專利名稱：造血干細(xì)胞的制備方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及造血干細(xì)胞的制備方法及用于培養(yǎng)造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
生物體中成熟血細(xì)胞的壽命短，常常通過造血前體細(xì)胞的分化而供給成熟血細(xì)胞，以此來保證血液的穩(wěn)定性。造血前體細(xì)胞是通過未分化的造血干細(xì)胞進(jìn)行分化而生成的。造血干細(xì)胞具有分化成各種分化系列的能力(分化多能性)，經(jīng)過始終保持分化多能性進(jìn)行自身復(fù)制的生涯，供給造血細(xì)胞。總之，在進(jìn)行自身復(fù)制時產(chǎn)生具有分化多能性的干細(xì)胞，同時一部分經(jīng)過造血前體細(xì)胞分化成各種成熟的血液細(xì)胞。
象這種血細(xì)胞的分化可受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。已知，紅細(xì)胞生成素(EPO)促進(jìn)紅細(xì)胞系的細(xì)胞的分化，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞系的分化，血小板生成素(TPO)促進(jìn)巨核細(xì)胞和血小板產(chǎn)生細(xì)胞的分化。但是，造血干細(xì)胞在保持分化多能性進(jìn)行自身復(fù)制時，不知道哪種因子是必要的。作為造血干細(xì)胞的增殖因子已有SCF/MGF(Williams，D.E.，Cell，63167-174，1990；Zsebo，K.M.，Cell，63213-224，1990)和SCGF(WO98/08869)等幾個報道，但均無充分維持造血干細(xì)胞的分化多能性的作用。另外，試驗了通過聯(lián)合添加多種已知的細(xì)胞因子來培養(yǎng)造血干細(xì)胞(Miller CL，PNAS USA，9413648-13653，1997；Yagi M.，PNAS USA，968126-8131，1999；ShihC.C.Blood，945 1623-1636，1999)。
另一方面，提供適于造血細(xì)胞維持和增殖的環(huán)境，嘗試?yán)没|(zhì)細(xì)胞來維持造血干細(xì)胞，并使之增殖，而不發(fā)生分化(Moore K.A.，Blood，8912 4337-4347 1997；具有可移植的淋巴-骨髓重建能力的成年鼠造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，Cindy L.Miller和Connie J.Eaves，PNAS9413648-13653)。WO99/03980中公開了一株基質(zhì)細(xì)胞株，它是從小鼠胎兒的AGM(Aorta-Gonad-Mesonephros)區(qū)域建株的能支持造血干細(xì)胞和造血前體細(xì)胞增殖或生存。再者，Rappold I，Watt SM，KusadasiN，Rose-John S，Hatzfeld J，Ploemacher RE.Gp 130-信號協(xié)同F(xiàn)L和TPO進(jìn)行長時程核心血液前體細(xì)胞擴(kuò)增，Leukemia，1999 Dec；13(12)2036-48)描述了用SCF、FL、TPO、sIL-6R-IL-6融合蛋白質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞來進(jìn)行培養(yǎng)。
但，Rappold等的培養(yǎng)體系是培養(yǎng)造血前體細(xì)胞的培養(yǎng)體系，與培養(yǎng)造血干細(xì)胞的培養(yǎng)體系完全不同。另外有報道，Kusadasi N等，Leukemia.2000；111944-1953，在IL-6、Flt-3配體(FL)和TPO的培養(yǎng)體系中用FL+TPO代償基質(zhì)細(xì)胞的功能，基質(zhì)細(xì)胞根本沒有增強(qiáng)干細(xì)胞維持功能的作用。
發(fā)明概述發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在gp130刺激因子、細(xì)胞因子雞尾酒(cocktail)和基質(zhì)細(xì)胞的存在下培養(yǎng)造血干細(xì)胞，可使造血干細(xì)胞有效增殖，并支持其生存。
本發(fā)明的目的是提供造血干細(xì)胞的有效制備方法，造血干細(xì)胞的有效培養(yǎng)方法，以及在造血干細(xì)胞的培養(yǎng)中應(yīng)用的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的造血干細(xì)胞的制備方法包括在gp130刺激因子、一種或一種以上細(xì)胞因子和基質(zhì)細(xì)胞的存在下培養(yǎng)造血干細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明的造血干細(xì)胞的培養(yǎng)方法包括在gp130刺激因子、一種或一種以上細(xì)胞因子和基質(zhì)細(xì)胞的存在下培養(yǎng)造血干細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明的造血干細(xì)胞的培養(yǎng)中應(yīng)用的培養(yǎng)基包含gp130刺激因子、一種或一種以上細(xì)胞因子和基質(zhì)細(xì)胞。
末梢血干細(xì)胞移植和臍帶血干細(xì)胞移植等造血干細(xì)胞移植療法，若不能獲取足量的造血干細(xì)胞數(shù)，就不能實施移植。通過本發(fā)明可在試管內(nèi)有效擴(kuò)增造血干細(xì)胞，或可以穩(wěn)定維持。因此，即便在從患者得不到足量的造血干細(xì)胞時，也可培養(yǎng)必要量的造血干細(xì)胞，移植給患者。也就是說，本發(fā)明為血液細(xì)胞的移植療法及移植療法作為必要治療的實用化開辟了一條道路。
用本發(fā)明的培養(yǎng)體系擴(kuò)增的造血干細(xì)胞還可作為分化成血液以外的組織的細(xì)胞利用。因此，根據(jù)本發(fā)明所獲得的造血干細(xì)胞可用于肝功能不全、肌營養(yǎng)不良、心肌梗塞等造成的心肌壞死、糖尿病引起的血管壞死、或腸道細(xì)胞壞死治療中的正常細(xì)胞再生，和神經(jīng)細(xì)胞的再生治療。
附圖簡述

圖1表示通過移植了小鼠造血干細(xì)胞的個體末梢血中供體來源的血細(xì)胞嵌合性隨時間的變化顯示細(xì)胞因子雞尾酒對造血干細(xì)胞增殖的影響?！拜斎?input)”(□)表示采集小鼠造血干細(xì)胞后立即移植到放射線照射小鼠時的情況?！癝+IL6+IL11+FL”(黑四角)表示采集小鼠造血干細(xì)胞后，在SCF+IL-6+IL-11+FL細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)以后，移植到放射線照射小鼠時的情況?！癝CF+FP6+FL”(○)表示采集小鼠造血干細(xì)胞后，在SCF+FP6+FL細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)以后，移植到放射線照射小鼠時的情況。
圖2表示通過移植了小鼠造血干細(xì)胞的個體末梢血中供體來源的血細(xì)胞嵌合性隨時間的變化顯示細(xì)胞因子雞尾酒對造血干細(xì)胞增殖的影響?！拜斎?input)”(×)表示采集小鼠造血干細(xì)胞后立即移植到放射線照射小鼠時的情況?！耙后wSTF”(□)表示采集小鼠造血干細(xì)胞后，在SCF+FP6+TPO細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)以后，移植到放射線照射小鼠時的情況。“A9+STF”(黑四角和◆)表示采集小鼠造血干細(xì)胞后，在SCF+FP6+TPO細(xì)胞因子存在下與基質(zhì)細(xì)胞AGM-S3-A9共培養(yǎng)以后，移植到放射線照射小鼠時的情況。“A9+STF(20)”(黑四角)表示FP6的濃度為20ng/ml時的結(jié)果。“A9+STF(50)”(◆)表示FP6的濃度為50ng/ml時的結(jié)果。
圖3表示人間葉干細(xì)胞和細(xì)胞因子雞尾酒對造血干細(xì)胞增殖的影響。具體而言，該圖表示移植了小鼠造血干細(xì)胞的個體末梢血中供體來源的血細(xì)胞嵌合性隨時間的變化?！拜斎搿?×)表示采集小鼠造血干細(xì)胞后立即移植到放射線照射小鼠時的情況?！癕SC”(○)表示采集小鼠造血干細(xì)胞后，與人間葉干細(xì)胞共培養(yǎng)以后移植到放射線照射小鼠時的情況?！癕SC+STF”(△)表示采集小鼠造血干細(xì)胞后，在SCF+FP6+TPO細(xì)胞因子存在下與人間葉干細(xì)胞共培養(yǎng)以后移植到放射線照射小鼠時的情況。
