專利名稱：實現(xiàn)基因高表達的系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及利用基因工程技術(shù)通過將基因插入到宿主生物體內(nèi)表達基因的方法。本發(fā)明進一步涉及新的啟動子，含有該啟動子和靶基因的重組載體，含有該重組載體的轉(zhuǎn)化體，以及利用該轉(zhuǎn)化體制備有用基因產(chǎn)物或有用物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
當通過宿主生物體制備物質(zhì)，或者改變或分析宿主生物體的功能時，使用的是基因工程技術(shù)。它包括向宿主生物體引入同源或異源基因用于表達。然而，這種基因工程技術(shù)在穩(wěn)定性和高表達方面尚不充分，因而期望它能夠得到改善。
例如，當宿主生物體是酵母菌釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)時，常用使用2-μm DNA的YEP型載體。YEP載體允許引入大量的基因拷貝。不過，YEP載體在穩(wěn)定性方面不能夠說是充分的，因為引入的基因產(chǎn)物的酶活可能會由于，例如，細胞分裂期間載體的丟失而下降。為提高酶活，載體被設計成含有藥物抗性標記，并向培養(yǎng)基中添加藥物，或者當宿主菌株中已經(jīng)提供營養(yǎng)缺陷型標記時，載體被設計成含有營養(yǎng)缺陷型標記，并且通過進一步利用高度純化的基本培養(yǎng)基(YNB，Difco)作為培養(yǎng)基，可以施加選擇壓力。然而，所有這樣的情況都是不利的，因為培養(yǎng)基成本昂貴。
同時，就能夠?qū)⒒蛘系饺旧w內(nèi)的載體而言，利用同源重組的YIP型載體是已知的。取決于載體的設計，這種YIP載體允許轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定地存在于基因組中，但是一般而言，它不能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因的高表達。
鑒于上述原因，本領域期望通過將基因穩(wěn)定且低成本地引入或插入到宿主生物體中高度表達基因的方法。
此外，例如當靶基因在酵母細胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達時，需要在基因上游連接能夠在酵母內(nèi)表達的啟動子。就當前報道的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)啟動子而言，醇脫氫酶1(ADH1)基因啟動子和3-磷酸甘油酸激酶(PGK)基因啟動子已知表現(xiàn)出強表達水平。而且，通過同源重組的基因轉(zhuǎn)移導致基因的高穩(wěn)定性。因此，如果靶基因能夠在強啟動子指導下表達，它將能有效地產(chǎn)生物質(zhì)以及改變并分析功能。
不過，當基因通過同源重組被插入到酵母中時，利用的是上述YIP載體。在這種情況下，能夠預期的拷貝數(shù)僅為1或2。因此，期望開發(fā)即便是單拷貝也允許高度表達的啟動子。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供通過將靶基因穩(wěn)定地引入到宿主生物體內(nèi)高度表達靶基因的方法。此外，本發(fā)明的另一個目的是提供具有用于靶基因表達的強轉(zhuǎn)錄活性的啟動子，和含有該啟動子的重組載體，含有該重組載體的轉(zhuǎn)化體，以及利用轉(zhuǎn)化體制備靶基因的表達產(chǎn)物或者有用物質(zhì)的方法。
作為實現(xiàn)上述目的而進行的徹底研究的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，通過將待表達靶基因連接于酵母菌釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的丙酮酸脫羧酶1啟動子上，然后將該基因整合到宿主基因組中，靶基因能夠穩(wěn)定地且高度地表達。
此外，我們集中于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中產(chǎn)生極大量乙醇的事件。我們預期丙酮酸脫羧酶1基因在乙醇發(fā)酵途徑中高度表達，并分離了上述丙酮酸脫羧酶1(PDC1)基因的啟動子區(qū)。此外，我們將PDC1基因啟動子區(qū)連接到靶基因上，并將該基因插入到釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，從而得到了靶基因在該啟動子指導下高度表達的發(fā)現(xiàn)。基于上述發(fā)現(xiàn)，我們完成了本發(fā)明。
具體地，本發(fā)明涉及表達基因的方法，其包括在存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子，或者對宿主生物體生長或發(fā)酵非必需的基因的啟動子的控制下將靶基因插入到基因組中。啟動子可以是含有由存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子的核苷酸序列或者宿主生物體生長或發(fā)酵非必需基因的啟動子的核苷酸序列，通過缺失、替代或添加1到40個核苷酸所衍生的序列，并具有啟動子活性的DNA。而且啟動子可以是能夠在嚴謹條件下與包含如下序列的DNA雜交的，并具有啟動子活性的DNA，所述序列互補于全部或部分存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子的核苷酸序列，或者宿主生物體生長或發(fā)酵非必需基因的啟動子的核苷酸序列。
在本發(fā)明中，上述存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子包括，例如，丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子。生長非必需基因的啟動子包括，例如，編碼硫氧還蛋白的基因的啟動子。
在本發(fā)明中，宿主生物體可以是任何一種細菌、酵母、昆蟲、動物或植物。特別地，優(yōu)選屬于酵母屬(Saccharomyces)的酵母。這些宿主生物體還可以指任何個體生物(人除外)、組織和細胞。
此外，在本發(fā)明中，上述丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子是包含下列DNA(a)到(c)中任意一個的啟動子(a)包含SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的DNA；(b)包含由SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列，通過缺失、替代或添加1到40個核苷酸所衍生的核苷酸序列，并具有啟動子活性的DNA；和(c)能夠在嚴謹條件下與包含互補于全部或部分SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的序列的DNA雜交，并具有啟動子活性的DNA。
本發(fā)明還涉及含有上述啟動子的重組載體。優(yōu)選本發(fā)明的重組載體可操作地連接于靶基因。在這種情況下，重組載體可以是質(zhì)粒載體或病毒載體。另外，重組載體中的靶基因是，例如，選自編碼蛋白的核酸或其反義核酸、編碼反義RNA誘餌(RNA decoy)及核酶的核酸的核酸。
此外，本發(fā)明提供了可通過利用任何一種上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主而獲得的轉(zhuǎn)化體。此處所用的宿主可以是細菌、酵母、動物、昆蟲或植物。特別地，宿主優(yōu)選是屬于酵母屬(Saccharomyces)的酵母。這些宿主生物體還可以指任何個體生物(人除外)、組織和細胞。
此外，本發(fā)明提供了制備靶基因的表達產(chǎn)物或者由該表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)任何一種上述轉(zhuǎn)化體，并從獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物中回收靶基因的表達產(chǎn)物或者由該表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)。
本發(fā)明詳細說明如下。本申請要求2001年9月20日遞交的日本專利申請No.2001-286637和2002年4月30日遞交的，要求了前述申請的優(yōu)選權(quán)的日本專利申請No.2002-128323，以及2001年9月20日遞交的日本專利申請No.2001-287159和2002年4月30日遞交的，要求了前述申請的優(yōu)選權(quán)的日本專利申請No.2002-128286的優(yōu)選權(quán)。本申請包括上述日本專利申請的說明書和/或附圖中所公開的內(nèi)容。
在生物世界中，有些具有存在自動調(diào)整機制的基因以及生長或發(fā)酵非必需的基因。我們致力于這一點，并選擇這類基因的啟動子用于基因轉(zhuǎn)移和基因表達的方法。因此，本發(fā)明的基因表達方法包括將靶基因插入基因組內(nèi)，該靶基因處于存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子、或者宿主生物體生長或發(fā)酵非必需基因的啟動子的控制之下。本發(fā)明的方法概括如下。
