專利名稱：編碼對映選擇性酰胺酶的核酸序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼對映選擇性酰胺酶的核酸序列。本發(fā)明還涉及載體，以及包括本發(fā)明核酸序列的宿主細胞，和用于生產和使用所述核酸序列的表達產物的方法。
酰胺酶是具有酰胺酶活性的多肽，并且是具有催化羧酸酰胺水解形成相應的羧酸和氨的能力的酶。對映選擇性酰胺酶是優(yōu)選羧酸酰胺的對映體之一作為底物的酰胺酶。已知對映選擇性酰胺酶在生產對映體富集的羧酸的商業(yè)化生物工藝中具有價值。例如，羧酸包括α-H-α-氨基酸，α，α-二烷基氨基酸，α-羥酸和/或它的衍生物以及它的肽。對映體富集的羧酸和/或它的衍生物以及它的肽被用于各種行業(yè)，例如，用于制藥工業(yè)，農藥工業(yè)等。例如，氨基酸L-纈氨酸非常適合用作環(huán)孢菌素A發(fā)酵的前體，α-羥基丙酸被用于生產除草劑，某些α-N-羥基氨基酸可以用作抗腫瘤制劑，而D-p-羥基苯基甘氨酸和D-苯基甘氨酸被用于生產某些半合成的廣譜性β-內酰胺抗生素。在EP 494716 B1中，提供了具有酰胺酶活性的微生物的兩種例子人蒼白桿菌NCIB 40321(又被稱作NCIMB 40321)和克雷伯氏菌NCIB 40322。
本發(fā)明特別涉及編碼其氨基酸序列與SEQ IDNO.2具有至少70％同一性的對映選擇性酰胺酶的核酸序列。在SEQ IDNO.1中，提供了編碼來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶的核酸序列。在SEQ IDNO.2中，提供了相應于SEQ IDNO.1的核酸序列的氨基酸序列。業(yè)已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中進行的能表達具有與SEQ IDNO.2有至少70％的同一性的氨基酸序列的對映選擇性酰胺酶的核酸的微生物的包括分批階段和補料階段的發(fā)酵，導致了對映選擇性酰胺酶活性的產量的提高，前提是在補料階段在每升發(fā)酵培養(yǎng)基中補充0.5-50毫克Zn2+。
對映選擇性酰胺酶活性的產量的這種提高，可能是由于對映選擇性酰胺酶本身活性的增強，以及所產生的對映選擇性酰胺酶數(shù)量的增加。在EP1,174,499中，業(yè)已披露了編碼來自陰溝腸桿菌N-7901的對映選擇性酰胺酶的核酸序列；相應的氨基酸序列與相應于SEQ IDNO1的核酸序列的氨基酸序列有68％的同一性。因此，編碼本發(fā)明的對映選擇性酰胺酶的核酸序列是新的。在EP1,174,499中尚未披露表達編碼陰溝腸桿菌N-7901的對映選擇性酰胺酶的核酸序列的微生物發(fā)酵的Zn2+依賴性。
本發(fā)明優(yōu)選涉及編碼其氨基酸序列與SEQ ID NO.2具有至少大約75％的同一性程度的對映選擇性酰胺酶的核酸序列，同一性更優(yōu)選為80％，更優(yōu)選至少大約85％，最優(yōu)選至少大約90％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少97％，特別優(yōu)選至少98％，更特別優(yōu)選至少99％，最特別優(yōu)選100％。
對于本發(fā)明來說，兩種氨基酸序列之間的同一性程度，是通過BLASTP成對比對程序(NCBI)確定的，采用以下同一性表和比對參數(shù)錯配＝-15，罰分＝-3，空位-延伸＝1，配對-獎分＝1，空位x-droff＝50，預期值＝10，字長＝3。
本發(fā)明還涉及編碼對映選擇性酰胺酶的核酸序列，所述核酸序列優(yōu)選在中等，更優(yōu)選在高嚴格條件下，最優(yōu)選在極高嚴格性條件下與(i)SEQ ID NO.1，(ii)包括SEQ ID NO.1的基因組DNA序列或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交。
雜交實驗可以通過多種方法進行，這些方法為技術人員所熟知。例如，從多種方法中進行選擇的一般指南，可以參見以下文獻的第9章，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloningA Laboratory Manual.2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989。
雜交條件的嚴格性表示進行雜交的條件，所述雜交由實際雜交和洗滌步驟組成。洗滌步驟被用于洗掉沒有與固定在諸如硝酸纖維素濾膜上的靶核酸雜交的核酸。例如，雜交條件的嚴格性，可以通過改變洗滌溶液的鹽濃度和/或改變進行洗滌步驟的溫度(洗滌溫度)而改變。通過降低洗滌溶液中的鹽濃度或提高洗滌溫度，可以提高雜交的嚴格性。對于本申請來說，雜交在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，在大約45℃下進行大約12小時。在1X SSC，0.1％SDS中，在50℃下進行兩個連續(xù)的30分鐘的洗滌步驟是低嚴格性的例子，在55℃下進行的洗滌是中等嚴格性的例子，在60℃下的洗滌是高嚴格性的例子，在65℃下的洗滌是極高嚴格性的例子。
本發(fā)明還涉及編碼具有SEQ IDNO.2的氨基酸序列的對映選擇性酰胺酶的核酸序列，在所述氨基酸序列的大約15或更少的氨基酸位置上具有改變，優(yōu)選至少10個或更少的氨基酸位置，更優(yōu)選大約5個或更少，更優(yōu)選大約3個或更少的氨基酸位置，其中，所述改變獨立地是(i)氨基酸的插入(ii)氨基酸的缺失(iii)氨基酸的取代。
