專(zhuān)利名稱(chēng)：長(zhǎng)雙歧桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及下述新型長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)，該長(zhǎng)雙歧桿菌的發(fā)酵性和在酸性條件下、流通過(guò)程中的保存性優(yōu)良，并且耐胃酸性能優(yōu)良，容易發(fā)揮生理功能。
背景技術(shù)：
已知長(zhǎng)雙歧桿菌等雙歧桿菌屬菌(以下稱(chēng)為雙尾菌)是人腸道內(nèi)形成的腸內(nèi)菌叢中的優(yōu)勢(shì)菌種之一，通過(guò)攝取它具有整腸作用。近年來(lái)，隨著人們健康意識(shí)的提高，對(duì)含有雙尾菌的食品的需求也日益提高，雙尾菌在發(fā)酵乳和乳酸菌飲料等中被廣泛應(yīng)用。另外，對(duì)于雙尾菌具有的抗腫瘤活性等生理作用也已被多個(gè)報(bào)告報(bào)道，正在嘗試將其用于各種保健食品。因此，雖然雙尾菌的腸內(nèi)菌叢維持或改善等效果備受期待，但是，為了使其發(fā)揮上述效果，必須持續(xù)攝取雙尾菌。
但是，雙尾菌在乳性成分培養(yǎng)基中的增殖性不好，需要長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵才能達(dá)到一定的pH值和菌數(shù)。并且，雙尾菌在酸性條件下難于保存，容易死亡，因此，利用雙尾菌的發(fā)酵乳制品在流通過(guò)程中的菌數(shù)維持是一大課題。
另一方面，一般認(rèn)為在發(fā)揮雙尾菌的生理作用時(shí)，活菌是最有效的，但在人體消化道內(nèi)存在乳酸菌和雙尾菌的多種死亡因素和發(fā)育抑制因素。特別是到達(dá)消化道的最初關(guān)口——胃時(shí)，必定受到胃液的低pH值和消化酶的洗禮。受胃內(nèi)容物等情況的影響，一般將在pH3.0下存活2小時(shí)作為耐胃酸性能的一個(gè)基準(zhǔn)(伊藤等，日畜會(huì)報(bào)，63卷，12號(hào)，1276～1289頁(yè)，1992年)。
但是，一般認(rèn)為雙尾菌大部分不耐低pH，與乳酸桿菌等相比，通過(guò)胃液的幾率低。
因此，在開(kāi)發(fā)含有雙尾菌的飲料食品時(shí)，希望開(kāi)發(fā)下述雙尾菌其能夠在短時(shí)間內(nèi)增殖到一定量以上(發(fā)酵性)，在生產(chǎn)后的流通和消費(fèi)過(guò)程中能維持一定量以上的活菌數(shù)(耐酸性)，并且具有耐胃酸性能，能活著到達(dá)消化道(特別是腸道)后發(fā)揮生理作用。
從上述問(wèn)題出發(fā)，正在進(jìn)行雙尾菌的發(fā)酵性、耐酸性和耐胃酸性能的研究。例如，對(duì)于雙歧雙歧桿菌(Biffdobacterium bifidum)，已知其存在在耐酸性或含乳培養(yǎng)基中具有發(fā)酵性的變異株(特公昭56-42250號(hào)公報(bào))。另外，對(duì)于長(zhǎng)雙歧桿菌，已知其存在具有耐酸性的菌株(特公昭59-53829號(hào)公報(bào)(以下稱(chēng)為引用文獻(xiàn)1)、特開(kāi)平11-75830號(hào)公報(bào))。進(jìn)一步地，已知短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)在還原脫脂乳培養(yǎng)基中增殖后還具有耐酸性(特開(kāi)平4-320642號(hào)公報(bào))。
但是，上述現(xiàn)有報(bào)道的雙歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌在含乳培養(yǎng)基中為了發(fā)酵達(dá)到規(guī)定的pH，需要15小時(shí)以上的長(zhǎng)時(shí)間。另外，耐酸性菌株的大多數(shù)在酸性乳制品或果汁制品中(pH4.0～4.8)冷藏保管后的存活率不一定能充分滿足。即，上述菌株耐酸性不夠。另外，被認(rèn)為與消化道(腸道)內(nèi)的存活率有關(guān)的耐胃酸性能強(qiáng)的長(zhǎng)雙歧桿菌變異株也有報(bào)告(特開(kāi)平9-322762，以下稱(chēng)為引用文獻(xiàn)2)，但從后述試驗(yàn)的結(jié)果可知，該菌株在酸性乳制品中的保存性不足。
因此，本發(fā)明的目的是提供下述雙尾菌，該雙尾菌在含乳培養(yǎng)基中增殖性好，具有耐酸性，在發(fā)酵乳制品中容易確保一定數(shù)量以上的菌數(shù)，在保存流通中也能保持菌數(shù)，并且耐胃酸性能強(qiáng)，活著到達(dá)消化道(腸道)，容易發(fā)揮生理功能。
