專利名稱：生物活性粒細胞集落刺激因子的純化和/或分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過使用固定化金屬色譜親合法(IMAC)純化和/或分離生物活性的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的新方法。
G-CSF屬于調(diào)節(jié)造血母體細胞的分化和增生以及嗜中性白細胞的活化的集落刺激因子族。G-CSF被用于血液學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域的藥物中。在臨床上可以獲得兩種類型的G-CSF通過使用在哺乳動物細胞中的表達而被制造的糖基化形式(來格司亭)和通過使用在細菌——大腸桿菌(E.coli)中的表達而被制造的非糖基化形式(非格司亭)。
背景技術(shù)：
在EP 237545中對非糖基化形式的G-CSF(非格司亭)及其制備進行了描述，在EP 169566中對糖基化形式的G-CSF(來格司亭)及其制備進行了描述。
從該專利和科學(xué)文獻中可以得知的G-CSF純化和/或分離法包括離子色譜法、色譜聚焦、疏水作用色譜法、凝膠過濾法以及一些其它方法的不同組合。
一般而言，G-CSF純化和/或分離法的第一步取決于G-CSF異種表達的主體生物。在其在大腸桿菌中進行表達的情況中，在不溶性包涵體中發(fā)現(xiàn)了G-CSF。因此，常規(guī)的方法包括從導(dǎo)致恰當(dāng)折疊的生物活性形式的包涵體將G-CSF分離的另外的步驟。這些步驟通常包括用去污劑或離液物質(zhì)進行洗滌、用強變性劑(例如鹽酸胍(GndHCl)、脲)或者用高濃度的去污劑(例如N-月桂?；?肌氨酸(十二烷基肌氨酸鈉)或十二烷基硫酸鈉(SDS))溶解、用凝膠過濾法、反相HPLC(RP-HPLC)對被溶解的變性蛋白進行部分純化和通過使用稀變性劑或通過使用滲析來進行復(fù)性。在G-CSF在酵母菌或哺乳動物細胞中表達的情況中，很少發(fā)現(xiàn)包涵體或類似結(jié)構(gòu)，并且在這些情況中在G-CSF分泌后直接開始純化和/或分離過程。在下面的專利申請和專利中對用于對G-CSF進行分離和純化的方法進行了描述EP 169566、EP 237545、EP 215126、EP 243153、US 5055555和WO 0104154。還在科學(xué)文獻中對G-CSF的純化和/或分離方法進行了描述Lu，H.S.等人，Protein Expr Purif 4，465-472(1993)；Kang，S.H.等人，Biotechnol.Lett.17，687-692(1995)；Wingfield，P等人，Biochem J 256，213-218(1988)；Kang，S.H.等人v Biotechnol.Lett.17，687-692(1995)；Yamasaki，M.等人，Biosci Biotechnol Biochem 62，1528-1534(1998)；Wingfield，P.等人，Biochem J 256，213-218(1988)；Bae，C.S.等人，Biotechnol.Bioeng.57，600-609(1998)。
在一些其它蛋白的情況中，還已經(jīng)用IMAC來進行部分純化和復(fù)性。Porath等人在Nature 258，598-599(1975)中第一次對IMAC進行了描述并且其是以蛋白與被螯合于各種IMAC支撐物的固定化金屬離子的結(jié)合為基礎(chǔ)的。該蛋白氨基酸序列中的電子供體負責(zé)與該支撐物協(xié)調(diào)結(jié)合，尤其是組氨酸殘基中的咪唑環(huán)。Hochuli，E.等人在Bio/Technology1321-1325(1988)中，Chaga，G.等人在Biotechnol Appl Biochem 29(第1部分)，19-24(1999)中和Jeong，J.K.和Lee S.Y.在Protein Expr.Purif，23311-318(2001)中對通過使用IMAC來進行在蛋白的N-或C-末端上具有工程組氨酸親合附屬物的重組蛋白的分離進行了描述。Sulkowski在Trends Biotechnol 3，1-7(1985)中和Hemdan等人在ProcNatl Acad Sci USA 86，1811-1815(1989)中對用IMAC對蛋白分子中微小的局部差異進行研究的應(yīng)用進行了描述。
在US 5932102中對用IMAC對包含組氨酸殘基的一些其它蛋白進行純化的方法進行了描述。
在WO 9012803中對具有能與金屬離子結(jié)合的表面氨基酸的蛋白的純化方法進行了描述。在這種方法中，在用幾種其它的色譜法進行部分蛋白純化后，用IMAC作為另外的步驟。描述了在自然條件下使用IMAC不能將未變性的或生物學(xué)活性的G-CSF分子與變性或無生物學(xué)活性的G-CSF分離或隔離開。
對通過與特異性的染料-金屬離子復(fù)合體的親合分配而進行相互作用的G-CSF——其Ser-17和(His)6-標(biāo)記形式——的比較研究進行了描述(Zaveckas，M.等人，J Chromatogr A 904，145-169(2000)。以對菠蘿蛋白酶和純G-CSF在無金屬和帶有Hg(II)的IDA(亞氨酸二醋酸鹽)柱上的色譜行為的評估為基礎(chǔ)，Gelunaite，L.等人在J Chromatogr A904，131-143(2000)中試圖對荷-Hg(II)的IMAC(瓊脂糖IDA)在變性條件下從去污劑-溶解的包涵體中提取G-CSF的能力進行評估。
還用帶有固定化Zn(II)或Ni(II)離子的IMAC作為GndHCl變性的白介素-3、G-CSF和粒細胞巨噬細胞集落因子(GM-CSF)復(fù)性的方法(Rozenaite，V.等人，Poster abstract，P-104.，Cordoba，Spain，19-22.April(1998))。變性的蛋白在變性的條件下被結(jié)合于IMAC支撐物上。
本發(fā)明的概述本發(fā)明的目的是改善G-CSF的純化和/或分離，并提供高純度的和活性形式的生物學(xué)活性G-CSF、以及包含其的藥物組合物。
本發(fā)明提供了如權(quán)利要求1所述的生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離方法。本發(fā)明還提供了一種如權(quán)利要求27所述的生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離方法、如權(quán)利要求31所述的生物學(xué)活性的G-CSF、如權(quán)利要求33所述的藥物組合物以及如權(quán)利要求35所述的生物學(xué)活性G-CSF的應(yīng)用。在從屬權(quán)利要求中對優(yōu)選的實施方案進行了陳述。