編碼具有包括多種改變的SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的對映選擇性酰胺酶的核酸序列，可以按本領域已知方法制備，例如，核酸序列的定點誘變。在該方法中，將編碼所需突變，如在特定氨基酸位置上的取代，插入或缺失的誘變寡核苷酸與感興趣的DNA的一條鏈退火，并且用作啟動DNA合成的引物。通過DNA合成，將誘變寡核苷酸摻入新合成的DNA鏈上。通常，本領域已知的方法還具有誘變核酸序列的陽性選擇技術，以便提高定點誘變方法的效率。某些定點誘變技術使用PCR，其中，將誘變寡核苷酸用作引物用于實現(xiàn)定點誘變的方法，披露于很多公司的產品手冊中，例如，Stratagene和Invitrogen公司的產品手冊，并且，用于實現(xiàn)定點誘變的試劑盒可以通過商業(yè)渠道獲得。
本發(fā)明還涉及編碼對映選擇性酰胺酶的核酸序列，這種酰胺酶與抗SEQ IDNO.2的氨基酸序列片段的抗體具有免疫交叉反應性。每一個片段的長度優(yōu)選至少20個氨基酸。所述免疫學交叉反應性可以使用抗具有酰胺酶活性的本發(fā)明分離的多肽的至少一個表位或者與其反應的抗體測定。所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，可以用本領域所公知的方法生產，例如，披露于以下文獻中的方法Hudson等，Practical Immunology，Third Edition(1989)，BlackwellScientific Publications。所述免疫化學交叉反應性可以通過本領域已知的測定方法測定，所述方法的一種例子是Western印跡，例如，在以下文獻中所披露的Hudson等，Practical Immunology，ThirdEdition(1989)，Blackwell Scientific Publications。
本發(fā)明還涉及編碼對映選擇性酰胺酶的融合蛋白的核酸序列，它由可操作地與編碼標記多肽的一種或多種核酸序列連接的編碼本發(fā)明多肽的核酸組成?？刹僮鞯剡B接表示兩種核酸序列是這樣連接的如果表達的話，能產生對映選擇性酰胺酶的融合蛋白，所述標記多肽存在于它的N-和/或C-末端。所述標記多肽可用于多種目的，例如，可以用它提高融合蛋白的穩(wěn)定性或可溶性，還可以用它作為分泌信號，它是指導融合蛋白進入細胞的某些區(qū)室的信號，或者可將它用于促進融合蛋白的純化。用于促進融合蛋白純化的標記多肽的例子是MBP-和GST-標記。例如，具有MBP-標記或GST-標記的融合蛋白的純化披露于以下文獻中F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，和K.Struhl eds.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，USA，1990。例如，可以在pMAL載體中生產具有MBP-標記的融合蛋白(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)，而具有GST-標記的融合蛋白可以在pGEX載體(Amersham Biosciences，Inc.，Piscataway，NJ，USA)中生產，采用各自供應商的方法。
本發(fā)明的核酸序列，例如，具有SEQ IDNO.1的序列的核酸序列可以用標準分子生物學技術和其中所提供的序列信息分離。例如，將SEQ IDNO.1的全部或部分核酸序列作為雜交探針用于人蒼白桿菌NCIB 40321上，可以通過標準雜交和克隆技術分離本發(fā)明的核酸序列(例如，披露于以下文獻中Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
另外，包括SEQ IDNO.1的全部或一部分的核酸序列可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)使用根據(jù)SEQ IDNO.1或SEQ IDNO.2所包含的序列信息設計的合成寡核苷酸引物分離，在人蒼白桿菌NCIB40321上采用PCR，并且，如果將所述寡核苷酸引物用于具有對映選擇性酰胺酶活性的微生物的話，也可以分離。
本發(fā)明的核酸序列還可以使用諸如來自具有對映選擇性酰胺酶活性的微生物的基因組DNA，cDNA或者合適的mRNA作模板，和基于按照標準(RT)-PCR擴增技術提供的序列信息的合適的寡核苷酸引物擴增?？梢詫⒂纱藬U增的核酸克隆到合適的載體上，并且通過DNA序列分析表征。
另外，相當于本發(fā)明核酸序列或者能與本發(fā)明核酸序列雜交的寡核苷酸可以通過標準合成技術制備，例如，使用自動DNA合成儀。
可以按照本領域技術人員所公知的標準克隆和表達技術將本發(fā)明的核酸序列克隆到合適載體上，并且在導入合適的宿主之后，該序列能夠表達，以便產生相應的對映選擇性酰胺酶(例如，在以下文獻中所披露的Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明核酸序列的載體。