圖4表示基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子雞尾酒對造血干細(xì)胞及造血干細(xì)胞前體細(xì)胞增殖的影響?！拜斎搿北硎静杉嗽煅杉?xì)胞后立即進(jìn)行集落分析?！癆”表示采集人造血干細(xì)胞后，在SCF+FP6+TPO+FL細(xì)胞因子存在下與基質(zhì)細(xì)胞AGM-S3-A9共培養(yǎng)以后進(jìn)行集落分析?！癇”表示采集人造血干細(xì)胞后，在SCF+FP6+TPO+FL細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)以后進(jìn)行集落分析。“BFU-E”紅細(xì)胞樣爆發(fā)形成單位(erythroid burst-forming unit)、“CFU-GM”粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位(granulocyte-macrophage colony-forming unit)、“CFU-Emix”紅細(xì)胞混合集落形成單位(erythrocyte mixed colony-formingunit)。
圖5表示基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子雞尾酒對造血干細(xì)胞及造血干細(xì)胞前體細(xì)胞增殖的影響。“輸入”表示采集人造血干細(xì)胞后立即進(jìn)行集落分析?！癆”表示表示采集人造血干細(xì)胞后，在SCF+FP6+TPO+FL細(xì)胞因子存在下與基質(zhì)細(xì)胞AGM-S3-A9共培養(yǎng)以后進(jìn)行集落分析?！癇”表示表示采集人造血干細(xì)胞后，在SCF+TPO+FL細(xì)胞因子存在下與基質(zhì)細(xì)胞AGM-S3-A9共培養(yǎng)以后進(jìn)行集落分析。“C”表示采集人造血干細(xì)胞后，在SCF+FP6+TPO+FL細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)以后進(jìn)行集落分析?！癉”表示采集人造血干細(xì)胞后，在SCF+TPO+FL細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)以后進(jìn)行集落分析?！癇FU-E”紅細(xì)胞樣爆發(fā)形成單位、“CFU-GM”粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位、“CFU-Emix”紅細(xì)胞混合集落形成單位。
圖6表示基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子雞尾酒對造血干細(xì)胞及造血干細(xì)胞前體細(xì)胞增殖的影響?！拜斎搿北硎静杉嗽煅杉?xì)胞后立即進(jìn)行集落分析?！癆”表示表示采集人造血干細(xì)胞后，在SCF+FP6+TPO+FL細(xì)胞因子存在下與基質(zhì)細(xì)胞AGM-S3-A9共培養(yǎng)以后進(jìn)行集落分析?！癇”表示表示采集人造血干細(xì)胞后，在SCF+TPO+FL細(xì)胞因子存在下與基質(zhì)細(xì)胞AGM-S3-A9共培養(yǎng)以后進(jìn)行集落分析?！癇FU-E”紅細(xì)胞樣爆發(fā)形成單位、“CFU-GM”粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位、“CFU-Emix”紅細(xì)胞混合集落形成單位。
發(fā)明詳述造血干細(xì)胞本發(fā)明中的“造血干細(xì)胞”是指具有分化成血細(xì)胞中所有分化系列(lineages)的能力(多分化能力)，且能在維持其多能分化性的同時進(jìn)行自身復(fù)制。
造血干細(xì)胞可從人和小鼠等哺乳動物的胎肝、骨髓、胎兒骨髓、末梢血、通過施用細(xì)胞因子和/或抗癌劑動員了干細(xì)胞的末梢血、以及臍帶血中獲得。
小鼠中通過移植實驗可區(qū)分造血干細(xì)胞和造血前體細(xì)胞。即，將試驗細(xì)胞移植到放射線照射小鼠后經(jīng)過3個月以上，若能在移植個體(接受者)中見到供體來源的骨髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞雙方分化系列的造血細(xì)胞，說明移植細(xì)胞團(tuán)中存在具有多能分化性，在接受者個體中可自身復(fù)制的造血干細(xì)胞。
紅細(xì)胞前體細(xì)胞在試管內(nèi)的培養(yǎng)環(huán)境中難以維持?jǐn)U增，迅速消失。確定維持、使紅細(xì)胞前體細(xì)胞增殖時，因為可維持、使未分化的造血干細(xì)胞或造血前體細(xì)胞增殖，所以能繼續(xù)產(chǎn)生紅細(xì)胞前體細(xì)胞。因此，人造血干細(xì)胞的評價體系，可以是維持紅細(xì)胞前體細(xì)胞(BFU-E)或可分化成粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞兩個細(xì)胞系列的前體細(xì)胞(CFU-GM)，使之增殖為指標(biāo)，確認(rèn)造血干細(xì)胞或未分化的造血前體細(xì)胞的增殖?；蛘?，給免疫功能不全的小鼠NOD/SCID小鼠移植人造血細(xì)胞，根據(jù)移植后人造血細(xì)胞的存在率來確認(rèn)移植細(xì)胞團(tuán)中是否存在造血干細(xì)胞或造血前體細(xì)胞。
gp130刺激因子本發(fā)明中的“gp130刺激因子”是指借助gp130的信號傳導(dǎo)分子，象IL-6和IL-6受體(以下叫做IL-6R)α鏈的復(fù)合體那樣，通過與gp130結(jié)合而活化gp130，然后活化JAK激酶，使STAT3磷酸化，通過STAT3而促進(jìn)JunB、JAB、SAA3、C-反應(yīng)性蛋白等基因的轉(zhuǎn)錄，結(jié)果調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等。向原本不表達(dá)人gp130的小鼠IL-3依賴株Ba/F3細(xì)胞中轉(zhuǎn)化表達(dá)編碼人gp130基因，因為轉(zhuǎn)化細(xì)胞可通過gp130信號進(jìn)行增殖，所以可通過檢測該轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖來評價gp130刺激因子的存在否。轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖的測定可通過細(xì)胞攝取同位素標(biāo)記的核酸，評價線粒體活性，直接計算細(xì)胞數(shù)等進(jìn)行。例如，按照特開2001-8690號公報的實施例5中記載的方法進(jìn)行。另外，由于如上所述gp130刺激可活化細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子STAT3，所以可通過檢測上述Ba/F3細(xì)胞的STAT3的活化來評價是不是gp130刺激因子。STAT3的活化可通過檢測細(xì)胞內(nèi)STAT3磷酸化進(jìn)行，或者，針對STAT3促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基因群，通過Northern分析、定量RT-PCR法檢測其轉(zhuǎn)錄促進(jìn)作用。
gp130刺激因子包括IL-6或其突變體與IL-6R或其突變體的融合蛋白，IL-6R(優(yōu)選可溶性IL-6R(sIL-6R))或其突變體與IL-6或其突變體的聯(lián)合(特表平10-509040號)、對gp130有拮抗作用的抗gp130抗體(Gu ZJ，Vos JD，Rebouissou C，Jourdan M，ZhangXG，Rossi JF，Wijdenes J，Klein B.，激動劑抗gp130傳導(dǎo)物(transducer)單克隆抗體是人骨髓瘤細(xì)胞存活和生長因子，Leukemia，2000 Jan；14(1)188-97)、白細(xì)胞介素-11(IL-11)、白細(xì)胞游走抑制因子(LIF)、制瘤素M和心營養(yǎng)蛋白(cardiotropin)。