1.啟動子的選擇首先，選擇存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子、或者宿主生物體生長或發(fā)酵非必需基因的啟動子。就靶標宿主生物體而言，所有期望用于產(chǎn)生物質(zhì)、以及期望進行功能的改變或分析的生物體，都可以用作為宿主生物體。宿主生物體的例子包括細菌、酵母、昆蟲、動物和植物。
(1)存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子為選擇存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子，首先要確定存在自動調(diào)整機制的基因?！白詣诱{(diào)整機制”是指這樣一種機制，其中多個具有相同功能的基因存在于同一個生物體內(nèi)，其中至少一個基因正常地表達而其余的被抑制，并且僅當通常表達的基因由于破壞等原因不能夠行使功能的時候，其余的基因才被表達以繼續(xù)該功能。例如，酵母屬(Saccharomyces)的酵母的丙酮酸脫羧酶(PDC)基因是編碼在乙醇合成過程中通過脫羧作用將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛的酶的基因，該基因在發(fā)酵過程中起著重要作用。PDC包括PDC1、PDC5和PDC6，但正常地PDC1是活化的，而PDC5和PDC6由于PDC1的作用而被抑制。不過，當PDC1因藥物作用發(fā)生基因破壞或者突變從而其功能被失活的時候，PDC5被活化，藉此酵母的乙醇產(chǎn)生功能不喪失(Eberhardt，I.等，Eur.J.Biochem.1999，262(1)191-201；Muller，EH.等，F(xiàn)EBS Lett.1999，449(2-3)245-250)。實際上，Schaaff等缺失了PDC1啟動子，并隨后證實了酵母的丙酮酸脫羧酶活性(Schaaff I.等，Curr.Genet.1989，1575-81)。具體地，表型幾乎等價于親本菌株。在另一方面，已經(jīng)在被歸類為酵母的克魯維酵母屬(Kluyveromyces)中分離到PDC1啟動子(國際公開WO94/01569)。不過，在克魯維酵母屬(Kluyveromyces)中沒有報道過自動調(diào)整機制。
存在自動調(diào)整機制的基因可通過確認當菌株中的基因被破壞時，該基因編碼的蛋白是否依然表達來確定。選擇如此確定的存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子。在本發(fā)明中，例如，可以選擇PDC1的啟動子(下文稱之為PDC1啟動子)。
(2)生長或發(fā)酵非必需基因的啟動子為選擇宿主生物體生長或發(fā)酵非必需基因的啟動子，首先要確定生長或發(fā)酵非必需基因。這里，“生長”是指細胞生存以致能夠增殖。“發(fā)酵”是指物質(zhì)藉以產(chǎn)生的乙醇發(fā)酵等。此外，“非必需基因”是指不參與生長或發(fā)酵過程的基因，從而即使是在該基因被破壞或失活的時候，生長、發(fā)酵或兩者仍得以維持。
生長或發(fā)酵非必需基因可通過確認該菌株宿主生物體是否，在基因被破壞的情況下，繼續(xù)其生長和發(fā)酵來確定。這類基因的例子是編碼硫氧還蛋白的TRX1基因，其存在于大多數(shù)生物體內(nèi)。TRX1基因參與DNA復制、氧化應激應答、液泡遺傳等，但并總是生長或發(fā)酵所必需的。具體地，如果在宿主生物體內(nèi)TRX1基因被破壞或用其它基因取代，宿主生物體能夠繼續(xù)生長或發(fā)酵。選擇如此確定的宿主生物體生長或發(fā)酵非必需的基因的啟動子。
2.靶基因和啟動子的制備制備待插入宿主生物體的上文選擇的啟動子和靶基因。在本發(fā)明中，“靶基因”是指為了產(chǎn)生物質(zhì)以及改變或分析功能而期望其表達的基因，其可以是同源或異源的基因。例如，對于物質(zhì)制備的目的，優(yōu)選編碼有用蛋白的基因作為靶基因。這類有用蛋白的例子包括干擾素、疫苗和激素。而且，靶基因還可以是編碼產(chǎn)生有用物質(zhì)的酶的基因。這種基因的例子是編碼從丙酮酸產(chǎn)生乳酸的乳酸脫氫酶的基因。
為制備靶基因和上述啟動子，可以使用本領域公知的任何技術(shù)。例如，當從原料中分離靶基因和上述啟動子的時候，可通過從已由異硫氰酸胍方法制備的RNA合成cDNA的方法制備靶基因和上述啟動子。此外，靶基因和上述啟動子還可以利用基因組DNA作為模板，通過PCR擴增制備。如此獲得的靶基因和上述啟動子的DNA可以依賴于目的而直接利用，或者如果需要的話，可以在用限制酶消化后或在添加接頭后利用。
在本發(fā)明中，包含由啟動子核苷酸序列通過缺失、替代或添加1到40個核苷酸衍生而來的序列并具有啟動子活性的DNA，也可以用作為啟動子。啟動子活性是指，通過將靶基因可操作地連接于啟動子下游，當靶基因被插入到宿主中的時候，具有導致靶基因在宿主中或宿主體外產(chǎn)生基因產(chǎn)物的能力和功能。在這種DNA中，啟動子活性所維持的水平允許該DNA在與包括全長核苷酸序列且不帶任何突變(缺失、替代或添加)的啟動子行使功能的條件相同的條件下實現(xiàn)幾乎相同的應用。例如，這種DNA維持的啟動子活性與全長序列相比高大約0.01到100倍、優(yōu)選大約0.5到20倍、更優(yōu)選大約0.5到2倍。
這種DNA可以如文獻例如分子克隆(Molecular Cloning)(Sambrook等，冷泉港實驗室出版社，紐約)所述制備。
例如，通過基于并起始于存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子的核苷酸序列、或者宿主生物體生長或發(fā)酵非必需的基因的啟動子的核苷酸序列對1到40個核苷酸進行缺失、替代或添加的技術(shù)，例如通過定點突變方法，能夠制備具有不同序列同時又維持啟動子活性的變體。例如，對于可實現(xiàn)1到40個核苷酸替代的定點突變，可根據(jù)文獻例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)5662-5666；國際公布WO85/00817；Nature 316(1985)601-605；Gene 34(1985)315-323；Nucleic Acids Res.13(1985)4431-4442；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)6409-6413或Science 224(1984)1431-1433中所描述的技術(shù)獲得變體，然后可以利用該變體。另外，這些變體可利用商業(yè)上可獲得的試劑盒(Mutan-G和Mutan-K(TAKARA BIO))制備。此外，易錯聚合酶鏈式反應(易錯PCR)也是公知的制備變體的方法，而且通過選擇復制準確度低的條件，可以引入1到數(shù)個核苷酸的突變(Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.PCR方法和應用(PCR Methods andApplications)2(1992)28-33；Malboeuf，C.M.等，Biotechniques 30(2001)1074-8；Moore，G.L.和Maranas C.D.J.Theor.Biol.7；205(2000)483-503)。
此外，利用包括與存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子、或者宿主生物4體生長或發(fā)酵非必需的基因的啟動子的全部或部分核苷酸序列互補的序列的DNA作為探針(100到900個核苷酸)，在嚴謹條件下雜交，將允許新獲得并利用與包括存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子、或者宿主生物體生長或發(fā)酵非必需的基因的啟動子的核苷酸序列的DNA具有類似的功能(即，啟動子活性)，并包括不同的核苷酸序列的DNA。這里，嚴謹條件是指其中，例如鈉濃度在10到300mM之間，優(yōu)選在20到100mM之間，并且溫度在25到70℃之間，優(yōu)選在42到55℃之間的條件。
如上所述獲得的變體以及通過雜交獲得的DNA是否具有啟動子的活性可以通過下列操作確認。具體地，如上所述獲得的DNA的啟動子活性可以通過制備載體——其中優(yōu)選地，將各種報道基因，例如，螢光素酶(LUC)基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因和β-半乳糖苷酶(GAL)基因連接到啟動子下游區(qū)域，利用載體將基因插入到宿主基因組中，然后測量報道基因的表達來確認。
3.靶基因和啟動子的插入隨后，上述存在自動調(diào)整機制的基因、或者宿主生物體生長或發(fā)酵非必需的基因被破壞，然后插入在該基因啟動子控制下的靶基因，或者，所述基因用靶基因取代。
例如，可以將如上所述分離的靶基因可操作地連接到如上所述選擇的啟動子上，然后插入到宿主生物體的基因組中?！翱刹僮鞯剡B接”是指將靶基因連接到上述啟動子，從而靶基因在靶基因插入的宿主生物體中在上述啟動子的控制下表達。靶基因和上述啟動子可以利用本領域公知的任何技術(shù)插入。例如，靶基因和上述啟動子可以利用重組載體插入到宿主生物體的基因組中。重組載體可以通過將靶基因和上述啟動子連接(插入)到合適的載體中獲得。用于插入靶基因的載體不特別限定，只要它們能夠整合到宿主生物體的基因組中即可，所述載體包括質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子DNA和酵母人工染色體DNA(YAC)。
