專利名稱：來自棒狀細菌的sigA基因的等位基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了來自棒狀細菌(coryneform bacteria)的編碼σ因子A(sigma factor A)的變體的sigA基因的一些等位基因，及使用含有這些等位基因的細菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
現(xiàn)有技術(shù)L-賴氨酸用于人用藥物和制藥工業(yè)，食品工業(yè)，特別是動物營養(yǎng)。
已知氨基酸可通過棒狀細菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于其極其重要性，已持續(xù)進行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵期間的糖濃度，或例如通過離子交換層析對產(chǎn)物形式的加工，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方式可獲得對抗代謝物有抗性或重要的調(diào)節(jié)代謝物缺陷的并產(chǎn)生氨基酸的菌株。一種已知抗的代謝物是賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)。
一段時間以來，重組DNA技術(shù)的方法也用于改良谷氨酸棒桿菌菌株生產(chǎn)L-氨基酸的能力，通過擴增各個氨基酸生物合成基因，并研究對氨基酸生產(chǎn)的作用而進行改良。
來自谷氨酸棒桿菌的編碼σ因子A的核苷酸序列可見于專利申請EP-A-1108790，序列號為No.2100和No.7065。
所述核苷酸序列也保藏于國家醫(yī)學圖書館的國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)(Bethesda，MD，美國)的數(shù)據(jù)庫中，登錄號為AX122184和AX127149。
發(fā)明目的本發(fā)明人的目的是為發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸提供改良的新方法。
發(fā)明概述當下文提及L-賴氨酸或賴氨酸時，不僅指堿還指鹽，例如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
本發(fā)明提供了可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其源自棒狀細菌，特別是谷氨酸棒桿菌，并編碼σ因子A，其中SEQ ID NO2中相關(guān)的氨基酸序列在第414位含有除了L-丙氨酸之外的任何蛋白原性氨基酸(proteinogenic amino acid)。
本發(fā)明還提供了可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其源自棒狀細菌，特別是谷氨酸棒桿菌，并編碼σ因子A，其中如SEQ ID NO4所示相關(guān)氨基酸序列在第414位含有L-纈氨酸。
本發(fā)明還提供了可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其源自棒狀細菌，特別是谷氨酸棒桿菌，并編碼σ因子A，其堿基序列如SEQ ID NO3所示，其在第1241位含有胸腺嘧啶。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的核苷酸序列并任選地在棒狀細菌中復(fù)制的質(zhì)粒(載體)。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的核苷酸序列的棒狀細菌，在所述棒狀細菌中編碼σ因子A的核苷酸序列任選地以超量表達形式存在，其中相關(guān)的氨基酸序列在SEQ ID NO2的第414位含有另一種蛋白原性氨基酸。
超量表達是指本發(fā)明σ因子A的胞內(nèi)濃度或活性增加。
通過超量表達措施，相應(yīng)蛋白的活性或濃度基于起始微生物中蛋白質(zhì)的活性或濃度一般增加至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最大1000％或2000％。
σ因子A是一種轉(zhuǎn)錄因子，其介導(dǎo)RNA聚合酶與DNA的特異性位點(起始位點)結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄開始(起始)。其參與起始大量基因的轉(zhuǎn)錄，例如編碼高絲氨酸脫氫酶的基因bom，編碼甘油醛三磷酸脫氫酶的gap，編碼果糖二磷酸醛縮酶的fda，及編碼磷酸甘油酸激酶的pgk(Patek等，微生物學1431297-1309(1996))。
為獲得超量表達，可增加相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或可使位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點突變。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達盒以同樣方式工作。通過誘導(dǎo)型啟動子，在L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)期間增強表達也是可能的。延長mRNA壽命的措施也可改良表達。另外，通過防止酶蛋白的分解也可提高酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或可在染色體中整合與擴增?；蛘撸ㄟ^改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件，也可獲得相關(guān)基因的超量表達。
在棒狀細菌中復(fù)制的質(zhì)粒適于增加本發(fā)明sigA等位基因的拷貝數(shù)。許多已知的質(zhì)粒載體，例如pZ1(Menkel等，應(yīng)用及環(huán)境微生物學(1989)64549-554)，pEKExl(Eikmanns等，基因10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因10769-74(1991))，基于隱蔽性質(zhì)粒pHM1519，pBL1或pGA1。以相同方式可以使用其它質(zhì)粒載體例如基于pCG4(US-A 4489160)或pNG2(Serwold-Davis，F(xiàn)EMS微生物學通訊66，119-124(1990))，或pAG1(US-A 5158891))的那些質(zhì)粒載體。
可以進一步使用染色體基因擴增方法以增加拷貝數(shù)，如Reinscheid等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學60，126-132(1994))針對復(fù)制或擴增hom-thrB操縱子所述的方法。在這個方法中，將完整基因或等位基因克隆入在宿主中(典型在大腸桿菌中)能復(fù)制但在谷氨酸棒桿菌中不能復(fù)制的質(zhì)粒載體中?？赡艿妮d體例如是pSUP301(Simon等，生物/技術(shù)1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，6973(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，美國)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化學雜志26932678-84；US-A5，487993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Holland；Bernard等，分子生物學雜志，234534-541(1993))，pEM1(Schrumpft等，1991，細菌學雜志1734510-4516)或pBGS8(Spratt等，1986，基因41337-342)。然后通過接合或轉(zhuǎn)化將含有要擴增的基因或等位基因的質(zhì)粒載體移至所需谷氨酸棒桿菌菌株中。接合方法例如Schafer等所述(應(yīng)用和環(huán)境微生物學60，756-759(1994))。轉(zhuǎn)化方法例如Thierbach等(應(yīng)用微生物學和生物技術(shù)29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技術(shù)7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物學通信123，343-347(1994))所述。在通過“交換”事件進行同源重組后，所得菌株含有所述基因或等位基因的至少兩個拷貝。
蛋白質(zhì)濃度的提高可通過1-和2-二維蛋白質(zhì)凝膠分離及隨后使用合適的評估軟件經(jīng)光學鑒別凝膠中蛋白質(zhì)濃度而檢測。在棒狀細菌的情況中制備蛋白質(zhì)凝膠及鑒別蛋白質(zhì)的一種常用方法是Hermann等(電泳，221712-23(2001))所描述的方法。蛋白質(zhì)濃度也可以通過與特異于所檢測的蛋白質(zhì)的抗體的Western印跡雜交進行分析(Sambrook等，分子克隆實驗指導(dǎo)，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)，隨后使用合適軟件經(jīng)光學評估以測定濃度(Lohaus和Meyer(1998)，Biospektrum532-39；Lottspeich(1999)AngewandteChemie 1112630-2647)。DNA結(jié)合蛋白的活性可通過DNA條帶移位分析(也稱為凝膠阻滯)測定(Wilson等(2001)，細菌學雜志1832151-2155)。DNA結(jié)合蛋白對其它基因表達的作用可以通過各種熟知的報道基因分析方法檢測(Sambrook等，分子克隆實驗指導(dǎo)，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)。
本發(fā)明提供了可復(fù)制的優(yōu)選地內(nèi)源的核苷酸序列(DNA)，其衍生自棒狀細菌并編碼蛋白質(zhì)σ因子A，其中在相關(guān)的氨基酸序列中，在SEQ ID NO2的第414位的L-丙氨酸由另一個蛋白原性氨基酸置換，特別是如SEQ ID NO4所示由L-纈氨酸置換，。
本發(fā)明還提供了可復(fù)制的優(yōu)選地內(nèi)源的核苷酸序列(DNA)，其衍生自棒狀細菌并編碼蛋白質(zhì)σ因子A，其相關(guān)的堿基序列在第1241位含有胸腺嘧啶，如SEQ ID NO3所示。
“內(nèi)源基因”或“內(nèi)源核苷酸序列”應(yīng)理解為一個物種群體中存在的基因或核苷酸序列及其等位基因。
本發(fā)明還提供了載體(質(zhì)粒)，其含有所述核苷酸序列并任選地在棒狀細菌中復(fù)制。