根據(jù)本發(fā)明令人吃驚地發(fā)現(xiàn)用IMAC在天然條件下可以將恰當(dāng)折疊和生物學(xué)活性的G-CSF分子與不恰當(dāng)折疊或無生物學(xué)活性的G-CSF分子分離開。本發(fā)明生物學(xué)活性G-CSF的純化和/或分離方法包括通過在自然條件下使用IMAC而將恰當(dāng)折疊和生物學(xué)活性的G-CSF分子與不恰當(dāng)折疊或無生物學(xué)活性的G-CSF分子分離開并還將其與大多數(shù)宿主蛋白分開。通過這種方法，恰當(dāng)折疊和生物學(xué)活性的G-CSF分子與IMAC支撐物特異結(jié)合，而不恰當(dāng)折疊的無生物學(xué)活性的G-CSF形式和大多數(shù)雜質(zhì)仍然留在洗脫液中。本發(fā)明純化和/或分離的方法還包括將生物學(xué)活性的單體G-CSF與基本留在洗脫液中的低聚的、聚合的和無生物學(xué)活性的單體G-CSF分開。生物學(xué)活性的G-CSF的單體形式特定地與IMAC支撐物結(jié)合，而低聚、多聚和無生物學(xué)活性的G-CSF的單體形式基本留在洗脫液中。
本發(fā)明的方法代表了恰當(dāng)折疊的生物學(xué)活性的單體形式或G-CSF分子純化和濃縮的有效步驟，并且可以用其作為整個G-CSF純化和/或分離方法中的關(guān)鍵步驟。
本發(fā)明純化和/或分離的方法可用于其中在表達后G-CSF通過分泌途徑直接分泌到介質(zhì)中的情況，或其中G-CSF在細胞質(zhì)、周質(zhì)或任何其它細胞細胞器中以包涵體的形式被形成的情況。其還可用于生物學(xué)活性的G-CSF直接從被溶解的包涵體純化和/或分離以及其中之前已經(jīng)對G-CSF變性然后使其復(fù)性的所有情況。本發(fā)明生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離方法可以在整個過程中都被維持在天然條件下。
本發(fā)明生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離方法使得可以制備純度高于95％的生物學(xué)活性的G-CSF。僅僅可以進一步用兩個另外的色譜步驟——陽離子交換色譜法和凝膠過濾(它們用在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中)來除去剩余雜質(zhì)中的痕量物質(zhì)(精煉)。
因此，本發(fā)明的整個方法使得可以制備純度高于99％的生物學(xué)活性的G-CSF。該方法適用于制備大量生物學(xué)活性的G-CSF并適用于生物學(xué)活性的G-CSF的工業(yè)生產(chǎn)。
在科學(xué)或?qū)＠墨I中都沒有發(fā)現(xiàn)在天然條件下用IMAC將生物學(xué)活性的恰當(dāng)折疊的單體的G-CSF分子與寡聚的、聚合的或無生物學(xué)活性的單體形式或不恰當(dāng)折疊的G-CSF分子分離開的說明。
在現(xiàn)有技術(shù)中也沒有通過恰當(dāng)折疊的生物學(xué)活性的單體G-CSF(即在溶液或混合物中早已發(fā)現(xiàn)的這些分子)在自然條件下與IMAC支撐物相結(jié)合而將生物學(xué)活性的G-CSF從包含生物學(xué)活性的G-CSF分子和雜質(zhì)的粗溶液或混合物分離開的描述。此外，也一直沒有通過使用IMAC而將G-CSF分子根據(jù)其構(gòu)象進行分離的描述。
在現(xiàn)有技術(shù)中找到的用于G-CSF的純化和/或分離的所有方法都包括幾個步驟。在現(xiàn)有技術(shù)中一直沒有描述對于根據(jù)其生物學(xué)活性和恰當(dāng)?shù)恼郫B而進行的G-CSF的分離以及對于其與存在于溶液或混合物中的雜質(zhì)的分離以及作為G-CSF濃縮和純度高于95％的生物學(xué)活性的G-CSF的制備的有效方法而言可以僅使用一個色譜步驟，從而僅必需進行另外的精煉。
本發(fā)明及其優(yōu)選實施方案的詳細說明本發(fā)明涉及IMAC在生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離方法中作為有效的色譜法的應(yīng)用。該恰當(dāng)折疊的生物學(xué)活性的G-CSF單體形式或分子在自然條件下選擇性地結(jié)合于一種IMAC支撐物，而不恰當(dāng)折疊的或聚集的G-CSF分子以及大多數(shù)其它雜質(zhì)，特別是在由例如大腸桿菌表達后得自包涵體的被溶解的蛋白基本不與這些支撐物相結(jié)合，并且被不保留地洗脫下來。其應(yīng)該是由于天然組氨酸殘基的特異性分布而產(chǎn)生了這種特性。
這里所用的術(shù)語‘天然條件’指的是分子(G-CSF蛋白)保留自然構(gòu)象和生物學(xué)活性的條件。
術(shù)語‘變性條件’指的是不保留G-CSF的天然構(gòu)象、改變和不保留生物學(xué)活性的條件。
這里所用的術(shù)語‘聚集的分子’指的是通過疏水性或還有一些其它相互作用(例如二硫化物鍵)而被聚集在一起形成分子簇的分子。這些分子是沒有生物學(xué)活性的。
這里所用的術(shù)語‘洗脫’指的是將被吸附的物質(zhì)從色譜柱洗滌或提取下來。
這里所用的術(shù)語‘洗脫液’指的是通過對色譜柱進行洗滌和提取而獲得的溶液。
這里所用的術(shù)語‘包涵體’指的是不溶性的不恰當(dāng)折疊或部分恰當(dāng)折疊的蛋白的致密的聚集體。
這里所用的術(shù)語‘包涵體溶液’指的是包含包涵體的溶液。
這里所用的術(shù)語‘生物學(xué)活性的G-CSF’指的是能促進造血母細胞的分化和增生以及造血系統(tǒng)成熟細胞的活化的G-CSF形式或分子。
這里所用的術(shù)語‘G-CSF的生物學(xué)活性形式(或分子)’指的是為單體和未變性狀態(tài)并且能提供上述生物學(xué)活性的G-CSF形式或分子。
這里所用的術(shù)語‘雜質(zhì)’指的是與該G-CSF的生物活性分子不同從而使得該G-CSF的生物活性分子不純的物質(zhì)。所說的雜質(zhì)可包括至少一種得自G-CSF的無生物學(xué)活性的單體形式和不恰當(dāng)折疊的分子、G-CSF的寡聚和聚合形式、G-CSF的變性形式和宿主細胞蛋白的物質(zhì)組成的組。所說的雜質(zhì)還可進一步包括宿主細胞物質(zhì)如DNAs、(脂)多糖等等、以及在G-CSF的制造和處理中所使用的添加劑。
這里所指出的純度指的是HPLC純度。
本發(fā)明用于生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離的方法特別是被定義為包含下面的步驟a)將包含G-CSF的生物學(xué)活性形式和雜質(zhì)的溶液或混合物裝填到IMAC支撐物上；b)G-CSF的生物學(xué)活性形式與該IMAC支撐物選擇性結(jié)合，對該IMAC柱進行洗滌或不進行洗滌；和c)將該G-CSF的生物學(xué)活性形式從該柱上洗脫下來本發(fā)明的方法可以有利地在自然條件下進行。
