專利名稱：具有改變產(chǎn)物產(chǎn)量特性的真細(xì)菌rna聚合酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離的真細(xì)菌突變體，其包含至少一突變，上述突變導(dǎo)致rpoB基因編碼的RNA聚合酶β-亞基中至少一種氨基酸發(fā)生取代，因此在同等的條件下，與等基因親本株系產(chǎn)生的目的產(chǎn)物的產(chǎn)量相比，上述突變作用導(dǎo)致了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變。本發(fā)明的另一方面涉及在突變真細(xì)菌中生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的方法以及使用本發(fā)明的突變真細(xì)菌生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的用途。
背景技術(shù)：
在多肽的工業(yè)化生產(chǎn)中，人們的興趣是獲得盡可能高的產(chǎn)物產(chǎn)量。增加產(chǎn)量的一條途徑是增加編碼目標(biāo)多肽的基因的拷貝數(shù)，其可以通過將基因置于具有高拷貝數(shù)的質(zhì)粒中來實(shí)現(xiàn)，然而在宿主細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，如果沒有選擇壓力，質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，并且經(jīng)常從宿主細(xì)胞中丟失。另一條增加目標(biāo)基因拷貝數(shù)的途徑是以多拷貝的形式將其整合到宿主細(xì)胞的染色體上。以前已經(jīng)描述過在不使用抗生素標(biāo)記的情況下，通過雙重(double)同源重組的方法可以將基因整合到染色體上(Hone et al.，MicrobialPathogenesis，1988，5407-418)；也有關(guān)于整合兩個(gè)基因的描述(Novo NordiskWO 91/09129和WO 94/14968)。將基因的多個(gè)拷貝整合到宿主細(xì)胞的染色體上導(dǎo)致了不穩(wěn)定性。也有人描述過將空間上緊密相連的反向平行排列的兩個(gè)基因整合能獲得較好的穩(wěn)定性(NovozymesWO 99/41358)，并且將多基因的多拷貝整合也同樣具有穩(wěn)定性(NovozymesWO 02/00907)。
其他增加產(chǎn)物產(chǎn)量的方法可以是提高調(diào)節(jié)特異性目標(biāo)基因表達(dá)的特異性啟動(dòng)子的啟動(dòng)子活性，也可以通過同時(shí)綜合提高一些啟動(dòng)子的活性來改善產(chǎn)物的產(chǎn)量。
在細(xì)菌的RNA聚合酶中，研究最多的是E.coli的RNA聚合酶，它代表了從許多細(xì)菌屬中分離得到的酶，包括沙門氏菌屬(Samonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、Proteus、氣桿菌屬(Aerobacter)和芽孢桿菌屬(Bacillus)(Fukuda etal.，1977，Mol.Gen.Genet.154135)。
RNA聚合酶的核心酶由α、β和β’-亞基，按2∶1∶1的比例組成，它們分別由rpoA、rpoB和rpoC基因編碼。在RpoB基因內(nèi)突變體提供了對(duì)多種抗生素(如利福平)的細(xì)胞抗性。
利福平結(jié)合于β-亞基，并且在體外和體內(nèi)均完全阻止了通過酶的RNA鏈的生產(chǎn)起始作用(Wehrli和Staehelin，1971，Bact.Rev.35290)。由于β-亞基發(fā)生了改變不再與藥物相結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)胞獲得了對(duì)利福平的抗性。
利福平抗性細(xì)胞的RNA聚合酶β-亞基中的突變位于亞基中心的200個(gè)氨基酸鏈長中的3個(gè)單獨(dú)的區(qū)域，上述區(qū)域被定義為假定的利福平結(jié)合袋(packet)(Jin和Gross，1988，J.Mol.Biol.20245-58)。
由rpoB基因突變所產(chǎn)生的利福平抗性可以產(chǎn)生多效表現(xiàn)型(Yang和Price，1995，J.Biol.Chem.27023930-23933；Kane et al.，1979，J.Bacteriol.1371028-1030)，一些情況下可以導(dǎo)致基因活性的增加，而在一些情況下并不產(chǎn)生任何效果(Kane et al.，1979，J.Bacteriol.1371028-1030)。Sharipova等(1994，Microbiology 6329-32)報(bào)道，在一些利福平抗性株系中具有較高水平的磷酸酶活性，而在另一些利福平抗性株系中則具有較低水平的磷酸酶活性。已有人報(bào)道，從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的利福平抗性SPO-分離物中，α-淀粉酶的活性增加了100倍(Hu Xuezhi et al.，1991，Actamicrobiologica sinica 31268-273)。在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中，突變Q469R導(dǎo)致產(chǎn)生了利福平抗性，并對(duì)NusG產(chǎn)生了超敏性(Ingham和Furnaux，2000，Microbiology，1463041-3049)。

發(fā)明內(nèi)容
雖然一些報(bào)道顯示在利福平抗性分離物中一些基因產(chǎn)物的產(chǎn)量有所增加，但也有報(bào)道表明rpoB的突變效果具有很高的多效性，并且所觀察到的產(chǎn)量增加從來沒有聯(lián)系到特定的rpoB基因中的突變。令人驚奇的是本發(fā)明的特異性突變無論是單獨(dú)、還是組合，在所述rpoB-突變存在于宿主菌株時(shí)，都將導(dǎo)致目的產(chǎn)物的產(chǎn)量產(chǎn)生大幅度的改善。
本發(fā)明的第一方面涉及一種分離的突變體真細(xì)菌，其包含至少一個(gè)突變，上述突變導(dǎo)致了所編碼的RNA聚合酶β-亞基中至少一種氨基酸發(fā)生取代，因此與在同等的生長條件下培養(yǎng)的等基因親本株系產(chǎn)生的目的產(chǎn)物的產(chǎn)量相比，上述突變作用導(dǎo)致了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變，其中所說的至少一種氨基酸取代發(fā)生在SEQ ID NO2中469、478、482、485和487的任一位置處，或者發(fā)生在任何真細(xì)菌RNA聚合酶β-亞基家族成員的等價(jià)位置上。
本發(fā)明的第二方面涉及在突變真細(xì)菌中產(chǎn)生至少一種目的產(chǎn)物的方法，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變真細(xì)菌，并產(chǎn)生上述目的產(chǎn)物。
本發(fā)明的第三方面涉及使用本發(fā)明的突變真細(xì)菌來生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的用途，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變真細(xì)菌，并產(chǎn)生上述目的產(chǎn)物。


附圖1中對(duì)比序列的第一行顯示了地衣芽孢桿菌RpoB蛋白的40個(gè)氨基酸片段，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2中第461到500的位置。第二行顯示了Bacillus clausii RpoB蛋白的同源的40個(gè)氨基酸片段，對(duì)應(yīng)于(incl.)序列4中第462到501的位置，上述位置與SEQ ID NO2中的相應(yīng)位置進(jìn)行了比對(duì)。上述兩個(gè)片段與已公布的不同細(xì)菌的RpoB蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果顯示在附圖1中，粗體字母表示與頂端兩個(gè)芽孢桿菌屬RpoB蛋白序列存在差異的野生型序列。附圖中每一個(gè)來源編號(hào)對(duì)應(yīng)的同源片段，其微生物來源如下來源1)Boor et al.，Genetic and transcriptional organization of the regionencoding the beta subunit of枯草芽孢桿菌RNA polymerase.J.Biol.Chem.27020329(1995)。
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定義在討論本發(fā)明的具體實(shí)施方案之前，首先提供關(guān)于本發(fā)明主要方面的特定術(shù)語的定義。在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中，使用了傳統(tǒng)的單個(gè)字母核苷酸代碼和傳統(tǒng)的單個(gè)字母和三個(gè)字母氨基酸殘基代碼。為了便于參考使用了下列命名法原始氨基酸 位點(diǎn) 取代氨基酸按照這種命名法，具體實(shí)例為，天冬酰胺在位置30處取代丙氨酸以表示為Ala30Asn 或A30N在同一位置處的丙氨酸缺失表示為Ala30*或A30*插入額外的氨基酸殘基，例如賴氨酸，表示為Ala30AlaLys 或A30AK缺失氨基酸殘基的連續(xù)區(qū)段，以30-33位置處的氨基酸殘基為例，可以表示為(30-33)*。
在含有缺失(例如缺失氨基酸殘基)的特異性多肽與其同源多肽進(jìn)行相比處，如果在上述位置發(fā)生插入，可以表示為*36Asn 或*36N表明了在位置36處插入了天冬酰胺。
多突變采用加號(hào)來表示，例如Ala30Asn+Glu34Ser 或 A30N+E34S代表了在位置30和34處發(fā)生了取代(天冬酰胺和絲氨酸分別取代了丙氨酸和谷氨酸)。
在一個(gè)給定的位置處可以插入一個(gè)或更多個(gè)可選擇的氨基酸殘基時(shí)，表示為A30N，E 或 A30N或A30E此外，當(dāng)一個(gè)適合于修飾的位置沒有給出具體的修飾方式時(shí)，可以理解為其它任何氨基酸殘基都可以取代該位置上的氨基酸殘基(例如可以從A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V中選擇不同于通常在所研究該位置上的其它任一氨基酸殘基)。因此，例如在位置202處發(fā)生甲硫氨酸的修飾作用(取代)，M202，但并沒有給出具體的修飾方式，可以理解為其它任一氨基酸殘基都可以取代甲硫氨酸，例如可以從A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y和V中選擇其它任何氨基酸殘基。
真細(xì)菌本發(fā)明中的術(shù)語“真細(xì)菌”是指具有細(xì)胞壁的單細(xì)胞原核微生物，細(xì)胞可以是桿菌、球菌(ccocci)或螺旋菌，多數(shù)種類的細(xì)菌是通過一個(gè)或多個(gè)鞭毛來實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)的。真細(xì)菌與原始細(xì)菌的區(qū)別之處在于其擁有肽聚糖細(xì)胞壁和由酯類相連的脂質(zhì)。
突變真細(xì)菌本發(fā)明中的術(shù)語“突變真細(xì)菌”是指不同的同基因親本真細(xì)菌，它是通過在RNA聚合酶β-亞基上述5個(gè)位置中的至少1個(gè)發(fā)生突變而獲得的。
取代本發(fā)明中的術(shù)語“取代”是指一個(gè)氨基酸被另一個(gè)氨基酸替代。
β-亞基本發(fā)明中的術(shù)語“β-亞基”是指rpoB基因編碼的RpoB蛋白，其被包含在RNA聚合酶中，所述RNA聚合酶由α、β和β’-亞基組成，按2∶1∶1的比例組成，它們分別由rpoA、rpoB和rpoC基因編碼。
rpoB基因本發(fā)明中的術(shù)語“rpoB基因”是指編碼RNA聚合酶中β-亞基的基因。
β-亞基家族成員本發(fā)明中的術(shù)語“β-亞基家族成員”不是指通常分類學(xué)意義上的包含相同屬成員的家族，而是指由α、β和β’3個(gè)亞基組成，并按上述比例組成的原核(真細(xì)菌)RNA聚合酶，其中β-亞基氨基酸序列包含了40個(gè)連續(xù)的氨基酸，這40個(gè)連續(xù)的氨基酸序列可以與SEQ ID NO2中RpoB蛋白序列第461到500處位置進(jìn)行比對(duì)，并且至少具有75％的同源性。