本發(fā)明還提供了棒狀細菌，其優(yōu)選地含有一個或多個超量表達形式的所述的編碼σ因子A的核苷酸序列。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)L-賴氨酸或包含L-賴氨酸的食品添加劑的方法，其中一般進行以下步驟a)發(fā)酵含有編碼σ因子A的內(nèi)源核苷酸序列的棒狀細菌，其中在相關(guān)的氨基酸序列中，第414位的L-丙氨酸由另一個蛋白原性氨基酸置換，優(yōu)選地由L-纈氨酸置換，在適于形成sigA基因產(chǎn)物σ因子A的條件下超量表達內(nèi)源sigA的等位基因；b)濃縮發(fā)酵肉湯中的L-賴氨酸；c)從發(fā)酵肉湯中分離L-賴氨酸或包含L-賴氨酸的食品添加劑，任選地d)伴有發(fā)酵肉湯的組分和/或生物量(＞0-100％)。
蛋白原性氨基酸是指組成蛋白質(zhì)或多肽的所有氨基酸。這些氨基酸特別是L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-蘇氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-組氨酸，L-賴氨酸，L-色氨酸，L-脯氨酸和L-精氨酸。
sigA基因的野生型形式包含于棒狀細菌的野生型菌株中，尤其在棒桿菌屬中。其示于SEQ ID NO1。野生型蛋白質(zhì)示于SEQ ID NO2。
在棒桿菌屬中，特別提及的是本領(lǐng)域已知的谷氨酸棒桿菌物種。谷氨酸棒桿菌物種的已知野生型菌株例如是谷氨酸棒桿菌ATCC 13032醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806
嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870Corynebacterium melassecola ATCC 17965嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERMBP-1539黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869和擴展短桿菌(Brevibacterium divaricam)ATCC 14020。
具有“ATCC”標號的菌株可以得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA，美國)。具有“FEMS”標號的菌株可得自日本國家高級產(chǎn)業(yè)科學技術(shù)研究院(AIST Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba Ibaraki，日本)。上述嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(FERM BP-1539)菌株及其它菌株(FERM BP-1540，RERM BP-1541和FERM BP-1542)在US-A 52550434中描述。
為產(chǎn)生編碼σ因子A的變體的本發(fā)明sigA等位基因，使用現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中描述的誘變方法，所述變體特征在于SEQ ID NO2的第414位氨基酸被置換。
使用誘變物質(zhì)的常規(guī)體內(nèi)誘變方法可用于進行誘變，所述誘變物質(zhì)例如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍，或UV光。
體外方法如用羥胺處理(Miller，J.H.細菌遺傳學短期教程，大腸桿菌和相關(guān)細菌的實驗指導(dǎo)和手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，1992)或用誘變寡核苷酸處理(T.A.Brown遺傳工程入門，SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，1993)，或者用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，如Newton和Graham所著手冊中描述(PCR，Spektrum AkademischerVerlag，Heidelberg，1994)，可進一步用于誘變。
關(guān)于產(chǎn)生突變的進一步信息可見于現(xiàn)有技術(shù)及已知的遺傳和分子生物學教材中，例如Knippers(分子遺傳學，第六版，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart，德國，1995)，Winnacker(基因與克隆，VCHVerlagsgesellschaft，Weinhheim，德國，1990)或者Hagemann(AllgemeineGenetik，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)所著教材。
如果使用體外方法，現(xiàn)有技術(shù)中所描述的sigA基因是借助于聚合酶鏈反應(yīng)從任選地克隆入合適的質(zhì)粒載體中的野生型菌株的分離的完整DNA開始擴增，然后將該DNA進行誘變。借助于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增DNA序列的信息可見于以下手冊中，Gait寡核苷酸合成實踐方案(IRL出版社，Oxford，UK，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德國，1994)。合適的sigA等位基因然后通過上述方法選擇并研究。
本發(fā)明提供了一種新的sigA等位基因，其編碼σ因子A的變體，并示于SEQ ID NO3。
本發(fā)明的sigA等位基因可通過基因置換方法移至合適的菌株中，如Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9，84-87(1991))所述或PetersWendisch等(微生物學144，915-927(1998))所述。將相應(yīng)的sigA等位基因克隆入在谷氨酸棒桿菌中不能復(fù)制的一個載體中，所述載體例如pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jager等，細菌學雜志1745462-65(1992))或者pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Holland；Bernard等，分子生物學雜志234534-541(1993))，然后通過轉(zhuǎn)化或接合將其移至谷氨酸棒桿菌的希望宿主中。在通過實現(xiàn)整合的第一次“交換”事件及實現(xiàn)靶基因或靶序列切除的適當?shù)牡诙巍敖粨Q”事件同源重組后，突變被摻入。
另外，除本發(fā)明的sigA基因之外，特定生物合成途徑，糖酵解，回補作用，檸檬酸循環(huán)，戊糖磷酸循環(huán)，氨基酸輸出的一或多種酶及任選地調(diào)節(jié)蛋白的增強尤其超量表達，對L-氨基酸的生產(chǎn)可以是有益的。一般優(yōu)選地使用內(nèi)源基因。
“內(nèi)源基因”或“內(nèi)源核苷酸”是指存在于一個物種群提中的基因或核苷酸序列或其等位基因。
文中術(shù)語“增強”是指微生物中由相應(yīng)的DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性或濃度的增加，例如通過增加基因的拷貝數(shù)，或使用強啟動子或編碼高活性相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)的基因或等位基因，及任選地組合使用這些方法。相應(yīng)酶蛋白活性的增加也可以通過降低對抑制因子的敏感性而實現(xiàn)。
通過增強措施，尤其超量表達，相應(yīng)蛋白的活性或濃度基于野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中蛋白質(zhì)的活性或濃度一般增加至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最大1000％或2000％。
因此，為了生產(chǎn)L-賴氨酸，除使用sigA基因的變體之外，同時例如選自以下一組的一或多個內(nèi)源基因可被增強尤其被超量表達·編碼二氫吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)的dapA基因(EP-B 0197335)，·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼烯醇化酶的eno基因(DE19947791.4)，·編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因(JP-A-09224661，EP-A-1108790)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609；EP-A-1108790)，·編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等，歐洲生物化學雜志254，395-403(1998))，·編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(登記號No.P26512；EP-B-0387527；EP-A-0699759；WO 00/63388)，·編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-19548 222)，·編碼Zwal蛋白的zwal基因(DE19959328.0，DSM 13115)，
·編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因(WO 01/71012)·編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶一個亞基的opcA基因(WO 01/00844D的序列號No.79；WO 01/04322)。
6-磷酸葡糖酸脫氫酶的增強也可以通過氨基酸置換等實現(xiàn)，例如將酶蛋白第158位的L-脯氨酸用L-絲氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸或L-蘇氨酸置換，和/或?qū)⒚傅鞍椎?61位的L-絲氨酸用L-苯丙氨酸或L-酪氨酸置換。
葡糖-6-磷酸脫氫酶亞基的增強也可以通過氨基酸置換等而實現(xiàn)，例如將酶蛋白第312位的L-絲氨酸用L-苯丙氨酸或L-酪氨酸置換。
除使用sigA基因變體之外，同時對選自以下一組的一或多個內(nèi)源基因進行弱化尤其降低其表達對于L-賴氨酸的生產(chǎn)也可以是有益的·編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，·編碼葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM 13114)，·編碼Zwa2蛋白的zwa2基因(DE19959327.2，DSM 13113)，·編碼果糖-1，6-二磷酸醛縮酶的fda基因(登記號X17313；von derOsten等，分子微生物學3(11)，1625-1637(1989))，·編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因(EP-A-0131171).
