專利名稱：適配器定向展示系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明處于展示技術(shù)領(lǐng)域。特定地，本發(fā)明涉及用于基因包裝上外源性展示的適配器定向展示系統(tǒng)的產(chǎn)生。本發(fā)明所包含之組合物和方法尤其適用于自多肽的大量清單中來識(shí)別展現(xiàn)期望的特性的個(gè)體。
背景技術(shù)：
在基因包裝(genetic package)表面上的多肽展示代表一種用于在實(shí)驗(yàn)室中執(zhí)行分子進(jìn)化的強(qiáng)大的方法學(xué)。構(gòu)建龐大分子多樣性文庫的能力與選擇具有期望的特性的分子的能力使得此技術(shù)可應(yīng)用于許多問題。噬菌體展示起點(diǎn)的注明日期為二十世紀(jì)中期，當(dāng)時(shí)喬治.史密斯(George Smith)首次在噬菌體M13病毒顆粒的表面上通過將外源性序列融合為噬菌體外殼蛋白質(zhì)(Science(1985)2281315-1317)來顯現(xiàn)蛋白質(zhì)的外源性片段。兩個(gè)創(chuàng)造性概念自史密斯的最初試驗(yàn)中呈現(xiàn)出來。第一，該實(shí)驗(yàn)建議可構(gòu)建多肽的大量多樣性清單，其中個(gè)別噬菌體顆粒展示獨(dú)特多肽。第二，該實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了在表型和基因型之間的直接物理連接。即，展示期望的多肽的噬菌體亦含有對(duì)多肽進(jìn)行編碼的脫氧核糖核酸(DNA)，可迅速地將DNA分離以進(jìn)行隨后的分析。麥卡費(fèi)提(McCafferty)和拉德那(Ladner)將該等概念延伸至多肽的熒幕清單，例如在噬菌體顆粒表面上所展示的單鏈抗體(美國專利第5,969,108號(hào)和第5,837,500號(hào))。其后，噬菌體展示已成為蛋白質(zhì)工程的一種廣泛技術(shù)。
展示系統(tǒng)的范圍已基于喬治.史密斯的發(fā)現(xiàn)得到發(fā)展。該等系統(tǒng)可廣泛分為兩類。第一種產(chǎn)生系統(tǒng)是單載體系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中的載體含有整個(gè)噬菌體基因包裝，其中插入一個(gè)具有外殼蛋白質(zhì)基因的外源性序列框架(in-frame)。因?yàn)樗檬删w顆粒攜帶整個(gè)噬菌體基因包裝，所以其相對(duì)不穩(wěn)定且不易傳染。第二個(gè)產(chǎn)生系統(tǒng)通常指噬菌體中央系統(tǒng)，其具有兩組分(1)攜帶已融合為噬菌體外殼蛋白質(zhì)的外源性序列的噬菌體載體和由噬菌體所獲得的復(fù)制起點(diǎn)，以允許將噬菌體中間部分包裹為噬菌體顆粒；和(2)攜帶所有其它噬菌體包裹所需序列的輔助噬菌體載體。該輔助載體通常為有復(fù)制缺陷的載體，例如由香港商安法瑪亞股份有限公司(Amersham Pharmacia Biotech)所制造的輔助載體和由斯特拉塔根(Stratagen)所生產(chǎn)的其衍生物VCSM13。在以該輔助噬菌體對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行雙重感染(superinfection)時(shí)，可產(chǎn)生新穎包裹噬菌體，該噬菌體攜帶噬菌體載體且展示外源性序列。
同樣地，先前的噬菌體中間系統(tǒng)需要將外源性序列融合為至少一部分噬菌體外表面序列(例如外殼序列)。雖然已報(bào)道了基因VI、VII和IX融合，最常用的融合或展示位點(diǎn)在M13噬菌體的基因HI和VIII中。然而，該等融合系統(tǒng)具有許多明顯的限制。首先的和重要的，外殼蛋白質(zhì)的顯現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞是有毒的，因此必須對(duì)該外殼融合的嚴(yán)格調(diào)控進(jìn)行監(jiān)控。雖然如此，不可避免的促進(jìn)劑(promoter)泄漏可導(dǎo)致具有多樣性文庫的個(gè)體的損失。維持文庫的穩(wěn)定性對(duì)于產(chǎn)生具有至少109組成(complexity)的分子(例如抗原結(jié)合單元)的大量多樣性清單尤其關(guān)鍵。第二，某些外殼蛋白質(zhì)例如基因III產(chǎn)物(pIII)的顯現(xiàn)可提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞可抵抗產(chǎn)生后代噬菌體顆粒所需的輔助噬菌體的感染。第三，包含基因III和基因II噬菌體展示系統(tǒng)的融合格式將插入點(diǎn)限制在該外表面序列的第五端。因此必須將該外源性多肽連接至該外表面蛋白質(zhì)的氨基末端(N-terminus)。從而，含有所有閱讀框的編碼序列片段的cDNA文庫由于內(nèi)部終止碼對(duì)于閱讀框的頻繁破壞而不能由該等融合系統(tǒng)充分展示。此外，由于在融合和正常型外表面蛋白質(zhì)(通常由輔助載體所提供)之間的重組，該融合系統(tǒng)不穩(wěn)定。最后，由于噬菌體中間載體含有至少一部分該外表面序列，因此大的外源性序列由于大載體的低轉(zhuǎn)化效率而不能有效地顯現(xiàn)。然而，轉(zhuǎn)化效率是產(chǎn)生高組合文庫的關(guān)鍵因子。
已經(jīng)描述了對(duì)于融合噬菌體中間系統(tǒng)所做的各種改進(jìn)。WO 91/17271提出構(gòu)建一個(gè)噬菌體展示系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中可經(jīng)由“標(biāo)記(tag)”和“標(biāo)記配位體(tag ligand)”的相互作用來展示該外源性序列。該系統(tǒng)含有攜帶與標(biāo)記序列相結(jié)合的外源性序列的噬菌體染色體組載體。相同的載體攜帶在框架內(nèi)與外殼蛋白質(zhì)基因相融合的標(biāo)記配位體序列。在以該載體來感染宿主細(xì)胞時(shí)，據(jù)推測(cè)將產(chǎn)生可顯現(xiàn)該外源性序列的噬菌體顆粒。然而，WO 91/17271所揭示的內(nèi)容不能提供可使得該總體思路得以進(jìn)行的教導(dǎo)。例如WO 91/17271既不能證實(shí)任一序列已經(jīng)由“標(biāo)記”和“配位體”的相互作用在噬菌體顆粒的表面上得到展示；亦不能證實(shí)該蛋白質(zhì)(若顯現(xiàn))保持生物活性。此外，由于所提出的系統(tǒng)在相同的載體中使用攜帶所有噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因的噬菌體染色體組載體，該系統(tǒng)不可避免地繼承上述所有限制和缺點(diǎn)。
克萊姆(Crameri)等人設(shè)計(jì)了一個(gè)展示cDNA產(chǎn)物的系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中插入臨近該外源性序列的Fos原癌基因(oncogene)以在噬菌體中間載體上展示，且插入臨近在相同的載體(參見克萊姆等人的(1993)Gene 13769-75)上的基因III的Jun原癌基因。將該兩個(gè)融合序列置于兩個(gè)獨(dú)立促進(jìn)劑的控制下?？巳R姆方法開發(fā)了在fos和jun蛋白質(zhì)之間的優(yōu)選相互作用由于該Fos外源性多肽已經(jīng)顯現(xiàn)且分泌于該胞質(zhì)間間隙(periplasmic space)中，其形成與pIII-Jun的絡(luò)合物(complex)，在以M13KO7輔助噬菌體來產(chǎn)生雙重感染時(shí)，則將該絡(luò)合物包裹于該噬菌體顆粒中。盡管在此系統(tǒng)中的該外源性序列未直接與外表面序列連接，在相同載體的獨(dú)立促進(jìn)劑下該噬菌體外殼蛋白質(zhì)pIII的組成性表達(dá)仍導(dǎo)致對(duì)于宿主細(xì)胞的實(shí)質(zhì)毒性。
與克萊姆系統(tǒng)相似的另一變體(variant)為在WO 01/05950中所述的半胱氨酸偶合性(cysteine-coupled)展示系統(tǒng)。通過在兩種半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵來調(diào)節(jié)(mediate)該外源性多肽的附著和展示，其中一種殘基包含在該外源性序列中且另一種插入于該外表面序列中。在WO 01/05950中所述的單載體系統(tǒng)攜帶兩個(gè)獨(dú)立的由促進(jìn)劑控制的表達(dá)盒(expression cassette)一個(gè)表達(dá)盒顯現(xiàn)該外源性序列，且另一個(gè)顯現(xiàn)該外殼蛋白質(zhì)pIII。在WO 01/05950中所述的雙載體系統(tǒng)包含攜帶一個(gè)外源性序列的噬菌體中間載體和顯現(xiàn)該外殼蛋白質(zhì)pIII的質(zhì)粒(plasmid)。該兩種載體用于相互轉(zhuǎn)染(co-transfect)大腸桿菌細(xì)胞。在以該輔助噬菌體M13KO7來產(chǎn)生雙重感染時(shí)，將該噬菌體中間和/或該質(zhì)粒包裹于所得噬菌體顆粒中。盡管此系統(tǒng)避免了包含連接至外表面蛋白質(zhì)的外源性蛋白質(zhì)的融合表達(dá)，由于該外殼蛋白質(zhì)pIII在該單載體或該雙載體系統(tǒng)中的組成性表達(dá)，該系統(tǒng)仍未能使外殼蛋白質(zhì)對(duì)于宿主細(xì)胞的毒性降至最小。此外，在WO 01/05950中所述的雙載體系統(tǒng)不可避免地產(chǎn)生攜帶外表面序列的具有錯(cuò)包裹(mispackaged)載體的噬菌體顆粒，且在產(chǎn)生該輔助噬菌體的感染時(shí)未產(chǎn)生該外源性基因。錯(cuò)包裹是眾所周知的與雙載體系統(tǒng)相關(guān)的問題。已表明該丸劑-補(bǔ)充(pill-supplementing)質(zhì)粒載體已錯(cuò)包裹于輔助噬菌體顆粒中(羅托(Rondot) 等人的(2000)Nature 1975-78)。
最終，上述先前噬菌體展示系統(tǒng)與其它展示系統(tǒng)(例如細(xì)菌展示系統(tǒng))不一致。為了直接在細(xì)菌細(xì)胞上呈現(xiàn)相同的噬菌體-展示外源性序列，必須首先將該外源性序列次亞克隆(subclone)于細(xì)菌展示載體中。
因此，仍然相當(dāng)需要用于基因包裝上外源性展示的改性組合物和方法。理想的系統(tǒng)將避免先前所報(bào)道系統(tǒng)的缺點(diǎn)。本發(fā)明滿足了該等需要且同樣提供了相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要方面是使多肽展示不經(jīng)由肽鍵(peptide bond)來連接至基因包裝的任何外表面序列的系統(tǒng)設(shè)計(jì)。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了史無前例的對(duì)于基因包裝(例如噬菌體顆粒)上具有期望的特性蛋白質(zhì)的顯現(xiàn)和/或選擇的適應(yīng)性(flexibility)。該噬菌體-展示系統(tǒng)的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)得以增加。首先，該系統(tǒng)避免了與該外表面蛋白質(zhì)通過該表達(dá)載體的表達(dá)相關(guān)的所有缺點(diǎn)。如上所述，該等缺點(diǎn)包括(1)由于該外表面序列的組成性表達(dá)而產(chǎn)生的對(duì)于該宿主細(xì)胞的高毒性；(2)宿主細(xì)胞對(duì)于產(chǎn)生后代噬菌體顆粒所需輔助噬菌體的感染的抵抗性；(3)由于氨基末端融合產(chǎn)物的單向性(unidirectional)展示而產(chǎn)生的對(duì)于待展示蛋白質(zhì)的定向(orientation)限制；和(4)由于在該融合外表面序列和通常由輔助載體來提供的該正常型外表面序列之間的重組所產(chǎn)生的該融合產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。第二，該系統(tǒng)排除了攜帶該外表面序列的錯(cuò)包裹質(zhì)粒的可能性，但未排除待亞克隆的基因；該等質(zhì)粒是用于WO 01/05950所述的雙載體系統(tǒng)中。盡管避免了先前展示系統(tǒng)的該等和其它固有缺點(diǎn)，本系統(tǒng)進(jìn)一步提供了對(duì)于每個(gè)基因包裝呈現(xiàn)多肽的一個(gè)復(fù)制(copy)(單價(jià)展示)或多個(gè)復(fù)制(多價(jià)展示)的適應(yīng)性?；诙嚯呐c所特別關(guān)心分子的結(jié)合能力，本系統(tǒng)尤其適用于顯現(xiàn)和篩選(screening)多肽(例如抗原結(jié)合單元)的大量多樣性清單。由本系統(tǒng)所展示的多肽是功能性的。
因此，本發(fā)明提供用于在基因包裝的外表面上展示外源性多肽的適配器定向展示系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含(a)包含可對(duì)在框架內(nèi)融合為第一適配器序列的外源性多肽進(jìn)行編碼的編碼序列的表達(dá)載體，其中該載體缺乏對(duì)基因包裝的任何功能性外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的外表面序列；(b)包含對(duì)包裹基因包裝所必需的外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的外表面序列的輔助載體，其中至少一個(gè)外表面蛋白質(zhì)在框架內(nèi)融合為第二適配器，在合適的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽時(shí)，第一和第二適配器產(chǎn)生作用以經(jīng)由第一和第二適配器之間的成對(duì)相互作用來引起多肽展示。
所使用的基因包裝可以是病毒、細(xì)胞和孢子。在一具體實(shí)施例中，本系統(tǒng)是噬菌體展示系統(tǒng)。該外表面序列對(duì)噬菌體的功能性外殼蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。該優(yōu)選外表面序列對(duì)噬菌體(例如絲狀噬菌體)的功能性外殼蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。優(yōu)選外表面序列選自絲狀噬菌體的基因III、基因VI、基因VII、基因VIII和基因IX。
在本系統(tǒng)的另一具體實(shí)施例中是一細(xì)菌展示系統(tǒng)。不在表達(dá)載體中卻在細(xì)菌輔助載體中的該外表面序列對(duì)細(xì)菌外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。優(yōu)選外表面蛋白質(zhì)選自Lpp-OmpA、TraT、Pal、Oprl、Inp和AIDA-I。
用于構(gòu)建本展示系統(tǒng)的第一和第二適配器可以是同源二聚(homodimerization)序列或異源二聚(heterodimerization)序列。優(yōu)選同源二聚序列是能夠形成二硫鍵的兩種成對(duì)半胱氨酸殘基。優(yōu)選異源二聚序列包括在生理緩沖條件下和/或生理機(jī)體溫度下基本上不能形成同源二聚體的序列，例如由異源二聚體受體GABAB受體1和2所衍生的序列。其它優(yōu)選適配器可采用卷曲螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明亦提供用于在基因包裝的外表面上展示多肽的輔助載體。該載體包含包裹該基因包裝所必需的外表面序列，其中至少一個(gè)該表面呈現(xiàn)序列在框架內(nèi)融合為適配器，在合適的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽時(shí)，該適配器產(chǎn)生作用以引起多肽展示。一方面，該輔助載體是細(xì)菌輔助載體(參看例如圖26)。另一方面，該輔助載體是噬菌體輔助載體(本文亦稱作“超輔助噬菌體載體”)。優(yōu)選噬菌體輔助載體包括(但不限于)圖5A所示的GM-輔助噬菌體載體、圖13A所示的CM-超輔助噬菌體載體和圖19A所示的GMCT-超輔助噬菌體載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于在基因包裝中或其外表面上產(chǎn)生多肽的表達(dá)載體。該表達(dá)載體包含可對(duì)在框架內(nèi)融合為第一適配器的多肽進(jìn)行編碼的編碼序列，其中該載體缺乏可對(duì)該基因包裝的任何功能性外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的外表面序列，且在基因包裝外表面上的多肽展示是經(jīng)由第一適配器和第二適配器之間的非共價(jià)成對(duì)相互作用來調(diào)節(jié)，其中第二適配器融合為外表面序列。一方面，該表達(dá)載體是噬菌體中間。該噬菌體展示系統(tǒng)的說明性噬菌體中間是圖9A中所示的pABMX14、圖15A中所示的pABMX15和圖25A中所示的pAMBX22。
本發(fā)明亦包括試劑盒和該系統(tǒng)的個(gè)別組分，該試劑盒包含該適配器定向展示系統(tǒng)且該系統(tǒng)包括表達(dá)和輔助載體。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含該載體的宿主細(xì)胞。
在一獨(dú)立具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供可在其外表面(external surface)上展示融合多肽的基因包裝。該融合多肽包含一待展示且在框架內(nèi)與第一適配器融合的多肽序列，在合適的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生該融合多肽時(shí)，第一適配器產(chǎn)生作用以經(jīng)由在第一適配器和連接至外表面蛋白質(zhì)的第二適配器之間的非共價(jià)成對(duì)相互作用來促成該融合多肽的展示。該基因包裝可以是病毒、細(xì)胞和孢子。
在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一個(gè)包含許多基因包裝的選擇性文庫，至少一個(gè)基因包裝如上所述。
在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種通過使本適配器定向展示系統(tǒng)在合適的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄(transcribe)且轉(zhuǎn)譯(translate)來展示基因包裝外表面上的多肽的方法。本發(fā)明所產(chǎn)生的選擇性文庫亦涵蓋于本發(fā)明。
本發(fā)明進(jìn)一步提供探測(cè)在測(cè)試劑(test agent)和在基因包裝上所展示的外源性多肽之間的特定相互作用的存在的方法。該方法包含下述步驟(a)提供通過上述方法所制備的可展示外源性多肽的基因包裝；(b)在適于產(chǎn)生穩(wěn)定多肽-試劑(polypeptide-agent)絡(luò)合物的條件下使該基因包裝與該測(cè)試劑相接觸；和(c)探測(cè)該穩(wěn)定多肽-試劑絡(luò)合物在基因包裝上的形成，從而探測(cè)特定相互作用的存在。一方面，該外源性多肽選自抗原結(jié)合多肽、細(xì)胞表面受體、受體配位體、細(xì)胞固定蛋白質(zhì)(cytosolic protein)、分泌性蛋白質(zhì)(secreted protein)和核蛋白質(zhì)(nuclear protein)。一優(yōu)選方面，該外源性多肽是抗原-結(jié)合單元。該測(cè)試劑可以由蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類和其組合構(gòu)成。優(yōu)選測(cè)試劑是抗原或配位體。
最后，本發(fā)明提供獲得具有期望的特性的多肽的方法。該方法包含(a)提供由本發(fā)明方法所制作的選擇性文庫；和(b)篩選該選擇性文庫以獲得至少一個(gè)展示具有期望的特性的多肽的基因包裝。一方面，期望的特性是與所關(guān)心試劑的結(jié)合特性。另一方面，該步驟(若篩選該選擇性文庫)進(jìn)一步包含將展示具有期望的特性的多肽的基因包裝分離。該步驟可進(jìn)一步包括由對(duì)具有期望的特性的多肽進(jìn)行編碼的基因包裝獲得核苷酸序列。具有期望的特性的多肽可以是下述類型蛋白質(zhì)中的一種抗原結(jié)合單元、細(xì)胞表面受體、受體配位體、細(xì)胞固定蛋白質(zhì)、分泌性蛋白質(zhì)和核蛋白質(zhì)。
本文所用縮寫的說明1.Nsc非單一鏈(Non-single chain)2.Sc單鏈(Sing-chain)3.Abu抗原-結(jié)合單元4.Abus(多個(gè))抗原-結(jié)合單元4.L chain輕鏈5.H chain重鏈6.VL輕鏈可變區(qū)7.VH重鏈可變區(qū)


圖1是本適配器定向展示系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。所述展示系統(tǒng)不僅允許可溶外源性多肽在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)，而且容許該外源性序列在基因包裝外表面上的展示。該系統(tǒng)具有兩種組分表達(dá)載體和輔助載體。該表達(dá)載體僅在宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)菌)中的引入導(dǎo)致了在由適配器在框架內(nèi)融合(指定“適配器1”，參看圖1的中央面板)的該外源性多肽的細(xì)菌周質(zhì)(bacterial periplasm)中的表達(dá)和分泌。由輔助噬菌體載體對(duì)細(xì)菌細(xì)胞所造成的雙重感染允許經(jīng)由第一和第二適配器之間的成對(duì)相互作用來在該噬菌體顆粒上展示該外源性多肽，該輔助噬菌體載體攜帶由第二適配器(指定“適配器2”，參看左面板)在框架內(nèi)融合的噬菌體外表面序列。可將多樣性DNA序列插入此表達(dá)載體中以構(gòu)建一個(gè)表達(dá)文庫。輔助噬菌體的雙重感染產(chǎn)生多樣性噬菌體展示文庫。同樣地，由包裹輔助細(xì)菌載體的該噬菌體中間顆粒對(duì)該細(xì)菌細(xì)胞所造成的感染，允許經(jīng)由第一和第二適配器之間的成對(duì)相互作用在細(xì)菌上展示該外源性多肽，該輔助細(xì)菌載體攜帶由第二適配器(指定“適配器2”，參看右面板)在框架內(nèi)融合的細(xì)菌外表面序列?？捎妙愃频姆绞絹順?gòu)建選擇性細(xì)菌展示文庫。
圖2展示由噬菌體ELISA來篩選抗卡那霉素、KO7kpn輔助噬菌體陽性克隆的結(jié)果。對(duì)48個(gè)復(fù)制體進(jìn)行篩選以用于噬菌體繁殖。C2、B3、B7、B9、A12代表KO7kpn輔助噬菌體陽性克隆。FL和F2代表親本(parent)M13KO7噬菌體的兩個(gè)陽性控制。
圖3是該KO7kpn輔助噬菌體載體的示意圖。圖3B描述在輔助性噬菌體載體中所獲得的該基因III引導(dǎo)序列(leader sequence)的核苷酸和氨基酸序列。在該引導(dǎo)序列的下游引入一個(gè)KpnI限制性位點(diǎn)，而不改變基因III的編碼區(qū)。
圖4是載體pABMC6的示意圖。該載體含有KpnI位點(diǎn)、局部基因HI引導(dǎo)序列、GR2編碼序列和置于基因III序列5′的Myc-標(biāo)記。
圖5A是GM-超輔助噬菌體的示意圖。圖5B描述跨越KpnI位點(diǎn)和BgIII位點(diǎn)的片段的核苷酸和氨基酸序列。圖5C描述在GR2-Myc區(qū)域中的胰蛋白酶剪切位點(diǎn)(cleavage site)(Tryp)。
圖6是噬菌體外殼蛋白質(zhì)的抗Myc(anti-Myc)免疫印跡(免疫印跡)的復(fù)制(reproduction)。結(jié)果指示了GM-超輔助噬菌體顆粒的組合(assembly)。線(Lane)1和7代表在kDa中的分子量標(biāo)志(marker)。線2-5展示GM-超輔助噬菌體的四個(gè)復(fù)制體，該輔助噬菌體顯現(xiàn)該GR2-Myc-pIII融合。不攜帶該GR2-Myc-pIH融合序列的線6展示M13KO7輔助噬菌體的陰性控制。
圖7描述ELISA分析結(jié)果，其是應(yīng)用抗Myc抗體來探測(cè)組裝于GM-超輔助噬菌體顆粒中的GR2-Myc-pIII融合蛋白質(zhì)。對(duì)圖6中所示的噬菌體克隆6、18和20進(jìn)行測(cè)試。所包含KO7輔助噬菌體是陰性控制。
圖8描述ELISA分析結(jié)果，其是應(yīng)用抗Myc抗體來證實(shí)來自于超輔助噬菌體的GR2-Myc區(qū)域應(yīng)用增加劑量的胰蛋白酶所進(jìn)行的成功剪切。M13KO7輔助噬菌體起到陰性控制的作用。
圖9A是載體pABMX14的示意圖。圖9B展示pABMX14的完整核苷酸序列。該載體含有用于抗生素選擇(AMP)的氨芐青霉素抗藥性(ampicillin-resistance)基因、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(replication origin)(ColE1 ori)、f1噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)和推動(dòng)下游序列plac-RBS-pelB-GR1-DH(HA和6xHis標(biāo)記)表達(dá)的lac促進(jìn)劑/lac O1。該NcoI/XbaI或NcoI/NotI或XbaI/NotI限制位點(diǎn)可用于插入外源性序列以在細(xì)菌細(xì)胞中展示或產(chǎn)生可溶性蛋白質(zhì)。
圖10描述噬菌體結(jié)合分析結(jié)果，其中在以GM-超輔助噬菌體或M13KO7輔助噬菌體對(duì)細(xì)菌TG1細(xì)胞產(chǎn)生雙重感染時(shí)可產(chǎn)生噬菌體顆粒。細(xì)菌TG1細(xì)胞含有用于scFv適配器(scFv-adapter)1融合的表達(dá)的pABMX14-Aml噬菌體中間載體。與各自抗原相結(jié)合的劑量依賴(dose-dependent)噬菌體僅在發(fā)生GM-超輔助噬菌體的感染而不是陰性控制M13KO7噬菌體的感染時(shí)才可以觀察到。結(jié)果證實(shí)功能性scFv在噬菌體顆粒上應(yīng)用pABMX14噬菌體中間和GM-超輔助噬菌體載體所產(chǎn)生的展示。
圖11中左面板是噬菌體外殼蛋白質(zhì)的抗Myc免疫印跡的復(fù)制。線1代表7陰性控制，其中該噬菌體顆粒在含有由M13KO7輔助噬菌體來雙重感染的噬菌體中間載體pABMX14-Aml的TG1細(xì)胞中產(chǎn)生。線2代表由噬菌體中間pABMX14-Aml載體和GM-超輔助噬菌體載體所產(chǎn)生的噬菌體顆粒?？商綔y(cè)到該外源性序列scFv。線3代表陰性控制，其中僅使用GM-超輔助噬菌體載體?？筂yc抗體僅在線2中探測(cè)到一個(gè)經(jīng)由GR1與GR2的成對(duì)相互作用所形成的與該scFv-GR1-DH/GR2-Myc-pIII絡(luò)合物一致的帶(band)。與線2中的游離GR2-Myc-pIII相比，可展示近似兩倍(twice as much)的scFv-GR1-DH/GR2-Myc-pin絡(luò)合物。此預(yù)示每個(gè)噬菌體顆粒平均攜帶該scFv-GR1融合的多個(gè)復(fù)制。在線3中探測(cè)到一個(gè)與二聚pIII-Myc-GR2一致的帶。pIII-Myc-GR2二聚體的形成是由于在該GABAB受體2適配器序列下游引入的一對(duì)半胱氨酸殘基(the pair of cysteine residues)。GABAB受體2適配器序列本身缺乏在生理機(jī)體溫度和/或生理緩沖條件下(Kammerer等人(1999)，『生物化學(xué)』(Biochemistry)3813263-13269)形成同源二聚體的傾向。
在以抗HA抗體(參看圖11的右面板)再次探查相同印跡(blot)時(shí)，由線2中的抗HA抗體探測(cè)到一個(gè)與該scFv-GR1-DH/GR2-Myc-pIII絡(luò)合物一致的帶。此確認(rèn)了在發(fā)生GM-超輔助噬菌體的雙重感染時(shí)所產(chǎn)生的scFv-GR1-DH融合的展示。
圖12是載體pABMC13的示意圖。該載體含有一個(gè)包含局部gIII引導(dǎo)序列的DNA片段，該片段具有KpnI位點(diǎn)、Ala-Cys-Gly-Gly編碼序列和置于基因III的5′的Myc-標(biāo)記。
圖13A是CM-超輔助噬菌體載體的示意圖。圖13B描述跨越KpnI位點(diǎn)和BgIII位點(diǎn)的片段的核苷酸和氨基酸序列。該載體含有一個(gè)對(duì)Ala-Cys-Gly-Gly進(jìn)行編碼的核苷酸序列，Ala-Cys-Gly-Gly是由置于基因III的5′的Myc-標(biāo)記來融合。此外，該載體包含由基因HI引導(dǎo)序列和該Cys-Myc編碼區(qū)在側(cè)面相接的琥珀終止碼(amber stop codon)。琥珀密碼子的引入允許噬菌體僅在抑制菌株(suppressor bacterial strain)中產(chǎn)生。
圖14描述ELISA分析結(jié)果，其是應(yīng)用抗Myc抗體來探測(cè)組裝于該CM-超輔助噬菌體顆粒中的Cys-Myc-pIII融合。線1代表陰性控制M13KO7輔助噬菌體。線2-6代表CM-超輔助噬菌體的五個(gè)復(fù)制體。線7代表陽性控制GM-超輔助噬菌體。
圖15A是載體pABMX15的示意圖。圖15B展示pABMX15的完整核苷酸序列。該載體含有用于噬菌體選擇(AMP)的氨芐青霉素抗藥性基因、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(ColE1 ori)、f1噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)和推動(dòng)下游序列plac-RBS-pelB-HA-Cys的表達(dá)的lac促進(jìn)劑/lac O1。該NcoI/XbaI或NcoI/NotI或XbaI/NotI限制位點(diǎn)可用于插入外源性序列以在細(xì)菌細(xì)胞中展示或產(chǎn)生可溶性蛋白質(zhì)。
圖16描述噬菌體結(jié)合分析結(jié)果，其中在以CM-超輔助噬菌體或M13KO7(亦表示“KO7”)輔助噬菌體對(duì)細(xì)菌TG1細(xì)胞產(chǎn)生雙重感染時(shí)可產(chǎn)生噬菌體顆粒。細(xì)菌TG1細(xì)胞含有用于scFv-HA-Cys融合的表達(dá)的pABMX15-Aml噬菌體中間載體。結(jié)果證實(shí)了功能性scFv在噬菌體顆粒上應(yīng)用pABMX15噬菌體中間和CM-超輔助噬菌體載體所產(chǎn)生的展示。在線3-6中所示的1至100感染復(fù)數(shù)(MIO)范圍內(nèi)的scFv展示水平無顯著變化。線1和2代表KO7輔助噬菌體的兩個(gè)陰性控制。如線2所示，在采用陰性控制M13KO7輔助噬菌體時(shí)不能探測(cè)到scFv-HA-Cys。
圖17中左面板是噬菌體外殼蛋白質(zhì)的抗Myc免疫印跡的復(fù)制。線1代表陰性控制，其中僅采用KO7噬菌體。線2代表陰性控制，其中僅應(yīng)用CM-超輔助噬菌體載體。線3代表陰性控制，其中在以KO7來產(chǎn)生雙重感染時(shí)不能探測(cè)到通過噬菌體中間pABMX15所顯現(xiàn)的scFv-HA-Cys融合。線4代表噬菌體克隆，其中在以CM-超輔助噬菌體載體來產(chǎn)生雙重感染時(shí)可成功展示通過噬菌體中間pABMX15所顯現(xiàn)的scFv-HA-Cys融合。抗Myc抗體僅在線4中可探測(cè)到一個(gè)經(jīng)由成對(duì)(paring)半胱氨酸的成對(duì)相互作用所形成的與scFv-HA-S-S-Myc-pIII絡(luò)合物一致的帶。此結(jié)果指出scFv-HA-Cys的展示僅在該噬菌體中間是通過CM-超輔助噬菌體而不是M13KO7噬菌體來保護(hù)時(shí)才發(fā)生。由于在兩種半胱氨酸殘基之間建立的在pIII序列的5′終端所引入的二硫鍵，所以可在線2和線4中探測(cè)到pIII-Myc二聚體。