等基因親本株系本發(fā)明中的術(shù)語“等基因親本株系”是指在突變體中，除所述突變體的rpoB基因至少一個(gè)突變外，該菌株遺傳上等同于的突變體菌株或突變體的后代。
等價(jià)位置本發(fā)明中的術(shù)語“等價(jià)位置”是指與SEQ ID NO2中461到500位置片斷相比對(duì)后的位置，附圖1和實(shí)施例3中也進(jìn)行了解釋。
同源性本發(fā)明中的術(shù)語“同源性”是指同源的多核苷酸或多肽。如果兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸或兩個(gè)或更多個(gè)多肽具有同源性，這就意味著同源的多核苷酸或多肽至少具有60％的同一性，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少98％?？梢酝ㄟ^已有技術(shù)中公知的計(jì)算機(jī)程序?qū)蓚€(gè)序列進(jìn)行對(duì)比來確定上述兩個(gè)多核苷酸或多肽序列是否具有足夠高的同一性以達(dá)到所定義的同源性程度，此種計(jì)算機(jī)程序例如GCG程序包中提供的“GAP”程序(Prograrn Manual for the WisconsinPackage，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)。在使用GAP程序?qū)NA序列進(jìn)行比較時(shí)，采用下述設(shè)定GAP生成罰(creation penalty)為5.0，GAP延伸罰(extension penalty)為0.3。
代謝途徑本發(fā)明中的術(shù)語“代謝途徑”是指活細(xì)胞中由酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)鏈條，例如將一種化合物轉(zhuǎn)換為另一種化合物，或由較小的單元組建成較大的高分子，或分解化合物釋放出了利用的能量。
外源的本發(fā)明中的術(shù)語“外源的”是指在自然情況下，通常不存在于宿主生物體中的物質(zhì)，例如基因。
內(nèi)源的本發(fā)明中的術(shù)語“內(nèi)源的”是指來源于宿主生物體體內(nèi)的物質(zhì)，例如基因。
操縱子本發(fā)明中的術(shù)語“操縱子”是指包括一些基因的多核苷酸，這些基因成簇的，并且可能轉(zhuǎn)錄在多順反子mRNA中，例如編碼代謝途徑中酶的基因。操縱子的轉(zhuǎn)錄可以起始于啟動(dòng)子區(qū)域，并且由相鄰的調(diào)控基因進(jìn)行調(diào)控，其編碼一種調(diào)控蛋白，反過來結(jié)合于操縱子的操作子序列上，進(jìn)而分別對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行抑制或增強(qiáng)。
改變產(chǎn)物產(chǎn)量本發(fā)明中的術(shù)語“改變產(chǎn)物產(chǎn)量”是指或者產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變，其意味著每增加一定數(shù)量的底物，終產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變，或者通過縮短或延長培養(yǎng)周期可以獲得相同數(shù)量的終產(chǎn)物。改變產(chǎn)物產(chǎn)量可以是增加產(chǎn)物的產(chǎn)量，也可以是增加生產(chǎn)力，然而也可以是降低產(chǎn)物的產(chǎn)量或降低某種產(chǎn)物的生產(chǎn)力。
核酸構(gòu)建體此處所說的術(shù)語“核酸構(gòu)建體”是指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因或已經(jīng)過修飾作用而包含了自然界中并不存在的核酸片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含表達(dá)本發(fā)明編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”具有相同的含義。
調(diào)控序列此處所說的術(shù)語“調(diào)控序列”是指包含了表達(dá)本發(fā)明多肽所必需的或有利于表達(dá)本發(fā)明多肽的所有成份。對(duì)編碼多肽的核酸序列而言，每一種調(diào)控序列可以是同源的，也可以是異源的。上述調(diào)控序列包括，但并不局限于前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。在最小程度上，調(diào)控序列包括了啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。調(diào)控序列中可以提供接頭而有目的地引入特異性限制性位點(diǎn)，從而方便于調(diào)控序列與編碼多肽的核酸序列中的編碼區(qū)域進(jìn)行連接。
操作性連接此處所說的術(shù)語“操作性連接”是指一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中調(diào)控序列被放置在相對(duì)于DNA序列中的編碼序列而言為恰當(dāng)?shù)奈恢锰?，從而保證調(diào)控序列可以行使對(duì)多肽表達(dá)的指導(dǎo)作用。
編碼序列此處所說的術(shù)語“編碼序列”是意欲包括一種核酸序列，其直接說明的是其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列。編碼序列的界限通常為開放閱讀框確定，其通常起始于起始密碼子ATG。典型的編碼序列包括DNA、cDNA和重組核苷酸序列。
表達(dá)此處所說的術(shù)語“表達(dá)”包括了產(chǎn)生多肽的任何步驟，其中包括了，但并不局限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
表達(dá)載體此處所說的術(shù)語“表達(dá)載體”包括了線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包括了編碼本發(fā)明多肽的片段，上述片段操作性地與提供其轉(zhuǎn)錄的其它片段相連。
宿主細(xì)胞此處所說的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括了任何適于用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞類型。
具體實(shí)施例方式
如前所述大腸桿菌中導(dǎo)致利福平抗性的突變體具有多種效果。大腸桿菌中的這種抗性來源于rpoB基因中的點(diǎn)突變(Jin and Gross，1988，J.Mol.Biol.20245-58)，上述點(diǎn)突變處于該蛋白的3個(gè)獨(dú)立區(qū)域。在一些報(bào)道中突變也造成了特異性蛋白表達(dá)水平發(fā)生了改變。在來自不同的細(xì)菌的已知rpoB基因中進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了很高程度的同源性。
我們已經(jīng)測(cè)定出地衣芽孢桿菌中RpoB蛋白的氨基酸序列與枯草芽孢桿菌中RpoB蛋白具有約95％的同源性。在枯草芽孢桿菌和E.Coli的β-亞基中擁有四個(gè)非常相似的共線性序列區(qū)，其中包括了一旦改變將產(chǎn)生利福平抗性的保守區(qū)域。本發(fā)明分離了地衣芽孢桿菌的rpoB突變體，并且檢測(cè)了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量?？梢圆捎靡延屑夹g(shù)中已知的方法來獲得RpoB突變體，例如定點(diǎn)突變或隨機(jī)突變。如前所述RpoB蛋白中還存在有其它一些位置，如果上述位置發(fā)生突變將導(dǎo)致產(chǎn)生利福平抗性。
本發(fā)明獲得了地衣芽孢桿菌和B.clausii的利福平抗性RpoB突變體，并且檢測(cè)了不同RpoB突變個(gè)體對(duì)目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變情況。
通過對(duì)分離的突變體進(jìn)行研究表明，地衣芽孢桿菌和B.clausii的利福平抗性是由于rpoB基因的點(diǎn)突變，在實(shí)施例4和5中還進(jìn)一步鑒定了增加了特異性目的產(chǎn)物產(chǎn)量的特異性突變體。
在多數(shù)情況下，如果RpoB蛋白5個(gè)特異性位置中的一個(gè)發(fā)生了單氨基酸取代就將導(dǎo)致目的產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生改善，同時(shí)也可能存在兩個(gè)或更多個(gè)特異性突變之間的協(xié)同效果。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種分離的真細(xì)菌突變體，其包含至少一個(gè)突變，上述突變導(dǎo)致了由rpoB基因編碼的RNA聚合酶β-亞基中至少一種氨基酸發(fā)生取代，因此在同等的生長條件下，與等基因親本株系產(chǎn)生的目的產(chǎn)物的產(chǎn)量相比，上述突變作用導(dǎo)致了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變，其中所說的至少一種氨基酸取代發(fā)生在SEQ ID NO2中469、478、482、485和487的任一位置處，或者發(fā)生在任一真細(xì)菌RNA聚合酶β-亞基家族成員的等價(jià)位置上。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)物產(chǎn)量的改變是指產(chǎn)量改進(jìn)。
在分離的突變體DNA序列中，本發(fā)明鑒定出一些至少是一個(gè)氨基酸發(fā)生了取代的特異性突變，上述特異性突變提高了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，涉及在由rpoB基因編碼的RNA聚合酶的β-亞基中至少有一個(gè)氨基酸發(fā)生了取代，上述至少一個(gè)氨基酸所發(fā)生的至少一個(gè)取代包括了Q469R、A478D、A478V、H482R、H482P、R485H或S487L，在與SEQ ID NO2進(jìn)行比對(duì)時(shí)，上述位置對(duì)應(yīng)于不同來源的β-亞基的等價(jià)位置。
一旦確定了可以導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量發(fā)生改善的相關(guān)位置后，本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以在此相同的位置試著進(jìn)行隨機(jī)突變。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案涉及了本發(fā)明第一方面所提到的分離的突變真細(xì)菌，在上述突變真細(xì)菌中，所說的至少一個(gè)氨基酸取代包括了在SEQ ID NO2中位置469或478處的任何隨機(jī)取代；或者包括了在SEQ ID NO2中位置469、478和/或487處的任何取代；或者在任一真細(xì)菌RNA聚合酶β-亞基家族成員的等價(jià)位置所發(fā)生的取代。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，涉及了上述定義的分離突變真細(xì)菌，其中所發(fā)生的至少一個(gè)氨基酸取代包括了Q469R、A478D和/或S487L；或者優(yōu)選包括Q469R或A478D；其中在與SEQ ID NO2進(jìn)行比對(duì)時(shí)，上述位置對(duì)應(yīng)于這些β-亞基的等價(jià)位置。
按照本發(fā)明，分離細(xì)菌應(yīng)包含由α、β和β’3個(gè)亞基按上述比例組成的RNA聚合酶，上述β-亞基氨基酸序列中包含40個(gè)連續(xù)的氨基酸，這40個(gè)連續(xù)的氨基酸序列可以與SEQ ID NO2中RpoB蛋白第461到500處位置進(jìn)行比對(duì)，并且至少具有75％的同源性。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，上述同源性至少為80％，在另外兩個(gè)特定的實(shí)施方案中，上述同源性分別為85％和90％。