本發(fā)明生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離還可另外包括生物學(xué)活性的G-CSF的進一步純化并且優(yōu)選地包含在用IMAC對該生物活性的G-CSF進行純化和/或分離后進行的下面的步驟d)陽離子交換色譜法和/或e)凝膠過濾。
本發(fā)明的全部方法使得可以制備適于醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用的生物學(xué)活性的G-CSF。
通過應(yīng)用其中在自然條件下將包含G-CSF的不純的混合物用僅由IMAC和任選的至少一種選自離子交換和凝膠過濾技術(shù)的方法所組成的色譜步驟進行處理而進行純化和/或分離處理的方式已經(jīng)以有效且優(yōu)選的方式獲得了適用于醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用的生物學(xué)活性的G-CSF。本發(fā)明的方法還可以用于對G-CSF衍生物如甲二磺?；鵊-CSF(Met-G-CSF)、糖基化、酶或化學(xué)改性的(例如pegylated)G-CSF、G-CSF類似物和包含G-CSF的融合蛋白進行純化和/或分離的情況。
本發(fā)明的純化和/或分離方法的顯著優(yōu)點包括1.根據(jù)其構(gòu)象狀態(tài)并從而根據(jù)其生物學(xué)活性將G-CSF的分子分離開。
2.該方法使得G-CSF的生物學(xué)活性的分子可以在自然條件下結(jié)合到IMAC支撐物上并使得可以在自然條件下連續(xù)地進行G-CSF的生物學(xué)活性的分子與G-CSF的無生物學(xué)活性的分子的分離，3.該方法使得恰當(dāng)折疊的G-CSF分子可以在自然條件下結(jié)合到IMAC支撐物上并使得可以在自然條件下連續(xù)地進行恰當(dāng)折疊的G-CSF分子與不恰當(dāng)折疊的G-CSF分子的分離，4.該方法使得生物學(xué)活性的G-CSF的單體形式可以在自然條件下結(jié)合到IMAC支撐物上并使得可以在連續(xù)地完成生物學(xué)活性的G-CSF的單體形式與無生物學(xué)活性的G-CSF的單體形式的分離，5.該方法使得G-CSF的單體形式可以結(jié)合到IMAC支撐物上并使得可以在自然條件下連續(xù)地進行G-CSF的單體形式與G-CSF的寡-和多-聚形式的G-CSF的分離，6.該方法使得可以在自然條件下進行恰當(dāng)折疊的生物學(xué)活性的單體G-CSF分子與存在于溶液、混合物或介質(zhì)中的其它蛋白和雜質(zhì)的分離，7.對于本發(fā)明的方法而言，其可顯著增加被純化的G-CSF的特異活性，例如將其活性增加至至少1×107IU/mg的特異活性范圍，更優(yōu)選地將其增加至7-8×107IU/mg的特異活性范圍，最優(yōu)選地將其增至約1×108IU/mg的特異活性范圍，其中所說的特異活性是通過如實施例5所述的以細胞增生的刺激為基礎(chǔ)的方法來進行測量的。
8.對于本發(fā)明的方法而言，其可以以高收率來制備具有至少95％的純度G-CSF，或者，當(dāng)進一步包括用根據(jù)優(yōu)選實施方案的陽離子交換色譜法和凝膠過濾法進行的純化時，其純度為至少99％，因此，該方法適用于生物學(xué)活性的G-CSF的工業(yè)生產(chǎn)，9.包含用陽離子交換色譜法和凝膠過濾法進行的進一步的純化的對生物活性的G-CSF進行純化和/或分離的優(yōu)選實施方案的整個過程不需要任何另外的G-CSF純化步驟并且可以有利地被一直維持在自然條件下。
本發(fā)明生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離的全過程最優(yōu)選地被維持在自然條件下。
本發(fā)明的方法并不是不恰當(dāng)折疊的G-CSF分子的復(fù)性方法，而是一種包含已經(jīng)存在于包含未被純化的G-CSF的溶液、混合物或介質(zhì)中的未變性的或恰當(dāng)折疊的生物學(xué)活性的G-CSF單體分子與IMAC支撐物特異結(jié)合的方法。
G-CSF的單體形式與寡-和多聚形式的分離以一種使得生物學(xué)活性的單體G-CSF結(jié)合到IMAC支撐物上，而寡-和多聚形式基本留在洗脫液中的方式發(fā)生，其中所述的寡-和多聚形式也可以以聚集形式存在。
可以用凝膠過濾法代替IMAC來進行單體形式的G-CSF與寡-和多聚形式的G-CSF的分離。IMAC比凝膠過濾法優(yōu)越之處在于其濃縮能力、較高的結(jié)合能力和將恰當(dāng)折疊的單體形式的G-CSF與不恰當(dāng)折疊的單體形式的G-CSF分離的能力。凝膠過濾不能將恰當(dāng)折疊的單體形式的G-CSF與不恰當(dāng)折疊的單體形式的G-CSF分開。因此，通過使用IMAC可以獲得更好的收率。
本發(fā)明生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離另一個優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中其它已知方法的優(yōu)點是使得可以進行(整個過程被維持在自然條件下的)恰當(dāng)折疊的G-CSF分子與不同蛋白的混合物的分離以及與以不同構(gòu)象狀態(tài)存在的G-CSF分子混合物的分離。因此，可以在自然條件下將G-CSF直接從(優(yōu)選地被稀釋的)培養(yǎng)介質(zhì)或特別是從包涵體中分離出來。
本發(fā)明的方法優(yōu)于常規(guī)方法的另外的優(yōu)點還有可降低去污劑的使用或可以不使用去污劑、可以在沒有有毒或者對環(huán)境不利的變性劑(例如GndHCl或脲)的情況下進行、以及可以降低或省略緩沖劑和其它溶液的使用。
本發(fā)明生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離方法優(yōu)于使用強變性劑的方法的優(yōu)點在于不需要使用活性還原劑如二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇。
在G-CSF直接分泌到介質(zhì)的情況中，本發(fā)明生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離的方法使得可以從被稀釋的基質(zhì)中有效和直接濃縮生物學(xué)活性的G-CSF。在得自IMAC柱的洗脫液中獲得了高純度的生物學(xué)活性的G-CSF。
因為通過將生物學(xué)活性的G-CSF分子從包涵體中分離出來和/或通過將生物學(xué)活性的G-CSF分子直接從包含其的溶液或混合物中分離出來可以獲得生物學(xué)活性的G-CSF分子與無生物學(xué)活性的G-CSF分子和其它雜質(zhì)的有效分離，所以當(dāng)與其它方法相比時，G-CSF的純化和/或分離的經(jīng)濟性得到了更大的改善。