另外，本發(fā)明的目的是提供含有所述雙尾菌的菌粉和飲料和食品。

發(fā)明內(nèi)容
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人進(jìn)行悉心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只要是具有如下性質(zhì)的長(zhǎng)雙歧桿菌，則可以在短時(shí)間增殖到達(dá)一定量以上，在生產(chǎn)后的流通和消費(fèi)過(guò)程中能維持一定量以上的活菌數(shù)，并且具有耐胃酸性能，可以活著到達(dá)消化道(特別是腸道)發(fā)揮生理作用。所述性質(zhì)如下(1)使含乳培養(yǎng)基的pH達(dá)到4.6或4.6以下的發(fā)酵性；(2)在含乳培養(yǎng)基達(dá)到pH為4.4～4.6時(shí)驟冷，在10℃保持2小時(shí)后的存活率為50％或50％以上；(3)在pH＝3.0的人工胃液中于37℃保溫2小時(shí)后的存活率為10％或10％以上的耐胃酸性能。從而完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供具有下述菌學(xué)性質(zhì)的長(zhǎng)雙歧桿菌
(1)使含乳培養(yǎng)基的pH達(dá)到4.6或4.6以下的發(fā)酵性；(2)在含乳培養(yǎng)基達(dá)到pH為4.4～4.6時(shí)驟冷，在10℃保持2小時(shí)后的存活率為50％或50％以上；(3)在pH＝3.0的人工胃液中于37℃保溫2小時(shí)后的存活率為10％或10％以上的耐胃酸性能。
另外，本發(fā)明提供含有所述長(zhǎng)雙歧桿菌的菌粉。
本發(fā)明還提供含有所述長(zhǎng)雙歧桿菌的飲料和食品。
發(fā)明的最佳實(shí)施形態(tài)本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌具有上述(1)、(2)和(3)的特性。
(1)是與發(fā)酵性有關(guān)的性質(zhì)。雙尾菌一般在乳性成分培養(yǎng)基中的增殖性弱，必需長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵才能達(dá)到一定的pH和菌數(shù)。如果是具有在含乳培養(yǎng)基中可以使pH達(dá)到4.6或4.6以下的強(qiáng)發(fā)酵力的菌，則可以短時(shí)間進(jìn)行發(fā)酵，在利用該菌的飲料食品(發(fā)酵乳制品等酸性乳制品、果汁制品等)中，容易確保一定量的菌數(shù)(例如1000萬(wàn)個(gè)/1ml發(fā)酵乳制品)，提高生產(chǎn)效率。
(2)是與耐酸性有關(guān)的性質(zhì)，所述耐酸性能夠在利用雙尾菌的發(fā)酵乳制品的保存或流通過(guò)程中維持一定的菌數(shù)。一般來(lái)說(shuō)，酸性乳制品或果汁制品的pH為4.0～4.8，其保質(zhì)期一般是在10℃以下的保存條件下為2周左右。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果是利用含乳培養(yǎng)基培養(yǎng)，在pH達(dá)到4.4～4.6時(shí)驟冷，在10℃保持兩周后的存活率為50％或50％以上的菌，則其耐酸性強(qiáng)，在保質(zhì)期內(nèi)的酸性乳制品等中可以確保一定的活菌數(shù)。相反，在例如pH4的枸櫞酸或蘋(píng)果酸緩沖液中，在10℃保存4天后的殘存率為5％或5％以上的菌不一定具有足夠的耐酸性。另外，含乳培養(yǎng)基是指用牛奶、鮮干酪、奶油和脫脂乳等乳成分制作的含有乳蛋白3％或3％以上的培養(yǎng)基。
(3)是與使雙尾菌活著到達(dá)消化道(腸道)的耐胃酸性能相關(guān)的性質(zhì)。雙尾菌在口服攝取后通過(guò)胃，然后到達(dá)腸道并發(fā)揮其生理功能。但是，由于胃酸的pH值低，大部分的菌在胃中死亡，能夠達(dá)到腸道的菌很少。如果在pH＝3.0的人工胃液中于37℃保溫2小時(shí)后的存活率為10％或10％以上，則可以認(rèn)為耐胃酸性能高，大部分的菌能活著到達(dá)腸道。
通過(guò)攝取具有上述(1)～(3)菌學(xué)性質(zhì)的長(zhǎng)雙歧桿菌，大部分的菌能活著到達(dá)腸道，容易發(fā)揮作為雙尾菌的生理功能。