在一些細(xì)菌種類中，例如大腸桿菌、沙門氏菌(Salmonella)、淋病菌(Neiseria)和假單胞菌(Pseudomonas)等一些革蘭氏陰性菌，與地衣芽孢桿菌(SEQ ID NO2)位置478處相等價(jià)的位置處通常是由絲氨酸(S)而不是丙氨酸(A)。如附圖1所示，地衣芽孢桿菌SEQ ID NO2中461到500位置處的氨基酸片段均可與已公布的各種細(xì)菌RpoB蛋白相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)。
由于絲氨酸和丙氨酸在結(jié)構(gòu)上非常相似，因此用絲氨酸來替代丙氨酸或用丙氨酸來替代絲氨酸而不影響RpoB蛋白的功能并不足以為奇。
因此本發(fā)明所說的在478位置處發(fā)生的氨基酸取代，例如A478D或A478V或A478的任一隨機(jī)取代，應(yīng)該包括S478D或S478V或S478的任一隨機(jī)取代。
在本發(fā)明的第一方面，細(xì)菌是分離的突變真細(xì)菌。在其中的一個(gè)實(shí)施例中，分離的突變真細(xì)菌是革蘭氏陽性菌?？捎玫母锾m氏陽性菌包括了，但不局限于芽孢桿菌的各個(gè)種(Bacillus sp.)，Bacillus alkalophilus，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，短芽孢桿菌(Bacillus brevis)，環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)，Bacillus clausii，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)，Bacillus lautus，緩慢芽孢桿菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(NBacillus stearothermophilus)，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，所說細(xì)菌包括緩慢芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，Bacillus clausii，嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所說細(xì)菌是地衣芽孢桿菌。
按照本發(fā)明，目的產(chǎn)物包括基因產(chǎn)物或代謝途徑中的產(chǎn)物，由于rpoB基因編碼的RNA聚合酶的β-亞基中至少一個(gè)氨基酸發(fā)生了至少一次的取代作用，從而導(dǎo)致上述產(chǎn)物的產(chǎn)量得到了改善。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中涉及了第一方面的突變體，該突變體中的目的產(chǎn)物是基因產(chǎn)物或代謝途徑中的產(chǎn)物，優(yōu)選編碼目的產(chǎn)物的基因包含在操縱子中；更優(yōu)選該基因是突變真細(xì)菌的外源或內(nèi)源基因；最優(yōu)選該基因以至少2個(gè)拷貝的形式存在或至少10個(gè)拷貝或甚至至少100個(gè)拷貝。
可以通過能夠穩(wěn)定保持的合適質(zhì)粒來攜帶基因或操縱子，例如在宿主細(xì)胞中能夠穩(wěn)定自主復(fù)制的質(zhì)粒(對(duì)質(zhì)粒的選擇主要依靠該質(zhì)粒與要引入的宿主細(xì)胞之間是否具有穩(wěn)定的兼容性)或其可攜帶在宿主的染色體上。上述基因可以與宿主細(xì)胞具有內(nèi)源性，在這種情況下，目的產(chǎn)物是宿主細(xì)胞產(chǎn)生的天然蛋白，并且大多數(shù)情況下，該基因處于其在染色體的通常位置處。如果編碼目的產(chǎn)物的基因是一種外源基因，可以用合適的質(zhì)粒攜帶該基因或?qū)⒃摶蛘系剿拗鞯娜旧w上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，真細(xì)菌是一種重組真細(xì)菌。在其它的實(shí)施方案中目的產(chǎn)物也可以是一種重組蛋白。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一些技術(shù)對(duì)編碼目的產(chǎn)物的基因進(jìn)行整合。該基因可以在染色體上存在一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)拷貝。
WO 91/09129和WO 94/14968(Novo Nordisk)對(duì)整合兩個(gè)基因進(jìn)行了描述，上述內(nèi)容一并作為參考。WO 99/41358描述了對(duì)空間上緊密相連的反向平行排列的兩個(gè)基因進(jìn)行整合具有較好的穩(wěn)定性(Novo Nordisk)，上述內(nèi)容一并作為參考。WO 02/00907描述了基因的穩(wěn)定染色體多拷貝整合(Novozymes A/S)，上述內(nèi)容一并作為參考。
編碼目的產(chǎn)物的基因以多拷貝的形式存在可以進(jìn)一步改善上述產(chǎn)物的產(chǎn)量。整合在宿主細(xì)胞染色體上的基因可以每條染色體上一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的形式存在。攜帶于質(zhì)粒中的基因可以在每個(gè)宿主細(xì)胞中以上百個(gè)拷貝的形式存在。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，上述基因以至少兩個(gè)拷貝的形式存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上述基因以至少十個(gè)拷貝的形式存在。在另一個(gè)實(shí)施例中，上述基因以至少100個(gè)拷貝的形式存在。
為了方便對(duì)染色體整合的選擇，導(dǎo)致使用了選擇性標(biāo)記，例如抗生素抗性標(biāo)記。然而應(yīng)當(dāng)盡量避免使用抗生素標(biāo)記基因。WO 01/90393描述了一種將基因整合到宿主細(xì)胞染色體上而在菌株中并未留有抗生素抗性標(biāo)記的方法，上述內(nèi)容一并作為參考。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，涉及了對(duì)上述定義的分離的突變真細(xì)菌，在該突變真細(xì)菌中編碼目的產(chǎn)物的基因被整合到突變真細(xì)菌的宿主染色體上，但在整合位點(diǎn)處并未留有任何抗生素抗性標(biāo)記。
本發(fā)明也涉及了包含編碼目的產(chǎn)物的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其可以操作性地連接于一個(gè)或更多個(gè)調(diào)控序列上，上述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中、在與其相兼容的條件下，對(duì)編碼序列的表達(dá)進(jìn)行指導(dǎo)。
可以采用多種途徑對(duì)編碼目標(biāo)多肽的核苷酸序列進(jìn)行調(diào)控以使其表達(dá)目標(biāo)多肽。根據(jù)表達(dá)載體，在將核苷酸序列插入表達(dá)載體之前，對(duì)其進(jìn)行調(diào)控是比較合理或必需的。采用重組DNA方法對(duì)核苷酸序列進(jìn)行修飾的技術(shù)已為本領(lǐng)域人員所公知。
調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，其為宿主細(xì)胞所識(shí)別的能夠表達(dá)目標(biāo)核苷酸序列的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列中包含有可以調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是任何在宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的核苷酸序列，包括了突變、截短和雜交啟動(dòng)子，其可以來源于與宿主細(xì)胞同源或異源的編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因。
適于調(diào)節(jié)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子實(shí)例，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中，可以是來源于大腸桿菌lac操縱子的啟動(dòng)子，天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的瓊脂糖基因(dagA)，枯草芽孢桿菌的蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)，地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶基因(amyL)，嗜熱脂肪芽孢桿菌的麥芽糖淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢桿菌的青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢桿菌的xylA和xylB基因及原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 753727-3731)，以及tac啟動(dòng)子(DeBoer et al.，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 8021-25)。在“Usefulproteins from recombinant bacteria”in Scientific American，1980，24274-94和Sambrook et al.，1989，supra中也描述了一些其它啟動(dòng)子。
調(diào)控序列也可以是適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子序列，該序列為宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄。終止子序列可操作性地連接于編碼多肽的核苷酸序列的3’末端。任何在宿主細(xì)胞中具有功能的終止子都可以在本發(fā)明中使用。
調(diào)控序列也可以是適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列，其是對(duì)宿主細(xì)胞翻譯起重要作用的mRNA的非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作性地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’末端。任何在宿主細(xì)胞中具有功能的前導(dǎo)序列都可以在本發(fā)明中使用。
調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是一種可操作性地連接于核苷酸序列3’末端的序列，并且在轉(zhuǎn)錄過程中，可以被宿主細(xì)胞識(shí)別作為信號(hào)在轉(zhuǎn)錄形成的mRNA上加載多聚腺苷酸殘基。任何在宿主細(xì)胞中具有功能的多聚腺苷酸化序列都可以在本發(fā)明中使用。
調(diào)控序列也可以是一種信號(hào)肽編碼區(qū)，該區(qū)域編碼的氨基酸序列與多肽的氨基末端相連，并指導(dǎo)所編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。核苷酸序列的5’末端編碼序列天然包含一種信號(hào)肽編碼區(qū)，其通常與翻譯閱讀框相連，編碼區(qū)的片段可以編碼分泌型多肽?；蛘呔幋a序列的5’末端包含與編碼序列異源的信號(hào)肽編碼區(qū)。在天然編碼序列中不包含信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)需要異源信號(hào)肽編碼區(qū)簡單地替代天然信號(hào)肽編碼區(qū)。或者為了增加多肽的分泌，可以用異源信號(hào)肽編碼區(qū)簡單替換天然的信號(hào)肽編碼區(qū)。然而任何可以指導(dǎo)表達(dá)多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)都可以在本發(fā)明中使用。