因此，通過僅使用一個純化步驟而可以獲得95％以上的G-CSF純度。
下面的色譜步驟特別適用于從IMAC洗脫下來后生物學(xué)活性的G-CSF的最后純化(精煉)。
.陽離子交換色譜法和/或.凝膠過濾法陽離子交換色譜法對于除去得自宿主細胞的痕量的核酸、脂多糖和蛋白、以及除去G-CSF的離子異構(gòu)體和被改變的(被損害的)具有改變的pI值的G-CSF形式而言尤其有效。凝膠過濾色譜法對于除去痕量的二聚物和G-CSF的高聚集形式而言尤其有效。
僅使用另外兩個最后的純化步驟產(chǎn)生純度高于99％的生物學(xué)活性的G-CSF。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案還包括陽離子交換色譜法和凝膠過濾法的本發(fā)明生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離的整個過程的優(yōu)點有除適宜的預(yù)處理步驟如溶解和可進行或不進行的隨后通過滲析、離子交換、超濾、滲濾或稀釋等等來除去增溶劑外，該方法可以高效地僅包含上面所指定的三種色譜步驟；在這三種色譜步驟兩者之間優(yōu)選地沒有中間步驟(如濃縮、滲析、沉淀等等)，并且該純化和/或分離過程一直優(yōu)選地被維持在自然條件下。
中間的濃縮步驟將不利地造成二聚物和其它聚集體形式的形成，從而降低了收率?？梢詫⒓兓?或分離的整個方法轉(zhuǎn)化成工業(yè)規(guī)模和用來制造純度為至少99％的生物學(xué)活性的G-CSF。
通過本發(fā)明整個純化和/或分離過程而獲得的生物學(xué)活性的G-CSF適于制備包含治療有效量的生物學(xué)活性的G-CSF并適于臨床應(yīng)用的藥物組合物。
在短期的純化和分離過程中可以維持G-CSF的活性形式不僅有助于改善收率，而且還有助于改善該生物學(xué)活性的G-CSF以及包含其的藥物組合物的純度和效力。
這里所用的術(shù)語‘治療有效量’指的是具有生物學(xué)活性的G-CSF的治療作用的生物學(xué)活性的G-CSF的數(shù)量。
適宜的可藥用的輔助物質(zhì)包括在G-CSF治療中有用的適宜的稀釋劑、助劑和/或載體。
通過本發(fā)明的方法獲得的，特別是當(dāng)進行另外的陽離子交換色譜法和凝膠過濾色譜法時所獲得的生物學(xué)活性的G-CSF可用于制備表明適用于下面的適應(yīng)癥的藥物嗜中性白細胞減少癥和與嗜中性白細胞減少癥相關(guān)的臨床后遺癥、化療后發(fā)熱性嗜中性白細胞減少癥的住院的減少、作為供體白細胞輸入的供替代選擇的造血母細胞的調(diào)動、慢性嗜中性白細胞減少癥、中性白細胞減少癥和非中性白細胞減少癥性感染、移植受體、慢性炎性情況、膿毒癥和膿毒性休克、中性白細胞減少癥和非-中性白細胞減少癥的感染的風(fēng)險(rist)、發(fā)病率、死亡率、住院天數(shù)的減少、中性白細胞減少癥和非中性白細胞減少癥患者的感染和與感染相關(guān)的并發(fā)癥的預(yù)防、非醫(yī)院源性感染的預(yù)防和降低非醫(yī)院源性感染的死亡率和感染頻率、新生兒的腸內(nèi)給藥、增強新生兒的免疫系統(tǒng)、改善重癥監(jiān)護病房患者和病?；颊叩呐R床結(jié)果、傷口/皮膚漬瘍/燒傷愈合和治療、化療和/或放療的強化、各類血細胞減少、抗炎性citokines的增加、通過預(yù)防性使用非格司停而縮短高劑量化療的間隔、光動力學(xué)療法抗腫瘤作用的增強、由不同腦機能異常所造成的疾病的預(yù)防和治療、栓塞性疾病及其并發(fā)癥的治療和輻射后紅細胞生成的恢復(fù)。
其還可以用于治療需要G-CSF的所有其它疾病。
因此可以將包含用本發(fā)明的方法所獲得的純的生物學(xué)活性的G-CSF的藥物組合物以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方式以可有效治療上述疾病的治療量給藥于患者。
將在下面對用于進行本發(fā)明方法的IMAC的優(yōu)選實施方案進行描述。
該方法通過將樣品進行填充和將至少G-CSF蛋白的生物學(xué)活性形式結(jié)合到IMAC支撐物上而開始。
所說的IMAC支撐物包括一種固相材料和結(jié)合于該固相材料的金屬離子螯合物?？梢赃m宜地使用常規(guī)的固相材料，如瓊脂糖、Fractogel和其它凝膠支撐物質(zhì)。結(jié)合于該IMAC支撐物的金屬離子螯合物適宜地選自優(yōu)選地具有兩個化合價的金屬離子，尤其是過渡金屬離子。由于其毒性和從該IMAC柱被萃取出來的傾向，較不適于采用Hg。結(jié)合于該IMAC支撐物的金屬離子螯合物的優(yōu)選實例包括M(II)-亞氨酸二醋酸鹽(IDA)、M(II)-氨三乙酸(NTA)、M(II)-羧甲基天冬氨酸鹽等等，其中M代表Zn、Cu、Co、Ni等等。特別有效的是Zn(II)-IDA、Ni(II)-IDA和Ni(I1)-NTA。
在被裝填到IMAC柱上以前，該包涵體優(yōu)選地是以溶液的形式被提供的，或者在分批或膨脹床分離模式中，在存在低去污劑或增溶劑濃縮物的情況下優(yōu)選地是以混懸液的形式被提供的。因此，當(dāng)去污劑留在溶液或混懸液中或當(dāng)用離子交換、滲析、沉淀等等除去去污劑時該G-CSF可以被保持在自然條件下。優(yōu)選地在將該溶液或混合物裝填到IMAC柱上之前除去去污劑或增溶劑。
如果被裝填的樣品之前已經(jīng)被復(fù)性，例如通過稀釋、滲析、超濾或除去變性劑/去污劑來被復(fù)性，則還可以用存在強變性劑如8M脲或6MGndHCl的包涵體溶液或混懸液(或混合物)和存在變性濃度的去污劑(例如1％十二烷基肌氨酸鈉、2％十二烷基肌氨酸鈉或1％十二烷基硫酸鈉)的溶液作為起始樣品。
在分泌系統(tǒng)如酵母菌、真菌或哺乳動物細胞系中進行表達的情況中，可以將pH為6.5至9.0范圍的預(yù)先進行了處理的混合物的上清液或進行了濃縮的上清液或培養(yǎng)介質(zhì)裝填到該IMAC支撐物上。
還可以用得自由IMAC柱進行的第一次洗脫的洗脫液作為用于IMAC的裝填溶液或混合物。應(yīng)通過例如加入NaOH溶液或高pH的緩沖溶液將該洗脫液的pH調(diào)節(jié)至6.5至9.0。然后可以將洗脫液重新裝填到相同的IMAC支撐物如例如Zn(II)-IDA、Ni(II)-IDA、Ni(II)-NTA上或不同的IMAC支撐物上。還可以與其它固定化金屬離子相組合(例如Zn(1I)、Cu(II)、Co(II)、Ni(II)等等)，使之能更好的分離和除去特定的宿主蛋白。
不考慮裝填溶液的制備和起源，裝填溶液的pH應(yīng)當(dāng)為6.5至9.0。裝填溶液的pH優(yōu)選地為7.0至8.5，最優(yōu)選地為7.8至8.2。