本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌可以通過(guò)例如下述方法獲得。首先，從各種試樣中分離菌株，從中選取在含乳培養(yǎng)基中發(fā)酵性優(yōu)良的菌株，即具有使含乳培養(yǎng)基的pH達(dá)到4.6或4.6以下的發(fā)酵性的菌株。然后，以選出的菌為起始原料(スタ-タ-)制備發(fā)酵乳制品，選出在低溫保存中存活性優(yōu)良的菌株，即用含乳培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在pH達(dá)到4.4～4.6時(shí)驟冷，在10℃保持2小時(shí)后的存活率為50％或50％以上的菌株。接著，將該菌株用pH＝3.0的人工胃液中于37℃保溫2小時(shí)，選取存活率為10％或10％以上的耐胃酸性能優(yōu)良的菌株。
下面進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
1、菌株的獲得為了從自然界獲得具有上述性質(zhì)的菌株，本發(fā)明人將從自然界采集的樣品用厭氧性稀釋液(1980年叢文社發(fā)行，光岡知足著《腸內(nèi)菌的世界》，322頁(yè)，以下稱(chēng)為參考文獻(xiàn)1。)，涂布到BL瓊脂培養(yǎng)基(上述參考文獻(xiàn)1，319頁(yè))的平板上，在37℃進(jìn)行厭氧性培養(yǎng)。在通過(guò)上述方法得到的菌落中，雙尾菌呈現(xiàn)特有的形態(tài)，并且通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)涂布標(biāo)本為革蘭氏陽(yáng)性。取呈現(xiàn)棒狀、棍狀或分支狀菌形的菌，畫(huà)線涂布到BL瓊脂平板上，用與上述相同的方法反復(fù)進(jìn)行厭氧性培養(yǎng)，得到純粹分離的菌株。用下述的試驗(yàn)方法，將這些菌株首先進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)和保存過(guò)程中的存活性試驗(yàn)，得到具有優(yōu)良性質(zhì)的菌株20多株。然后進(jìn)行耐胃酸性試驗(yàn)，獲得在pH＝3.0的人工胃液中顯示優(yōu)良存活性的菌株。其中，將最好的菌株在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心以FERM BP-7787(委托保藏日平成13年10月31日)委托保藏。該菌株的菌學(xué)性質(zhì)性質(zhì)如下所示。
2、菌學(xué)性質(zhì)(1)菌形(在BL瓊脂培養(yǎng)基中于37℃厭氧性培養(yǎng)72小時(shí)后，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察時(shí))大小0.3～0.8μm×4～10μm形狀呈現(xiàn)多形性的桿菌(棍棒狀、Y字狀等)(2)革蘭氏染色性陽(yáng)性(3)菌落形態(tài)(在BL瓊脂培養(yǎng)基中于37℃厭氧性培養(yǎng)72小時(shí)后)形狀圓形隆起～半球形隆起周邊圓滑大小1～4mm色調(diào)周邊暗褐色，中心濃褐色表面光滑(4)芽孢形成陰性(5)氣體產(chǎn)生無(wú)(6)運(yùn)動(dòng)性無(wú)(7)過(guò)氧化氫酶活性陰性(8)醋酸/L(+)乳酸摩爾比1.5以上(9)糖發(fā)酵性 用光岡的糖發(fā)酵性用培養(yǎng)基(上述參考文獻(xiàn)1，323頁(yè))通過(guò)API 50CH系統(tǒng)(日本バイオメリユ-株式會(huì)社)實(shí)施。
L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、松三糖、棉子糖、D-松二糖為陽(yáng)性，α-甲基糖苷為滯后陽(yáng)性。
甘油、赤蘚糖醇、D-阿拉伯糖、核糖、L-木糖、核糖醇、甲基木糖苷(メチリキシロシド)、L-山梨糖、鼠李糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、甘露糖醇、雙脫水山梨糖醇、α-甘露糖苷、N-乙?；咸前贰⒈馓臆?アミグタリン)、熊果葉苷、七葉苷、水楊苷、纖維二糖、海藻糖、旋復(fù)花粉、淀粉、糖原、木糖醇、龍膽二糖、D-來(lái)蘇糖、D-塔格糖、D-巖藻糖、L-巖藻糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸鹽(酯)、2-葡糖酮酸鹽(酯)、5-葡糖酮酸鹽(酯)為陰性。