對(duì)細(xì)菌宿主細(xì)胞而言，有效的信號(hào)肽編碼區(qū)可以是來源于BacillusNCIB 11837麥芽糖淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢桿菌prsA基因的信號(hào)肽編碼區(qū)。在Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57109-137中也描述了一些其它的信號(hào)肽。
調(diào)控序列也可以是前肽編碼區(qū)，其編碼的氨基酸序列位于多肽的氨基末端。由此產(chǎn)生的多肽被稱為酶或前多肽(在一些情況下也被稱為酶原(zymogen))。通常前多肽是不具有活性的，可以通過催化作用或自主催化作用從前多肽中切除前肽而轉(zhuǎn)變成成熟的有活性的多肽。前肽編碼區(qū)可以來源于枯草芽孢桿菌的堿性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢桿菌的中性蛋白酶基因(nprT)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α因子、Rhizomucor miehei的天冬氨酸蛋白酶基因和Myceliophthora thermophila的漆酶基因(WO95/33836)。
在多肽的氨基末端存在信號(hào)肽和前肽區(qū)，前肽區(qū)的位置靠近多肽的氨基末端，而信號(hào)肽區(qū)的位置靠近前肽區(qū)的氨基末端。
增加調(diào)節(jié)序列也是十分必要的，因?yàn)檫@些調(diào)節(jié)序列可以隨著宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例可以是那些對(duì)化學(xué)或物理刺激以及調(diào)節(jié)化合物發(fā)生反應(yīng)并開啟或關(guān)閉基因表達(dá)的序列。原核系統(tǒng)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱子系統(tǒng)。也可以采用酵母的ADH2或GAL1系統(tǒng)。在真核系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括了在甲氨蝶呤存在時(shí)能夠擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因和在重金屬存在時(shí)能夠擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在上述情況下，編碼多肽的核酸序列可操作性地與調(diào)節(jié)序列相連接。
表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。上述的各種核酸和調(diào)控序列可以連接在一起，從而產(chǎn)生了重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體中包括了一個(gè)或更多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，保證了在上述位點(diǎn)處方便地插入或取代編碼多肽的核酸序列。或者也可以通過將核苷酸序列或含有該核苷酸序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體來表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。在構(gòu)建的表達(dá)載體中，編碼序列位于載體中以便于將編碼序列操作性地與表達(dá)的調(diào)控序列相連接。
重組表達(dá)載體可以是任何便于對(duì)重組DNA進(jìn)行操作并使核酸序列進(jìn)行表達(dá)的載體(例如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇主要依靠于載體與載體將要引入的宿主細(xì)胞之間的兼容性。載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。
載體可以是能夠自主復(fù)制的載體，例如存在于染色體之外的載體，它的復(fù)制與染色體的復(fù)制相獨(dú)立，實(shí)例有質(zhì)粒、染色體外成份、微型染色體或人工染色體。
為了保證自主復(fù)制，載體可以包含任何成份?；蛘邔⑤d體引入宿主細(xì)胞時(shí)，載體可以與基因組整合在一起，與其插入的染色體一起進(jìn)行復(fù)制。此外，可以將含有全長DNA的單個(gè)載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞的基因組中，或是使用轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一個(gè)或更多個(gè)選擇標(biāo)記，上述選擇標(biāo)記允許對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行容易的選擇。選擇標(biāo)記可以是一種基因，其產(chǎn)物可以提供生物殺滅劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、原養(yǎng)型微生物對(duì)營養(yǎng)缺陷體的抗性等。
細(xì)菌性選擇標(biāo)記的實(shí)例有來源于枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者可以提供抗生素抗性的標(biāo)記，例如青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。
本發(fā)明的載體優(yōu)選含有能夠允許將載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組或載體能夠在宿主細(xì)胞中獨(dú)立于基因組進(jìn)行自主復(fù)制的元件。
為了能夠整合到宿主細(xì)胞基因組中，載體可以根據(jù)編碼多肽的核苷酸序列或其它任何能夠通過同源重組或非同源重組而將載體穩(wěn)定整合到基因組中的元件。或者載體中含有額外的可以指導(dǎo)通過同源重組而將載體整合到宿主細(xì)胞中的核苷酸序列。上述額外核苷酸序列可以將載體精確地整合到宿主細(xì)胞基因組中確定的染色體位置上。為了增加精確整合的可能性，整合元件優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核苷酸，例如100到1500個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400到1500個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選800到1500個(gè)堿基對(duì)，上述堿基對(duì)與相應(yīng)的靶序列具有高度的同源性以增強(qiáng)同源重組的可能性。整合元件可以是任何與宿主細(xì)胞基因組中目標(biāo)序列相同源的序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核酸序列。另一方面，載體也可以通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
為了保證載體能夠在所研究宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制，載體還要含有復(fù)制起點(diǎn)。細(xì)菌中復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例可以是質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的允許在大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制，pUB110、pE194、pTA1060，pAMβ1允許在芽孢桿菌中進(jìn)行復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)中還可以含有突變，上述突變?cè)谒拗骷?xì)胞中產(chǎn)生了溫度敏感功能(例如參考Ehrlich，1978，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 751433)。
可以將超過一個(gè)拷貝的本發(fā)明核苷酸序列插入到宿主細(xì)胞中以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)量?？赏ㄟ^向宿主細(xì)胞基因組中整合至少核苷酸序列的一個(gè)額外拷貝來增加核酸序列的拷貝數(shù)，或者通過包括核苷酸序列與擴(kuò)增性選擇標(biāo)記基因來增加核酸序列的拷貝數(shù)，其中細(xì)胞含有可選擇標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，其中通過在有適當(dāng)選擇試劑存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，可以獲得該核酸序列的額外拷貝數(shù)。
本領(lǐng)域人員已經(jīng)廣泛熟悉了連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法(例如參考Sambrook et al.，1989，supra)。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞，其優(yōu)先在重組生產(chǎn)多肽中使用。將包含本發(fā)明核苷酸序列的載體引入到宿主細(xì)胞中，從而保證了如前所述的載體能夠作為染色體的元件進(jìn)行復(fù)制或能夠在染色體之外進(jìn)行自主復(fù)制。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞(unicelluar)微生物，例如原核微生物，也可以是非單細(xì)胞微生物，例如真核微生物。
可以采用的單核細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，例如革蘭氏陽性菌，其中包括，但并不局限于芽孢桿菌細(xì)胞，例如Bacillus alkalophilus，解淀粉芽孢桿菌，短芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，Bacillus clausii，凝結(jié)芽孢桿菌，Bacillus lautus，緩慢芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或者鏈霉菌細(xì)胞，例如Streptomyces lividans或Streptomyces murinus，或者革蘭氏陰性菌，例如大腸桿菌和假單胞菌。在優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是緩慢芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，桿狀細(xì)菌細(xì)胞是alkalophilic芽孢桿菌。
將載體引入細(xì)菌宿主細(xì)胞可以采用的有效方法例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如參見Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168111-115)、采用感受態(tài)細(xì)胞(例如參見Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81823-829，或者Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of MolecularBiology 56209-221)、電轉(zhuǎn)化(例如參見Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6742-751)、結(jié)合(conjugation)(例如參見Koehler and Thorne，1987，Journal of Bacteriology 1695771-5278)。
