選地在等溫條件下產(chǎn)生了多個單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子優(yōu)選地具有比基于目標(biāo)核酸分子的長度可產(chǎn)生的全長更短的長度。在一個實施方案中，在NARS中有一個錯配的堿基對，而在另一個實施方案中，在NARS中有兩個錯配的堿基對，而在另一個實施方案中，形成NARS的所有堿基對均是錯配的，而在另一個實施方案中，形成NARS的n-1個堿基對是錯配的，其中n堿基對形成NARS。在一個實施方案中，在NARS中有一個未配對的核苷酸。在另一個實施方案中，形成NARS有義鏈的所有核苷酸是未配對的。
另一方面，本發(fā)明提供了方法，包括(a)形成以下組分的混合物(i)包含切割劑識別序列(NARS)的部分或完全雙鏈的模板核酸分子，(ii)識別NARS的切割劑(NA)，(iii)DNA聚合酶，和(iv)一種或多種脫氧核苷三磷酸。(b)在一定條件下維持步驟(a)中的混合物，該條件使得能夠擴增單鏈核酸片段，在該條件下，單鏈核酸片段在不存在任何DNA聚合酶或鏈置換促進劑的鏈置換活性時能夠自發(fā)地從模板核酸中解離。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了方法，包括(a)使部分或完全雙鏈的模板核酸與切割劑(NA)接觸，該模板包含切割劑識別序列(NARS)。(b)如果模板不包含可由NA切割的切割位點(NS)，則延伸模板以提供NS。(c)在NS切割模板或其延伸產(chǎn)物以提供在NS包含新3’末端的切割產(chǎn)物和在NS包含新的5’末端的切割產(chǎn)物；其中在NS包含新5’末端的切割產(chǎn)物和包含NARS反義鏈序列的模板鏈或其延伸產(chǎn)物之間形成的雙鏈體的熔解溫度比在NS包含新3’末端的切割產(chǎn)物和相同的模板鏈或其延伸產(chǎn)物之間形成的雙鏈體的高。(d)延伸在NS包含新3’末端的步驟(c)中的切割產(chǎn)物。(e)重復(fù)步驟(c)和(d)以擴增單鏈核酸片段。可選擇地，切割、延伸和/或擴增是在等溫條件下進行的?？蛇x擇地，步驟(b)、(c)、(d)和(e)進行的溫度處于在NS包含新5’末端的切割產(chǎn)物和包含NARS反義鏈序列的模板鏈或其延伸產(chǎn)物之間形成的雙鏈體的熔解溫度和在NS包含新3’末端的切割產(chǎn)物和相同的模板鏈或其延伸產(chǎn)物之間形成的雙鏈體的熔解溫度之間。
只要單鏈核酸片段是由本發(fā)明任何方法中的擴增步驟形成的，且特別地(但不是必需的)當(dāng)該單鏈核酸片段含有目標(biāo)信息時，如在特定位置具有特定核苷酸，或具有特定核苷酸序列，其中該信息使得能夠允許進行確定，那么在本發(fā)明方法的各個實施方案中，單鏈核酸片段具有至少1個、或至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少6個、或至少7個、或至少8個、或至少9個、或至少10個、或至少11個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個、或至少17個、或至少18個、或至少19個、或至少20個核苷酸。此外，由本發(fā)明的擴增步驟形成的單鏈核酸片段可表征為含有不超過3個、或不超過4個、或不超過5個、或不超過6個、或不超過7個、或不超過8個、或不超過9個、或不超過10個、或不超過11個、或不超過12個、或不超過13個、或不超過14個、或不超過15個、或不超過16個、或不超過17個、或不超過18個、或不超過19個、或不超過20個、或不超過21個、或不超過22個、或不超過23個、或不超過24個、或不超過25個、或不超過26個、或不超過27個、或不超過28個、或不超過29個、或不超過30個、或不超過31個、或不超過32個、或不超過33個、或不超過34個、或不超過35個、或不超過36個、或不超過37個、或不超過38個、或不超過39個、或不超過40個、或不超過41個、或不超過42個、或不超過43個、或不超過44個、或不超過45個、或不超過46個、或不超過47個、或不超過48個、或不超過49個、或不超過50個核苷酸。
當(dāng)消化產(chǎn)物是在本發(fā)明的任何方法中形成的時，那么在各個實施方案中，消化產(chǎn)物具有至少8個、或至少10個、或至少12個、或至少14個、或至少16個、或至少18個、或至少20個、或至少22個、或至少24個、或至少26個、或至少28個、或至少30個、或至少32個、或至少34個、或至少36個、或至少38個、或至少40個、或至少42個、或至少44個、或至少46個、或至少48個、或至少50個、或至少52個、或至少54個、或至少56個、或至少58個、或至少60個、或至少62個、或至少64個、或至少66個、或至少68個、或至少70個、或至少72個、或至少74個、或至少76個、或至少78個、或至少80個、或至少82個、或至少84個、或至少86個、或至少88個、或至少90個、或至少92個、或至少94個、或至少96個、或至少98個、或至少100個核苷酸；當(dāng)形成了消化產(chǎn)物時，在各個實施方案中，消化產(chǎn)物具有不超過200個、或不超過180個、或不超過160個、或不超過140個、或不超過120個、或不超過110個、或不超過100個、或不超過90個、或不超過80個、或不超過70個、或不超過60個、或不超過50個、或不超過40個、或不超過38個、或不超過36個、或不超過34個、或不超過32個、或不超過30個、或不超過28個、或不超過26個、或不超過24個、或不超過22個、或不超過20個、或不超過18個、或不超過16個、或不超過14個、或不超過12個、或不超過10個核苷酸。
在包括NARS的本發(fā)明的任何方法或化合物或組合物中，該NARS可含有一個或多個錯配的核苷酸。換句話說，形成NARS的一個或多個核苷酸堿基對可能不根據(jù)常規(guī)的沃森-克里克堿基配對法則進行雜交。然而，當(dāng)錯配堿基存在于NARS中時，那么至少所有形成NARS有義鏈的核苷酸是存在的。
當(dāng)本發(fā)明的任何方法需要使用修飾的脫氧核苷三磷酸時，那么在一個實施方案中，修飾的脫氧核苷三磷酸是α-硫代脫氧核苷三磷酸。
當(dāng)在本發(fā)明的任何方法中使用DNA聚合酶時，該DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌體M2 DNA聚合酶、噬菌體phiPRD1 DNA聚合酶、測序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和T4 DNA聚合酶的任何一種或多種，一個適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶的組合可通過對所列的這些聚合酶的任何2種、或任何3種、或任何4種等進行組合而形成，如聚合酶可選自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶或exo-Vent聚合酶。
