專利名稱：通過(guò)全面檢測(cè)和定量食物中毒細(xì)菌的熱穩(wěn)定直接溶血素相關(guān)的基因 ( t d h ) 相關(guān)溶 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及簡(jiǎn)捷、快速、準(zhǔn)確地對(duì)熱穩(wěn)定溶血素(hemolysin)蛋白組的基因進(jìn)行檢測(cè)、定量分析和分類的方法，所述熱穩(wěn)定溶血素蛋白組指的是TDH(熱穩(wěn)定直接溶血素)、TRH(TDH相關(guān)溶血素)和其它類似的溶血蛋白，下文稱為TDH相關(guān)毒素，它們是由弧菌屬病原菌，如副溶血弧菌、部分霍亂弧菌、最小弧菌和霍氏弧菌產(chǎn)生的。即，本發(fā)明涉及了漁業(yè)、食品工業(yè)、公共衛(wèi)生、臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
弧菌屬病原菌，包括副溶血弧菌、部分霍亂弧菌、最小弧菌、霍氏弧菌，是食品衛(wèi)生控制中重要的細(xì)菌種群?？谇桓腥竞髸?huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的癥狀，并可導(dǎo)致患者死亡。在日本，副溶血弧菌食物中毒的發(fā)生率尤其高，在食物中毒的起因中通常居前列。出于此考慮，有必要檢測(cè)主要感染源-未烹飪的魚、海產(chǎn)品中的副溶血弧菌。只有一些攜帶熱穩(wěn)定溶血素蛋白(熱穩(wěn)定直接溶血素TDH)基因和有類似毒素蛋白(TDH相關(guān)溶血素TRH)基因的弧菌屬細(xì)菌才是食物中毒的病因。在食品衛(wèi)生站點(diǎn)，食品衛(wèi)生控制是通過(guò)設(shè)定食物中的副溶血弧菌總數(shù)容許量的上限來(lái)實(shí)現(xiàn)的。其前提是產(chǎn)毒素細(xì)菌在從食物(易腐爛的魚和海產(chǎn)品)中分離的副溶血弧菌中占有一定比例或更多。具體地說(shuō)，依照“食品衛(wèi)生檢查指南”對(duì)懷疑是副溶血弧菌的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果細(xì)菌數(shù)量等于或少于參照值(100cfu/g或更低)，食品就是安全的(依照日本厚生勞動(dòng)省，藥品和食品安全局，食品安全處，標(biāo)準(zhǔn)分處的第22號(hào)公告)。
如上所述，病原性副溶血弧菌僅是那些能產(chǎn)生TDH或TRH的副溶血弧菌。此外，TDH也存在于除副溶血弧菌外的其它弧菌屬細(xì)菌中。因此，從更廣的角度來(lái)說(shuō)，食物中毒的預(yù)防和合乎需要的控制不應(yīng)該用副溶血弧菌的數(shù)量作為指標(biāo)，而是以是否有產(chǎn)TDH或TRH的細(xì)菌的存在或其數(shù)量作為。
據(jù)報(bào)道除了副溶血弧菌外的弧菌屬細(xì)菌，即非01霍亂弧菌、霍氏弧菌和最小弧菌的一些菌株具有產(chǎn)生TDH的基因tdh(Infect.Immun.，52，319-322，1986，J Bacteriol.，171，6859-6861，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.，84，249-254，1990)。已發(fā)現(xiàn)TDH相關(guān)毒素蛋白是從弧菌屬的實(shí)際病原菌的門(phylum)獨(dú)立進(jìn)化而來(lái)，弧菌屬病原菌通過(guò)水平傳播(horizontal transmission)獨(dú)立地獲得每種毒素(J.Bacteriol.，173，5036-5046)。因此，似乎有一種可能就是除了已知產(chǎn)毒菌株外的其它菌株獲得并保留了TDH相關(guān)毒素的基因。依此觀點(diǎn)，在食品衛(wèi)生控制站點(diǎn)檢測(cè)和定量確定能夠產(chǎn)生TDH相關(guān)毒素蛋白的實(shí)際細(xì)菌是理想的(ideal)。但是，并沒(méi)有一個(gè)靈活可信的檢測(cè)和定量確定TDH相關(guān)毒素的方法，因此，在食品衛(wèi)生控制站點(diǎn)很難切實(shí)執(zhí)行。
發(fā)明公開發(fā)明所要解決的問(wèn)題如上所述，在食品衛(wèi)生控制站點(diǎn)對(duì)能夠產(chǎn)生TDH相關(guān)毒素蛋白的實(shí)際細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)和定量是理想的。為此目的展開的TDH相關(guān)毒素蛋白編碼基因的全面檢測(cè)和拷貝數(shù)的定量分析也是合適的。檢測(cè)和定量確定TDH相關(guān)毒素蛋白使得檢測(cè)和定量確定可能有相同毒性和病原性的細(xì)菌成為可能。
然而，用這種方法檢測(cè)存在著很大的技術(shù)問(wèn)題。具體地說(shuō)，沒(méi)有一種方法能夠同時(shí)并全面地檢測(cè)TDH相關(guān)毒素蛋白組所有已知的基因類型。相應(yīng)地，當(dāng)進(jìn)行基因擴(kuò)增(比如使用引物的PCR法)和檢測(cè)時(shí)，必須單獨(dú)設(shè)計(jì)引物的類型，并且必須同時(shí)使用大量的引物進(jìn)行檢測(cè)。因此，這種方法是不實(shí)際的。另外，后文會(huì)提到，把現(xiàn)存的引物結(jié)合使用很可能不能檢測(cè)到所有的TDH相關(guān)毒素基因。
TDH是一種被認(rèn)為引起神奈川(Kanagawa)現(xiàn)象的溶血素，神奈川現(xiàn)象與副溶血弧菌食物中毒的病因有關(guān)，會(huì)出現(xiàn)人紅細(xì)胞的溶血。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，純化的TDH與施用活細(xì)胞的一例樣本產(chǎn)生相似的特性，因此，TDH被認(rèn)為是致病因子。另一方面，TRH被發(fā)現(xiàn)于來(lái)源于不出現(xiàn)神奈川現(xiàn)象的食物中毒患者的菌株。TRH在氨基酸水平與TDH有大約68％的同源性，但與TDH不同，TRH是熱不穩(wěn)定溶血素(Infect.Immun.，56，961-965，1988)。
已知編碼TRH的trh基因包括兩型(trh1和trh2)，它們有大約16％的核苷酸序列互不相同(Appl.Environ.Microbiol.，58，2449-2457，1992)。此外，比較TDH型毒素組(group)和TRH毒素組的氨基酸序列會(huì)發(fā)現(xiàn)，這兩種毒素組都經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)期的演化過(guò)程并獲得了各自的基因多樣性(diversity)。因此，可能會(huì)存在具有未知的中間類型序列的毒素。事實(shí)上已經(jīng)有報(bào)道，來(lái)源于霍氏弧菌一些菌株的tdh基因與其它弧菌屬細(xì)菌(如副溶血弧菌)的tdh基因有系統(tǒng)發(fā)生上的不同(Microbiol.Immunol.，40，59-65，1996)。此報(bào)道還表明3個(gè)檢測(cè)tdh基因的現(xiàn)有PCR引物對(duì)中的2個(gè)不能完全檢測(cè)出被檢霍氏弧菌的每個(gè)tdh基因類型。此外，據(jù)報(bào)道，就trh基因而言，trh1和trh2基因存在菌株之間的核苷酸序列的差異(Appl.Evniron.Microbiol.，58，2449-2457，1992)。但是，在設(shè)計(jì)檢測(cè)trh基因的現(xiàn)有PCR引物時(shí)并沒(méi)有考慮這trh1和trh2基因核苷酸序列間的不同，所以很難說(shuō)這種檢測(cè)trh基因的PCR引物令人滿意。實(shí)際在本發(fā)明的方法中，發(fā)現(xiàn)了一種與TRH類似并且用標(biāo)準(zhǔn)引物很難擴(kuò)增的新的毒素基因。這些結(jié)果強(qiáng)有力地表明除了現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的基因外還可能有TDH相關(guān)毒素基因存在。