目的產(chǎn)物可以是任何基因的產(chǎn)物或者代謝途徑的產(chǎn)物，上述產(chǎn)物可以在工業(yè)上使用，并且可以在例如真細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，目的產(chǎn)物包括了多肽、維生素、氨基酸、抗生素、碳水化合物或表面活性劑。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例是關(guān)于本發(fā)明第一方面的突變體，通過上述突變體產(chǎn)生的目的產(chǎn)物包括了多肽、維生素、氨基酸、抗生素、碳水化合物或表面活性劑；目的產(chǎn)物優(yōu)選多肽；其中優(yōu)選酶類；更優(yōu)選選自酶分類系統(tǒng)中的下述酶類氧化還原酶(EC1)、轉(zhuǎn)移酶(EC2)、水解酶(EC3)、裂解酶(EC4)、異構(gòu)酶(EC5)和連接酶(EC6)。
在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，酶類可以是選自具有下述活性的酶類氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、haloperoxidase、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶(invertase)、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶(phytase)、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或者木聚糖酶，其中優(yōu)選淀粉酶或甘露聚糖酶。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽產(chǎn)物包括了纖維素結(jié)合區(qū)、淀粉結(jié)合區(qū)、抗體、殺微生物肽、激素或者融合蛋白。優(yōu)選的目的產(chǎn)物是包含纖維素結(jié)合區(qū)、淀粉結(jié)合區(qū)、抗體、殺微生物肽、激素或融合蛋白的多肽。目的產(chǎn)物也優(yōu)選碳水化合物，優(yōu)選透明質(zhì)酸。
在宿主細(xì)胞中，本發(fā)明的特異性突變改變了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變可以是如上所述的改善產(chǎn)量或改善生產(chǎn)力。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)量的改變是指與生長在等同條件下的等基因親本株系相比，其產(chǎn)量至少增長5％到1000％。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)量的改變?cè)?％到500％之間，在另一個(gè)實(shí)施方案中，在5％到250％之間，在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)量的改變?cè)?％到50％之間。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中、在適于生產(chǎn)目標(biāo)多肽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，產(chǎn)生的多肽任選從培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)基中進(jìn)行回收。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任一適于生長宿主細(xì)胞的傳統(tǒng)培養(yǎng)基，例如進(jìn)行了適當(dāng)添加的基本或復(fù)合培養(yǎng)基。適合的培養(yǎng)基可以從商業(yè)上獲得或按照已公開的配方進(jìn)行制備(例如in catalogues of the American TypeCulture Collection)。培養(yǎng)基可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進(jìn)行制備(例如參見references for bacteria and yeast；Bennett，J.W.and LaSure，L.，editors，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)。
如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，可以從培養(yǎng)基中直接回收多肽。如果多肽沒有分泌到培養(yǎng)基中，可從細(xì)胞裂解物中回收多肽?？梢圆捎脗鹘y(tǒng)的方法從培養(yǎng)基中回收多肽，其中根據(jù)具體的多肽種類包括了采用離心或過濾的方法從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞，沉淀上清的蛋白成分或采用硫酸銨等鹽類進(jìn)行過濾，采用離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析以及相似的各種層析方法進(jìn)行純化。
可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的特異方法對(duì)多肽進(jìn)行檢測(cè)，上述方法包括了使用特異性抗體、形成一種酶產(chǎn)物或一種酶底物消失。例如可以采用一種酶實(shí)驗(yàn)對(duì)多肽的活性進(jìn)行檢測(cè)。
可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種方法對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行純化，其中包括了，但并不限制于層析方法(例如離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦和大小排阻層析)，電泳方法(例如制備等電位聚焦電泳(IEF))、差異溶解度(如硫酸銨沉淀)或抽提方法(例如參見ProteinPurification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，目的產(chǎn)物分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，目的產(chǎn)物附著在細(xì)胞膜上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，目的產(chǎn)物存在于細(xì)胞中。
本發(fā)明的第二方面涉及在突變真細(xì)菌中生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的方法，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施例所定義的突變真細(xì)菌，由此所述產(chǎn)物產(chǎn)生于培養(yǎng)基中。用于培養(yǎng)的適合的培養(yǎng)基以及純化或分離目的產(chǎn)物的方法如上所述，其中純化或分離是完成本發(fā)明額外的任選步驟。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法、在適于生產(chǎn)多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。例如可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中、在適于多肽表達(dá)和/或分離的條件下，采用搖瓶培養(yǎng)或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵器中進(jìn)行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵培養(yǎng)(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、fed-batch發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)宿主細(xì)胞。在包含碳源、氮源和無機(jī)鹽的適當(dāng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中，采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。適合的培養(yǎng)基可以從商業(yè)上獲得或按照已公開的配方進(jìn)行制備(例如in catalogues of the American Type CultureCollection)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，可以從培養(yǎng)基中直接回收多肽。如果多肽沒有分泌到培養(yǎng)基中，可從細(xì)胞裂解物中回收多肽。
可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的特異方法對(duì)多肽進(jìn)行檢測(cè)，上述方法包括了使用特異性抗體、形成一種酶產(chǎn)物或消耗一種酶底物。例如可以采用一種酶實(shí)驗(yàn)對(duì)多肽的活性進(jìn)行檢測(cè)。
可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法對(duì)產(chǎn)生的多肽進(jìn)行回收，例如采用傳統(tǒng)的從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽的方法，其中包括了，但并不局限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。
可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種方法對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行純化，其中包括了，但并不限制于層析方法(例如離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦和大小排阻層析)，電泳方法(例如制備等電位聚焦)、差異溶解度(如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提方法(例如參見ProteinPurification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。
本發(fā)明的第三方面涉及使用本發(fā)明第一方面任一實(shí)施例所定義的突變真細(xì)菌生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的方法，其中包括了在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變真細(xì)菌，由此目的產(chǎn)物得以產(chǎn)生，并且任選使用分離或純化目的產(chǎn)物的步驟。
下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步的解釋說明，然而并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成限制。前面描述的特征和下面的實(shí)施例既可以相互獨(dú)立，也可以相互結(jié)合，它們是以不同的形式來解釋本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1來源于地衣芽孢桿菌rpoB基因的DNA序列從包含有地衣芽孢桿菌染色體DNA片段的質(zhì)?？寺≈?，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定了地衣芽孢桿菌rpoB基因的DNA序列。包含有地衣芽孢桿菌克隆的質(zhì)粒文庫來源于保藏ATCC14580。DNA序列顯示于SEQ ID NO1。
實(shí)施例2地衣芽孢桿菌RpoB蛋白從SEQ ID NO1 DNA序列的開放閱讀框中翻譯的地衣芽孢桿菌RpoB蛋白顯示于SEQ ID NO2。
實(shí)施例3DNA聚合酶片段比對(duì)采用BLAST搜索對(duì)SEQ ID NO2中位置461到500處的40個(gè)地衣芽孢桿菌RpoB蛋白片段與已發(fā)表的不同細(xì)菌來源的RpoB蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)。結(jié)果顯示于附圖1中，其中第一行為地衣芽孢桿菌RpoB蛋白序列。