除上文簡述的和在此處更詳細(xì)描述的方法、試劑盒和組合物之外，本發(fā)明在下面也提供了可用于或可由本發(fā)明的方法和試劑盒生成的化合物、組合物和試劑盒部分雙鏈的寡核苷酸探針，該探針包括(a)可由切割劑(NA)識別的切割劑識別序列(NARS)，該NA將在切割位點(NS)切割該探針或其延伸產(chǎn)物，(b)或者(i)在含有NS的鏈中的5’突出端，其中該突出端包括至少基本與目標(biāo)核酸中的核苷酸序列互補的核苷酸序列，或(ii)在不含有NS的鏈中的3’突出端，其中該突出端包括至少基本與目標(biāo)核酸中的核苷酸序列互補的核苷酸序列；和(c)在既不含有NS也不能進行延伸以含有NS的探針鏈中的核苷酸序列，該核苷酸序列位于相應(yīng)于NS的位置的5’，且該核苷酸序列唯一地與目標(biāo)核酸相關(guān)，其中該突出端至少基本與所述目標(biāo)核酸互補。該探針在下面的方法中是特別有用的，在該方法中使懷疑含有目標(biāo)核酸的檢驗樣品與探針進行組合；不與樣品中的核酸進行雜交的探針可以和與樣品中的核酸進行雜交的探針分離；然后用切割劑和聚合酶對與樣品中的核酸進行雜交的探針進行處理以擴增單鏈核酸片段，該單鏈核酸片段含有唯一地與樣品中的核酸相關(guān)的核苷酸序列；且對擴增的核酸片段進行表征以至少確定其核苷酸序列是唯一與樣品中該核酸的存在相關(guān)的序列。例如，可將目標(biāo)或探針進行固定，然后將非固定的目標(biāo)(當(dāng)探針固定時)或非固定的探針(當(dāng)目標(biāo)固定時)與固定的材料進行組合，然后將未固定的或沒有與固定材料雜交的任何材料洗掉，并根據(jù)本發(fā)明對固定的材料進行重復(fù)切割和延伸以提供擴增的單鏈核酸片段，然后對擴增的單鏈片段進行表征以至少鑒定存在于探針中的唯一與目標(biāo)相關(guān)的核苷酸序列的互補鏈，然后確定目標(biāo)(即設(shè)計探針以與其“唯一相關(guān)”的目標(biāo))是否存在于樣品中。本質(zhì)上，唯一與目標(biāo)核酸相關(guān)的探針中的核苷酸序列是特定目標(biāo)核酸的有效的特異性信號。在一方面，本發(fā)明提供了一種化合物，其中目標(biāo)核酸與探針是雜交的。另一方面，本發(fā)明提供了一種化合物，其中目標(biāo)核酸固定于固體支持體上并與探針雜交。另一方面，本發(fā)明提供了固定于固體支持體上的探針。另一方面，本發(fā)明提供了固定于固體支持體上的探針和與探針進行雜交的目標(biāo)核酸。在本發(fā)明的各個實施方案中，一種或多種下面的標(biāo)準(zhǔn)可用于描述探針和/或探針與目標(biāo)的雜交產(chǎn)物目標(biāo)核酸是變性的雙鏈核酸的一條鏈，而雙鏈核酸可為如基因組核酸和/或可為cDNA；目標(biāo)核酸源自病原病毒的基因組；目標(biāo)核酸源自病原細(xì)菌的基因組；目標(biāo)核酸源自病原細(xì)菌的附加體；探針的雙鏈區(qū)域長度為10-22個、或11-21個、或12-20個、或13-19個、或8-25個、或8-30個、或8-35個、或10-25個、或10-30個、或10-35個核苷酸；探針在不含有NS的鏈中具有3’突出端；探針在含有NS的鏈中具有5’突出端；5’突出端或3’突出端長度為5-25個、或6-22個、或8-20個、或10-18個核苷酸；探針含有少于200個核苷酸；探針含有少于150個核苷酸；探針含有少于100個核苷酸；探針含有少于90個、或少于80個、或少于70個、或少于60個、或少于50個核苷酸；探針含有至少20個、或至少21個、或至少22個、或至少23個、或至少24個、或至少25個、或至少26個、或至少27個、或至少28個、或至少29個、或至少30個核苷酸；NS可由切割性內(nèi)切核酸酶切割；NS可由N.BstNB I切割；本發(fā)明也提供了包括多個上述的唯一探針的組合物，其中該探針由于其具有根據(jù)探針的特性(c)的序列而是唯一的，即與組合物中的其他探針不同，該探針唯一地以某種方式與目標(biāo)核酸相關(guān)，該方式不同于任何其他探針與特定目標(biāo)核酸相關(guān)的方式，或者該探針具有與目標(biāo)核酸唯一相關(guān)的序列，而組合物中無其他探針也與該特定目標(biāo)核酸相關(guān)。在一方面，這多個探針是以陣列形式組織的，如該多個探針是在支持體上的不同限定位置固定于固體支持體上的。
一對寡核苷酸引物(ODNP)，或包括一對ODNP的試劑盒或組合物，該引物對定義為第一個ODNP和第二個ODNP，其中(a)第一個ODNP至少部分是由至少基本與位于單鏈目標(biāo)核酸中限定位置3’的核苷酸序列互補的核苷酸序列形成的，(b)第二個ODNP至少部分是由至少基本與存在于目標(biāo)核酸互補鏈中的核苷酸序列互補的核苷酸序列形成的，其中存在于互補鏈中的該核苷酸序列位于限定位置互補鏈的3’；(c)第一個和第二個ODNP進一步包括中斷的限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(IRERS)(而不是完整的IRERS)的第一條鏈的第一個不變識別序列(CRS)和第二條鏈的第二個CRS，完整的IRERS是從第一條和第二條鏈形成的雙鏈核酸序列，其中第一個和第二個CRS由可變識別序列(VRS)連接，和(d)第一個或第二個ODNP進一步包含位于第一個CRS或第二個CRS的5’的NERS。除可在此處闡明的其他標(biāo)準(zhǔn)之外，下面的標(biāo)準(zhǔn)可進一步用于描述單獨的ODNP，或存在于組合物或試劑盒中的ODNP，可將這些標(biāo)準(zhǔn)的任何兩個或多個進行組合以描述ODNP至少基本與目標(biāo)核酸互補的第一個ODNP的核苷酸序列長度為至少8個、或9個、或10個、或11個、或12個、或13個、或14個、或15個、或16個、或17個、或18個、或19個、或20個核苷酸；至少基本與目標(biāo)核酸的互補鏈互補的第二個ODNP的核苷酸序列長度為至少8個、或9個、或10個、或11個、或12個、或1 3個、或14個、或15個、或16個、或17個、或18個、或19個、或20個核苷酸；第一個ODNP長度為15-85個、或16-70個、或17-60個、或18-50個、或18-40個、或20-30個、或15-30個、或15-40個、或15-50個核苷酸；第二個ODNP長度為15-85個、或16-70個、或17-60個、或18-50個、或18-40個、或20-30個、或15-30個、或15-40個、或15-50個核苷酸；第一個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸中的第一個CRS的3’末端的核苷酸互補的一個或多個核苷酸；第二個ODNP包含至少基本與存在于目標(biāo)核酸中的第二個CRS的3’末端的核苷酸互補的一個或多個核苷酸；單鏈目標(biāo)核酸是雙鏈核酸的一條鏈；而雙鏈核酸可為如基因組核酸和/或可為cDNA；目標(biāo)核酸源自病原病毒的基因組；目標(biāo)核酸源自病原細(xì)菌的基因組；目標(biāo)核酸源自病原細(xì)菌的附加體。該組合物可進一步包含目標(biāo)核酸和/或目標(biāo)核酸的互補鏈。該組合物或試劑盒可進一步包括一種或多種識別IRERS的限制性內(nèi)切核酸酶；Bsl I；識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)；N.BstNB I；DNA聚合酶；運行ODNP測定法的適當(dāng)緩沖液；和使用試劑盒的說明書。例如，本發(fā)明提供了基因型試劑盒，該試劑盒包括剛剛描述的引物對，以及識別NERS的NE、識別IRERS的RE、DNA聚合酶和使用試劑盒的說明書。