(10)DNA的同源性分別抽取長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC 15707T和動(dòng)物雙歧桿菌(Bididobacteriumanimalis)R 101-8T(可以通過(guò)理化學(xué)研究所微生物系統(tǒng)保存設(shè)備以JCM1190T獲得)的染色體DNA，與從長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787抽取的染色體DNA通過(guò)微型板雜交法進(jìn)行雜交。從長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787抽取的染色體DNA對(duì)從長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC 15707抽取的染色體DNA顯示出95％的同源性，與動(dòng)物雙歧桿菌R 101-8T的同源性為22％。
上述本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787與Bergey’s Manual ofSystematic Bacteriology，Vol.2，1986的分類(lèi)基準(zhǔn)中所示的雙尾菌一致。另外，通過(guò)糖發(fā)酵性、性狀以及DNA的同源性結(jié)果鑒定為長(zhǎng)雙歧桿菌。
3、含乳培養(yǎng)基中的發(fā)酵性將混合了0.2％酵母提取物(Difco公司)的11％還原脫脂奶粉培養(yǎng)基在115℃滅菌15分鐘，將用該培養(yǎng)基進(jìn)行兩次傳代培養(yǎng)的長(zhǎng)雙歧桿菌FERMBP-7787以及對(duì)照株(表1中記錄的本發(fā)明菌株以外的菌株)的起始菌(スタ-タ-)接種5％，在37℃培養(yǎng)6小時(shí)。測(cè)定培養(yǎng)液的pH值和菌數(shù)。菌數(shù)測(cè)定在RCA(Reinforced Clostridial Agar，Oxoid公司)平板上進(jìn)行。在本培養(yǎng)條件下，與對(duì)照株相比，長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787能夠在短時(shí)間內(nèi)使含乳培養(yǎng)基凝固，雙尾菌數(shù)也是最高的(表1)。
表1各菌株在含乳培養(yǎng)基中的發(fā)酵性

長(zhǎng)雙歧桿菌FERM P-6548引用文獻(xiàn)1記載的菌株長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC55817引用文獻(xiàn)2記載的菌株4、耐酸性(1)單獨(dú)發(fā)酵將混合了0.2％酵母提取物(Difco公司)的11％還原脫脂奶粉培養(yǎng)基裝入試管，在115℃滅菌15分鐘，將長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787以及對(duì)照株(表2中記錄的本發(fā)明菌株以外的菌株)的起始菌(スタ-タ-)接種5％，在37℃發(fā)酵至pH變成4.3～4.4，然后驟冷，在10℃進(jìn)行保存試驗(yàn)。在RCA瓊脂平板上測(cè)定驟冷后立即保存1周后和2周后的菌數(shù)，算出各期間保存后的存活率。
長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787在發(fā)酵至pH＝4.4的培養(yǎng)基中，即使在10℃保存2周，基本上都存活，顯示出非常高的存活性，其比對(duì)照株長(zhǎng)雙歧桿菌FERM P-6548更優(yōu)良(表2)。已知具有耐胃酸性能的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC55817和其它對(duì)照株在保存2周后幾乎內(nèi)沒(méi)有存活。
表2各菌株在含乳培養(yǎng)基中的發(fā)酵性