在以抗HA抗體(參看圖17的右面板)再次探查相同的印跡時(shí)，可由在線4而不是控制線(control lane)1-3中的抗HA抗體探測(cè)到一個(gè)與該scFv-HA-S-S-Myc-pIII絡(luò)合物一致的帶。此確認(rèn)了在產(chǎn)生GM-超輔助噬菌體保護(hù)時(shí)所引起的scFv-HA-S融合的展示。
圖18是載體pABMC12的示意圖。除載體pABMC6的核苷酸序列外，載體pABMC12含有包含編碼序列的DNA片段(用于可融合為GR2-Myc編碼序列的基因III的C-末端部分)和與序列(RBS)-OmpA引導(dǎo)序列(可融合為基因III序列)相結(jié)合的核糖體。
圖19A是GMCT-超輔助噬菌體載體的示意圖。圖19B描述跨越KpnI位點(diǎn)和BgIII位點(diǎn)的片段的核苷酸和氨基酸序列。該載體含有對(duì)KO7kpn噬菌體載體中的工程基因HI(融合為適配器GR2)的另外復(fù)制進(jìn)行編碼的核苷酸序列和結(jié)合了序列-OmpA引導(dǎo)序列(與KO7基因HI序列相臨近)的核糖體。
圖20描述噬菌體結(jié)合分析結(jié)果，其中在以GMCT-超輔助噬菌體或控制M13KO7輔助噬菌體對(duì)細(xì)菌TG1細(xì)胞產(chǎn)生雙重感染時(shí)可產(chǎn)生噬菌體顆粒。該TG1細(xì)胞含有用于scFv-GR1-DH融合的表達(dá)的pABMX14-Aml噬菌體中間載體。結(jié)果證實(shí)了功能性scFv應(yīng)用pABMX14噬菌體中間和該GMCT-超輔助噬菌體載體(線2-5)在噬菌體顆粒上所產(chǎn)生的展示。在1至100感染復(fù)數(shù)(MIO)范圍內(nèi)scFv展示水平無顯著變化。線1代表陰性控制，其中在發(fā)生KO7輔助噬菌體的雙重感染時(shí)不能展示scFv。
圖21中左面板是噬菌體外殼蛋白質(zhì)的抗Myc免疫印跡的復(fù)制。線1代表陰性控制，其中僅應(yīng)用KO7噬菌體來保護(hù)pABMX14噬菌體中間。線2代表噬菌體克隆，其中在以GMCT-超輔助噬菌體載體來產(chǎn)生雙重感染時(shí)可成功展示由噬菌體中間pABMX14所顯現(xiàn)的scFv抗體。線3代表另一陰性控制，其中僅應(yīng)用GMCT-超輔助噬菌體。抗Myc抗體僅在線2中可探測(cè)到一個(gè)經(jīng)由GR1和GR2的成對(duì)相互作用所形成的與該scFv-GR1/GR2-Myc-CT(HI)絡(luò)合物一致的帶。此結(jié)果指出scFv-GR1的展示僅在該噬菌體中間是由GMCT-超輔助噬菌體而不是由KO7輔助噬菌體來保護(hù)時(shí)才發(fā)生。
在以抗HA抗體(參看圖21的右面板)再次探查相同的印跡時(shí)，可由在線2而不是控制線1或3中的抗HA抗體探測(cè)到與該scFv-GR1/GR2-Myc-CT(III)絡(luò)合物一致的帶。此確認(rèn)了在產(chǎn)生GMCT-超輔助噬菌體的保護(hù)時(shí)所引起的scFv-HA-S融合的展示。
圖22A描述載體pABMD1和pABMD2的示意圖。圖22B描述跨越lac促進(jìn)劑/lac O1和SalI位點(diǎn)的核苷酸和氨基酸序列。
圖23描述GABAB受體1和2的C-末端序列。通過在該序列的C-末端添加“ValGlyGlyCys”間隔(spacer)來引入外源性半胱氨酸殘基。
圖24是描述各種抗原結(jié)合單元的示意圖。
圖25A是細(xì)菌表達(dá)載體pABMX22的示意圖。圖25B描述pABMX22的完整核苷酸序列。該載體含有用于噬菌體選擇(AMP)的氨芐青霉素抗藥性基因、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(ColE1 ori)、f1噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)和推動(dòng)下游序列plac-RBS-p8L-GR1-HA的表達(dá)的lac促進(jìn)劑/lac O1。該MluI/XbaI或MluI/NotI或XbaI/NotI限制位點(diǎn)可用于插入外源性序列以在細(xì)菌細(xì)胞上展示。
圖26A是細(xì)菌輔助載體pABMbd-1的示意圖。圖26B描述pABMbd-1的完整核苷酸序列。該載體含有用于噬菌體選擇(Cam)的氯霉素抗藥性基因、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(ColE1 ori)、f1噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)和推動(dòng)下游序列plac-RBS-pelB-Lpp-0mpA-GR2的表達(dá)的lac促進(jìn)劑/lac O1。
圖27描述由隨機(jī)選自于最終淘篩的個(gè)別克隆所產(chǎn)生的AM3噬菌體ELISA結(jié)果。每個(gè)條代表一個(gè)特別AM3變體在OD405處的讀數(shù)(reading)。位置A13和A14分別為陰性控制和陽性控制。
圖28描述由Ni-NTA柱所產(chǎn)生的AM3 scFv凈化結(jié)果。在10％SDS-PAGE凝膠上對(duì)沖洗片段的25ul等分試樣進(jìn)行分析，并且隨后產(chǎn)生庫馬西藍(lán)變(Coomassie blue stain)。M蛋白質(zhì)標(biāo)記；1WT克隆#1的片斷#2；2WT克隆#1的片斷#3；3WT克隆#2的片斷#2；4WT克隆#2的片斷#3。
圖29描述AM3 scFv抗體應(yīng)用凝膠過濾色譜法的凈化結(jié)果。應(yīng)用休珀代克斯(Superdex)75柱將由Ni-NTA所凈化的scFv抗體(Ni-NTA purified scFvantibody)進(jìn)行色譜分離。如圖所示，將單體scFv自混合物中的蛋白質(zhì)剩余部分中分離出來。
圖30描述與應(yīng)用生物傳感器(BiaCore)的正常型AM2相比的該AM3變體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析。Sensorgram展示所有的4個(gè)AM3變體，該等變體具有相對(duì)于野生型(wild type)顯著較低的離解速率和較高的結(jié)合親和力。該曲線的斜率表示所選擇的抗體與(初相)的組合和自抗原(末期相)中的分離有多快。
具體實(shí)施例方式
本揭示內(nèi)容以辨識(shí)引用的方式引用各種出版物、專利和已出版的專利說明書。因此，該等出版物、專利和已出版專利說明書的揭示內(nèi)容以引用的方式并入本揭示內(nèi)容。
普通技術(shù)除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)踐將采用在本技術(shù)的技能中的免疫學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、染色體組和重組體DNA的傳統(tǒng)技術(shù)。參看例如『肽和蛋白質(zhì)的噬菌體展示』(PHAGE DISPLAY OFPEPTIDES AND PROTEINS)(B.K.Kay等人，1996)；『噬菌體展示實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)』(PHAGE DISPLAY，A LABORATORY MANUAL)(C.F.Barbas III等人，2001)；(薩姆布魯克(Sambrook)、弗瑞特斯(Fritsch)和瑪尼阿蒂斯(Maniatis))，『分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)』(MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL)，第2版(1989)；CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人eds.，(1987))；the series METHODS INENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)PCR 2A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson、B.D.Hames和G.R.Taylor eds.(1995))，Harlow和Lane，eds.(1988)ANTIBODIES，ALABORATORY MANUAL和ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney，ed.(1987))。
除非上下文明確指出其它方面，本說明書和權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一(a)”、“一個(gè)(an)”和“該(the)”包含復(fù)數(shù)引用。例如，術(shù)語“一種細(xì)胞(a cell)”可包含許多細(xì)胞及其混合物。
定義術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可交替使用來表示任一長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。該聚合物可以是直鏈、環(huán)狀或分支的，其可包含改性(modified)氨基酸并且可以由非氨基酸中斷。該術(shù)語亦涵蓋已改性的氨基酸聚合物，該等+聚合物已經(jīng)由例如硫酸化作用、糖基化作用、脂化作用、乙?；饔谩⒘姿峄饔?phosphorylation)、碘化作用、甲基化作用、氧化作用、蛋白水解過程、磷酸化作用(phosphorylation)、異戊二烯基化作用(prenylation)、外消旋作用、硒基化作用(selenoylation)、氨基酸的轉(zhuǎn)移核糖核酸(transfer-RNA)調(diào)節(jié)附加物為蛋白質(zhì)(例如精氨?；饔?arginylation)、泛醌化(ubiquitination))或其它任何操作，例如與標(biāo)記組分的結(jié)合作用。本文所用的術(shù)語“氨基酸”指天然的和/或非天然的或合成氨基酸，其包含甘氨酸和D或L光學(xué)異構(gòu)體和氨基酸類似物和多肽模擬物(peptidomimetics)。
由指定蛋白質(zhì)“獲得”的多肽或氨基酸序列表示該多肽的起點(diǎn)。較佳地，該多肽具有實(shí)質(zhì)上與在該序列中編碼的多肽的序列相同的氨基酸序列或其部分，或可在免疫學(xué)上采用在該序列中編碼的多肽來確認(rèn)的序列，其中該部分由至少10-20個(gè)氨基酸(較佳地由至少20-30個(gè)氨基酸，更佳地由至少30-50個(gè)氨基酸)組成。此術(shù)語亦包含由指定核酸序列來顯現(xiàn)的多肽。
與自然界中存在蛋白質(zhì)相比，“嵌合”蛋白質(zhì)含有至少一個(gè)包含該序列中不同位置處的區(qū)域的融合多肽。該等區(qū)域通常可存在于個(gè)別蛋白質(zhì)中并且在該融合多肽中集合；或其通?？纱嬖谟谙嗤鞍踪|(zhì)中但位于該融合多肽中的新穎裝置中?？赏ㄟ^例如化學(xué)合成或創(chuàng)造并翻譯多核苷酸(其中肽區(qū)域是以期望的關(guān)系來編碼)來制造嵌合蛋白質(zhì)。
本文所用的“多元體蛋白質(zhì)”表示含有多個(gè)獨(dú)立多肽的球形蛋白質(zhì)或相互結(jié)合以形成體外或體內(nèi)單一球形蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)鏈。該多元體蛋白質(zhì)可由多個(gè)相同類型的多肽組成以形成“異源多聚體”?；蛘撸摱嘣w蛋白質(zhì)可由多個(gè)不同序列的多肽組成以形成“異源多聚體”。因此，“異源多聚體”是包含至少一個(gè)第一多肽和第二多肽的分子，其中該第二多肽由于至少一種氨基酸殘基而與第一多肽不同。該異源多聚體可包含由第一和第二多肽所形成的“異源二聚體”或可形成較高次序第三結(jié)構(gòu)(其中存在多于兩個(gè)多肽)。用于該異源多聚體的示范性結(jié)構(gòu)包含異源二聚體(例如Fv和Fab片段、聯(lián)體、GABAB受體1和2絡(luò)合物)、三聚G-蛋白質(zhì)、異源四聚物(例如F(ab′)2片段)和其它寡聚結(jié)構(gòu)。
“配位體”表示可由受體的該配位體-結(jié)合區(qū)域來限制的分子。該分子可在化學(xué)上合成或可存在于自然界。
“激動(dòng)劑”是可刺激信號(hào)分子例如受體的生物活性的分子。
“拮抗劑”是可限制受體的生物活性的分子。
通過“成對(duì)相互作用”是指兩個(gè)適配器可相互作用并結(jié)合以形成穩(wěn)定絡(luò)合物。該穩(wěn)定絡(luò)合物必須足夠長(zhǎng)期以允許在基因包裝的外表面上包裹多肽。該絡(luò)合物或二聚體必須能夠經(jīng)受在形成瞬間和探測(cè)該展示多肽的瞬間之間存在或引入的任何條件，該等條件是所執(zhí)行的分析或反應(yīng)的函數(shù)。
“單價(jià)展示”表示每個(gè)基因包裝的外源性多肽的單一復(fù)制的表達(dá)。在單價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)中，噬菌體顆粒的集合平均為每個(gè)噬菌體顆粒攜帶零至一個(gè)外源性多肽。相反，“多價(jià)展示”表示每個(gè)基因包裝的該外源性多肽的多個(gè)復(fù)制的表達(dá)。因此，在多價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)中，噬菌體顆粒的集合平均攜帶多個(gè)外源性多肽。
本文所用的術(shù)語“抗體”表示免疫球蛋白分子和其免疫活性部分，例如含有可特定地與抗原結(jié)合(“發(fā)生免疫反應(yīng)”)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。在結(jié)構(gòu)上，自然存在的最簡(jiǎn)單抗原(例如IgG)含有由二硫鍵相互連接的四個(gè)多肽鏈、兩個(gè)重(H)鏈和兩個(gè)輕(L)鏈。該免疫球蛋白代表一大系列含有多種分子類型的分子，例如IgD、IgG、IgA、IgM和IgE。該術(shù)語“免疫球蛋白分子”包含(例如)融合抗體或已改變的抗體和其片斷。已展示出抗體的抗原結(jié)合功能可由自然存在抗體的片斷來執(zhí)行。該等片斷被共同稱作“抗原結(jié)合單元”(“抗原結(jié)合單元”)?；谄浞肿咏Y(jié)構(gòu)，可將抗原結(jié)合單元廣泛劃分為“單鏈”(“Sc”)和“非單鏈”(“Nsc”)類型。
術(shù)語“抗體”和“抗原結(jié)合單元”亦涵蓋包含無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的多種物種起源的免疫球蛋白分子。應(yīng)用于抗體或抗原結(jié)合單元的術(shù)語“人類”表示由人類基因或其片斷所顯現(xiàn)的免疫球蛋白分子。應(yīng)用于非人類(例如嚙齒動(dòng)物或靈長(zhǎng)類動(dòng)物)抗體的術(shù)語“母乳化的”是含有由非人類免疫球蛋白所獲得的最小序列的融合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片斷。一般地，母乳化抗體是人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中將該受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基由來自于非人類物種(供體抗體)的CRR的殘基代替，例如由具有期望的特性、親和力和能力的耗子、老鼠、兔子或靈長(zhǎng)類動(dòng)物的CDR殘基來代替。例如，將人類免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人類殘基來代替。此外，該母乳化抗體可包含既不是在受體抗體亦不是在該輸入CDR或框架序列中所發(fā)現(xiàn)的殘基。在人類機(jī)體中引入該等改進(jìn)是為了進(jìn)一步使抗體效能改進(jìn)和最優(yōu)化并使免疫原性最小化。通常，該母乳化抗體將包含幾乎所有(至少一個(gè)，通常兩個(gè))可變區(qū)域，其中所有或幾乎所有CDR區(qū)域均與非人類免疫球蛋白中的區(qū)域相符合并且所有或幾乎所有FR區(qū)域是人類免疫球蛋白序列的區(qū)域。該母乳化抗體亦可包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，其通常為人類免疫球蛋白恒定區(qū)。
“非單一鏈抗原結(jié)合單元”(“Nsc Abus”)是包含輕鏈多肽和重鏈多肽的異源多聚體。非單一鏈抗原結(jié)合單元的實(shí)例包括(但不限于)(1)由本文所展示的異源二聚序列來穩(wěn)定的ccFv片段(圖24)；(2)任何其它包含至少一個(gè)如本文所述ccFv片段的單價(jià)和多價(jià)分子；(3)由該VL、VH、CL和CH1區(qū)域組成的Fab片段；(4)由該VH和CH1區(qū)域組成的Fd片段；(5)由抗體單臂(single arm)的VL和VH區(qū)域組成的Fv片段；(6)F(ab′)2片段，其是包含兩個(gè)通過該鉸鏈區(qū)的雙硫橋來連接的Fab片段的二價(jià)片段；(7)聯(lián)體；和(8)任何其它在Little等人(2000)的『今日免疫學(xué)』(Immunology Today)中所述的非單一鏈抗原結(jié)合單元。
如上所注，非單一鏈抗原結(jié)合單元可以是“單價(jià)”或“多價(jià)”。盡管前者的每個(gè)抗原結(jié)合單元具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，后者含有可結(jié)合多個(gè)相同或不同類型抗原的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)?；诮Y(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，一個(gè)非單一鏈抗原結(jié)合單元可以是二價(jià)(具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))、三價(jià)(具有三個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))、四價(jià)(具有四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))等。
以其結(jié)合特性為基礎(chǔ)，可將多價(jià)非單一鏈抗原結(jié)合單元進(jìn)一步分類。一個(gè)“單特異性”非單一鏈抗原結(jié)合單元是可結(jié)合一種或多種相同類型抗原的分子。一個(gè)“多特異性”非單一鏈抗原結(jié)合單元是具有可用于至少兩種不同抗原的結(jié)合特性的分子。盡管該等分子通常僅結(jié)合兩種不同抗原(例如雙特異性抗原結(jié)合單元)，具有另外特性的抗體(例如三特異性抗體)若在本文中使用則涵蓋于此表達(dá)。雙特異性抗原結(jié)合單元的實(shí)例包括一個(gè)臂對(duì)準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞抗原并且另一臂對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞毒素觸發(fā)分子的單元，例如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗惡性(malignant)B-細(xì)胞(1D10)、抗CDS/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗腎細(xì)胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗結(jié)腸癌)、抗CD3/抗黑素細(xì)胞刺激激素類似物、抗EGF受體/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神經(jīng)細(xì)胞附著分子(NCAM)/抗CD3、抗葉酸鹽結(jié)合蛋白質(zhì)(FBP)/抗CD3、抗淘篩癌連帶(anti-pan carcinoma associated)抗原(AMOC-31)/抗CD3；一個(gè)臂特定地與腫瘤抗原結(jié)合并且一個(gè)臂與毒素結(jié)合的雙特異性抗原結(jié)合單元，例如抗毒性蛋白/抗Id-1、抗CD22/抗毒性蛋白、抗CD7/抗毒性蛋白、抗CD38/抗毒性蛋白、抗CEA/抗蓖麻蛋白A鏈、抗干擾素α(IFN-α)/抗融合瘤獨(dú)特型、抗CEA/抗長(zhǎng)春花屬生物堿；用于轉(zhuǎn)換酶活性前體藥物的BsAbs，例如抗CD30/抗堿性磷酸酶(其可催化絲裂霉素磷酸鹽前體藥物轉(zhuǎn)化為絲裂霉素醇)；可用作纖維溶(fibrmolytic)劑的雙特異性抗原結(jié)合單元，例如抗纖維蛋白/抗組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA)、抗纖維蛋白/抗尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)；用于將免疫絡(luò)合物指向于細(xì)胞表面受體的雙特異性抗原結(jié)合單元，例如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(例如FeγRI、FcγRII或FcγRIII)；用于感染性疾病的治療的雙特異性抗原結(jié)合單元，例如抗CD3/抗單純皰疹病毒(HSV)、抗T細(xì)胞受體CD3絡(luò)合物/抗流行性感冒、抗FcγR/抗HIV；用于體外或體內(nèi)腫瘤探測(cè)的雙特異性抗原結(jié)合單元，例如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗pl85HER2/抗半抗原；疫苗輔劑BsAbs；和作為診斷工具的雙特異性抗原結(jié)合單元，例如抗兔子免疫球蛋白G/抗鐵蛋白、抗辣根過氧化物酶(HRP)/抗激素、抗生長(zhǎng)抑制素/抗P物質(zhì)、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶。三特異7性抗體的實(shí)例包含抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。
單鏈抗原結(jié)合單元(“Sc Abu”)表示單體抗原結(jié)合單元。盡管該Fv片段的該兩個(gè)區(qū)域是由兩個(gè)獨(dú)立基因來編碼，可制造一個(gè)合成連接器以能夠通過重組體方法將其制造為單一蛋白質(zhì)鏈(例如在Bird等人(1988)的Science 242423-426和Huston等人(1988)的PNAS 855879-5883中所述的單一鏈Fv(“scFv”))。
“抗原結(jié)合單元的清單”指多種抗原結(jié)合單元，其中至少有兩個(gè)展現(xiàn)不同結(jié)合特性?？乖Y(jié)合單元的遺傳多樣性清單表示多種抗原結(jié)合單元，其大多數(shù)(否則所有)抗原結(jié)合單元展現(xiàn)關(guān)于其各自的獨(dú)特結(jié)合特性。遺傳多樣性清單通常具有至少106至1013(較佳地在107至109之間，更佳地在108至1010之間，最佳地在108至1011之間)個(gè)不同抗原結(jié)合單元的組成。
若抗體或抗原結(jié)合單元以比其與其它基準(zhǔn)抗原(包含多肽或其它物質(zhì))結(jié)合時(shí)更大的親合力或抗體親抗原性來結(jié)合，則其與抗原“特定地結(jié)合”或“發(fā)生免疫反應(yīng)”。
在抗原結(jié)合單元存在于宿主細(xì)胞的外表面時(shí)，使其在宿主細(xì)胞的表面上展示?？蓪⑺故镜目乖Y(jié)合單元直接附著于宿主細(xì)胞的外表面上或可通過宿主細(xì)胞邊界基因包裝(例如噬菌體顆粒)將其間接附著于宿主細(xì)胞上。
本文所用的“外表面序列”表示對(duì)基因包裝的“外表面蛋白質(zhì)”進(jìn)行編碼的核苷酸序列。該等蛋白質(zhì)形成一個(gè)可將基因包裝的基因包裝形成膠囊的蛋白質(zhì)外殼。通常，該外表面蛋白質(zhì)引導(dǎo)基因包裝使其組合在該基因包裝的外表面上的待展示多肽，例如噬菌體或細(xì)菌。
應(yīng)用于基因或蛋白質(zhì)的術(shù)語“野生型”表示“自然存在的”、“天然的”基因或蛋白質(zhì)。該等術(shù)語包括可在細(xì)胞或基因包裝中自然發(fā)現(xiàn)的大型的并經(jīng)過加工的多核苷酸和多肽。術(shù)語“正常型外表面蛋白質(zhì)”表示可形成天然存在基因包裝的外殼的蛋白質(zhì)，無論其是病毒、細(xì)胞或孢子。關(guān)于絲狀噬菌體，其正常型蛋白質(zhì)是基因III蛋白質(zhì)(pIII)、基因VI蛋白質(zhì)(pVI)、基因VII蛋白質(zhì)(pVII)、基因VIII蛋白質(zhì)(pVIII)和基因IX蛋白質(zhì)(pIX)。
本文所用的“抗原”表示由抗體認(rèn)可并特定地結(jié)合的物質(zhì)?？乖砂?、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖和脂類及其部分和組合。
本文所用的術(shù)語“表面抗原”表示細(xì)胞的質(zhì)膜組分。其涵蓋構(gòu)成該質(zhì)膜的完整的和周邊的膜蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖和脂類?！巴暾さ鞍踪|(zhì)”是橫跨膜的蛋白質(zhì)，其通過細(xì)胞的該質(zhì)膜的雙層脂質(zhì)延伸。典型的完整膜蛋白質(zhì)由至少一個(gè)“膜生成片段”組成，其通常包含疏水性氨基酸殘基。周邊膜蛋白質(zhì)不在該雙層脂質(zhì)的疏水性內(nèi)部中延伸且通過與其它膜蛋白質(zhì)的非共價(jià)鏈相互作用來與膜表面結(jié)合。
應(yīng)用于細(xì)胞蛋白質(zhì)的術(shù)語“膜”、“細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的(cytosolic)”、“核”和“分泌(secreted)”詳細(xì)說明該細(xì)胞外的和/或亞細(xì)胞的位置，其中主要地、占優(yōu)勢(shì)地或優(yōu)選地將該細(xì)胞蛋白質(zhì)定位。
“細(xì)胞表面受體”代表膜蛋白質(zhì)的子集，其能夠與其各自配位體相結(jié)合。細(xì)胞表面受體是固定在該細(xì)胞質(zhì)膜上的或插入該細(xì)胞質(zhì)膜中的分子。其構(gòu)成蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖和脂類的一大系列，不僅可作為該質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)組分而且可作為常規(guī)成分，例如控制多種生物功能的信號(hào)分子。
“異源二聚體受體”涵蓋由兩種蛋白質(zhì)副族組成的細(xì)胞蛋白質(zhì)，其可顯現(xiàn)與配位體的結(jié)合親合力。該兩種蛋白質(zhì)副族是不同的分子，其通過至少一種氨基酸殘基在氨基酸序列中變化。非限制的說明性異源二聚體受體是與生長(zhǎng)因子(例如heregulin)、神經(jīng)傳遞質(zhì)(例如γ-氨基丁酸)和其它有機(jī)或無機(jī)小分子(例如鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素)相結(jié)合的受體。優(yōu)選異源二聚體受體是核激素受體(Belshaw等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93(10)4604-4607)、erbB3和erbB2受體絡(luò)合物和G蛋白質(zhì)偶合受體，其包括(但不限于)類鴉片物質(zhì)(Gomes等人(2000)J.Neuroscience 20(22)RC110)、毒蕈堿型受體、多巴胺受體、血清素、腺苷/多巴胺和GABAB系列受體。
“區(qū)域”表示蛋白質(zhì)部分，其在物理上或機(jī)能上與該蛋白質(zhì)或肽的其它部分相區(qū)別。物理性定義的區(qū)域包括格外地疏水或親水的氨基酸序列，例如與膜相關(guān)的或與細(xì)胞質(zhì)相關(guān)的序列。區(qū)域亦可由產(chǎn)生自(例如)基因復(fù)制的內(nèi)部同系物來定義。機(jī)能性定義的區(qū)域具有一個(gè)(多個(gè))不同生物功能。例如，受體的配位體結(jié)合區(qū)域是結(jié)合配位體的區(qū)域?？乖Y(jié)合區(qū)域表示與該抗原相結(jié)合的抗原結(jié)合單元或抗體的部分。功能性定義的區(qū)域不需要由連續(xù)的氨基酸序列來編碼。功能性定義的區(qū)域可包含一種或多種物理定義的區(qū)域。例如，受體通常劃分為細(xì)胞外配位體結(jié)合域、橫跨膜的區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)域?！澳す讨颉敝缚烧{(diào)節(jié)膜組合的蛋白質(zhì)部分。通常，該膜固著域由疏水性氨基酸殘基組成。或者，該膜固著域可由改性氨基酸(例如附著于脂肪酸鏈上的氨基酸)組成，改性氨基酸反過來可將該蛋白質(zhì)錨定于膜上。
“宿主細(xì)胞”包括可作為或已作為本載體的受體的個(gè)別細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)。宿主細(xì)胞包括單一宿主細(xì)胞的后代。由于天然的、偶然的或故意的突變，其后代不必要與最初親本細(xì)胞完全相同(在所有DNA補(bǔ)碼的形態(tài)學(xué)或染色體組中)。宿主細(xì)胞包括在體內(nèi)感染本發(fā)明載體的細(xì)胞。
“細(xì)胞株”或“細(xì)胞培養(yǎng)”表示在體外生長(zhǎng)或維持的細(xì)菌、植物、昆蟲或更高真核細(xì)胞。細(xì)胞的后代可以不與該親本細(xì)胞完全相同(在形態(tài)學(xué)上、遺傳上或表現(xiàn)上)。
“成分明確載體”表示包含培養(yǎng)細(xì)胞的存活和/或生長(zhǎng)所必需的營養(yǎng)和激素需求的載體，因此該載體的組分是已知的。通常，成分明確載體已由生長(zhǎng)和/或存活所必需的營養(yǎng)和生長(zhǎng)因子的附加物來闡明。典型地，成分明確載體提供至少一種來自于下述種類中的一種或多種的組分a)所有必需氨基酸和通常由二十種氨基酸加上半胱氨酸所組成的基本集；b)通常以碳水化合物(例如葡萄糖)的形式存在的能源；c)必需的低濃度的維生素和/或其它有機(jī)化合物；d)游離脂肪酸；和e)定義為無機(jī)化合物或自然存在的元素的微量元素，其濃度通常是必需的在微摩爾范圍內(nèi)的極低濃度。成分明確載體亦可視情況以一種或多種來自于下述任何種類的組分來補(bǔ)充a)一種或多種促有絲分裂劑；b)鹽和緩沖劑，例如鈣、鎂和磷酸鹽；c)核苷和堿，例如腺苷和胸腺嘧啶核苷、次黃嘌呤；和d)蛋白質(zhì)和組織水解物。
本文所用的術(shù)語“獨(dú)立的”表示由組分、細(xì)胞和別的方面中分離，其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段實(shí)質(zhì)上通常相互結(jié)合。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易明白，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段不需要通過“分離”來與天然存在的對(duì)應(yīng)部分相區(qū)別。此外，“濃縮的”、“獨(dú)立的”、或“稀釋的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段可與其天然存在的對(duì)應(yīng)部分相區(qū)分，其中每體積分子的濃度或數(shù)目比天然存在的對(duì)應(yīng)部分更“濃縮”或較少“獨(dú)立”。
可在純堿中測(cè)量富集作用，例如與每體積溶液的重量；或可與存在于原料混合物中的第二潛在妨礙物質(zhì)相比來測(cè)量。本發(fā)明具體實(shí)施例的增加富集作用日益更佳。因此，(例如)2-折疊富集為較佳，10-折疊富集為更佳，100-折疊富集為較佳，1000-折疊富集為最佳。亦可在分離狀態(tài)通過人造組合過程，例如通過化學(xué)合成或重組體表達(dá)來提供物質(zhì)。
