專利名稱：白細胞介素－2基因轉(zhuǎn)移的淋巴因子活化的殺傷細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于治療癌癥或病毒感染的轉(zhuǎn)移的淋巴因子活化的殺傷細胞，其中導入了白細胞介素-2基因。更具體地，本發(fā)明涉及用攜帶白細胞介素-2基因的重組載體轉(zhuǎn)染的淋巴因子活化的殺傷細胞，通過用攜帶白細胞介素-2基因的重組載體轉(zhuǎn)染衍生自哺乳動物外周血的淋巴因子活化的殺傷細胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)染細胞的方法，和包含轉(zhuǎn)染的細胞用于治療癌癥或病毒感染的藥物組合物。本發(fā)明轉(zhuǎn)染的淋巴因子活化的殺傷細胞具有持續(xù)分泌低濃度白細胞介素-2和顯示選擇性破壞癌細胞和病毒感染的細胞的特性。
背景技術：
淋巴因子活化的殺傷細胞(下文表示為LAK細胞)通常在用于治療惡性黑色素瘤和結腸癌等的過繼免疫治療中使用。利用LAK細胞的過繼免疫治療是為了治療特別是癌癥，其中從患者去除淋巴細胞，與白細胞介素-2一起培養(yǎng)以誘導它們轉(zhuǎn)化成LAK細胞，并與白細胞介素-2一起回到患者體內(nèi)。
在最近10年期間已經(jīng)發(fā)展了過繼免疫治療，其集中于修復先天免疫功能或增強患者對癌癥的抵抗力。通常，已經(jīng)了解過繼免疫治療對于治療相對強烈抗免疫的癌癥如惡性黑色素瘤等是有效的。
除了LAK細胞，在免疫治療中通常使用的免疫治療劑包括BCG，干擾素，白細胞介素-2，腫瘤壞死因子，單克隆抗體，Picibanil，Helix等。BCG，一種結核的減毒株(attenuated strain)，在免疫治療的初期使用，已經(jīng)已知BCG通過增強巨噬細胞消化癌細胞的功能和增強淋巴細胞介導的免疫而有效抗惡性黑色素瘤。干擾素通過影響除了癌細胞以外的正常細胞產(chǎn)生各種副作用，因此目前幾乎不使用。
在例如Leung的美國專利號4,849,329中公開了一種生產(chǎn)LAK細胞的方法。
Irr的美國專利號5,108,760公開了一種其中外周血單核細胞用氨基酸酰胺處理的增強LAK細胞激活的方法和一種包含所述LAK細胞用于治療癌癥的藥物組合物。
Rosenberg的美國專利號4,690,915公開了一種通過共同給藥LAK細胞和IL-2治療人癌癥的方法。
同時，LAK細胞也能用于治療HIV感染，并且該研究已經(jīng)在體外實施。已經(jīng)提供證據(jù)表明LAK細胞對于體外去除HIV感染的細胞是有效的(Tyler DS等.，J.Surg.Res.，79，115-120(1998)；和Wang L.，等.，Virology，241，169-180(1998))。
盡管近年來HIV感染的療法已經(jīng)迅速開發(fā)，但直至今日HIV感染仍未最終治愈。在迄今開發(fā)的療法中，共同給藥至少3種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒試劑，稱為HAART(高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法)，其表示HIV感染的標準療法(Hammer S.等.，N.Engl.J.Med.，337，725-733(1997)；和Staszewski S.，N.Engl.J.Med.，341，1865-1873(1999))。然而，HAART受限于完全治愈HIV感染，因為抗病毒劑即不作用于潛伏的HIV細胞，也不能通過解剖學屏障如腦血管和睪丸血管屏障。備選的HIV療法是結合上述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒試劑共同給藥IL-2(Chun TW等.，Nature Med.，5(6)，651-655(1999))。同樣，該療法也不足以治愈HIV感染。
在使用LAK細胞治療癌癥和HIV感染過程中，應克服幾種問題以臨床應用LAK細胞。LAK細胞應與高濃度的IL-2同時常規(guī)注射以在體內(nèi)保持存活。已經(jīng)報道高濃度的IL-2瞬時活化血液中的HIV病毒(病毒標記(viral blips))，其次增加潛伏細胞(Ramratnam B等.，Nat Med，6(1)，82-5(2000))。另外，已經(jīng)提示另一種問題，即持續(xù)給藥高濃度的IL-2導致包括細胞因子滲漏綜合征的各種副作用。
我們制備了一種用攜帶IL-2基因的重組載體轉(zhuǎn)化的淋巴因子活化的殺傷細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的細胞持續(xù)分泌低濃度的IL-2，并選擇性破壞癌細胞或病毒感染的細胞，而幾乎不影響正常細胞。
附圖簡述