質(zhì)粒DNA的例子包括YIp-型大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)-酵母穿梭載體例如pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101或pAUR135；來源于大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)的質(zhì)粒(ColE質(zhì)粒例如pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396或pTrc99A；p15A質(zhì)粒例如pACYC177或pACYC184；或者pSC101質(zhì)粒例如pMW118、pMW119、pMW218或pMW219)；以及來源于芽孢桿菌屬(Bacillus)的質(zhì)粒(如pUB110或pTP5)。噬菌體DNA的例子包括λ噬菌體(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11或λZAP)、fX174、M13mp18和M13mp19。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的例子是Ty因子。YAC載體的例子是pYACC2。
為了將靶基因和上述啟動子插入到載體中，舉例來說，本文所用的方法包括，首先，用合適的限制性酶切割純化的DNA，然后將該產(chǎn)物插入到合適的載體DNA的限制性位點或多克隆位點中，以便將產(chǎn)物連接到載體上。
靶基因應當摻入到載體中，從而該基因在上文所選擇的啟動子的控制下行使功能。因此，除了上文所選擇的啟動子、靶基因和終止子之外，如果需要，可以將順式元件例如增強子、剪接信號、polyA添加信號、核糖體結(jié)合序列(SD序列)等連接到重組載體上。此外，還可以連接指示載體保留在細胞之內(nèi)的選擇標記。另外，選擇標記的例子包括二氫葉酸還原酶基因、氨芐青霉素抗性基因和新霉素抗性基因。另外，標記基因的例子是用于色氨酸合成的基因(TRP1基因)，但不局限于此。還可以使用其它標記基因，例如，具有營養(yǎng)缺陷型能力的URA3基因、ADE2基因和HIS3基因，或者具有藥物抗性能力的G418抗性基因。
終止序列的例子是甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)的終止基因，但在本發(fā)明中不局限于此。可以利用任何終止序列，只要它是能夠在宿主生物體內(nèi)利用的終止序列即可。
如上所述，能夠制備重組載體，以便可用于在宿主生物體中表達靶基因。通過利用重組載體轉(zhuǎn)化宿主生物體，靶基因能夠在上文所選擇的啟動子的控制下在宿主生物體中表達。
當利用細菌例如大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)作為宿主時，重組載體優(yōu)選由啟動子、核糖體結(jié)合序列、靶基因和轉(zhuǎn)錄終止子序列組成。另外，還可以含有調(diào)節(jié)啟動子的基因。
大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)的例子包括大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)K12和DH1。芽孢桿菌屬(Bacillus)的例子是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )。將重組載體引入細菌的方法不特別限定，只要它是將DNA引入細菌的方法。這種方法的例子包括利用鈣離子的方法和電穿孔法。
當利用酵母作為宿主時，舉例來說，可以利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyce pombe)或巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)。將重組載體引入酵母的方法不特別限定，只要它是將DNA引入酵母的方法。這種方法的例子包括電穿孔法、原生質(zhì)球法和醋酸鋰法。
當利用昆蟲或動物作為宿主時，舉例來說，可使用磷酸鈣法、脂轉(zhuǎn)染法或電穿孔法作為將重組載體引入宿主的方法。
當利用植物作為宿主時，舉例來說，可使用土壤桿菌法、基因槍法、PEG法或電穿孔法作為將重組載體引入宿主的方法。
當利用昆蟲、動物(人除外)或植物個體作為宿主時，可根據(jù)本領域公知的技術(shù)引入重組載體，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物或植物。將重組載體引入動物個體的方法的例子包括微注射進受精卵的方法、引入ES細胞的方法以及通過核移植將已引入培養(yǎng)細胞的細胞核引入受精卵的方法。
對如上所述引入重組載體的宿主生物體進行有關引入了在上文所選啟動子控制之下的靶基因的株系(克隆)的選擇。具體地，利用上述選擇標記作為指示選擇轉(zhuǎn)化體。
靶基因是否在上文所選擇的啟動子的控制之下被摻入可以通過PCR(聚合酶鏈式反應)或Southern雜交確認。例如，由轉(zhuǎn)化體制備DNA，設計引入的DNA的特異性引物，然后利用引物和所制備的DNA進行PCR。隨后，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或者毛細管電泳，用溴化乙錠、SYBR綠溶液等染色，然后作為單個條帶進行檢測，這樣可以確認引入的DNA。此外，利用預先用熒光染料等標記的引物進行PCR，從而可以檢測擴增產(chǎn)物。此外，本文還可以使用的方法包括將擴增產(chǎn)物結(jié)合到固相例如微量培養(yǎng)板上，然后通過熒光反應、酶反應等確認擴增產(chǎn)物。
如上所述，在存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子、或者宿主生物體生長或發(fā)酵非必需的基因的啟動子的控制下，靶基因被插入到基因組中(基因組整合)，從而靶基因在宿主生物體中表達。由于PDC1啟動子是一個非常強的啟動子，當選擇PDC1啟動子時，靶基因即使是以單拷貝的形式插入到基因組中也能獲得高度表達。此外，由于啟動子被選擇用于本發(fā)明的內(nèi)源基因是生長或發(fā)酵非必需的，即使它被破壞或用靶基因取代時，宿主生物體仍能夠繼續(xù)生長和發(fā)酵，從而能夠長時間表達靶基因。
4.丙酮酸脫羧酶1基因(PDC1)啟動子本發(fā)明的啟動子是從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分離的丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子(下文稱之為PDC1啟動子)。丙酮酸脫羧酶是參與酵母乙醇發(fā)酵途徑的酶。一般地，在PDC1、PDC5和PDC6基因中，只有PDC1發(fā)揮功能(見“1.啟動子的選擇”部分)。我們集中于雖然丙酮酸脫羧酶僅通過PDC1的表達產(chǎn)生，但因為自動調(diào)整機制，乙醇仍大量產(chǎn)生的事實，然后確定了PCD1的啟動子區(qū)。
如下文所述確定并分離PDC1啟動子。首先利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的公共基因組數(shù)據(jù)庫(酵母屬基因組數(shù)據(jù)庫)，構(gòu)建同源重組載體，從而靶基因能夠插入到PDC1啟動子下游。引入載體，選擇具有高表達量的靶基因的菌株，通過PCR獲得PDC1啟動子片段，然后用測序儀(ABI 310 Genetic Analyzer)確定與PDC1啟動子相應的推斷區(qū)域的核苷酸序列。
PDC1啟動子含有包括SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的DNA。在分離PDC1啟動子之后，可根據(jù)核酸合成的技術(shù)通過化學合成獲得此DNA。
而且，本發(fā)明的PDC1啟動子還包括含有從SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列通過缺失、替代或添加1到40個核苷酸分離的核苷酸序列，并具有啟動子活性的DNA。啟動子活性是指，通過將靶基因可操作地連接于啟動子下游，當靶基因被插入到宿主中的時候，具有在宿主中或宿主體外產(chǎn)生靶基因的基因產(chǎn)物的能力和功能。在這種DNA中，啟動子活性維持在允許該DNA在與包括SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的啟動子行使功能的條件相同的條件下實現(xiàn)幾乎相同的應用的水平上。例如，這種DNA維持的啟動子活性與包括SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的DNA相比高大約0.01到100倍、優(yōu)選大約0.5到20倍、更優(yōu)選大約0.5到2倍。
這種DNA可以如文獻例如分子克隆(Molecular Cloning)(Sambrook等編輯，(1989)冷泉港實驗室出版社，紐約)所述，通過參照SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列制備。
例如，通過基于并起始于上述SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列對1到40個核苷酸進行缺失、替代或添加的技術(shù)，例如通過如上文“2.靶基因和啟動子的制備”部分所描述的定點突變方法，能夠制備具有不同序列同時又維持啟動子活性的變體。
此外，利用包括與全部或部分SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列互補的序列的DNA作為探針(100到900個核苷酸)，在嚴謹條件下雜交，將允許新獲得并利用與包括SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的DNA具有類似的功能(即，啟動子活性)，但包括不同的核苷酸序列的DNA。這里，嚴謹條件是指其中，例如鈉濃度在10到300mM之間，優(yōu)選在20到100mM之間，并且溫度在25到70℃之間，優(yōu)選在42到55℃之間的條件。