“連接的(Linked)”和“融合的(fused)”或“融合(fusion)”在本文中可交替使用。該等術(shù)語表示兩種化學(xué)元素或組分通過包括化學(xué)結(jié)合或重組體構(gòu)件的任何構(gòu)件來結(jié)合在一起?！霸诳蚣軆?nèi)融合”表示結(jié)合兩種或兩種以上開放閱讀框(OFRs)來形成連續(xù)的更長(zhǎng)的開放閱讀框，以維持最初開放閱讀框的恰當(dāng)閱讀框。因此，所得重組體融合蛋白質(zhì)是含有兩種或兩種以上片段的單一蛋白質(zhì)，該等片段與通過最初開放閱讀框(其片段實(shí)質(zhì)上通常不是如此結(jié)合)來編碼的多肽一致。盡管該閱讀框因此在融合片段內(nèi)是連續(xù)的，該等片段仍可以在物理上或空間上通過(例如)在框架內(nèi)結(jié)合的序列(例如“靈活性連接器(flexon)”)來分離。
本文所用的“靈活性連接器”表示靈活性多肽連接器(或?qū)Χ嚯倪M(jìn)行編碼的核酸序列)，其通常包含具有小側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和絲氨酸)。在該融合的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)之間所合并的靈活性連接器可以通過使其采取相互相對(duì)獨(dú)立的構(gòu)造來促進(jìn)其功能性。
在上下文中的多肽“直鏈序列”或“序列”是多肽中的氨基酸在氨基至羧基終點(diǎn)方向上的次序，其中該序列中的相互臨近的殘基在該多肽的初始結(jié)構(gòu)中是連續(xù)的。“局部序列”是多肽的部分的直鏈序列，已知其包含在一個(gè)或兩個(gè)方向上的另外殘基。
“異源的”表示由在遺傳上完全不同的來自于所比較實(shí)體的剩余部分的實(shí)體中獲得。例如自其天然編碼序列中移除并在操作上連接至與天然序列不同的編碼序列上的促進(jìn)劑是異種促進(jìn)劑。應(yīng)用于多核苷酸、多肽的術(shù)語“異源的”表示該多核苷酸或多肽是由在遺傳上完全不同的來自于所比較實(shí)體的剩余部分的實(shí)體中獲得。例如，異源多核苷酸或抗原可由不同物種起源、不同細(xì)胞類型和不同個(gè)體的細(xì)胞的相同類型中獲得。
術(shù)語“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可交替使用。其指任一長(zhǎng)度的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物的核苷酸的多聚體形式。多核苷酸可以具有任意三維結(jié)構(gòu)且可以執(zhí)行任意已知或未知功能。下述是多核苷酸的非限制性實(shí)例基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)域、由連接分析所定義的(多個(gè))基因座、編碼順序、基因內(nèi)區(qū)、信使核糖核酸(mRNA)、轉(zhuǎn)譯RNA、核醣RNA、核酶、cDNA、重組體多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任一序列的分離DNA、任一序列的分離RNA、核酸蛋白質(zhì)和底漆。多核苷酸可包含改性核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。若存在，則可在該聚合物集合之前或之后對(duì)于該核苷酸結(jié)構(gòu)作出改進(jìn)。核苷酸的序列可由非核苷酸組分打斷。多核苷酸可在聚合作用后進(jìn)一步改性，例如通過與標(biāo)記組分的結(jié)合來改性。
應(yīng)用于多核苷酸的“重組體”表示該多核苷酸是克隆、限制和/或結(jié)合步驟和可引起構(gòu)建的其它程序的各種組合的產(chǎn)物，該產(chǎn)物與在自然界發(fā)現(xiàn)的多核苷酸不同。
術(shù)語“基因”或“基因片段”在本文中可交替使用。其表示含有至少一個(gè)能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯后對(duì)特別蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的開放閱讀框的多核苷酸?；蚧蚧蚱慰梢允侨旧w組或cDNA，只要該多核苷酸含有至少一個(gè)可覆蓋整個(gè)編碼區(qū)域或其片段的開放閱讀框。
“可操作性連接”或“操作性地連接”指一個(gè)并列，其中所述組分的關(guān)系是允許其以預(yù)計(jì)方式運(yùn)行。例如，若該促進(jìn)劑序列可促進(jìn)該編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則促進(jìn)劑序列可操作性地與編碼序列連接。
“融合基因”是由至少兩種連接在一起的異種多核苷酸組成的基因。
基因“數(shù)據(jù)庫”表示一系列儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，其代表包含核苷酸和肽序列的序列集合，該序列反過來代表生物機(jī)轉(zhuǎn)物質(zhì)的集合。
本文所用的“表達(dá)”指將多核苷酸轉(zhuǎn)錄為mRNA的過程和/或?qū)⑥D(zhuǎn)錄的mRNA(亦稱作“轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物”)隨后轉(zhuǎn)錄為肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和該編碼多肽共同表示基因產(chǎn)物。若該多核苷酸是由染色體組DNA獲得，則表達(dá)可包括在真核細(xì)胞中的mRNA的接合。
“載體”是核酸分子(較佳地是自我復(fù)制核酸分子)，其將插入的核酸分子傳輸至宿主細(xì)胞中和/或宿主細(xì)胞之間。該術(shù)語包括主要用于將DNA或RNA插入細(xì)胞中的載體、主要用于DNA或RNA復(fù)制的載體復(fù)制、和用于該DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的表達(dá)載體。其亦包含可提供多個(gè)上述功能的載體。
“表達(dá)載體”是多核苷酸，在引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞時(shí)，可將其轉(zhuǎn)錄或翻譯為多肽。“表達(dá)系統(tǒng)”通常意味著由可用于產(chǎn)生期望的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)載體所組成的合適的宿主細(xì)胞?！皬?fù)制子”表示含有復(fù)制起點(diǎn)(通常稱作起點(diǎn)序列)的多核苷酸，其允許該多核苷酸在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制。復(fù)制子的實(shí)例包括游離基因(例如質(zhì)粒)和染色體(例如核或線粒體染色體)。
“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)"是將刺激和抑制信號(hào)傳輸至細(xì)胞中以引起細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的過程?！靶盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的調(diào)整基因”表示可調(diào)整與該相同物種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑相比對(duì)的一種或多種細(xì)胞蛋白質(zhì)的活性的化合物。
本發(fā)明的適配器定向展示系統(tǒng)本發(fā)明的主要方面是展示系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)允許在外源性多肽的基因包裝上或在隨機(jī)或預(yù)定多肽的文庫上所產(chǎn)生的展示，可經(jīng)由肽鍵將其與任何功能性外表面序列分開。本系統(tǒng)避免了與該表達(dá)載體的外表面蛋白質(zhì)相關(guān)的所有缺點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)性設(shè)計(jì)尤其適用于提供和/或選擇由基因包裝(例如病毒、細(xì)胞和孢子)所提供的具有期望的特性的蛋白質(zhì)。
本展示系統(tǒng)包含兩種組分(1)攜帶所關(guān)心的外源性基因的表達(dá)載體，其對(duì)在基因包裝外表面上待展示的多肽進(jìn)行編碼；和(2)促進(jìn)所特別關(guān)心的多肽的展示的輔助載體。與先前所報(bào)告的展示系統(tǒng)相區(qū)別，本系統(tǒng)具有下述獨(dú)特特點(diǎn)。首先，該表達(dá)載體包含一個(gè)對(duì)在框架內(nèi)以第一適配器融合的待展示外源性多肽進(jìn)行編碼的編碼序列。第二，該表達(dá)載體缺乏對(duì)該基因包裝的任何功能性外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的外表面序列。第三，該輔助載體包含對(duì)該基因包裝進(jìn)行包裹所必需的所有外表面序列，該等外表面序列中的至少一個(gè)在框架內(nèi)融合為第二適配器序列，且其中該外源性多肽的展示是通過在第一和第二適配器之間的成對(duì)相互作用來調(diào)節(jié)。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含噬菌體中間表達(dá)載體和具有前述特征的噬菌體輔助載體的噬菌體展示系統(tǒng)。在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供細(xì)菌展示系統(tǒng)，其中該細(xì)菌表達(dá)載體和該細(xì)菌輔助載體可展現(xiàn)所主張的特點(diǎn)。該噬菌體和細(xì)菌展示系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)性設(shè)計(jì)可延伸至真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng)的構(gòu)建。
本發(fā)明的噬茵體展示系統(tǒng)如上所注，先前所報(bào)道的噬菌體展示系統(tǒng)具有許多明顯的缺點(diǎn)。例如，通常所應(yīng)用的基因III和基因VIII系統(tǒng)可產(chǎn)生數(shù)個(gè)固有缺點(diǎn)。其中(1)由于與該基因包裝的某些外表面蛋白質(zhì)相融合的外源性多肽的顯現(xiàn)所產(chǎn)生的對(duì)宿主細(xì)胞的毒性；(2)因?yàn)閷⒃撏庠葱远嚯陌皆摶虬b上所必需的外表面蛋白質(zhì)的某些區(qū)域，所以產(chǎn)生對(duì)于待展示的外源性多肽的尺寸和定位的嚴(yán)格限制；和(3)由于在該融合和通常由輔助載體所提供的正常型外表面蛋白質(zhì)之間的重組所產(chǎn)生的融合產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。最近所報(bào)道的“半胱氨酸偶合性”展示系統(tǒng)(WO 01/05950)避免了外表面蛋白質(zhì)融合經(jīng)由肽鍵的表達(dá)，但仍未能使該等蛋白質(zhì)對(duì)宿主細(xì)胞的毒性最小化。此外，一個(gè)特別的設(shè)計(jì)，也就是在WO 01/05950中所述的兩載體系統(tǒng)不可避免地在該輔助噬菌體的感染上產(chǎn)生錯(cuò)包裹載體。錯(cuò)包裹載體含有該外表面序列但不含有外源性基因。本噬菌體展示系統(tǒng)避免了該等缺點(diǎn)并提供其它相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。
本設(shè)計(jì)的一個(gè)主要方面是將該外源性多肽與噬菌體包裹所必需的該外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。因此，攜帶外源性多肽的該噬菌體中間載體(表達(dá)載體)不含有任何對(duì)功能性外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的序列。該外源性多肽在該噬菌體顆粒表面上的提出是通過兩個(gè)適配器的成對(duì)相互作用來調(diào)節(jié)。一個(gè)適配器是在框架內(nèi)與通過該噬菌體中間載體來編碼的該外源性多肽的融合，且另一個(gè)是在框架內(nèi)與至少一個(gè)由該輔助噬菌體所編碼的外表面蛋白質(zhì)的融合。在使攜帶噬菌體中間載體的宿主細(xì)胞由輔助噬菌體來感染時(shí)，該編碼外源性多肽是經(jīng)由在各自適配器之間的成對(duì)相互作用與該外表面蛋白質(zhì)所形成的絡(luò)合物。然后將該絡(luò)合物包裹入該噬菌體表面外殼中，而留下在其外表面上所曝露的該外源性多肽。
本發(fā)明的噬菌體中間載體的一般特性將數(shù)個(gè)因子應(yīng)用于噬菌體展示系統(tǒng)的構(gòu)建。首先，噬菌體中間載體不含有對(duì)基因包裝的任何功能性外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的序列，其中多肽將在該基因包裝上展示?！肮δ苄浴北硎驹摼幋a外表面蛋白質(zhì)保持促進(jìn)或引導(dǎo)該基因包裝在其外表面上對(duì)所關(guān)心的多肽進(jìn)行組合的能力。將要由該表達(dá)載體中所排除的精確外表面序列將取決于噬菌體包裹的選擇。
本文所用的術(shù)語“噬菌體”涵蓋由蛋白質(zhì)外殼所組成的病毒，病毒性復(fù)制所需的病毒性基因包裝將在該外殼中進(jìn)行壓縮。該病毒性基因包裝可由單一或雙束的、直鏈或環(huán)狀的DNA或RNA組成。該噬菌體可感染許多宿主細(xì)胞，該等宿主細(xì)胞包含(但不限于)原核生物，例如細(xì)菌細(xì)胞。已將許多絲狀或非絲狀噬菌體的基因包裝排列順序。典型的絲狀噬菌體包括M13、f1、fd、If1、Ike、Xf、Pf1和Pf3。在絲狀噬菌體種類中，MB是最特征化的物種。已知其三維結(jié)構(gòu)，且已正確理解其外殼蛋白質(zhì)的功能。特定地，該M13基因包裝對(duì)五個(gè)外殼蛋白質(zhì)(也就是pIII、VIII、VI、VII和IX)進(jìn)行編碼。為了構(gòu)建該噬菌體展示系統(tǒng)基于M13的表達(dá)載體，必須將所有外殼編碼序列刪除或改變以使得該編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物不能影響外源性多肽在噬菌體顆粒外表面上的提出。對(duì)于功能性外表面蛋白質(zhì)所做的合適的改進(jìn)可導(dǎo)致(1)功能性信號(hào)肽的損失，該信號(hào)肽可將該外表面蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)易位引導(dǎo)至該細(xì)菌細(xì)胞的周質(zhì)中，其中然后將該信號(hào)肽裂開；(2)該外殼蛋白質(zhì)區(qū)域的功能的損失，該功能可將成熟多肽錨定于該細(xì)菌細(xì)胞膜和/或噬菌體外殼中；(3)該外殼蛋白質(zhì)區(qū)域的功能損失，該功能可特定地將該宿主細(xì)菌的F-纖毛結(jié)合至該噬菌體受體；和/或(4)內(nèi)部終止碼的引入，以防止任何功能性外殼蛋白質(zhì)的表達(dá)。已描繪了在一些外殼蛋白質(zhì)中的該等和其它區(qū)域(例如pIII)(參看例如美國專利第5,969,108)。其它緊密相關(guān)的膜的外表面蛋白質(zhì)(例如f1和fd絲狀噬菌體)亦為此項(xiàng)技術(shù)中已知(參看例如凱(Kay)等人(1996)的『肽和蛋白質(zhì)的噬菌體展示實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)』(Phage Display of Peptides and ProtiensA Laboratory Manual，美國學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，圣地牙哥有限公司(Inc.San Diego))。較佳地，在基于M13的表達(dá)載體中所提出的該唯一噬菌體序列含有噬菌體中間的復(fù)制和包裹所必需的f1起點(diǎn)。對(duì)于構(gòu)建基于M13的表達(dá)載體的逐步說明將在實(shí)例1-4中詳細(xì)說明。因此，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員之一采用適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)可以很容易地構(gòu)建具有所主張的特征的表達(dá)載體。
可用相似方法來構(gòu)建其它絲狀噬菌體。Pf3是另一熟知的絲狀噬菌體，其可感染對(duì)IncP-1質(zhì)粒進(jìn)行錨定的假單胞菌屬aerugenosa細(xì)胞。Pf3的整個(gè)基因包裝已經(jīng)排列順序，且已將復(fù)制和包裹所包含的基因信號(hào)特征化(Luiten等人(1985)J.Virology 56(1)268-276)。Pf3的主要外殼蛋白質(zhì)的獨(dú)特處在于其不具有信號(hào)肽來引導(dǎo)其分泌。該序列已負(fù)載殘基ASP7、ARG37、LYS40和PHE44-COO-，該序列的終點(diǎn)與已曝露氨基酸的終點(diǎn)一致。用于Pf3噬菌體的139bp DNA的病毒性鏈復(fù)制起點(diǎn)已經(jīng)確定(Luiten等人(1991)J.Bacteriol 173(13)4007-4012)。為了構(gòu)建基于Pf3的表達(dá)載體，必須將該P(yáng)f3外殼編碼序列刪除或改變以使其無法對(duì)功能性主要外殼蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。優(yōu)選表達(dá)載體僅含有用于其復(fù)制和包裹的Pf3噬菌體復(fù)制起點(diǎn)。
將相同的方法應(yīng)用于由非絲狀噬菌體所得到的噬菌體中間載體的構(gòu)建。此類噬菌體的非限制性典型部分是細(xì)菌噬菌體_X174、ё、T4和T7。細(xì)菌噬菌體_X174是非常小的二十面體病毒，其已由遺傳學(xué)、生物化學(xué)和電子顯微鏡學(xué)進(jìn)行全面研究。_X174的三種基因產(chǎn)物存在于成熟病毒的外面F(衣殼)、G(主要的鞘蛋白質(zhì)，每個(gè)病毒60個(gè)復(fù)制)和H(主要的鞘蛋白質(zhì)，每個(gè)病毒12個(gè)復(fù)制)。G蛋白質(zhì)包含175種氨基酸，而H包含328種氨基酸。F蛋白質(zhì)與該病毒的單鏈DNA相互作用。蛋白質(zhì)F、G和H是由在該病毒性感染細(xì)胞中的單一mRNA來翻譯。因此，基于此類非絲狀噬菌體的典型表達(dá)載體缺乏F、G和H蛋白質(zhì)的所有編碼序列。其它替代的表達(dá)載體包含已改變的F-、G-或H-編碼序列，該等編碼序列不產(chǎn)生功能性F、G和H蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的輔助噬菌體載體的一般特性本噬菌體展示系統(tǒng)的第二組分是輔助載體，其功能為對(duì)缺乏任何功能性外表面序列的該表達(dá)載體進(jìn)行補(bǔ)充。與先前所述的缺乏一個(gè)必需的外殼蛋白質(zhì)編碼序列的或含有一個(gè)對(duì)該基因包裝的有缺陷外殼蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的序列的輔助載體(美國專利第5,969,108)不同，該輔助載體提供包裹該基因包裝所必需的所有外表面序列。再次應(yīng)用的精確外表面序列取決于該噬菌體包裹的選擇。
如上所述，可在此技術(shù)中獲得在多種噬菌體上的大量結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)的信息。對(duì)復(fù)制和包裹多種類型基因包裝所必需的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和酶進(jìn)行編碼的該等基因序列已經(jīng)確定，且將其廣泛應(yīng)用于構(gòu)建先前的展示系統(tǒng)(美國專利第6248516號(hào)、5969108號(hào)、5885793號(hào)、5837500號(hào)、5571698號(hào)、5223409號(hào)和5514548號(hào)、WO9005144、EP0368684、WO09201047、WO09311236和WO09708320)。該等序列通?？蓱?yīng)用于構(gòu)建可展現(xiàn)另外獨(dú)特特性的輔助載體。
特定地，該輔助噬菌體載體通常包含對(duì)于輔助噬菌體和噬菌體中間載體的壓縮負(fù)責(zé)的所有外表面序列。一方面，該輔助噬菌體載體包含對(duì)下述絲狀噬菌體之一的所有外殼蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的外表面序列M13、f1、fd、If1、Ike、Xf、Pf1和Pf3。基于M13的輔助噬菌體載體的優(yōu)選外殼編碼序列是gIII、gVIII、gVI、gVII、gIX或其功能性等價(jià)物。在另一具體實(shí)施例中，輔助噬菌體載體含有非絲狀噬菌體的外殼編碼序列，該絲狀噬菌體選自細(xì)菌噬菌體_X174、ё、T4和T7。除了該等結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，輔助噬菌體載體通常對(duì)其它由噬菌體衍生的酶進(jìn)行編碼，該酶反過來在該噬菌體載體和輔助噬菌體上攜帶的復(fù)制的噬菌體起點(diǎn)上起作用以“輔助”復(fù)制和包裹該噬菌體中間載體。本發(fā)明的優(yōu)選M13輔助載體是有缺陷復(fù)制，以確保該噬菌體中間載體的優(yōu)選包裹。較佳地，超過90％的該包裹載體是噬菌體中間載體；更佳地，超過99％的該包裹載體是噬菌體中間載體。優(yōu)選M13輔助噬菌體載體進(jìn)一步包含對(duì)蛋白質(zhì)I、II、IV、V、X或其功能性等價(jià)物進(jìn)行編碼的序列。本文所用的外表面蛋白質(zhì)的功能性等價(jià)物包括用于改性外表面蛋白質(zhì)的譯碼，改性外表面蛋白質(zhì)保持該正常型外表面蛋白質(zhì)的功能性。功能性等價(jià)外表面蛋白質(zhì)包括增強(qiáng)、減少或不明顯影響相應(yīng)正常型蛋白質(zhì)的特性的蛋白質(zhì)。這些等價(jià)物可以是具有保守氨基酸替換物的多肽、包含融合和突變體的類似物。優(yōu)選M13輔助載體可抗干擾。典型的抗干擾輔助載體是M13KO7(香港商安法瑪亞股份有限公司(Amersham PharmaciaBiotech))和其衍生物例如VCSM13(Stratagene)。這兩個(gè)抗干擾輔助載體提供包裹噬菌體顆粒所必需的該噬菌體序列。
只要存在噬菌體包裹所必需的外表面序列，本發(fā)明的輔助噬菌體載體就可含有給定外表面序列的一個(gè)或多個(gè)復(fù)制。每個(gè)必需的外表面序列的一個(gè)復(fù)制通常用于產(chǎn)生一個(gè)“多價(jià)”噬菌體展示系統(tǒng)。相反，給定外表面序列或其功能性等價(jià)物的多個(gè)復(fù)制的結(jié)合潛在地產(chǎn)生一個(gè)“單價(jià)”噬菌體展示系統(tǒng)。單價(jià)展示可以區(qū)分所展示的以適度親合力和以高親和力與目標(biāo)結(jié)合的多肽。其亦有助于以親合力為基礎(chǔ)通過消除該“抗體親抗原性”影響來選擇多肽(例如抗體)，其中可顯現(xiàn)低親合力抗體的多個(gè)復(fù)制的噬菌體將具有與顯現(xiàn)較高親合力抗體的一個(gè)復(fù)制的噬菌體相同的明顯親合力。然而，多價(jià)展示提供可替代的優(yōu)點(diǎn)。其尤其適用于結(jié)合多肽的選擇的最初階段。在篩選的早期，其作為潛在的引導(dǎo)常常更適于積聚廣譜性多肽，而不是識(shí)別單一高親合力候選物。然后可應(yīng)用單價(jià)展示或其它方法將經(jīng)由最初篩選所獲得的多肽根據(jù)其親合力來排序。本發(fā)明提供單價(jià)展示系統(tǒng)的一個(gè)典型輔助噬菌體載體(圖5A)。在以所得輔助噬菌體來感染細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，該包裹的噬菌體中間顆粒展現(xiàn)比游離pIII多兩-折疊的外源性多肽/pIII絡(luò)合物，此表示該包裹的噬菌體具有多個(gè)復(fù)制(參看實(shí)例2、圖11)的化合價(jià)。本發(fā)明亦提供M13輔助噬菌體載體，該載體攜帶KO7基因III外表面序列的復(fù)制和基因HI(圖19A和實(shí)例4)的C終端部分的復(fù)制。后者對(duì)功能性等價(jià)物進(jìn)行編碼，該等價(jià)物可與用于包裹的正常型pIII競(jìng)爭(zhēng)。所得輔助噬菌體預(yù)期可產(chǎn)生單價(jià)展示系統(tǒng)。
尤其較佳的輔助載體可支持單價(jià)和多價(jià)展示?？赏ㄟ^將在外表面序列的第一和第二復(fù)制之間的抑制性可移置終止碼合并來構(gòu)建該輔助載體，例如M13噬菌體的基因III。抑制性密碼子可在抑制條件下對(duì)該密碼子(例如基因III)的核苷酸序列下游進(jìn)行翻譯，但在非抑制性條件下可對(duì)該密碼子的末端進(jìn)行翻譯。在抑制性條件下生長(zhǎng)時(shí)(例如在抑制劑細(xì)菌鏈中)，該輔助噬菌體可展示該外表面蛋白質(zhì)的與用于包裹的第一復(fù)制進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)的第二復(fù)制；同時(shí)存在單價(jià)噬菌體展示。然而，在非抑制性細(xì)菌鏈中生長(zhǎng)時(shí)，相同輔助噬菌體不顯現(xiàn)該外表面序列的第二復(fù)制，因此產(chǎn)生多價(jià)展示系統(tǒng)。同樣地，作為適宜的“開關(guān)”，該抑制性密碼子可控制任一形式的兩種不同條件下的展示。抑制性可譯終止碼的實(shí)例是琥珀、赭石和貓眼石密碼子。
本發(fā)明適配器的一般特性構(gòu)建該噬菌體展示系統(tǒng)的進(jìn)一步考慮是選擇一對(duì)適配器序列，該對(duì)適配器序列對(duì)能夠成對(duì)相互作用的兩適配器進(jìn)行編碼。然而該適配器序列之一是與由該噬菌體中間載體所攜帶的該外源性序列插入框架中，另一序列是與該輔助噬菌體載體的至少一個(gè)外表面蛋白質(zhì)在框架內(nèi)融合。通過“成對(duì)相互作用”表示該兩適配器可相互作用且相互結(jié)合以形成穩(wěn)定絡(luò)合物。該穩(wěn)定絡(luò)合物必須具有足夠長(zhǎng)持久性以允許該多肽在該基因包裝的外表面上包裹。該絡(luò)合物或二聚體必須能夠承受在形成瞬間和所展示多肽的探測(cè)瞬間之間所存在或引入的任何條件，該等條件是所執(zhí)行的分析或反應(yīng)的函數(shù)。對(duì)于在周質(zhì)中(periplasmically)組合的噬菌體(例如M13)，絡(luò)合物或二聚體在停留于該細(xì)菌周質(zhì)中時(shí)必須足夠穩(wěn)定，其中該絡(luò)合物或二聚體是與該噬菌體基因包裝一起包裹。只要該穩(wěn)定絡(luò)合物或二聚體滿足此限制的其它需要，其就可以是不可逆或可逆。因此，在反應(yīng)混合物中可形成瞬時(shí)絡(luò)合物或二聚體，但若其隨即分解且產(chǎn)生在基因包裝的外表面上無法探測(cè)的多肽，則其不能構(gòu)成穩(wěn)定絡(luò)合物。
在第一和第二適配器之間的成對(duì)相互作用可以是共價(jià)或非共價(jià)相互作用。非共價(jià)相互作用包含每一離去的穩(wěn)定連接，但無法形成共價(jià)鍵。非共價(jià)相互作用的非限制性實(shí)例包含兩親性肽的離子鍵、氫鍵結(jié)合、范·德瓦耳斯力、空間交錯(cuò)。相反，共價(jià)相互作用可形成共價(jià)鍵，其包括(但不限于)在兩個(gè)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵、在兩個(gè)含碳分子之間的C-C鍵、分別在碳和含氧或含氫的分子之間的C-O或C-H、以及在含氧和含磷分子之間的O-P鍵。
可應(yīng)用于構(gòu)建該展示系統(tǒng)的表達(dá)和輔助載體的適配器序列可由多種來源獲得。通常，任何包含在穩(wěn)定多聚物中的蛋白質(zhì)序列是候選適配器序列。同樣地，該等序列可以由任何同型多元體或異源多元體蛋白質(zhì)絡(luò)合物獲得。典型的同型多元體蛋白質(zhì)是同源二聚受體(例如由血小板所獲得的生長(zhǎng)因子)、同源二聚體BB(PDGF)、同源二聚轉(zhuǎn)錄因子(例如Max同源二聚體、NF-kappaB p65(RelA)同源二聚體)和生長(zhǎng)因子(例如神經(jīng)營養(yǎng)素同源二聚體)。異源多元體蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例是蛋白質(zhì)激酶和含SH2區(qū)域的蛋白質(zhì)(Cantley等人(1993)Cell 72767-778；Cantley等人(1995)J.Biol.Chem.270(44)26029-26032)的絡(luò)合物、異源二聚轉(zhuǎn)錄因子和異源二聚受體。
優(yōu)選異源二聚轉(zhuǎn)錄因子是a-Pal/Max絡(luò)合物和Hox/Pbx絡(luò)合物。Hox代表一大系列轉(zhuǎn)錄因子，胚胎發(fā)生期間將該前-后軸圖案化時(shí)包含該等因子。Hox蛋白質(zhì)與具有已保存的三α螺旋異源區(qū)域的DNA結(jié)合。為了結(jié)合至特定DNA序列，Hox蛋白質(zhì)需要存在異源伴侶，例如該P(yáng)bx異源區(qū)域。為了理解Hox-Pbx絡(luò)合物的形成如何發(fā)生且該絡(luò)合物如何與DNA結(jié)合，Wolberger等人解答了HoxB1-Pbx1-DNA三重絡(luò)合物的該2.35_晶體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)展示每個(gè)蛋白質(zhì)的異源區(qū)域與臨近識(shí)別序列是在DNA的對(duì)邊上結(jié)合。異源二聚經(jīng)由在HoxB1的同源區(qū)域的六氨基酸六元肽氨基末端和在Pbx1中的穴之間的接觸發(fā)生，Pbx1是在螺旋3和螺旋1、2之間形成。該P(yáng)bx1同源區(qū)域的C-終端延伸形成α螺旋，該螺旋對(duì)螺旋1進(jìn)行壓縮以形成較大的四螺旋同源區(qū)域(Wolberger等人(1999)Cell 96587-597；Wolberger等人J Mol Biol.291521-530)。
大量異源二聚受體已經(jīng)確認(rèn)。其包括(但不限于)與生長(zhǎng)因子(例如heregulin)、神經(jīng)遞質(zhì)(例如γ-Arninobutyric acid)和其它有機(jī)或無機(jī)小分子(例如礦質(zhì)類固醇皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素)相結(jié)合的受體。優(yōu)選異源二聚受體是核激素受體(Belshaw等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93(10)4604-4607)、erbB3和erbB2受體絡(luò)合物和G蛋白質(zhì)偶合受體，該偶合受體包括(但不限于)鴉片樣物質(zhì)(Gomes等人(2000)J.Neuroscience 20(22)RC110；Jordan等人(1999)Nature 399697-700)、毒蕈堿型、多巴胺、血清素、腺苷/多巴胺和GABAB系列受體。對(duì)于大多數(shù)已知異源二聚受體，已發(fā)現(xiàn)其C-終端序列可調(diào)節(jié)異源二聚的形成。
與使L和H鏈成為二聚體有關(guān)的抗體鏈的序列亦可用作適配器來構(gòu)建本展示系統(tǒng)。該等序列包括(但不限于)L或H鏈的恒定區(qū)序列。此外，適配器序列可由抗體結(jié)合位點(diǎn)序列和其結(jié)合抗體獲得。在此情況下，該對(duì)適配器之一含有抗體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸，該適配器已得到其它含有相應(yīng)抗原殘基的適配器的認(rèn)可(例如可穩(wěn)定地聯(lián)合)。
基于大量關(guān)于多族基因的遺傳學(xué)和生物化學(xué)資料，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員之一采取適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)將能夠選擇和獲得合適的用于構(gòu)建本展示系統(tǒng)的適配器序列。