長(zhǎng)雙歧桿菌FERM P-6548引用文獻(xiàn)1記載的菌株長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC55817引用文獻(xiàn)2記載的菌株(2)混合發(fā)酵將與后述實(shí)施例1組成相同的由乳脂肪3.0％(W/W)、無(wú)脂乳固體成分9％(W/W)組成的鮮乳基質(zhì)加熱到70℃，在15MPa的壓力下勻化，在90℃殺菌10分鐘，冷卻至40℃。在該殺菌后的基質(zhì)上，接種通過(guò)后述實(shí)施例1記載的方法制備的唾液鏈球菌唾液亞種(Streptococcus thermophilus)和德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lacobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)的混合培養(yǎng)物0.6％。然后，分別接種5％下述長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787以及對(duì)照株(表2中記錄的本發(fā)明菌株以外的菌株)的起始菌(スタ-タ-)，所述長(zhǎng)雙歧桿菌和對(duì)照菌用混合了0.2％酵母提取物(Difco公司)的11％還原脫脂奶粉培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)到pH變成4.3～4.4。然后分注到試管中，在37℃培養(yǎng)5小時(shí)，驟冷后在10℃進(jìn)行保存試驗(yàn)。在RCA瓊脂平板上測(cè)定驟冷后立即保存1周后和2周后的菌數(shù)，算出保存中的存活率。長(zhǎng)雙歧桿菌FERMBP-7787在發(fā)酵至pH為4.6或4.6以下的發(fā)酵乳中，即使在10℃保存2周仍有50％或50％以上存活，與已知具有耐胃酸性能的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC55817及其它對(duì)照菌株相比，耐酸性優(yōu)良(表3)。
表3各菌株在含乳培養(yǎng)基中的存活性

長(zhǎng)雙歧桿菌FERM P-6548引用文獻(xiàn)1記載的菌株長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC55817引用文獻(xiàn)2記載的菌株
5、耐胃酸性按照下述方法進(jìn)行耐胃酸性試驗(yàn)。即，往過(guò)濾滅菌過(guò)的并且用1M鹽酸調(diào)至pH＝3.0的人工胃液[將0.2％NaCl、0.35％胃蛋白酶(1∶50000)用精制水溶解]9.9ml中，加入下述長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787和對(duì)照株的菌體懸浮液0.1ml，所述長(zhǎng)雙歧桿菌和對(duì)照株用Briggs liver broth(光岡知足，《(臨床檢查)》，18卷，1163～1172頁(yè)，1974年)進(jìn)行2次活化培養(yǎng)(37℃，24小時(shí))，用生理鹽水洗滌一次。在37℃接觸2小時(shí)后，將1ml加入pH＝6.5的磷酸緩沖液(67mM)9ml中停止處理。然后，用RCA瓊脂平板計(jì)數(shù)初始菌數(shù)和與人工胃液接觸后的菌數(shù)，算出存活率。通過(guò)本法，本發(fā)明的FERMBP-7787株與ATCC55817株顯示出相同水平的高耐胃酸性能，其它菌株，包括具有相當(dāng)耐酸性的FERM P-6548，幾乎不顯示耐性(表4)。
表4各菌株的人工胃液耐性

長(zhǎng)雙歧桿菌FERM P-6548引用文獻(xiàn)1記載的菌株長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC55817引用文獻(xiàn)2記載的菌株如上所述，本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787菌株在含乳培養(yǎng)基中具有很強(qiáng)的發(fā)酵性，在酸性條件下保存時(shí)具有優(yōu)良的存活性。進(jìn)一步地，從對(duì)人工胃液顯示強(qiáng)耐性可知，其具有在長(zhǎng)雙歧桿菌基準(zhǔn)株或至今公知的菌株上未曾發(fā)現(xiàn)過(guò)的性質(zhì)。相反，已知具有耐胃酸性能的ATCC55817在含乳培養(yǎng)基中的發(fā)酵性、在酸性條件下保存的存活性極差，與本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787菌株相比明顯很差。
本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌是從自然界中分離的長(zhǎng)雙歧桿菌中選出的具有發(fā)酵性、耐酸性和耐胃酸性能的菌株。因此，本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌可以在短時(shí)間內(nèi)迅速培養(yǎng)，培養(yǎng)物或其加工物在保存中的活菌數(shù)下降少，可以用于寬范圍pH值的飲料和食品。