包含切割劑識別序列(NARS)的核酸連接物。本發(fā)明提供了連接物、含有該連接物的試劑盒、使用該連接物的方法和含有該連接物的組合物。在本發(fā)明的各個實施方案中，下面的標(biāo)準(zhǔn)可用于進一步表征連接物，而任何兩個或更多標(biāo)準(zhǔn)可進行組合，這些標(biāo)準(zhǔn)僅僅是示例性的并補充在文中別處闡明的任何標(biāo)準(zhǔn)它含有NARS的有義和反義序列兩者；它含有雙鏈切割位點(NS)，在該位點僅僅一條鏈被識別NARS的切割劑切割；它含有少于200個、或少于175個、或少于150個、或少于125個、或少于100個、或少于90個、或少于80個、或少于70個、或少于65個、或少于60個、或少于55個、或少于50個、或少于45個、或少于40個、或少于35個、或少于30個、或少于25個、或少于20個核苷酸；它含有超過10個、或超過15個、或超過20個、或超過25個、或超過30個、或超過35個、或超過40個、或超過45個、或超過50個核苷酸；它含有用于與目標(biāo)核酸連接的3’突出端；它含有用于與目標(biāo)核酸連接的5’突出端；它含有用于與目標(biāo)核酸連接的平端；它是固定于固體支持體上的，它是通過連接物的3’末端固定于固體支持體上的；它是通過連接物的5’末端固定于固體支持體上的；NARS可由切割性內(nèi)切核酸酶識別；NARS可由N.BstNB I識別；NARS是半修飾的限制性內(nèi)切核酸酶識別序列；NARS可由選自AvaI、Bsl I、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4HI、Hinc II、Hind II和Nci I的限制性內(nèi)切核酸酶(RE)識別；連接物設(shè)計為，當(dāng)連接物與雙鏈目標(biāo)核酸片段連接時，目標(biāo)核酸鏈位于NARS的部分的5’，該NARS的部分位于不含有NS的連接物的鏈中；它含有IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)；它含有IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)，識別TRERS的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點同時位于(i)雙鏈目標(biāo)核酸片段中，和(ii)相應(yīng)于由NA切割的NS的位置的5’；它含有IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)且該TRERS位于含有NS鏈的NARS的5’；它含有IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)且該TRERS位于含有NS的鏈中NARS的3’；它含有可由Bpm I識別的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)；它含有可由Mme I識別的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)。本發(fā)明也提供了包括連接物的組合物和試劑盒。該組合物和試劑盒可用于如合成如在此處所述的寡核苷酸探針。除連接物之外，組合物和試劑盒的可選擇成分包括一種或多種識別NARS的切割劑；識別NARS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)；NE的緩沖液；識別TRERS的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶；IIs型限制性內(nèi)切核酸酶的緩沖液；DNA聚合酶(如選自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTMDNA聚合酶和/或exo-Vent聚合酶的DNA聚合酶)；DNA聚合酶的緩沖液；可連接連接物與目標(biāo)核酸的連接酶；DNA連接酶的緩沖液；使用試劑盒的說明書；固定于固體支持體上的包含poly(dT)寡核苷酸的引物；反轉(zhuǎn)錄酶；鏈置換促進劑，如海藻糖。本發(fā)明也提供了包含連接物和雙鏈目標(biāo)核酸的組合物?？蛇x擇地，雙鏈目標(biāo)核酸片段是cDNA片段?？蛇x擇地，雙鏈目標(biāo)核酸是固定于固體支持體上的?？蛇x擇地，該組合物進一步包括連接酶和/或聚合酶和/或限制性內(nèi)切核酸酶和/或切割性內(nèi)切核酸酶。例如，本發(fā)明提供了包含(a)IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)；和(b)切割劑識別序列(NARS)的核酸連接物，其中當(dāng)該連接物與雙鏈目標(biāo)核酸片段連接時，在不含有識別NARS的切割劑(NA)的切割位點(NS)的鏈中，目標(biāo)核酸片段位于NARS的5’，那么識別該鏈中的TRERS(如果TRERS存在)的IIs型限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點則同時位于(i)雙鏈目標(biāo)核酸片段中，和(ii)相應(yīng)于NS的位置的5’。
可用于合成單鏈cDNA分子的模板核酸分子。該模板核酸分子包括(a)可表征為源自雙鏈cDNA分子或其片段的部分；和(b)可表征為源自核酸連接物的部分，其中(a)部分連接到(b)部分。核酸連接物(b)部分包括切割劑識別序列(NARS)。在同時存在(i)模板核酸分子，(ii)識別NARS的切割劑(NA)和(iii)DNA聚合酶時，擴增了單鏈分子，其中該單鏈分子的至少部分具有與雙鏈cDNA的一條鏈核苷酸序列的至少一部分相同的核苷酸序列。優(yōu)選地，該部分長度為至少6個、或至少7個、或至少8個、或至少9個、或至少10個、或至少11個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個、或至少17個、或至少18個、或至少19個、或至少20個核苷酸。下面的標(biāo)準(zhǔn)可單獨或以任何組合用于進一步表征本發(fā)明的模板核酸分子識別NARS的NA是切割性內(nèi)切核酸酶(NE)；識別NARS的NA是N.BstNB I；NARS是半修飾的限制性內(nèi)切核酸酶?？蛇x擇地，模板核酸分子的至少一條鏈固定于固體支持體上。該固定可例如通過雙鏈cDNA分子或核酸連接物的末端進行，該末端現(xiàn)在不、過去不且將來也不參與雙鏈cDNA分子和核酸連接物之間的連接?？蛇x擇地，在固體支持體和固定于固體支持體上的模板核酸分子的末端之間可存在連接體分子?？蛇x擇地，在固體支持體和最直接固定于固體支持體上的模板核酸分子的末端之間可存在連接體半分子，該連接體包含限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)一條鏈的序列。許多這種模板核酸分子可用于形成cDNA文庫。在一個實施方案中，形成文庫的許多模板核酸分子中的每一個都固定于固體支持體上?？蛇x擇地，在該文庫中，識別NARS的NA是切割性內(nèi)切核酸酶(NE)，如N.BstNB I。可選擇地，如已經(jīng)提及的，NARS可為半修飾的限制性內(nèi)切核酸酶。