·編碼異丙基蘋果酸脫氫酶的leuB基因(Patek等，應(yīng)用環(huán)境微生物學5043-47(1989))，登記號No.Y09578)，·編碼異丙基蘋果酸脫水酶的leuC基因(登記號AX121536，專利EP1108790中的序列號No.1452；登記號AX063983，專利WO0100843中的序列號No.265)，·編碼高絲氨酸激酶的thrB基因(Peoples，O.W.等，分子微生物學263-72(1988))及·編碼果糖磷酸激酶的pfkB基因(WO 01/00844中的SEQ IDNO57)。
文中術(shù)語“弱化”是指降低或消除微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性，例如通過使用弱啟動子或使用編碼具有低活性的相應(yīng)酶的基因或等位基因，或失活相應(yīng)基因或酶或蛋白質(zhì)，及任選地組合使用這些方法。
通過弱化措施，相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度一般降低至野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中蛋白質(zhì)活性或濃度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或0-5％。
異丙基蘋果酸脫氫酶的弱化也可以通過氨基酸置換等實現(xiàn)，例如所述酶蛋白第131位的L-甘氨酸可以用L-天冬氨酸，L-天冬酰胺或L-谷氨酸置換。
異丙基蘋果酸脫水酶的弱化也可以通過氨基酸置換等實現(xiàn)，例如所述酶蛋白第451位的L-精氨酸用L-絲氨酸置換，或第456位的L-谷氨酸用L-天冬氨酸置換，或者組合這些置換。
高絲氨酸脫氫酶的弱化也可以通過氨基酸置換等實現(xiàn)，例如所述酶蛋白第118位的L-天冬酰胺用L-蘇氨酸或L-絲氨酸置換，或第160位的L-亮氨酸用L-脯氨酸置換，或者組合這些置換。
果糖磷酸激酶的弱化也可以通過氨基酸置換等實現(xiàn)，例如所述酶蛋白第109位的L-亮氨酸可以用L-丙氨酸，L-甘氨酸或L-脯氨酸置換。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物，它們可連續(xù)或非連續(xù)地通過分批法(分批培養(yǎng))，補料分批法(補料方法)或重復(fù)補料分批法(重復(fù)補料方法)培養(yǎng)，以生產(chǎn)L-氨基酸。已知培養(yǎng)法見于由Chmiel(生物方法技術(shù)學1，生物工程入門，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反應(yīng)器及外周設(shè)備，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培養(yǎng)基必須以適當方式符合各菌株的需求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細菌學會的“細菌學通用方法手冊”(美國華盛頓D.C.，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有機化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無機化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。這些氮源可單獨或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，還可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當前體加入培養(yǎng)基中，上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間適當補加。
可以適當方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值?？古菽瓌├缰舅峋垡叶减タ捎糜诳刂婆菽a(chǎn)生。適當?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃-45℃，優(yōu)選地25℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至所需產(chǎn)物形成最大量。此目的通常在10-160小時內(nèi)達到。
本領(lǐng)域已知確定L-氨基酸的方法。因此可例如Spackman等所述通過陰離子交換層析隨后茚三酮衍生化作用(分析化學，30(1958)，1190)進行該分析，或者通過反相HPLC進行，如Lindroth等所述(分析化學(1979)511167-1174)。
本發(fā)明的方法用于發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸。
L-賴氨酸的濃度可任選通過加入L-賴氨酸而調(diào)節(jié)為希望的值。
本發(fā)明借助于以下實施例得以更詳細闡述。
實施例1菌株DM1547的sigA等位基因DNA的擴增和測序谷氨酸棒桿菌菌株DM1547通過多次非定向誘變、選擇及突變體選擇從谷氨酸棒桿菌ATCC13032中制備。該菌株對賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，對甲硫氨酸敏感。
通過常規(guī)方法從菌株DM1547中分離染色體DNA(Eikmanns等，微生物學1401817-1828(1994))。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，擴增攜帶sigA基因或等位基因的DNA節(jié)段。基于已知的谷氨酸棒桿菌sigA基因序列(EP1108970的序列號2100和7065)，選擇以下引物寡核苷酸進行PCRsigA-1(SEQ ID No8)5’tgatcggctgaccaactcta 3’sigA-2(SEQ ID No9)5’aaggtctcgaatccgagaac 3’所示引物通過MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成，通過Innis等所述方法進行PCR(PCR方案，方法與應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學術(shù)出版社)。用所述引物擴增出長度為大約1.89kb的一DNA節(jié)段，其攜帶sigA等位基因。
攜帶菌株DM1547的sigA等位基因的長度為大約1.89kb的擴增的DNA片段，通過在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳而鑒別，從凝膠中分離并通過常規(guī)方法純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
該擴增的DNA片段或PCR產(chǎn)物的核苷酸序列通過MWG Biotech(Ebersberg，德國)測序確定。PCR產(chǎn)物的序列示于SEQ ID NO5。編碼區(qū)的序列示于SEQ ID NO3。借助于Patentin程序獲得的相關(guān)σ因子A的氨基酸序列示于SEQ ID NO6和4。
在菌株DM1547的sigA等位基因編碼區(qū)的核苷酸序列的第1241位，即SEQ ID NO5所示核苷酸序列的第1466位，是堿基胸腺嘧啶。在野生型基因(SEQ ID NO1)的相應(yīng)位置是堿基胞嘧啶。
在菌株DM1547的σ因子A的氨基酸序列的第414位是纈氨酸(SEQ ID NO6和4)。在野生型蛋白質(zhì)的相應(yīng)位置是丙氨酸(SEQ IDNO2)。
在編碼區(qū)第1241位含有堿基胸腺嘧啶并因此編碼在氨基酸序列第414位含有纈氨酸的σ因子A的sigA等位基因在下文稱為sigA_A414V等位基因。在名稱“sigA_A414V”中，A代表L-丙氨酸，V代表L-纈氨酸，414表示氨基酸置換的位置(見SEQ ID NO2和4)。
實施例2用sigA_A414V等位基因交換菌株DSM5715的sigA野生型基因2.1產(chǎn)生攜帶sigA_A414V等位基因的具有突變A414V的區(qū)域的DNA片段通過常規(guī)方法從菌株DM1547中分離染色體DNA(Eikmanns等，微生物學1401817-1828(1994))。借助于聚合酶鏈反應(yīng)擴增攜帶sigA_A414V等位基因的具有突變A414V的區(qū)域的一個DNA節(jié)段?；谝阎墓劝彼岚魲U菌sigA基因的序列(來自EP-A-1108790，序列號No.2100和序列號No.7065)，選擇以下引物寡核苷酸進行聚合酶鏈反應(yīng)，由此突變A414V位于擴增產(chǎn)物的中心區(qū)域sigA-XL-A1(SEQ ID NO10)5’acgaa tte-cga cgg cga tga ctt cgt ag 3’sigA-XL-A2(SEQ ID NO11)5’tggaa ttc-cgt tcc acc tcg ctc cat tc 3’所示引物通過MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成，并通過Innis等所述標準PCR方法進行PCR(PCR方案，方法與應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學術(shù)出版社)。用所述引物擴增出攜帶sigA_A414V等位基因的一個區(qū)域的長度為大約1.69kb的一DNA節(jié)段(SEQ ID NO7)。該引物還含有限制性內(nèi)切酶EcoRI的切割位點序列，該切割位點序列在上述核苷酸序列中以下劃線示出。
將攜帶菌株DM1547的sigA等位基因的長度為大約1.69kb的擴增的DNA片段用限制性內(nèi)切酶EcoRI切割，通過在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳而鑒別，然后從該凝膠中分離并通過常規(guī)方法純化(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
2.2構(gòu)建置換載體pK18mobsacB_sigA_A414V將含有攜帶突變A414V的sigA_A414V等位基因的一個區(qū)域并用限制性內(nèi)切酶EcoRI切割的長度為大約1.68kb的DNA片段，借助于Schafer等所述sacB系統(tǒng)(基因14，69-73(1994))，通過置換誘變摻入谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715的染色體中。這個系統(tǒng)能產(chǎn)生并選擇通過同源重組發(fā)生的等位基因交換。
將活動型克隆載體pK18mobsacB用限制酶EcoRI消化，用堿性磷酸酶將末端去磷酸化(堿性磷酸酶，德國曼海姆Boehringer)。以此方式制備的載體與大小為大約1.68kb的sigA_A414V片段混合，并將此混合物用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理。