如上所述獲得的變體以及通過雜交獲得的DNA是否具有啟動子的活性可以通過如上文“2.靶基因和啟動子的制備”部分所描述的技術(shù)確認。
本發(fā)明的PDC1啟動子能夠利用自動調(diào)整機制用來表達在該啟動子控制下的靶基因，而且能夠用作為普通啟動子。
5.重組載體的構(gòu)建本發(fā)明的啟動子可用作為普通啟動子，從而它能夠被用作為啟動子以實現(xiàn)靶基因的高表達。本發(fā)明的重組載體可通過將本發(fā)明的PDC1啟動子和靶基因連接(插入)到合適的載體中獲得?！鞍谢颉钡睦影ň幋a蛋白的核酸或其反義核酸，編碼反義RNA誘餌(RNA decoy)及核酶的核酸。
為制備物質(zhì)，編碼有用蛋白的核酸優(yōu)選用作為靶基因。這種有用蛋白的例子包括干擾素和疫苗。另外，編碼蛋白的核酸可以是編碼產(chǎn)生有用物質(zhì)的酶的基因的核酸。這種核酸的例子是編碼從丙酮酸產(chǎn)生乳酸的乳酸脫氫酶的基因的核酸。
反義核酸具有與任何RNA(基因組RNA和mRNA)互補的核苷酸序列，并與這種RNA形成雙鏈，藉此抑制RNA編碼的基因信息的表達(轉(zhuǎn)錄和翻譯)。作為反義序列，可以利用任何核酸物質(zhì)，只要它阻斷基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄。這種核酸物質(zhì)的例子包括DNA、RNA或任何核酸模擬物。因此，設計反義核酸(寡核苷酸)序列以便與表達待受抑制的基因的部分序列互補。
所設計的反義核酸序列的長度不特別限定，只要它能夠抑制基因的表達，并且，例如，長度可以在10到50個核苷酸之間，優(yōu)選在15到25個核苷酸之間。寡核苷酸能夠通過已知技術(shù)容易地化學合成。
鑒于本發(fā)明的目的，還可以利用反義寡核苷酸的分子類似物。該分子類似物具有高穩(wěn)定性、分布特異性等。這種分子類似物的例子是結(jié)合有化學反應基團例如乙二胺四乙酸鐵(II)鈉鹽三水合物的反義寡核苷酸。
編碼RNA誘餌(RNA decoy)的核酸是指編碼轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的蛋白的基因，或者具有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的序列或其類似序列的RNA。它們作為“誘餌(decoy)”被引入到細胞內(nèi)，以便抑制轉(zhuǎn)錄因子的作用。
核酶是指能夠切割特定蛋白的mRNA并抑制該特定蛋白翻譯的核酸。核酶可以從編碼特定蛋白的基因序列設計。例如，為設計錘-頭狀核酶，可利用FEBS Letter，228，228-230(1988)中描述的方法。此外，不僅錘-頭狀核酶，而且那些切割特定蛋白的mRNA(例如發(fā)夾-型核酶或三角形核酶)和抑制該特定蛋白翻譯的核酸都能夠用于本發(fā)明。
用于插入靶基因的載體不特別限定，只要它是能夠被整合進染色體的載體類型，即能夠如上文“靶基因和啟動子的插入”部分所描述的，將靶基因整合到宿主生物體的基因組中的載體，或者是本領域公知的質(zhì)粒型載體即可。這種載體的例子包括質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子DNA和酵母人工染色體DNA(YAC)。
質(zhì)粒DNA的例子包括YCp-型大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)-酵母穿梭載體例如pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112或pAUR123，YEp-型大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)-酵母穿梭載體例如pYES2或YEp13，YIp-型大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)-酵母穿梭載體例如pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101或pAUR135，來源于大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)的質(zhì)粒(如，ColE質(zhì)粒例如pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396或pTrc99A；p15A質(zhì)粒例如pACYC177或pACYC184；或者pSC101質(zhì)粒例如pMW118、pMW119、pMW218或pMW219)，以及來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的質(zhì)粒(如pUB110或pTP5)。噬菌體DNA的例子包括λ噬菌體(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11或λZAP)、fX174、M13mp18和M13mp19。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的例子是Ty因子。YAC載體的例子是pYACC2。
為了將本發(fā)明的PDC1啟動子和靶基因插入到載體中，舉例來說，可以利用包括首先用合適的限制性酶切割純化的DNA，然后將該產(chǎn)物插入到合適的載體DNA的限制性位點或多克隆位點中以便將產(chǎn)物連接到載體上的方法。
本發(fā)明的PDC1啟動子應當摻入到載體中，以便載體可操作地表達靶基因，以行使靶基因的功能?！翱刹僮鞯乇磉_”是指將靶基因和PDC1啟動子相互連接起來，然后將它們摻入到載體中，從而靶基因在PDC1啟動子的控制下在插入靶基因的宿主生物體中表達。因此，對于本發(fā)明的載體，除了PDC1啟動子、靶基因和終止子之外，如果必要，可以連接順式元件例如增強子、剪接信號、polyA添加信號、選擇標記、核糖體結(jié)合序列(SD序列)等。此外，選擇標記的例子包括二氫葉酸還原酶基因、氨芐青霉素抗性基因和新霉素抗性基因。
6.重組載體的轉(zhuǎn)化本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以通過將本發(fā)明的重組載體引入宿主中獲得，從而靶基因能夠在PDC1啟動子的控制下表達。此處宿主不特別限定，只要它能夠使靶基因在本發(fā)明的PDC1啟動子的控制下表達即可。這種宿主的例子包括屬于埃希氏桿菌屬(Escherichia)例如大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)、芽孢桿菌屬(Bacillus)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、假單胞菌屬(Pseudomonas)例如惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的細菌。此外，宿主的例子包括酵母例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，以及動物細胞例如COS細胞和中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)?？商娲?，還可以利用昆蟲細胞例如Sf9和Sf21。
當利用細菌例如大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)作為宿主時，優(yōu)選本發(fā)明的重組載體在細菌中自主復制，并且同時由本發(fā)明的啟動子、核糖體結(jié)合序列、靶基因和轉(zhuǎn)錄終止序列組成。另外，還可以含有調(diào)節(jié)本發(fā)明的啟動子的基因。
大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)的例子包括大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)K12和DH1，而芽孢桿菌屬(Bacillus)的例子是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。將重組載體引入細菌的方法不特別限定，只要它是將DNA插入細菌的方法。
當利用酵母作為宿主時，舉例來說，可以利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyce pombe)或巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)等。將重組載體引入酵母的方法不特別限定，只要它是將DNA引入酵母的方法。
當利用動物細胞作為宿主時，可以利用猿COS-7細胞和Vero細胞、CHO細胞、小鼠L細胞、大鼠GH3、人FL細胞等。將重組載體引入動物細胞的方法的例子包括電穿孔法、磷酸鈣法和脂轉(zhuǎn)染法。
當利用昆蟲作為宿主時，利用Sf9細胞、Sf21細胞等。就將重組載體引入昆蟲細胞的方法而言，舉例來說，可以利用磷酸鈣法、脂轉(zhuǎn)染法、電穿孔法等。
當利用植物作為宿主時，植物的例子包括，但不限于，番茄和煙草。就將重組載體引入植物細胞的方法而言，舉例來說，可以利用土壤桿菌法、基因槍法、PEG法、電穿孔法等。
當利用昆蟲、動物(人除外)或植物個體作為宿主時，可根據(jù)本領域公知的技術(shù)引入重組載體，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物或植物。