若需要，由新穎的異源多元體蛋白質(zhì)所得的序列則能用作適配器。在此情況下采取適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)，與異源多元體的形成有關(guān)的候選序列的確認(rèn)可由任何遺傳學(xué)或生物化學(xué)的分析來測(cè)定。此外，計(jì)算機(jī)建模和檢索技術(shù)進(jìn)一步促進(jìn)異源多元體序列的測(cè)定，該異源多元體序列是基于在相關(guān)和不相關(guān)基因中所顯現(xiàn)的普通區(qū)域的序列同源。允許同源檢索的程序的非限制性實(shí)例是Blast(http//www.ncbi.nhn.nih.gov/BLAST/)、Fasta(Genetics Computing Group package，Madison，Wisconsin)、DNA Star、Clustlaw、TOFFEE、COBLATH、Genthreader和MegAlign。任何含有與目標(biāo)受體或其片段相關(guān)的DNA序列的序列數(shù)據(jù)庫均可用于分析。通常所應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫包括(但不限于)GenBank、EMBL、DDBJ、PDB、SWISS-PROT、EST、STS、GSS和HTGS。
基于其物理特性，可進(jìn)一步將由異源二聚序列所獲得的本適配器特征化。優(yōu)選異源二聚序列展現(xiàn)成對(duì)親合力，此導(dǎo)致主要形成了異源二聚體和實(shí)質(zhì)上排除了同源二聚體。較佳地，該主要形成可產(chǎn)生異源多元體庫，該異源多元體庫含有至少60％異源二聚體(更佳地至少80％異源二聚體，較佳地在85-90％之間的異源二聚體，且較佳地在90-95％之間的異源二聚體，且最佳地在96-99％之間的異源二聚體)，該等異源二聚體可以在生理緩沖條件下和/或生理機(jī)體溫度下形成。在本發(fā)明的某些具體實(shí)施例中，該適配器對(duì)的至少一個(gè)異源二聚序列基本上無法在生理緩沖條件下和/或生理機(jī)體溫度下形成同源二聚體?！盎旧蠠o法”表示該選擇的異源二聚序列在單獨(dú)測(cè)試時(shí)(如Kammerer等人(1999)『化學(xué)生物化學(xué)』(Biochemistry)3813263-13269所詳述的)在體外沉淀試驗(yàn)中或在體外兩種混合酵母的分析(參看例如White等人Nature(1998)396679-682)中不長(zhǎng)生可探測(cè)劑量的同源二聚體。此外，個(gè)別異源二聚序列可在宿主細(xì)胞中顯現(xiàn)，且宿主細(xì)胞中的同源二聚體的存在可由多種蛋白質(zhì)分析來證明，該等蛋白質(zhì)分析包括(但不限于)SDS-PAGE、免疫印記法(免疫印記法)和免疫沉淀反應(yīng)。該體外分析必須在生理緩沖條件下(或較佳地在生理機(jī)體溫度下)來進(jìn)行。通常，生理緩沖劑含有鹽的生理濃度和在經(jīng)調(diào)整過的約6.5至約7.8(并且較佳地在約7.0至約7.5)范圍內(nèi)變化的中性pH值。在Sambrook等人(1989)如上中列舉了多種生理緩沖劑，因此本文不再詳述。優(yōu)選生理?xiàng)l件見Kammerer等人的如上所述。
展現(xiàn)上述物理特性的說明性適配器對(duì)是GABAB-R1/GABAB-R2受體。此兩個(gè)受體基本上無法在生理?xiàng)l件下(例如在體內(nèi))和在生理機(jī)體溫度下形成同源二聚體。由Kuner等人和White等人(Science(1999)28374-77；Nature(1998)396679-682)所做的研究已證實(shí)GABAB-R1和GABAB-R2在體內(nèi)的該異源二聚特性。實(shí)際上，White等人能夠基于該異源二聚受體對(duì)的排外特性由酵母細(xì)胞中克隆GABAB-R2。由Kammerer等人的如上所做的體外研究已展示GABAB-R1和GABAB-R2的C-終端序列在生理機(jī)體溫度下分析時(shí)均無法在生理緩沖條件下形成同源二聚體。特定地，Kammerer等人已由沉淀試驗(yàn)證實(shí)該GABAB受體1和2的異源二聚序列在單獨(dú)測(cè)試時(shí)在生理調(diào)價(jià)下和在生理機(jī)體溫度(例如在37℃)下沉淀分子質(zhì)量的該單體。在以當(dāng)量克分子的劑量混合時(shí)，GABAB受體1和2的異源二聚序列以與該兩序列(參看Kammerer等人的表1)的異源二聚體相應(yīng)的分子質(zhì)量沉淀。然而，在將該GABAB-R1和GABAB-R2的C-終端序列連接至半胱氨酸殘基時(shí)，同源二聚體可經(jīng)由二硫鍵的形成而發(fā)生。
適配器可進(jìn)一步基于其二級(jí)結(jié)構(gòu)來特征化。優(yōu)選適配器由采用卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的兩性肽組成。該螺旋卷曲螺旋是在蛋白質(zhì)中的一個(gè)主要子組齊聚序列。初步序列分析展示所有蛋白質(zhì)殘基的大約2-3％形成卷曲螺旋(Wolf等人(1997)Protein Sci-61179-1189)。適當(dāng)特征化的含卷曲螺旋的蛋白質(zhì)包括該細(xì)胞骨架系的組員(例如α-角蛋白、波形蛋白纖維(vimentin))、細(xì)胞骨架系運(yùn)動(dòng)原系(cytoskeletal motor family)(例如肌球蛋白、驅(qū)動(dòng)蛋白和動(dòng)力蛋白)、病毒性膜蛋白質(zhì)(例如Ebola或HTV的膜蛋白質(zhì))、DNA結(jié)合蛋白質(zhì)和細(xì)胞表面受體(例如GABAB受體1和2)。本發(fā)明的卷曲螺旋適配器可廣泛分為兩類，也就是左旋和右旋卷曲螺旋。該左旋卷曲螺旋是由“七個(gè)一組”重復(fù)表示的“abcdefg”來特征化表示，同時(shí)伴隨優(yōu)選定位于該第一(a)和第四(d)位置的非極性殘基。在此兩個(gè)位置處的殘基通常組成與其它鏈互鎖的“球形突出物和孔”的之字形圖案以形成密合疏水性核。相反，覆蓋該卷曲螺旋周邊的第二(b)、第三(c)和第六(f)位置處較佳地充滿殘基。充滿氨基酸的實(shí)例包括堿性殘基(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)和酸性殘基(例如門冬氨酸、谷氨酸、天門冬酰胺)和谷氨酰胺。適于設(shè)計(jì)異源二聚卷曲螺旋的未充滿的或非極性的氨基酸包括(但不限于)甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、]亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。未充滿殘基通常形成疏水性核，包括充滿殘基的中螺旋狀(inter-helical)和內(nèi)螺旋狀鹽橋甚至在核心位置也可用于穩(wěn)定全面螺線卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(Burkhard等人(2000)J.Biol.Chan.27511672-11677)。盡管可采用卷曲螺旋的改變的長(zhǎng)度，該卷曲螺旋較佳地含有二至十個(gè)“七個(gè)一組”的重復(fù)。更佳地，該適配器含有三至八個(gè)“七個(gè)一組”的重復(fù)，甚至更佳地含有四至五個(gè)“七個(gè)一組”的重復(fù)。
在設(shè)計(jì)最佳卷曲螺旋適配器時(shí)，可應(yīng)用多種可預(yù)知肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)的現(xiàn)有計(jì)算機(jī)軟件程序。將COILS算法應(yīng)用于一種說明性計(jì)算機(jī)分析，該算法可將一個(gè)氨基酸序列與在已知兩鏈卷曲螺線的數(shù)據(jù)庫中的序列相比，且可預(yù)知高概率卷曲螺旋伸縮性(Kammerer等人(1999)『化學(xué)生物化學(xué)』(Biochemistry)3813263-13269)。
包含在多元體形成中的多種卷曲螺旋可用作本展示系統(tǒng)中的適配器。優(yōu)選卷曲螺旋是由異源二聚受體獲得。因此，本發(fā)明包含由GABAB受體1和2所獲得的卷曲螺旋適配器。一方面，該卷曲螺旋適配器包含GABAB受體1和GABAB受體2的該C-終端序列。另一方面，該適配器是由至少30種氨基酸殘基的兩種不同多肽組成，其中之一基本上與圖23(GR1)中所描述的可比長(zhǎng)度的直鏈序列相同，且另一個(gè)基本上與圖23(GR2)中所描述的可比長(zhǎng)度的直鏈肽序列相同。
另一類優(yōu)選卷曲螺旋適配器是亮氨酸拉鏈。該亮氨酸拉鏈已在本技術(shù)中定義為含有4-5個(gè)通過六種氨基酸(Maniatis和Abel，(1989)Nature 34124)互相分離的亮氨酸殘基的約35種氨基酸的伸展。已發(fā)現(xiàn)亮氨酸拉鏈存在于多種真核DNA結(jié)合蛋白質(zhì)中，例如GCN4、C/EBP、c-fos基因產(chǎn)物(Fos)、c-jun基因產(chǎn)物(Jun)和c-Myc基因產(chǎn)物。在該等蛋白質(zhì)中，亮氨酸拉鏈造成二聚界面，其中含亮氨酸拉鏈的蛋白質(zhì)可形成穩(wěn)定同源二聚體和/或異源二聚體。由兩個(gè)原癌基因(proto-oncogenes)(c-fos和c-jun)來編碼的該蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分子類型分析已展示了優(yōu)選異源二聚體形成的情況(Gentz等人(1989)Science2431695；Nalcabeppu等人(1988)Cell 55907；Cohen等人(1989)GenesDev.3173)。亦已經(jīng)展示包含F(xiàn)os和Jun的亮氨酸拉鏈區(qū)域的合成肽可調(diào)節(jié)異源二聚體形成，且在該合成肽的氨基端各自包括一種半胱氨酸殘基以允許分子間二硫結(jié)合，異源二聚體形成發(fā)生于同源二聚的實(shí)質(zhì)排除。
本發(fā)明的亮氨酸拉鏈適配器具有通用結(jié)構(gòu)式，其作為“七個(gè)一組”重復(fù)(亮氨酸-X1-X2-X3-X4-X5-X6)n，其中X可以是傳統(tǒng)的20種氨基酸中的任一種，但最有可能是具有α-螺旋形成潛力的氨基酸，例如丙氨酸、纈氨酸、天門冬胺酸、谷氨酸和賴氨酸，且n可以是2或更大，盡管其通常是3至10(較佳地4至8，更佳地4至5)。優(yōu)選序列是Fos或Jun亮氨酸拉鏈。
若兩個(gè)序列均展現(xiàn)實(shí)質(zhì)氨基酸或核苷酸序列同源，則本文所用的肽的直鏈序列與另一直鏈序列“基本相同”。通常實(shí)質(zhì)上相同的序列在同源區(qū)域的結(jié)盟后，相互是至少約60％相同。較佳地，該序列是至少約70％相同；更佳地，其是至少約80％相同；更佳地，其是至少約90％相同；更佳地，該等序列是至少約95％相同；最佳地，該等序列是100％相同。
在確定多肽序列是否基本相同時(shí)，一個(gè)保存與其相比的多肽的功能性的序列是尤其較佳。功能性可通過不同標(biāo)準(zhǔn)來建立，例如與配對(duì)(pairing)適配器形成穩(wěn)定絡(luò)合物的能力和促進(jìn)在框架內(nèi)與該適配器融合的多肽的展示的能力。
適配器包括改性的亮氨酸拉鏈和與本文所例示的多肽序列功能性相同的GABAB異源二聚序列。提供改性的對(duì)于成對(duì)適配器的穩(wěn)定性和/或展示效率的改性多肽是較佳的。改性多肽的實(shí)例包括具有氨基酸殘基的保守取代的多肽，和氨基酸的一種或多種刪除或添加，該等刪除或添加明顯有害地改變異源二聚特性。只要維持該成對(duì)相互作用，取代作用可自將一種或多種氨基酸殘基替代或修改為一個(gè)區(qū)域的完整再設(shè)計(jì)來變化。氨基酸取代作用(若存在)是較佳的保守取代，其不會(huì)有害地影響肽的折疊或功能特性?？蛇M(jìn)行保守取代的功能性描述氨基酸的組是甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天門冬胺酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸/蛋氨酸；賴氨酸/精氨酸(argimne)和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。本發(fā)明的多肽可以是糖基化或未糖基化形式，可將其柱狀平移(post-translationally)(例如乙?；饔煤土姿峄饔?改性或可將其綜合(例如標(biāo)簽組的附著)改性。
本發(fā)明的適配器序列可應(yīng)用傳統(tǒng)重組體方法和/或化學(xué)合成來獲得。應(yīng)用良好建立的限制和結(jié)合技術(shù)，將適當(dāng)?shù)倪m配器序列自各種DNA來源中刪去且在框架內(nèi)與外源性基因序列和外表面序列分別結(jié)合以產(chǎn)生表達(dá)和輔助載體。
較佳地，以將所得外源性融合多肽上的結(jié)構(gòu)界面(若有)最小化的方式將第一適配器插入于該表達(dá)載體中。然而第一適配器可融合為該外源性基因序列的5′或3′，圖9A描述一種優(yōu)選噬菌體中間載體，其中該適配器序列(例如由GABAB受體1所獲得的異源二聚序列)在框架內(nèi)融合為該外源性基因序列的3′末端。
相似地，在展示噬菌體外殼的完整性未破壞的位置處，將第二適配器序列插入于該輔助載體中。若不打斷編碼區(qū)域，則該適配器序列可融合為外表面序列的5′或3′末端。圖5和19描述兩種優(yōu)選輔助噬菌體載體，其中該適配器序列(例如由GABAB受體2所獲得的異源二聚序列)在框架內(nèi)置于該外表面序列、基因HI或其功能性部分的5′末端。
本發(fā)明的細(xì)菌展示系統(tǒng)本發(fā)明亦提供包含下述兩種組分的細(xì)菌展示系統(tǒng)(1)攜帶所關(guān)心的外源性基因的細(xì)菌表達(dá)載體，其可對(duì)在細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)菌孢子的外表面上的待展示的外源性多肽進(jìn)行編碼；和(2)促進(jìn)所特別關(guān)心的多肽的展示。與先前所述的細(xì)菌系統(tǒng)(其中該外源性多肽作為與細(xì)菌外表面蛋白質(zhì)的融合來展示)不同，該細(xì)菌系統(tǒng)具有下述獨(dú)特特征。首先，該細(xì)菌表達(dá)載體包含對(duì)待展示的該外源性多肽進(jìn)行編碼的編碼序列，該序列在框架內(nèi)以第一適配器來融合。第二，該細(xì)菌表達(dá)載體缺乏對(duì)細(xì)菌或細(xì)菌孢子的功能性外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的外表面序列。第三，該輔助載體包含對(duì)該基因包裝進(jìn)行包裹所必需的所有外表面序列，該等外表面序列中的至少一個(gè)是在框架內(nèi)融合為第二適配器序列，且其中外源性多肽的展示是通過在第一和第二適配器之間的成對(duì)相互作用來調(diào)節(jié)。
上述用于構(gòu)建噬菌體展示系統(tǒng)的通用原則和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同樣可應(yīng)用于產(chǎn)生細(xì)菌展示系統(tǒng)。盡管細(xì)菌表達(dá)載體缺少對(duì)任何功能性外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的序列，輔助細(xì)菌載體含有補(bǔ)償該不足所必需的外表面序列。
輔助細(xì)菌載體通常包含對(duì)具有下述兩個(gè)區(qū)域的外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的外表面序列(1)將待分泌的蛋白質(zhì)經(jīng)由雙層脂質(zhì)引導(dǎo)至周質(zhì)的信號(hào)肽；和(2)能夠?qū)⑼獗砻娴鞍踪|(zhì)定位于細(xì)菌細(xì)胞該外表面上的膜移位區(qū)域。顯現(xiàn)的外表面蛋白質(zhì)首先傳輸至周質(zhì)，其中引導(dǎo)肽已裂開。在外表面蛋白質(zhì)是作為與適配器的融合來顯現(xiàn)時(shí)，適配器促進(jìn)外源性多肽的移位，在與外源性多肽中所含有的成對(duì)(paring)適配器結(jié)合時(shí)，適配器亦存在與在細(xì)菌外表面上的周質(zhì)中。
先前研究已展示大量細(xì)菌表面蛋白質(zhì)編碼序，其能用于構(gòu)建輔助細(xì)菌表達(dá)載體。細(xì)菌表面蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例是LamB(Bremer等人Proc.Natl Acad.Sci U.S.A.(1984)813830-34；Gene(1987)52165-73)；OmpA(Prog BiophysMolec Biol(1987)4989-115)；OmpC(Misra等人(1988)J.Bacteriol 170528-33)；OmpF(Pages等人Biochemimie(1990)72169-76)；PhoE(van derLey等人J.Biol.Chem.26112222-5)；pilin(So等人Curr Top in Microbiol&Immunol(1985)11813-28)；pldA(de Geus等人EMBO J.(1984)3(8)1799-1802)、BtuB、FepA、FhuA、IutA、FecA和FhuE(Gudmundsdottir等人(1989)J.Bacteriol 171(12)6526-33)；GIP錨定蛋白質(zhì)INP(Kim等人(1999)Lett Appl Microbiol 29(5)292-297)和β-自傳送蛋白質(zhì)AIDA(Veiga等人(1999)Mol Microbiol 331232-1243)和其它外膜脂蛋白(例如TratT、Pal、Oprl、OsmB、N1pB和BlaZ)。多種停留于細(xì)菌孢子的表面上的外殼蛋白質(zhì)亦已經(jīng)確定。其相關(guān)基因序列已隨后分離。例如Donovan等人報(bào)告Bacillus subtilis孢子外殼CotD和CotC基因的確認(rèn)(Donovan等人(1987)J.Mol.Biol.1961-10)。該等和其它表面蛋白質(zhì)的特征化已在下述文獻(xiàn)中詳述Pierre Cornelis等人(2000)Curr.Opin.Biotech.L1(5)450-454；Lang等人(2000)Int.J.Med.Microbiol.290579-585；Daugherty等人(1999)Protein Engineering 12(7)613-621；美國專利第5,837,500號(hào)和第5,348,867號(hào)及其中所應(yīng)用的文獻(xiàn)。
該等或其它細(xì)菌外表面蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和膜置換已為此項(xiàng)技術(shù)中已知。該信號(hào)肽通常含有該蛋白質(zhì)的最初5至30種氨基末端氨基酸。該膜置換區(qū)域通常包含一種或多種極易由計(jì)算機(jī)輔助傳統(tǒng)序列分析來確認(rèn)的膜生成片段。應(yīng)用傳統(tǒng)合成和重組體技術(shù)，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員之一能夠容易地獲得適當(dāng)?shù)亩嚯暮秃塑账?。若須要，外表面蛋白質(zhì)的該信號(hào)肽可以在框架內(nèi)附著于另一外表面蛋白質(zhì)的該膜置換區(qū)域，反之亦然。已展示該嵌合體可在細(xì)菌外表面(美國專利第5,837,500號(hào))上顯現(xiàn)。同樣地，上述細(xì)菌外表面蛋白質(zhì)的任一種信號(hào)肽引導(dǎo)肽可以在框架內(nèi)連接至任何天然細(xì)菌外表面蛋白質(zhì)的該膜置換區(qū)域。同樣地，上述外表面蛋白質(zhì)中的任一種的置換區(qū)域能在框架內(nèi)融合為細(xì)菌或其它起點(diǎn)的任何蛋白質(zhì)的信號(hào)肽，已知該信號(hào)肽能夠引導(dǎo)該融合至該細(xì)菌周質(zhì)。
本發(fā)明的細(xì)菌表達(dá)載體缺乏對(duì)任何功能性細(xì)菌外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的序列。在構(gòu)建該表達(dá)載體時(shí)，任何上述外表面序列均是候選待排除序列。本文所使用的術(shù)語“功能性”表示該編碼外表面蛋白質(zhì)保持促進(jìn)或引導(dǎo)該基因包裝在其外表面上對(duì)所關(guān)心多肽進(jìn)行組合的能力?！肮δ堋钡膿p失可有助于將產(chǎn)生下述情況的改進(jìn)(1)功能性信號(hào)肽的損失，該功能性信號(hào)肽可將該外表面蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)置換引導(dǎo)至該細(xì)菌細(xì)胞的[周質(zhì)]內(nèi)，其中該信號(hào)肽然后將裂開；(2)膜移位區(qū)域的功能損失，該膜移位區(qū)域可將成熟多肽移位于該細(xì)菌細(xì)胞膜上；和/或(3)內(nèi)部終止碼的引入，其可以防止任何功能性外表面蛋白質(zhì)的表達(dá)。
作為在該噬菌體展示系統(tǒng)中所用的序列，連接至表達(dá)和輔助載體的兩個(gè)適配器序列具有相同的結(jié)構(gòu)和功能特征。可應(yīng)用于構(gòu)建該噬菌體展示系統(tǒng)的任何適配器序列同樣適用于產(chǎn)生該細(xì)菌展示系統(tǒng)。因此，用于選擇和制備該成對(duì)適配器的標(biāo)準(zhǔn)和程序不在此部分重復(fù)。
合適的細(xì)菌基因包裝包括所有細(xì)菌株，其能夠在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)且可將其設(shè)計(jì)為可在外表面上展示外源性多肽且與親合力選擇一致。優(yōu)選基因包裝是革蘭氏(gram)-負(fù)細(xì)菌。優(yōu)選物種的非限制性實(shí)例包括鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、肺炎克氏桿菌(Klebsiella pneumonia)、生殖性奈瑟氏菌(Neisseria gonoirhoeae)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、多類桿菌(Bacteroides nodosus)、牛莫拉氏菌(Moraxella bovis)，且尤其是埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)。
細(xì)菌孢子具有基因包裝期望的特性。孢子比植物細(xì)菌細(xì)胞更能抗化學(xué)和物理試劑，且因此允許使用多種測(cè)試條件。例如，該種類桿菌的細(xì)菌可形成完全抗熱、輻射、干燥和有毒化學(xué)物質(zhì)(Losick等人Ann.Rev.Genet.(1986)20625-669)破壞的內(nèi)生孢子。此外，該桿菌孢子既不能積極產(chǎn)生代謝變化，亦不能改變?cè)谄浔砻嫔系牡鞍踪|(zhì)。該現(xiàn)象有助于擴(kuò)大該外殼蛋白質(zhì)的分子間交聯(lián)。其它適用于基因包裝的孢子是外生孢子，例如阿維鏈霉菌孢子。
構(gòu)建該噬菌體和細(xì)菌展示系統(tǒng)的其它考慮本發(fā)明的載體一般包含顯現(xiàn)該外源性多肽所必需的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制序列。合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制序列包括(但不限于)復(fù)制起點(diǎn)、促進(jìn)劑、強(qiáng)化因子、抑制結(jié)合區(qū)域、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)和用于轉(zhuǎn)錄和翻譯的終端位點(diǎn)。
復(fù)制的起點(diǎn)(通常指一個(gè)ori序列)允許該載體在合適的宿主細(xì)胞中復(fù)制。其選擇將取決于所應(yīng)用的宿主細(xì)胞和/或基因包裝的類型。其中該宿主細(xì)胞是原核生物且該基因包裝是噬菌體顆粒，該表達(dá)載體通常包含兩個(gè)ori序列、在原核生物中的該載體的自主引導(dǎo)復(fù)制和該噬菌體顆粒的其它支持包裹。優(yōu)選原核ori能夠在細(xì)菌細(xì)胞中引導(dǎo)載體復(fù)制。此類ori的非限制性實(shí)例包括pMB1、pUC和其它大腸桿菌起點(diǎn)。該噬菌體顆粒的優(yōu)選ori支持包裹包括(但不限于)f1ori、Pf3噬菌體復(fù)制ori。
本文所用的“促進(jìn)劑”是在某些條件下能夠結(jié)合RNA多聚酶且能夠引起來自于該促進(jìn)劑的編碼區(qū)域定位下游(在3′方向)的轉(zhuǎn)錄。其可以是可構(gòu)成的或可誘導(dǎo)的。通常，該促進(jìn)劑序列是通過轉(zhuǎn)錄開始位點(diǎn)限制于其3′終點(diǎn)且向上(5′方向)延伸以包括在上述可探測(cè)的水平處引起轉(zhuǎn)錄所必需的最少數(shù)目的堿或元素。其中該促進(jìn)劑序列和對(duì)RNA多聚酶負(fù)責(zé)的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。真核促進(jìn)劑將常常(但不總是)含有“TATA”部分和“CAT”部分。
促進(jìn)劑的選擇將在很大程度上取決于宿主細(xì)胞，其中引入該載體。對(duì)于原核細(xì)胞，多種穩(wěn)固促進(jìn)劑在此技術(shù)中是已知的。優(yōu)選促進(jìn)劑是lac促進(jìn)劑、Trc促進(jìn)劑、T7促進(jìn)劑和pBAD促進(jìn)劑。
用于其它原核細(xì)胞的合適的促進(jìn)劑包括用于3-磷酸甘油酸鹽活化酶或其它糖酵解酶的促進(jìn)劑，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶、環(huán)活化酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸鹽異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸鹽變位酶、丙酮酸鹽活化酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。具有由生長(zhǎng)條件所控制的轉(zhuǎn)錄的另外優(yōu)點(diǎn)的其它促進(jìn)劑是用于醇脫氫酶2、異氰酸鉻(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、與氮素代謝相結(jié)合的降解酶、上述甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶、和對(duì)麥芽糖和半乳糖利用負(fù)責(zé)的酶的促進(jìn)劑區(qū)域。
在構(gòu)建該載體時(shí)，亦將與該外源性序列相關(guān)的該終止序列插入于期望的轉(zhuǎn)錄的該序列的3′末端以提供該mRNA的多腺苷酸和/或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。該終止序列較佳地含有一種或多種轉(zhuǎn)錄終止序列(例如多腺苷酸序列)且亦可由另外DNA序列來加長(zhǎng)以進(jìn)一步破壞轉(zhuǎn)錄通讀。本發(fā)明的優(yōu)選終止序列(或終止位點(diǎn))具有跟隨轉(zhuǎn)錄終止序列的基因，該終止序列可以是其自身終止序列或異源終止序列。該等終止序列的實(shí)例包括與各種多腺苷酸序列偶合的終止碼，該等多腺苷酸序列在該此技術(shù)中已知、廣泛應(yīng)用且在下面例示。該終止劑包含一個(gè)基因，其有利于應(yīng)用一個(gè)對(duì)探測(cè)性或選擇性標(biāo)記進(jìn)行編碼的基因；從而提供一個(gè)可探測(cè)和/或選擇該終止劑序列的存在和/或不存在(和相應(yīng)的該轉(zhuǎn)錄單元的失活和/或激活構(gòu)件)的構(gòu)件。
除了上述元素外，該等載體可含有一個(gè)選擇性標(biāo)記(例如對(duì)以該載體來轉(zhuǎn)換的宿主細(xì)胞的存活或生長(zhǎng)所必需的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因)，盡管該標(biāo)記基因可在共同引入該宿主細(xì)胞中的另一聚核苷酸序列上進(jìn)行。只有選擇性基因已引入其中的宿主細(xì)胞才能在選擇性條件下存活和/或生長(zhǎng)。典型選擇基因?qū)ο铝?多種)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼(a)賦予對(duì)于抗生素或其它毒素(例如氨必西林、卡那霉素、新鏈絲菌素、G418、氨甲蝶呤等)的抵抗性；(b)補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷的缺乏；或(c)供應(yīng)絡(luò)合物介質(zhì)無法得到的關(guān)鍵性營養(yǎng)素。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記基因的選擇將取決于該宿主細(xì)胞且用于不同宿主的適當(dāng)?shù)幕蛟诖隧?xiàng)技術(shù)中是已知的。
在一優(yōu)選具體實(shí)施例中，該載體是往復(fù)載體，能夠在至少兩種不相關(guān)表達(dá)載體中復(fù)制。為了促進(jìn)該復(fù)制，該載體通常含有復(fù)制的至少兩個(gè)起點(diǎn)，其在各自表達(dá)系統(tǒng)中有效。典型地，往復(fù)載體能夠在真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)中復(fù)制。此使得能夠在真核宿主(該表達(dá)細(xì)胞類型)中探測(cè)該載體且能夠在原核宿主(該放大細(xì)胞類型)中放大該載體。盡管此技術(shù)中已知的任何合適的起點(diǎn)只要可引導(dǎo)該載體的復(fù)制就可應(yīng)用，但較佳地，復(fù)制的一個(gè)起點(diǎn)是由SV40獲得且另一個(gè)是由pBR322獲得。如果該載體是往復(fù)載體，那么該載體較佳地含有至少兩個(gè)選擇性標(biāo)記，一個(gè)用于表達(dá)細(xì)胞類型，一個(gè)用于放大細(xì)胞類型。只要其在所利用的表達(dá)系統(tǒng)中起作用，任何此技術(shù)中已知的選擇性標(biāo)記或本文中所述的就可應(yīng)用。
本發(fā)明所包含的載體可應(yīng)用重組體克隆方法和/或通過化學(xué)合成來獲得。我們已熟知大量重組體克隆技術(shù)，例如PCR、限制性核酸內(nèi)切酶消化和結(jié)合，且本文不必詳述。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員之一亦可應(yīng)用本文或在公共或私有數(shù)據(jù)庫中所提供的序列以通過此技術(shù)可用的任何合成構(gòu)件來獲得期望的載體。另外，應(yīng)用已知限制和結(jié)合技術(shù)，適當(dāng)?shù)男蛄锌勺远喾NDNA來源中切離或在操作性關(guān)系中與本發(fā)明相應(yīng)的待顯現(xiàn)的該外源性序列結(jié)合。
由本展示系統(tǒng)所顯現(xiàn)的該外源性序列可以是任何長(zhǎng)度的異源序列。“異源”表示由與來自于其所對(duì)應(yīng)整體的剩余物在基因上不同的整體所獲得。例如，該異源序列可以是通常不在該基因包裝(例如細(xì)菌細(xì)胞或噬菌體顆粒)中顯現(xiàn)的基因?；蛘?，該異源序列可以是該基因包裝本來的基因，但其與除該天然序列之外的編碼序列相連接，該基因自然地且可操作地與該編碼序列連接。此外，該異源序列可對(duì)隨機(jī)或預(yù)定多肽進(jìn)行編碼。
由本系統(tǒng)顯現(xiàn)的該外源性序列亦可以基于下述特征中的一種或多種來特征化在特別生物學(xué)過程中所包含的物種起點(diǎn)、發(fā)展起點(diǎn)、初期結(jié)構(gòu)相似性，其與特別疾病或疾病標(biāo)記、組織、子組織或細(xì)胞特定表達(dá)圖案及該顯現(xiàn)基因產(chǎn)物的子細(xì)胞定位相結(jié)合或相沖突。