現(xiàn)在，分別用于檢測(cè)產(chǎn)生TDH的tdh基因和產(chǎn)生TRH的trh基因的PCR引物(僅檢測(cè)tdh基因的引物，僅檢測(cè)trh1的引物和同時(shí)檢測(cè)trh1和trh2基因的引物)已經(jīng)被應(yīng)用于毒素基因的測(cè)試(JapanesePatent Laid-Open No.4-293486，Mol.Cell.Probes，6477-487，1992)，而且，它們作為一種研究副溶血弧菌的試劑已經(jīng)出現(xiàn)在市場(chǎng)上。但是由于上述原因，沒(méi)有一種商品試劑可以提供檢測(cè)和定量確定食物中TDH相關(guān)毒素或毒素基因的方法。也就是說(shuō)，如果在食品衛(wèi)生控制站點(diǎn)使用這種試劑，就需要同時(shí)使用多種檢測(cè)系統(tǒng)，即便如此，仍然可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
解決問(wèn)題的方式作為解決上述問(wèn)題的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了TDH和TRH蛋白存在高度保守區(qū)。具體地說(shuō)，通過(guò)對(duì)TDH和TRH已知氨基酸序列的多重比對(duì)(multi-alignment)分析，我們發(fā)現(xiàn)了TDH和TRH中有高度同源性的區(qū)域。由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的特征在于，可同時(shí)檢測(cè)溶血素基因tdh和trh，方法是利用核苷酸序列設(shè)計(jì)混合引物(退變引物(degenerate primers))，所述核苷酸序列相應(yīng)于與具有不同序列的兩種類型的溶血素高度同源的氨基酸序列；用PCR方法擴(kuò)增編碼兩種類型的溶血素的tdh和trh基因的片段；從產(chǎn)TDH和產(chǎn)TRH菌株中獲取擴(kuò)增片段，其序列的側(cè)翼是引物。此外，本發(fā)明的特征還在于可以確定毒素類型，功能上與TDH和TRH類似的未知毒素基因片段也可以被檢測(cè)出來(lái)。
附圖的簡(jiǎn)單描述[

圖1]圖1a-1c基于現(xiàn)有的TDH和TRH氨基酸序列進(jìn)行多重排列分析的結(jié)果刪除Entrez蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)里的13種類型的TDH氨基酸序列(8種類型的副溶血弧菌，1種類型的最小弧菌，1種類型的霍亂弧菌和3種類型的霍氏弧菌)和3種類型的TRH氨基酸序列(只有副溶血弧菌)的信號(hào)肽序列(第一部分中的24個(gè)氨基酸)，然后進(jìn)行多重排列分析。細(xì)菌種類名稱和毒素類型后面以“”分隔的數(shù)字代表數(shù)據(jù)庫(kù)的登記號(hào)。
圖2瓊脂糖凝膠電泳的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析泳道1100bp梯狀標(biāo)記(ladder marker)；泳道2IFO12711T(trh)；泳道3V89-655(trh1)；泳道4V89-656(tdh)；泳道5V99-157(tdh)；泳道6V99-161(tdh)泳道7V99-177(tdh)；泳道8V99-215(tdh)；泳道9V99-223(tdh)；泳道10陰性對(duì)照(無(wú)DNA)[圖3]圖3PCR擴(kuò)增的DNA片段系統(tǒng)發(fā)生樹(phylogenetic trees)系統(tǒng)發(fā)生樹是在把被分析核酸序列翻譯成氨基酸序列后用neighbor-joining(NJ)方法建立的。本發(fā)明分析的數(shù)據(jù)以符號(hào)*標(biāo)示。對(duì)未用*號(hào)標(biāo)示的數(shù)據(jù)，使用Entrez蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列(在圖中，“”后的數(shù)字代表數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào))。
副溶血弧菌模式菌株(IFO12711T)所含的TRH用←標(biāo)示。
圖4通過(guò)熔解曲線分析擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的Tm值將Light cycler擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以每秒鐘0.1℃的速率從65℃上升到95℃，接著分析擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。用Light cycler附帶的Lightcycler軟件(第3版)進(jìn)行分析。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式根據(jù)本發(fā)明，可以檢測(cè)可能產(chǎn)生溶血素的弧菌屬細(xì)菌，并用混合核酸序列鑒定毒素類型，所述混合核酸序列編碼TDH和TRH氨基酸序列中一部分共同序列，所述TDH和TRH分別由一些弧菌屬細(xì)菌的tdh和trh基因編碼。
用Clustal W計(jì)算機(jī)程序?qū)?3種類型的已知熱穩(wěn)定型溶血素TDH和3種類型的TDH相關(guān)毒素TRH的氨基酸序列進(jìn)行多重排列分析(圖1)，發(fā)現(xiàn)兩種毒素中都存在高度保守的氨基酸序列。緊接著，用相同的混合引物來(lái)研究tdh和trh基因是否能用PCR方法擴(kuò)增，所述引物是將這些氨基酸序列反向翻譯成核酸序列產(chǎn)生的。
高度保守氨基酸序列的例子包括(1)LPS(V或I)PFP(A或S)PGSDE(L或I)LFVVR，(2)KRKPY，(3)Y(M或I)TV(N或S)IN，(4)YTMAA(V或L)SGYK，(5)YLDETP(E或S)YFV，(6)VEAYESG和(7)VMCISNK。這些序列分別與序列表中SEQ ID NO1的氨基酸位置相應(yīng)。具體地說(shuō)，序列(1)與氨基酸位置3-21相應(yīng)；序列(2)與45-49；序列(3)與69-75；序列(4)與79-88；序列(5)與126-135；序列(6)與137-143；序列(7)與149-155相應(yīng)。(α或β)的意思是在括號(hào)的位置是氨基酸α或β。例如，(5)YLDETP(E或S)YFV表示YLDETPEYFV或者YLDETPSYFV。