實(shí)施例4特異rpoB突變體產(chǎn)量/生產(chǎn)力的改善材料和方法正如WO 91/09129和WO 99/41358中所記載的，表達(dá)盒的一個(gè)或更多個(gè)拷貝被整合到下列株系的染色體中。
株系JA 677能夠過量生產(chǎn)內(nèi)源α-淀粉酶變體的地衣芽孢桿菌(BLA)。
JA 678JA 677的rpoB突變，導(dǎo)致氨基酸改變Q469R。
JA 688能夠過量生產(chǎn)嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶突變體的地衣芽孢桿菌(BSG)。
JA 689JA 688的rpoB突變，導(dǎo)致氨基酸改變Q469R。
JA 690JA 688的rpoB突變，導(dǎo)致氨基酸改變H482R。
JA 684能夠過量生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的地衣芽孢桿菌(BAN)。
JA 687JA 684的rpoB突變，導(dǎo)致氨基酸改變A478D。
SJ 4671能夠過量生產(chǎn)內(nèi)源α-淀粉酶的地衣芽孢桿菌(BLA)。
SJ 4671 rif10SJ 4671的rpoB突變，導(dǎo)致氨基酸改變A478V。
SJ 4490能夠過量生產(chǎn)內(nèi)源α-淀粉酶的地衣芽孢桿菌。
JA 675SJ 4490的rpoB突變，導(dǎo)致氨基酸改變Q469R和R485H。
SJ 6129能夠過量生產(chǎn)Bacillusα-淀粉酶突變體的地衣芽孢桿菌(WO00/60060中公布)；(糾正-實(shí)際的國際參考號(hào)為SJ 6093)。
SJ 6129 rif10SJ 6129(SJ 6093)的rpoB突變，導(dǎo)致氨基酸改變S487L。
培養(yǎng)基LB瓊脂10g/l來源于酪蛋白的蛋白胨；5g/l酵母抽提物；10g/l氯化鈉；12g/lBacto-瓊脂，用50KAN調(diào)整pH到6.8-7.2，其中50KAN為含有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂。M-9緩沖液(使用去離子水)磷酸氫二鈉·2H2O 8.8g/l；磷酸二氫鉀3g/l；氯化鈉4g/l；硫酸鎂·7H2O 0.2g/l。
Med-F搖瓶培養(yǎng)基(于去離子水混勻后達(dá)到既定濃度)A部分Maltodextrin 11g/l；Casitone 6.2g/l；Bacto-蛋白胨0.5；酵母抽提物0.5g/l；硫酸鎂·7H2O 0.5g/l；氯化鈣0.1g/l；檸檬酸50mg/l；痕量金屬(硫酸鋅·H2O 2.5mg/l；硫酸亞鐵·7H2O 9.9mg/l；硫酸銅·5H2O 1.0mg/l；氯化鋅1.0mg/l)；Pluronic 0.1g/l；調(diào)整pH為6.7。
B部分5g/l磷酸二氫鉀，用氫氧化鈉調(diào)整pH為6.7。
A部分和B部分在121℃下滅菌20分鐘后，按1∶1的比例進(jìn)行混合。
搖瓶評(píng)估菌株的步驟首先，菌株在37℃下、在瓊脂中斜面培養(yǎng)1天。(SJ4671、SJ4671rif10、SJ4490、JA675在LB瓊脂中培養(yǎng)；JA677、JA678、JA688、JA689、JA690、JA684、JA687在含有50KAN的LB中培養(yǎng))。然后，瓊脂用M-9緩沖液清洗，并且在650nm(OD650nm)下測(cè)定獲得的細(xì)胞懸浮液的光學(xué)密度。
基于OD650nm的測(cè)定結(jié)果，每一個(gè)搖瓶中采用相同數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。此處采用的接種強(qiáng)度為OD×ml細(xì)胞懸浮液＝0.1。每一菌株分別在3個(gè)搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、300rpm，分別培養(yǎng)1、2和3天后，收集樣品。測(cè)定pH、OD650nm和α-淀粉酶活性，并且確定每一菌株的相對(duì)活性，依次計(jì)算出每一rpoB突變菌株其親本菌株的相對(duì)活性，結(jié)果顯示于表1。從上述結(jié)果可以清楚看出上述rpoB突變對(duì)酶的生產(chǎn)力/產(chǎn)量具有重大的效果。
表1rpoB突變菌株的相對(duì)淀粉酶活性(相對(duì)于親本菌株的％)


實(shí)施例5來源于Bacillus clausii部分rpoB基因的DNA序列從包含有B.clausii染色體DNA片段的質(zhì)?？寺≈校捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定了Bacillus clausii部分rpoB基因的DNA序列。包含有B.clausii克隆的質(zhì)粒文庫來源于保藏NCIB 10309。部分DNA序列顯示于SEQ ID NO3。
實(shí)施例6B.clausii RpoB蛋白從SEQ ID NO3 DNA序列的開放閱讀框中翻譯的B.clausii RpoB蛋白顯示于SEQ ID NO4。
實(shí)施例7DNA聚合酶片段比對(duì)采用BLAST搜索對(duì)SEQ ID NO4中位置462到501處的40個(gè)B.clausiiRpoB蛋白片段與已發(fā)表的不同細(xì)菌來源的RpoB蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)，其中上述蛋白片段在RpoB蛋白的位置上與地衣芽孢桿菌同源和等價(jià)。結(jié)果顯示于附圖1中，其中第一行為地衣芽孢桿菌RpoB蛋白序列，上數(shù)第二行為B.clausii RpoB蛋白序列。
實(shí)施例8特異rpoB突變體產(chǎn)量/生產(chǎn)力的改善材料與方法采用天然表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。
株系NCIB 10309B.clausii(產(chǎn)生其內(nèi)源蛋白，BCP)。
PP143NCIB 10309的典型突變體，其在編碼顯示于SEQ ID NO4中位置462到501處的40個(gè)B.clausii RpoB蛋白氨基酸片段的DNA區(qū)域中沒有發(fā)生突變，其蛋白片段與SEQ ID No2中位置461到500處顯示的地衣芽孢桿菌RpoB蛋白同源。
NN49201PP143的rpoB基因突變，導(dǎo)致SEQ ID NO4中位置462到501處的40個(gè)B.clausii RpoB蛋白氨基酸片段發(fā)生氨基酸取代A479D。SEQID NO4中的取代A479D對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2中的等價(jià)取代A478D，可從附圖1中最上端兩行的比對(duì)中清楚地看出。
培養(yǎng)基瓊脂例如B3-瓊脂等適于支持B.clausii良好生長的適當(dāng)瓊脂。
蛋白胨6g/l；肽酶4g/l；酵母抽提物3g/l；肉類提取物1.5g/l；葡萄糖·1H2O1g/l；使用去離子水的瓊脂20g/l，用氫氧化鈉/鹽酸調(diào)整pH到7.35，在121℃下滅菌40分鐘。冷卻到40-50℃后，加入經(jīng)過濾滅菌的pH為9的10％v/v的1M碳酸氫鈉和經(jīng)121℃滅菌40分鐘的用去離子水溶解的10％w/v干脫脂牛奶的10％v/v。
M-9緩沖液(使用去離子水)磷酸氫二鈉·2H2O 8.8g/l；磷酸二氫鉀3g/l；氯化鈉4g/l；硫酸鎂·7H2O 0.2g/l。
Med-F搖瓶培養(yǎng)基(于去離子水最終混勻后達(dá)到既定濃度)A部分Maltodextrin 11g/l；Casitone 6.2g/l；Bacto-蛋白胨0.5；酵母抽提物0.5g/l；硫酸鎂·7H2O 0.5g/l；氯化鈣0.1g/l；檸檬酸50mg/l；痕量金屬(硫酸鋅·H2O 2.5mg/l；硫酸亞鐵·7H2O 9.9mg/l；硫酸銅·5H2O 1.0mg/l；氯化鋅1.0mg/l)；Pluronic 0.1g/l；調(diào)整pH為6.7，于121℃下滅菌20分鐘。
B部分5g/l磷酸二氫鉀，28.6g/l碳酸鈉；8.4g/l碳酸氫鈉，用磷酸調(diào)整pH為9.0，該溶液經(jīng)過濾滅菌后立即使用。
A部分和B部分滅菌后進(jìn)行混合。
搖瓶評(píng)估菌株的步驟首先，菌株在37℃下、在瓊脂中斜面培養(yǎng)1天。然后，瓊脂用M-9緩沖液清洗，并且在650nm(OD650nm)下測(cè)定獲得的細(xì)胞懸浮液的光學(xué)密度。
基于OD650nm的測(cè)定結(jié)果，每一個(gè)搖瓶中采用相同數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。此處采用的接種強(qiáng)度為OD×ml細(xì)胞懸浮液＝0.1。每一菌株在2個(gè)搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、300rpm，分別培養(yǎng)1、2和3天后，收集樣品。測(cè)定pH、OD650nm和蛋白酶活性，并且確定每一菌株的相對(duì)活性，依次計(jì)算出每一rpoB突變菌株其親本菌株的相對(duì)活性，結(jié)果顯示于表2。從上述結(jié)果可以清楚看出上述rpoB突變對(duì)酶的生產(chǎn)力/產(chǎn)量具有重大的效果。
表2rpoB突變菌株的相對(duì)蛋白酶活性(相對(duì)于親本菌株的％)

序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>具有改變產(chǎn)物產(chǎn)量特性的真細(xì)菌RNA聚合酶突變體<130>10245.204-WO<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3579<212>DNA<213>Bacillus licheniformis<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3579)<223>編碼RNA聚合酶β-亞基(RpoB)的DNA顯示于SEQ ID NO2中<400>1ttgacaggtc aactagttca gtatggacga caccgccagc gcagaagcta tgcacgcatt 60agcgaagtgt tagaattacc aaatctcatt gaaattcaaa cctcttctta tcagtggttt120cttgatgagg gtcttagaga gatgtttcaa gacatatcgc caattgagga tttcactggt180aacctctctc tggaatttat cgactacagc ttgggcgagc ctaagtatcc ggtagaagaa240tcaaaagagc gggatgtgac ctattcagct ccgctgcggg ttaaagtccg cttaatcaac300aaagaaaccg gcgaagtaaa ggatcaggat gtcttcatgg gcgatttccc tattatgaca360gacactggaa ccttcattat caacggtgca gaacgggtca tcgtatctca gctcgttcgt420tctccaagtg tatattttag tggtaaagta gacaaaaacg gtaagaaagg ttttaccgcg480actgtcattc caaaccgtgg cgcatggtta gaatacgaga ctgatgcgaa agatgttgtt540tacgtacgca tcgatcgcac acgtaagttg ccggttacgg ttcttttgcg tgctcttggc600ttcggatctg accaagagat cattgatctc atcggtgaaa acgagtatct gcgcaatacg660cttgataaag ataatacgga aaacaccgat aaagcgcttc ttgaaatcta cgagcgtctt720cgtccagggg agccgcctac cgtagaaaac gcaaaaagcc tgcttgattc aaggttcttt780gatccgaaaa gatatgacct tgcgagtgta ggacgttata aaattaataa aaagcttcac840atcaaaaacc gactttttaa tcagcggctt gctgaaacgc tagtcgaccc tgaaacaggc900gaaatccttg ccgaaaaagg agcgatttta gacagaagaa cgcttgataa agttctgccg960taccttgaaa acggaatcgg ttttaaaaag ctttatccga acggcggagt tgtcgaagac 1020gaagtaacgc ttcagtctat caaaatctat gctccgacag accaagaagg ggagcagaca 1080atcaatgtga ttggaaatgc ttatatcgaa gaaggcgtta agaatattac accttctgat 1140attatcgctt ccatcagcta tttctttaac ctgcttcacg gagtgggcga taccgacgat 1200atcgaccatc taggaaaccg ccgtctccgt tcagtgggag agcttctgca aaaccaattc 1260cgtattggtt taagcagaat ggagcgcgtt gttcgtgaaa gaatgtctat tcaagataca 1320aacacgatca cgccgcagca gctgatcaat attcgccctg tcatcgcatc aatcaaagag 1380