圖1顯示依照本發(fā)明的重組載體LNC/IL-2/IRES/TK的示意圖。(LNCLTR啟動子/新霉素標記/CMV啟動子；IRES內(nèi)部核糖體進入位點，TK胸苷激酶；MSV小鼠肉瘤病毒；MLV小鼠白血病病毒；SD剪接供體；SA剪接受體)。
圖2顯示其中LAK細胞的活力與本發(fā)明的I-LAK細胞相比較的圖表。
圖3顯示其中LAK細胞對各種靶細胞的細胞毒性與本發(fā)明的I-LAK細胞相比較的圖表。
圖4顯示其中在共培養(yǎng)LAK細胞或I-LAK細胞和HIV感染的細胞后通過EIA分析定量HIV生產(chǎn)的圖表。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了導入重組載體的轉(zhuǎn)化的淋巴因子活化的殺傷細胞，所述重組載體攜帶對其可操作連接的IL-2基因。該轉(zhuǎn)化的細胞下文表示為I-LAK細胞。
優(yōu)選地，本發(fā)明的I-LAK細胞是用攜帶對其可操作連接的IL-2的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的I-LAK細胞是用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNC/IL-2/IRES/TK轉(zhuǎn)染的細胞。
另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)用于治療癌癥或病毒感染的I-LAK細胞的方法，其包含(a)從哺乳動物收集外周血并從外周血去除紅細胞以獲得包含淋巴細胞的白細胞級分，(b)在含IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的含淋巴細胞的白細胞級分，以產(chǎn)生LAK細胞，(c)用攜帶對其可操作連接的分泌IL-2的基因的重組載體轉(zhuǎn)染得到的LAK細胞，并在培養(yǎng)基中和在適于分化它們的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細胞，和(d)從培養(yǎng)液中篩選和回收具有分泌IL-2的能力的細胞。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療癌癥或病毒感染的藥物組合物，其包含足夠量的I-LAK細胞以激發(fā)免疫應答。
發(fā)明詳述本發(fā)明的一個實施方案包括導入重組載體的I-LAK細胞，所述重組載體攜帶對其可操作連接的IL-2基因。本發(fā)明的I-LAK細胞特征在于通過持續(xù)分泌調(diào)節(jié)量的IL-2恒定保持體內(nèi)低水平IL-2蛋白，從而選擇性破壞癌細胞或病毒感染的細胞而不影響正常細胞。一旦將本發(fā)明的I-LAK細胞給藥于遭受癌癥或病毒感染的哺乳動物，它們體內(nèi)持續(xù)分泌低濃度IL-2蛋白，結果低濃度的分泌的IL-2蛋白保持I-LAK細胞對癌細胞或病毒感染的細胞的細胞毒性而幾乎不影響正常細胞。
LAK細胞是能夠通過非MHC限制性機制消化病毒感染的細胞和各種轉(zhuǎn)化細胞的非特異性免疫效應細胞。通過與IL-2蛋白培養(yǎng)外周血單核細胞生產(chǎn)LAK細胞，其可用于治療癌癥，病毒感染疾病，自身免疫疾病等。
美國專利號4,690,915描述了聯(lián)合給藥LAK細胞和IL-2在治療惡性黑色素瘤，肺癌，腎癌，結腸癌和直腸癌中是有效的。同樣，它描述了LAK細胞具有各種抗結腸癌，胰腺癌，食管癌等的殺傷腫瘤活性(Rayner等.，Cancer，55，1327-1333(1985))。
IL-2蛋白是作為能促進抗原特異性效應T-淋巴細胞的體外長期培養(yǎng)的淋巴因子的有效免疫調(diào)節(jié)細胞因子(Morgan等.，Science，193，1007-1008(1976))。IL-2蛋白由CD4 T-淋巴細胞產(chǎn)生，非常少量的IL-2由CD8 T-淋巴細胞產(chǎn)生。IL-2蛋白作為刺激分泌細胞自身的自分泌生長因子發(fā)揮作用。同樣，IL-2蛋白作為旁分泌生長因子發(fā)揮作用，因為它影響包括CD4和CD8細胞的臨近的T-淋巴細胞。也已知IL-2蛋白調(diào)節(jié)各種免疫功能，包括影響細胞毒性T細胞，NK細胞和活化的B細胞，并通過產(chǎn)生LAK細胞增強細胞溶解功能。
依照本發(fā)明導入LAK細胞的IL-2基因負責IL-2蛋白的天然活性，以使LAK細胞在體內(nèi)保持存活。已克隆了編碼人IL-2蛋白的cDNA(Taniguchi等.，Nature，302，305(1983))并從其推導出了氨基酸序列。在真核細胞中，IL-2蛋白首次作為由153個氨基酸殘基組成的前體多肽而被生產(chǎn)，然后缺失20個氨基酸殘基，被修飾為成熟IL-2。利用分子生物學技術，具有天然活性的人重組IL-2已在大腸桿菌(Rosenberg等.，Science，223，1412(1984))，昆蟲細胞(Smith等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82，8404(1985))和哺乳動物COS細胞(Taniguchi等.，Nature，302，305 (1983))中生產(chǎn)。