特別優(yōu)選的高度保守氨基酸序列的例子包括氨基酸序列(1)LPS(V或I)PFPE(A或S)PGSD(L或I)LFVVLR中的DE(L或I)LFVV；(6)VEAYESG；(3)Y(M或I)TV(N或S)IN中的YMTVNIN；和(5)YLDETP(E或S)YFV中的DETPEYFV。
制備編碼這些氨基酸序列的全部或部分的混合引物。這些混合引物的例子包括編碼DE(L或I)LFVV的正義(sense)引物5’-gaygarhtnytnttygtngt-3’，和編碼VEAYESG的反義引物5’-ccnswytcrtangcytcnac-3’(在本說(shuō)明書中n代表a，t，c或g)。用這些引物擴(kuò)增樣品，可用一次實(shí)驗(yàn)輕松地檢測(cè)出tdh和trh基因。
此外，與以上tdh和trh基因類似的未知溶血素的基因也可以用這些引物檢測(cè)。在這種情況下，先將一個(gè)已知序列加入每種引物的5’末端，以便能用擴(kuò)增的片段進(jìn)行直接的序列反應(yīng)。用添加了已知序列的引物作為序列引物可以直接檢測(cè)核酸序列，而不用克隆擴(kuò)增的DNA片段。
對(duì)本發(fā)明的擴(kuò)增DNA片段的分析結(jié)果也可以用實(shí)時(shí)PCR分析中的溶解曲線分析等來(lái)評(píng)價(jià)，不用確定核苷酸序列，如實(shí)施例所示。
本發(fā)明包括檢測(cè)、定量確定或鑒別溶血素基因的試劑盒，它使用了基于上述氨基酸序列設(shè)計(jì)的混合引物，以及其他藥劑的組合。
實(shí)施例[實(shí)施例1]用圖1所示的高度保守區(qū)域，設(shè)計(jì)編碼(1)來(lái)自LPS(V或I)PFP(A或S)PGSDE(L或I)LFVVLR的DE(L或I)LFVV的正義引物5’-gaygarhtnytnttygtngt-3’，和編碼(6)VEAYESG的反義引物5’-ccnswytcrtangcytcnac-3’。這些引物分別與副溶血弧菌的TDH氨基酸位置38-44和161-167相應(yīng)。前一種混合引物有3072種組合，后一種混合引物有2048種混合。用引物的組合可以通過(guò)PCR獲取386bp擴(kuò)增DNA片段。但獲得的DNA片段可能是一種未知溶血素基因。因此，先將已知序列(正義側(cè)5’-caggaaacagctatgacc-3’，反義側(cè)5’-tgtaaaacgacggccagt-3’)加入到每個(gè)引物的5’末端，使之能用擴(kuò)增片段進(jìn)行直接序列反應(yīng)。用添加了已知序列的引物作為序列引物可以直接確定核苷酸序列，而不用克隆擴(kuò)增的DNA片段。此外，加入該序列后擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物是422bp。
用上述引物通過(guò)PCR擴(kuò)增毒素基因片段，所使用的模板是用標(biāo)準(zhǔn)方法從表1所列的8種已知能產(chǎn)FDH或TRH的副溶血弧菌菌株中提取的染色體DNA。
擴(kuò)增反應(yīng)用熱穩(wěn)定DNA聚合酶(AmpliTaq GoldAppliedBiosystems)和GENE MATE熱循環(huán)儀(ISC BioExpress)進(jìn)行。制備終體積為50μl反應(yīng)液，包含0.1μg DNA，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，2.0mM MgCl2，0.01％明膠，dNTP(每種0.2mM)，2.5UAmpliTaq Gold和引物(每種1μM)。反應(yīng)條件包括AmpliTaq Gold激活(95℃ 10分鐘)；95℃ 1分鐘的5個(gè)反應(yīng)循環(huán)，45℃ 40秒，72℃1分30秒；94℃ 1分鐘的35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，46℃ 40秒，72℃ 1分30秒；然后72℃ 10分鐘進(jìn)行延伸反應(yīng)。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠(Sea Plaque GTG瓊脂糖BioWhittaker MolecularApplications)電泳(0.5×TAE，100V 30分鐘)，溴乙錠染色10分鐘。紫外燈照射下確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
結(jié)果，如圖2所示，對(duì)所有產(chǎn)生TDH或TRH菌株的DNA，確認(rèn)了422bp的DNA片段的擴(kuò)增。
依標(biāo)準(zhǔn)方法切下含擴(kuò)增片段的凝膠并提純，用上述序列引物以雙脫氧法確定核苷酸序列。
核苷酸序列用ABI PRISM BigDye Terminator Cycle SequenceingReady Reaction Kit(Applied Biosystems)和ABI PRISM 310 GENETICANALYZER(Applied Biosystems)確定。
產(chǎn)生的核酸序列(SEQ ID NO41-46)被翻譯成氨基酸序列，并確認(rèn)為編碼TDH和TRH的基因。
一直被報(bào)道具有trh2基因的副溶血弧菌模式菌株IFO12711T(副溶血弧菌專題會(huì)概述，No.33，1999Clinical Microbiology，27，p239，2000)的一種毒素基因，被顯示是一種新的基因(SEQ ID NO40)，與trh2基因序列有所不同(氨基酸水平有80％的同源性，核酸水平有91％的同源性)，并且與目前所知道的基因不同(表3)。
所以，以基于TDH和TRH蛋白的高度同源區(qū)的氨基酸序列的混合引物可以同時(shí)檢測(cè)tdh和trh基因，并檢測(cè)未知的TDH相關(guān)毒素基因。
表1 本研究中所用的副溶血弧菌菌株
用圖1所示的高度同源區(qū)域，設(shè)計(jì)編碼Y(M或I)TV(N或S)IN中的YMTVNIN的正義引物5’-tayatgacngtnaayathaayg-3’和編碼YLDETP(E或S)YFV中的DETPEYFV的反義引物5’-acraartaytcnggngtytcrtc-3’。引物分別與副溶血弧菌TDH的氨基酸位置100-106和152-159相應(yīng)。兩種引物都是混合引物，有512種組合。用這些引物的組合可以擴(kuò)增出180bp的DNA片段。
檢測(cè)和確定溶血素基因可以使用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，并使用LightCycler System(Roche Diagnostics Co.，Ltd.)，其模板染色體DNA來(lái)源于產(chǎn)TDH菌株，1型產(chǎn)TRH菌株和副溶血弧菌模式菌株(IFO12711T)，后者被證明能生成一種新的TRH。以LightCycler-DNAMaster SYBR Green I kit(Roche Diagnostics Co.，Ltd.)作為反應(yīng)液，加0.1μg DNA，制成終體積為20μl的反應(yīng)液。為進(jìn)行自動(dòng)熱啟動(dòng)，用抗Taq聚合酶的抗體(Taq Start AntibodyClontech)失活Light Cycler DNAMaster mix SYBR Green I。