另外，通過(guò)試驗(yàn)也證明了本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌在冷凍或冷凍干燥時(shí)的存活率優(yōu)良，因此，可以菌粉的形態(tài)使用。進(jìn)一步地，本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌具有耐胃酸性能，被攝取到人或動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，可以高幾率地活著到達(dá)消化道(腸道)發(fā)揮生理功能，因此在產(chǎn)業(yè)上極為有用。例如，不用說(shuō)在自古已知的作為人或動(dòng)物藥物的整腸劑中的應(yīng)用，也可以添加或混合到粉末狀食品、飼料或者液體狀或半固體狀的飼料、食品中。
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1在由酵母提取物0.2％(W/W)、脫脂奶粉11％(W/W)組成的、在90℃進(jìn)行過(guò)30分鐘殺菌的培養(yǎng)基1000ml上，接種本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌FERMBP-7787，在37℃培養(yǎng)6小時(shí)。另一方面，將10％(W/W)還原脫脂乳培養(yǎng)基1500ml在90℃滅菌30分鐘，接種唾液鏈球菌唾液亞種(ハンセン公司)和德氏乳桿菌保加利亞亞種(ハンセン公司)的混合培養(yǎng)物50ml，在42℃培養(yǎng)5小時(shí)。
另外將由乳脂肪3.0％(W/W)、無(wú)脂乳固體成分9.0％(W/W)組成的鮮乳50L加熱至70℃，在15MPa的壓力下勻化，在90℃殺菌10分鐘后冷卻至40℃。在該殺菌過(guò)的基質(zhì)上，接種進(jìn)行過(guò)上述前培養(yǎng)的本發(fā)明長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787菌株的培養(yǎng)物750m1，和，唾液鏈球菌唾液亞種和德氏乳桿菌保加利亞亞種的混合培養(yǎng)物300ml，填充到500ml的容器中，密封，在37℃培養(yǎng)5小時(shí)，立即冷卻。所得的發(fā)酵乳乳酸酸度為0.81％，pH＝4.55，含有長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787菌株2.33×108/ml、唾液鏈球菌唾液亞種6.8×108/ml、德氏乳桿菌保加利亞亞種3.4×107/ml。將此發(fā)酵乳在10℃保存14天后，長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787菌數(shù)為1.5×108/ml，存活率為65％。
實(shí)施例2將在37℃進(jìn)行前培養(yǎng)16小時(shí)的本發(fā)明長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787菌株的種子培養(yǎng)物500ml接種到具有下述組成的培養(yǎng)基10L上肉提取物50g、酵母提取物100g、蛋白胨100g、乳糖200g、K2HPO450g、KH2PO410g、胱氨酸4g和水9.5L。在37℃培養(yǎng)16小時(shí)，然后把上述培養(yǎng)液全部(10.5L)接種到在90℃殺菌30分鐘、組成與上述培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基200L上，在37℃培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)后的活菌數(shù)為3.0×109/ml。
然后，通過(guò)シヤ-プレス型離心分離機(jī)(15000rpm)收集菌體，再懸浮到與培養(yǎng)基等量的、在90℃殺菌30分鐘的生理鹽水中，與上述方法同樣離心分離，再次收集菌體。將所得的菌體懸浮于由脫脂奶粉10％(W/W)、蔗糖1％(W/W)、谷氨酸鈉1％(W/W)組成的溶液(90℃殺菌30分鐘)200L中，按照常規(guī)方法冷凍干燥，得到含本菌1.6×1010/g的粉末約2.2kg。
實(shí)施例3往干燥殺菌后的淀粉14kg和乳糖6kg中，加入實(shí)施例2所得的含有本發(fā)明長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787菌株的粉末20g，均勻混合，得到含本菌1.0×108/g的粉末整腸劑約20kg。