本發(fā)明的這些和相關(guān)方面及實施方案將在下文中更詳細(xì)地進行闡明。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明方法中主要步驟的示意圖，該方法用于用示例性的ODNP對在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異，該ODNP對分別含有切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)有義鏈的序列和IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)一條鏈的序列，圖2是本發(fā)明方法中主要步驟的示意圖，該方法用于用各自含有NERS有義鏈的序列的示例性O(shè)DNP對在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異。
圖3是本發(fā)明方法中主要步驟的圖示，該方法使用ODNP對、作為示例性IRERS的Bst I和作為示例性NERS的N.BstNB I在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定核苷酸。
圖4是中斷的限制性內(nèi)切核酸酶識別序列主要成分的示意圖。A1A2...Am是由m個核苷酸組成的特定的核苷酸序列，而A’1A’2...A’m是A1A2...Am的互補鏈序列。由A1A2...Am和A’1A’2...A’m組成的雙鏈片段形成了第一個CRS。N1N2...Nn是由n個核苷酸組成的可變核苷酸序列，其中核苷酸的任何一個都可含有四個堿基的任何一個(A、C、T或G)。N’1N’2...N’n是N1N2...Nn的互補鏈并與N1N2...Nn組合形成了VRS。C1C2...Ci是由i個核苷酸組成的特定的核苷酸序列，而C’1C’2...C’i是C1C2...Ci的互補鏈。由C1C2...Ci和C’1C’2...C’i組成的雙鏈片段形成了第二個CRS。
圖5是本發(fā)明方法中主要步驟的示意圖，該方法使用各自含有半修飾的RERS有義鏈的序列的示例性O(shè)DNP對在目標(biāo)核酸的限定位置鑒定遺傳變異。虛線代表具有整合的修飾脫氧核苷酸的延伸/擴增產(chǎn)物。
圖6是本發(fā)明用于探測生物學(xué)樣品中目標(biāo)核酸存在與否的方法中主要步驟的示意圖。
圖7是從對4-聚體ODN(5’-ACGA-3’)的1∶10稀釋物的電噴射-液相-層析/質(zhì)譜分析法-飛行時間(ES-LC/MS-TOF)分析中獲得的層析譜。
圖8是從對4-聚體ODN(5’-ACGA-3’)的1∶100稀釋物的(ES-LC/MS-TOF)分析中獲得的層析譜。
圖9是從對4-聚體ODN(5’-ACGA-3’)的1∶1000稀釋物的(ES-LC/MS-TOF)分析中獲得的層析譜。
圖10A和10B是從對6-聚體ODN(5’-ACGATG-3’)的1∶10稀釋物的(ES-LC/MS-TOF)分析中獲得的層析譜。
圖11是從對6-聚體ODN(5’-ACGATG-3’)的1∶100稀釋物的(ES-LC/MS-TOF)分析中獲得的層析譜。
圖12是從對6-聚體ODN(5’-ACGATG-3’)的1∶1000稀釋物的(ES-LC/MS-TOF)分析中獲得的層析譜。
圖13A和13B是從對8-聚體ODN(5’-ACGATGCA-3’)的1∶10稀釋物的(ES-LC/MS-TOF)分析中獲得的層析譜。
圖14是從對8-聚體ODN(5’-ACGATGCA-3’)的1∶100稀釋物的(ES-LC/MS-TOF)分析中獲得的層析譜。
圖15A和15B是從對10-聚體ODN(5’-GAACATCCAT-3’)的1∶10稀釋物的(ES-LC/MS-TOF)分析中獲得的層析譜。
圖16是從對10-聚體ODN(5’-GAACATCCAT-3’)的1∶100稀釋物的(ES-LC/MS-TOF)分析中獲得的層析譜。
圖17是從對10-聚體ODN(5’-GAACATCCAT-3’)的1∶1000稀釋物的(ES-LC/MS-TOF)分析中獲得的層析譜。
圖18是一套4個、6個、8個和10個核苷酸的ODNP的高壓液相層析(HPLC)的層析譜。
圖19A和19B表示對3個8-聚體(圖19A)和3個10-聚體(圖19B)的HPLC分級分離和探測。
圖20A和20B表示對1個4-聚體、1個6-聚體、3個8-聚體和3個10-聚體的HPLC分離(圖20A)和對2個6-聚體的洗脫(圖20B)。
圖21是PCR反應(yīng)產(chǎn)物用N.BstNB I和Bsl I兩者消化后的UV層析譜。箭頭顯示單鏈核酸消化產(chǎn)物。
圖22A和22B分別是PCR反應(yīng)產(chǎn)物用N.BstNB I和Bsl I兩者消化后的單個離子層析譜和總離子層析譜。
圖23表示用N.BstNB I和Bsl I雙消化從雙鏈PCR產(chǎn)物中切割的單鏈寡核苷酸的質(zhì)譜。
圖24A和24B表示從一個個體的基因組DNA中擴增的序列5’-GAGCACAGGATG-3’(頂部鏈)和5’-CATCCTGTGCTC-3’(底部鏈)的UV層析譜(圖24A)和抽取(extracted)的離子流圖(圖24B)。
圖25A和25B表示從另一個個體的基因組DNA中擴增的序列5’-GAGCACAGGATG-3’(頂部鏈)和5’-CATCCTGTGCTC-3’(底部鏈)的UV層析譜(圖25A)和抽取(extracted)的離子流圖(圖25B)。
圖26A和26B表示無模板對照中的UV層析譜(圖26A)和抽取的離子流圖(圖26B)。
圖27A和27B表示頂部片段(m/z＝3@1265amu)(圖27B)和底部片段(m/z＝3@1216amu)(圖27A)的質(zhì)譜。
圖28是本發(fā)明用于制備單鏈核酸探針的示例性方法中主要步驟的示意圖。固定的poly(dT)探針用于分離mRNA并充當(dāng)合成cDNA的引物。然后使合成的cDNA與本發(fā)明的示例性連接物連接，該連接物包含切割性內(nèi)切核酸酶識別序列(NERS)和IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)。然后將連接的核酸片段用IIs型限制性內(nèi)切核酸酶消化并用作模板以在DNA聚合酶和識別核酸連接物中的NERS的切割性內(nèi)切核酸酶存在時合成短的單鏈核酸探針。