反應(yīng)條件包括激活Taq聚合酶(95℃ 90秒)；95℃ 0秒，44℃10sec，72℃ 30sec的5個(gè)反應(yīng)循環(huán)；然后進(jìn)行94℃ 0秒，45℃ 10秒，72℃ 30秒的35個(gè)反應(yīng)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，溫度以0.1℃/秒的速率從65℃升至95℃，然后分析擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線。
通過(guò)分析從所有DNA中確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物。熔解曲線分析顯示，tdh基因片段，trh1基因片段和一個(gè)新的trh基因片段都顯示了不同的Tm值(特異性熔解溫度)，可以很容易地被鑒別(圖4)。
用熱循環(huán)儀確認(rèn)目的基因所經(jīng)歷的標(biāo)準(zhǔn)的從擴(kuò)增到電泳的過(guò)程需要3-4小時(shí)。但使用本發(fā)明的實(shí)時(shí)PCR僅需要40分鐘，包括從目的基因的擴(kuò)增到熔解曲線的分析，和同時(shí)確認(rèn)毒素類型。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明為全面檢測(cè)編碼TDH相關(guān)毒素蛋白組的多種基因群提供了一種通用方法，所述蛋白組有不同的氨基酸序列。此方法能快速檢測(cè)食品(尤其是鮮食的易腐壞的魚和海產(chǎn)品)中是否含有任何攜帶有TDH相關(guān)毒素蛋白基因的細(xì)菌。當(dāng)存在具有毒素基因的細(xì)菌時(shí)，此法能快速評(píng)價(jià)食品安全性，因?yàn)榭梢杂么朔ù_定帶有毒素基因的細(xì)菌的數(shù)目。因此本發(fā)明可以極大地預(yù)防食物中毒，提高食品制造和食品銷售領(lǐng)域衛(wèi)生監(jiān)控的有效性和高度準(zhǔn)確性。
本發(fā)明使人們能夠檢測(cè)食物中毒患者的糞便和食物中是否有TDH相關(guān)毒素蛋白基因，并快速確定毒素類型。此外還可以鑒定從糞便或食物中分離的菌株是否有TDH相關(guān)毒素蛋白基因，如果菌株有這種基因，還可以快速確定毒素類型。
本說(shuō)明書引入2001年10月18提交日本專利局的專利申請(qǐng)2001-320403(已要求優(yōu)先權(quán))的說(shuō)明書和附圖的內(nèi)容作為參考。
序列表<110>NICHIREI CORPORATION<120>通過(guò)全面檢測(cè)和定量食物中毒細(xì)菌的熱穩(wěn)定直接溶血素相關(guān)基因(tdh相關(guān)溶血素基因)對(duì)產(chǎn)溶血素細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)和定量的方法<130>PH-1547PCT<140>JP 2001-320403<141>2001-10-18<160>46<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>149<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>1Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Glu Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys His Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asp Ser Val Ala Asn100 105 110Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
115 120 125Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu130 135 140Cys Lys His Gln Gln145<210>2<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>2Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Glu Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys His Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asp Ser Val Ala Ser100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Gln Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160
Cys Lys His Gln Gln165<210>3<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>3Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Asn Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asn Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Lys Tyr Gln Asn165
<210>4<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>4Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Glu Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys His Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asp Ser Val Ala Ser100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Lys His Gln Gln165<210>5<211>165<212>PRT
<213>副溶血弧菌<400>5Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Gln Ala Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Ser Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Gly Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Gly Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Lys His Gln Gln165<210>6<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>6Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Gln Ala Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Ser Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Gly Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Lys His Gln Gln165<210>7<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>7Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Ala Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30
Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Arg Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Lys Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Glu His Gln Lys165<210>8<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>8Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Ala Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45
Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Arg Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Glu His Gln Lys165<210>9<211>165<212>PRT<213>霍亂弧菌<400>9Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asn Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asp Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Lys Tyr Gln Asn165<210>10<211>165<212>PRT<213>最小弧菌<400>10Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Ala Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asp Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Ser Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95
Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Val Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Glu His Gln Arg165<210>11<211>165<212>PRT<213>霍氏弧菌<400>11Phe Glu Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Glu Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn Asn Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Ser Ser Val Phe Val85 90 95Lys Ser Gly Gln Ile Gln Leu Gln His Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asp100 105 110
Phe Val Gly Gly Asp Glu Asn Ser Ile Pro Ser Lys Thr Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Ser Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Tyr Phe Glu145 150 155 160Cys Glu Glu Gln Gln165<210>12<211>165<212>PRT<213>霍氏弧菌<400>12Phe Glu Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Glu Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn Asn Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Ser Ser Val Phe Val85 90 95Lys Ser Gly Gln Ile Gln Leu Gln His Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asp100 105 110Phe Val Gly Gly Asp Glu Asn Ser Ile Pro Ser Lys Thr Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Ser Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Tyr Phe Glu145 150 155 160Cys Glu Glu Gln Gln165<210>13<211>165<212>PRT<213>霍氏弧菌<400>13Phe Glu Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Glu Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val His Gly Gln Ser Val Phe Ile Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn Asn Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Ser Ser Val Phe Val85 90 95Lys Ser Gly Gln Ile Gln Leu Gln His Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asp100 105 110Phe Val Gly Gly Asp Glu Asn Ser Ile Pro Ser Lys Thr Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Tyr Phe Glu145 150 155 160