依照本發(fā)明導入LAK細胞的IL-2基因可源自任何合適的來源，包括已知的重組IL-2基因。具體地，IL-2基因包括天然和重組IL-2基因和其生物功能等價物。生物功能等價物表示具有相同或非常類似的生物活性的多肽，例如在美國專利號4,518,584中描述的rIL-2突變蛋白，和具有代替NH2-末端丙氨酸的甲硫氨酸的rIL-2蛋白。
作為此處使用，術語“低濃度IL-2蛋白”或“低水平IL-2蛋白”表示能刺激和活化LAK細胞而無副作用如臨時增加的病毒活性誘導和細胞因子滲漏綜合征的量的IL-2蛋白。優(yōu)選的在人體內(nèi)日分泌自LAK細胞的IL-2蛋白的量為約500,000 IU或以下。如上述提及，已經(jīng)提示使用LAK細胞的免疫治療需要聯(lián)合LAK細胞注射高濃度的IL-2蛋白以保持LAK細胞存活。然而，高濃度IL-2蛋白的全身給藥導致具有次生潛伏HIV病毒的LAK細胞增加或?qū)е卵軆?nèi)流體滲漏到血管外空間(毛細血管滲漏綜合征)(Rosenstein M.等.，Immunology，137，1735-1742(1986)；Ohkubo C.等.，Cancer Res.，51，1561-1563(1991)；Edwards，M.J.等.，Cancer Res.，52，3425-3431(1992)；Damle N.K.等.，J.Immunol.，142，2660-2669(1989))。由給藥IL-2蛋白導致的毛細血管滲漏綜合征包括，例如形成水腫，低血壓和腎功能異常。當將IL-2給藥于人用于治療腫瘤時，通過動物試驗獲得的不超過10％最佳劑量是可接受的。然而，即使常規(guī)劑量也可導致無力，胃灌洗，嘔吐，腹瀉，低血壓和器官功能異常，甚至于不死亡。
作為此處使用，術語“癌細胞”表示不象正常細胞，它異常分裂和再生，不受控制的生長，并可脫離周圍組織和發(fā)展成浸潤。癌細胞的實例包括胰腺癌細胞，肺癌細胞，結腸癌細胞，肝癌細胞，乳腺癌細胞，前列腺癌細胞，膀胱癌細胞，皮膚癌細胞和軟組織癌細胞。優(yōu)選的癌細胞包括惡性黑色素瘤細胞，肺癌細胞，腎癌細胞，結腸癌細胞和直腸癌細胞。
作為此處使用，術語“病毒感染的細胞”表示通過感染病毒被突變改變的正常細胞，并具有下述性質(zhì)。它易于在體外生長。它的生長比正常細胞快。許多改變發(fā)生在細胞表面，例如增加離子通過的能力，喪失結合毒性激素，產(chǎn)生新的抗原等。改變了染色體，并形成抗病毒劑如干擾素。尤其是，此處通過病毒感染表示正常細胞被人免疫缺陷病毒(HIV)感染。HIV是稱為AIDS的獲得性免疫綜合征的誘因劑(casual agent)。HIV攻擊的主要靶目標是調(diào)節(jié)免疫功能的T細胞中的輔助T細胞。一旦輔助T細胞被HIV感染并發(fā)展成壞死，人免疫功能被損壞，發(fā)生免疫缺陷，導致致命性感染和惡性腫瘤。
作為此處使用，術語“選擇性破壞”或“選擇性殺傷”表示本發(fā)明的I-LAK細胞顯示對癌細胞或病毒感染的細胞而非正常細胞的細胞毒性，結果溶解并去除所述細胞。我們研究了I-LAK細胞對各種細胞的細胞毒性，所述細胞包括HIV感染的外周血單核細胞，K562，CEM，ACH.2，H9，H9/HTLV-IIIMN等，發(fā)現(xiàn)I-LAK細胞選擇性殺傷HIV感染的細胞和惡性細胞(實施例5，圖3)，但不影響正常細胞。
本發(fā)明的I-LAK細胞具有下述性質(zhì)1)LAK細胞依賴于IL-2蛋白，即可在存在IL-2蛋白的條件下存活(Grimm EA等.，J Exp Med 158(4)，1356-61(1983))。作為對比，在未加入IL-2蛋白的條件下，攜帶IL-2基因的I-LAK細胞可以保持存活。該事實首次由本發(fā)明人證實，其是基于在缺乏IL-2蛋白情況下，當單獨培養(yǎng)LAK細胞和I-LAK細胞60天時，LAK細胞和I-LAK細胞在培養(yǎng)第60天的生存力分別為0％和約90％(實施例4，圖2)。
2)分泌自I-LAK細胞的IL-2蛋白刺激HIV感染的細胞，幫助它在潛伏期脫逸，降低人體內(nèi)潛伏細胞的總數(shù)(Chun TW等.，J.Exp.Med.188(1)，83-91(1998.12))。
3)I-LAK細胞以低濃度分泌IL-2蛋白，防止病毒的瞬時活化。已經(jīng)報道當依照現(xiàn)有技術時對HIV感染的人給藥LAK細胞和高濃度IL-2蛋白時可發(fā)生病毒的這種瞬時活化(Ramratnam B.等.，Nat.Med.6(1)，82-5(2000.09))。