圖29A-H是示例性連接物和目標(biāo)核酸的連接產(chǎn)物的示意圖。目標(biāo)核酸由虛線代表。TRERS(“IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列”的縮寫)上面或下面的箭頭顯示從TRERS到識別TRERS的限制性內(nèi)切核酸酶(RE)的切割位點的方向。同樣地，NERS(“切割性內(nèi)切核酸酶識別序列”的縮寫)上面或下面的箭頭顯示從NERS到識別NERS的切割性內(nèi)切核酸酶(NE)的切割位點的方向。
圖30A和30B表示本發(fā)明方法中主要步驟的示意圖，該方法用于確定目標(biāo)cDNA分子中特定外顯子-外顯子連接(Exon A和Exon B之間的連接)的存在(圖30A)或不存在(圖30B)。
圖31A-C表示用于本發(fā)明確定源自目標(biāo)基因的cDNA中每一個外顯子-外顯子連接存在與否的方法中主要步驟的示意圖。圖31A是用于本發(fā)明方法中的目標(biāo)基因和兩套ODNP的示意圖。虛線代表未顯示的基因部分。圖31B是目標(biāo)cDNA分子(目標(biāo)cDNA I)和擴增的模板核酸片段的示意圖。圖31C是另一個目標(biāo)cDNA(目標(biāo)cDNA II)和擴增的模板核酸片段的示意圖。
圖32表示源自1號個體的含有二等位基因(biallelic)的SNP(即A或T)或其互補核苷酸的擴增單鏈片段的質(zhì)譜分析，該1號個體對于A等位基因是純合的。上面的試驗組表示含有T等位基因的互補核苷酸的片段(稱為“T等位基因的底部鏈”)的抽取的離子流層析譜。第二個試驗組表示含有T等位基因的片段(稱為“T等位基因的頂部鏈”)的抽取的離子流層析譜。第三個試驗組表示含有A等位基因的互補核苷酸的片段(稱為“A等位基因的底部鏈”)的抽取的離子流層析譜。第四個試驗組表示含有A等位基因的片段(稱為“A等位基因的頂部鏈”)的抽取的離子流層析譜。下面的試驗組表示總離子流的層析譜。
圖33表示源自2號個體的含有二等位基因(biallelic)的SNP(即A或T)或其互補核苷酸的擴增單鏈片段的質(zhì)譜分析，該2號個體對于A和T等位基因是雜合的。上面的試驗組表示含有T等位基因的互補核苷酸的片段(稱為“T等位基因的底部鏈”)的抽取的離子流層析譜。第二個試驗組表示含有T等位基因的片段(稱為“T等位基因的頂部鏈”)的抽取的離子流層析譜。第三個試驗組表示含有A等位基因的互補核苷酸的片段(稱為“A等位基因的底部鏈”)的抽取的離子流層析譜。第四個試驗組表示含有A等位基因的片段(稱為“A等位基因的頂部鏈”)的抽取的離子流層析譜。下面的試驗組表示總離子流的層析譜。
圖34表示源自樣本的含有二等位基因(biallelic)的SNP(即A或T)或其互補核苷酸的擴增單鏈片段的質(zhì)譜分析，該樣本取自200個對于A等位基因是純合的個體和1個對于T等位基因是純合的個體。上面的試驗組表示含有T等位基因的互補核苷酸的片段(稱為“T等位基因的底部鏈”)的抽取的離子流層析譜。第二個試驗組表示含有T等位基因的片段(稱為“T等位基因的底部鏈”)的抽取的離子流層析譜。第三個試驗組表示含有A等位基因的互補核苷酸的片段(稱為“A等位基因的底部鏈”)的抽取的離子流層析譜。第四個試驗組表示含有A等位基因的片段(稱為“A等位基因的頂部鏈”)的抽取的離子流層析譜。下面的試驗組表示總離子流的層析譜。
圖35表示對與圖34中相同的擴增寡核苷酸片段在2.5分鐘和5分鐘之間的二極管陣列追蹤(UV追蹤)(上面試驗組)與總離子流(下面試驗組)。
圖36表示通過使源自基因組DNA的引發(fā)核酸與單鏈核酸探針退火及隨后擴增單鏈核酸分子而制備模板核酸分子的主要步驟的示意圖。
圖37表示從基因組DNA制備模板核酸分子及隨后擴增單鏈核酸分子的主要步驟的示意圖。該基因組DNA包含切割劑識別序列。該模板分子是通過使基因組DNA片段的一條鏈與單鏈核酸探針退火而制備的，該單鏈核酸探針是基因組DNA片段的另一條鏈的部分。
圖38表示從基因組DNA制備模板核酸分子及隨后擴增單鏈核酸分子的主要步驟的示意圖。該基因組DNA包含切割劑識別序列和限制性內(nèi)切核酸酶識別序列。將可在其識別序列之外進行切割的切割性內(nèi)切核酸酶所識別的切割性內(nèi)切核酸酶識別序列用作示例性的切割劑識別序列。
圖39表示用兩個寡核苷酸引物從目標(biāo)核酸制備模板核酸分子及隨后擴增單鏈核酸分子的主要步驟的示意圖。一個引物包含NERS有義鏈的序列而另一個引物包含IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)的一條鏈。
圖40表示用兩個ODNP制備模板核酸分子及隨后擴增單鏈核酸分子的主要步驟的示意圖。在該示例性的實施方案中，兩個ODNP均包含NERS有義鏈的序列。
圖41表示在示例性的實施方案中用兩個ODNP制備模板核酸分子及隨后擴增單鏈核酸分子的主要步驟的示意圖。兩個ODNP均包含RERS一條鏈的序列。該擴增是在用作示例性的修飾脫氧核苷三磷酸的α-硫代脫氧核苷三磷酸存在時進行的。
圖42表示用包含NARS反義鏈序列的單鏈核酸探針探測固定的目標(biāo)核酸的方法的示意圖。
圖43表示用包含切割劑識別序列有義鏈序列的寡核苷酸引物擴增單鏈核酸分子的方法的示意圖。
圖44表示用固定的單鏈核酸探針探測目標(biāo)核酸存在的方法的示意圖，該單鏈核酸探針包含NARS有義鏈的序列和至少基本與目標(biāo)核酸3’部分互補的序列。
圖45表示用固定的單鏈核酸探針探測目標(biāo)核酸存在的方法的示意圖，該單鏈核酸探針包含NARS有義鏈的序列和至少基本與目標(biāo)核酸互補的序列。
圖46表示用寡核苷酸引物擴增單鏈核酸分子的方法的示意圖，該寡核苷酸探針包含切割劑識別序列有義鏈的序列和包含雙鏈IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(TRERS)的部分雙鏈的核酸分子。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于擴增單鏈核酸片段的方法、組合物和試劑盒，該擴增方法用于如鑒定遺傳變異；制備寡核苷酸探針；和探測生物學(xué)樣品中的核酸存在與否，和cDNA和mRNA中外顯子之間連接的存在與否。該擴增是通過組合(a)包含切割劑識別序列(NARS)的模板雙鏈核酸和(b)識別NARS的切割劑(NA)的識別位點(NS)而進行的。然后用切割劑在NS對雙鏈核酸模板進行切割以借此在NS生成3’末端。在5’→3’外切核酸酶缺陷的DNA聚合酶存在時，延伸了NS的3’末端，從而替換了下游的單鏈DNA片段(即在NS具有5’末端的單鏈DNA片段)。然后用切割劑切割延伸產(chǎn)物，并將這樣在NS形成的3’末端再次用DNA聚合酶進行延伸以形成另一個延伸產(chǎn)物。使該切割-延伸過程重復(fù)多次，從而導(dǎo)致具有由切割劑在NS生成的5’末端的單鏈DNA片段的擴增。