可以將可將pH維持在6.5至9.0的各種緩沖劑用于裝填和G-CSF與IMAC支撐物的結(jié)合。適宜緩沖劑有可以提供6.5至9.0的pH的磷酸鹽、醋酸鹽、羥甲基氨基甲烷(Tris)/HCl、Tris/醋酸鹽、枸櫞酸鹽和其它緩沖劑。優(yōu)選地，使用Tris/HCl。
緩沖劑，尤其是Tris/HCl緩沖劑的應(yīng)用濃度優(yōu)選地為5至50mM，最優(yōu)選地為10至40mM。
在與該支撐物結(jié)合后，通過對該柱進行洗滌和將蛋白從柱上洗脫下來來繼續(xù)進行該方法?？梢杂胮H遞減的不連續(xù)梯度或線性梯度或高pH下的競爭洗脫(例如用咪唑、組氨酸、氯化銨以及類似物)來進行洗脫。
這里所用的術(shù)語‘線性梯度’指的是用其組成以一種緩沖劑(或該緩沖劑的一種組分)的比例線性增加，而其它緩沖劑(或該緩沖劑的其它成組分)的比例線性降低的方式進行變化的溶液對色譜柱進行洗脫。
這里所用的術(shù)語‘不連續(xù)梯度’指的是用由一定比例的一種緩沖劑(或該緩沖劑的一種組分)和一定比例的另一種緩沖劑(或該緩沖劑的其它組分)所組成的溶液對色譜柱洗滌所確定的時間。兩種緩沖劑的比例都快速(突然)改變并且用其對色譜柱洗滌另一個所確定的時間。溶液的組成(緩沖劑比例或組分比例的變化)并不是線性改變的。
這里所用的術(shù)語‘競爭洗脫’指的是在結(jié)合緩沖劑的pH下其中洗脫緩沖劑中的競爭劑分子如咪唑、組氨酸、氯化銨等等本身結(jié)合到螯合了金屬的基質(zhì)上從而替換了蛋白分子的洗脫。
優(yōu)選地，使用可以在低pH下進行洗脫的不連續(xù)梯度。即，高pH可能會造成半胱氨酸殘基的活化和二聚物的形成。在低pH下G-CSF的穩(wěn)定性也高。
可以用一些洗脫劑來進行不連續(xù)或線性洗滌和洗脫，這些緩沖劑可選自醋酸鹽、Tris/醋酸鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽和其它適宜的緩沖劑。洗脫的pH范圍可以為3.0至5.0，優(yōu)選地為3.5至4.5。在進行不連續(xù)洗脫時，其pH迅速從裝填時的pH次序改變成洗脫pH的次序，如從7.0至4.0，從而跳過了等電點，避免了蛋白的沉淀。即，等電點的pH環(huán)境可造成其沉淀。
在洗脫液中，獲得了純度高于95％的生物學(xué)活性的恰當(dāng)折疊的單體G-CSF。
如果需要的話，可以將得自IMAC柱的洗脫液不需要進行任何另外的中間步驟地直接裝填到陽離子交換色譜柱上?？梢允褂酶鞣N陽離子交換色譜支撐物，其可以選自SP瓊脂糖FF、SP瓊脂糖HP、CM瓊脂糖FF、TSK凝膠SP-5PW、TSK凝膠SP-5PW-HR、Toyopearl SP-650M、Toyopearl SP-650S、Toyopearl SP-650C、Toyopearl CM-650M、Toyopearl CM-650S、Macro-Prep High S支撐物、Macro-Prep S支撐物、Macro-Prep CM支撐物等等。優(yōu)選地使用SP瓊脂糖FF或TSK凝膠SP-5PW。
用于陽離子交換色譜法的裝填溶液的pH范圍為3.0至5.8，優(yōu)選地為4.0至5.0。
用于陽離子交換色譜法的裝填溶液中的鹽濃度必需足夠低以確?？梢赃M行對溶液的pH也有依賴性的結(jié)合。
可以用pH為3.0至5.8的各種緩沖劑來進行裝填和與陽離子交換色譜法的支撐物相結(jié)合，其可以選自醋酸鹽、枸櫞酸鹽、Tris/HCl、Tris/醋酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、丙二酸鹽、2-(N-嗎啉乙基磺酸鹽)(MES)和其它緩沖劑。優(yōu)選地使用醋酸鹽。
醋酸鹽緩沖劑的應(yīng)用濃度可以為10至60mM，優(yōu)選地為10至30mM。
在陽離子交換色譜法中，在柱裝填后對柱進行清洗并將蛋白從柱上洗脫下來。在緩沖溶液中加入高濃度的鹽后由于離子強度增加而發(fā)生洗脫?？梢允褂貌贿B續(xù)梯度、線性梯度以及不連續(xù)和線性梯度的適宜組合。
可用于洗滌和洗脫的洗脫緩沖劑可以選自醋酸鹽、枸櫞酸鹽、Tris/HCl、Tris/醋酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、丙二酸鹽、MES和具有添加的鹽如NaCl或KCl的其它適宜緩沖劑。可以獲得洗脫效果的離子強度和鹽的濃度取決于緩沖溶液的pH。緩沖劑的pH越高，將蛋白從柱上洗脫下來所需的離子強度就越低。
在該洗脫液中，得到純度高于98％的生物學(xué)活性的恰當(dāng)折疊的單體形式的G-CSF。
如果需要的話，可以將得自IMAC的洗脫液或優(yōu)選地在連續(xù)的陽離子交換色譜柱后所獲得的洗脫液不需要進行任何另外的中間步驟地直接裝填到凝膠過濾柱上。
可以使用各種凝膠過濾支撐物，其可以選自Sephacryl S-200HR、Sephacryl S-100HR、Superose 12、Superose 6、Superdex 75、TSKgelG-2500PW、TSK gel G-3000 PW、Bio-Gel P-60、Bio-Gel P-100等等。優(yōu)選地使用Superdex 75。
對于凝膠過濾法而言，裝填溶液可以具有廣泛的pH范圍，因此，可以適宜地直接將得自IMAC或優(yōu)選得自隨后的陽離子交換色譜法的洗脫液作為裝填溶液?？梢杂孟嗤木彌_劑來進行溶液的裝填、蛋白與凝膠過濾支撐物的結(jié)合和蛋白的洗脫?？梢允褂酶鞣N洗脫劑，其可以選自可以將pH維持在3.5至8.0的范圍內(nèi)的枸櫞酸鹽、醋酸鹽、Tris、磷酸鹽和其它適宜緩沖劑。優(yōu)選地使用pH為6.0至7.0的枸櫞酸鹽緩沖劑。
優(yōu)選地，磷酸鹽緩沖劑(用于裝填的磷酸鹽緩沖劑)的應(yīng)用濃度可以為2至100mM，優(yōu)選地為3至10mM。
凝膠過濾緩沖劑中鹽的濃度可以為30至100mM，優(yōu)選地為約50mM。
在該洗脫液中，得到純度高于99％和生物學(xué)活性為1×108IU/mg的生物學(xué)活性的恰當(dāng)折疊的單體形式的G-CSF。
用下面的實施例來對本發(fā)明的各實施方案進行解釋，并不是要用其以任何方式對本發(fā)明進行限制。


圖1表示通過使用IMAC支撐物Zn(II)-IDA Chelating Sepharosefast flow(Pharmacia)而進行的蛋白與溶解的包涵體的色譜分離。
該色譜圖表明了依賴于時間(分鐘)在280nm(A280)(—)下的吸收變化和緩沖劑P3(----)的比例。
峰A-大腸桿菌蛋白和聚集的G-CSF；峰B-單體形式的恰當(dāng)折疊的生物學(xué)活性的G-CSF和痕量的大腸桿菌蛋白。
圖2表示在存在起始樣品的十二烷基硫酸鈉(SDS-PAGE)和用Zn-IDA Chelating Sepharose fast flow(Pharmacia)進行分離后圖1中的色譜峰中所表示的樣品的情況下用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行的分析。
圖例說明1.分子量標(biāo)準品(Bio-Rad)和G-CSF(Neupogen)(用箭頭標(biāo)出的)。