實(shí)施例4往由酵母提取物0.2％(W/W)、脫脂奶粉11％(W/W)組成的、在90℃殺菌30分鐘后的培養(yǎng)基1000ml中，接種本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌FERMBP-7787菌株，在37℃培養(yǎng)6小時(shí)。另一方面，將加入酵母提取物0.6％(W/W)的10％(W/W)的還原脫脂乳培養(yǎng)基1000ml在90℃殺菌30分鐘，接種乳酸乳球菌乳脂亞種(Streptococcus cremoris，ハンセン公司)的培養(yǎng)物30ml，在37℃培養(yǎng)16小時(shí)。
另外將由乳脂肪0.5％(W/W)、無(wú)脂乳固體成分8.5％(W/W)、蔗糖6.5％組成的鮮乳50L加熱至70℃，在15MPa的壓力下勻化處理，在90℃殺菌10分鐘，冷卻到33℃。在該殺菌后的基質(zhì)上，接種進(jìn)行過(guò)上述前培養(yǎng)的本發(fā)明長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787菌株的培養(yǎng)物750ml和進(jìn)行過(guò)上述前培養(yǎng)的乳酸乳球菌乳脂亞種的培養(yǎng)物500ml，在30℃培養(yǎng)16小時(shí)，然后立即攪拌冷卻。將冷卻發(fā)酵乳在15MPa的壓力下勻化處理，填充到200ml容量的玻璃容器中，密封，得到飲用酸乳。
所得的發(fā)酵乳乳酸酸度為0.70％，pH＝4.55，含有長(zhǎng)雙歧桿菌FERMBP-7787菌株1.5×108/ml、乳酸乳球菌乳脂亞種9.8×108/ml。將此發(fā)酵乳在10℃保存14天后，長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787菌數(shù)為8.5×107/ml，存活率為57％。
產(chǎn)業(yè)適用性本發(fā)明的長(zhǎng)雙歧桿菌FERM BP-7787菌株在乳性成分培養(yǎng)基中具有高發(fā)酵性和存活性、并且對(duì)人工胃液具有很強(qiáng)的耐性。因此，可以在短時(shí)間內(nèi)迅速配制本發(fā)明菌的培養(yǎng)物，培養(yǎng)物或其加工物在保存過(guò)程中活菌數(shù)的下降少，可以用于寬pH范圍的飲料和食品。進(jìn)一步地，本發(fā)明菌具有耐胃酸性能，在被攝取到人或動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，高幾率地活著到達(dá)消化道(腸道)發(fā)揮生理功能，在產(chǎn)業(yè)上極為有用。
權(quán)利要求
1.具有下述菌學(xué)性質(zhì)的長(zhǎng)雙歧桿菌(Bidofobacterium longum)(1)使含乳培養(yǎng)基的pH達(dá)到4.6或4.6以下的發(fā)酵性；(2)在含乳培養(yǎng)基達(dá)到pH為4.4～4.6時(shí)驟冷，在10℃保持2小時(shí)后的存活率為50％或50％以上；(3)在pH＝3.0的人工胃液中于37℃保溫2小時(shí)后的存活率為10％或10％以上的耐胃酸性能。
2.權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)雙歧桿菌，該菌株為長(zhǎng)雙歧桿菌FERMBP-7787。
3.含有權(quán)利要求1或2所述的長(zhǎng)雙歧桿菌的菌粉。
4.含有權(quán)利要求1或2所述的長(zhǎng)雙歧桿菌的飲料和食品。
全文摘要
本發(fā)明提供具有下述菌學(xué)性質(zhì)的長(zhǎng)雙歧桿菌(Bidifobacterium longum)和含有該長(zhǎng)雙歧桿菌的菌粉以及飲料和食品(1)使含乳培養(yǎng)基的pH達(dá)到4.6或4.6以下的發(fā)酵性；(2)在含乳培養(yǎng)基達(dá)到pH為4.4～4.6時(shí)驟冷，在10℃保持2小時(shí)后的存活率為50％或50％以上；(3)在pH＝3.0的人工胃液中于37℃保溫2小時(shí)后的存活率為10％或10％以上的耐胃酸性能。
文檔編號(hào)A23L1/03GK1585820SQ0282222
公開(kāi)日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2002年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月7日
發(fā)明者外山一吉, 平松明德, 肖金忠, 高橋典俊, 近藤靜木, 八重島智子, 高橋幸子 申請(qǐng)人:森永乳業(yè)株式會(huì)社