一方面，該外源性序列可以是任何在與該基因包裝不同的實(shí)體(例如植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞或酵母細(xì)胞)中顯現(xiàn)的序列。
另一方面，在多細(xì)胞動(dòng)物中形成外胚層、中胚層或內(nèi)胚層時(shí)，或在植物的葉、莖、芽的發(fā)展中，該外源性序列具有特定發(fā)展起點(diǎn)，例如在胚胎或成熟有機(jī)體中的起點(diǎn)。
另一方面，該外源性序列屬于一族基因或一子組基因，其共用初始結(jié)構(gòu)相似。結(jié)構(gòu)相似可由上述計(jì)算機(jī)軟件的輔助來識(shí)別?；蜃宓姆窍拗菩詫?shí)例包括對(duì)蛋白酶；蛋白酶抑制劑；細(xì)胞表面受體；蛋白質(zhì)活化酶(例如酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸或組氨酸活化酶)；三聚G蛋白質(zhì)；細(xì)胞激素；PH-；SH2-；SH3-；含蛋白質(zhì)的PDZ-區(qū)域；和由the Institute for Genomic Research(TIGR)、IncytePharmaceuticals Inc.、Human Genome Sciences Inc.、Monsanto和Celera所發(fā)行的任何基因族來進(jìn)行編碼的基因族。
另一方面，該外源性序列包含于特定生物學(xué)過程中，其包含(但不限于)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞區(qū)別、趨藥性(chemotaxsis)、細(xì)胞死、細(xì)胞游動(dòng)性和細(xì)胞骨架基因重排。另一方面，包含于本發(fā)明的該外源性序列與特別疾病或與特定疾病標(biāo)記相關(guān)。該等序列包括(但不限于)與自身免疫疾病、肥胖癥、高血壓、糖尿病、神經(jīng)元和/或肌肉變性疾病、心臟病、內(nèi)分泌紊亂和其任何組合相關(guān)的序列。
另一方面，該外源性序列涵蓋展現(xiàn)嚴(yán)格表達(dá)圖案的序列。此種類的非限制性典型基因轉(zhuǎn)錄不包括普遍存在的已顯現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄，而包括在一種或多種植物組織(包括葉、種子、塊莖、莖、根和芽)中有差別地顯現(xiàn)的基因轉(zhuǎn)錄；或是在包括心臟、肝臟、前列腺、肺、腎、骨髓、血液、皮膚、膀胱、大腦、肌肉、神經(jīng)和所選組織的動(dòng)物機(jī)體組織中所顯現(xiàn)的基因轉(zhuǎn)錄，其由各種類型的癌癥(惡性或非惡性)所影響且由囊腫性纖維化或多囊腎疾病所影響。非普遍存在的展示序列的另外實(shí)例是將蛋白質(zhì)產(chǎn)物定位于某些子細(xì)胞位置細(xì)胞外矩陣、核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架、原生質(zhì)和/或細(xì)胞內(nèi)膜狀結(jié)構(gòu)，其包括(但不限于)涂覆的坑、高爾基體(Golgi)裝置、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核內(nèi)體、溶酶體核線粒體。
本展示系統(tǒng)可包含基因包裝的選擇性文庫。該等基因包裝可顯現(xiàn)相同或不同外源性序列。一方面，基因包裝的文庫對(duì)一定量的隨機(jī)或預(yù)定多肽進(jìn)行編碼。另一方面，該文庫對(duì)一定量的由特定宿主起點(diǎn)、組織起點(diǎn)、發(fā)展標(biāo)記或特別疾病狀態(tài)所獲得的cDNA進(jìn)行編碼。
一特別優(yōu)選文庫對(duì)一定量的抗原結(jié)合單元進(jìn)行編碼。該抗原結(jié)合單元可以是單體或多元體。單體抗原結(jié)合單元通常指單鏈抗原結(jié)合單元(Sc Abus)，而該多元體抗原結(jié)合單元在本文中指非單鏈抗原結(jié)合單元(Nsc Abus)。
由本系統(tǒng)所展示的該非單鏈抗原結(jié)合單元可以是“單價(jià)”或“多價(jià)”。所展示的多價(jià)抗原結(jié)合單元可進(jìn)一步表征為“單特異性”或“多特定”抗原結(jié)合單元。為了展示多元體抗原結(jié)合單元，必須應(yīng)用兩組表達(dá)載體，包含該輕鏈(L)可變區(qū)域的一組和包含該重鏈(H)可變區(qū)域的另一組。盡管所顯現(xiàn)的抗體區(qū)域是通過較佳地在框架內(nèi)與該抗體區(qū)域融合的異源二聚序列來實(shí)現(xiàn)二聚作用，所顯現(xiàn)的抗體區(qū)域之一必須另外包含能夠與該輔助載體所提供的另一適配器成對(duì)相互作用的適配器。
應(yīng)用包括(但不限于)融合、PCR和DNA序列的傳統(tǒng)技術(shù)，極易獲得與現(xiàn)有抗體的L或H鏈的各種區(qū)域相關(guān)的核苷酸序列且對(duì)其進(jìn)行編序。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞是抗體核苷酸序列的優(yōu)選來源。產(chǎn)生一列單克隆抗體的大量雜交瘤細(xì)胞可以由公共或私有倉庫來獲得。最大的儲(chǔ)存劑是美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)(http//www.atcc.org)，其提供良好特征化的雜交瘤細(xì)胞株的多樣性收集?；蛘撸贵w核苷酸可由免疫或非免疫嚙齒動(dòng)物或人類來獲得，且形成有機(jī)體，例如脾和外周血液淋巴細(xì)胞。下述文獻(xiàn)中對(duì)應(yīng)用于萃取和合成抗體核苷酸的特定技術(shù)進(jìn)行了描述Orlandi等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 863833-3837；Larrick等人(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.1601250-1255；Sastry等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.865728-5732和第5,969,108號(hào)美國專利。
通過(例如)以用于人類重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列來取代其同源非人類序列亦可對(duì)該抗體核苷酸序列進(jìn)行改性，反之亦然。以此方式來制備可保持原始抗體的結(jié)合特性的嵌合抗體。
若須要，該外源性序列可包含用于半族的序列編碼，該等半族可促進(jìn)該蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)和凈化的探測(cè)。該等半族的實(shí)例是此項(xiàng)技術(shù)中已知且包括對(duì)指示器蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的半族，例如β-半乳糖激酶、β-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)、瑩光素酶、綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)和其衍生物。其它促進(jìn)凈化的序列可對(duì)單抗原決定簇例如Myc、HA(由流行性感冒病毒血細(xì)胞凝集素獲得)、His-6、FLAG或免疫球蛋白Fc部分、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)和麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)進(jìn)行編碼。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞本發(fā)明提供包含上述表達(dá)和/或輔助載體的宿主細(xì)胞。該通過許多適當(dāng)?shù)臉?gòu)件中的任一構(gòu)件可將該表達(dá)載體引入合適的原核或真核宿主細(xì)胞中，該構(gòu)件包括電穿孔、基因槍法；脂質(zhì)體法、感染(其中該載體是與一個(gè)感染試劑產(chǎn)生偶合)；應(yīng)用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-右旋糖酐或其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)染。依據(jù)宿主細(xì)胞的特征，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員之一極易實(shí)施此技術(shù)中已良好建立的一種或多種適當(dāng)構(gòu)件。
一旦引入于合適的宿主細(xì)胞中，該外源性序列的表達(dá)可應(yīng)用此技術(shù)中已知的任何核酸或蛋白質(zhì)分析來測(cè)定。例如，應(yīng)用補(bǔ)充該外源性序列的任何區(qū)域的探針，可由傳統(tǒng)融合分析(例如Northern blot analysis)、擴(kuò)大程序(例如RT-PCR)、SAGE(美國專利第5,695,937號(hào))和基于分析的技術(shù)(參看例如美國專利第5,405,783號(hào)、第5,412,087號(hào)和第5,445,934)來對(duì)該外源性序列的已轉(zhuǎn)錄mRNA的存在進(jìn)行探測(cè)和/或量化。
該外源性序列的表達(dá)亦可通過對(duì)所顯現(xiàn)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行檢查來測(cè)定。此技術(shù)中可應(yīng)用多種用于蛋白質(zhì)分析的技術(shù)。其包括(但不限于)放射免疫測(cè)定法(radioimmunoassays)、ELISA(酶連免疫吸附分析)、“夾層”免疫測(cè)定、免疫放射測(cè)定法(immunoradiometric assays)、現(xiàn)場(chǎng)免疫測(cè)定法(應(yīng)用例如膠態(tài)金、酶或放射性同位素示蹤)、免疫印記法分析、免疫沉淀反應(yīng)分析、螢光免疫檢驗(yàn)法和PAGE-SDS。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞尤其可用作該外源性序列、載體的倉庫或用于產(chǎn)生和篩選期望的多肽(例如基于其結(jié)合特性的抗原結(jié)合單元)的載體。
本發(fā)明的適配器定向展示系統(tǒng)的應(yīng)用本發(fā)明的適配器定向展示系統(tǒng)具有幾種特定用途。首先，該系統(tǒng)允許在合適的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生可溶性單體和多元體外源性多肽。第二，該系統(tǒng)允許單體和多元體多肽在所選基因包裝上的展示。本展示系統(tǒng)亦可用以創(chuàng)造用于多種用途的隨機(jī)或預(yù)定多肽、全長(zhǎng)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)區(qū)域的文庫。例如，所展示的文庫可用以測(cè)定抗原決定部位和模擬位(mimotopes)的位置、識(shí)別多種目標(biāo)蛋白質(zhì)的對(duì)抗體和激動(dòng)劑、設(shè)計(jì)抗體、優(yōu)化抗體特性和創(chuàng)造新穎結(jié)合活性。
因此，本發(fā)明提供可探測(cè)在測(cè)試劑和在基因包裝上所展示的外源性多肽之間的特定相互作用的存在的方法。該方法包含下述步驟(a)提供本展示系統(tǒng)的基因包裝，該基因包裝呈現(xiàn)該外源性多肽；(b)將該基因包裝在適于產(chǎn)生穩(wěn)定多肽-劑絡(luò)合物的條件下與測(cè)試劑接觸；和(c)探測(cè)在該基因包裝上的穩(wěn)定多肽-劑絡(luò)合物的形成，從而探測(cè)該特定相互作用的存在。
為了本發(fā)明，將“測(cè)試劑”規(guī)定為包括(但不限于)生物學(xué)或化學(xué)化合物，例如簡(jiǎn)單或復(fù)雜有機(jī)或無機(jī)分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類、聚核苷酸或其組合?？珊铣梢淮笙盗谢衔?，例如寡聚物，例如寡肽和寡核苷酸和基于各種核結(jié)構(gòu)的合成有機(jī)化合物，上述化合物亦包含于術(shù)語“試劑”中。此外，各種天然來源可提供用于篩選的化合物，例如植物或動(dòng)物萃取物及類似物。應(yīng)了解盡管不總是明確規(guī)定該試劑是單獨(dú)使用或與另一試劑組合使用，作為由本發(fā)明篩選所證實(shí)的試劑，其具有相同或不同生物學(xué)活性。優(yōu)選試劑是候選診斷程序和/或療法，例如能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的試劑。在一獨(dú)立具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供獲得具有期望的特性的多肽的方法。該方法包含下述步驟(a)提供本展示系統(tǒng)的選擇性文庫；和(b)篩選該選擇性文庫以獲得至少一個(gè)展示具有期望的特性的多肽的基因包裝。該方法可進(jìn)一步包含分離該基因包裝的步驟，其展示具有期望的特性的多肽。該基因包裝的分離可包含由對(duì)期望的多肽進(jìn)行編碼的基因包裝中獲得核苷酸序列。期望的特性涵蓋了多肽特定地與所關(guān)心的試劑進(jìn)行結(jié)合的能力。具有期望的特性的所選多肽可屬于一種或多種類別的下述分子，即抗原結(jié)合單元、細(xì)胞表面受體、受體配位體、細(xì)胞溶質(zhì)(cytosolic)蛋白質(zhì)、分泌性蛋白質(zhì)、核內(nèi)蛋白和其功能性主題。待測(cè)試的特定試劑和待展示的外源性多肽的文庫的選擇將取決于該篩選分析的期望的目的。
展現(xiàn)期望的結(jié)合特性或親合力的抗體的分離噬菌體和細(xì)菌展示的最強(qiáng)大的應(yīng)用之一是抗體設(shè)計(jì)。已展示scFv抗原結(jié)合單元可在噬菌體顆粒和細(xì)菌細(xì)胞的表面上顯現(xiàn)，且不存在結(jié)合特性和親合力(McCafferty等人(1990)Nature 348552-554；Daugherty等人(1999)proteinEngineering 12(7)613-621)的明顯損失。亦已證實(shí)功能性Nsc Abus(例如Fab片段)可在噬菌體表面上顯現(xiàn)?，F(xiàn)在，許多不同抗原的抗體已應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行了成功分離。
因?yàn)樵撓到y(tǒng)允許提供抗原結(jié)合單元的大量不同清單，所以本噬菌體展示系統(tǒng)尤其適用于本申請(qǐng)案。該噬菌體展示系統(tǒng)在許多方面可模擬天然免疫系統(tǒng)?？乖Y(jié)合單元的抗原驅(qū)動(dòng)刺激可通過自抗原結(jié)合單元的噬菌體所展示的文庫中選擇高親合力結(jié)合劑來獲得。在發(fā)展B細(xì)胞中的H和L鏈基因進(jìn)行重組期間所發(fā)生的大量鏈置換可通過將DNA和蛋白質(zhì)的克隆H和L鏈進(jìn)行混合和通過位點(diǎn)特定重組(Geoffory等人(1994)Gene 151109-113)的應(yīng)用來模擬。體細(xì)胞突變亦可通過在噬菌體-展示抗原結(jié)合單元的CDR區(qū)域中引入突變來匹配。
具有期望的結(jié)合特性或親合力的該抗原結(jié)合單元可應(yīng)用一種稱作“淘篩”(Parmley and Smith(1988)Gene 73305-318)的親合力選擇形式來確定。首先將抗原結(jié)合單元的文庫以所關(guān)心的抗原來培養(yǎng)，繼而對(duì)具有界定噬菌體的抗原進(jìn)行捕集。然后可將以此方式所回收的該噬菌體放大且再次對(duì)其進(jìn)行選擇以與該抗原結(jié)合，從而對(duì)與所關(guān)心抗原相結(jié)合的噬菌體進(jìn)行富集。通常，可在一星期內(nèi)完成三至四次選擇，其導(dǎo)致一至一百種結(jié)合噬菌體的分離。因此在試驗(yàn)中顯現(xiàn)期望的抗原結(jié)合單元的稀有噬菌體可順利地由多于108種不同個(gè)體中選擇出。然后由個(gè)體噬菌體克隆的核苷酸序列來推導(dǎo)結(jié)合抗原結(jié)合單元的一級(jí)結(jié)構(gòu)。在所展示的抗原結(jié)合單元中采用人類VH和VL區(qū)域時(shí)，本展示系統(tǒng)可以進(jìn)行人類抗體的選擇，而不進(jìn)一步操縱非人類抗原結(jié)合單元。
包含具有改性結(jié)合特性或親合力的Abus的新穎蛋白質(zhì)的產(chǎn)生應(yīng)用本展示系統(tǒng)可獲得展示多肽的具有用于目標(biāo)蛋白質(zhì)的高親合力和特性的復(fù)制性基因包裝(例如抗原結(jié)合單元)。該基因包裝攜帶結(jié)合多肽和對(duì)結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行編碼的多核苷酸。多核苷酸的存在促進(jìn)了結(jié)合蛋白質(zhì)的重組體表達(dá)和隨后操作。例如，用于該結(jié)合蛋白質(zhì)的多核苷酸編碼可由盒式誘變發(fā)生、易于出錯(cuò)的PCR或滑移來進(jìn)行誘變處理以產(chǎn)生已改變的序列的精確清單，已改變的序列類似于親本多核苷酸。在篩選新穎結(jié)合蛋白質(zhì)的精確清單時(shí)，可確定展現(xiàn)改性結(jié)合特性或親合力的蛋白質(zhì)。
測(cè)定抗原決定部位的位置傳統(tǒng)上，抗原的抗原決定部位位置測(cè)定極大地取決于物理化學(xué)分析。這些方法包括(1)分裂具有各種蛋白酶的凈化抗原，識(shí)別反應(yīng)性片段，且對(duì)其排序；(2)化學(xué)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，其中殘基與抗原結(jié)合單元的相互作用可保護(hù)改進(jìn)；(3)合成一系列與該抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)相應(yīng)的肽；和(4)應(yīng)用NMR或X射線結(jié)晶學(xué)來引導(dǎo)物理表征。所有方法是勞動(dòng)密集且通常不由高處理量分析來檢驗(yàn)。噬菌體或細(xì)菌展示可提供用于對(duì)該抗原的抗原決定部位進(jìn)行定位的高效和穩(wěn)固替換物。對(duì)該抗原的部分進(jìn)行編碼的DNA片段可由該表達(dá)載體顯現(xiàn)為外源性多肽。然后可由該抗體來測(cè)試基因包裝(例如噬菌體、細(xì)菌細(xì)胞或孢子)以確定與該抗體反應(yīng)的展示片段。此展示技術(shù)已廣泛用于此技術(shù)中且已展示可成功確定多種分子的抗原的抗原決定部位。
測(cè)定單克隆和多克隆Abus的結(jié)合抗原決定部位的位置亦可應(yīng)用本展示系統(tǒng)來提交用于測(cè)定該抗原結(jié)合位點(diǎn)的特性的位置的隨機(jī)肽文庫。隨機(jī)肽文庫可代表一個(gè)序列來源，抗原決定部位和模擬位可在運(yùn)行上由其來定義。以該文庫可確定且獲得用于抗原抗體相互作用的肽競(jìng)爭(zhēng)物，并且因此測(cè)定多種抗原結(jié)合單元的可達(dá)到的和/或功能性位點(diǎn)。
信號(hào)轉(zhuǎn)換路徑的受體和其它調(diào)節(jié)子的識(shí)別配位體亦可采用本展示系統(tǒng)以識(shí)別用于受體的配位體。該過程通常繼續(xù)從屬于一定量將測(cè)試配位體顯現(xiàn)為該受體的基因包裝，繼而識(shí)別限制于該受體的基因包裝?；蛘?，該受體可在基因包裝中呈現(xiàn)。然后將限制于測(cè)試配位體的受體分離。關(guān)于肽配位體的確認(rèn)，隨機(jī)肽文庫是優(yōu)選的用于執(zhí)行該分析的啟動(dòng)(staring)物質(zhì)。相同的方法可應(yīng)用于識(shí)別細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)錄路徑的其它調(diào)節(jié)子。
細(xì)胞的活性是由可刺激或抑制細(xì)胞內(nèi)情形的外部信號(hào)來調(diào)節(jié)。將刺激或抑制信號(hào)傳輸至細(xì)胞中以引起細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的方法是指信號(hào)轉(zhuǎn)換。適當(dāng)?shù)男盘?hào)轉(zhuǎn)換對(duì)于適當(dāng)?shù)募?xì)胞功能是必要的。在過去的十年中，多種細(xì)胞信號(hào)分子已經(jīng)確認(rèn)、克隆和表征。該信號(hào)蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例包括細(xì)胞表面受體、蛋白質(zhì)活化酶(例如酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸或組氨酸活化酶)、三聚G-蛋白質(zhì)、細(xì)胞漿(cytokines)、SH2-、SH3-、PH-、PDZ-、含蛋白質(zhì)的死區(qū)(death-domain)和由Human Genome Sciences Inc.、Celera、the Institute for Genomic Research(TIGR)和Incyte Pharmaceuticals，Inc所發(fā)行的基因或蛋白質(zhì)族中的任一種。已經(jīng)說明了由信號(hào)蛋白質(zhì)的經(jīng)常生長(zhǎng)(ever-growing)族所調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)換情形的串連且已發(fā)現(xiàn)其可在多種生物學(xué)反應(yīng)中執(zhí)行中央作用。其中有細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞區(qū)別、細(xì)胞死、趨藥性(chemotaxsis)、細(xì)胞游動(dòng)性和細(xì)胞骨架基因重排(Cantley等人(1991)Cell 64281-302；Liscovitch等人(1994)Cell 77329-334)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在信號(hào)轉(zhuǎn)換路徑的各種組分中的缺點(diǎn)可說明大量疾病，其包括多種形式的癌癥、血管病和神經(jīng)疾病。實(shí)質(zhì)上，能夠調(diào)節(jié)信號(hào)路徑(例如信號(hào)轉(zhuǎn)換路徑的調(diào)節(jié)子)的試劑已作為潛在診斷和/或治療藥而得到長(zhǎng)期公認(rèn)。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)子是以其下述能力來特征化(1)與存在于本基因包裝上的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白質(zhì)結(jié)合；或(2)在通常與該信號(hào)蛋白質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞蛋白質(zhì)存在時(shí)，為了與所展示的信號(hào)蛋白質(zhì)結(jié)合而競(jìng)爭(zhēng)。該等調(diào)節(jié)子可以是目標(biāo)信號(hào)蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑或?qū)贵w。
顯現(xiàn)cDNA文庫本展示系統(tǒng)尤其適用于顯現(xiàn)cDNA文庫。如上所注，先前所報(bào)道的包括基因III和基因VIII噬菌體展示系統(tǒng)的融合系統(tǒng)將插入點(diǎn)限制于該外表面序列的5′末端。因此必須將該外源性多肽連接至該外表面蛋白質(zhì)的氨基末端。因此，由于內(nèi)部終止碼對(duì)于閱讀框的分裂，含有所有閱讀框的編碼序列的片段的cDNA文庫不能由融合系統(tǒng)全面顯現(xiàn)。然而，由于該外源性序列未在框架內(nèi)與該外表面蛋白質(zhì)融合，該系統(tǒng)無法承受單向克隆的這個(gè)缺點(diǎn)。
cDNA展示可以是定義蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的有效技術(shù)。cDNA文庫的表達(dá)和篩選可極大地促進(jìn)基于所顯現(xiàn)的產(chǎn)物與所特別關(guān)心的已知蛋白質(zhì)結(jié)合的能力的新穎基因的確認(rèn)。cDNA-編碼蛋白質(zhì)可在該基因包裝的表面上顯現(xiàn)，然后可對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，經(jīng)由如上所述的生物淘篩濃縮對(duì)在體外的特別固定目標(biāo)進(jìn)行測(cè)試。
所展示的外源性多肽或隨機(jī)或預(yù)定多肽的文庫可特定地與測(cè)試劑結(jié)合的能力可由此技術(shù)中所建立的多種程序井來測(cè)試。通常，應(yīng)用親合力色譜學(xué)來較佳地執(zhí)行選擇。該方法通常繼續(xù)將該基因包裝與測(cè)試劑涂覆板(test-agent-coated plates)、柱矩陣、細(xì)胞或與在溶液中的生物素化(biotinylated)試劑結(jié)合，繼而進(jìn)行捕集。對(duì)限制于該固體相的該基因包裝進(jìn)行洗滌且然后以可溶性半抗原、酸或堿來洗提。或者，該測(cè)試劑的增強(qiáng)濃度可用以自該親合力矩陣中分離該基因包裝。關(guān)于具有對(duì)測(cè)試抗原的極高親合力或抗體親抗原性的特定抗原結(jié)合單元，有效洗提可需要如WO 92/01047所述的高pH值或溫和還原溶液。
為了避免在回收具有期望的結(jié)合特性的限制多肽時(shí)的潛在困難，可在該適配器和外源性多肽之間引入蛋白酶分裂位點(diǎn)?？蓱?yīng)用于此目的的分裂位點(diǎn)包括(但不限于)因子X、胰蛋白酶和凝血酶識(shí)別位點(diǎn)。在將該基因包裝與親合力矩陣結(jié)合且洗滌該非特定包裹之后，展示具有期望的親合力的剩余包裹可通過以蛋白酶在適于在分裂位點(diǎn)進(jìn)行消化的條件下對(duì)該抗原親合力矩陣進(jìn)行洗滌來收集。該消化將自該基因包裝(例如噬菌體顆粒)中釋放該外源性多肽。
上述可代替的程序是獲得已保持強(qiáng)結(jié)合噬菌體或細(xì)菌顆粒的該親合力矩陣，且提取其核酸，例如通過在SDS溶液中沸騰。所提取的核酸可用于直接轉(zhuǎn)換大腸桿菌宿主細(xì)胞，或者該外源性序列可由PCR應(yīng)用合適的引物來放大。
選擇的效率有可能依據(jù)幾種因子的組合，其包括在洗滌時(shí)的分裂動(dòng)力學(xué)，一級(jí)在單一噬菌體或細(xì)菌上的多個(gè)復(fù)制能否立即與在固體載體上的測(cè)試劑結(jié)合。例如，具有快速列界動(dòng)力學(xué)(和弱結(jié)合親合力)的抗體應(yīng)該通過在該固體載體上使用短期洗滌、多價(jià)展示和抗原高涂覆密度來保持。相反地，具有慢分裂動(dòng)力學(xué)的抗原結(jié)合單元的選擇應(yīng)該通過使用長(zhǎng)期洗滌、多價(jià)噬菌體和抗原的低涂覆密度來支持。
或者，對(duì)于給定試劑的特定結(jié)合可以由細(xì)胞分類來評(píng)估。該技術(shù)包括在基因包裝(例如黏著于待分類的宿主細(xì)胞的噬菌體顆粒)上提供該外源性多肽，然后將目標(biāo)細(xì)胞標(biāo)定于偶合至探測(cè)半族的測(cè)試劑，繼而將標(biāo)定細(xì)胞與在細(xì)胞分類器中的未標(biāo)定細(xì)胞進(jìn)行分離。一種成熟的細(xì)胞分離方法是熒光激活細(xì)胞分類(FACS)。在單一文件中在良好溪流中使流動(dòng)的細(xì)胞通過激光束，且然后測(cè)定由該熒光標(biāo)簽所結(jié)合的每個(gè)細(xì)胞的熒光。
在必要時(shí)，外源性多肽的清單可由不相干測(cè)試劑來預(yù)選擇以反向選擇非期望的多肽。例如，抗原結(jié)合單元的清單可由不相干抗原來反向選擇。為了分離，該清單亦可以是由相關(guān)試劑(例如抗突變抗原結(jié)合單元(anti-idiotypic Abus))來預(yù)選擇。本展示系統(tǒng)使得具有期望的特性的抗原結(jié)合單元可快速分離?？深A(yù)期多種已分離的抗原結(jié)合單元將難以或不可能通過傳統(tǒng)雜交瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因(transgenic)動(dòng)物技術(shù)來獲得。
對(duì)于已洗提的抗原結(jié)合單元所做的隨后分析可包含用于對(duì)該L和H鏈的氨基酸序列進(jìn)行描繪的蛋白質(zhì)排序。基于所推導(dǎo)出的氨基酸序列，對(duì)抗體多肽進(jìn)行編碼的該cDNA然后可由包含PCR、文庫篩選、在現(xiàn)有核酸數(shù)據(jù)庫中的同源搜索及其組合的重組體克隆方法來獲得。通常所采用的數(shù)據(jù)庫包括(但不限于)GenBank、EMBL、DDBJ、PDB、SWISS-PROT、EST、STS、GSS和HTGS。
包含本發(fā)明的載體的試劑盒本發(fā)明亦涵蓋在合適的包裹中含有該表達(dá)和輔助載體的試劑盒。
每個(gè)試劑盒必定包含將載體傳輸至可能存在的宿主細(xì)胞中的試劑。促進(jìn)載體的傳輸?shù)脑噭┑倪x擇可以根據(jù)所用的特別轉(zhuǎn)染或感染方法而變化。該等試劑盒亦可含有適用于產(chǎn)生用于外源性序列和該蛋白質(zhì)產(chǎn)物的探測(cè)的標(biāo)記聚核苷酸探針或蛋白質(zhì)探針。每個(gè)試劑可由適于庫存儲(chǔ)存(inventory storage)的固體形式或溶解/懸浮于液體緩沖劑中的形式提供，且隨后當(dāng)執(zhí)行該實(shí)驗(yàn)時(shí)，其適于交換或添加于該反應(yīng)介質(zhì)中。提供合適的包裹。該試劑盒可視情況提供適用于該程序的另外組分。該等選擇性組分包括(但不限于)緩沖劑、捕獲試劑、發(fā)展試劑(developing reagents)、標(biāo)簽、反應(yīng)表面、探測(cè)構(gòu)件、控制樣品、指令和說明信息。
本展示系統(tǒng)、宿主細(xì)胞和基因包裝的發(fā)展和用途的進(jìn)一步說明在下述實(shí)例部分中提供。該等實(shí)例是對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的實(shí)踐者的指導(dǎo)，且不表示任何方式的限制。
實(shí)例實(shí)例1KO7kpn輔助噬菌體的制備和應(yīng)用A.KO7kpn載體的構(gòu)建該KO7kpn載體是通過根據(jù)下述程序來對(duì)良好特征化的載體(即M13KO7(來自于Amersham Pharmacia))進(jìn)行修改來構(gòu)建。所得載體與KO7相同，除了已將一獨(dú)特KpnI限制位點(diǎn)插入于該基因III引導(dǎo)序列，而不破壞該基因III編碼區(qū)域(參看圖3A和3B)。
通過基于PCR的發(fā)生定位突變，將該KpnI位點(diǎn)引入至KO7輔助噬菌體載體的基因III引導(dǎo)序列中。KO7基因包裝的放大係通過PCR并利用下述含有KpnI位點(diǎn)的引物來完成p3KNl5′-TTTAGTGGTACCTTTCTATTCTCACTCCGCTG-3′和p3KN25′-TAGAAAGGTACCACTAAAG GAATTGCGAATAA-3′。該等引物共用對(duì)基因III引導(dǎo)序列的序列同源性。