Cys Glu Ser Gln Gln165<210>14<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>14Ile Asp Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asn Thr Thr Ile Lys Thr Glu Ser Pro Val Asn20 25 30Ala Ile Val Asn Asp Tyr Trp Thr Asn Arg Asn Ile Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Ser Val His Gly Gln Ser Ile Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys50 55 60Trp Leu Ser Ala Tyr Ile Thr Val Asn Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Leu Ser Thr Val Phe Thr85 90 95Lys Ser Glu Lys Thr Ser Leu Asn Gln Asn Tyr Ser Ser Val Ser Asp100 105 110Phe Val Gly Glu Asn Glu Glu Ser Leu Pro Ser Val Thr Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Asn130 135 140Gly His Met Phe Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Ser Ser Phe Asp Glu145 150 155 160Cys Met Ser Gln Asn165
<210>15<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>15Ile Asp Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asn Thr Thr Ile Lys Thr Glu Ser Pro Val Asn20 25 30Ala Ile Val Asp Asp Tyr Trp Thr Asn Arg Asn Ile Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Ser Val His Gly Gln Ser Ile Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys50 55 60Trp Leu Ser Ala Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Leu Ser Thr Val Phe Thr85 90 95Lys Ser Glu Lys Thr Ser Leu Asn Gln Asn Tyr Ser Ser Val Ser Asp100 105 110Phe Val Gly Glu Asn Glu Glu Ser Leu Pro Ser Val Thr Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Asn130 135 140Gly His Met Phe Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Ser Ser Phe Asp Glu145 150 155 160Cys Met Ser Gln Asn165<210>16<211>165<212>PRT
<213>副溶血弧菌<400>16Ile Asp Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asn Thr Thr Ile Lys Thr Glu Ser Pro Val Lys20 25 30Ala Ile Val Glu Asp Tyr Trp Thr Asn Arg Thr Ile Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ala Gly Ser Lys50 55 60Trp Leu Ser Ala Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Gly His Asn Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys His Gly Thr Ser Thr Val Phe Thr85 90 95Lys Ser Glu Lys Thr Ser Leu Asn Gln Asp Phe Tyr Ser Val Lys Ser100 105 110Phe Val Asp Asp Ser Glu Glu Ser Ile Pro Ser Ile Asn Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Thr Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Asn130 135 140Gly His Met Phe Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Leu Ser Phe Gly Glu145 150 155 160Cys Lys Ser Gln Ile165<210>17<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段
<400>17Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Leu Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>18<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>18Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>19<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>19Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>20<211>19<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>20Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>21<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>21Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>22<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>22Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg
<210>23<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>23Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Leu Ile Leu1 5 10 15Phe Val Val Arg20<210>24<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>24Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>25<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>25Lys Arg Lys Pro Tyr1 5