本發(fā)明中的“IL-6”是指由4個螺旋構(gòu)成的全長212個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(Hirano等，Nature，324，731(1986))。本發(fā)明中的“IL-6突變體”是指有一個或一個以上選自替換、缺失、插入及添加的改變，且具有g(shù)p130刺激活性的IL-6突變體。已知IL-6即便缺失N端信號肽第28位的丙氨酸殘基也可維持gp130刺激活性(WO00/01731)。另外，已知即便IL-6第37位賴氨酸殘基C端側(cè)接受蛋白酶消化，以及從第28位的丙氨酸到第37位的賴氨酸殘基為止的10個氨基酸殘基缺失，對IL-6的活性也不造成障礙(WO00/01731)。因此，本發(fā)明中將N端缺失，且具有g(shù)p130刺激活性的改變了的IL-6作為IL-6突變體應(yīng)用。所講IL-6突變體包括到第28位為止的N末端序列缺失的IL-6，第37位為止的N末端序列缺失的IL-6。
本發(fā)明中的“IL-6R”是指由信號區(qū)域、細(xì)胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域及細(xì)胞內(nèi)區(qū)域構(gòu)成的全長468個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(Yamasaki等，Science，241，p825(1988))。本發(fā)明中的“IL-6R突變體”是指具有一個或一個以上選自替換、缺失、插入及添加的改變，且具有g(shù)p130刺激活性的IL-6R突變體。已知IL-6R細(xì)胞外區(qū)域中存在的細(xì)胞因子受體區(qū)域(從第112位纈氨酸殘基附近到第323位丙氨酸殘基附近的區(qū)域)是與IL-6結(jié)合十分必要的區(qū)域(Yawata等，EMBO J.12，p1705(1993))。因此，本發(fā)明中應(yīng)用包含IL-6R第112個纈氨酸殘基附近到第333位丙氨酸殘基附近區(qū)域的IL-6R作為IL-6R突變體。
融合蛋白質(zhì)是IL-6或其突變體與IL-6R或其突變體直接或通過連接體連接成的蛋白質(zhì)。例如，按照WO00/01731、WO99/02552、特表2000-506014號或Fisher等，Nature，Biotech.，15，p142(1997)中記載的方法制備融合蛋白。
融合蛋白質(zhì)可以是IL-6R第112位纈氨酸殘基到第333位丙氨酸殘基片段的C末端與IL-6的第38位天冬氨酸到第212位甲硫氨酸為止的片段N末端直接連接而成的蛋白質(zhì)(FP6)。該情況下，將連接了編碼融合蛋白質(zhì)DNA序列的在宿主中可表達(dá)載體導(dǎo)入適宜的宿主中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主，從培養(yǎng)物中收集FP6，由此來制備FP6(參照WO00/01731)。
細(xì)胞因子本發(fā)明中所使用的“細(xì)胞因子”可使造血干細(xì)胞增殖，維持造血干細(xì)胞。
所講細(xì)胞因子包括血小板生成素(TPO)及其突變體和它們的衍生物、c-mp1配體(除外TPO)及其突變體、干細(xì)胞因子(SCF)、F1t-3配體(FL)、IL-3(白細(xì)胞介素3)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、MIP-1α(Davatelis，G.，J.Exp.Med.1671939，1988)樣增殖因子；紅細(xì)胞生成素(EPO)之類的造血激素；趨化因子、Wnt基因產(chǎn)物、notch配體之類的分化增殖調(diào)節(jié)因子；發(fā)育調(diào)節(jié)因子；及這些因子的組合。
本發(fā)明中的“血小板生成素(TPO)”是具有特異性刺激或增強(qiáng)血小板產(chǎn)生活性的蛋白質(zhì)，全長由332個氨基酸殘基構(gòu)成(WO95/21919)。另外，本發(fā)明中的“TPO突變體”是指具有一個或一個以上選自替換、缺失、插入及添加的改變，且能特異性刺激或增強(qiáng)血小板產(chǎn)生的TPO突變體。TPO突變體包括，例如WO95/18858、日本專利第2991640號、日本專利第2991630號、及日本專利第2996729號中記載的突變體，優(yōu)選由1-163位氨基酸殘基構(gòu)成的TPO突變體。
本發(fā)明中的“TPO及其突變體的衍生物”是指連接了水溶性聚合物的TPO及其突變體。水溶性聚合物包括聚乙二醇，優(yōu)選平均分子量約5kDa-50kDa的聚乙二醇?？砂凑毡娝苤姆椒▽嵤㏕PO及其突變體的聚乙二醇化(PEG化)(例如，參照Focus on Growth Factors3(2)4-10(1992))。水溶性聚合物與c-mp1配體蛋白質(zhì)的摩爾比可為1∶1-100∶1，多PEG化時摩爾比為1∶1-20∶1，單PEG化時摩爾比為1∶1-5∶1。
本發(fā)明中的“c-mp1配體”是指可與c-mp1受體結(jié)合的肽性配體，蛋白質(zhì)性配體，及非肽性配體。蛋白質(zhì)性c-mp1配體(TPO除外)包括作為巨核細(xì)胞刺激劑的激動性抗體(WO99/03495、WO99/10494)和造血受體激動劑等其他蛋白質(zhì)(WO96/23888、WO97/12978、WO97/12985、WO98/17810、WO96/34016、WO00/24770)。肽性c-mp1配體包括WO96/40189、WO96/40750、WO98/25965、特開平10-72492、WO99/42127、WO00/24770中記載的配體。非肽性c-mp1配體包括苯二氮雜卓衍生物(特開平11-1477號，特開平11-152276號)和其它低分子配體(WO99/11262、WO99/22733、WO99/22734、WO00/35446、WO00/28987)。
本發(fā)明中優(yōu)選的細(xì)胞因子包括干細(xì)胞因子(SCF)，血小板生成素(TPO)及其突變體以及它們的衍生物，F(xiàn)lt-3配體(FL)，或其組合。
本發(fā)明中優(yōu)選的細(xì)胞因子至少包括血小板生成素(TPO)或其突變體或它們的衍生物。
基質(zhì)細(xì)胞本發(fā)明中的“基質(zhì)細(xì)胞”是指可在體外提供與生物體內(nèi)造血環(huán)境等同的或類似的造血環(huán)境的細(xì)胞，只要是能在試管內(nèi)與造血細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞即可，不管其來源。
基質(zhì)細(xì)胞的例子有AGM(Aorta-Gonad-Mesonephros)區(qū)域來源的細(xì)胞、骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞、間葉干細(xì)胞(mesenchymal stem cell)、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎肝來源的細(xì)胞及前脂肪細(xì)胞。優(yōu)選AGM區(qū)域來源的細(xì)胞、骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞、間葉干細(xì)胞，特別優(yōu)選AGM區(qū)域來源的細(xì)胞和間葉干細(xì)胞。