在含有100ng的KO7載體DNA、20pmol的每種引物、250uM的dNTP和1X pfu緩沖劑和pfu DNA多聚酶(Stratagene)的100ul反應(yīng)混合物中來執(zhí)行PCR。使該反應(yīng)混合物最初處于約96℃的條件下且然后如下所述在溫度循環(huán)器中經(jīng)受15PCR循環(huán)變性96℃、30秒鐘退火5.5℃、30秒鐘伸展72℃、10分鐘放大之后，將其產(chǎn)物凝膠凈化、用KpnI切開且通過電穿孔來與轉(zhuǎn)換TG1細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合。冷凍(sleet)細(xì)菌細(xì)胞以產(chǎn)生卡那霉素抗藥性。具體而言，在96-井微量滴定盤中使抗卡那霉素(KanR)菌落在含有70ug/ml卡那霉素的2xYT介質(zhì)中生長(zhǎng)，且通過噬菌體ELISA分析將上清液用于篩選以消除由PCR誤差所引起的功能喪失突變。簡(jiǎn)要地，如下進(jìn)行該噬菌體ELISA在4℃過夜將含有噬菌體顆粒的100ul上清液應(yīng)用于該ELISA板的外殼井。室溫下在PBS緩沖劑中以5％牛奶凍結(jié)30分鐘后，將結(jié)合于ELISA盤上的噬菌體顆粒在室溫下進(jìn)一步用100ul的HRP-共軛抗-M13抗體(Amersham Pharmcia)培養(yǎng)1小時(shí)。通過含有0.05％Tween 20的PBS來洗除該游離抗M13抗體。然后添加基體ABTS[2，2′連氮基-雙(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)]。通過在405nm的吸光度來測(cè)定該HRP活性。圖2展示用于抗卡那霉素、陽性噬菌體復(fù)制體的噬菌體ELISA篩選結(jié)果。對(duì)48個(gè)復(fù)制體進(jìn)行篩選以用于噬菌體繁殖。該復(fù)制體C2、B3、B7、B9和A12呈噬菌體陽性。由TG1培養(yǎng)物來制備摘取自克隆B7、B9和A12的DNA。含有Acc65I(KpnI的同裂酶)和BamHI的載體DNA的雙重降解展示600 bp的DNA片段，其證明KpnI位點(diǎn)存在于所有的三個(gè)KO7kpn載體復(fù)制體中。
B.KO7kpn噬菌體繁殖將含有產(chǎn)生自B9復(fù)制體的KO7kpn輔助噬菌體的KanRTGl上清液在2xYT瓊指平板上種菌劃線(streaked)。將與0.5ml的TG1培養(yǎng)物(OD600＝0.5)相混合的4ml軟瓊脂澆注于該板上。在37℃過夜培養(yǎng)之后形成噬菌體斑。采集單個(gè)噬菌體斑且將其用于培養(yǎng)10ml含有70ug/ml卡那霉素的2x YT培養(yǎng)物。在37℃以250rpm持續(xù)搖動(dòng)的方式培養(yǎng)2小時(shí)之后，將該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至容納含有500ml的70ug/ml卡那霉素的2x YT的2升燒瓶中。經(jīng)由持續(xù)搖動(dòng)過夜培養(yǎng)該培養(yǎng)物。然后應(yīng)用聚乙二醇(PEG)/NaCl將在supematant中的噬菌體沉淀，且在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中再次懸浮。由OD268測(cè)量來確定噬菌體濃度。通常OD268的1單位讀數(shù)指示出上清液含有近似5×1012噬菌體/ml。所產(chǎn)生的用于KO7kpn輔助噬菌體的已記錄的噬菌體近似是1-2×1012/ml，其與該M13KO7輔助噬菌體非常相似。
C.用于噬菌體展示的KO7Kpn輔助噬菌體的應(yīng)用在顯現(xiàn)scFv-pIII融合的噬菌體展示載體pABMD1(圖22)中亞克隆scFv抗體AM2的編碼序列。將攜帶展示載體的TG1細(xì)胞生長(zhǎng)至OD600＝0.6，且在MOI＝10由KO7kpn輔助噬菌體雙重感染。在30℃過夜將感染的TG1細(xì)胞在2x YT/Amp/Kan中生長(zhǎng)。通過來自于培養(yǎng)物上清液的PEG/NaCl將該噬菌體中間顆粒沉淀兩次，且在PBS中再次懸浮。將展示于噬菌體上的scFv-pIII融合經(jīng)由噬菌體ELISA分析來探測(cè)。簡(jiǎn)要地，首先在4℃過夜將0.2ug的AM2-抗原涂覆于96-井ELISA板上。在5％牛奶/PBS阻斷之后，將在2％牛奶/PBS中的噬菌體溶液置于該ELISA板上1小時(shí)。通過以HRP-共軛抗-M13抗體進(jìn)行培養(yǎng)來探測(cè)與抗原相結(jié)合的噬菌體。將基板ABTS[2，2′連氮基-雙(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)]用于HRP活性的測(cè)量。由攜帶pABMD1-AM2/KO7kpn載體的TG1細(xì)胞所產(chǎn)生的噬菌體中間展示出極強(qiáng)的抗原結(jié)合活性，此展示scFv抗體AM2通過KO7kpn輔助噬菌體的功能性展示。該系列實(shí)驗(yàn)用作構(gòu)建和展示本展示系統(tǒng)所采用的試劑的陽性控制。
實(shí)例2包含GM-超輔助噬菌體載體的適配器定向展示系統(tǒng)的制備A.GM-超輔助噬菌體載體的構(gòu)建通過以合成DNA片段置換在載體pABMD1(圖22A)的XbaI和Bg1II位點(diǎn)之間的序列來構(gòu)建pABMC6載體，該DNA片段對(duì)具有KpnI位點(diǎn)和用于GR2區(qū)域(人類GABAB受體2的該卷曲螺旋區(qū)域)的編碼序列和Myc-標(biāo)記(圖4)的局部基因III引導(dǎo)序列進(jìn)行編碼。將用于GR2-Myc區(qū)域的序列直接與在pABMD1載體中的pIII編碼序列融合，且由DNA序列來證實(shí)。
GM-超輔助噬菌體載體通過以具有相應(yīng)的對(duì)來自于pABMC6載體的局部pIII引導(dǎo)和適配器2-pIII融合蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的片段置換對(duì)在KO7Kpn輔助載體中的局部pIII引導(dǎo)(氨基酸殘基11-19)和局部pIII蛋白質(zhì)(氨基酸殘基1-197)進(jìn)行編碼的該KpnI/BamHI片段來構(gòu)建。所得GM-超輔助噬菌體載體(圖5)包含工程基因III融合，其中GR2區(qū)域和Myc-標(biāo)記序列(用于探測(cè)工程pIII蛋白質(zhì))在框架內(nèi)與基因III(圖5B)融合。
將B9 KO7kpn輔助噬菌體復(fù)制體(參看實(shí)例1)用于構(gòu)建GM-超輔助噬菌體載體。在KO7kpn噬菌體載體中亞克隆工程基因III片段之后，在96-井微量滴定盤中使20個(gè)抗卡那霉素復(fù)制體在含有70ug/ml卡那霉素的2x YT介質(zhì)中生長(zhǎng)。將上清液用于由如實(shí)例1所述的噬菌體ELISA分析所進(jìn)行的噬菌體篩選。19個(gè)復(fù)制體能夠產(chǎn)生噬菌體顆粒。
為了證實(shí)GM-超輔助噬菌體已用GR2-Myc-pIII融合蛋白質(zhì)來包裹，執(zhí)行應(yīng)用抗-Myc抗體(來自于BD Pharmingen的9E10)抗體的免疫印記法來探測(cè)工程pIII融合。簡(jiǎn)要地，將來自于四個(gè)復(fù)制體(克隆6、9、18和20)的1-4x1011噬菌體顆粒在樣品緩沖劑(2％SDS，5％的β-巰基乙醇，10％甘油，0.67M的Trice-HCl，pH值為6.8)中加熱10分鐘。對(duì)該變性的樣品進(jìn)行SDS-PAGE。然后將SDS凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，隨后以在5％牛奶/PBS中的2ug/ml的9E10抗體來探查該P(yáng)VDF膜。由抗鼠抗體-AP共軛和BCHVNBT AP基板(Sigma)來探測(cè)Myc-標(biāo)記蛋白質(zhì)。如圖6所示，通過該抗-Myc抗體來探測(cè)在所有四個(gè)復(fù)制體中的單一蛋白質(zhì)鍵。在陰性控制M13KO7輔助噬菌體中沒有探測(cè)出Myc鍵。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)GR2-Myc-pIII融合蛋白質(zhì)是在超輔助噬菌體顆粒中組合。GR2-Myc-pIII融合的組合進(jìn)一步由ELISA分析(參看圖7)來確認(rèn)。
我們已熟知M13噬菌體對(duì)于胰蛋白酶有抵抗性。用于蛋白酶分裂位點(diǎn)的篩選揭示了在GM-超輔助噬菌體(圖5C)的GR2-Myc區(qū)域中有七個(gè)胰蛋白酶分裂位點(diǎn)。為了測(cè)試GR2-Myc區(qū)域能否通過胰蛋白酶自該噬菌體表面分裂，將來自于克隆18的GM-超輔助噬菌體在37℃曝露于不同濃度的胰蛋白酶中30分鐘，且然后添加胰蛋白酶抑制劑以使該反應(yīng)停止。圖8展示該Myc-標(biāo)記可通過5ug/ml胰蛋白酶完全移除。該M13KO7輔助噬菌體起到陰性控制的作用。
B.GM-超輔助噬菌體的產(chǎn)生應(yīng)用含有如上所述的GM-超輔助噬菌體顆粒的上清液來進(jìn)行噬菌體斑分析。采集單一噬菌體斑且將其用于培養(yǎng)10ml含有70ug/ml卡那霉素的2x YT培養(yǎng)物。在37℃在250rpm以持續(xù)搖動(dòng)的方式培養(yǎng)2小時(shí)以后，將該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至容納500ml含有70ug/ml卡那霉素的2x YT的2升燒瓶中，以用于大規(guī)模產(chǎn)生噬菌體顆粒。應(yīng)用聚乙二醇(PEG)/NaCl沉淀在TG1上清液中的噬菌體，且在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中再次懸浮。由OD268測(cè)量來確定噬菌體濃度。該OD OD268測(cè)量指示出該培養(yǎng)物含有近似2×1011/ml的GM-超輔助噬菌體顆粒。由胰蛋白酶自噬菌體表面所移除的GR2-Myc區(qū)域可通過1至3個(gè)折疊來增加噬菌體傳染性。
C.用于展示抗原結(jié)合單元的GM-超輔助噬菌體的應(yīng)用在適配器定向展示系統(tǒng)中，所關(guān)心的該外源性多肽是作為與成對(duì)適配器(指定“適配器2”)相互作用的適配器(指定適配器1)的融合來顯現(xiàn)，該成對(duì)適配器在框架內(nèi)與外表面蛋白質(zhì)融合。在兩適配器之間的該成對(duì)相互作用促進(jìn)該外源性多肽的展示。該噬菌體中間載體pABMX14是顯現(xiàn)在框架內(nèi)與適配器1融合的外源性多肽的表達(dá)載體之一。該載體pABMX14(圖9A和9B)是由pBluescript SK(+)獲得。在該lac促進(jìn)劑之后立即由具有一組引物(pBS-Ska5′-GGAATTGTGAGCGGATAACAATTTACCGGTCACACAGGAAACAGCTATGACCATG-3′和pBS-SKb5′-CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGACCGGTAAATTGTTATCCGCTCACAAT TCC-3′)的基于PCR位點(diǎn)引導(dǎo)誘變發(fā)生來引入一獨(dú)特AgeI限制位點(diǎn)，且通過切削和鈍端結(jié)合來刪去XhoI位點(diǎn)和KpnI位點(diǎn)。將由AgeI在5′和由SalI位點(diǎn)在3′側(cè)面相切的合成DNA片段在工程pBluescript SK(+)中復(fù)制，該片段含有核多糖體結(jié)合序列序列RBS、pelB引導(dǎo)和用于由GABAB受體1(GR1是適配器1)和HA-(His)6-標(biāo)記(指DH-標(biāo)記)所獲得的適配器的編碼序列。該lac Z促進(jìn)劑推動(dòng)了GR1融合的表達(dá)且因此允許以細(xì)菌細(xì)胞所顯現(xiàn)的可溶性外源性多肽的產(chǎn)生。
為了證實(shí)功能性蛋白質(zhì)可應(yīng)用本發(fā)明來展示，在pABMX14載體中亞克隆單鏈抗體AM1。將所得PABMX14-AM1轉(zhuǎn)換為TG1細(xì)胞，且以4或40或100感染復(fù)數(shù)(MOI)將該等細(xì)胞與GM-超輔助噬菌體雙重感染。如實(shí)例1所述產(chǎn)生并凈化噬菌體顆粒。應(yīng)用以AM1抗原涂覆的板將展示于該噬菌體表面上的單鏈抗體以噬菌體ELISA來探測(cè)。第二抗體是HRP-共軛抗M13抗體。ELISA結(jié)果展示由所有三個(gè)MOI感染所產(chǎn)生的該噬菌體中間顆粒能夠特定地與AM1-抗原結(jié)合，其指示出單鏈抗體在噬菌體表面(圖10)上功能性展示?？梢杂^察到一個(gè)取決于劑量的結(jié)合。當(dāng)噬菌體濃度達(dá)到1012/ml時(shí)，結(jié)合是飽和的。由攜帶pABMX14-AM1/M13KO7載體的TG1所產(chǎn)生的控制噬菌體中間不與甚至在高濃度(例如1013/ml)下的AM1-抗原相結(jié)合。噬菌體顆粒亦應(yīng)用抗-Myc和抗-HA抗體通過免疫印記法來分析。通過在非還原條件(例如無(3-巰基乙醇))下加熱在SDS樣品緩沖劑中的噬菌體顆粒來使其改性。圖11展示，scFv抗體只能在與GM-超輔助噬菌體而不是控制M13KO7輔助噬菌體發(fā)生感染時(shí)才能展示?？?Myc印跡亦揭示出大約是游離GR2-Myc-pIII兩倍的scFv-GR1-DH/GR2-Myc-pIII絡(luò)合物在線2中的噬菌體顆粒中組合。每個(gè)噬菌體顆粒含有pIII外殼蛋白質(zhì)的5個(gè)復(fù)制體。此展示每個(gè)噬菌體顆粒平均攜帶scFv-GR1融合的多個(gè)復(fù)制體。
實(shí)例3包含CM-超輔助噬菌體載體的適配器定向展示系統(tǒng)的制備A.CM-超輔助噬菌體載體的構(gòu)建通過以合成DNA片段來置換在載體pABMD1(圖22)的XbaI位點(diǎn)和BglII位點(diǎn)之間的序列來構(gòu)建pABMC13載體，該DNA片段包含5′至3′基因引導(dǎo)序列、KpnI位點(diǎn)、用于Ala-Cys-Gly-Gly和Myc-標(biāo)記(圖12)的編碼序列。此合成序列在框架內(nèi)與在pABMD1載體中的基因III連接。
CM-超輔助噬菌體載體通過對(duì)在KO7Kpn輔助載體中的局部pIII引導(dǎo)(氨基酸殘基11-19)和局部pIII蛋白質(zhì)(氨基酸殘基1-197)進(jìn)行編碼的KpnI/BamHI片段來構(gòu)建，KO7Kpn輔助載體具有相應(yīng)的對(duì)來自于該pABMC6載體的局部pIII引導(dǎo)和適配器2-pIII融合蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的片段。所得CM-超輔助噬菌體載體(圖13A)對(duì)與置于pIII的氨基末端的Cys-myc區(qū)域融合的工程pIII衣殼進(jìn)行編碼(圖13B)。此外，將琥珀終止碼標(biāo)記置于Cys-myc編碼序列和基因III之間。該終止碼允許在抑制細(xì)菌株而不是非抑制株中繁殖整個(gè)噬菌體顆粒。
將B9 KO7kpn輔助噬菌體復(fù)制體用于構(gòu)建CM-超輔助噬菌體載體。在KO7kpn噬菌體載體中亞克隆工程基因III片段之后，在96-井微量滴定盤中使24個(gè)抗卡那霉素復(fù)制體在含有70ug/ml卡那霉素的2x YT介質(zhì)中生長(zhǎng)。將上清液用于由如實(shí)例1所述的噬菌體ELISA分析所進(jìn)行的噬菌體篩選。23個(gè)復(fù)制體能夠產(chǎn)生噬菌體顆粒。
為了證實(shí)CM-超輔助噬菌體能夠包裹在該噬菌體顆粒中顯現(xiàn)的Cys-Myc-pIII融合，應(yīng)用抗-Myc抗體來執(zhí)行ELISA分析。來自于所選五個(gè)復(fù)制體的CM-超輔助噬菌體在其表面上均展示Myc-標(biāo)記。Myc-標(biāo)記在KO7輔助噬菌體陰性控制(圖14)中不能探測(cè)。
B.CM-超輔助噬菌體的產(chǎn)生根據(jù)如上所述的程序應(yīng)用含有CM-超輔助噬菌體顆粒的上清液來進(jìn)行噬菌體斑形成分析。簡(jiǎn)要地，采集單一噬菌體斑且將其用于培養(yǎng)10ml含有70ug/ml卡那霉素的2x YT培養(yǎng)物。在37℃在250rpm以持續(xù)搖動(dòng)的方式培養(yǎng)2小時(shí)以后，將該培養(yǎng)物添加至容納500ml含有70ug/ml卡那霉素的2x YT的2升燒瓶中過夜培養(yǎng)。應(yīng)用聚乙二醇(PEG)/NaCl來沉淀在TG1上清液中的噬菌體，且在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中再次懸浮。由OD268測(cè)量來確定該噬菌體濃度。所產(chǎn)生的用于CM-超輔助噬菌體的噬菌體近似是1-2×1012/ml培養(yǎng)物，其與M13KO7和KO7kpn輔助噬菌體非常相似。Myc-標(biāo)記可由胰蛋白酶自噬菌體表面移除。由于置于工程基因HI中的琥珀終止碼，在非抑制細(xì)菌株TOP10F′中不產(chǎn)生明顯劑量的CM-超輔助噬菌體顆粒。
C.用于展示抗原結(jié)合單元的CM-超輔助噬菌體的應(yīng)用噬菌體中間載體pABMX15是顯現(xiàn)在框架內(nèi)融合為適配器的外源性多肽(單鏈抗體AM1)的另一說明性表達(dá)載體。載體pABMX15(圖15A和15B)是通過以對(duì)HA-標(biāo)記和Gly-Gly-Cys進(jìn)行編碼的合成DNA片段來置換pABMD2(應(yīng)用NotI和SalI為位點(diǎn))的fd基因III片段自pABMD2(圖22)來構(gòu)建。
為了證實(shí)功能性蛋白質(zhì)可應(yīng)用CM-超輔助噬菌體載體來展示，在pABMX15載體中亞克隆該單鏈抗體AM1。將所得PABMX15-AM1轉(zhuǎn)換為TG1細(xì)胞，且以1或10或50或100感染復(fù)數(shù)(MOI)將該等細(xì)胞與GMCT-超輔助噬菌體雙重感染。如實(shí)例1所述產(chǎn)生并凈化噬菌體顆粒。應(yīng)用以AM1抗原涂覆的板將展示于該噬菌體表面上的單鏈抗體以噬菌體ELISA來探測(cè)。在每個(gè)井中添加2×1012噬菌體。第二抗體是HRP-共軛抗M13抗體。該ELISA結(jié)果展示由所有四個(gè)MOI感染所產(chǎn)生的該噬菌體中間顆粒能夠特定地與AM1-抗原結(jié)合，其指示功能性單鏈抗體在該噬菌體表面(圖16)上展示。由攜帶pABMX15-AM1/M13KO7載體的TG1所產(chǎn)生的該控制噬菌體中間不與AM1-抗原結(jié)合。該噬菌體顆粒亦用于免疫印記法分析。該噬菌體顆粒亦適用于通過在非還原條件(例如無(3-巰基乙醇))下在SDS樣品緩沖劑中加熱來對(duì)該噬菌體顆粒變性。如圖17所示，該scFv抗體只能由由CT-超輔助噬菌體而不是M13KO7輔助噬菌體來展示。
圖17亦指示了比scFv更多的游離pIII在噬菌體顆粒上展示(參看左面板的線4)。這是單價(jià)展示的表示。相反，實(shí)例2所述的GM-超輔助噬菌體展示系統(tǒng)產(chǎn)生了比游離pIII更多的AM1 scFv(參看左面板圖11的線2)。在該scFv序列中的GABAB受體1的該適配器序列的包含物，和在GM-超輔助載體中的適配器序列GABAB受體2的結(jié)合增強(qiáng)了該成對(duì)相互作用。
實(shí)例4包含GMCT-超輔助噬菌體載體的適配器定向展示系統(tǒng)的制備A.GMCT-超輔助噬菌體載體的構(gòu)建pABMC12載體是由載體pABMC6所構(gòu)建，其中Not1-BglII片段是以含有編碼序列的合成DNA片段來置換，該編碼序列是用于Myc標(biāo)記、基因III的CT區(qū)域(氨基酸217-405)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和OmpA引導(dǎo)序列(圖22A和B)。
通過以pABMC12載體所得的相關(guān)片段來置換在KO7kpn輔助載體中的KpnI/BamHI片段來構(gòu)建GMCT超輔助噬菌體載體。所得GMCT超輔助噬菌體載體(圖19A)對(duì)工程pIII衣殼的另外復(fù)制體進(jìn)行編碼，其包含GR2區(qū)域、myc標(biāo)記序列(用于工程pIII蛋白質(zhì)的探測(cè))和pIII的CT區(qū)域。在該工程基因III的下游，來自于該細(xì)菌蛋白質(zhì)OmpA的核糖體結(jié)合序列(RBS)和引導(dǎo)序列融合為由pAMBD1所獲得的基因III序列。將含基因III的序列的兩個(gè)復(fù)制體置于初始基因III促進(jìn)劑(圖19B所示)的控制下。進(jìn)行噬菌體ELISA分析以篩選如實(shí)例3所述的噬菌體-陽性復(fù)制。已發(fā)現(xiàn)十分之三的復(fù)制體可以產(chǎn)生噬菌體顆粒。將克隆3用于大規(guī)模噬菌體制備。
B.GMCT超輔助噬菌體的產(chǎn)生根據(jù)如上所述的程序來進(jìn)行噬菌體斑形成分析。所產(chǎn)生的用于GM-超輔助噬菌體的該噬菌體大約為8×10n/ml培養(yǎng)物，其與M13KO7和KO7kpn輔助噬菌體相似。GR2-Myc區(qū)域可由胰蛋白酶自噬菌體的表面移除。
C.用于顯現(xiàn)抗原結(jié)合單元的GMCT-超輔助噬菌體的應(yīng)用噬菌體中間載體pABMX14與GMCT超輔助(UltrHelperelper)噬菌體組合可用于噬菌體展示。將單鏈抗體AM1亞克隆至pABMX14載體(指pABMX14-AML)中。將PABMX14-AM1轉(zhuǎn)變?yōu)門G1細(xì)胞，且以1或10或50或100感染復(fù)數(shù)(MOI)將該等細(xì)胞與GMCT-超輔助噬菌體雙重感染。如實(shí)例1所述產(chǎn)生并凈化噬菌體顆粒。使用以AM1抗原涂覆的板將展示于該噬菌體表面上的單鏈抗體以噬菌體ELISA來探測(cè)。第二抗體是HRP-共軛抗M13抗體。該ELISA結(jié)果證實(shí)由所有四個(gè)MOI感染所產(chǎn)生的噬菌體中間顆粒具有相似的與AM1-抗原結(jié)合的活性，其標(biāo)志著單鏈抗體在該噬菌體表面(圖20)上功能性展示。由攜帶pABMX14-AM1/M13KO7載體的TG1所產(chǎn)生的控制噬菌體中間不展現(xiàn)與AM1-抗原結(jié)合的可探測(cè)性。噬菌體顆粒亦用于免疫印記法分析。如圖21所示，在與GMCT-超輔助噬菌體而不是M13KO7輔助噬菌體發(fā)生感染時(shí)，可展示該scFv抗體。
實(shí)例5展示期望的的經(jīng)淘篩多肽的噬菌體的富集在用于產(chǎn)生可溶性多肽的pABMX14或pABMX15載體中可復(fù)制各種DNA序列。該表達(dá)文庫可在與該超輔助噬菌體(用于pABMX14的GM和GMCT；用于pABMX15的CM)發(fā)生感染時(shí)用于展示編碼多肽。展示于噬菌體上的該特定蛋白質(zhì)或肽可由來自于各種文庫的淘篩的幾圈來富集。淘篩過程如下所述。簡(jiǎn)要地，在4℃過夜以在1-10ug/ml的濃度的特定抗原來涂覆96-井盤。在以PBS洗滌和以5％牛奶/PBS來阻斷后，添加1011-12噬菌體且在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。在以PBST和PBS所進(jìn)行的幾次洗滌后，以10ug/ml胰蛋白酶對(duì)結(jié)合噬菌體洗提30分鐘，所有超輔助噬菌體具有融合為pIII蛋白質(zhì)的可分裂的Myc-標(biāo)記。在我們的實(shí)驗(yàn)中，胰蛋白酶洗提比100mM三乙胺(通常用于傳統(tǒng)噬菌體淘篩)更有效。在重復(fù)幾次該過程之后，展示期望的多肽的噬菌體可富集。
實(shí)例6細(xì)菌輔助載體的制備和應(yīng)用A.表達(dá)載體和細(xì)菌輔助載體的構(gòu)建通過以具有對(duì)GR1適配器和HA-標(biāo)記進(jìn)行編碼的合成DNA片段置換在載體pABMD1(圖22A)的HindIII位點(diǎn)和SalI位點(diǎn)之間的序列來構(gòu)建表達(dá)載體pABMX22。如圖25A所示，該載體含有抗氨必西林基因，該基因可用于抗生素選擇(AMP)、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(ColE1 ori)、該f1噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)和由下游序列plac-RBS-p8L-GR1-HA-標(biāo)記的表達(dá)所獲得的該lac促進(jìn)劑/lac 01。MluI/XbaI或MluI/NotI或XbaI/NotI限制位點(diǎn)可用于在細(xì)菌細(xì)胞中插入用于可溶性蛋白質(zhì)的展示或產(chǎn)生的外源性序列。完整的載體序列如圖25B所示。
由來自于Stratagene的pBC-KS(+)載體來獲得細(xì)菌輔助載體pABMbd-1(圖26A用于載體圖譜且圖26B用于完整載體序列)。以合成的由在5′的MluI位點(diǎn)(具有可與BssHII相比的粘性末端)和在3′的BssHII位點(diǎn)來側(cè)面相接的DNA片段來置換用于在pBC-KS(+)中的兩個(gè)BssHII位點(diǎn)之間的多重復(fù)制位點(diǎn)的序列，該序列含有核多糖體結(jié)合序列RBS、pelB引導(dǎo)序列、用于嵌合外膜序列的編碼序列，該外膜序列含有大腸桿菌主要外膜脂蛋白(Lpp)和初始9種氨基酸和外膜蛋白質(zhì)OpmA的氨基酸46-159和適配器GR2序列。該lacZ促進(jìn)劑可驅(qū)動(dòng)Lpp-0mpA-GR2融合的表達(dá)，其將隱藏于細(xì)菌細(xì)胞的周質(zhì)中間(periplasmid)中。pABMbd-1載體含有用于抗生素選擇的抗氯霉素基因(Cam)、用于質(zhì)粒復(fù)制的ColE1 ori起點(diǎn)和用于噬菌體中間包裹的該f1噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)。
B.攜帶細(xì)菌輔助載體的噬菌體中間顆粒的產(chǎn)生將該pABMbd-1輔助載體轉(zhuǎn)化為細(xì)菌TG1細(xì)胞。采集單一pABbd-1菌落且將其應(yīng)用于培養(yǎng)具有50ug/ml氯霉素的15ml的2x YT培養(yǎng)物。在OD600達(dá)到0.8之后，在37℃由在MOI 10中的KO7Kpn輔助噬菌體對(duì)該細(xì)菌細(xì)胞感染1小時(shí)。將該感染TG1細(xì)胞在容納500ml含有氯霉素和卡那霉素的2x YT的2升燒瓶中過夜培養(yǎng)。然后應(yīng)用聚乙二醇(PEG)/NaCl將在上清液中的噬菌體中間顆粒沉淀，且在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中再次懸浮。由測(cè)量OD268來測(cè)定該噬菌體中間載體濃度。然后將包裹pABMbd-1輔助載體的噬菌體中間顆粒用于適配器定向細(xì)菌展示。
C.用于展示抗原結(jié)合單元的細(xì)菌表達(dá)和輔助載體的應(yīng)用在pABMX22載體中復(fù)制scFv抗體基因AM2。含有此表達(dá)載體的該TG1細(xì)菌細(xì)胞成長(zhǎng)為OD600＝0.8且與對(duì)細(xì)菌輔助載體pABMbd-1進(jìn)行包裹的該噬菌體中間顆粒發(fā)生感染。在30℃時(shí)使含有表達(dá)載體和輔助載體的該TG1細(xì)胞在含有氨芐青霉素/凸輪的2x YT中過夜生長(zhǎng)，然后采集并以PBS來洗滌。因?yàn)檎故镜牡鞍踪|(zhì)是以HA-標(biāo)記來標(biāo)記，所以抗HA標(biāo)記抗體可用于探測(cè)在細(xì)菌表面上所展示的蛋白質(zhì)。為了進(jìn)行FACS分析試驗(yàn)，懸浮于PBS中的細(xì)胞首先以抗HA標(biāo)記抗體來培養(yǎng)，然后以熒光素FITC-標(biāo)簽抗鼠抗體來培養(yǎng)。在以PBS來洗滌后，應(yīng)用FACS分類器將以3-5×107/ml懸浮于PBS中的細(xì)胞以氫化熒光素強(qiáng)度基礎(chǔ)來計(jì)數(shù)。ELISA分析亦用于探測(cè)在細(xì)菌表面上所展示的蛋白質(zhì)。首先，在4℃過夜將AM2-抗原涂覆于ELISA板上。在以抗原培養(yǎng)2小時(shí)后，限制于ELISA板的該等細(xì)胞以如上所述的抗-HA抗體和HRP-共軛抗鼠抗體來探測(cè)。
在用于產(chǎn)生可溶性抗體片段的pABMX22載體中可復(fù)制各種抗體序列。在與包裹細(xì)菌輔助載體pABMbd-1的噬菌體中間顆粒發(fā)生感染時(shí)，此表達(dá)文庫可用于產(chǎn)生選擇性細(xì)菌展示文庫。展示抗體的該細(xì)菌細(xì)胞與該FITC-標(biāo)簽抗原培養(yǎng)，且應(yīng)用FACS分類器在熒光強(qiáng)度的基礎(chǔ)上分類。分類之后，將選擇的細(xì)胞在2x YT液體培養(yǎng)基中以AMP過夜生長(zhǎng)。隨后在新鮮介質(zhì)中次培養(yǎng)該等細(xì)胞，且與用于展示的細(xì)菌輔助載體發(fā)生感染。然后將展示細(xì)胞用于另一次FACS分類選擇。
實(shí)例7具有改性親合力的抗原結(jié)合單元的繁殖和識(shí)別如上所注，本展示系統(tǒng)尤其適用于具有改性親合力或特性的抗原結(jié)合單元的繁殖和識(shí)別。在各種所揭示的系統(tǒng)中，本適配器定向噬菌體展示系統(tǒng)提供用于篩選具有改性親合力的抗原結(jié)合單元的堅(jiān)固平臺(tái)。
我們已選擇設(shè)計(jì)現(xiàn)有抗原結(jié)合單元(即AM3 scFv抗體)，其序列和相應(yīng)抗原已經(jīng)在先前有所描繪。該過程(下文指“抗體親合力成熟”)開始產(chǎn)生以GMCT載體格式的AM3 ScFv抗體。AM3 scFv抗體的框架結(jié)構(gòu)由VH和VL區(qū)域組成，每個(gè)區(qū)域在所述載體pABMX14(參看圖9A)的相應(yīng)位置處亞克隆。為了促進(jìn)AM3抗體結(jié)合親合力，將VH的CDR3構(gòu)建為在多重位置含有氨基酸殘基的各種代替的文庫。該文庫是通過在其兩端的變質(zhì)DNA寡接限制位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)合成來制備以影響在PCR放大和限制消化后在AM3 scFv基因中其位置處的亞克隆。該文庫具有近似107(例如含有近似107AM3抗體變體)的多樣性。在DNA結(jié)合后，將該文庫在TG1組分細(xì)胞中電結(jié)合(electroporated)。然后通過GMCT超輔助噬菌體來收集和保護(hù)該轉(zhuǎn)化株。隨后如上述實(shí)例來收集該噬菌體顆粒。
為了篩選或“淘篩”所構(gòu)建的適配器展示文庫，我們首先在4℃過夜將重組體抗原固定在0.05M的NaHCO3(pH值為9.6的緩沖劑)中的Nunc Maxisorb96-井盤上。將含有1012個(gè)在PBS緩沖劑中以2％牛奶來稀釋的噬菌體顆粒的文庫噬菌體的等分試樣添加于涂覆該抗原的井中。在37℃結(jié)合2小時(shí)以后，洗滌該井且根據(jù)本文所述方法來洗提噬菌體。將洗提的噬菌體用于感染TG1細(xì)胞，且然后由GMCT超輔助噬菌體來保護(hù)。在30℃過夜生長(zhǎng)后，將該噬菌體在TG1細(xì)胞中放大且準(zhǔn)備為另一次淘篩來采集。為了通過GMCT噬菌體文庫來選擇高親合力結(jié)合劑，應(yīng)用該文庫對(duì)具有不同分裂條件的淘篩的所有多重連續(xù)圈來進(jìn)行。
在最終淘篩之后，隨機(jī)采集個(gè)別復(fù)制體且進(jìn)一步通過應(yīng)用相同重組體抗原的ELISA來分析。以96-井微量滴定盤的格式通過上述程序來執(zhí)行ELISA。如圖27所示，所有選擇的復(fù)制體必定與該抗原進(jìn)行反應(yīng)(例如結(jié)合)。
然后隨機(jī)采集在上述ELSIA中展示陽性反應(yīng)性的該等復(fù)制體，將其用于排序且測(cè)定在VH的CDR3上的殘基的位置，其中對(duì)許多代表性復(fù)制體進(jìn)行處理以用于蛋白質(zhì)表達(dá)。關(guān)于AM3抗體，所有scFv是通過由Invitrogen LifeTechnologies所述的Pichia表達(dá)系統(tǒng)來顯現(xiàn)。根據(jù)Qiagen′s manual book將來自于培養(yǎng)物上清液的可溶性His-標(biāo)記scFvs直接由Ni-NTA瓊脂糖柱(2ml)來凈化。自Ni-NTA柱中所洗提的萃取物的等分試樣是通過SDS-PAGE和庫馬西藍(lán)變來分析。如圖28所示，作為主要蛋白質(zhì)鍵的30KD scFv在萃取物#2和#3中探測(cè)。為了移除scFv和其它物質(zhì)的同源二聚體，將萃取物#2和#3組合且進(jìn)一步經(jīng)受凝膠過濾色譜(HiLoad 16/60 Superdex 75柱，Amersham-pharmacia biotech)。