tttttcggaa gctcgcagct ttctcagttt atggatcaga cgaatccgct tgctgagctg1440acgcataagc gccgtctgtc agcgctcgga ccgggcggtt tgactcgtga gcgcgccgga1500atggaagtcc gtgacgttca ctattcacac tacggccgga tgtgtccgat tgaaacccct1560gagggtccaa acatcggctt gatcaactcg ctttcttcat tcgcgaaagt gaaccgtttc1620ggcttcatcg aaacgccgta tcgccgcgtc gatcctgaaa ctggaaaagt aacgccgaga1680atcgattact tgacagctga tgaagaagac aactatgtcg ttgcccaggc aaacgcacgc1740ctgaatgatg acggttcttt tgtggatgac agcatcgtcg cccgtttcag aggggagaac1800accgttgttc cgaaagaccg cgtcgactat atggacgttt cgcctaaaca ggttgtctct1860gccgcgactg catgtattcc tttcttggaa aacgatgact caaaccgcgc ccttatggga1920gcgaacatgc aacgtcaggc cgtacctctt atgcagcctg aatcgccgat cgtcggaacc1980gggatggaat atgtatctgc gaaagactcc ggtgccgctg ttatttgccg ccaccctgga2040atcgttgaac gggtggaagc gaagaacatc tgggtgcgcc gctatgaaga agtcgacggc2100cagaaagtca aagggaacct tgataaatac agcctgctga agtttgtccg ttccaaccag2160ggaacttgct acaaccagcg tccgatcgta agcgtcggtg atgaggttga aaaaggtgaa2220attttagctg acggtccgtc catggaaaaa ggtgagcttg cccttggacg caacgtcatg2280gtcggcttta tgacatggga tggctacaac tatgaggatg ccatcatcat gagcgaacgc2340cttgtaaaag acgacgtata cacgtctatt catattgaag aatacgaatc agaggcccgg2400gatacaaaac tcggacctga agaaatcact cgcgatattc cgaacgtcgg tgaggacgct2460cttcgcaatc tcgatgaacg cggaattatc cgtgtcggtg ctgaagtaaa agacggagat2520cttcttgttg gtaaagtaac ccctaaaggt gttacagagc ttacggcgga agaacgcctg2580cttcatgcca tcttcgggga aaaagcgcgt gaagtgcgtg atacgtcgct gcgtgtacct2640cacggaggcg gcggtatcat ccttgatgta aaagtgttca accgcgaaga cggagacgaa2700ctgcctccgg gcgttaacca gctcgtccgc gtctacatcg ttcagaagcg taaaatttct2760gaaggggaca aaatggccgg acgccacggt aacaaaggtg ttatttcgaa aattcttccg2820gaggaagata tgccgtatct gcctgacgga acgccgattg acatcatgtt aaacccgctg2880ggcgtaccat cgcgtatgaa catcgggcag gtgttggagc tgcaccttgg tatggctgca2940cgccgcctcg gtctgcatgt cgcgtcacct gtatttgacg gtgcccgcga agaagatgtg3000tgggaaaccc ttgaagaagc cggcatgtca agagacgcaa aaaccgtcct ttacgacggc3060cgaactgggg agccgtttga caaccgggtt tctgtcggca tcatgtacat gatcaaactg3120gcacacatgg ttgacgacaa attgcacgca cgttcaaccg gtccttactc actcgttacc3180cagcagcctc tcggaggtaa agcgcagttc ggcggacagc gttttggaga gatggaagtt3240tgggcgcttg aagcttatgg tgcagcatat acgctacaag agatcctgac tgttaaatcg3300gatgatgtcg taggccgtgt gaaaacatat gaagccatcg taaaaggcga caatgttcca3360gaacctggtg ttccggaatc gttcaaagta ttgatcaaag agcttcaaag cttaggtatg3420gacgtcaaaa ttctatcaag cgacgaagaa gaaatcgaaa tgagagactt ggaagacgac3480
gaagacgcga aacaaaacga agggctttct ctgccgaatg atgaagagtc cgaagagttg 3540gtttctgctg acgcagaacg cgatgtcgtt acaaaagaa3579<210>2<211>1193<212>PRT<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)<220>
<221>肽<222>(1)..(1193)<223>RNA聚合酶β-亞基，RpoB<400>2Leu Thr Gly Gln Leu Val Gln Tyr Gly Arg His Arg Gln Arg Arg Ser1 5 10 15Tyr Ala Arg Ile Ser Glu Val Leu Glu Leu Pro Asn Leu Ile Glu Ile20 25 30Gln Thr Ser Ser Tyr Gln Trp Phe Leu Asp Glu Gly Leu Arg Glu Met35 40 45Phe Gln Asp Ile Ser Pro Ile Glu Asp Phe Thr Gly Asn Leu Ser Leu50 55 60Glu Phe Ile Asp Tyr Ser Leu Gly Glu Pro Lys Tyr Pro Val Glu Glu65 70 75 80Ser Lys Glu Arg Asp Val Thr Tyr Ser Ala Pro Leu Arg Val Lys Val85 90 95Arg Leu Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu Val Lys Asp Gln Asp Val Phe100 105 110Met Gly Asp Phe Pro Ile Met Thr Asp Thr Gly Thr Phe Ile Ile Asn115 120 125Gly Ala Glu Arg Val Ile Val Ser Gln Leu Val Arg Ser Pro Ser Val130 135 140Tyr Phe Ser Gly Lys Val Asp Lys Asn Gly Lys Lys Gly Phe Thr Ala145 150 155 160Thr Val Ile Pro Asn Arg Gly Ala Trp Leu Glu Tyr Glu Thr Asp Ala165 170 175Lys Asp Val Val Tyr Val Arg Ile Asp Arg Thr Arg Lys Leu Pro Val180 185 190Thr Val Leu Leu Arg Ala Leu Gly Phe Gly Ser Asp Gln Glu Ile Ile195 200 205
Asp Leu Ile Gly Glu Asn Glu Tyr Leu Arg Asn Thr Leu Asp Lys Asp210 215 220Asn Thr Glu Asn Thr Asp Lys Ala Leu Leu Glu Ile Tyr Glu Arg Leu225230 235 240Arg Pro Gly Glu Pro Pro Thr Val Glu Asn Ala Lys Ser Leu Leu Asp245 250 255Ser Arg Phe Phe Asp Pro Lys Arg Tyr Asp Leu Ala Ser Val Gly Arg260 265 270Tyr Lys Ile Asn Lys Lys Leu His Ile Lys Asn Arg Leu Phe Asn Gln275 280 285Arg Leu Ala Glu Thr Leu Val Asp Pro Glu Thr Gly Glu Ile Leu Ala290 295 300Glu Lys Gly Ala Ile Leu Asp Arg Arg Thr Leu Asp Lys Val Leu Pro305 310 315 320Tyr Leu Glu Asn Gly Ile Gly Phe Lys Lys Leu Tyr Pro Asn Gly Gly325 330 335Val Val Glu Asp Glu Val Thr Leu Gln Ser Ile Lys Ile Tyr Ala Pro340 345 350Thr Asp Gln Glu Gly Glu Gln Thr Ile Asn Val Ile Gly Asn Ala Tyr355 360 365Ile Glu Glu Gly Val Lys Asn Ile Thr Pro Ser Asp Ile Ile Ala Ser370 375 380Ile Ser Tyr Phe Phe Asn Leu Leu His Gly Val Gly Asp Thr Asp Asp385 390 395 400Ile Asp His Leu Gly Asn Arg Arg Leu Arg Ser Val Gly Glu Leu Leu405 410 415Gln Asn Gln Phe Arg Ile Gly Leu Ser Arg Met Glu Arg Val Val Arg420 425 430Glu Arg Met Ser Ile Gln Asp Thr Asn Thr Ile Thr Pro Gln Gln Leu435 440 445Ile Asn Ile Arg Pro Val Ile Ala Ser Ile Lys Glu Phe Phe Gly Ser450 455 460Ser Gln Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Thr Asn Pro Leu Ala Glu Leu465 470 475 480