可人為地在調(diào)節(jié)表達(dá)的啟動子下游插入自殺基因，將這樣的重組載體導(dǎo)入基質(zhì)細(xì)胞，與造血干細(xì)胞培養(yǎng)后，只使基質(zhì)細(xì)胞死亡，從而可除去移植時的基質(zhì)細(xì)胞。如下進(jìn)行自殺基因的導(dǎo)入及表達(dá)。即，根據(jù)自殺基因表達(dá)的手段，更具體地講，通過白喉毒素的利用(Lidor YJ，Lee WE，Nilson JH，Maxwell IH，Su LJ，Brand E，Globe LM，白喉毒素A鏈基因在人絨毛膜促性腺激素基因啟動子控制下的體外表達(dá)，作為向卵巢癌細(xì)胞系導(dǎo)入毒性的手段，Am J Obstet Gynecol.1997Sep；177(3)579-85)、皰疹病毒胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(HStk)的利用(Link CJ，Seregina T，Traynor A，Burt RK.，惡性疾病的細(xì)胞自殺療法，Oncologist.2000；5(1)68-74.)、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，可使自殺基因表達(dá)。凋亡相關(guān)基因可利用具有死亡功能區(qū)的受體基因，如Fas(Ioth N，Cell，66233-243，1991)、II型TNFR(Loetscher H.，Cell61(2))、死亡受體3(Kitoson J.，Nature，384372-375，1996)、死亡受體4(Pan G.，Science，276111-113，1997)，上述受體的信號傳導(dǎo)分子Flice，屬于信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)分解酶ICE(IL-1 b convertingenzyme)(Cerretti D.P.，Science 25697-100，1992)和Caspase家族(PatelT，F(xiàn)ASEB.J.，10587-597，1996)，如CPP32(Fernandes-Alnemri T，JBC，26930761-30764，1994)等。可利用應(yīng)用四環(huán)素的表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)(Manferd G.，PNAS USA，895547-5551，1992)來人為調(diào)控這些基因的表達(dá)。將這些基因?qū)牖|(zhì)細(xì)胞株時，除宿主中應(yīng)用基質(zhì)細(xì)胞株以外，通常應(yīng)用將基因?qū)雱游锛?xì)胞的方法，例如應(yīng)用莫洛尼鼠白血病病毒等逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)的載體(Kotin，R.M.Hum Gene Ther 5，793(1994))、單純皰疹病毒載體等病毒來源的動物細(xì)胞用載體的方法，磷酸鈣共沉淀法，DEAE-葡聚糖法，電穿孔法，脂質(zhì)體法，脂染(lipofection)法，顯微注射法等。將自殺相關(guān)基因?qū)牖|(zhì)細(xì)胞時，加入該基因的耐藥基因等標(biāo)志基因和導(dǎo)入了目的基因的基質(zhì)細(xì)胞株的選擇很容易。
培養(yǎng)本發(fā)明提供擴(kuò)增造血干細(xì)胞的培養(yǎng)體系。通過利用該培養(yǎng)體系可有效維持造血干細(xì)胞的增殖、生存。
本發(fā)明的培養(yǎng)體系，包含造血干細(xì)胞，還可包含其它的造血細(xì)胞。還可以是包含造血干細(xì)胞的級分。即，用特異識別造血干細(xì)胞的抗體從臍帶血、末梢血、骨髓等包含造血干細(xì)胞的組織中分離出造血干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。特異性除去紅細(xì)胞等各種細(xì)胞的方法可通過目前的血細(xì)胞分級的方法進(jìn)行。也可不分級進(jìn)行培養(yǎng)。
培養(yǎng)造血干細(xì)胞，可應(yīng)用培養(yǎng)用的平皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)袋進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成、pH等可機(jī)械控制，通過高密度培養(yǎng)的生物反應(yīng)物，可改善其培養(yǎng)體系(Schwartz，PNAS USA，886760，1991；Koller，M.R.，Bio/Technology，11358，1993；Koller，M.R.，Blood，82378，1993；Palsson，B.O.，Bio/Technology，11368，1993)。
基質(zhì)細(xì)胞與造血細(xì)胞的共培養(yǎng)，可在采集骨髓以后直接進(jìn)行培養(yǎng)。另外，可在采集骨髓后分離基質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞、其它細(xì)胞群等，與所采骨髓者之外的基質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞組合進(jìn)行共培養(yǎng)。另外，在只培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞使之增殖后，可添加細(xì)胞因子雞尾酒和造血細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞時，為了進(jìn)行更有效地使之增殖、生存，可在培養(yǎng)體系中添加細(xì)胞刺激因子。所講細(xì)胞刺激因子包括血小板生成素(TPO)及其突變體及其衍生物、c-mp1配體(TPO除外)及其衍生物、干細(xì)胞因子(SCF)、Flt-3配體(FL)、白細(xì)胞介素3(IL-3)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、MIP-1α(Davatelis，G.，J.Exp.Med.1671939，1988)等細(xì)胞因子所代表的增殖因子；紅細(xì)胞生成素(EPO)之類的造血激素；趨化因子、Wnt基因產(chǎn)物、notch配體之類的分化增殖調(diào)節(jié)因子；發(fā)育調(diào)節(jié)因子等。這些細(xì)胞因子也可由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。若是與細(xì)胞因子同樣借助細(xì)胞因子受體而傳遞信號的物質(zhì)，可與細(xì)胞因子同樣使用。
對用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基無特殊限制，只要對造血干細(xì)胞的增殖和生存無害即可，例如優(yōu)選MEM-α培養(yǎng)基(GIBCO BRL)、SF-02培養(yǎng)基(三光純藥)、Opti-MEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)、IMDM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)、PRMI1640培養(yǎng)基(GIBCO BRL)。通常培養(yǎng)溫度為25-39℃，優(yōu)選33-39℃。另外，培養(yǎng)基中添加的物質(zhì)包括胎牛血清、人血清、馬血清、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、乙醇胺、亞硒酸鈉、單硫甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種氨基酸等。通常CO2為4-6％，優(yōu)選5％。
由于造血干細(xì)胞能分化成造血系統(tǒng)的所有分化系列，所以可在試管內(nèi)擴(kuò)增造血干細(xì)胞后使之分化成各種細(xì)胞種類，進(jìn)行移植。例如，如果紅細(xì)胞必需的話，在擴(kuò)增培養(yǎng)患者的干細(xì)胞后，利用EPO等促進(jìn)紅細(xì)胞分化誘導(dǎo)的因子，人為產(chǎn)生以紅細(xì)胞為主要成分的造血細(xì)胞。
本發(fā)明的方法中包括培養(yǎng)造血干細(xì)胞后，從培養(yǎng)物中收集造血干細(xì)胞的步驟。
按本發(fā)明的方法培養(yǎng)的造血干細(xì)胞，利用單獨的EDTA、包含EDTA的胰蛋白酶等作為細(xì)胞分離溶液使用的物質(zhì)，從培養(yǎng)器皿中剝離，成為可用于人體的細(xì)胞懸液。
按本發(fā)明的方法培養(yǎng)的造血干細(xì)胞，可將造血干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞分離移入患者。還可將基質(zhì)細(xì)胞與造血干細(xì)胞同時移植。
按照本發(fā)明，制備方法中優(yōu)選的制備方法包括在白細(xì)胞介素6(IL-6)和IL-6受體的α鏈(IL-6R)形成的融合蛋白、血小板生成素(TPO)、選自AGM區(qū)域來源的細(xì)胞、骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞和間葉干細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞、根據(jù)情況選擇的干細(xì)胞因子(SCF)和Flt-3配體(FL)存在下，培養(yǎng)造血干細(xì)胞的步驟。