對如上所述其中引入了重組載體的宿主生物體進行選擇，以便獲得引入了在上文所選啟動子控制之下的靶基因的株系(克隆)。具體地，利用上述選擇標記作為指示選擇轉(zhuǎn)化體。如此獲得的轉(zhuǎn)化體能夠在PDC1啟動子的控制下高水平且穩(wěn)定地表達靶基因，從而轉(zhuǎn)化體能夠如下文所述被用來制備靶基因所編碼的蛋白，或者用于其它目的，例如靶基因的功能分析。
7.基因表達產(chǎn)物或者由表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)的制備接下來，描述制備基因表達產(chǎn)物或者由表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)的方法。在本發(fā)明中，基因表達產(chǎn)物或者由表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)可以通過培養(yǎng)如上文所述獲得的轉(zhuǎn)化體，并從獲得的培養(yǎng)物中收集基因表達產(chǎn)物或者由表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)獲得?！芭囵B(yǎng)物”是指培養(yǎng)上清液以及，任何培養(yǎng)細胞或培養(yǎng)的生物體，或者破碎細胞或破碎的生物體。培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的方法根據(jù)適用于培養(yǎng)宿主的常規(guī)方法進行。
就培養(yǎng)利用微生物例如酵母作為宿主獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基而言，可以利用天然培養(yǎng)基或者合成培養(yǎng)基，只要培養(yǎng)基含有微生物能夠利用的碳源、氮源、無機鹽等，并允許有效培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體即可。就碳源而言，可以利用碳水化合物例如葡萄糖、果糖、蔗糖或淀粉，有機酸例如乙酸或丙酸，或者醇例如乙醇或丙醇。就氮源而言，可以利用無機酸或有機酸的銨鹽例如氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨或磷酸銨，或者其它含氮化合物以及蛋白胨、肉膏、玉米漿等。就無機物而言，可以利用磷酸一氫鉀(potassiumprimary phosphate)、磷酸二氫鉀(potassium secondary phosphate)、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養(yǎng)通常通過搖瓶培養(yǎng)、通風攪拌培養(yǎng)等在有氧條件下于30℃進行6到24小時。培養(yǎng)期間，pH值維持在4.0和6.0之間。pH利用無機或有機酸、堿溶液等調(diào)整。培養(yǎng)期間，如果必要，可以向培養(yǎng)基中添加抗生素例如氨卡青霉素或四環(huán)素。
就培養(yǎng)利用動物細胞作為宿主獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基而言，舉例來說，利用通常所用的RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基，或者補充有胎牛血清等的這些培養(yǎng)基之一。培養(yǎng)通常在存在5％CO2的條件下于37℃進行1到30天。培養(yǎng)期間，如果必要，可以向培養(yǎng)基中添加抗生素例如卡那霉素或青霉素。
在培養(yǎng)完成后，可通過常規(guī)的蛋白純化技術(shù)等從培養(yǎng)物中收集基因產(chǎn)物或由表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)。舉例來說，當產(chǎn)生在轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)時，通過標準方法例如超聲波、研磨破碎法或者壓力破碎法等破碎細胞，以便提取基因產(chǎn)物或由表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)。如果必要，添加蛋白酶抑制劑。此外，當產(chǎn)物或物質(zhì)產(chǎn)生在培養(yǎng)上清液中時，可以使用培養(yǎng)液本身。隨后，對溶液進行過濾、離心等以除去固體，然后，如果必要，通過魚精蛋白懸浮等除去核酸。
接著，添加硫酸銨、醇、丙酮等用于分級分離。收集沉淀，然后獲得粗蛋白溶液。對蛋白溶液進行各種層析、電泳等，藉以獲得純化的酶樣品。純化的感興趣基因產(chǎn)物或者由表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)可以通過，舉例來說，適當?shù)剡x擇或組合利用Sephadex、Ultrogel、Biogel等的凝膠過濾、離子交換層析、利用聚丙烯酰胺凝膠等的電泳以及利用諸如親合層析或反相層析等的分級分離方法獲得。不過，上文的培養(yǎng)方法和純化方法僅僅是例子，而此處可用的方法不局限于此。
另外，舉例來說，純化的基因產(chǎn)物或由表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)的氨基酸序列可通過氨基酸分析的公知方法，例如根據(jù)Edman降解法確定氨基酸序列的自動方法確認。
附圖的簡短說明

圖1A到1C顯示了染色體整合型載體pBTRP-PDC1-LDH的構(gòu)建。
圖2A到2B顯示了染色體整合型載體pBTRP-PDC1-LDH的構(gòu)建。
圖3顯示了當用載體pBTRP-PDC1-LDH轉(zhuǎn)化酵母菌釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)時所得的菌株的基因組結(jié)構(gòu)。
圖4顯示了染色體整合型載體pAUR-LacZ-T123PDC1(A)、pAUR-LacZ-OC2PDC1(B)和pAUR-LacZ-YPHPDC1(C)的構(gòu)建。
圖5A和5B顯示了分離自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1啟動子(983bp)、分離自IFO2260菌株的PDC1啟動子(968bp)及分離自YPH菌株的PDC1啟動子(968bp)的基因序列的比較。
圖6顯示了插入了分離自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1啟動子(983bp)、分離自IFO2260菌株的PDC1啟動子(968bp)及分離自YPH菌株的PDC1啟動子(968bp)的轉(zhuǎn)化體在傳代培養(yǎng)前的β-半乳糖苷酶活性。
圖7顯示了插入了分離自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1啟動子(983bp)、分離自IFO2260菌株的PDC1啟動子(968bp)及分離自YPH菌株的PDC1啟動子(968bp)的轉(zhuǎn)化體在傳代培養(yǎng)后的β-半乳糖苷酶活性。
實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明將進一步通過實施例在下文具體描述。不過，本發(fā)明的范圍不受限于這些實施例。
實施例[實施例1]分離PDC1P片段用以構(gòu)建pBTRP-PDC1-LDH在本實施例中，確定和分離了丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子區(qū)(PDC1P)。PDC1P片段通過PCR擴增法利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YPH菌株(Stratagene)的基因組DNA作為模板分離。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH菌株的基因組DNA利用Fast DNA試劑盒(Bio 101)(一種基因組制備試劑盒)根據(jù)所附的操作方案制備。DNA濃度利用Ultro spec 3000分光光度計(AmershamPharmacia Biotech)測量。
在PCR反應中，利用被認為在產(chǎn)生擴增片段時具有高準確度的Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA BIO)作為擴增酶。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH菌株的基因組DNA(50ng/樣品)通過上文的技術(shù)制備，將其與引物DNA(50pmol/樣品)和Pyrobest DNA聚合酶(0.2單位/樣品)配成總計50μl的反應體系。將反應液置于PCR擴增系統(tǒng)(Gene Amp PCR system 9700，PE Applied Biosystems)進行DNA擴增。PCR擴增系統(tǒng)的反應條件為96℃2分鐘，接著是25個循環(huán)的96℃30秒、55℃30秒和72℃90秒，然后4℃。對PDC1引物的擴增片段進行1％TBE瓊脂糖凝膠電泳以確認基因擴增片段。另外，這個反應所用的引物DNA是合成DNA(Sawady Technology)，并且引物的DNA序列如下●在PDC1P-LDH-U(31mer且Tm 58.3℃)末端添加限制性酶BamHI位點ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAC CTA TCT C(SEQ IDNO2)●在PDC1P-LDH-D(31mer且Tm 54.4℃)末端添加限制性酶EcoRI位點ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G(SEQ IDNO3)[實施例2]構(gòu)建含有啟動子和靶基因的重組載體在本實施例中，利用分離自長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)的乳酸脫氫酶基因(LDH基因)作為靶基因在分離自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的丙酮酸脫羧酶1基因(PDC1)啟動子序列的控制下構(gòu)建重組載體。