合適的載體是通常被用于克隆和表達的載體，并且為本領域技術人員所公知。例如，用于在大腸桿菌中表達的合適載體的例子披露于以下文獻中的表1中Makrides，S.C.，Microbiological Reviews，Vol.60，No.3，(1996)，512-538。所述載體優(yōu)選包括位于克隆位點上游的啟動子，所述克隆位點包括編碼具有酰胺酶活性的多肽的核酸序列，所述啟動子在所述宿主業(yè)已生長到能表達具有酰胺酶活性的相應的多肽時啟動，可以啟動和關閉的啟動子為本領域技術人員所公知，并且，舉例來說，包括lac啟動子，araBAD啟動子，T7啟動子，trc啟動子，tac啟動子和trp啟動子。例如，特別適用于本發(fā)明范圍的是披露于WO 00/66751中的載體，例如，沒有插入的青霉素G酰基轉移酶基因的pKAFssECtrp或pKAFssECaro。合適的宿主通常是用于克隆或表達的宿主，并且為本領域技術人員所公知。例如，合適宿主菌株的例子是大腸桿菌菌株，例如大腸桿菌TOP10F′，TOP10，DH10B，DH5a，HB101，W3110，BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。特別適用于本發(fā)明范圍的是大腸桿菌K-12菌株，例如，DH1，HB101，RV308，RR1，W3110，C600。
有時，載體的選擇取決于宿主的選擇，反之亦然。例如，如果使用具有araBAD啟動子的載體的話，不能破壞阿拉伯糖誘導物(ara-)的大腸桿菌宿主菌株是非常優(yōu)選的。
另外，可以將本發(fā)明的核酸序列整合到正常情況下不包括本發(fā)明核酸序列的宿主細胞的基因組中，并且(超量)表達。這一目的可以按照本領域技術人員所公知的方法實現(xiàn)。本發(fā)明還涉及正常情況下不包括本發(fā)明核酸序列，現(xiàn)在包括本發(fā)明核酸序列的宿主細胞，優(yōu)選包括含有本發(fā)明核酸序列的載體的宿主細胞。
本發(fā)明還涉及用于制備權利要求1-5中任意一項的核酸序列的表達產物的方法，其中，在第一個步驟中，將所述核酸序列導入合適的宿主，該宿主正常情況下不包括本發(fā)明的核酸序列，并且，其中，所述核酸序列隨后在所述宿主中表達。核酸序列的導入和隨后的表達是本領域技術人員所公知的標準技術。
本發(fā)明還涉及包括分批和補料階段的在發(fā)酵培養(yǎng)基中對微生物進行發(fā)酵的方法，其中，所述微生物表達本發(fā)明的核酸，并且，在發(fā)酵期間向每升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5-50毫克的Zn2+(相當于7.7μM-770μM)。
通常，所述補料階段是在大約10小時之后開始。0.5-50毫克/升發(fā)酵培養(yǎng)基的Zn2+用量可以一次補充到發(fā)酵培養(yǎng)基中。不過，優(yōu)選分次補充，因為一次添加Zn2+會導致在發(fā)酵培養(yǎng)基上形成泡沫，并且導致隨后在發(fā)酵中分解微生物。例如，Zn2+可以分成5-10個相等的部分添加，不過，當然還可以將Zn2+分成不同的部分在補料階段添加。優(yōu)選將Zn2+連續(xù)補充到發(fā)酵培養(yǎng)基中，如果采用連續(xù)補料方法的話，將Zn2+與其他成分組合在一種補料中是非常實用的。
例如，Zn2+存在于鋅鹽中。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選使用能很好地溶解在水中的鋅鹽(高于0.1摩爾/升)，例如Zn(NO3)2，Zn(CH3COO)2，ZnSO4，ZnCl2，ZnBr2，ZnI2。
用于發(fā)酵的微生物可以是本身就具有并且能表達本發(fā)明核酸序列的微生物，不過優(yōu)選是能表達本發(fā)明核酸序列，更優(yōu)選超量表達所述核酸序列的宿主。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在存在0.01mM-100mM Zn2+的條件下，也能提高本發(fā)明核酸序列的表達產物的對映選擇性酰胺酶活性。因此，本發(fā)明還涉及用于制備對映體富集的羧酸和/或對映體富集的羧酸酰胺的方法，其中，在存在0.01mM-100mM Zn2+的條件下，讓相應的D-和L-羧酸酰胺的混合物與權利要求1-5中任意一項的表達產物接觸，以便對所述羧酸酰胺的一種對映體進行對映選擇性水解，形成相應的對映體富集的羧酸，而所述羧酸酰胺的其他對映體保持不變。如果必要，可以水解其余的對映體富集的羧酸酰胺，以便形成相應的對映體富集的酸。所述其余羧酸酰胺的水解可以用本領域已知方法進行，例如，在堿性或酸性條件下進行，或通過酶促進行。
通過本發(fā)明核酸序列的表達產物催化的對映選擇性水解優(yōu)選是在存在0.5-50，更優(yōu)選0.5-20mM Zn2+的條件下進行的。
進行由本發(fā)明核酸序列的表達產物催化的對映選擇性水解的pH并不重要，所述對映選擇性水解優(yōu)選是在5-9，更優(yōu)選6.5-8.5的pH下進行的。
在存在本發(fā)明表達產物的條件下進行的對映選擇性水解的溫度優(yōu)選為10-75℃，更優(yōu)選30-65℃，特別優(yōu)選40-60℃。
作為混合物，可以使用D-和L-羧酸酰胺的消旋混合物，不過，當然也可以使用隨機選擇的D-和L-羧酸酰胺的混合物。
合適的羧酸酰胺的例子有具有2-20個C原子的α-H-α-氨基酸酰胺或它的衍生物，例如，丙氨酸酰胺，苯基甘氨酸酰胺，苯丙氨酸酰胺，對羥基苯基甘氨酸酰胺，脯氨酸酰胺，纈氨酸酰胺，亮氨酸酰胺，叔亮氨酸酰胺，甲硫氨酸酰胺，脯氨酸酰胺，谷氨酸酰胺，具有2-20個C原子的α-H-α-羥酸酰胺，例如，扁桃酸酰胺，具有2-20個C原子的α-α-二烷基-氨基酸酰胺，例如α-甲基纈氨酸酰胺，α-甲基苯基甘氨酸酰胺，α-乙基苯基甘氨酸酰胺，α-丁基苯基甘氨酸酰胺，α-甲基苯丙氨酸酰胺，α-乙基苯丙氨酸酰胺，α-乙基-α-丁基甘氨酸酰胺。叔亮氨酸或α-甲基苯基甘氨酸優(yōu)選是按照本發(fā)明的方法制備的。