按本發(fā)明，培養(yǎng)基中優(yōu)選的培養(yǎng)基包括包含白細(xì)胞介素6(IL-6)和IL-6受體的α鏈(IL-6R)形成的融合蛋白、血小板生成素(TPO)、AGM區(qū)域來源的細(xì)胞、骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞、從間葉干細(xì)胞篩選的基質(zhì)細(xì)胞、根據(jù)情況包含干細(xì)胞因子(SCF)和Flt-3配體(FL)的培養(yǎng)基。
造血干細(xì)胞的用途應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的造血干細(xì)胞，可取代以往的骨髓移植和臍帶血移植，作為血細(xì)胞移植用的移植物應(yīng)用。由于可半永久性移入移植物，所以造血干細(xì)胞的移植可改善以往的血細(xì)胞移植治療。
造血干細(xì)胞的移植在對白血病進(jìn)行全身性X線放射療法和高劑量化學(xué)療法時施用。例如，對實體癌患者實施化療、放療等有骨髓抑制副作用的治療時，在術(shù)前采骨髓，在試管內(nèi)擴(kuò)增造血干細(xì)胞，術(shù)后返回到患者，可早日恢復(fù)因副作用而造成的造血系的障礙，如同進(jìn)行更強(qiáng)力的化療那樣可改善化療的治療效果。另外，根據(jù)本發(fā)明所得造血干細(xì)胞能分化成各種血細(xì)胞，通過將之移入患者體內(nèi)，少量形成各種血細(xì)胞，可試圖改善呈現(xiàn)不全狀況的患者。還可改善出現(xiàn)再生不良性貧血等貧血，因骨髓低形成而造成的造血不全癥。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行造血干細(xì)胞的移植所有效的疾患包括慢性肉芽腫、重復(fù)免疫功能不全綜合征、無γ球蛋白血癥、Wiskott-Aldrich綜合征、獲得性免疫功能不全綜合征(AIDS)等免疫不全綜合征、地中海貧血、酶缺損造成的溶血性貧血、鐮刀狀紅細(xì)胞癥等先天性貧血；Gaucher病、粘多糖癥等溶酶體蓄積癥、副腎白質(zhì)變性癥、各種癌或腫瘤等。
除所用細(xì)胞外，造血干細(xì)胞的移植與以往進(jìn)行的骨髓移植和臍帶血移植同樣。有可能可以用于上述造血干細(xì)胞移植的造血干細(xì)胞的來源不限于骨髓，可應(yīng)用前面所講胎肝、胎兒骨髓、末梢血、應(yīng)用細(xì)胞因子和/或抗癌劑動員了干細(xì)胞的末梢血和臍帶血等。
除了按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的造血干細(xì)胞以外，移植物中可包含緩沖液等。
按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的造血干細(xì)胞可用于離體的基因治療。針對造血干細(xì)胞進(jìn)行的基因治療很難，因為干細(xì)胞在靜止期的染色體的重組率低，培養(yǎng)中干細(xì)胞發(fā)生分化等。通過利用本發(fā)明，可擴(kuò)增干細(xì)胞而不分化，可大幅度改善基因?qū)肼省Ｋv基因治療是將外來基因(治療用基因)導(dǎo)入造血干細(xì)胞，應(yīng)用所得基因?qū)爰?xì)胞進(jìn)行。要導(dǎo)入的外來基因可根據(jù)病情適當(dāng)選擇。可作為以血細(xì)胞為靶細(xì)胞的基因治療對象的疾病包括慢性肉芽腫、重復(fù)免疫功能不全綜合征、無γ球蛋白血癥、Wiskott-Aldrich綜合征、獲得性免疫功能不全綜合征(AIDS)等免疫不全綜合征、地中海貧血、酶缺損造成的溶血性貧血、鐮刀狀紅細(xì)胞癥等先天性貧血；Gaucher病、粘多糖癥等溶酶體蓄積癥、副腎白質(zhì)變性癥、各種癌或腫瘤等。
向造血干細(xì)胞中導(dǎo)入治療用基因時，可應(yīng)用通常所用的用于動物細(xì)胞基因?qū)氲姆椒?，如?yīng)用莫洛尼鼠白血病病毒等逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)的載體、單純皰疹病毒載體、HIV載體和內(nèi)源性病毒載體RDI14(Kelly PF，Vandergriff J，Nathwani A，Nienhuis AW，Vanin EF，通過用貓內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(RDI14)包膜蛋白假型化的致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒將基因高效地轉(zhuǎn)移到臍血非肥胖糖尿病/嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷再增殖細(xì)胞中，Blood，2000Aug 15；96(4)1206-14)等病毒來源的用于基因治療的動物細(xì)胞用載體(所謂基因治療用載體，參照Verma，I.M.，Nature，389239，1997)的方法，磷酸鈣共沉淀法，DEAE-葡聚糖法，電穿孔法，脂質(zhì)體法，脂染法，顯微注射法等。從靶細(xì)胞的染色體DNA能穩(wěn)定持久表達(dá)整合的基因這一點考慮的話，優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體或HIV載體。
例如，腺病毒相關(guān)病毒(AAV)載體可如下制備。首先，將野生型腺病毒相關(guān)病毒DNA兩端的ITR(inverted terminal repeat)間插入了治療用基因的載體質(zhì)粒與表達(dá)病毒蛋白質(zhì)的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。接著感染輔助病毒的腺病毒，產(chǎn)生包含AAV載體的病毒顆粒。或者，轉(zhuǎn)染表達(dá)擔(dān)當(dāng)輔助功能的腺病毒基因的載體而非腺病毒。然后，用所得病毒顆粒感染造血干細(xì)胞。載體DNA中，優(yōu)選在目的基因的上游插入適當(dāng)?shù)膯幼?，下游插入適當(dāng)?shù)慕K止子，或在上游或下游適宜的位置插入增強(qiáng)子，由此，可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。為了防止沉默(サィレンシンゲ)，可在目的基因的上游或下游連接隔離子(ィンシュレ-タ-)。為了導(dǎo)入了治療用基因的細(xì)胞的篩選更容易，可與治療用基因連接耐藥性基因等標(biāo)志性基因。治療用基因可以是正義基因也可以是反義基因。
基因治療用組合物除包含按本發(fā)明的方法生產(chǎn)的造血干細(xì)胞以外，還可包含緩沖液和新型活性物質(zhì)等。
再者，按本發(fā)明的培養(yǎng)體系擴(kuò)增的造血干細(xì)胞可作為分化成血液之外組織的細(xì)胞使用。以往，人們認(rèn)為生物體中存在的各種組織的干細(xì)胞只具有該組織的干細(xì)胞的作用，但近年來顯示，也具有其它臟器干細(xì)胞的作用。造血干細(xì)胞或含有造血干細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)具有分化成肝臟細(xì)胞(Lagases E，Connors H，AI-Dhalimy M，Reitsma M，Dohes M，Osborne L，Wang X，F(xiàn)inegold M，Weissman IL，Grompe M.，純化的造血干細(xì)胞，體內(nèi)分化成肝細(xì)胞，Nat Med.2000 Nov；6(11)1229-34.；通過人LIN-，CD34+/-細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生人肝細(xì)胞，Esmail D.Zanjani，Christopher D.Porada，Kirsten B.Crapnell，Neil D.Theise，Dianne S.Kraus，F(xiàn).R.MacKintosh，Joao L.Ascensao，Graca Almeida-Porada.Department of Veterans Affairs Medical Center，Reno，NV，USA；University of Nevada School of Medicine，Reno，NV，USA；New YorkUniversity School of Medicine，New York，NY，USA；Yale University，New Haven，CT，USA.Blood 2000 96(11)；494a)、骨骼肌細(xì)胞(GussoniE，Soneoka Y，Strickland CD，Buzney EA，Khan MK，F(xiàn)lint AF，KunkelLM，Mulligen RC.