<210>26<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>26Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn1 5<210>27<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>27Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn1 5<210>28<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>28Tyr Ile Thr Val Asn Ile Asn1 5<210>29<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>29Tyr Ile Thr Val Ser Ile Asn1 5<210>30<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>30Tyr Thr Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys1 5 10<210>31<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>31Tyr Thr Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys1 5 10<210>32<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段
<400>32Tyr Leu Asp Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val1 5 10<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>33Tyr Leu Asp Glu Thr Pro Ser Tyr Phe Val1 5 10<210>34<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>34Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly1 5<210>35<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>35Val Met Cys Ile Ser Asn Lys1 5
<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述編碼TDH、TRH或類似溶血素的基因的引物<220>
<221>
<222>9，12，18<223>n表示a，g，c或t<400>36gaygarhtny tnttygtngt 20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述編碼TDH、TRH或類似溶血素的基因的引物<220>
<221>
<222>3，12，18<223>n表示a，g，c或t<400>37ccnswytcrt angcytcnac 20<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述編碼TDH、TRH或類似溶血素的基因的引物<220>
<221>
<222>12，15<223>n表示a，g，c或t<400>38acraartayt cnggngtytc rtc23<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述編碼TDH、TRH或類似溶血素的基因的引物<220>
<221>
<222>9，12<223>n表示a，g，c或t<400>39tayatgacng tnaayathaa yg22<210>40<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌IFO12711T<400>40gttagaaata caacaatcaa aactgaatcc ccggttaagg caattgtgga ggactattgg 60acaaaccgaa acataaaaag aaaaccatac aaagatgtat acggtcaatc ggttttcaca 120acagcaggtt caaagtggtt aagcgcctat atgacagtaa acatcaatgg tcataactat 180acgatggcag ctctttctgg ttataaagat ggtatttcta cggtcttcac aaaatcagag 240aaaacaagcc taaagcaaga ctattcctcg gtaaaatatt ttgttgatga caacgaagaa 300tcaataccaa gtgtaactta tttagatgaa acatcagaat actttgttac tgt 353<210>41<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌V89 655<400>41gttagaaata caacaataaa aactgaatca ccagttaacg caatcgttaa tgactactgg 60
acaaaccgaa acataaaacg aaaaccatat aaaagcgttc acggtcaatc tattttcacg 120acttcaggct caaaatggtt aagcgcctat ataacggtaa atattaatgg aaataactac 180acaatggctg ctctttctgg ctataaagat ggcctttcaa cggtcttcac aaaatcagaa 240aaaacaagcc taaatcagaa ctattcttct gttagtgatt tcgttggtga aaatgaagaa 300tcattgccaa gtgtaacgta tttggatgaa acgccagaat atttcgtcaa tgt 353<210>42<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌V89 656<400>42gttcgagata caacttttaa tacccaagct ccggtcaatg taaaggtctc tgacttttgg 60acaaaccgta atgtaaaaag aaaaccgtac aaagatgttt atggtcaatc agtattcaca 120acgtcaggta ctaaatggct gacatcctac atgactgtga acattaatga taaagactat 180acaatggcag cggtgtctgg ctataagcgc ggtcattctg ctgtgttcgt aaaatcagat 240caagtacagc ttcaacattc ctatgattct gtagctaact ttgttggtga agatgaaggt 300tctattccaa gtaaaatgta tttggatgaa actccagaat attttgttaa tgt 353<210>43<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌V99 157<400>43gttcgagata