為了說明本發(fā)明，補充了以下實施例。
實施例實施例1通過在補料階段向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加Zn2+對能表達SEQ IDNO.1所示核酸序列的大腸桿菌K-12進行發(fā)酵。
制備了以下種子培養(yǎng)基酵母提取粉(DIFCO，BactoTM) 38gNa2HPO417.8gKH2PO413.6gNH4Cl 4.8g蒸餾水 1500ml用NaOH水溶液將pH調整到6.8。將100和200ml的等分樣品放入500和2000ml的三角燒瓶中，并且消毒(121℃，20分鐘)。在無菌條件下將1.1ml的50％(w/v)葡萄糖和2.2ml的青霉素(1.2g/l)溶液添加到500ml燒瓶中(接種階段1)。將1和2ml的50％(w/v)葡萄糖和新霉素(1.2g/l)溶液添加到2000ml燒瓶中(接種階段2)。
然后，用能表達SEQ IDNO.1所示核酸的大腸桿菌K-12菌株的1.8ml 50％v/v甘油/水懸浮液，接種所述接種階段1的三角燒瓶，并且在穩(wěn)定的定軌振蕩條件下，在27℃的溫度下培養(yǎng)并且溫育22小時。為了在大腸桿菌K12菌株308中表達SEQ IDNO 1所示的核酸序列，使用具有包括限制位點(對于正向引物來說為Ndel，而對于反向引物來說為SmaI)的5’延伸部分的酰胺酶特異性引物通過PCR擴增所述核酸序列。使用限制酶Ndel和SmaI，將所獲得的片段克隆到大腸桿菌表達載體pKECtrp的衍生物的大腸桿菌青霉素G?；D移酶編碼序列的位點上。所使用的衍生的表達載體與構建體pKECtrp類似，它的構建披露于WO00/66751中，所不同的是，它包括大腸桿菌aro啟動子而不是trp啟動子。將整個接種階段1三角燒瓶用于接種接種階段2的2000ml三角燒瓶。在穩(wěn)定定軌振蕩條件下，在27℃的溫度下將接種階段2培養(yǎng)和溫育3小時。
將2％(v/v)的接種階段2的培養(yǎng)物用于接種20L玻璃發(fā)酵罐中的6.4L分批階段培養(yǎng)基。所述分批階段培養(yǎng)基具有以下組分Gistex_LS pasta 24.6g/l檸檬酸10g/lFeSO4·7H2O0.2g/lMgSO4·7H2O3.1g/lCaCl2·2H2O1.5g/lMnSO4·H2O 0.169g/l(NH4)2SO49.0g/lCoCl2·6H2O0.006g/lNaMoSO4·2H2O 0.004g/lH3BO30.004g/l消泡劑Basildon 86/013 數(shù)滴
K2HPO418.1g/l葡萄糖211.4g/l新霉素20.012g/l硫胺素20.014g/l在將pH調整到4.5(用NaOH)之后，在121℃下將所述分批階段培養(yǎng)基消毒65分鐘。用1和2標注各自是分別溶解的培養(yǎng)基成分，并且將包括用1標注的成分的溶液在121℃下消毒65分鐘，而包括用2標注的成分的溶液進行過濾消毒。這兩種成分都是在無菌條件下添加到所述培養(yǎng)基中的。在轉移接種階段1之前，將分批階段培養(yǎng)基的pH調整到pH7.0。發(fā)酵是在27℃下，在穩(wěn)定攪拌和最佳通氣條件下進行的。在50-54小時之間，發(fā)酵溫度在4小時內從27℃線性降低到25℃，并且直到發(fā)酵結束都一直保持在該溫度下。
在發(fā)酵期間(分批和補料階段)，pH可以在7.00和7.30之間變動。分批階段隨著補料1和補料2的開始而結束(補料階段的開始)，此時，pH達到7.15。此時，碳源被耗盡。分批階段持續(xù)大約9小時。補料1具有以下組分葡萄糖 670g/l硫氨素10.18g/lMgSO4·7H2O114.4g/l脯氨酸16.1g/l谷氨酸一鈉112.2g/lZnSO4·7H2O10.022g/l補料1是按以下方法制備的。首先溶解葡萄糖。將大約0.4ml/l4N HCl添加到葡萄糖溶液中。對該溶液進行消毒(121℃，30分鐘)。硫氨素，MgSO4·7H2O，脯氨酸和谷氨酸一鈉和ZnSO4·7H2O是分別溶解的，并且在添加(無菌)到葡萄糖溶液中之前，對它們的溶液進行過濾消毒。在下面的表1中提供了用于將補料1導入分批階段培養(yǎng)基的參數(shù)。
表1.用于導入補料1的補料參數(shù)
補料2具有以下組分Gistex_LS pasta 300g/l補料2是按以下方法制備的。首先將酵母提取膏溶解在水中。然后，將pH調整到4.5+/-0.1。對該溶液進行消毒(121℃，30分鐘)。在下面的表2中提供了用于將補料2導入分批階段培養(yǎng)基的參數(shù)。在表1和2中的參數(shù)中的‘時間’表示‘補料開始之后的小時數(shù)’。
表2.用于導入補料2的參數(shù)
補料1和補料2構成了補料階段培養(yǎng)基。發(fā)酵在120小時之后結束。
所述發(fā)酵是重復進行的，所不同的是，在補料1中沒有添加ZnSO4·7H2O。
在補料階段開始之后，用下文所披露的方法測定兩種發(fā)酵的發(fā)酵液(發(fā)酵培養(yǎng)基和細胞)L-酰胺酶活性。
分析在補料1中有Zn2+和在補料1中沒有Zn2+的條件下，從能表達SEQIDNO.1所示核酸序列的大腸桿菌K-12的發(fā)酵獲得的發(fā)酵液(具有細胞的發(fā)酵培養(yǎng)基)樣品的L-酰胺酶活性。