為這個實施例新近構(gòu)建了染色體-整合型載體，并命名為pBTRP-PDC1-LDH。構(gòu)建這個載體的實施例將在下文詳細描述。另外，本實施例的略圖示于圖1和2。不過，載體構(gòu)建的操作不限于此。
在構(gòu)建載體時，所需的基因片段(PDC1基因的971bp啟動子片段(PDC1P)和PDC1基因下游區(qū)的518bp片段(PDC1D))通過PCR擴增法利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH菌株的基因組DNA作為模板分離，如上所述。PCR擴增操作描述如上。為擴增PDC1基因下游區(qū)片段，利用如下引物。
●在PDC1D-LDH-U(34mer且Tm 55.3℃)末端添加限制性酶XhoI位點ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CTT GGT CGA C (SEQID NO4)●在PDC1D-LDH-D(31mer且Tm 54.4℃)末端添加限制性酶ApaI位點ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G(SEQ IDNO5)上述反應中獲得的PDC1P和PDC1D基因擴增片段分別通過乙醇沉淀處理純化。然后，PDC1擴增片段和PDC1D擴增片段分別利用限制性酶BamHI/EcoRI和限制性酶XhoI/ApaI通過限制性酶反應處理。另外，下文所用的酶都是由TAKARA BIO公司生產(chǎn)的。此外，包括乙醇沉淀處理和用限制性酶處理的一系列操作的詳細手冊是根據(jù)分子克隆實驗室指南第2版(Molecular CloningA Laboratory Manual second edition)(Maniatis等，冷泉港實驗室出版社，1989)使用的。
在構(gòu)建載體時的一系列反應操作是根據(jù)一般的DNA亞克隆方法進行的。具體地，向用限制性酶BamHI/EcoRI(TAKARA BIO)以及堿性磷酸酶(BAP，TAKARA BIO)，一種脫磷酸化酶，處理過的pBluescriptIISK+載體(TOYOBO)，通過T4 DNA連接酶反應，連接通過上述PCR法擴增并隨后用限制性酶處理過的PDC1P片段(圖1A)。T4 DNA連接酶反應利用LigaFast快速DNA連接系統(tǒng)(Promega)根據(jù)所附的方案進行。
接下來，經(jīng)過連接反應的溶液然后用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。這里所用的感受態(tài)細胞是大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)JM109菌株(TOYOBO)，并且轉(zhuǎn)化根據(jù)所附的方案進行。所獲得的培養(yǎng)液接種于含有100μg/ml抗生素(氨芐青霉素)的LB板，之后過夜培養(yǎng)。長出的菌落通過菌落PCR法利用插入片段的引物DNA確認，而通過Miniprep制備的質(zhì)粒DNA溶液通過用限制性酶處理確認，藉此分離pBPDC1P載體，它就是靶載體(圖1B)。
隨后，LDH基因片段通過用限制性酶EcoRI/AatII和T4 DNA聚合酶，(一種末端修飾酶)處理由TOYOTA JIDOSHA KABUSHIKI KAISHA構(gòu)建的pYLD1載體獲得，并通過與上述相似的操作被亞克隆到用限制性酶EcoRI和T4 DNA聚合酶(一種末端修飾酶)類似處理過的pBPDC1P載體中，藉此制備pBPDC1P-LDH I載體(圖1C)。另外，上述pYLD1載體被引入大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)中(名稱“E.coli.pYLD1”)，并依據(jù)布達佩斯條約以FERM BP-7423保藏號國際保藏于國立高級工業(yè)科技研究院(National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology)(1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)的國際專利生物保藏單位；(原始保藏日期1999年10月26日)。接著，該載體用XhoI/ApaI處理，然后其上連接擴增的PDC1D片段，藉此制備pBPDC1P-LDH II載體(圖2A)。最后，TRP1標記片段——它通過用AatII/SspI和T4 DNA聚合酶處理pRS404載體(Stratagene)獲得——被連接到用EcoRV處理過的pBPDC1P-LDH II載體上，藉此構(gòu)建最終構(gòu)建產(chǎn)物，即待引入染色體的pBTRP-PDC1-LDH載體(圖2B)。
為確認如此構(gòu)建的染色體整合型pBTRP-PDC1-LDH載體，測定了核苷酸序列。利用ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(PE AppliedBiosystems)作為核苷酸序列分析儀，并根據(jù)該分析儀所附的手冊進行測序，所述手冊中可以找到有關制備樣品的方法、利用儀器的方法等的細節(jié)。待用作為樣品的載體DNA由堿抽提法制備。DNA用GFX DNA純化試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)柱純化，DNA濃度用Ultro spec 3000分光光度計(Amersham Pharmacia Biotech)測量，然后使用。
向宿主中引入重組載體酵母色氨酸依賴型菌株，IFO2260菌株(該菌株在大阪發(fā)酵所注冊)，作為宿主，在10ml YPD培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期。在收集并用TE緩沖液洗滌后，添加0.5ml TE緩沖液和0.5ml 02.M的醋酸鋰，然后于30℃振蕩培養(yǎng)1小時。隨后，添加用限制性酶ApaI和SpeI處理過的pBTRP-PDC1-LDH。
質(zhì)粒懸液于30℃振蕩培養(yǎng)30分鐘，添加150ml 70％的聚乙二醇4000，然后充分攪拌溶液。于30℃振蕩培養(yǎng)1小時之后，于42℃給予熱激5分鐘。細胞洗滌并懸浮于200ml水中。將懸液涂布于選擇培養(yǎng)基上。
在用選擇培養(yǎng)基對產(chǎn)生的菌落進行分離獲得克隆后，通過PCR獲得在PDC1啟動子下游插入了LDH的菌株。此外，在形成芽孢的培養(yǎng)基中進行芽孢形成，利用同宗配合特性進行二倍體形成，然后得到在二倍體的兩條染色體中都引入了上述載體的菌株。
酵母菌釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)轉(zhuǎn)化有圖2所示pBTRP-PDC1-LDH并且基因插入到基因組中的事實通過PCR確認。上述載體在基因組中的結(jié)構(gòu)顯示于圖3。
通過表達產(chǎn)物制備物質(zhì)所獲得的轉(zhuǎn)化體以1％的細胞濃度接種于YPD液體培養(yǎng)基中(葡萄糖10％)，然后于30℃靜置培養(yǎng)2天。對(1)未引入載體的菌株、(2)用YEP載體插入LDH的菌株(在常規(guī)GAP啟動子控制下插入LDH的系統(tǒng))、3)用pBTRP-PDC1-LDH插入LDH的菌株(在PDC1啟動子控制下插入LDH的系統(tǒng))生產(chǎn)的乳酸量進行比較。結(jié)果示于表1。
表1.引入LDH和傳代培養(yǎng)的不同方法所導致的乳酸生產(chǎn)量的比較

雖然未引入載體的菌株(1)不生產(chǎn)乳酸，引入LDH的菌株(2)和(3)生產(chǎn)乳酸。此外，用染色體-整合型載體在PDC1啟動子控制下插入了LDH的菌株(3)的乳酸生產(chǎn)水平比用YEP載體插入了LDH的菌株(2)的生產(chǎn)水平高2.5倍。
而且，為確認由該方法引入的性狀的穩(wěn)定性的目的，在YPD板上傳代培養(yǎng)3次，然后通過PCR檢測基因轉(zhuǎn)移和生產(chǎn)的乳酸量。雖然用YEP載體插入LDH的系統(tǒng)(2)停止生產(chǎn)乳酸，但導致表達LDH的菌株(3)維持與傳代培養(yǎng)前相同量的乳酸產(chǎn)量。
而且，通過PCR證實基因組結(jié)構(gòu)沒有變化。因而，通過pBTRP-PDC1-LDH表達LDH的系統(tǒng)(3)可以說是穩(wěn)定存在并允許基因的高表達。
基于上述結(jié)果，證明LDH在利用染色體-整合型(載體)的情況下穩(wěn)定且高水平地表達，其中可操作地將LDH連接于本發(fā)明的PDC1啟動子上。
分離含有PDC1啟動子序列的變體序列在這個實施例和以下的實施例中，分離了具有數(shù)個核苷酸差別的3種PDC1啟動子序列。然后，制備了設計的在啟動子之后連接LacZ基因的染色體-整合型載體。轉(zhuǎn)化的酵母利用這些載體通過將啟動子和1拷貝的基因插入到染色體上相同的位置構(gòu)建。測量了每個轉(zhuǎn)化酵母的β-半乳糖苷酶活性，并比較了3種啟動子活性。