在各個方面，本發(fā)明在各個有用的應(yīng)用中使用上述擴增方法，該應(yīng)用包括在目標(biāo)核酸中鑒定遺傳變異、寡核苷酸探針的制備和探測生物學(xué)樣品中特定核酸的存在與否或者cDNA或mRNA分子或群體中特定外顯子-外顯子連接的存在與否。這種應(yīng)用在許多方面是有用的，包括遺傳疾病的遺傳分析、腫瘤或病原體診斷、鑒定疾病的誘因、法律、親子確定、創(chuàng)建和監(jiān)控作物培養(yǎng)或動物優(yōu)質(zhì)育種項目、細(xì)胞功能和/或疾病標(biāo)記基因的表達描述、鑒定和/或表征在植物或動物中導(dǎo)致傳染性疾病和/或與食品安全相關(guān)的傳染性生物。
A.規(guī)定/定義在提供對本發(fā)明更詳細(xì)的描述之前，如在下文中定義一些在此處所用的規(guī)定和術(shù)語對于理解是有幫助的。額外的定義可在貫穿本發(fā)明的描述中發(fā)現(xiàn)。
術(shù)語“3’”和“5’”在此處用于描述核酸單鏈中特定位點的位置。當(dāng)核酸中的位置為參考核苷酸或參考核苷酸序列“3’”時，這意味著該位置在參考核苷酸或參考核苷酸序列的3’末端和該核酸鏈的3’羥基之間。同樣地，當(dāng)核酸中的位置為參考核苷酸或參考核苷酸序列“5’”時，這意味著該位置在參考核苷酸或參考核苷酸序列的5’末端和該核酸鏈的5’磷酸之間。進一步地，當(dāng)所討論核酸序列為參考核苷酸或參考核苷酸序列的“直接3’”時，這意味著該所討論核酸序列直接鄰接參考核苷酸或參考核苷酸序列的3’末端。類似地，當(dāng)所討論核酸序列為參考核苷酸或參考核苷酸序列“直接5’(5’to)”或“的直接5’(5’of)”，這意味著該所討論核酸序列直接鄰接參考核苷酸或參考核苷酸序列的5’末端。
如在此處所用的，“切割”指在相對于由進行切割的酶識別的核苷酸序列的特定位置對雙鏈核酸分子的僅僅一條鏈或部分雙鏈核酸分子的雙鏈部分的切割。將核酸進行切割的該特定位置稱為“切割位點”(NS)。
“切割劑”(NA)是識別完全或部分雙鏈核酸分子的特定核苷酸序列并僅在相對于識別序列的特定位置切割核酸分子的一條鏈的酶。當(dāng)雙鏈(或部分雙鏈的)核酸分子含有半修飾的識別/切割序列時，其中一條鏈含有至少一個阻止限制性內(nèi)切核酸酶對該鏈(即含有衍生的核苷酸的鏈)進行裂解的衍生的核苷酸，該切割劑包括但不局限于切割性內(nèi)切核酸酶(如N.BstNB I)和限制性內(nèi)切核酸酶(如Hinc II)。
如在此處所用的，“切割性內(nèi)切核酸酶”(NE)指識別完全或部分雙鏈核酸分子的核苷酸序列并僅在相對于識別序列的特定位置對核酸分子的一條鏈進行切割的內(nèi)切核酸酶。與限制性內(nèi)切核酸酶(RE)不同，該限制性內(nèi)切核酸酶(RE)需要其識別序列通過含有至少一個衍生的核苷酸而進行修飾以阻止對完全或部分雙鏈核酸分子含有衍生的核苷酸的鏈進行切割，NE一般識別僅包含天然核苷酸的核苷酸序列并僅在含有該核苷酸序列的完全或部分雙鏈核酸分子的一條鏈進行切割。
如在此處所用的，“天然核苷酸”指腺苷酸、鳥苷酸、胞苷酸、胸苷酸或尿苷酸。“ 衍生的核苷酸”指除天然核苷酸之外的核苷酸。
完全或部分雙鏈的核酸分子中被NA識別的核苷酸序列稱為“切割劑識別序列”(NARS)。同樣地，完全或部分雙鏈的核酸分子中被NE識別的核苷酸序列稱為“切割性內(nèi)切核酸酶識別序列”(NERS)。RE識別的特定序列稱為“限制性內(nèi)切核酸酶識別序列”(RERS)。如在此處所用的，“半修飾的RERS”指雙鏈RERS，其中識別序列的一條鏈含有至少一個衍生的核苷酸(如α-硫代脫氧核苷酸)，該衍生的核苷酸阻止識別RERS的RE對該鏈(即在識別序列含有衍生的核苷酸的鏈)進行裂解。
在某些實施方案中，NARS是雙鏈核苷酸序列，其中序列的一條鏈中的每一個核苷酸均與另一條鏈中相應(yīng)位置的核苷酸互補。在這種實施方案中，含有可由識別NARS的NA切割的NS的鏈中的NARS序列稱為“NARS有義鏈的序列”或“雙鏈NARS有義鏈的序列”，而不含有NS的鏈中的NARS序列稱為“NARS反義鏈的序列”或“雙鏈NARS反義鏈的序列”。
同樣地，在NERS是其中一條鏈精確地與另一條鏈互補的雙鏈核苷酸序列的實施方案中，位于含有可由識別NERS的NE切割的NS的鏈中的NERS序列稱為“NERS有義鏈的序列”或“雙鏈NERS有義鏈的序列”，而位于不含有NS的鏈中的NERS序列稱為“NERS反義鏈的序列”或“雙鏈NERS反義鏈的序列”。例如，示例性切割性內(nèi)切核酸酶N.BstNB I的識別序列和切割位點如下面所示，“”指示切割位點且N指示任何核苷酸5′-GAGTCNNNNN-3′3′-CTCAGNNNNN-5′N.BstNB I識別序列有義鏈的序列為5’-GAGTC-3’，而反義鏈的為5’-GACTC-3’。
類似地，含有可由識別半修飾的RERS(即不含有任何衍生的核苷酸的鏈)的RE切割的NS的鏈中的半修飾RERS序列稱為“半修飾RERS有義鏈的序列”并位于“半修飾RERS有義鏈”中，而位于不含有NS的鏈(即含有衍生的核苷酸的鏈)中的半修飾RERS序列稱為“半修飾RERS反義鏈的序列”并位于“半修飾RERS反義鏈”中。
在某些其他的實施方案中，NARS是具有一個或多個核苷酸錯配的至多部分雙鏈的核苷酸序列，但含有如上所述的雙鏈NARS的完整有義鏈。根據(jù)此處所用的規(guī)定，在描述NARS的上下文中，當(dāng)兩個核酸分子相互退火從而形成雜交產(chǎn)物時，且該雜交產(chǎn)物包括NARS時，且在雜交產(chǎn)物的NARS中有至少一個錯配的堿基對時，則認(rèn)為該NARS是僅僅部分雙鏈的。這種NARS可由某些切割劑(如N.BstNB I)識別，該切割劑僅需要雙鏈識別序列的一條鏈來發(fā)揮其切割活性。例如，在某些實施方案中，N.BstNB I的NARS可含有如下完整有義鏈5′-GAGTC-3′3′-NNNNN-5′其中N指示任何核苷酸，且一個位置上的N可以與另一個位置上的N相同或不同，然而在該識別序列中有至少一個錯配堿基對。在該情況下，可將NARS表征為具有至少一個錯配的核苷酸。
在某些其他的實施方案中，NARS是具有一個或多個未配對核苷酸的部分或完全單鏈核苷酸序列，但含有如上所述的雙鏈NARS的完整有義鏈。根據(jù)此處所用的規(guī)定，在描述NARS的上下文中，當(dāng)兩個核酸分子(即第一鏈和第二鏈)相互退火從而形成雜交產(chǎn)物時，且該雜交產(chǎn)物在第一鏈中包括由NA識別的核苷酸序列時(即雜交產(chǎn)物含有NARS時)，且當(dāng)形成雜交產(chǎn)物時由NA識別的序列中至少一個核苷酸不相應(yīng)于第二鏈中的核苷酸(即不在第二鏈中核苷酸的對面)，則在雜交產(chǎn)物的NARS中有至少一個未配對的核苷酸，且認(rèn)為該NARS是部分或完全單鏈的。這種NARS可由某些切割劑(如N.BstNB I)識別，該切割劑僅需要雙鏈識別序列的一條鏈來發(fā)揮其切割活性。例如，在某些實施方案中，N.BstNB I的NARS可含有如下完整有義鏈5′-GAGTC-3′3′-N0-4-5′(其中“N”指示任何核苷酸，0-4指核苷酸“N”的數(shù)目，且一個位置上的“N”可以與另一個位置上的“N”相同或不同)，該鏈含有N.BstNB I的雙鏈識別序列有義鏈的序列。在該情況下，G、A、G、T或C的至少一個是未配對的，從而在互補鏈中沒有相應(yīng)的核苷酸。例如在雜交產(chǎn)物中有“環(huán)”時，且特別地當(dāng)在環(huán)中存在有義鏈(完全或部分)時，這種情況會產(chǎn)生。