在水浴中將1.5ml的溫育試劑(含有1.1w％L-苯基甘氨酸酰胺，0.11M HEPES-NaOH緩沖液，pH8.0和1.1mM MnSO4.1H2O)加熱到55℃。10分鐘之后，將100微升樣品溶液(含有用20mM HEPES-NaOH稀釋的發(fā)酵液，pH7.5/2mM DTT)添加到加熱的溫育試劑中。將合并的溫育試劑與樣品溶液一起溫育20分鐘。然后通過將100微升的合并的溫育試劑添加到1.5ml終止試劑(53mM磷酸)中終止該反應。以14,000rpm的速度將該終止的反應混合物離心5分鐘。在以下條件下通過HPLC分析上清液柱nucleosil 120-3C18(125×4mm)波長檢測儀220nm流速1.0ml/分鐘注入體積20微升洗脫液100mM磷酸緩沖液pH3.0L-苯基甘氨酸和L-苯基甘氨酸酰胺的保留時間分別為大約1.8和2.7分鐘計算相當于苯基甘氨酸的HPLC峰下的面積，并且在校正發(fā)酵液的稀釋系數(shù)之后與來自其他樣品的苯基甘氨酸峰下面的面積進行比較。來自所述樣品的相對峰面積等于相對L-酰胺酶活性，該活性是所述樣品彼此比較的活性。在

圖1中提供了來自具有含有Zn2+的補料1的發(fā)酵樣品(A)和不含Zn2+的補料1的發(fā)酵樣品(B)的相對L-酰胺酶活性(rel.act.)，其中，相對活性業(yè)已相對采集樣品的時間T(h)(分批階段開始之后的小時數(shù))進行了作圖。
從圖1中可以看出，如果在補料階段將Zn2+添加到發(fā)酵液中的話，能夠產生更高的L-酰胺酶活性。
從在補料1中使用Zn2+的發(fā)酵中制備酶溶液LAM0011。
用4g/l辛醇處理來自在補料1中使用Zn2+的發(fā)酵的發(fā)酵液，以便殺滅微生物，并且通過高壓勻漿(600-700巴)，勻漿2次。在勻漿之后，通過添加根據(jù)發(fā)酵液體積計算的10v％的C577的10％溶液使之絮凝。添加根據(jù)發(fā)酵液體積計算的10v％的過濾助劑Dicalite 448。在膜式過濾壓力器上過濾所得到的漿，并且用1倍體積的處理水洗滌。然后對生物物質塊進行燒灼滅菌。用Seitz過濾平板(大小為5-15微米)過濾濾液，然后用0.1-0.3微米的微生物過濾平板過濾。所得到的濾液在容器中冷凍保存待用。
從在補料1中不使用Zn2+的發(fā)酵制備酶溶液LAM0001用4g/l辛醇處理來自在補料1中不使用Zn2+的發(fā)酵的發(fā)酵液，以便殺滅微生物，并且通過高壓勻漿(600-700巴)，勻漿2次。在勻漿之后，通過添加根據(jù)發(fā)酵液體積計算的10v％的C577的10％溶液使之絮凝。添加根據(jù)發(fā)酵液體積計算的10v％的過濾助劑Dicalite 448。在膜式過濾壓力器上過濾所得到的漿，并且用2.2倍體積的處理水洗滌。然后對生物物質塊進行燒灼滅菌。用大小為5-15微米的Seitz過濾平板過濾所述濾液，然后用0.1-0.3微米的微生物過濾平板過濾。然后，使用50kD Polysulphon膜將所得到的濾液濃縮3倍，用1/4保留物體積的RO水洗滌保留物。然后再次用大小為5-15微米的Seitz過濾平板過濾所述保留物，然后用0.1-0.3微米的微生物過濾平板過濾。將所得到的濾液保存在容器中直到在應用反應中使用(實施例2-5)。
實施例2在存在不同濃度的Zn2+的條件下，在pH6.5的條件下用來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶對DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺進行對映選擇性水解通過在存在0.1，0.3，1.0，3.0和9.0mM Zn2+的條件下進行反應，確定Zn2+濃度對來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶對DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的水解反應的影響。作為對照，還進行了進行沒有額外Zn2+的反應。
對于本實驗來說，在燒瓶中填充25g反應混合物，每一種反應混合物含有2.5g DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺(最終濃度為10wt％)，46微升來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的批號LAM0011，不另外添加ZnSO4，或添加0.1，0.3，1.0，3.0或9.0mM的ZnSO4，所有反應混合物的pH為6.5。通過添加酶液啟動所述反應。
所有反應混合物都是在定軌搖床上，在55℃下以200rpm的速度溫度。在添加所述酶之后(t＝0小時)馬上，以及在1，4和11小時之后采集1g樣品，并且轉移到裝有4g 1M H3PO4小瓶中，以便馬上終止該反應。樣品和終止溶液的確切量是通過稱重確定的，在用0.22微米的過濾器過濾之后，按照以下方法通過HPLC測定α-甲基苯基甘氨酸和α-甲基苯基甘氨酸酰胺的濃度柱Inertsil ODS-3(3微米)50mm*4.6mm ID洗脫液50mM H3PO4-NaOH，pH＝2.5流速0.8ml/分鐘溫度40℃Vinj15L檢測UV 210nm在表3中提供了該實驗的結果，其中，所述反應的轉化率(與起始氨基酸酰胺的總量相比所形成的氨基酸的量)是以相對轉化率形式提供的；最大轉化率被設定為100。
表3.Zn2+濃度對來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶(批號LAM 0011)對DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的水解反應的影響。