4)I-LAK細胞持續(xù)分泌IL-2蛋白，增強HIV感染的人的免疫力。已經(jīng)提示IL-2蛋白長期增加對CD4+T細胞的免疫而言關鍵的細胞的數(shù)目(Davey RT Jr.等.，JAMA，284(2)，92074(2000))。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了一種生產(chǎn)導入了重組載體的I-LAK細胞的方法，所述重組載體攜帶對其可操作連接的IL-2基因，所述方法包含(a)從哺乳動物收集外周血，并從外周血去除紅細胞，以獲得含淋巴細胞的白細胞級分，(b)在含IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的含淋巴細胞的白細胞級分，以產(chǎn)生LAK細胞，(c)用攜帶對其可操作連接的分泌IL-2的基因的重組載體轉(zhuǎn)染得到的LAK細胞，并在培養(yǎng)基中和在適于分化它們的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細胞，和(d)從培養(yǎng)液篩選和回收具有分泌IL-2的能力的細胞。
更具體地，從哺乳動物收集外周血并離心。添加菲可帕克，并再次離心以提供外周血單核細胞。將得到的外周血單核細胞懸浮在含IL-2蛋白的LAK活化培養(yǎng)基中，以生產(chǎn)LAK細胞。
用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，優(yōu)選重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNC/IL-2/IRES/TK轉(zhuǎn)染如此獲得的LAK細胞，以同時表達多個基因，即IL-2基因和單純皰疹病毒的胸苷激酶基因。在含G418(新霉素類似物)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細胞，以獲得G418抗性細胞，其被再次培養(yǎng)。例如ELISA檢測培養(yǎng)物上清的IL-2蛋白，以篩選具有高度分泌IL-2蛋白的能力的細胞。將篩選的細胞表示為I-LAK細胞。
本發(fā)明舉例說明質(zhì)粒LNC/IL-2/IRES/TK作為攜帶IL-2基因的重組載體。已知該重組載體可易于制備，也可非限制地獲自韓國科學和技術高等研究所(Korea Advanced Institute of Science and Technology)(韓國，大田)的Kim，Yeon-Soo博士。
重組載體LNC/IL-2/IRES/TK攜帶IL-2基因，位于CMV啟動子和胸苷激酶(TK)基因下游。TK基因使得可用具有抗病毒劑的重組載體處理轉(zhuǎn)染的細胞。TK基因的表達產(chǎn)物顯著增強細胞對鳥嘌呤的敏感性。優(yōu)選地，LTR啟動子/新霉素標記/CMV啟動子，IL-2基因，內(nèi)部核糖體進入位點基因和酪氨酸激酶基因順序可操作連接(圖1)。
如此處使用，術語“重組載體”表示能指導對其可操作連接的另一核酸分子，即IL-2基因表達的核酸分子。本發(fā)明的重組載體包括適于在宿主細胞中表達核酸的形式的IL-2基因，其表示重組載體包括一個或多個調(diào)節(jié)序列，在用于表達的宿主細胞的基礎上選擇，其操作連接到待表達的編碼IL-2的核酸序列上。一種類型的重組載體能夠在導入其的宿主細胞中自發(fā)復制。另一類型的重組載體在導入宿主細胞后被整合到宿主細胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起復制。在本發(fā)明中，哺乳動物細胞用作宿主細胞。
在本發(fā)明中可使用各種載體，其通常表示能轉(zhuǎn)運它已經(jīng)連接的另一核酸分子。適于本發(fā)明的病毒載體的實例包括SV40，牛乳頭瘤病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，單純皰疹病毒，痘病毒，慢病毒屬，腺伴隨病毒和巨細胞病毒。
在本發(fā)明中尤其優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒科家族中的任何病毒，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒科具有RNA作為它的核酸并利用酶-逆轉(zhuǎn)錄酶將它的基因組拷貝到宿主細胞染色體的DNA中。衍生自MoMLV(莫洛尼鼠類白血病毒)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在本領域中是最有用的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是有利的，是因為體外操作方便，基因的遞送是有效的，整合到宿主細胞染色體中是穩(wěn)定的，使得它可穩(wěn)定轉(zhuǎn)移到子代細胞。在本發(fā)明中舉例說明的LNCX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特征在于neor標記基因在5’LTR啟動子控制下表達，并且包括人巨細胞病毒(CMV)的立即早期啟動子作為內(nèi)部啟動子，導致外源基因的高表達。