caacttttaa tacccaagct ccggtcaatg taaaggtctc tgacttttgg 60acaaaccgta atgtaaaaag aaaaccgtac aaagatgttt atggtcaatc agtattcaca 120acgtcaggta ctaaatggtt gacatcctac atgactgtga acattaatga taaagactat 180acaatggcag cggtgtctgg ctataagaac ggtcattctg ctgtgttcgt aaaatcagat 240caagtacagc ttcaacattc ctatgattct gtagctaact ttgttggtga agatgaaggt 300tctattccaa gtaaaatgta tttggatgaa actccagaat attttgttaa tgt 353<210>44<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌V99 161<400>44gttcgagata caacttttaa tacccaagct ccggtcaatg taaaggtctc tgacttttgg 60acaaaccgta atgtaaaaag aaaaccgtac aaagatgttt atggtcaatc agtattcaca 120acgtcaggta ctaaatggct gacatcctac atgactgtga acattaatga taaagactat 180
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1.一種用于檢測(cè)和定量確定攜帶TDH相關(guān)毒素[TDH(熱穩(wěn)定直接溶血素)，TRH(TDH相關(guān)溶血素)]基因的病原菌的方法，包括使用廣泛分布于弧菌屬病原菌中的，編碼熱穩(wěn)定溶血素蛋白組[TDH(熱穩(wěn)定直接溶血素)，TRH(TDH相關(guān)溶血素)和類似溶血素蛋白，下文稱為TDH相關(guān)毒素]的氨基酸序列中存在的共有氨基酸序列的基因序列，由此廣泛而全面地檢測(cè)和定量確定TDH相關(guān)毒素基因。
2.一種全面檢測(cè)和鑒別攜帶TDH相關(guān)毒素基因的細(xì)菌的方法，包括用多種寡核苷酸作為PCR引物對(duì)，完全擴(kuò)增廣泛分布于弧菌屬病原菌中TDH相關(guān)毒素基因的步驟，所述PCR引物對(duì)編碼選自以下氨基酸序列(1)至(7)的至少兩條氨基酸序列中的部分或全部，所述氨基酸序列是權(quán)利要求1中的共有氨基酸，并具有作為實(shí)際引物的功能(1)LPS(V或I)PFP(A或S)PGSDE(L或I)LFVVR，(2)KRKPY，(3)Y(M或I)TV(N或S)IN，(4)YTMAA(V或L)SGYK，(5)YLDETP(E或S)YFV，(6)VEAYESG，(7)VMCISNK。
3.一種擴(kuò)增TDH相關(guān)毒素基因的引物，包括編碼選自以下氨基酸序列(1)至(7)的部分或全部氨基酸序列的寡核苷酸，所述氨基酸序列是權(quán)利要求1中的共有氨基酸(1)LPS(V或I)PFP(A或S)PGSDE(L或I)LFVVR，(2)KRKPY，(3)Y(M或I)TV(N或S)IN，(4)YTMAA(V或L)SGYK，(5)YLDETP(E或S)YFV，(6)VEAYESG，(7)VMCISNK。
4.一種擴(kuò)增TDH相關(guān)毒素基因的引物，其包含編碼氨基酸序列(1)LPS(V或I)PFP(A或S)PGSDE(L或I)LFVVLR中的DE(L或I)LFVV的5’-gaygarhtnytnttygtngt-3’，及其相應(yīng)的互補(bǔ)鏈。
5.一種擴(kuò)增TDH相關(guān)毒素基因的引物，其包含編碼氨基酸序列(6)VEAYESG的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈5’-ccnswytcrtangcytcnac-3’，及其相應(yīng)的互補(bǔ)鏈。
6.一種擴(kuò)增TDH相關(guān)毒素基因的引物，其包含編碼氨基酸序列(3)Y(M或I)TV(N或S)IN中的YMTVNIN的5’-tayatgacngtnaayathaayg-3’，及其相應(yīng)的互補(bǔ)鏈。
7.一種擴(kuò)增TDH相關(guān)毒素基因的引物，其包含編碼氨基酸序列(5)YLDETP(E或S)YFV中的DETPEYFV的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈5’-acraartaytcnggngtytcrtc-3’，及其互補(bǔ)鏈。
8.一種全面檢測(cè)和定量確定產(chǎn)TDH相關(guān)毒素的細(xì)菌的方法，其包括用權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的引物檢測(cè)TDH相關(guān)毒素基因的步驟。
9.一種對(duì)檢測(cè)到的毒素基因編碼的毒素類型進(jìn)行分類的方法，其包括用基因擴(kuò)增系統(tǒng)，用編碼TDH和TRH的氨基酸序列中的共有氨基酸序列的基因序列完全擴(kuò)增TDH相關(guān)毒素基因；分析擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值(特異性熔解溫度)。
10.一種對(duì)產(chǎn)生TDH相關(guān)毒素蛋白的細(xì)菌產(chǎn)生的毒素類型進(jìn)行分類的方法，其中使用了權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的引物。
11.一種試劑盒，用于檢測(cè)和定量確定TDH相關(guān)毒素蛋白的基因和產(chǎn)TDH相關(guān)毒素蛋白的細(xì)菌，或檢測(cè)毒素類型以進(jìn)行分類，所述試劑盒包含權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的引物。
全文摘要
本發(fā)明可以簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確地檢測(cè)、定量確定和鑒別弧菌屬病原菌產(chǎn)生的熱穩(wěn)定溶血素蛋白組[指的是TDH(熱穩(wěn)定直接溶血素)，TRH(TDH相關(guān)溶血素)和其它類似溶血素蛋白，下文稱為TDH相關(guān)毒素]的基因。本發(fā)明為檢測(cè)和定量確定實(shí)際產(chǎn)TDH相關(guān)毒素細(xì)菌提供了一種方法，對(duì)食品衛(wèi)生監(jiān)控具有重要意義。用包含編碼TDH和TRH的共有氨基酸序列的基因序列的引物對(duì)，全面檢測(cè)TDH相關(guān)毒素基因，由此可以檢測(cè)和定量確定產(chǎn)TDH相關(guān)毒素的細(xì)菌。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1606622SQ0282556
公開日2005年4月13日 申請(qǐng)日期2002年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月18日
發(fā)明者小泉雄史, 山本敏, 伊藤武, 中川弘 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日冷