在這個實施例中，通過PCR擴增法，利用引入了pBTRP-PDC1-LDH的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株(實施例3中制備的菌株)、IFO2260菌株(在大阪發(fā)酵所注冊的菌株)和YPH菌株(Stratagene)的基因組DNA作為模板分離PDC1啟動子序列。
每種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株(引入pBTRP-PDC1-LDH的菌株、IFO2260菌株和YPH菌株)的基因組DNA的制備方法和PCR擴增方法通過與實施例1和2中所使用的那些相似的技術(shù)進行。
另外，反應所用的引物DNA的核苷酸序列如下。
擴增分離自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1啟動子●在PDC1 PrFrag-U2(32mer且Tm 64.4℃)末端添加限制性酶SalI位點AAA TTT GTC GAC AAG GGT AGC CTC CCC ATA AC(SEQ IDNO6)●在PDC1 PrFrag-D2(31mer且Tm 61.1℃)末端添加限制性酶SalI位點ATA TAT GTC GAC GAG AAT TGG GGG ATC TTT G(SEQ IDNO7)擴增IFO2260菌株-來源的和YPH菌株-來源的PDC1啟動子●在PDC1 PrFrag-U2(32mer且Tm 64.4℃)末端添加限制性酶SalI位點AAA TTT GTC GAC AAG GGT AGC CTC CCC ATA AC(SEQ IDNO6)●在PDC1 PrFrag-D(43mer且Tm 62.5℃)末端添加限制性酶SalI位點TTT AAA GTC GAC TTT GAT TGA TTT GAC TGT GTT ATTTTG CGT G(SEQ ID NO8)[實施例6]構(gòu)建含有變體啟動子序列的載體用以分析β-半乳糖苷酶在這個實施例中，在3種分離的PDC1啟動子序列的控制下，構(gòu)建連接有報道基因的載體。就報道基因而言，利用的是β-半乳糖苷酶基因(LacZ基因)。
為這個實施例新近構(gòu)建的待引入染色體的載體命名為pAUR-LacZ-T123PDC1、pAUR-LacZ-OC2PDC1和pAUR-LacZ-YPHPDC1。構(gòu)建載體的實施例將在下文詳細描述。另外，這個實施例的略圖顯示于圖4。不過，構(gòu)建載體的操作不局限于此。
構(gòu)建載體的一系列反應操作根據(jù)常規(guī)DNA亞克隆法進行。用限制性酶切割pSV-β-半乳糖苷酶對照載體(Promega)以獲得LacZ片斷。然后，片斷被鈍端化，從而構(gòu)建pAUR-LacZ載體。如此構(gòu)建的pAUR-LacZ載體用SalI(TAKARA BIO)和堿性磷酸酶(BAP，TAKARA BIO)(一種脫磷酸化酶)處理。接著，實施例5中獲得的3種啟動子序列，即，分離自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1啟動子(983bp)、分離自IFO2260菌株的PDC1啟動子(968bp)以及分離自YPH菌株的PDC1啟動子(968bp)，分別用限制性酶SalI(TAKARA BIO)處理，然后通過T4 DNA連接酶反應連接到pAUR-LacZ載體上。T4 DNA連接酶反應利用LigaFast快速DNA連接系統(tǒng)(Promega)根據(jù)所附的方案進行。
感受態(tài)細胞利用如此獲得的連接反應液轉(zhuǎn)化，然后通過菌落PCR法獲得靶標構(gòu)建載體。上述一系列操作通過與實施例2中所使用的那些類似的技術(shù)進行。
對構(gòu)建的載體進行核苷酸序列分析，然后比較分離自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1啟動子(983bp)、分離自IFO2260菌株的PDC1啟動子(968bp)以及分離自YPH菌株的PDC1啟動子(968bp)的基因序列。序列的比較結(jié)果顯示于圖5A和B。另外，核苷酸序列分析通過與實施例2中所使用的技術(shù)類似的操作進行。
分離自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1啟動子(983bp)與包含SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的PDC1啟動子(971bp)有12個核苷酸的差別。具體地，分離自引入了pBTRP-PDC1-LDH的菌株的PDC1啟動子(983bp)由在SEQ ID NO1啟動子序列的兩端添加了限制性酶SalI位點(GTCGAC)的序列構(gòu)成。
此外，IFO2260菌株來源的PDC1啟動子(968bp)與包含SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的PDC1啟動子有30個核苷酸的差別，其中具體地，SEQ ID NO1啟動子序列的861位的鳥嘌呤(G)由胞嘧啶(C)替代，894位的胞嘧啶(C)由胸腺嘧啶(T)替代，925位的腺嘌呤由胸腺嘧啶(T)替代，并在972位核苷酸之后添加了15個核苷酸的序列(GATCCCCCAATTCTC)。此外，IFO2260菌株來源的PDC1啟動子序列由在SEQ ID NO1啟動子序列的兩端添加了限制性酶SalI位點(GTCGAC)的序列構(gòu)成。
YPH菌株來源的PDC1啟動子(968bp)與包含SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的PDC1啟動子有37個核苷酸的差別，其中具體地，SEQID NO1啟動子序列的179位的胞嘧啶(C)由胸腺嘧啶(T)替代，214位的腺嘌呤(A)由鳥嘌呤(G)替代，216位的鳥嘌呤(G)由腺嘌呤(A)替代，271位的胸腺嘧啶(T)由胞嘧啶(C)替代，344位的鳥嘌呤(G)由腺嘌呤(A)替代，490位的腺嘌呤(A)由鳥嘌呤(G)替代，533位的胞嘧啶(C)由胸腺嘧啶(T)替代，566位的胸腺嘧啶(T)由胞嘧啶(C)替代，660位的鳥嘌呤(G)由胞嘧啶(C)替代，925位的腺嘌呤(A)由胸腺嘧啶(T)替代，并在972位核苷酸之后添加了15個核苷酸的序列(GATCCCCCAATTCTC)。此外，YPH菌株來源的PDC1啟動子序列由在SEQ ID NO1啟動子序列的兩端添加了限制性酶SalI位點(GTCGAC)的序列構(gòu)成。
向宿主中引入重組載體酵母色氨酸依賴型菌株，IFO2260菌株(該菌株在大阪發(fā)酵所注冊)，作為宿主，在10ml YPD培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期。在收集并用TE緩沖液洗滌后，添加0.5ml TE緩沖液和0.5ml 02.M的醋酸鋰，然后于30℃振蕩培養(yǎng)1小時。隨后，添加用限制性酶Bst11 07I(TAKARABIO)處理過的pAUR-LacZ-T123PDC1P、pAUR-LacZ-YPHPDC1 P和pAUR-LacZ-OC2PDC1P。
質(zhì)粒懸液于30℃振蕩培養(yǎng)30分鐘，添加150μl 70％的聚乙二醇4000，然后充分攪拌溶液。于30℃振蕩培養(yǎng)1小時之后，于42℃給予熱激5分鐘。細胞于30℃在1ml YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時。洗滌培養(yǎng)液，然后懸浮于200μl無菌水中。將懸液涂布于aureobasidin A選擇培養(yǎng)基上。向培養(yǎng)基中添加的aureobasidin A濃度為0.4μg/ml。
獲得的菌落利用aureobasidin A選擇培養(yǎng)基分離，然后對得到的菌落進行PCR方法，藉此獲得靶標菌株。
測量基因重組菌株中β-半乳糖苷酶活性對上述轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體測量β-半乳糖苷酶活性。每種菌株在2mlYPD液體培養(yǎng)基(葡萄糖2％)中于30℃培養(yǎng)20小時。收集它們并加入500μl 50mM的Tris-HCl和玻璃珠(425到600微米，酸洗的，SIGMA)，并于4℃震蕩15分鐘。
通過離心收集該溶液的上清，然后測量這些上清中的β-半乳糖苷酶活性。活性測量利用β-半乳糖苷酶酶分析系統(tǒng)(Promega)根據(jù)所附的方案進行。計算活性值(ABS 600nm＝1.0)，結(jié)果顯示于圖6(傳代培養(yǎng)前)和圖7(傳代培養(yǎng)后)。
基于上述結(jié)果，揭示即使其上添加了數(shù)十個核苷酸、或者具有不同序列的PDC1啟動子序列仍具有穩(wěn)定的啟動子活性。所以，可以說存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子、或者宿主生物體生長或發(fā)酵非必需的基因的啟動子能夠被利用，即使它不具有全長的序列。
茲將本文引用的所有出版物、專利和專利申請全文并入作為參考。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，基因能夠穩(wěn)定地引入宿主生物體中并在其中高水平表達，而不影響宿主的生長和發(fā)酵。因此，提供了制備物質(zhì)及改變或分析功能的有效工具。此外，根據(jù)本發(fā)明，提供了在宿主中激活轉(zhuǎn)錄的啟動子。本發(fā)明的啟動子允許以小的拷貝數(shù)引入宿主的基因得以高表達，從而它有效地提高了所制備的物質(zhì)的量。