然后將大腸桿菌菌株S17-1(Simon等，生物/技術(shù)1784-791，1993)用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實踐方案，第1卷，ILR出版社，冷泉港，紐約，1989)。攜帶質(zhì)粒的細胞通過將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于補加25mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港，紐約，1989)上進行選擇。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒，從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過用酶BamHI限制酶切，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳而檢測。該質(zhì)粒稱為pK18mobsacB_sigA_A414V，并示于

圖1。
2.3等位基因交換通過Schafer等所述方法(微生物學雜志1721663-1666(1990))，將實施例2.2中所述載體pK18mobsacB_sigA_A414V通過接合轉(zhuǎn)移至谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715中。該載體在DSM5715中不能獨立復(fù)制，只有由于重組而整合在染色體中的情況下才能保留在細胞中。通過將接合混合物鋪板子補加15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港，紐約，1989)上選擇轉(zhuǎn)接合子，及具有整合的pK18mobsacB_sigA_A414V的克隆。將卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子鋪板于具有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上，在33℃溫育24小時。為選擇其中由于第二次重組事件而發(fā)生質(zhì)粒切除的突變體，將所述克隆在LB液體培養(yǎng)基中非選擇性培養(yǎng)30小時，然后鋪板于具有10％蔗糖的LB瓊脂上，溫育16小時。
與起始質(zhì)粒pK18mobsacB相似，質(zhì)粒pK18mobsacB_sigA_A414V除了卡那霉素抗性基因之外，還含有一個拷貝的編碼得自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的果聚糖蔗糖酶的sacB基因?？梢杂烧崽钦T導(dǎo)的表達導(dǎo)致果聚糖蔗糖酶形成，其催化對谷氨酸棒桿菌有毒性的果聚糖產(chǎn)物合成。因此只有其中整合的pK18mobsacB_sigA_A414V由于第二次重組已經(jīng)被切除的那些克隆在LB瓊脂上生長。根據(jù)第二次重組相對于突變位點的位置，隨切除而發(fā)生等位基因的交換或突變的摻入，或者原始拷貝保留在宿主染色體中。
對大約40-50個菌落測試表型“在存在蔗糖情況下生長”和“在存在卡那霉素的情況下不生長”。在顯示出表型“在存在蔗糖情況下生長”和“在存在卡那霉素的情況下不生長”的4個菌落中，通過GATCBiotech AG(Constance，德國)，從測序引物sA_1(SEQ ID NO12)開始對跨越A414V突變的sigA基因區(qū)域進行測序，以證實sigA_A414V等位基因的突變存在于染色體中。通過GATC合成為此所用的引物sA_1sA_1(SEQ ID NO12)5’aag ttc tcc acc tac gca ac 3’以此方式鑒別一個克隆，其在sigA基因的第1241位含有堿基胸腺嘧啶，并因此具有sigA_A414V等位基因。這個克隆稱為菌株DSM5715sigA_A414V。
實施例3制備賴氨酸將實施例2中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715sigA_A414V在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
首先，在33℃將菌株在瓊脂板上溫育24小時。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶中)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是MM培養(yǎng)基。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物24小時。從這些預(yù)培養(yǎng)物中接種主培養(yǎng)物，由此主培養(yǎng)物的起始光密度(波長660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM也用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL 5g/lMOPS20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌)50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌)0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL(玉米漿)，MOPS(嗎啉代丙磺酸)和所述鹽溶液的pH調(diào)節(jié)為7，并高壓滅菌。然后加入無菌底物和維生素溶液，以及在干態(tài)下高壓滅菌的CaCO3。
在具有擋板的100ml錐形瓶中以10ml體積進行培養(yǎng)。在33℃和80％濕度下進行培養(yǎng)。
72小時后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長下測定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實驗結(jié)果示于表1。
表1
附圖簡述圖1質(zhì)粒pK18mobsacB_sigA_A414V圖譜。
圖中所采用的縮寫和符號有如下含義。標示的堿基對數(shù)是在重復(fù)測定基礎(chǔ)上獲得的大約值。
Kan卡那霉素抗性基因EcoRI限制酶EcoRI的酶切位點BamHI限制酶BamHI的酶切位點′sigA含有sigA等位基因(＝sigA_A414V等位基因)3’末端區(qū)域及下游區(qū)域的克隆的DNA片段sacBsacB基因RP4-mob具有進行轉(zhuǎn)移的復(fù)制源點(oriT)的mob區(qū)域oriV復(fù)制源點V
序列表<110>德古薩股份公司<120>來自棒狀細菌的sigA基因的等位基因<130>DEDEG0231<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1497<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(1)..(1494)<223>sigA wild-type gene<400>1gtg gag agc agc atg gta gaa aac aac gta gca aaa aag acg gtc gct48Met Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala1 5 10 15aaa aag acc gca cgc aag acc gca cgc aaa gca gcc ccg cgc gtg gca96Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala20 25 30acc cca ttg gga gtc gca tct gag tct ccc att tcg gcc acc cct gcg144Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala35 40 45cgc agc atc gat gga acc tca acc cct gtt gaa gct gct gac acc ata192Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile50 55 60gag acc acc gcc cct gca gcg aag gct cct gcg gcc aag gct ccc gct240Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala65 70 75 80aaa aag gtt gcc aag aag aca gct cgc aag gca cct gcg aaa aag act288Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr85 90 95gtc gcc aag aaa gcc aca acc gcc aag gct gca cct gca act gcc aag336Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys100 105 110gac gaa aac gca cct gtt gat gac gac gag gag aac ctc gct cag gat384Asp Glu Asn Ala Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp115 120 125gaa cag gac ttc gac ggc gat gac ttc gta gac ggc atc gaa gac gaa432Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu130 135 140