，通過干細(xì)胞移植在mdx小鼠中恢復(fù)肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)，Nature.1999 Sep 23；401(6751)309-4)、心肌細(xì)胞(Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，Jakoniuk I，Anderson SM，Li B，Pickel J，McKayR，Nadal-Ginard B，Bodine DM，Leri A，Anversa P.，骨髓細(xì)胞再生受損的心肌，Nature.2001 Apr 5；410701-5)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腸粘膜細(xì)胞(Krause DS，Theise ND，Collector MI，Henegariu O，Hwang S，GardnerR，Neutzel S，Sharkis SJ，通過單一的骨髓來源的干細(xì)胞進(jìn)行多器官多系統(tǒng)移植，Cell.2001 May 4；105(3)369-77)等的能力。因此，按本發(fā)明的培養(yǎng)法制備的造血干細(xì)胞可用于治療從肝功能不全、肌營養(yǎng)不良、心肌梗塞造成的心肌壞死、糖尿病引起的血管壞死、或腸道膜細(xì)胞壞死到正常細(xì)胞再生的治療，按本發(fā)明的培養(yǎng)法制備的造血干細(xì)胞還可用于神經(jīng)細(xì)胞的再生治療。
實施例實施例1從小鼠骨髓制備造血干細(xì)胞采集C57BL/6-Ly5.1pep(8-10周齡，雄性)(筑波大學(xué)中內(nèi)啟光教授提供)大腿骨內(nèi)的骨髓，懸于PBS。按照常規(guī)方法(高津圣志，免疫研究的基本技術(shù)，羊土社，1995年)用比重離心法濃縮小鼠骨髓單核細(xì)胞，然后懸浮于染色緩沖液(含5％FCS、0.05％NaN3的PBS)中，按Osawa，M.等，Science 273242-245，1996，用以下方法獲得造血干細(xì)胞。
向骨髓單核細(xì)胞懸浮中添加FITC結(jié)合的CD34抗體、藻紅蛋白結(jié)合的Sca-1抗體、別藻藍(lán)素(allophycocyanin)c-Kit(均為Pharmingen公司產(chǎn)品)和以下6種生物素化的分化抗原特異的抗體CD45R、CD4、CD8、Gr-1、Ter119、CD11c(均為Pharmingen公司產(chǎn)品)，冰浴中放置20分鐘進(jìn)行反應(yīng)。用染色緩沖液洗滌2次后，用細(xì)胞分選儀cellsorter(FACSVantage，Becton Dickinson)分選出CD34陰性、且Sca-1陽性、別藻藍(lán)素c-Kit陽性且Lin陰性的細(xì)胞。
實施例2細(xì)胞因子雞尾酒與小鼠造血干細(xì)胞的液體培養(yǎng)將實施例1中制備的小鼠造血干細(xì)胞50個/孔接種到U底的96孔板中，進(jìn)行培養(yǎng)。向培養(yǎng)用的培養(yǎng)基S-clone SF03(三光純藥社)中添加0.1％BSA。分別添加50ng/ml的小鼠SCF(キリンビ-ル社)、人IL-6(キリンビ-ル社)、小鼠IL-11(R&D Systems)、Flt-3配體(R&D Systems)或小鼠SCF(キリン ビ-ル社)、FP6(東ソ-社)、Flt-3配體(R&D Systems)作為細(xì)胞因子雞尾酒，37℃、5％CO2下培養(yǎng)7天。培養(yǎng)7天后，為了調(diào)整造血干細(xì)胞/前體細(xì)胞擴(kuò)增比例，進(jìn)行實施例3中所示競爭性長期造血再構(gòu)建測定。
實施例3給放射線照射小鼠移植造血細(xì)胞將在實施例2及實施例3中培養(yǎng)的細(xì)胞與20萬個全骨髓細(xì)胞(來源于C57BL/6-Ly5.2小鼠，Charles River)一起經(jīng)尾靜脈照射移植給經(jīng)8.5Gy X射線照射的C57BL/6-Ly5.2小鼠(Charles River，8周齡，雄性)，各5只。移植后，按時間段從小鼠眼部回收末梢血，經(jīng)FCAS計算C57BL/6-Ly5.1pep小鼠來源的細(xì)胞數(shù)的比例。按照常規(guī)方法(高津圣志免疫研究的基本技術(shù)，羊土社，1995年)進(jìn)行末梢血分析。向50μl末梢血中加入350μl蒸餾水，放置30秒鐘，使紅細(xì)胞溶血后，加入2倍濃度的PBS離心，回收白細(xì)胞。用染色緩沖液(含5％FCS、0.05％NaN3的PBS)洗滌1次后，添加抗CD16抗體、FITC結(jié)合的抗Ly5.1(CD45.1)抗體、藻紅蛋白結(jié)合的抗Gr-1和CD11c抗體，以及藻紅蛋白結(jié)合的CD90(Thy1)和CD45R(B220)抗體(均購自Pharmingen公司)，冰浴中放置30分鐘進(jìn)行反應(yīng)。接著，用染色緩沖液洗滌后，進(jìn)行FACS分析。分別計算移植后隨時間變化末梢血中Gr-1或CD11c陽性細(xì)胞中(髓系)Ly5.1陽性的比例，和CD90或CD45R陽性細(xì)胞中(淋巴系)Ly5.1陽性的比例，由此來推定造血干細(xì)胞培養(yǎng)期間可進(jìn)行再構(gòu)建細(xì)胞數(shù)的增減。
與圖1所示，添加細(xì)胞因子進(jìn)行培養(yǎng)時，移植后2周顯示高嵌合性的具有短期骨髓再構(gòu)建能力的造血前體細(xì)胞顯著性增加。但是，細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)的細(xì)胞的嵌合性1個月以后急速下降，比未培養(yǎng)移植的干細(xì)胞的嵌合性還低，這說明培養(yǎng)期間造血干細(xì)胞具有造血干細(xì)胞的分化性質(zhì)，丟失了其長期再構(gòu)建能力。另一方面，SCF+FP6+FL細(xì)胞因子聯(lián)合與SCF+IL-6+IL-11+FL細(xì)胞因子聯(lián)合相比，前者能長期保持穩(wěn)定的嵌合性。該結(jié)果表明，應(yīng)用FP6的培養(yǎng)體系中可同樣進(jìn)行與添加傳遞gp130受體信號的IL-6、IL-11時不同的造血細(xì)胞的擴(kuò)增。前者中，即便在移植3個月后也可觀察到高于后者的嵌合性，這提示加入FP6的細(xì)胞因子聯(lián)合更能擴(kuò)增未分化的造血細(xì)胞。
實施例4小鼠基質(zhì)細(xì)胞AGM-S3-A9與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)按WO99/03980或特開2001-37471制備基質(zhì)細(xì)胞AGM-S3，對所得AGM-S3進(jìn)行亞克隆，得到對人臍帶血來源的造血干細(xì)胞支持活性高的亞克隆，即獲得擴(kuò)增或維持BFU-E活性高的亞克隆AGM-S3-A9。將AGM-S3-A9細(xì)胞(在含10％FCS的MEMα培養(yǎng)基中培養(yǎng))接種到24孔培養(yǎng)皿中，1×105個/孔，培養(yǎng)1天，使細(xì)胞增殖到覆蓋培養(yǎng)皿的底面。其后，換成含SCF(キリンビ-ル社)、TPO(キリンビ-ル社)(各20ng/ml)、FP6(東ソ-社)(各20ng/ml或50ng/ml)的1ml新鮮培養(yǎng)基(含10％FCS的MEMα培養(yǎng)基)，將100個實施例1中獲得的小鼠造血干細(xì)胞(來源于小鼠C57BL/6-Ly5.1)鋪到這些細(xì)胞上，開始培養(yǎng)。培養(yǎng)第7天用胰蛋白酶處理(含0.05％胰蛋白酶、0.5mM EDTA的PBS，37℃放置2-5分鐘)細(xì)胞，回收包含培養(yǎng)皿中基質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞，每2份培養(yǎng)體系作為1份移植給1只小鼠。回收按實施例2的方法同時制備的僅細(xì)胞因子雞尾酒(各細(xì)胞因子的濃度為20ng/ml)的培養(yǎng)體系(含10％FCS的MEMα培養(yǎng)基)作為對照。應(yīng)用回收的細(xì)胞，按實施例3所示的方法分析造血干細(xì)胞或造血前體細(xì)胞的增殖狀況(圖2)。