從表3可以看出，Zn2+的存在對于人蒼白桿菌L-酰胺酶對DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的活性來說是非常有利的。在不添加Zn2+的情況下，幾乎不會發(fā)生對該底物的任何水解反應(參見項目F)。
實施例3在存在不同的二價金屬離子，pH6.5的條件下，使用來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶對DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的對映選擇性水解作用。
在與實施例2類似的反應設置中，研究了添加的Zn2+是否對來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶對DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的轉化率有有利影響，所述酰胺酶是在沒有多余Zn2+的條件下發(fā)酵的。所述水解反應是在存在等摩爾數(shù)量的Mn2+或Zn2+的條件下進行的。另外，使用在存在過量Zn2+的條件下發(fā)酵的來自蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶進行對照反應。
在燒瓶中填充25g反應混合物，每一種反應混合物含有2.5g DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺(最終濃度為10wt％)，240微升來自人蒼白桿菌NCIMB 40321制劑LAM0011的L-酰胺酶，和1mM MnSO4或ZnSO4。所制備的第三種反應混合物含有(除了底物之外)1mM Zn2+和92微升來自人蒼白桿菌NCIMB 40321制劑LAM0011的L-酰胺酶(92微升LAM0001相當于240微升LAM0011的L-酰胺酶活性)。底物溫育，取樣和分析都是按實施例2所述方法進行的。在表4中提供了該實驗的結果，其中，所述反應的轉化率(與起始氨基酸酰胺相比所形成的氨基酸的數(shù)量)是以相對轉化率形式提供的，將最大轉化率設定為100。
表4.添加Zn2+和Mn2+對來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶對DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的水解反應的影響，所述酰胺酶是在補料1中沒有Zn2+的條件下發(fā)酵的(批號LAM 0001)和在補料1中有Zn2+的條件下發(fā)酵的(批號LAM 0011)。
從表4可以看出，在存在1mM Zn2+的條件下，在有和沒有額外Zn2+的條件下發(fā)酵的酶對DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的轉化率是類似的，并且這兩種轉化率都高于在存在1mM Mn2+的條件下的轉化率。
實施例4在存在不同二價金屬離子的條件下，在pH7.0的條件下來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶對DL-叔-甲基苯基亮氨酸酰胺的對映選擇性水解作用。
在與實施例2類似的設置中，測定了等摩爾數(shù)量的Mn2+，Zn2+和Mg2+的存在對來自蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶對DL-叔-亮氨酸酰胺的水解反應的影響。作為對照，進行了沒有添加任何二價金屬離子的反應。
為了進行該實驗，用25g的反應混合物填充燒瓶，每一種反應混合物含有3.13g DL-叔-亮氨酸酰胺(最終濃度為12.5wt％)，1.45微升來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶(批號LAM0011)和1.0mM ZnSO4，MgSO4或MnSO4。此外，在沒有任何額外二價金屬離子的條件下進行了一種獨立的反應。所有反應混合物的pH為7.0。所述反應是通過添加所述酶液體啟動的。
所有反應混合物是在定軌搖床上在55℃以150rpm的速度溫育的。在添加酶之后(t＝0小時)，以及小1，3和6.7小時之后，采集1g的樣品，并且轉移到裝有4g 1M H3PO4的小瓶中，以便馬上終止該反應。通過稱重確定樣品和終止溶液的確切量。在用0.22微米的濾膜過濾之后，按照以下方法通過HPLC測定叔-亮氨酸和叔-亮氨酸酰胺的濃度
柱Inertsil ODS-3(150mm×4.6mm I.D.，5μ)，由VarianChrompack提供洗脫液99v/v％50mM H3PO4，pH＝2.3，使用1N NaOH+1v/v％乙腈流速1.0ml/分鐘溫度30℃Vinj.20微升檢測在柱后衍生化之后用OPA/MCE(a)檢測熒光(λex365nm和λem＞420nm)。
(a)柱后衍生化是在反應螺旋管(2m×0.25mmI.D.)中，在環(huán)境溫度下，用pH10的含有o-鄰苯二甲醛(OPA)和2-巰基乙醇(MCE)的0.4M硼酸緩沖液進行的。衍生化試劑的流速為1.0ml/分鐘。所述試劑是通過以下方法制備的首先將49.46g H3BO3和35g KOH溶解在2升Milli-Q水中，然后用1M KOH將pH調整到10。然后將1.6g OPA(溶解在20ml乙醇中)和2ml MCE添加到該硼酸緩沖液中。
在表5中提供了該實驗的結果，其中，該反應的轉化率(與起始氨基酸酰胺的數(shù)量相比所形成的氨基酸的數(shù)量)是以相對轉化率形式提供的，將最大轉化率設定為100。