作為此處使用，術語“調(diào)節(jié)序列”表示對于對其可操作連接的編碼基因在某些宿主細胞中表達基本的DNA序列。它意圖包括RNA聚合酶結合和引發(fā)轉(zhuǎn)錄的啟動子，任選能控制這種轉(zhuǎn)錄的操作子，編碼mRNA核糖體結合位點的序列和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。對于真核細胞調(diào)節(jié)序列的實例包括啟動子，多腺苷酸化信號，增強子等。
在重組載體內(nèi)，術語“可操作連接”意圖表示目的核苷酸序列以當適當分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白)結合到調(diào)節(jié)序列時允許核苷酸序列表達的方式結合到調(diào)節(jié)序列上。例如，在它表達為參與多肽分泌的前體蛋白的情況下，對于前序列或前導序列的DNA可操作連接到對于多肽的DNA上；在它影響轉(zhuǎn)錄的情況下，啟動子或增強子可操作連接到編碼序列上；或在它影響轉(zhuǎn)錄的情況下，核糖體結合位點可操作連接到編碼序列上；或在它被定位以便促進翻譯的情況下，核糖體結合位點可操作連接到編碼序列上。通常“可操作連接，”表示DNA序列是鄰接的，并且前導序列在讀框內(nèi)。然而，增強子不需要鄰接。這些序列的連接是通過在方便的限制位點連接而實施。然而，如果不存在這種限制位點，依照常規(guī)方法使用合成的寡核苷酸連接物或接頭。
可通過常規(guī)轉(zhuǎn)化方法例如DEAE-葡聚糖，磷酸鉀和電穿孔將重組載體導入宿主細胞。轉(zhuǎn)化宿主細胞和在轉(zhuǎn)化的宿主細胞中表達克隆的外源DNA序列的技術對于本領域的技術人員而言是熟知的(Maniatis等.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)；Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1989)；Gene Expression Technology，Method in Enzymology，Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Guthrie&Fink (編輯)，Academic Press，San Diego，Calif.(1991)；Hitzeman等.，J.Biol.Chem.，255，12073-12080(1980)；和美國專利號4,935,349)。優(yōu)選地，本發(fā)明的重組載體通過磷酸鉀沉淀轉(zhuǎn)化到宿主細胞中。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了一種用于治療癌癥或病毒感染的藥物組合物，其包含足夠量的攜帶IL-2基因的I-LAK細胞以激發(fā)免疫應答。
本發(fā)明的藥物組合物可包括藥用載體，尤其是，在本發(fā)明中可使用各種載體或稀釋劑，所述稀釋劑包括鹽水，緩沖的鹽水和鹽水與非特異血清白蛋白的混合物。藥物組合物可包含，例如添加劑，緩沖劑，抗氧化劑，糖類例如葡萄糖，蔗糖和糊精，和螯合劑如EDTA。另外，藥物組合物可包括水，鹽水，甘油，乙醇，乳化劑，潤濕劑或pH調(diào)節(jié)劑。藥物組合物還可包括增強免疫應答的佐劑。佐劑的實例包括，但不限于，氫氧化鋁(明礬)，thr-MDP，nor-MDP和MPT-PE。
可胃腸外，肌內(nèi)，皮下，真皮內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)或通過其它適于治療患者的腫瘤或感染和疾病的途徑給藥本發(fā)明的藥物組合物。由于可發(fā)生低水平的炎癥或痙攣，優(yōu)選選擇相對無損傷的方法。尤其優(yōu)選皮下途徑。
以對受試者而言足以引發(fā)免疫應答的量給藥本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物的劑量典型地為約105-1011I-LAK細胞，優(yōu)選約106-1010I-LAK細胞，更優(yōu)選約1×107-2×109I-LAK細胞。然而，依賴于需要保護的程度，受試者的年齡或體重，組合物的劑型，給藥方法等可改變劑量。
在一些特定實施的實施例的基礎上現(xiàn)在將解釋本發(fā)明，然而，所述實施例不能被認為是限制。