gaa gat gaa gac ggc gtc gaa gcc ctc ggt gaa gaa agc gaa gac gac480Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp145 150 155 160gaa gag gac ggc tca tcc gtt tgg gat gaa gac gaa tcc gca acc ctg528Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu165 170 175cgt cag gca cgt aaa gat gcc gag ctc acc gct tcc gcc gac tct gtt576Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val180 185 190cgc gct tac ctg aag caa atc ggt aaa gtt gcc ctg ctg aac gct gaa624Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu195 200 205cag gaa gtc tcc ctg gca aag cgc atc gaa gca ggc ctt tac gcc acc672Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr210 215 220cac cgc atg gag gaa atg gaa gaa gct ttc gca gcc ggt gac aag gac720His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp225 230 235 240gcg aaa ctc acc cca gcc gtc aag cgt gac ctc cgc gcc atc gct cgt768Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg245 250 255gac ggc cgc aag gcg aaa aac cac ctc ctg gaa gcc aac ctt cgt ctg816Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu260 265 270gtt gtc tcc ctg gca aag cgc tac acc ggc cgt ggc atg gca ttc ctg864Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu275 280 285gac ctc atc cag gaa ggc aac ctc ggt ctg att cgt gcc gta gag aag912Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys290 295 300ttc gac tac tcc aag ggc tac aag ttc tcc acc tac gca acc tgg tgg960Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp305 310 315 320atc cgt cag gca atc acc cgc gcc atg gcc gac caa gca cga acc atc1008Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile325 330 335cgt atc cca gtc cac atg gtt gaa gtg atc aac aaa ctt ggt cgc atc1056Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile340 345 350caa cgt gaa ctc ctt cag gaa ctc ggc cgc gaa cca acc cca cag gaa1104Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu355 360 365ctg tcc aaa gaa atg gac atc tcc gag gaa aag gta ctg gaa atc cag1152Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln370 375 380
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<221>CDS<222>(1)..(1494)<223>sigA allele<220>
<221>mutation<222>(1241)..(1241)<223>Exchange of cytosine for thymine<400>3gtg gag agc agc atg gta gaa aac aac gta gca aaa aag acg gtc gct48Met Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala1 5 10 15aaa aag acc gca cgc aag acc gca cgc aaa gca gcc ccg cgc gtg gca96Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala20 25 30acc cca ttg gga gtc gca tct gag tct ccc att tcg gcc acc cct gcg144Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala35 40 45cgc agc atc gat gga acc tca acc cct gtt gaa gct gct gac acc ata192Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile50 55 60gag acc acc gcc cct gca gcg aag gct cct gcg gcc aag gct ccc gct240Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala65 70 75 80aaa aag gtt gcc aag aag aca gct cgc aag gca cct gcg aaa aag act288Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr85 90 95gtc gcc aag aaa gcc aca acc gcc aag gct gca cct gca act gcc aag336Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys100 105 110gac gaa aac gca cct gtt gat gac gac gag gag aac ctc gct cag gat384
Asp Glu Asn Ala Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp115 120 125gaa cag gac ttc gac ggc gat gac ttc gta gac ggc atc gaa gac gaa432Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu130 135 140gaa gat gaa gac ggc gtc gaa gcc ctc ggt gaa gaa agc gaa gac gac480Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp145 150 155 160gaa gag gac ggc tca tcc gtt tgg gat gaa gac gaa tcc gca acc ctg528Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu165 170 175cgt cag gca cgt aaa gat gcc gag ctc acc gct tcc gcc gac tct gtt576Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val180 185 190cgc gct tac ctg aag caa atc ggt aaa gtt gcc ctg ctg aac gct gaa624Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu195 200 205cag gaa gtc tcc ctg gca aag cgc atc gaa gca ggc ctt tac gcc acc672Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr210 215 220cac cgc atg gag gaa atg gaa gaa gct ttc gca gcc ggt gac aag gac720His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp225 230 235 240gcg aaa ctc acc cca gcc gtc aag cgt gac ctc cgc gcc atc gct cgt768Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg245 250 255gac ggc cgc aag gcg aaa aac cac ctc ctg gaa gcc aac ctt cgt ctg816Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu260 265 270gtt gtc tcc ctg gca aag cgc tac acc ggc cgt ggc atg gca ttc ctg864Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu275 280 285gac ctc atc cag gaa ggc aac ctc ggt ctg att cgt gcc gta gag aag912Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys290 295 300ttc gac tac tcc aag ggc tac aag ttc tcc acc tac gca acc tgg tgg960Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp305 310 315 320atc cgt cag gca atc acc cgc gcc atg gcc gac caa gca cga acc atc1008Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile325 330 335cgt atc cca gtc cac atg gtt gaa gtg atc aac aaa ctt ggt cgc atc1056Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile340 345 350cas cgt gaa ctc ctt cag gaa ctc ggc cgc gaa cca acc cca cag gaa1104
Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr pro Gln Glu355 360 365ctg tcc aaa gaa atg gac atc tcc gag gaa aag gta ctg gaa atc cag1152Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln370 375 380cag tac gcc cgc gaa cca atc tcc ctg gac caa acc atc ggc gac gaa1200Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu385 390 395 400ggc gac agc cag ctc ggc gac ttc atc gaa gac tcc gaa gtc gtc gtc1248Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Val Val Val405 410 415gca gtc gac gcc gtc tca ttc acc ctg ctg caa gac cag cta cag gac1296Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp420 425 430gtc cta gag acc ctc tcc gaa cgt gaa gcc ggc gtg gtt aaa ctc cgc1344Val Leu Glu Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg435 440 445ttc gga ctc acc gac gga atg cca cgc act tta gac gaa atc ggc caa1392Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln450 455 460gtt tac ggt gtc acc cgt gag cgc atc cgc cag att gag tcc aag acc1440Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr465 470 475 480atg tct aag ctg cgc cac cca tca cgc tcc cag gtc ctt cgc gac tac1488Met Ser Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr485 490 495ctg gac taa1497Leu Asp<210>4<211>498<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>4Met Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala1 5 10 15Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala20 25 30Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala35 40 45Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile50 55 60Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala65 70 75 80
Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr85 90 95Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys100 105 110Asp Glu Asn Ala pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp115 120 125Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu130 135 140Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp145 150 155 160Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu165 170 175Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val180 185 190Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu195 200 205Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr210 215 220His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp225 230 235 240Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg245 250 255Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu260 265 270Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu275 280 285Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys290 295 300Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp305 310 315 320Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile325 330 335Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile340 345 350Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu355 360 365Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln370 375 380Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu385 390 395 400
Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Val Val Val405 410 415Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp420 425 430Val Leu Glu Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg435 440 445Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln450 455 460Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr465 470 475 480Met Ser Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr485 490 495Leu Asp<210>5<211>1892<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(226)..(1719)<223>sigA allele<220>
<221>mutation<222>(1466)..(1466)<223>Exchange of cytosine for thymine<400>5tgatcggctg accaactcta taagagatgc acctcaagtt tggggatact tattcggcgt60ttctggggaa caaatacgtt tccctattgt tgtatatagg tattcgcact taagaaacat120ctctcatgga aagaagctag gcggaaaggg cgttaagtac ttgccattta atcctcagca180tcactcggat cagtcggaga tgtcgatgaa aatgcaccag gagcc gtg gag agc agc237Val Glu Ser Ser1atg gta gaa aac aac gta gca aaa aag acg gtc gct aaa aag acc gca 285Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala Lys Lys Thr Ala5 10 15 20cgc aag acc gca cgc aaa gca gcc ccg cgc gtg gca acc cca ttg gga 333Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala Thr Pro Leu Gly25 30 35gtc gca tct gag tct ccc att tcg gcc acc cct gcg cgc agc atc gat 381Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala Arg Ser Ile Asp40 45 50
gga acc tca acc cct gtt gaa gct gct gac acc ata gag acc acc gcc429Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile Glu Thr Thr Ala55 60 65cct gca gcg aag gct cct gcg gcc aag gct ccc gct aaa aag gtt gcc477Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Lys Lys Val Ala70 75 80aag aag aca gct cgc aag gca cct gcg aaa aag act gtc gcc aag aaa525Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr Val Ala Lys Lys85 90 95 100gcc aca acc gcc aag gct gca cct gca act gcc aag gac gaa aac gca573Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys Asp Glu Asn Ala105 110 115cct gtt gat gac gac gag gag aac ctc gct cag gat gaa cag gac ttc621Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp Glu Gln Asp Phe120 125 130gac ggc gat gac ttc gta gac ggc atc gaa gac gaa gaa gat gaa gac669Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp135 140 145ggc gtc gaa gcc ctc ggt gaa gaa agc gaa gac gac gaa gag gac ggc717Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp Glu Glu Asp Gly150 155 160tca tcc gtt tgg gat gaa gac gaa tcc gca acc ctg cgt