僅SCF+TPO+FP6的液體培養(yǎng)時，與實施例3同樣，移植后2周可看到高嵌合性，但移植后2個月嵌合性減少。另一方面，基質(zhì)細(xì)胞AGM-S3-A9與SCF+TPO+FP6共培養(yǎng)時，移植后2周可看到高與僅細(xì)胞因子的培養(yǎng)條件同樣高的嵌合性，但即便移植后2個月還可維持超過輸入的嵌合性。遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過輸入嵌合性的嵌合性上升提示，基質(zhì)細(xì)胞AGM-S3-A9與SCF+TPO+FP6共培養(yǎng)結(jié)束時存在的造血干細(xì)胞比開始時的多，這提示造血干細(xì)胞在該培養(yǎng)體系下進(jìn)行自身復(fù)制，發(fā)生了增殖。該結(jié)果提示，AGM-S3-A9基質(zhì)細(xì)胞與SCF+TPO+FP6的存在下培養(yǎng)造血干細(xì)胞，不僅可擴(kuò)增造血前體細(xì)胞而且可擴(kuò)增造血干細(xì)胞。
實施例5人間葉干細(xì)胞(hMSC)與造血干細(xì)胞其培養(yǎng)將人間葉干細(xì)胞(hMSC)(CAMBREX，cat.#PT-2501Lot#0F0558專用培養(yǎng)基；hMSC BulletKit中培養(yǎng))接種到24孔培養(yǎng)皿中，1×105個/孔，培養(yǎng)1天，使細(xì)胞增殖到覆蓋培養(yǎng)皿的底面。其后，換成含SCF(キリンビ-ル社)、TPO(キリンビ-ル社)、FP6(東ソ-社)(各20ng/ml)的1ml新鮮培養(yǎng)基(含10％FCS的MEMα培養(yǎng)基)，將50個實施例1中獲得的小鼠造血干細(xì)胞(來源于小鼠C57BL/6-Ly5.1)鋪到這些細(xì)胞上，開始培養(yǎng)。培養(yǎng)第7天用胰蛋白酶處理(含0.05％胰蛋白酶、0.5mM EDTA的PBS，37℃放置2-5分鐘)細(xì)胞，回收包含培養(yǎng)皿中基質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞，每2份培養(yǎng)體系作為1份移植給1只小鼠。準(zhǔn)備未添加細(xì)胞因子雞尾酒的與hMSC共培養(yǎng)的培養(yǎng)體系，同時回收作為對照。應(yīng)用回收的細(xì)胞，按實施例3所示的方法分析造血干細(xì)胞的增殖狀況(圖3)。
僅與hMSC共培養(yǎng)時未觀察到嵌合性上升，培養(yǎng)過程中造血前體細(xì)胞、造血干細(xì)胞均丟失。另一方面，SCF+TPO+FP6細(xì)胞因子存在下與hMSC共培養(yǎng)造血干細(xì)胞時，移植后2周可看到高嵌合性，同時移植后經(jīng)過2個月還可維持超過輸入的嵌合性。遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過輸入嵌合性的嵌合性上升提示，hMSC細(xì)胞與SCF+TPO+FP6共培養(yǎng)結(jié)束時存在的造血干細(xì)胞比開始時的多，這提示造血干細(xì)胞在該培養(yǎng)體系下進(jìn)行自身復(fù)制，發(fā)生了增殖。該結(jié)果提示，hMSC細(xì)胞與SCF+TPO+FP6的存在下培養(yǎng)造血干細(xì)胞，不僅可擴(kuò)增造血前體細(xì)胞而且可擴(kuò)增造血干細(xì)胞。
實施例6人造血干細(xì)胞及造血前體細(xì)胞支持活性的評價
(1)人臍帶血CD34陽性干細(xì)胞的分離按照キリンビ-ル醫(yī)藥探索研究所研究倫理委員會的標(biāo)準(zhǔn)，正常分娩時收集人臍帶血。用添加了肝素(Novo Nordisk公司)的注射器采集，以防止血液凝固。將肝素處理的臍帶血重懸到Ficoll-paque(Pharmacia)上，通過比重離心(400G，室溫，30分鐘)分離單核細(xì)胞。用紅細(xì)胞溶血劑(PharmLyseTM，Pharmacia)處理混入單核細(xì)胞中的紅細(xì)胞，室溫5分鐘，使之溶血。用含1mM EDTA的PBS溶液洗滌單核細(xì)胞，然后添加結(jié)合CD34抗體的磁株(Direct CD34isolation kit，Miltenyi Biotec)，冰浴下放置30分鐘。洗滌細(xì)胞后，用磁柱(MidiMACS，Miltenyi Biotec)分離表達(dá)CD34的細(xì)胞。該細(xì)胞團(tuán)作為來源于人臍帶血的造血干細(xì)胞。
(2)人造血干細(xì)胞與AGM-S3亞克隆(AGM-S3-A9)的共培養(yǎng)將上述A9細(xì)胞以2×105個/孔接種到6孔培養(yǎng)皿(Faleon)中，用1ml含10％FCS的MEMα培養(yǎng)基培養(yǎng)，使細(xì)胞增殖到覆蓋培養(yǎng)皿的底面。將來源于人臍帶血的CD34陽性造血干細(xì)胞10000個/孔鋪到基質(zhì)細(xì)胞上，向4ml含10％FCS的MEMα培養(yǎng)基中添加含人FP620ng/ml、SCF 20ng/ml、人TPO(キリンビ-ル社)20ng/ml、和人FL100ng/ml(R&D Systems，目錄號308-FK)的細(xì)胞因子雞尾酒(SCF+FP6)，共培養(yǎng)。為了比較增殖活性，對照組不添加細(xì)胞因子只與A9共培養(yǎng)，或A9不存在下，向12孔中加入2ml含上述細(xì)胞因子雞尾酒的培養(yǎng)基培養(yǎng)。共培養(yǎng)開始1周后除去半量培養(yǎng)基，添加1ml新培養(yǎng)基。共培養(yǎng)2周用胰蛋白酶處理(含0.05％胰蛋白酶、0.5mMEDTA的PBS(GIBCO BRL)，37℃放置5-10分鐘)細(xì)胞，使基質(zhì)細(xì)胞與人血液細(xì)胞同時從培養(yǎng)皿上脫落下來，通過進(jìn)行集落測定來分析造血干細(xì)胞或造血前體細(xì)胞的增殖。
(3)通過集落測定評價造血干細(xì)胞和造血前體細(xì)胞的增殖狀況將上述共培養(yǎng)體系中增殖的細(xì)胞供給適當(dāng)稀釋的1ml甲基纖維素培養(yǎng)體系中，進(jìn)行4連解析。為了比較擴(kuò)增效果，以共培養(yǎng)前的CD34陽性細(xì)胞作為對照進(jìn)行同樣的集落測定。甲基纖維素培養(yǎng)體系是向含有0.89％甲基纖維素(信越化學(xué))的IMDM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)中加入10％胎牛血清(Hyclone)、2mM L-谷氨酰胺(GIBCO BRL)、1mM丙酮酸鈉(和光化學(xué))、0.5uM 2-巰基乙醇和抗生素(終濃度100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、250ng/ml兩性霉素B；Antibiotic-Antimycotic(X100)，liquid，GIBCO BRL)，向其中添加100ng/ml人SCF、人IL-6，10ng/ml人IL-3、人G-CSF、人TPO、41U/mlEPO(均為キリンビ-ル社)，在35mm培養(yǎng)皿(Nunc)中進(jìn)行培養(yǎng)。上面所用各種造血因子均為重組體，為純品。培養(yǎng)2周后，顯微鏡下觀察出現(xiàn)的集落，計算CFU-GM(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位)、BFU-E(紅細(xì)胞樣爆發(fā)形成單位)、CFU-Emix(紅細(xì)胞混合集落形成單位)數(shù)。
圖4表示CD34陽性造血干細(xì)胞與AGM-S3-A9基質(zhì)細(xì)胞存在下，或基質(zhì)細(xì)胞非存在下培養(yǎng)2周后檢測的造血干細(xì)胞或造血前體細(xì)胞的擴(kuò)增狀況的結(jié)果。與共培養(yǎng)前相比，AGM-S3-A9基質(zhì)細(xì)胞與細(xì)胞因子雞尾酒培養(yǎng)基可支持CFU-GM、BFU-E、CFU-Emix所有的分化系列細(xì)胞的增殖。與單獨應(yīng)用細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系相比，與只存在細(xì)胞因子雞尾酒的條件下相比，可確認(rèn)基質(zhì)細(xì)胞存在下所有集落的擴(kuò)增。特別是通常維持紅細(xì)胞系前體細(xì)胞的BFU-E、CFU-Emix很困難，但在細(xì)胞因子雞尾酒存在下，與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的體系比單獨應(yīng)用細(xì)胞因子的體系更易看到增殖。因此，對于人造血細(xì)胞而言，基質(zhì)細(xì)胞存在下添加包含sIL-6R-IL-6融合蛋白的細(xì)胞因子雞尾酒可促進(jìn)造血干細(xì)胞或造血前體細(xì)胞的擴(kuò)增。