實施例實施例1制備LAK細胞通過靜脈穿刺從HIV陰性健康供體(HIV抗體陰性)收集外周血。向外周血中添加菲可帕克，并將得到的混合物離心以獲得外周血單核細胞。在補充以15％胎牛血清(FBS)，青霉素，鏈霉素和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)外周血單核細胞。用1,000IU/ml rIL-2(aldesleukin，Chiron BV Amsterdam，Netherland)處理得到的培養(yǎng)液以生產(chǎn)LAK細胞。
實施例2構建重組載體LNC/IL-2/IRES/TK為將IL-2基因?qū)胪ㄟ^實施例1獲得的LAK細胞，構建多個基因表達逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNC/IL-2/IRES/TK，以便同時表達IL-2基因和單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(HSV TK基因)。
如圖1所示，通過將HSV TK基因，內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)和IL-2基因順序插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNCX構建重組載體LNC/IL-2/IRES/TK。
通過PCR從pTK3(BRL，Gaithersburg，MD)合成缺失啟動子和poly(A)信號位點的HSV TK基因的片段。將合成片段的兩個末端制成磷酸化平端。將得到的平頭片段插入到已被限制性內(nèi)切酶HpaI消化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNCK中。LNCX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括neor標記基因，其在5’LTR啟動子控制下表達，和人巨細胞病毒的立即早期啟動子(CMV啟動子)作為內(nèi)部啟動子，因此，期待高度表達外源基因。通過限制酶切消化和核苷酸測序分析得到的重組載體，以篩選其中HSV TK基因在CMV啟動子控制下表達的LNC/TK克隆。從質(zhì)粒pCITE-1(Novagen，WI)切除約600bpEcoRI-NcoI片段，并亞克隆到重組載體LNC/TK，使得將包括腦心肌炎病毒(EMC)的內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)的帽一非依賴性翻譯增強子序列導入到HSV-TK基因的上游。將得到的亞克隆表示為LNC/IRES/TK。將約700bp HindIII-BamHI IL-2 DNA片段(Invivogen，美國)亞克隆到CMV啟動子和IRES序列間，以構建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNC/IL-2/IRES/TK。
實施例3制備逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的細胞系通過磷酸鈣共沉淀將質(zhì)粒LNC/IRES/TK或LNC/IL-2/IRES/TK轉(zhuǎn)染到兼嗜性包裝細胞系PA317(ATCC，USA)以生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的細胞系，所述細胞系產(chǎn)生編碼HSV TK基因和/或IL-2基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒。48小時后，將培養(yǎng)基換為包含600μg/ml G418的新鮮培養(yǎng)基，將其培養(yǎng)10-14天以形成G418-抗性克隆。分離得到的克隆并通過大量培養(yǎng)富集。順序單獨稀釋PA317/LNC/IRES/TK細胞和PA317/LNC/IL-2/IRES/TK細胞的培養(yǎng)物。在具有60mm直徑的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)5×105NIH/3T3細胞24小時。將1ml培養(yǎng)物接種到上述獲得的每個稀釋物，其被感染4小時。添加4ml新鮮的培養(yǎng)液，并將它培養(yǎng)48小時。用胰蛋白酶處理培養(yǎng)的細胞，并接種在具有100mm直徑的培養(yǎng)皿上，其在含400μg/ml G418的培養(yǎng)液中培養(yǎng)10-14天。上述實驗重復3次。從3次實驗的結果確定病毒效價并選擇具有最高病毒效價的細胞系。