cag gca cgt765Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu Arg Gln Ala Arg165 170 175 180aaa gat gcc gag ctc acc gct tcc gcc gac tct gtt cgc gct tac ctg813Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val Arg Ala Tyr Leu185 190 195aag caa atc ggt aaa gtt gcc ctg ctg aac gct gaa cag gaa gtc tcc861Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu Gln Glu Val Ser200 205 210ctg gca aag cgc atc gaa gca ggc ctt tac gcc acc cac cgc atg gag909Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr His Arg Met Glu215 220 225gaa atg gaa gaa gct ttc gca gcc ggt gac aag gac gcg aaa ctc acc957Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp Ala Lys Leu Thr230 235 240cca gcc gtc aag cgt gac ctc cgc gcc atc gct cgt gac ggc cgc aag1005pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg Asp Gly Arg Lys245 250 255 260gcg aaa sac cac ctc ctg gaa gcc sac ctt cgt ctg gtt gtc tcc ctg1053Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu Val Val Ser Leu265 270 275gca aag cgc tac acc ggc cgt ggc atg gca ttc ctg gac ctc atc cag1101Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu Asp Leu Ile Gln280 285 290
gaa ggc aac ctc ggt ctg att cgt gcc gta gag aag ttc gac tac tcc1149Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Tyr Ser295 300 305aag ggc tac aag ttc tcc acc tac gca acc tgg tgg atc cgt cag gca1197Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Ala310 315 320atc acc cgc gcc atg gcc gac caa gca cga acc atc cgt atc cca gtc1245Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile Arg Ile Pro Val325 330 335 340cac atg gtt gaa gtg atc aac aaa ctt ggt cgc atc caa cgt gaa ctc1293His Met Val Glu Val Ile Asr Lys Leu Gly Arg Ile Gln Arg Glu Leu345 350 355ctt cag gaa ctc ggc cgc gaa cca acc cca cag gaa ctg tcc aaa gaa1341Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu Leu Ser Lys Glu360 365 370atg gac atc tcc gag gaa aag gta ctg gaa atc cag cag tac gcc cgc1389Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln Gln Tyr Ala Arg375 380 385gaa cca atc tcc ctg gac caa acc atc ggc gac gaa ggc gac agc cag1437Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu Gly Asp Ser Gln390 395 400ctc ggc gac ttc atc gaa gac tcc gaa gtc gtc gtc gca gtc gac gcc1485Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Val Val Val Ala Val Asp Ala405 410 415 420gtc tca ttc acc ctg ctg caa gac cag cta cag gac gtc cta gag acc1533Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp Val Leu Glu Thr425 430 435ctc tcc gaa cgt gaa gcc ggc gtg gtt aaa ctc cgc ttc gga ctc acc1581Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg Phe Gly Leu Thr440 445 450gac gga atg cca cgc act tta gsc gaa atc ggc caa gtt tac ggt gtc1629Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln Val Tyr Gly Val455 460 465acc cgt gag cgc atc cgc cag att gag tcc aag acc atg tct aag ctg1677Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr Met Ser Lys Leu470 475 480cgc cac cca tca cgc tcc cag gtc ctt cgc gac tac ctg gac1719Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr Leu Asp485 490 495taaaacccca gtcgggctca agaccgggcc gccactgttt tcctctgcgg ggaacggtgg 1779tggcccggtt tttctgttgc tttggttcgg ctggtcacag ttcggctggg gtgttttaag 1839tttgatttca cattgccgat ttctaaacgc cgagttctcg gattcgagac ctt 1892
<210>6<211>498<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>6Val Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala1 5 10 15Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala20 25 30Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala35 40 45Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile50 55 60Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala65 70 75 80Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr85 90 95Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys100 105 110Asp Glu Asn Ala Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp115 120 125Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu130 135 140Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp145 150 155 160Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu165 170 175Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val180 185 190Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu195 200 205Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr210 215 220His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp225 230 235 240Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg245 250 255Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu260 265 270Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu275 280 285
Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys290 295 300Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp305 310 315 320Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile325 330 335Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile340 345 350Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu355 360 365Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln370 375 380Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu385 390 395 400Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Val Val Val405 410 415Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp420 425 430Val Leu Glu Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg435 440 445Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln450 455 460Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr465 470 475 480Met Ser Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr485 490 495Leu Asp<210>7<211>1689<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1689)<223>Description of the artificial sequencePCR product containing ann3′-terminal region of the sigA allele (＝sigA_A414V allele) andthe downstream region<220>
<221>mutation<222>(854)..(854)<223>Exchange of cytosine for thymine
acgaattccg acggcgatga cttcgtagac ggcatcgaag acgaagaaga tgaagacggc60gtcgaagccc tcggtgaaga aagcgaagac gacgaagagg acggctcatc cgtttgggat120gaagacgaat ccgcaaccct gcgtcaggca cgtaaagatg ccgagctcac cgcttccgcc180gactctgttc gcgcttacct gaagcaaatc ggtaaagttg ccctgctgaa cgctgaacag240gaagtctccc tggcaaagcg catcgaagca ggcctttacg ccacccaccg catggaggaa300atggaagaag ctttcgcagc cggtgacaag gacgcgaaac tcaccccagc cgtcaagcgt360gacctccgcg ccatcgctcg tgacggccgc aaggcgaaaa accacctcct ggaagccaac420cttcgtctgg ttgtctccct ggcaaagcgc tacaccggcc gtggcatggc attcctggac480ctcatccagg aaggcaacct cggtctgatt cgtgccgtag agaagttcga ctactccaag540ggctacaagt tctccaccta cgcaacctgg tggatccgtc aggcaatcac ccgcgccatg600gccgaccaag cacgaaccat ccgtatccca gtccacatgg ttgaagtgat caacaaactt660ggtcgcatcc aacgtgaact ccttcaggaa ctcggccgcg aaccaacccc acaggaactg720tccaaagaaa tggacatctc cgaggaaaag gtactggaaa tccagcagta cgcccgcgaa780ccaatctccc tggaccaaac catcggcgac gaaggcgaca gccagctcgg cgacttcatc840gaagactccg aagtcgtcgt cgcagtcgac gccgtctcat tcaccctgct gcaagaccag900ctacaggacg tcctagagac cctctccgaa cgtgaagccg gcgtggttaa actccgcttc960ggactcaccg acggaatgcc acgcacttta gacgaaatcg gccaagttta cggtgtcacc1020cgtgagcgca tccgccagat tgagtccaag accatgtcta agctgcgcca cccatcacgc1080tcccaggtcc ttcgcgacta cctggactaa aaccccagtc gggctcaaga cagggccgcc1140actgttttcc tctgcgggga acggtggtgg cccggttttt ctgttgcttt ggttcggctg1200gtcacagttc ggctggggtg ttttaagttt gatttcacat tgccgatttc taaacgccga1260gttctcggat tcgagacctt acctgcaatt tcacggttac aatttctcgt tagcactttc1320gcgtactcaa tttcttatgt tcaatttcgg tcggaaaagt gccattttcc gacatcgcct1380tgagaaattg aatacaagaa attgagcgca aggtatcgaa cttgagaaat tgagctttag1440cactcactcc cctgtttgat gaagtcagca aagccaaaag acgacttcac atctccgact1500tcttaacagc gacttctcgt ggctgacttc gctacctaaa cctgagtttc cttagcgaag1560tcgtgtgatg agaagtcgtg tgatgagaag ttgggtatga gaagtcagca cacgtgaagt1620cgccttttct ccccggcacg ctcggagtag cgtgaaaggt ggaatggagc gaggtggaac1680ggaattcca1689
<210>8<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Description of the artificial sequenceprimer sigA-1<400>8tgatcggctg accaactcta 20<210>9<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Description of the artificial sequenceprimer sigA-2<400>9aaggtctcga atccgagaac 20<210>10<211>28<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>Description of the artificial sequenceprimer sigA_XL-Al<400>10acgaattccg acggcgatga cttcgtag28<210>11<211>28<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>Description of the artificial sequenceprimer sigA_XL-A2<400>11tggaattccg ttccacctcg ctccattc28<210>12<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)
<223> Description of the artificial sequenceprimer sA_1<400>12aagttctcca cctacgcaac 權(quán)利要求
1.源自棒狀細菌并編碼蛋白質(zhì)σ因子A的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其中在相關(guān)的氨基酸序列中，SEQ ID NO2的第414位L-丙氨酸由另一個蛋白原性氨基酸置換。
2.權(quán)利要求1的源自棒狀細菌并編碼蛋白質(zhì)σ因子A的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其中相關(guān)氨基酸序列在第414位含有L-纈氨酸，如SEQ ID NO4所示。
3.權(quán)利要求1的源自棒狀細菌并編碼蛋白質(zhì)σ因子A的可復(fù)制的核苷酸序列(DNA)，其堿基序列在第1241位含有胸腺嘧啶，如SEQID NO3所示。
4.含有權(quán)利要求1-3任一項的核苷酸序列并任選地在棒狀細菌中復(fù)制的質(zhì)粒(載體)。
5.含有權(quán)利要求1-4任一項的核苷酸序列的棒狀細菌，在所述棒狀細菌中編碼σ因子A的核苷酸序列優(yōu)選地以超量表達形式存在。
6.含有編碼σ因子A的核苷酸序列的棒狀細菌，其中在相關(guān)的氨基酸序列中，SEQ ID NO2的第414位L-丙氨酸由另一個蛋白原性氨基酸置換。
7.生產(chǎn)L-賴氨酸或包含L-賴氨酸的食品添加劑的方法，其中包括進行以下步驟a)發(fā)酵棒狀細菌，所述棒狀細菌中內(nèi)源sigA基因的等位基因在適于形成sigA基因產(chǎn)物σ因子A的條件下超量表達；b)從發(fā)酵肉湯、形成L-賴氨酸的棒狀細菌中分離L-賴氨酸或包含L-賴氨酸的食品添加劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中采用的是含有sigA基因等位基因的棒狀細菌，其中在相關(guān)的氨基酸序列中，SEQ ID NO2的第414位的L-丙氨酸由另一個蛋白原性氨基酸置換。
9.權(quán)利要求7的方法，其中采用的微生物中L-賴氨酸生物合成途徑的其它基因被額外超量表達。
10.權(quán)利要求7的方法，其中采用的微生物中降低L-賴氨酸形成的代謝途徑被至少部分消除。
11.生產(chǎn)L-賴氨酸或包含L-賴氨酸的食品添加劑的方法，其中進行以下步驟a)發(fā)酵含有編碼蛋白質(zhì)σ因子A的內(nèi)源核苷酸序列的棒狀細菌，其中在相關(guān)的氨基酸序列中，第414位L-丙氨酸由另一個蛋白原性氨基酸置換，優(yōu)選地用L-纈氨酸置換；b)濃縮發(fā)酵肉湯中的L-賴氨酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離L-賴氨酸或包含L-賴氨酸的食品添加劑，任選地d)伴有發(fā)酵肉湯中組分和/或生物量(＞0-100％)。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自棒狀細菌的編碼σ因子A的sigA基因的等位基因，本發(fā)明還涉及使用含有這些等位基因的細菌發(fā)酵生產(chǎn)L－賴氨酸的方法。
文檔編號C12N1/21GK1606617SQ02825477
公開日2005年4月13日 申請日期2002年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月20日
發(fā)明者布麗吉特·巴特, 斯特凡·漢斯, 卡羅琳·賴內(nèi)恩, 瓦爾特·普費弗勒 申請人:德古薩股份公司