(4)A9和細(xì)胞因子雞尾酒的造血干細(xì)胞支持活性中FP6的效果對本造血干細(xì)胞增殖培養(yǎng)體系中FP6的活性進(jìn)行評價。以CFU-GM、BFU-E、CFU-Emix為指標(biāo)，應(yīng)用上述(2)和(3)的評價體系對添加含F(xiàn)P6的細(xì)胞因子雞尾酒(SCF+TPO+FL+FP6)或不含F(xiàn)P6的細(xì)胞因子雞尾酒(SCF+TPO+FL)時的AGM-S3-A9共培養(yǎng)體系，或非共培養(yǎng)體系，進(jìn)行對CD34陽性人臍帶血來源的造血干細(xì)胞支持能力的比較。圖5顯示共培養(yǎng)2周的結(jié)果。無論應(yīng)用何種細(xì)胞因子雞尾酒的情況下，由于基質(zhì)細(xì)胞的存在，可擴(kuò)增所有的集落形成細(xì)胞。SCF+TPO+FL+FP6與SCF+TPO+FL的細(xì)胞因子組合應(yīng)用時，F(xiàn)P6存在時可看到更多的集落形成細(xì)胞的增加。
到目前為止，有在基質(zhì)細(xì)胞非存在下，向SCF+TPO+FL中添加sIL-6R-IL-6融合蛋白，或向SCF+TPO+FL中添加sIL-6R、IL-6進(jìn)行培養(yǎng)時，可有效擴(kuò)增SCID再構(gòu)建細(xì)胞的報道(Koller O，Aviram R，Chebath J，beh-Hur H，Nagler A，Shultz L，Revel M，Lapidot T.，sIL-6R-IL-6可溶性白細(xì)胞介素6(IL-6)受體/IL-6融合蛋白體外增強(qiáng)能夠再增殖嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺陷小鼠的人CD34(+)CD38(-/low)細(xì)胞的維持和增殖，Blood 1999 Aug 1943923-31；Ueda T，Tsuji K，Yoshino H，Ebihara Y，Yagasaki H，Hisakawa H，Mitsui T，Manabe A，Tanaka R，Kobayashi K，Ito M，Yasukawa K，Nakahata T.，通過干細(xì)胞因子、Flk2/Flt3配體、血栓形成素、IL-6、可溶性IL-6受體擴(kuò)增人NOD/SCID-再增殖細(xì)胞，J Clin Invest.2000 Apr；105(7)1013-21.)。本實施例中，將基質(zhì)細(xì)胞加入上述細(xì)胞因子的組合中，可看到超過細(xì)胞因子雞尾酒單獨時的集落形成細(xì)胞的擴(kuò)增。本實施例的結(jié)果顯示，與細(xì)胞因子雞尾酒單獨時相比，培養(yǎng)體系中存在基質(zhì)細(xì)胞時，集落形成細(xì)胞增加，提示人造血干細(xì)胞進(jìn)行了擴(kuò)增。
對本造血干細(xì)胞增殖培養(yǎng)體系中TPO的活性進(jìn)行檢測。以CFU-GM、BFU-E、CFU-Emix為指標(biāo)，應(yīng)用上述(2)和(3)的評價體系，對添加含TPO的細(xì)胞因子雞尾酒(SCF+TPO+FL+FP6)或不含TPO的細(xì)胞因子雞尾酒(SCF+FP6+FL)時的AGM-S3-A9共培養(yǎng)體系，進(jìn)行對CD34陽性人臍帶血來源的造血干細(xì)胞支持能力的比較。結(jié)果示于圖6。TPO存在時(SCF+TPO+FL+FP6)與TPO不存在時(SCF+FP6+FL)比較，可看到BFU-E 3.8倍、CFU-Emix 33倍擴(kuò)增效果的差別。該結(jié)果表明可選擇TPO作為所添加的細(xì)胞因子。另外，通過進(jìn)行這樣的檢測，可選擇適于本培養(yǎng)體系的細(xì)胞因子。
權(quán)利要求
1.一種制備造血干細(xì)胞的方法，它包括在gp130刺激因子、一種或一種以上細(xì)胞因子、以及基質(zhì)細(xì)胞的存在下培養(yǎng)造血干細(xì)胞的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中g(shù)p130刺激因子為白細(xì)胞介素-6(IL-6)或其突變體與IL-6受體α鏈(IL-6R)或其突變體的融合蛋白、IL-6R或其突變體與IL-6或其突變體的聯(lián)合、對gp130有激動作用的抗gp130抗體、白細(xì)胞介素-11(IL-11)、白細(xì)胞游走抑制因子(LIF)、制瘤素M或心營養(yǎng)蛋白。
3.權(quán)利要求1的方法，其中g(shù)p130刺激因子為IL-6或其突變體與IL-6R或其突變體的融合蛋白。
4.權(quán)利要求3的方法，其中融合蛋白為IL-6R的112-333位片段C末端與IL-6的38-212位片段N末端直接連接而成的蛋白質(zhì)(FP6)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞因子是使造血干細(xì)胞增殖和/或維持造血干細(xì)胞的因子。
6.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞因子為干細(xì)胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)或其突變體或它們的衍生物、Flt-3配體(FL)或這些因子的組合。
7.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞因子至少包含血小板生成素(TPO)或其突變體或它們的衍生物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)細(xì)胞為AGM區(qū)域來源的細(xì)胞、骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞、間葉干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎肝來源的細(xì)胞或前體脂肪細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1-8任一項中的方法，在進(jìn)行造血干細(xì)胞的培養(yǎng)步驟之前，還包括培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞的步驟。
10.一種培養(yǎng)造血干細(xì)胞的方法，它包括在gp130刺激因子、一種或一種以上細(xì)胞因子、以及基質(zhì)細(xì)胞的存在下培養(yǎng)造血干細(xì)胞的步驟。
11.一種制備造血干細(xì)胞的方法，它包括任選地在干細(xì)胞因子(SCF)、Flt-3配體(FL)的存在下，與白細(xì)胞介素-6(IL-6)與IL-6受體α鏈(IL-6R)的融合蛋白、血小板生成素(TPO)、以及選自AGM區(qū)域來源的細(xì)胞、骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞、間葉干細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞一起培養(yǎng)造血干細(xì)胞的步驟。
12.一種用于培養(yǎng)造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基，它包含gp130刺激因子、一種或一種以上細(xì)胞因子、以及基質(zhì)細(xì)胞。
13.一種用于培養(yǎng)造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基，它包含白細(xì)胞介素-6(IL-6)與IL-6受體α鏈(IL-6R)的融合蛋白、血小板生成素(TPO)、以及選自AGM區(qū)域來源的細(xì)胞、骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞、間葉干細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞，任選地包含干細(xì)胞因子(SCF)、Flt-3配體(FL)。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供有效的造血干細(xì)胞的制備方法。本發(fā)明的造血干細(xì)胞的制備方法包括在gp130刺激因子、一種或一種以上細(xì)胞因子和基質(zhì)細(xì)胞的存在下培養(yǎng)造血干細(xì)胞的步驟。
文檔編號C12N5/02GK1564864SQ0281984
公開日2005年1月12日 申請日期2002年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月7日
發(fā)明者西川光郎, 大澤匡毅, 石黑敬彥, 保川清 申請人:麒麟麥酒株式會社, 東曹株式會社