2.在進行色譜分離之前的起始樣品。
3.圖1中峰A的蛋白(聚集的G-CSF和大腸桿菌蛋白)。
4.圖1中峰B的蛋白(單體形式的恰當(dāng)折疊的生物學(xué)活性的G-CSF和痕量的大腸桿菌蛋白)。
圖3表示用具有IMAC支撐物Zn-IDA Chelating Sepharose FastFlow(Pharmacia)的XK50/20柱進行的色譜分離。
該色譜圖表明了隨時間(分鐘)變化在280nm(A280)(—)下的吸收變化和緩沖劑P6(----)的比例。
峰A-大腸桿菌蛋白和聚集的G-CSF；峰B-單體形式的恰當(dāng)折疊的生物學(xué)活性的G-CSF和痕量的大腸桿菌蛋白。
圖4表示用裝填有陽離子色譜法支撐物TSK gel SP-5Pw(TosoHaas)的XK16/20柱進行的色譜分離。
該色譜圖表明了依賴于時間(分鐘)在280nm(A280)(—)下的吸收變化和緩沖劑P8----)的比例。
主峰-單體形式的恰當(dāng)折疊的生物學(xué)活性的G-CSF；小峰-G-CSFisoforms和痕量的大腸桿菌蛋白。
圖5用裝填有凝膠過濾法支撐物SuperdexTM75制備等級(Pharmacia)的XK26/70柱進行的色譜分離。
色譜圖表示隨時間(分鐘)變化在280(A280)下的吸收變化。
主峰-單體形式的恰當(dāng)折疊的生物學(xué)活性的G-CSF。
實施例實施例1用IMACZn-IDA(Chelating Sepharose fast flow)進行的生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離用Chelating Sepharose fast flow(Pharmacia)支撐物對色譜柱(h＝10cm，d＝10mm)進行裝填，在所說的支撐物上結(jié)合有Zn2+離子，然后用5倍柱體積的緩沖劑P2以2ml/分鐘的恒定流速對該柱進行平衡。將包涵體溶解于緩沖劑P1(0.2％十二烷基肌氨酸鈉，40mM Tris/HCl，pH8.0)中并通過使用離子交換器來除去十二烷基肌氨酸鈉。將10ml包含生物學(xué)活性的G-CSF的裝填溶液(17mg總蛋白)以1ml/分鐘的恒定流速裝填到該柱上。用2ml/分鐘的恒定流速用緩沖劑P3的不連續(xù)梯度進行分離(圖1)。在第一個色譜峰(峰A)中發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌蛋白和大多數(shù)不恰當(dāng)折疊的和聚集的G-CSF。在100％的緩沖劑P3(0％的緩沖劑P2)的情況在，洗脫下來純度高于95％的基本純單體形式的生物學(xué)活性的G-CSF(7mg)(圖2)。
如下面實施例5所述的那樣對得自峰A的樣品的生物學(xué)活性進行測量，其為約1×106IU/mg蛋白，測得的得自峰B的樣品的生物學(xué)活性為0.8-1.0×108IU/mg蛋白，而標(biāo)準品的生物學(xué)活性為1×1081U/mg蛋白。用使用起始包涵體溶液的一步IMAC可以分離出純度高于95％和生物學(xué)活性可以與標(biāo)準品相提并論的單體形式的G-CSF。
實施例2用IMACZn-IDA(Fractogel EMD Chelate)進行的生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離用結(jié)合有Zn2+離子的Fractogel EMD Chelate(Merck)支撐物對色譜柱(h＝2cm，d＝10mm)進行裝填。用水對該柱進行洗滌并以1ml/分鐘的恒定流速用5倍柱體積的緩沖劑P2對其進行平衡。將包涵體溶解于緩沖劑P1中并用離子交換器除去十二烷基肌氨酸鈉。將3.3ml總量為4mg的被溶解的包涵體裝填到該柱上。用以1ml/分鐘的恒定流速進行的緩沖劑P3的不連續(xù)梯度(梯度13分鐘0％的緩沖劑P3(100％的緩沖劑P2)，12分鐘25％的緩沖劑P3(75％的緩沖劑P2)，14分鐘100％的緩沖劑P3(0％的緩沖劑P2)，11分鐘0％的緩沖劑P3(100％的緩沖劑P2))來進行分離。在100％的緩沖劑P3時洗脫下來單體形式的生物學(xué)活性的G-CSF(0.7mg)。
實施例3通過使用IMACNi-NTA(Superflow)進行的生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離用Ni-NTA Superflow(Qiagen)支撐物對色譜柱(h＝10cm，d＝10mm)進行裝填并用5倍柱體積的緩沖劑P4以2ml/分鐘的恒定流速對其進行平衡。將包涵體溶解于緩沖劑P1中并用離子交換器除去十二烷基肌氨酸鈉。以1ml/分鐘的恒定流速將10ml被溶解的包涵體(10mg總蛋白)裝填到該柱上。以2ml/分鐘的恒定流速用緩沖劑P5的不連續(xù)梯度(如圖1所示的用Zn-IDA Chelating Sepharose fast flow進行分離的相同梯度)進行分離。在100％的緩沖劑P5(0％的緩沖劑P4)時，洗脫下來純度高于95％的單體形式的生物學(xué)活性的G-CSF(3.6mg)。在第一個色譜峰中，除大腸桿菌蛋白外僅發(fā)現(xiàn)了不恰當(dāng)折疊的和聚集的G-CSF。在用Ni-NTA Superflow進行一些色譜分離后，匯集得自第二個峰的單體形式的G-CSF，然后用陽離子交換色譜法和凝膠過濾色譜法進行最后的純化(精煉)。
實施例4包括另外的色譜步驟的用于制備生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離方法這種生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離方法從G-CSF在大腸桿菌中表達之后所獲得的包涵體溶液開始，將4.5g進行了洗滌的包涵體重新混懸于225ml緩沖劑P1中，然后在用線性震動器輕輕(輕微)振動的情況下使其在20℃下溶解18小時。在離心15分鐘后，用離子交換器除去十二烷基肌氨酸鈉。用水將樣品稀釋至體積加倍，得到～430ml包涵體溶液；其蛋白濃度為～1.4mg/ml(在根據(jù)用G-CSF作為標(biāo)準品的Bradford后)。將該蛋白溶液分成兩份相等的體積裝填到用ChelatingSepharose fast flow(45-165μm，Pharmacia)支撐物裝填至10cm高度的色譜柱XK50/20(Pharmacia)(h＝10cm，d＝5cm，V＝200ml)上，其上結(jié)合有Zn2+離子。以7ml/分鐘的固定流速來進行樣品的裝填和洗脫。在裝填后，用不連續(xù)梯度(圖3)對該柱進行洗滌用緩沖劑P2洗滌15分鐘，然后用體積比為75∶25的緩沖劑P2和P6的混合物洗滌45分鐘，然后用緩沖劑P6洗滌86分鐘。在100％的緩沖劑P6時洗脫下來的是單體形式的生物學(xué)活性的G-CSF。將包含單體形式的生物學(xué)活性的G-CSF的所有級分(兩套分離系統(tǒng)的)合并，得到271ml蛋白濃度為～0.7mg/ml的溶液。向這種溶液中加入EDTA至終濃度為2mM。用20mM pH4.0的CH3COOH將該溶液稀釋三倍，然后將其用作用于陽離子交換色譜法的裝填溶液。