表5.不同二價金屬離子的存在對來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶(批號LAM 0011)對DL-叔-亮氨酸酰胺的水解反應的影響。
表5中的數(shù)據(jù)清楚地表明，在存在1mM Zn2+的條件下，所獲得的來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶對DL-叔-亮氨酸酰胺的水解反應，快于在存在等摩爾數(shù)量的Mg2+或在缺少額外二價金屬離子條件下所獲得的水解反應。
實施例5在存在Zn2+的條件下，在不同pH值下來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶對DL-叔-亮氨酸酰胺的對映選擇性水解為了研究pH對來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶對DL-叔-亮氨酸酰胺的對映選擇性水解作用的影響，在有和沒有1mM Zn2+的條件下，在pH7.0，8.0和9.0的條件下進行反應。
所有實驗設置與實施例3中的實驗設置相同。在表6中提供了該實驗的結果。
表6.在有和沒有1mM ZnSO4的條件下，反應混合物的pH對來自人蒼白桿菌NCIMB 40321的L-酰胺酶(批號LAM 0011)對DL-叔-亮氨酸酰胺的水解反應的影響。
序列表<110>DSM NV<120>編碼對映選擇性酰胺酸的核酸序列<130>20594WO<140>
<141>
<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>945<212>DNA<213>人蒼白桿菌(ochrobactrum anthropi)NCIMB 40321<400>1atgtgcaata attgccatta caccattcac ggccggcatc atcatttcgg ctgggacaac 60tcgttccagc cggctgaaac ggtcgcgccc ggctcgaccc tgaaattcga atgtctggac 120agcggcgcag gccactatca tcgcggcagc acagtcgccg atgtgtcgac gatggatttt 180tccaaggtca atccggttac cggccccatc ttcgtcgatg gagccaaacc gggcgatgtc 240ctgaaaatca ccatccacca gttcgagcca tcaggcttcg gctggacggc aaatattccg 300ggcttcggtc ttctcgccga cgacttcaag gaaccggcgc tagcattgtg gaactacaat 360cccacaacgc tggagccagc actcttcgga gagcgtgcgc gcgtgccgct gaagccgttc 420gccggaacca tcggcgtcgc accggcggaa aagggcctgc attcggtcgt accaccgcgt 480cgtgtcggcg gcaatctcga catccgcgat cttgcagccg gaaccacgct ttatctgccg 540atcgaagtcg aaggcgcttt gttctccatt ggtgataccc atgcggcaca gggcgacggc 600gaagtgtgcg gcaccgccat cgaaagcgcg atgaatgtcg ctctgacgct ggatctcatc 660aaggatacgc cactgaagat gccccggttc accacgccgg ggccagtgac gcggcacctc 720gataccaagg gttacgaagt caccaccggt atcgggtccg atctgtggga aggcgcgaaa 780gccgccctct ccaacatgat cgaccttctt tgccagacgc agaacctcaa cccggtggat 840gcctatatgc tctgctcggc ctgcggtgat ctgcgtatca gcgaaatcgt cgatcagccg 900aactgggtcg tatcgttcta cttcccgcgt tccgttttcg aataa 945<210>2<211>314<212>PRT<213>人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)NCIMB 40321<400>2Met Cys Asn Asn Cys His Tyr Thr Ile His Gly Arg His His His Phe1 5 10 15Gly Trp Asp Asn Ser Phe Gln Pro Ala Glu Thr Val Ala Pro Gly Ser20 25 30Thr Leu Lys Phe Glu Cys Leu Asp Ser Gly Ala Gly His Tyr His Arg35 40 45Gly Ser Thr Val Ala Asp Val Ser Thr Met Asp Phe Ser Lys Val Asn50 55 60Pro Val Thr Gly Pro Ile Phe Val Asp Gly Ala Lys Pro Gly Asp Val