圖29展示30KD單體scFv蛋白質(zhì)與同源二聚體scFv和其它物質(zhì)經(jīng)由凝膠過濾色譜來良好分離。隨后將凈化的單體scFv蛋白質(zhì)用于AM3抗體對(duì)于應(yīng)用BiaCore(表面等離子體共鳴(surface plasmon resonance))來固定的蛋白質(zhì)抗原的結(jié)合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析。如圖30所示，選自于該文庫的所有四個(gè)AM3變體(X107，X110-112)與正常型相比展示明顯較慢分裂速率(Koff)和較高的結(jié)合親合力。例如用于X112的Koff是2.88X10-4S-1，且用于WT的Koff是2.77X10-3 S-1。該X112抗體與正常型抗體相比具有幾乎10倍較慢的分裂速率。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)本噬菌體適配器定向展示系統(tǒng)在抗體工程中的適用性和技術(shù)優(yōu)越性。
序列表<110>阿布馬科西斯公司<120>適配器定向顯示系統(tǒng)<130>13403.0005.00PC00<140>未指定<141>2002-11-02<160>24<170>Patentln version 3.1<210>1<211>57<212>DNA<213>噬菌體M13<400>1gtgaaaaaat tattattcgc aattccttta gttgttcctt tctattctca ctccgct 57<210>2<211>19<212>PRT<213>噬菌體M13<400>2Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala He Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser15 10 15His Ser Ala<210>3<211>57<212>DNA<213>噬菌體M13<400>3gtgaaaaaat tattattcgc aattccttta gtggtacctt tctattctca ctccgct57<210>4<211>222<212>DNA<213>模擬序列<220>
<223>包括噬菌體基因III引導(dǎo)序列、GABAB受體2區(qū)域和Myc區(qū)域的合成物<400>4ttagtggtac ctttctattc tcactccgct acatcccgcc tggagggcct acagtcagaa 60aaccatcgcc tgcgaatgaa gatcacagag ctggataaag acttggaaga ggtcaccatg 120cagctgcagg acgtcggagg ttgcgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat 180ctgagatctg gaggcggtac tgttgaaagt tgtttagcaa aa222<210>5<211>74<212>PRT<213>模擬序列<220>
<223>包括噬菌體基因III引導(dǎo)序列、GABAB受體2區(qū)域和Myc區(qū)域的合成物<400>5Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser His Ser Ala Thr Ser Arg Leu Glu Gly15 10 15Leu Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met Lys Ile Thr Glu Leu Asp20 25 30Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Val Gly Gly Cys35 40 45Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu He Ser Glu Glu Asp Leu Arg Ser Gly50 55 60Gly Gly Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys65 70<210>6<211>56<212>PRT<213>模擬序列<220>
<223>包括噬菌體基因III引導(dǎo)序列、GABAB受體2區(qū)域和Myc區(qū)域的合成物<400>6Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met1 5 10 15Lys Ile Thr Glu Leu Asp Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu20 2530Gln Asp Val Gly Gly Cys Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu35 4045Glu Asp Leu Arg Ser Gly Gly Gly50 55<210>7<211>3093<212>DNA<213>模擬序列<220>
<223>包括氨芐青霉素基因序列、ColE1復(fù)制起點(diǎn)、f1復(fù)制起點(diǎn)、Plac促進(jìn)劑、GABAB受體1區(qū)域和組胺酸標(biāo)記的合成物<400>7gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat60gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttaccg gttctttaag120gaggaattaa aaaatgaaat acctattgcc tacggcagcc gctggattgt tattactcgc180ggcccagccg gccatggcgg ccctgcaggc ctctagagcg gccgctggag gtgaggagaa240gtcccggctg ttggagaagg agaaccgtga actggaaaag atcattgctg agaaagagga300gcgtgtctct gaactgcgcc atcaactcca gtctgtagga ggttgtagat cttatccata360cgacgtacca gactacgcag gaggtcatca ccatcatcac cattaatgag tcgacctcga420ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg480actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca540
gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga600atggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc660gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt720cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag780ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt840cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt900tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt960cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt1020aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttag gtggcacttt1080tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta1140tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat1200gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt1260ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg1320agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga1380agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg1440tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt1500tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg1560cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg1620aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga1680tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc1740tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc1800ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc1860ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg1920cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac1980gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc2040actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactra tatatacttt agattgattt2100aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac2160caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa2220aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc2280accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt2340aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg2400ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc2460agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt2520accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga2580gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct2640tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg2700cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca2760cctct9actt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcag9g gggcg9agcc tat9gaaaaa2820cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt2880ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga2940taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga3000gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca3060cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tga 3093<210>8
<211>192<212>DNA<213>噬菌體M13<400>8ttagtggtac ctttctattc tcactccgct taggcttgcg gtggtgcggc cgcagaacaa 60aaactcatct cagaagagga tctgagatct agatctggag gcggtactgt tgaaagttgt 120ttagcaaaac ctcatacaga aaattcattt actaacgtct ggaaagacga caaaacttta 180gatcgttacg ct 192<210>9<211>64<212>PRT<213>噬菌體M13<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>*＝stop<400>9Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser His Ser Ala * Ala Cys Gly Gly Ala1 5 10 15Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Arg Ser Arg Ser20 25 30Gly Gly Gly Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn35 40 45Ser Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala50 55 60<210>10<211>2962<212>DNA<213>模擬序列<220>
<223>hemagglutinin tag包括氨芐青霉素基因序列、ColE1復(fù)制起點(diǎn)、f1復(fù)制起點(diǎn)、Plac促進(jìn)劑、流感病毒血細(xì)胞凝集素標(biāo)記的合成物<400>10gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat60gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttaccg gttcttttaa120ctttagtaag gaggaattaa aaaatgaaat acctattgcc tacggcagcc gctggattgt180tattactcgc ggcccagccg gccatggcgg ccctgcaggc ctctagagcg gccgcttacc240cgtacgacgt tccggactac gcaggtggct gctgataagt cgacctcgac caattcgccc300tatagtgagt cgtattacaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac360cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat420agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg480gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc540gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc600acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt660agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg720
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt780ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta840taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt900aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttagg tggcactttt cggggaaatg960tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga10209acaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac1080atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc1140cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatca9tt gggtgcacga gtgggttaca1200tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc1260caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg1320ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac1380cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca1440taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg1500agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac1560cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg1620caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat1680taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg1740ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg1800cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc1860aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc1920attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt1980tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt2040aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt2100gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag2160cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca2220gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca2280agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg2340ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg2400cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct2460acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga2520gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc2580ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg2640agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg2700cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt2760tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc2820gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac2880gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc2940ccgactggaa agcgggcagtga 2962<210>11<211>903<212>DNA<213>噬菌體M13<400>11ttagtggtac ctttctattc tcactccgct acatcccgcc tggagggcct acagtcagaa60
aaccatcgcc tgcgaatgaa gatcacagag ctggataaag acttggaaga ggtcaccatg120cagctgcagg acgtcggagg ttgcgcggcc gcagaacaaa aactgatctc agaagaggat180ctgacgcgtg ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggcggc240tctgagggtg gcggttctga gggtggcggc tctgagggtg gcggttccgg tggcggctcc300ggttccggtg attttgatta tgaaaaaatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa360aatgccgatg aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact420gattacggtg ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat480ggtgctactg gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat540aattcacctt taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ccctccctca atcggttgaa600tgtcgccctt ttgtctttgg cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaa660ataaacttat tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgta720ttttctacgt ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aataaggcgc gccacaattt780cacagtaagg aggtttaata aatgaaaaag acagctattg cgattgcagt ggcactggct840ggtttcgcta ccgtagcgca ggctagatct ggaggcggta ctgttgaaag tt9tttagca900aaa 903<210>12<211>287<212>PRT<213>噬菌體M13<400>12Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser His Ser Ala Thr Ser Arg Leu Glu Gly1 5 1015Leu Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met Lys Ile Thr Glu Leu Asp20 25 30Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Val Gly Gly Cys35 40 45Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu He Ser Glu Glu Asp Leu Thr Arg Ala50 55 60Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly65 70 7580Ser Glu G1y Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser85 90 95Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn100 105 110Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln115 120 125Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala130 135 140Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn145 150 155 160Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val165 170 175Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu180 185 190
Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Gly Ala195 200 205Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe210 215 220Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val225 230 235 240Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser Met Lys Lys245 250255Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala260 265270Gln Ala Arg Ser Gly Gly Gly Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys275 280 285<210>13<211>272<212>DNA<213>模擬序列<220>
<223>包括lac促進(jìn)劑、噬菌體基因VIII引導(dǎo)序列、流感病毒血細(xì)胞凝集素標(biāo)記和噬菌體基因III序列的合成物<400>13aattgtgagc ggataacaat ttaccggttc ttttaacttt agtaaggagg aattaaaaaa60tgaaaaagtc tttagtcctc aaagcctccg tagccgttgc taccctcgtt ccgatgctaa120gcttcgcttc tagagcggcc gcttatccat acgacgtacc agactacgca ggaggtcatc180accatcatca ccattagaga tctggaggcg gtactgttga aagttgttta gcaaaagcta240acatactgcg taataaggag tcttaagtcg ac 272<210>14<211>69<212>PRT<213>模擬序列<220>
<223>包括流感病毒血細(xì)胞凝集素標(biāo)記、組胺酸標(biāo)記和噬菌體基因III序列的合成物<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(46)..(69)<223>*＝stop<400>14Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu1 510 15Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ser Arg Ala Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp20 25 30Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly His His His His His His Xaa Arg Ser35 4045Gly Gly Gly Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Ala Asn Ile Leu Arg50 55 60Asn Lvs Glu Ser*65<210>15<211>146<212>DNA<213>Homo Sapien<400>15
tctagaggtg gaggaggtga ggagaagtcc cggctgttgg agaaggagaa ccgtgaactg60gaaaagatca ttgctgagaa agaggagcgt gtctctgaac tgcgccatca actccagtct120gtaggaggtt gttaataggg cgcgcc 146<210>16<211>44<212>PRT<213>Homo Sapien<400>16Ser Arg Gly Gly Gly Gly Glu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu1510 15Asn Arg Glu Leu Glu Lys Ile He Ala Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser20 25 30Glu Leu Arg His Gln Leu Gln Ser Val Gly Gly Cys35 40<210>17<211>140<212>DNA<213>Homo Sapien<400>17tctcgaggag gtggtggaac atcccgcctg gagggcctac agtcagaaaa ccatcgcctg60cgaatgaaga tcacagagct ggataaa9ac ttggaagagg tcaccatgca gctgcaggac120gtcggaggtt gcgcggccgc140<210>18<211>47<212>PRT<213>Homo Sapien<400>18Ser Arg Gly Gly Gly Gly Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu Gin Ser Glu1 5 1015Asn His Arg Leu Arg Met Lys He Thr Glu Leu Asp Lys Asp Leu Glu20 25 30Glu Val Thr Met Gln Leu Gln Asp Val Gly Gly Cys Ala Ala Ala35 40 45<210>19<211>32<212>DNA<213>噬菌體M13<400>19tttagtggta cctttctatt ctcactccgc tg 32<210>20<211>32<212>DNA<213>噬菌體M13<400>20tagaaaggta ccactaaagg aattgcgaat aa 32<210>21<211>55
<212>DNA<213>模擬序列<220>
<223>合成引物<400>21ggaattgtga gcggataaca atttaccggt cacacaggaa acagctatga ccatg55<210>22<211>55<212>DNA<213>模擬序列<220>
<223>合成引物<400>22catggtcata gctgtttcct gtgtgaccgg taaattgtta tccgctcaca attcc55<210>23<211>3057<212>DNA<213>模擬序列<220>