將該IMAC洗脫液分成兩等份地裝填到用色譜支撐物SP-5PW(30μm；TosoHaas)裝填至16cm高度(h＝16cm，d＝1.6cm，V＝32ml)的色譜柱XK16/20(Pharmacia)上。樣品的裝填和從色譜柱上的洗脫都是在5ml/分鐘的恒定流速下進行的。在將樣品裝填后，用緩沖劑P7將該柱洗滌11分鐘，然后用緩沖劑P8以0％至25％緩沖劑P8(100％至75％緩沖劑P7)的線性梯度洗脫30分鐘。再用體積比為75∶25的緩沖劑P7和P8的混合物對該柱洗滌16分鐘，然后用緩沖劑P8將其洗滌22分鐘(圖4)。將在～18％緩沖劑P8的線性梯度的線性部分中被洗脫下來的并屬于恰當(dāng)折疊的G-CSF(其純度高于98％)的主要的色譜峰的級分合并，將其直接用作用于凝膠過濾柱的裝填溶液。
將得自該陽離子交換色譜法的洗脫液(V＝46ml，蛋白濃度為～2.4mg/ml)分成5等分裝填到用凝膠過濾支撐物Superdex 75(制備級，34μm)(Pharmacia)裝填至57cm高度的色譜柱XK26/70(Pharmacia)(h＝57cm，d＝2.6cm，V＝300ml)上。以2.5ml/分鐘的固定流速用緩沖劑P9來進行分離。表示蛋白二聚物的峰與表示單體蛋白的主峰清楚地分開(圖5)。將主要的色譜峰級分合并，改變緩沖劑，得到100mg純度高于99％和生物學(xué)活性為1×108IU/mg的純單體形式的G-CSF，其中所說的生物學(xué)活性相當(dāng)于標(biāo)準品的生物學(xué)活性。
實施例5G-CSF體外生物學(xué)活性測定用公知的方法(Hammerling，U.等人，J Pharm Biomed Anal 13，9-20(1995))通過以細胞增生(NFS-60細胞)的刺激為基礎(chǔ)的方法來測定G-CSF的生物學(xué)活性，并且使用國際標(biāo)準人重組G-CSF(88/502，得自酵母菌的細胞；NIBSC Potters Bar，Hertfordshire，UK；見Mire-Sluis，A.R.等人.v J Immunol Methods 179，117-126(1995)。
緩沖劑組成P10.2％十二烷基肌氨酸鈉，40mM Tris/HCl，pH8.0P220mM Tris/HCl，150mM NaCl pH8.0P320mM醋酸，150mM NaCl，通過加入1M NaOH將其pH調(diào)至4.5P410mM Tris/HCl，200mM NaCl，pH8.0P520mM醋酸，200mM NaCl，通過加入1M NaOH將其pH調(diào)至4.0
P620mM CH3COOH，150mM NaCl，pH4.0P720mM CH3COOH，pH5.5P820mM CH3COOH，500mM NaCl，pH5.5P95mM磷酸鈉，50mM NaCl，pH7.0
權(quán)利要求
1.一種用于生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離的方法，其包括提供一種存在雜質(zhì)的包含G-CSF的生物學(xué)活性形式的混合物，和將所說的混合物用IMAC進行處理。
2.如權(quán)利要求1所述的生物學(xué)活性的G-CSF的分離方法，其包括下面的步驟·將存在雜質(zhì)的包含生物學(xué)活性的G-CSF的所述混合物裝填到IMAC支撐物上，·該G-CSF的生物活性形式與IMAC支撐物選擇性結(jié)合，和·將G-CSF的生物活性形式從該IMAC支撐物上洗脫下來，從而提供生物學(xué)活性的G-CSF。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所說的混合物包含雜質(zhì)，所說的雜質(zhì)是無生物學(xué)活性的單體形式和不恰當(dāng)折疊的G-CSF分子、寡聚的和多聚的G-CSF形式、變性的G-CSF形式、宿主細胞蛋白和其它宿主蛋白雜質(zhì)(組分)組成的組中的至少一種物質(zhì)；和所說的IMAC是以在生物學(xué)活性的G-CSF形式洗脫之前該雜質(zhì)基本不與該IMAC支撐物結(jié)合并且不能從IMAC柱上被洗脫下來的方式來進行的。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項所述的方法，其中所說的生物學(xué)活性的G-CSF未被糖基化。
5.如權(quán)利要求1至3中任意一項所述的方法，其中所說的生物學(xué)活性的G-CSF被糖基化。
6.如權(quán)利要求1至3中任意一項所述的方法，其中所說的生物學(xué)活性的G-CSF是至少一種選自甲二磺?；鵊-CSF、G-CSF類似物、酶或化學(xué)改性的G-CSF形式和包含G-CSF的融合蛋白組的組中的物質(zhì)。
7.如前面權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中所說的包含G-CSF的混合物選自變性然后又復(fù)性后所得的混合物、介質(zhì)或溶液；自然條件下的包涵體的溶液或混懸液；在分泌系統(tǒng)中表達后得自上清液的混合物或溶液或得自表達系統(tǒng)的培養(yǎng)介質(zhì)的混合物或溶液；和通過由IMAC柱或任何其它色譜柱的之前的洗脫而獲得的洗脫液。
8.如權(quán)利要求1或7所述的方法，其中所說的混合物包含自然條件下的包涵體溶液或混懸液。
9.如前面權(quán)利要求中任意一項所述的方法，在該方法中進行具有結(jié)合于該IMAC支撐物上的被螯合的金屬離子的IMAC，其中所說的金屬離子不是Hg。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所說的結(jié)合于該IMAC支撐物的被螯合的金屬離子選自M(II)-亞氨酸二醋酸鹽、M(II)-氨三乙酸和M(II)-羧甲基天冬氨酸鹽，其中M選自Zn、Cu、Co和Ni。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所說的結(jié)合于該IMAC支撐物的被螯合的金屬離子選自Zn(II)-亞氨酸二醋酸鹽、Ni(II)-亞氨酸二醋酸鹽和Ni(II)-氨三乙酸。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所說的IMAC支撐物包含Zn(II)-亞氨酸二醋酸鹽。