實施例4制備I-LAK細胞在生產(chǎn)LAK細胞后培養(yǎng)第10天，用具有CMV啟動子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNCX/IL-2/IRES/TK轉(zhuǎn)化LAK細胞。將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體添加到LAK細胞中。48小時后，洗滌細胞，并在含G418(新霉素類似物)的RPMI-1640上培養(yǎng)，使得攜帶neor基因的細胞可以生長。獲得G418抗性細胞并培養(yǎng)。通過ELISA測量培養(yǎng)上清，以檢測細胞分泌IL-2的能力。通過RT-PCR在包含IL-2基因的基礎上證實I-LAK細胞。
實施例5確定LAK細胞和I-LAK細胞的生存力在無細胞刺激物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)LAK細胞和I-LAK細胞60天。通過錐蟲藍排除測量細胞的生存力。作為實驗結果，LAK細胞在培養(yǎng)第10天的生存力為98％，培養(yǎng)第20天為63％，培養(yǎng)第30天為40％，培養(yǎng)第40天為3％，培養(yǎng)第50天為2％，培養(yǎng)第60天為0％。作為對比，I-LAK細胞在培養(yǎng)第10天生存力為97％，培養(yǎng)第20天為97％，培養(yǎng)第30天為95％，培養(yǎng)第40天為95％，培養(yǎng)第50天為90％，培養(yǎng)第60天為90％(圖2)。
實施例6確定LAK細胞和I-LAK細胞對各種靶細胞的細胞毒性通過51鉻釋放試驗確定LAK細胞和I-LAK細胞對各種靶細胞的細胞毒性。
將正常外周血單核細胞，HTLV-IIIMN-感染的外周血單核細胞，K562，CEM，ACH.2，H9和H9/HTLV-IIIMN用作靶細胞。在LAK細胞毒性試驗中，將K562，LAK細胞的靶細胞系用作陽性對照。將CEM細胞系用于比較CD4+人細胞系ACH.2的LAK細胞活性水平。ACH.2是HIV-1-潛伏感染的T細胞亞克隆A3.01，其衍生自HIVLAV-CEM。上述人T細胞系分離自患有急性成淋巴細胞淋巴瘤的4歲caucasin女性患者。H9和H9/HTLV-IIIMN是衍生自特定HUT 78細胞系的單核克隆。ACH.2，H9和H9/HTLV-IIIMN獲自NIH AIDS研究和Reference Regent Program。將所有上述細胞在補充以1％FBS，青霉素，鏈霉素和L-谷氨酰胺的RPMI-1640中培養(yǎng)。
在37℃水浴中，將上述靶細胞(3×106)培養(yǎng)在0.5ml含150μl的51Cr的培養(yǎng)基中。將51Cr標記的細胞用新鮮培養(yǎng)基洗滌4次，并以104細胞/孔將50μl細胞在96孔培養(yǎng)板上劃線。以20∶1，1∶1和1∶20的比率向培養(yǎng)板中添加LAK細胞和I-LAK細胞。于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)效應物和靶細胞8小時。從每孔中取50μl上清，并在同位素計數(shù)器中計數(shù)。將這些實驗重復3次，并通過下式計算溶胞的百分比 通過培養(yǎng)50μl 0.5％trypton X-100和50μl靶細胞確定最大釋放。通過培養(yǎng)50μl細胞培養(yǎng)液和50μl靶細胞確定自發(fā)釋放。自發(fā)釋放通常不超過最大釋放的20％(Antonelli P等.，Clin.Immunol.Immunopath.19，161-169(1981))。通過利用student’s T-檢驗比較LAK細胞和I-LAK細胞之間的各種參數(shù)。當p為0.05或0.05以下時，認為是有統(tǒng)計學意義的。
結果揭示LAK和I-LAK細胞對所有腫瘤細胞，K562，CEM，ACH.2，H9和H9/HTLV-IIIMN具有有效的細胞毒性。這考慮為在破壞惡性細胞和病毒感染的細胞過程中涉及LAK細胞。所有的惡性細胞和HIV感染的細胞被選擇性殺傷和去除，而正常細胞未被損傷。盡管未發(fā)現(xiàn)相對的統(tǒng)計差異，ACH.2細胞和H9/HTLV-IIIMN的特定溶胞作用分別高于CEM細胞和H9細胞。同時，對HIV感染的細胞的LAK和I-LAK細胞的選擇性細胞毒性之間無顯著差異(圖3)。
實施例7比較LAK細胞或I-LAK細胞與HIV感染的細胞的共培養(yǎng)過程中HIV生產(chǎn)為制備HIV感染的外周血單核細胞，生產(chǎn)HIV病毒原液，然后用HIV病毒原液感染外周血細胞。在當它們產(chǎn)生最高病毒效價時培養(yǎng)感染的H9細胞。從得到的培養(yǎng)液中回收上清，以提供HIV病毒(HTLV-IIIMN)原液。在用HIV病毒原液感染細胞后7天通過確定TCID50終點測定HIV病毒原液的效價。通過在37℃用1.0的moi(感染復數(shù))培養(yǎng)12小時誘導外周血細胞的HIV感染。通過培養(yǎng)未感染的H9細胞培養(yǎng)物的上清獲得對照細胞。離心感染的外周血細胞，洗滌，并懸浮在新鮮培養(yǎng)基中。以3天的間隔用新鮮培養(yǎng)基替代一半培養(yǎng)上清。通過錐蟲藍排除測定細胞的生存力。