在本發(fā)明的一些方面，擴增的單鏈核酸片段是長度為最多5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個或100個核苷酸的單鏈核酸片段。這種片段的短的長度促進了通過各種技術(shù)對其進行探測和/或表征，包括質(zhì)譜分析法和液相層析，如在下文詳細(xì)描述的。然而，在一些方面的某些實施方案中(如制備單鏈核酸探針)，擴增的單鏈核酸片段相對較長，例如其長度可為51-1000個核苷酸。
位于“相應(yīng)于”雙鏈核酸另一條鏈(第二鏈)的位置(即限定位置)的位置的雙鏈核酸的一條鏈(第一鏈)中的核苷酸指，當(dāng)?shù)谝粭l和第二條鏈相互雜交從而形成雙鏈核酸時與第二鏈中限定位置的核苷酸形成氫鍵并互補的第一鏈中的核苷酸。同樣地，“相應(yīng)于”雙鏈核酸的另一條鏈(第二鏈)中的切割位點的雙鏈核酸的一條鏈(第一鏈)中的位置指第一鏈中兩個核苷酸之間的位置，該兩個核苷酸與圍繞切割位點的第二鏈中的兩個核苷酸互補。
B.遺傳變異的探測在一方面，本發(fā)明提供了探測目標(biāo)核酸中遺傳變異的方法、化合物和試劑盒。
1.探測遺傳變異的方法本發(fā)明提供了在目標(biāo)核酸的限定位置探測遺傳變異的方法。該方法包含(a)提供包含目標(biāo)核酸片段和位于遺傳變異5’的切割位點(NS)的雙鏈模板核酸；(b)在DNA聚合酶和在NS進行切割的切割劑存在時擴增包含遺傳變異的單鏈片段，該單鏈片段的5’末端位于NS；和(c)表征單鏈片段并借此鑒定遺傳變異。在一個實施方案中，單鏈片段是在切割性內(nèi)切核酸酶存在時擴增的。在另一個實施方案中，該片段是在限制性內(nèi)切核酸酶存在時擴增的。
至于使用切割性內(nèi)切核酸酶的方法，雙鏈模板核酸可通過首先形成第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和在限定位置含有遺傳變異的目標(biāo)核酸的混合物而提供。在目標(biāo)核酸是雙鏈的情況下，如圖1所示，第一個ODNP包含NERS有義鏈的核苷酸序列和至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸一條鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列。第二個ODNP包含至少基本與位于目標(biāo)核酸另一條鏈上的遺傳變異的3’的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且可選擇地包含限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)一條鏈的核苷酸序列。
在目標(biāo)核酸是單鏈的情況下，第一個ODNP包含NERS有義鏈的核苷酸序列和至少基本與位于遺傳變異5’的目標(biāo)核酸相同的核苷酸序列，而第二個ODNP包含至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且可選擇地包含RERS一條鏈的核苷酸序列。
用目標(biāo)核酸作為模板對第一個和第二個ODNP的延伸產(chǎn)生了具有NERS和可選擇地具有RERS的延伸產(chǎn)物，其中遺傳變異位于NERS和RERS之間。該延伸產(chǎn)物是包含目標(biāo)核酸片段和位于遺傳變異5’的NS的想要的雙鏈模板核酸。如果其含有RERS，那么延伸產(chǎn)物可用識別RERS的限制性內(nèi)切核酸酶進行裂解，并在識別NERS的NE存在時用作擴增單鏈核酸分子的模板。否則，延伸產(chǎn)物可直接用作擴增單鏈核酸分子的模板。該方法的示例性過程如圖1所示，其中用TRERS(IIs型限制性內(nèi)切核酸酶識別序列)作為示例性的RERS。
可選擇地，如圖2所示，雙鏈模板核酸可通過首先形成第一個寡核苷酸引物(ODNP)、第二個ODNP和在限定位置含有遺傳變異的雙鏈目標(biāo)核酸的混合物而提供。第一個ODNP包含NERS有義鏈的核苷酸序列和至少基本與位于遺傳變異互補鏈5’的目標(biāo)核酸一條鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列。第二個ODNP包含NERS有義鏈的序列，而不是如上所述的RERS。用目標(biāo)核酸作為模板對第一個和第二個ODNP的延伸產(chǎn)生了具有兩個NERS的延伸產(chǎn)物。該延伸產(chǎn)物是包含目標(biāo)核酸片段和位于遺傳變異5’的NS的想要的雙鏈模板核酸。然后該延伸產(chǎn)物可用作在識別NERS的NE存在時擴增單鏈核酸片段的模板，該單鏈核酸片段的5’末端位于NS。
至于使用限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈核酸的方法，雙鏈模板核酸可通過首先形成第一個ODNP、第二個ODNP和雙鏈目標(biāo)核酸的混合物而提供(圖5)。在目標(biāo)核酸是雙鏈的情況下，第一個ODNP包含第一個限制性內(nèi)切核酸酶識別序列(RERS)一條鏈的序列和至少基本與位于遺傳變異互補鏈3’的目標(biāo)核酸一條鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列，而第二個ODNP包含第二個RERS一條鏈的序列和至少基本與位于限定位置3’的目標(biāo)核酸第二鏈的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在目標(biāo)核酸是單鏈的情況下，第一個ODNP包含第一個RERS一條鏈的序列和至少基本與位于遺傳變異互補鏈5’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，而第二個ODNP包含第二個RERS一條鏈的序列和至少基本與位于遺傳變異3’的目標(biāo)核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在脫氧核苷三磷酸和至少一種修飾的脫氧核苷三磷酸存在時對第一個和第二個ODNP的延伸產(chǎn)生了具有第一個和第二個半修飾的RERS的片段。這種延伸產(chǎn)物可用作模板以在識別第一個RERS和第二個RERS的RE存在時擴增單鏈核酸分子。在某些實施方案中，第一個RERS與第二個RERS相同。因而，延伸產(chǎn)物可在識別第一個和第二個RERS兩者的RE存在時進行擴增。
在所有上述的實施方案中，單鏈核酸分子的擴增是在切割劑和DNA聚合酶存在時實現(xiàn)的。該擴增的單鏈核酸分子含有目標(biāo)核酸的遺傳變異并進而進行了表征。借此鑒定了目標(biāo)核酸的遺傳變異。
a.目標(biāo)核酸涉及鑒定遺傳變異的本發(fā)明的目標(biāo)核酸是任何如下核酸分子，該核酸分子用野生型核酸序列作為參考時可含有遺傳變異，且可充當(dāng)引物延伸反應(yīng)的模板，即可與寡核苷酸引物形成堿基對。