<223>包括氨芐青霉素基因序列、ColE1復(fù)制起點(diǎn)、f1復(fù)制起點(diǎn)、lac促進(jìn)劑、GABAB受體1區(qū)域和流感病毒血細(xì)胞凝集素標(biāo)記的合成物<400>23gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat60gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttaccg gttctttaag120gaggaattaa aaaatgaaaa agtctttagt cctcaaagcc tccgtagccg ttgctaccct180cgttccgatg ctaagcttcg ctggtgagga aaagtcccgt ctgctggaga aagagaaccg240tgaactggaa aagatcattg ctgagaaaga ggagcgtgtt tctgaactgc gccatcaact300gcagtctgta ggcggttgca cgcgttctag agcggccgct tacccgtacg acgttccgga360ctacgcatga taagtcgacc tcgaccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac420tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc480ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc540cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa600gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc660ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag720ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca780aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc840gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa900cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct960attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa1020cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt1080tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca1140ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt1200ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga1260tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa1320
gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 1380gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 1440acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 1500tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 1560caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 1620gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 1680cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac 1740tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 1800agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc 1860tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc 1920ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag 1980acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta 2040ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 2100gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 2160gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 2220ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 2280gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 2340ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 2400cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 2460cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 2520ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 2580tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 2640cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 2700ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 2760aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 2820ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 2880tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 2940gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 3000gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtga 3057<210>24<211>3817<212>DNA<213>模擬序列<220>
<223>包括Cam基因序列、ColE1復(fù)制起點(diǎn)、f1復(fù)制起點(diǎn)、lac促進(jìn)劑、GABAB受體2區(qū)域和Lpp-OmpA基因序列的合成物<400>24gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 60gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 120ctatgaccat gattacgcca agcgcgttta actttagtaa ggaggaatta aaaaatgaaa 180tacctgctgc cgaccgcagc cgcgggtttg ctgttactgg cggcccagcc ggctatggcg 240atgaaagcta ctaaactggt actgggcaac ccgtatgttg gctttgaaat gggttacgac 300tggttaggtc gtatgccgta caaaggcagc gttgaaaacg gtgcatacaa agctcagggc 360gttcaactga ccgctaaact gggttaccca atcactgacg acctggacat ctacactcgt 420
ctgggtggca tggtatggcg tgcagacact aaatccaacg tttatggtaa aaaccacgac480accggcgttt ctccggtctt cgctggcggt gttgagtacg cgatcactcc tgaaatcgct540acccgtctgg aataccagtg gacgaacaac atcggtgacg cacacaccat cggcactcgt600ccggacggag gtacatcccg cctggagggc ctacagtcag aaaaccatcg cctgcgaatg660aagatcacag agctggataa agacttggaa gaagtcacca tgcagctgca agacgttggc720ggttgctaat gagcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct780ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc840gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgggac900gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct960acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg1020ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt1080gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca1140tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga1200ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctc9g tctattcttt tgatttataa1260gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac1320gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc1380gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac1440aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt1500tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag1560aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg1620aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa1680tgatgagcac ttttcgaccg aataaatacc tgtgacggaa gatcacttcg cagaataaat1740aaatcctggt gtccctgttg ataccgggaa gccctgggcc aacttttggc gaaaatgaga1800cgttgatcgg cacgtaagag gttccaactt tcaccataat gaaataagat cactaccggg1860cgtatttttt gagttgtcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgg agaaaaaaat1920cactggatat accaccgttg atatatccca atggcatcgt aaagaacatt ttgaggcatt1980tcagtcagtt gctcaatgta cctataacca gaccgttcag ctggatatta cggccttttt2040aaagaccgta aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc tttattcaca ttcttgcccg2100cctgatgaat gctcatccgg aattacgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg2160ggatagtgtt cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt tttcatcgct2220ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc2280gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata tgtttttcgt2340ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa2400cttcttcgcc ccgttttcac catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg2460ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt2520aatgaattac aacagtactg cgatgagtgg cagggcgggg cgtaattttt ttaaggcagt2580tattggtgcc cttaaacgcc tggttgctac gcctgaataa gtgataataa gcggatgaat2640ggcagaaatt cgaaagcaaa ttcgacccgg tcgtcggttc agggcagggt cgttaaatag2700ccgcttatgt ctattgctgg tttaccggtt tattgactac cggaagcagt gtgaccgtgt2760gcttctcaaa tgcctgaggc cagtttgctc aggctctccc cgtggaggta ataattgacg2820atatgatcct ttttttctga tcaaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca2880tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga2940tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa3000aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga3060
aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt3120taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt3180taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat3240agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct3300tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca3360cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag3420agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc3480gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga3540aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca3600tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag3660ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg3720aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct3780ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtga 381權(quán)利要求
1.一種用于在基因包裝的外表面上展示外源性多肽的適配器定向展示系統(tǒng)，其包含(a)包含編碼序列的表達(dá)載體，該編碼序列可對(duì)在框架內(nèi)融合為第一適配器的外源性多肽進(jìn)行編碼，其中該載體缺乏對(duì)該基因包裝的任何功能性外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的外表面序列；(b)包含外表面序列的輔助載體，該外表面序列可對(duì)包裹該基因包裝所必需的外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼，其中至少一個(gè)該外表面蛋白質(zhì)在框架內(nèi)融合為第二適配器，在合適的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽時(shí)，所述第一和第二適配器起作用以使得多肽經(jīng)由第一和第二適配器之間的成對(duì)相互作用來展示。
2.如權(quán)利要求1所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)是噬菌體展示系統(tǒng)。
3.如權(quán)利要求1所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)是細(xì)菌展示系統(tǒng)。
4.如權(quán)利要求1所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該基因包裝選自病毒、細(xì)胞和孢子。
5.如權(quán)利要求2所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中外表面序列對(duì)噬菌體的功能性外殼蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。
6.如權(quán)利要求2所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中噬菌體是絲狀噬菌體。
7.如權(quán)利要求2所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該外表面序列選自絲狀噬菌體的基因III、基因VI、基因VII、基因VIII和基因IX。
8.如權(quán)利要求3所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該外表面序列對(duì)細(xì)菌外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。
9.如權(quán)利要求3所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該細(xì)菌外表面蛋白質(zhì)選自Lpp-OmpA、TraT、Pal、Oprl、Inp和AIDA-I。
10.如權(quán)利要求1所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該第一和第二適配器是同源二聚序列。
11.如權(quán)利要求1所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該同源二聚序列由一對(duì)半胱氨酸殘基組成。
12.如權(quán)利要求1所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該第一和第二適配器是異源二聚序列。
13.如權(quán)利要求1所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該第一和第二適配器形成卷曲螺旋二聚體。
14.如權(quán)利要求13所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該第一和第二適配器是亮氨酸拉鏈。
15.如權(quán)利要求13所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該第一和第二適配器包含可調(diào)節(jié)該受體的異源二聚的異源二聚受體序列。
16.如權(quán)利要求13所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該第一和第二適配器分別包含GABAB受體1和GABAB受體2的異源二聚序列。
17.如權(quán)利要求13所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該第一和第二適配器分別包含GABAB受體2和GABAB受體1的異源二聚序列。
18.如權(quán)利要求1所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該輔助載體進(jìn)一步包含外表面序列的至少一個(gè)另外復(fù)制，該外表面序列與(b)中的融合外表面序列競(jìng)爭(zhēng)包裹。
19.如權(quán)利要求2所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該表達(dá)載體選自圖9A中所示的pABMX14和圖15A中所示的pABMX15。
20.如權(quán)利要求2所述的適配器定向展示系統(tǒng)，其中該噬菌體輔助載體選自圖5A中所示的GM-超輔助噬菌體載體、圖13A中所示的CM-超輔助噬菌體載體和圖19A中所示的GMCT-超輔助噬菌體載體。
21.一種用于在基因包裝的外表面上展示多肽的輔助載體，其包含對(duì)該基因包裝進(jìn)行包裹所必需的外表面序列，其中至少一個(gè)該表面呈現(xiàn)序列在框架內(nèi)融合為適配器，在合適的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽時(shí)，該適配器起作用以引起該多肽的展示。
22.如權(quán)利要求21所述的輔助載體，其中該載體是噬菌體輔助載體。
23.如權(quán)利要求21所述的輔助載體，其中該載體是細(xì)菌輔助載體。
24.如權(quán)利要求21所述的輔助載體，其中該基因包裝選自病毒、細(xì)胞和孢子。
25.如權(quán)利要求22所述的輔助載體，其中該外表面序列對(duì)噬菌體的功能性外殼蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。
26.如權(quán)利要求22所述的輔助載體，其中該噬菌體是絲狀噬菌體。
27.如權(quán)利要求22所述的輔助載體，其中該外表面序列選自絲狀噬菌體的基因III、基因VI、基因VII、基因VIII和基因IX。
28.如權(quán)利要求23所述的輔助載體，其中該外表面序列對(duì)細(xì)菌外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。
29.如權(quán)利要求23所述的輔助載體，其中該細(xì)菌外表面蛋白質(zhì)選自Lpp-OmpA、TraT、Pal、Oprl、Inp和AIDA-I。
30.如權(quán)利要求21所述的輔助載體，其中由多肽在框架內(nèi)融合的該適配器經(jīng)由與第二適配器的成對(duì)相互作用來引起該多肽的展示。
31.如權(quán)利要求21所述的輔助載體，其中該適配器在不存在外表面蛋白質(zhì)表達(dá)的情況下經(jīng)由噬菌體中間載體或質(zhì)粒來引起該多肽的展示。
32.如權(quán)利要求21所述的輔助載體，其中兩個(gè)適配器是異源二聚序列。
33.如權(quán)利要求21所述的輔助載體，其中兩個(gè)適配器是同源二聚序列。
34.如權(quán)利要求21所述的輔助載體，其中兩個(gè)適配器是同源二聚序列。
35.如權(quán)利要求34所述的輔助載體，其中該同源二聚序列是由一對(duì)半胱氨酸殘基組成。
36.如權(quán)利要求32所述的輔助載體，其中兩個(gè)適配器形成卷曲螺旋二聚體。
37.如權(quán)利要求36所述的輔助載體，其中兩個(gè)適配器是亮氨酸拉鏈。
38.如權(quán)利要求36所述的輔助載體，其中兩個(gè)適配器包含可調(diào)節(jié)該受體的異源二聚的異源二聚受體序列。
39.如權(quán)利要求36所述的輔助載體，其中兩個(gè)適配器分別包含GABAB受體1和GABAB受體2的異源二聚序列。
40.如權(quán)利要求36所述的輔助載體，其中該兩個(gè)適配器分別包含GABAB受體2和GABAB受體1的異源二聚序列。
41.一種用于在基因包裝中或在其外表面上產(chǎn)生多肽的表達(dá)載體，其包含對(duì)在框架內(nèi)融合為第一適配器的多肽進(jìn)行編碼的編碼序列，其中該載體缺乏對(duì)該基因包裝的任何功能性外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的外表面序列，且在該基因包裝外表面上的多肽表達(dá)是經(jīng)由第一和第二適配器之間的非共價(jià)成對(duì)相互作用來調(diào)節(jié)，其中第二適配器融合為外表面蛋白質(zhì)。
42.如權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體，其中該載體是噬菌體中間載體。
43.如權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體，其中該載體是細(xì)菌表達(dá)載體。
44.如權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體，其中該基因包裝選自病毒、細(xì)胞和孢子。
45.如權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體，其中該外表面序列是噬菌體外殼-編碼基因序列。
46.如權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體，其中該外表面序列對(duì)細(xì)菌外表面蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。
47.如權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體，其中第一和第二適配器是同源二聚序列。
48.如權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體，其中第一和第二適配器是異源二聚序列。
49.如權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體，其中第一和第二適配器形成卷曲螺旋二聚體。
50.如權(quán)利要求49所述的表達(dá)載體，其中第一和第二適配器是亮氨酸拉鏈。
51.如權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體，其中第一和第二適配器包含對(duì)該受體的異源二聚進(jìn)行調(diào)節(jié)的異源二聚受體。
52.如權(quán)利要求51所述的表達(dá)載體，其中第一和第二適配器分別包含GABAB受體1和GABAB受體2的異源二聚序列。
53.如權(quán)利要求51所述的表達(dá)載體，其中第一和第二適配器分別包含GABAB受體2和GABAB受體1的異源二聚序列。
54.一種在合適的基因包裝中的試劑盒，其包含如權(quán)利要求1所述的適配器定向展示系統(tǒng)。
55.一種在合適的基因包裝中的試劑盒，其包含如權(quán)利要求21所述的輔助載體。
56.一種在合適的基因包裝中的試劑盒，其包含如權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體。
57.一種宿主細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求1所述的適配器定向展示系統(tǒng)。
58.一種宿主細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求21所述的輔助載體。
59.一種宿主細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求41所述的表達(dá)載體。
60.一種用于在基因包裝的外表面上展示多肽的方法，其包含在合適的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯如權(quán)利要求1所述的適配器定向展示系統(tǒng)。
61.一種根據(jù)權(quán)利要求60所述方法在基因包裝的外表面上展示的多肽。
62.一種在其外表面上展示融合多肽的基因包裝，該融合多肽包含一待展示且在框架內(nèi)由第一適配器融合的多肽序列，在合適的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生該融合多肽時(shí)，第一適配器起作用以經(jīng)由該第一適配器和連接至外表面蛋白質(zhì)的第二適配器之間的非共價(jià)成對(duì)相互作用來展示該融合多肽。
63.如權(quán)利要求62所述的基因包裝，其中該基因包裝選自病毒、細(xì)胞和孢子。
64.一種選擇性文庫，其包含多個(gè)基因包裝，至少一個(gè)基因包裝是如權(quán)利要求63所述的基因包裝。
65.一種選擇性文庫，其包含多個(gè)基因包裝，其中至少一項(xiàng)是根據(jù)權(quán)利要求60所述方法在其外表面上展示多肽。
66.一種探測(cè)測(cè)試劑和在基因包裝上所展示的外源性多肽之間的特定相互作用的存在的方法，該方法包含(a)提供根據(jù)權(quán)利要求60所述方法所制備的展示該外源性多肽的基因包裝；(b)在適于產(chǎn)生穩(wěn)定多肽-劑絡(luò)合物的條件下將該基因包裝與該測(cè)試劑接觸；和(c)探測(cè)該穩(wěn)定多肽-劑絡(luò)合物在該基因包裝上的形成，從而探測(cè)特定相互作用的存在。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中該外源性多肽選自抗原結(jié)合單元、細(xì)胞表面受體、受體配位體、細(xì)胞固定蛋白質(zhì)、分泌蛋白質(zhì)和核蛋白質(zhì)。
68.如權(quán)利要求66所述的方法，其中該外源性多肽是抗原結(jié)合單元。
69.如權(quán)利要求66所述的方法，其中該測(cè)試劑選自蛋白質(zhì)、多糖、脂類和其組合。
70.如權(quán)利要求66所述的方法，其中該測(cè)試劑是抗原。
71.如權(quán)利要求66所述的方法，其中該測(cè)試劑是配位體。
72.一種獲得具有期望的特性的多肽的方法，其包含(a)提供如權(quán)利要求65所述的選擇性文庫；和(b)篩選該選擇性文庫以獲得至少一個(gè)展示具有期望的特性的多肽的基因包裝。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其中期望的特性是對(duì)于所關(guān)心試劑的結(jié)合特性。
74.如權(quán)利要求72所述的方法，其中篩選該選擇性文庫進(jìn)一步包含將展示具有期望的特性的多肽的該基因包裝分離。
75.如權(quán)利要求72所述的方法，其中分離該基因包裝進(jìn)一步包含由對(duì)具有期望的特性的該多肽進(jìn)行編碼的該基因包裝獲得核苷酸序列。
76.如權(quán)利要求72所述的方法，其中具有期望的特性的多肽選自抗原結(jié)合單元、細(xì)胞表面受體、受體配位體、細(xì)胞固定蛋白質(zhì)、分泌蛋白質(zhì)和核蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供適配器定向展示系統(tǒng)(adapter－directed display system)，其是用于在宿主細(xì)胞中顯現(xiàn)外源性多肽和/或在基因包裝的外表面上展示外源性多肽。本系統(tǒng)尤其適用于展示單體和多元體多肽的遺傳多樣性清單(repertoire)。本發(fā)明亦提供表達(dá)載體、輔助載體和包含本展示系統(tǒng)的組分的試劑盒。本發(fā)明亦提供可展示所特別關(guān)心的外源性多肽的基因包裝。本發(fā)明進(jìn)一步提供應(yīng)用本展示系統(tǒng)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1630722SQ02821950
公開日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2002年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月2日
發(fā)明者王采力, 鐘平宇, 王新偉 申請(qǐng)人:阿布馬科西斯公司