將LAK細胞或I-LAK細胞與上述獲得的HIV感染的外周單核細胞共培養(yǎng)，并使用HIV-1 p24抗原捕獲EIA試劑盒(Organon Teknika，Boxtel，Netherlands)在3天的間隔定量細胞培養(yǎng)液中病毒的量。制備每個實驗的標準曲線，并在樣本稀釋數(shù)，標準曲線和OD值的基礎上計算p24的量。從分離自H9/HTLV-IIIMN細胞系(MN)的培養(yǎng)上清的HIV p24抗原的量可以看出，大多數(shù)病毒的復制發(fā)生在培養(yǎng)的第6天。在H9/HTLV-IIIMN細胞系與LAK細胞共培養(yǎng)的情況下，直至培養(yǎng)的第15天，p24抗原的值下降，并在培養(yǎng)的第18天升高。認為p24抗原值的升高(病毒復制的恢復)是由于在從第二周至第三周的時間IL-2刺激物被耗盡，LAK細胞的生存力降低。對于共培養(yǎng)H9/HTLV-IIIMN細胞系和I-LAK細胞，直至約第21天，p24抗原的值穩(wěn)定下降。用H9/HTLV-IIIMN細胞系感染的外周血細胞的共培養(yǎng)導致直至培養(yǎng)的第6天病毒復制的增加。HIV感染的外周血細胞(PBLinf)與LAK細胞或I-LAK細胞的共培養(yǎng)導致在培養(yǎng)的第9-12天間p24抗原值的顯著降低。體外結果顯示LAK細胞殺傷HIV感染的細胞的能力幾乎等同于I-LAK細胞(圖4)。
工業(yè)實用性由于通過篩選低濃度的IL-2蛋白本發(fā)明的I-LAK細胞顯示選擇性殺傷癌細胞或病毒感染的細胞而不影響正常細胞的活性，它在治療癌癥和病毒感染過程中是有用的。
從先前的詳細描述，很明顯，在未脫離本發(fā)明的精神或范圍的條件下，本領域的技術人員可進行修改。與之關聯(lián)，應當理解前述實施例是為了舉例說明的目的，而不是為了限制本發(fā)明。因此，意圖希望未脫離本發(fā)明的精神的所有修改和改變在權利要求和它們的等同體的范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種用于治療癌癥或病毒感染的轉(zhuǎn)化的淋巴因子活化的殺傷細胞(I-LAK細胞)，其中導入了攜帶對其可操作連接的IL-2基因的重組載體。
2.權利要求1的I-LAK細胞，其中所述重組載體包含逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
3.權利要求2的I-LAK細胞，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是載體LNC/IL-2/IRES/TK。
4.一種生產(chǎn)用于治療癌癥或病毒感染的轉(zhuǎn)化的淋巴因子活化的殺傷細胞(I-LAK細胞)的方法，所述細胞中導入了攜帶對其可操作連接的IL-2基因的重組載體，所述方法包含(a)從哺乳動物收集外周血并從外周血去除紅細胞以獲得包含淋巴細胞的白細胞級分，(b)在含IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的含淋巴細胞的白細胞級分，以產(chǎn)生LAK細胞，(c)用攜帶對其可操作連接的IL-2基因的重組載體轉(zhuǎn)染所述得到的LAK細胞，并在培養(yǎng)基中和在適于分化它們的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的細胞，和(d)從培養(yǎng)基中篩選和回收具有分泌IL-2的能力的細胞。
5.一種用于治療癌癥或病毒感染疾病的藥物組合物，其包含足以激發(fā)免疫應答的量的權利要求1的I-LAK細胞。
6.權利要求5的藥物組合物，其中所述癌癥包含惡性黑色素瘤，肺癌，腎癌，結腸癌和直腸癌。
7.權利要求5的藥物組合物，其中所述病毒包含HIV病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療癌癥或病毒感染的轉(zhuǎn)化的淋巴因子活化的殺傷細胞(I－LAK細胞)，所述細胞中導入了攜帶對其可操作連接的IL－2基因的重組載體。還涉及一種用于治療癌癥或病毒感染疾病的藥物組合物，其包含足以激發(fā)免疫應答的量的I－LAK細胞。
文檔編號C12N5/22GK1628167SQ02823304
公開日2005年6月15日 申請日期2002年11月22日 優(yōu)先權日2001年11月22日
發(fā)明者柳來春, 張京喜, 金演秀, 金俊明 申請人:醫(yī)學基因公司