術(shù)語“核酸”一般指整合了核糖核酸或其類似物單位的任何分子，優(yōu)選地指多聚體分子。目標(biāo)核酸可為單鏈或雙鏈的。單鏈目標(biāo)核酸可為變性的雙鏈DNA的一條鏈?？蛇x擇地，它可為不源自任何雙鏈DNA的單鏈核酸。在一方面，目標(biāo)核酸是DNA。另一方面，目標(biāo)是RNA。適當(dāng)?shù)暮怂岱肿邮荄NA，包括基因組DNA、核糖體DNA和cDNA。其他適當(dāng)?shù)暮怂岱肿邮荝NA，包括mRNA、rRNA和tRNA。核酸分子可天然存在，如在基因組DNA中，或它可為合成的，即基于人工作用制備的，或者可為兩者的組合。
在一方面，目標(biāo)核酸是天然存在的核酸或者源自天然存在的核酸。天然存在的目標(biāo)核酸是從生物學(xué)樣品中獲得的。優(yōu)選的生物學(xué)樣品包括一種或多種哺乳動物組織，優(yōu)選地為人類組織(如血液、血漿/血清、毛發(fā)、皮膚、淋巴結(jié)、脾、肝等)和/或細(xì)胞或細(xì)胞系。生物學(xué)樣品可包含一種或多種人類組織和/或細(xì)胞。哺乳動物和/或人類組織和/或細(xì)胞可進一步包含一種或多種腫瘤組織和/或細(xì)胞。
從生物學(xué)樣品中分離核酸群體的方法是眾所周知的且對于本發(fā)明領(lǐng)域中技術(shù)人員而言是易于獲得的。示例性的技術(shù)描述于如下面的實驗室研究手冊中Sambrook等人，“Molecular Cloning”Cold SpringHarbor Press，3rdEdition，2001)和Ausubel等人，“Short Protocolsin Molecular Biology”(1999)(在此處整體引入作為參考)。核酸分離試劑盒在許多公司中也是商業(yè)上可購得的，且可用于簡化和加速分離過程。
合成的目標(biāo)核酸是通過人工干預(yù)生產(chǎn)的。目前，許多公司從事于制備和銷售可用作本發(fā)明的目標(biāo)核酸分子的合成核酸。這些公司可以或也將制備用于本發(fā)明的引物。參見如Applied Bio ProductsBionexus(www.bionexus.net)；Commonwealth Biotechnologies，Inc.(Richmond，VA；www.cbi-biotech.com)；Gemini Biotech(Alachua，F(xiàn)lorida；www.geminibio.com)；INTERACTIVABiotechnologie GmbH(Ulm，德國；www.interactiva.de)；Microsynth(Balgach，瑞士；www.microsynth.ch)；Midland Certified ReagentCompany(Midland，TX；www.mcrc.com)；Oligos Etc.(Wilsonyille，OR；www.oligosetc.com)；Operon Technologies Inc.(Alameda，CA；www.operon.com)；Scandanavian Gene Synthesis AB(Kping，瑞典；www.sgs.dna)；Sigma-Genosys(The Woodlands，Texas；www.genosys.com)；Synthetic Genetics(San Diego，CA；www.syntheticgenetics.com，由Epoch Biosciences，Inc.(Bothell，WA；www.epochbio.com)所有)；和許多其他的。
合成的核酸目標(biāo)可用擴增反應(yīng)制備。該擴增反應(yīng)可為如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
合成的核酸目標(biāo)可用重組DNA方法通過在一種或多種原核或真核生物中制備，該生物如大腸桿菌(E.coli)、酵母、果蠅(Drosophila)或哺乳動物組織培養(yǎng)細(xì)胞系。
目標(biāo)核酸分子可以且通常會含有一種或多種存在于核苷酸中的天然堿基，即腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和在RNA的情況下為尿嘧啶(U)。此外，且特別地當(dāng)核酸是合成的分子時，目標(biāo)核酸可包括“非天然的”核苷酸。非天然的核苷酸是化學(xué)半分子(moiety)，該半分子可替代核苷酸鏈中的一種或多種天然核苷酸而不導(dǎo)致核酸喪失其充當(dāng)引物延伸反應(yīng)模板的能力。該替代除堿基替代之外，可包括糖和/或磷酸替代。
這種半分子是本領(lǐng)域中眾所周知的，且已知有許多名稱，包括如無堿基核苷酸，該無堿基核苷酸不含有通常公認(rèn)的核苷酸堿基如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶(參見如Takeshita等人“Oligonucleotides containing synthetic abasic sites”TheJournal of Biological Chemistry，262卷，pp.10171-10179 1987；Iyer等人“Abasic oligodeoxyribonucleoside phosphorothioatessynthesis and evaluation as anti-HIV-1 agents”Nucleic acidsResearch，18卷，pp.2855-2859 1990；和美國專利6,117,657)；堿基或核苷酸類似物(參見如Ma等人，“Design and Synthesis ofRNA Miniduplexes via a Synthetic Linker Approach.2.Generationof Covalently Closed，Double-Stranded Cyclic HIV-1 TAR RNAAnalogs with High Tat-Binding Affinity”，Nucleic acids Research212585(1993)。一些堿基已知是通用的錯配堿基類似物，如無堿基的3-硝基吡咯；convertides(參見如Hoops等人，Nucleic AcidsRes.254866-4871(1997)；修飾的核苷酸(參見如Millican等人，“Synthesis and biophysical studies of shortoligodeoxynucleotides with novel modificationsA possibleapproach to the problem of mixed base oligodeoxynucleotidesynthesis”，Nucleic acids Research 127435-7453(1984))；核苷酸模擬物；核酸相關(guān)化合物；間隔區(qū)(參見如Nielsen等人，Science 2541497-1500(1991)；和特異性間隔區(qū)(參見如PCT國際
發(fā)明者J·范尼斯, D·J·格拉斯, L·K·范尼斯 申請人:凱克研究生院