序列表說明
SEQ ID NO1合成DNASEQ ID NO2合成DNASEQ ID NO3合成DNASEQ ID NO4合成DNASEQ ID NO5合成DNASEQ ID NO6合成DNASEQ ID NO7合成DNASEQ ID NO8合成DNA
序列表<110>豐田自動車株式會社(TOYOTA JIDOSHA KABUSHIKI KAISHA)<120>實現(xiàn)基因高表達的系統(tǒng)<130>PH-1638PCT<150>JP 2001-286637<151>2001-09-20<150>JP 2001-287159<151>2001-09-20<150>JP 2002-128323<151>2002-04-30<150>JP 2002-128286<151>2002-04-30<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>971<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>1aagggtagcc tccccataac ataaactcaa taaaatatat agtcttcaac ttgaaaaagg60aacaagctca tgcaaagagg tggtacccgc acgccgaaat gcatgcaagt aacctattca120aagtaatatc tcatacatgt ttcatgaggg taacaacatg cgactgggtg agcatatgct180ccgctgatgt gatgtgcaag ataaacaagc aagacggaaa ctaacttctt cttcatgtaa240taaacacacc ccgcgtttat ttacctatct ttaaacttca acaccttata tcataactaa300tatttcttga gataagcaca ctgcacccat accttcctta aaagcgtagc ttccagtttt360tggtggttcc ggcttccttc ccgattccgc ccgctaaacg catatttttg ttgcctggtg420gcatttgcaa aatgcataac ctatgcattt aaaagattat gtatgctctt ctgacttttc480gtgtgatgaa gctcgtggaa aaaatgaata atttatgaat ttgagaacaa ttctgtgttg540ttacggtatt ttactatgga ataattaatc aattgaggat tttatgcaaa tatcgtttga600atatttttcc gaccctttga gtacttttct tcataattgc ataatattgt ccgctgcccg660tttttctgtt agacggtgtc ttgatctact tgctatcgtt caacaccacc ttattttcta720actatttttt ttttagctca tttgaatcag cttatggtga tggcacattt ttgcataaac780ctagctgtcc tcgttgaaca taggaaaaaa aaatatataa acaaggctct ttcactctcc840ttgcaatcag atttgggttt gttcccttta ttttcatatt tcttgtcata ttcctttctc900aattattatt ttctactcat aaccacacgc aaaataacac agtcaaatca atcaaagatc960
ccccaattctc 971<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2atatatggat ccgcgtttat ttacctatct c31<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3atatatgaat tctttgattg atttgactgt g31<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4atatatctcg aggccagcta acttcttggt cgac 34<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5atatatgaat tctttgattg atttgactgt g31
<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6aaatttgtcg acaagggtag cctccccata ac 32<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7atatatgtcg acgagaattg ggggatcttt g31<210>8<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8tttaaagtcg actttgattg atttgactgt gttattttgc gtg 4權(quán)利要求
1.表達基因的方法，其包括在存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子，或者宿主生物體生長或發(fā)酵非必需基因的啟動子的控制下將靶基因插入到基因組中。
2.權(quán)利要求1的表達基因的方法，其中啟動子是含有如下序列并具有啟動子活性的DNA，所述序列為由存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子的核苷酸序列，或者由宿主生物體生長或發(fā)酵非必需基因的啟動子的核苷酸序列，通過缺失、替代或添加1到40個核苷酸衍生而成的序列。
3.權(quán)利要求1的表達基因的方法，其中啟動子是能夠在嚴謹條件下與包含如下序列的DNA雜交的，并具有啟動子活性的DNA，所述序列互補于全部或部分的存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子的核苷酸序列或者宿主生物體生長或發(fā)酵非必需基因的啟動子的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1至3中任何一項的表達基因的方法，其中存在自動調(diào)整機制的基因的啟動子是丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子。
5.權(quán)利要求1至3中任何一項的表達基因的方法，其中對生長非必需的基因的啟動子是編碼硫氧還蛋白的基因的啟動子。
6.權(quán)利要求1至5中任何一項的表達基因的方法，其中宿主生物體是細菌、酵母、昆蟲、動物和植物中的任一種。
7.權(quán)利要求6的表達基因的方法，其中酵母屬于酵母屬(Saccharomyces)。
8.包含下列DNA(a)、(b)和(c)中任意一個的啟動子(a)包含SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的DNA，(b)包含由SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列通過缺失、替代或添加1到40個核苷酸所衍生而成的核苷酸序列、并具有啟動子活性的DNA，和(c)能夠在嚴謹條件下與包含互補于全部或部分的SEQ ID NO1所代表的核苷酸序列的序列的DNA雜交、并具有啟動子活性的DNA。
9.重組載體，其含有權(quán)利要求8的啟動子。
10.權(quán)利要求9的重組載體，其中靶基因可操作地與重組載體連接。
11.權(quán)利要求9或10的重組載體，它是質(zhì)粒載體或病毒載體。
12.權(quán)利要求10或11的重組載體，其中靶基因是選自編碼蛋白的核酸或其反義核酸、編碼反義RNA誘餌及核酶的核酸中的任何一種核酸。
13.轉(zhuǎn)化體，它可通過利用權(quán)利要求9至12中任何一項的重組載體轉(zhuǎn)化宿主獲得。
14.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是細菌、酵母、動物、昆蟲或植物。
15.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)化體，其中酵母屬于酵母屬(Saccharomyces)。
16.制備靶基因的表達產(chǎn)物或者由該表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求13至15中任何一項的轉(zhuǎn)化體，并從獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物中回收靶基因的表達產(chǎn)物或者由該表達產(chǎn)物產(chǎn)生的物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用基因工程技術(shù)將基因插入到宿主生物體內(nèi)并表達該基因的方法。本發(fā)明進一步涉及新的啟動子，含有該啟動子和靶基因的重組載體，含有該重組載體的轉(zhuǎn)化體，以及利用該轉(zhuǎn)化體制備有用基因產(chǎn)物或有用物質(zhì)的方法。
文檔編號C12N1/21GK1571838SQ0282080
公開日2005年1月26日 申請日期2002年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月20日
發(fā)明者齋藤聰志, 早乙女理, 保谷典子, 松尾康生, 石田亙廣, 平井正名, 北本勝彥 申請人:豐田自動車株式會社