65 70 75 80Leu Lys Ile Thr Ile His Gln Phe Glu Pro Ser Gly Phe Gly Trp Thr85 90 95Ala Asn Ile Pro Gly Phe Gly Leu Leu Ala Asp Asp Phe Lys Glu Pro100 105 110Ala Leu Ala Leu Trp Asn Tyr Asn Pro Thr Thr Leu Glu Pro Ala Leu115 120 125Phe Gly Glu Arg Ala Arg Val Pro Leu Lys Pro Phe Ala Gly Thr Ile130 135 140Gly Val Ala Pro Ala Glu Lys Gly Leu His Ser Val Val Pro Pro Arg145 150 155 160Arg Val Gly Gly Asn Leu Asp Ile Arg Asp Leu Ala Ala Gly Thr Thr165 170 175Leu Tyr Leu Pro Ile Glu Val Glu Gly Ala Leu Phe Ser Ile Gly Asp180 185 190Thr His Ala Ala Gln Gly Asp Gly Glu Val Cys Gly Thr Ala Ile Glu195 200 205Ser Ala Met Asn Val Ala Leu Thr Leu Asp Leu Ile Lys Asp Thr Pro210 215 220Leu Lys Met Pro Arg Phe Thr Thr Pro Gly Pro Val Thr Arg His Leu225 230 235 240Asp Thr Lys Gly Tyr Glu Val Thr Thr Gly Ile Gly Ser Asp Leu Trp245 250 255Glu Gly Ala Lys Ala Ala Leu Ser Asn Met Ile Asp Leu Leu Cys Gln260 265 270Thr Gln Asn Leu Asn Pro Val Asp Ala Tyr Met Leu Cys Ser Ala Cys275 280 285Gly Asp Leu Arg Ile Ser Glu Ile Val Asp Gln Pro Asn Trp Val Val290 295 300Ser Phe Tyr Phe Pro Arg Ser Val Phe Glu305 310
權利要求
1.編碼一種對映選擇性酰胺酶的核酸序列，所述酰胺酶的氨基酸序列與SEQ ID NO2具有至少70％的同一性。
2.編碼一種對映選擇性酰胺酶的核酸序列，所述核酸優(yōu)選能在中等嚴格條件下與(i)SEQ ID NO.1，(ii)包括SEQ ID NO.1的基因組DNA序列或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交。
3.編碼具有SEQ IDNO.2的氨基酸序列的對映選擇性酰胺酶的核酸序列，在所述氨基酸序列的大約15或更少的氨基酸位置上具有改變，其中，所述改變獨立地是(i)氨基酸的插入(ii)氨基酸的缺失(iii)氨基酸的取代。
4.編碼一種對映選擇性酰胺酶的核酸序列，所述對映選擇性酰胺酶表現(xiàn)出與抗SEQ ID NO2的氨基酸序列片段的抗體的免疫學交叉反應性。
5.編碼一種對映選擇性酰胺酶融合蛋白的核酸序列，它由可操作地與一種或多種編碼標記多肽的核酸序列連接的編碼權利要求1-4中任意一項的多肽的核酸序列組成。
6.包括權利要求1-5中任意一項的核酸序列的載體。
7.正常情況下不具有權利要求1-5中任意一項的核酸序列的宿主細胞，它包括權利要求1-5中任意一項的核酸序列，優(yōu)選包括權利要求6的載體。
8.用于制備權利要求1-5中任意一項的核酸序列的表達產物的方法，其中，在第一個步驟中，將所述核酸序列導入合適的宿主中，并且，其中，所述核酸序列隨后在所述宿主中表達。
9.包括分批和補料階段的用于在發(fā)酵培養(yǎng)基中對微生物進行發(fā)酵的方法，其中，所述微生物表達權利要求1-5中任意一項的核酸，并且，其中，在發(fā)酵期間向每升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5-50毫克的Zn2+。
10.用于制備對映體富集的羧酸和/或對映體富集的羧酸酰胺的方法，其中，在存在0.01mM-100mM Zn2+的條件下，讓相應的D-和L-羧酸酰胺的混合物與權利要求1-5中任意一項的表達產物接觸，以便所述羧酸酰胺的一種對映體被對映體選擇性地水解，從而形成相應的對映體富集的羧酸，而所述羧酸酰胺的另一種對映體保持不變。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼一種對映選擇性酰胺酶的核酸序列，該酰胺酶的氨基酸序列與SEQ ID NO.2具有至少70％的同一性，本發(fā)明還涉及一種包括包括分批和補料階段的用于在發(fā)酵培養(yǎng)基中對一種微生物進行發(fā)酵的方法，其中，所述微生物能表達本發(fā)明的核酸，并且，其中，在發(fā)酵期間，在每升發(fā)酵培養(yǎng)基中補充0.5－50毫克的Zn
文檔編號C12N1/21GK1555416SQ02818136
公開日2004年12月15日 申請日期2002年7月15日 優(yōu)先權日2001年7月23日
發(fā)明者T·?？? R·F·坦德勒, C·G·N·科雷瓦爾, F·B·J·阿塞馬范, R·珀范德, J 阿塞馬范, N 科雷瓦爾, T ?？? 兜, 坦德勒 申請人:Dsm Ip 財產有限公司