13.如前面權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中所說的包含G-CSF的生物活性形式的用于IMAC的裝填混合物或溶液是pH為6.5至9.0的緩沖溶液。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所說的裝填混合物或溶液具有7.0至8.5的pH，所說的pH優(yōu)選地為7.8至8.2。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所說的用于制備該包含G-CSF的生物活性形式的被緩沖的裝填混合物或溶液的緩沖劑選自醋酸鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽、Tris/HCl和Tris/醋酸鹽緩沖劑。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所說的緩沖劑是Tris/HCl緩沖劑。
17.如權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所說的緩沖劑的濃度為5至50mM。
18.如前面權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中所說的將G-CSF的生物學(xué)活性形式從IMAC支撐物上洗脫下來的步驟是用選自包括pH遞減的不連續(xù)梯度、線性梯度和在高pH下進行的競爭結(jié)合的洗脫方法來進行的。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所說的將G-CSF的生物學(xué)活性形式從該IMAC支撐物上洗脫下來的步驟是通過使用不連續(xù)梯度來進行的。
20.如前面權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中用于IMAC的洗脫溶液是pH3.0至5.0的緩沖劑溶液。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所說的洗脫溶液的pH為3.5至4.5。
22.如前面權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中所說的用于制備IMAC洗脫溶液的緩沖劑選自醋酸鹽、Tris/醋酸鹽、磷酸鹽和枸櫞酸鹽緩沖劑。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所說的洗脫緩沖劑是醋酸鹽緩沖劑。
24.如前面權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中在進行IMAC后所獲的生物學(xué)活性的G-CSF具有至少95％的純度。
25.如前面權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其進一步包含陽離子交換色譜法和/或凝膠過濾色譜法的步驟。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中在進行色譜步驟后獲得的生物學(xué)活性的G-CSF具有至少99％的純度。
27.一種用于生物學(xué)活性的G-CSF的純化和/或分離的方法，其中在自然條件下將包含G-CSF的不純混合物進行僅由IMAC和任選地至少一種選自離子交換和凝膠過濾技術(shù)的純化方法所組成的色譜步驟。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所說的包含G-CSF的混合物基本不含去污劑或增溶劑或以G-CSF在自然條件下存在的濃度包含去污劑或增溶劑。
29.如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中在進行色譜步驟后所獲得的生物學(xué)活性的G-CSF具有至少95％的純度；優(yōu)選地具有至少99％的純度。
30.如前面權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其中所說的整個方法是在自然條件下進行的。
31.一種純度高于99％的生物學(xué)活性的G-CSF。
32.用如權(quán)利要求1至30中任意一項所定義的方法所獲得的如權(quán)利要求31所述的生物學(xué)活性的G-CSF。
33.一種包含治療有效量的純度高于99％的生物學(xué)活性的G-CSF和可藥用的輔助物質(zhì)的藥物組合物。
34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中所說的生物學(xué)活性的G-CSF是用如權(quán)利要求1至30中任意一項所定義的方法所獲得的。
35.用如權(quán)利要求1至30中任意一項所定義的方法所獲得的生物學(xué)活性的G-CSF用于制備選自下面適應(yīng)癥的藥物的用途嗜中性白細胞減少癥和嗜中性白細胞減少癥-相關(guān)的臨床后遺癥、化療后發(fā)熱性嗜中性白細胞減少癥的住院的減少、作為供體白細胞輸入的供替代的造血母細胞的調(diào)動、慢性嗜中性白細胞減少癥、中性白細胞減少癥和非-中性白細胞減少癥性感染、移植受體、慢性炎性情況、膿毒癥和膿毒性休克、中性白細胞減少癥和非-中性白細胞減少癥的感染的風(fēng)險、發(fā)病率、死亡率、住院天數(shù)的減少、中性白細胞減少癥和非中性白細胞減少癥患者的感染和與感染相關(guān)的并發(fā)癥的預(yù)防、非醫(yī)院源性感染的預(yù)防和降低非醫(yī)院源性感染的死亡率和感染頻率、新生兒的腸內(nèi)給藥、增強新生兒的免疫系統(tǒng)、改善重癥監(jiān)護病房患者和病?；颊叩呐R床結(jié)果、傷口/皮膚潰瘍/燒傷愈合和治療、化療和/或放療的強化、各類血細胞減少、抗炎性細胞因子的增加、通過預(yù)防性使用非格司停而縮短高劑量化療的間隔、光動力學(xué)療法抗腫瘤作用的增強、由不同腦機能異常所造成的疾病的預(yù)防和治療、栓塞性疾病及其并發(fā)癥的治療和輻射后紅細胞生成的恢復(fù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生物學(xué)活性的粒細胞集落刺激因子(G－CSF)的分離的方法，其使得可以通過使用固定化金屬親合色譜法將恰當(dāng)折疊的生物學(xué)活性的單體G－CSF分子與不恰當(dāng)折疊的無生物學(xué)活性的單體形式的寡－或多聚G－CSF分離開以及還可以將其與聚集形式的G－CSF分子分開；如果需要的整個過程話，本發(fā)明的方法可以有利地在自然條件下進行。從而可以獲得純度高于95％的生物學(xué)活性的G－CSF。然后，優(yōu)選地僅用兩個另外的色譜步驟——陽離子交換色譜法和凝膠過濾色譜法來除去痕量的雜質(zhì)。整個方法可以以更高的收率來制備純度高于99％的G－CSF。所述的方法特別適用于G－CSF的工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/00GK1606568SQ02825465
公開日2005年4月13日 申請日期2002年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月19日
發(fā)明者V·賈伯克伯雷卡, V·米納特 申請人:Lek制藥股份公司