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Lys Leu Ala His Met Val Asp Asp Lys Leu His Ala Arg Ser Thr104010451050Gly Pro Tyr Ser Leu Val Thr Gln Gln Pro Leu Gly Gly Lys Ala105510601065Gln Phe Gly Gly Gln Arg Phe Gly Glu Met Glu Val Trp Ala Leu107010751080Glu Ala Tyr Gly Ala Ala Tyr Thr Leu Gln Glu Ile Leu Thr Val108510901095Lys Ser Asp Asp Val Val Gly Arg Val Lys Thr Tyr Glu Ala Ile110011051110Val Lys Gly Asp Asn Val Pro Glu Pro Gly Val Pro Glu Ser Phe111511201125Lys Val Leu Ile Lys Glu Leu Gln Ser Leu Gly Met Asp Val Lys113011351140Ile Leu Ser Ser Asp Glu Glu Glu Ile Glu Met Arg Asp Leu Glu114511501155Asp Asp Glu Asp Ala Lys Gln Asn Glu Gly Leu Ser Leu Pro Asn116011651170Asp Glu Glu Ser Glu Glu Leu Val Ser Ala Asp Ala Glu Arg Asp117511801185Val Val Thr Lys Glu1190<210>3<211>3546<212>DNA<213>Bacillus clausii<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3546)<223>編碼RNA聚合酶β-亞基(RpoB)的DNA顯示于SEQ ID N04中<400>3ttgacaggtc aactaattca gtatggacgt caccgccagc ggagaagcta tgcgcgaatt 60aatgaagtgc tcgaactgcc aaacttgatt gaaattcaaa cagcttctta tcaatggttt120cttgatgagg gtttgcggga gatgtttcaa gacatttcac cgatccaaga cttcactggc180aatttagtgt tagagtttat tgattacagt ctaggagaac caaagtatcc tgttgatgag240tcaaaagagc gtgacgtgac gtttgccgct cctctacgtg tcaaagttcg ccttattaat300aaagagacag gcgaagtaaa agaacaggaa gtctttatgg gcgatttccc gttgatgaca360
gaaacaggga catttatcat caatggcgct gagcgcgtta tcgtttctca gcttgttcts420tcaccgagcg tttactatag ccaaaagctc gacaaaaacg gaaaaaaagg ctttactgcc480actgtcattc cgaaccgcgg agcgtggctt gagcttgaga cagatgcaaa agatattgtt540tatgtacgta ttgaccgtac tcgtaaaatt ccagtaacag tacttttgcg tgctctaggc600tttgggtctg atcaagaaat cgttgacctt ttaggcgaaa acgagtattt gcgcaacacg660cttgagaaag ataatacgga ctcaactgat aaagtgctgc ttgaaatcta tgagcgtttg720cgcccgggcg agccgccaac agtagaaaat gcgaaaagct tgcttgaatc tcgctttttc780gatcctaagc gttatgacct cgcaaatgtc ggtcgttata aaataaataa aaagcttcat840atcaaaaatc ggctatttaa ccaacgtttg gcggaaaagc ttgttgatcc ggaaacaggc900gaagttctag ctgaagaggg aacacttctt gaccgcagaa cgttggataa actgatcccg960catttggaga aaaatgttgg tttccgtaca gcccgtacat ctggcggcgt tcttgaggaa 1020tccgacgtcg aaatccaatc ggttaaaatt tatgtagcag atgactacga gggcgagcgc 1080gtcatttccg ttattagcaa cggcatggtt gaacgtgacg tgaagcatat tgcccctgct 1140gatatcatcg cttccatcag ctatttcttc aacttgctgc atggtgtcgg cgatacagac 1200gacattgacc atttgggcaa ccgccgtctc cgttcggttg gggaactgtt gcaaaaccaa 1260ttccgaattg gcctttctcg gatggaacgc gtcgtccgtg aacggatgtc gattcaagac 1320ccgaatgtaa ttacgccaca agcgcttatt aacattcgcc cagtcatcgc atcgataaaa 1380gagttctttg gcagctcgca gctttcacag ttcatggacc aaacgaaccc gctcgctgaa 1440ctgacgcata agcgccgtct ttccgcgctt ggcccaggcg gcttaactcg tgagcgcgct 1500ggaatggaag tgcgtgacgt tcactactcc cattacggcc ggatgtgtcc gattgaaacg 1560ccggaaggtc cgaacattgg cttaattaac acgctgtcct cttatgcgaa agtgaatgag 1620ttcggcttta tggaaacacc atatcgccgt gttgaccctg aaacagggaa agtgacagcg 1680cgtatcgact atttaacagc cgatgaagag gacaattatg tagttgccca agcaaatgcg 1740aagctgaatg aagacggatc gtttgtcgat gataacatca ttgcccgctt ccgcggtgaa 1800aacaccgtcg ttccttgcga ccgtgtcgac tatatggacg tttcgcctaa acaagttgtc 1860tctgcggcga cgtcatgtat tccgtttttg gaaaatgacg actcgaaccg cgcactaatg 1920ggcgcaaaca tgcagcgcca ggccgtgcct ttgctcgttc cagaagcacc gcttgtcgga 1980acagggatgg agcacgtgtc tgctaaagat tcaggggctg ctgttgtctc aaaatatgcc 2040ggtatcgttg aacgcgttac tgctaaagaa atttgggtcc gccgcattga agaagtagat 2100ggcaaagaaa cgaaaggcga ccttgataaa tacaaactac aaaaatttgt gcgctccaac 2160cagggcacaa gttataatca gcgcccgatt gtacgcgaag gcgatcgcgt tgaaaaacgt 2220gaaatcctcg cagatggtcc ttcaatggag atgggcgaaa tggcgcttgg ccgcaacgtg 2280cttgtcgcct ttatgacatg ggacggctac aactacgaag atgcgatcat tttaagtgag 2340cgcctagtca aagatgacgt ttatacgtcc atccatattg aggaatatga atcggatgcc 2400
cgtgatacaa aactcggacc tgaagagatt acgcgcgata ttccgaacgt tggtaagaat 2460gcattacgca accttgatga gcggggaatt attcgcatcg gggctgaagt caaagatggc 2520gacattcttg ttggtaaagt gacgccaaag ggcgtaacgg agctgacggc ggaagaacgc 2580ctcttgcatg cgatttttgg agagaaagcc cgtgaagtgc gggatacttc attgcgtgca 2640ccgcatggtg gagacggaat cgttcttgac gtgaaaatct ttaaccgtga agacggcgat 2700gaacttcctc caggcgtcaa ccaacttgtc cgtgtctaca ttgtacaaaa gcggaaaatt 2760aaccagggcg ataaaatggc tggccgtcac gggaacaaag gtgttatttc ccgaatcctg 2820ccagaagaag atatgccgtt tttaccagac ggaacgcctg ttgacattat gttaaaccca 2880cttggcgtgc cttcgcggat gaatatcgga caagtgcttg aactccatct tggtatggct 2940gcccgcaagc taggcatcca tgttgcgtct ccagtatttg acggcgccag tgaagaagat 3000gtttggggca cattggaaga agcaggcatg gcccgagacg gaaaaacaat tttatatgat 3060ggccgtactg gcgaaccgtt tgacaaccgc gtatcagttg ggattatgta tatgatcaag 3120cttgcccata tggttgaacg accaagctcc atgcgcgtca acaggcccgt aactcattcg 3180ttaacgcagc agcttcttgg cggtaaagcc caatttggtg gacagcgttt cggggagatg 3240gaagtatggg cactggaagc atatggtgct gcttacacgc ttccaagaaa tccttcactg 3300ttaaattcag atgacgttgt tgggcgtgtg aaaacgtacg aggcaattgt aaaaggggaa 3360aacgttcctg agccaggggt gccagaatcg tttaaagtcc tcattaaaga attgcaatcg 3420ttgggcatgg atgtgaagat gctctccagc aacgaagagg aaattgaaat gcgtgagctg 3480gatgacgaag aagaccaaac gtctgaaaaa ctcaacctca acttagagac gaacgaatca 3540caacta 3546<210>4<211>1182<212>PRT<213>Bacillus clausii<220>
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340 345 350Ala Asp Asp Tyr Glu Gly Glu Arg Val Ile Ser Val Ile Ser Asn Gly355 360 365Met Val Glu Arg Asp Val Lys His Ile Ala Pro Ala Asp Ile Ile Ala370 375 380Ser Ile Ser Tyr Phe Phe Asn Leu Leu His Gly Val Gly Asp Thr Asp385 390 395 400Asp Ile Asp His Leu Gly Asn Arg Arg Leu Arg Ser Val Gly Glu Leu405 410 415Leu Gln Asn Gln Phe Arg Ile Gly Leu Ser Arg Met Glu Arg Val Val420 425 430Arg Glu Arg Met Ser Ile Gln Asp Pro Asn Val Ile Thr Pro Gln Ala435 440 445Leu Ile Asn Ile Arg Pro Val Ile Ala Ser Ile Lys Glu Phe Phe Gly450 455 460Ser Ser Gln Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Thr Asn Pro Leu Ala Glu465 470 475 480Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu Gly Pro Gly Gly Leu Thr485 490 495Arg Glu Arg Ala Gly Met Glu Val Arg Asp Val His Tyr Ser His Tyr500 505 510Gly Arg Met Cys Pro Ile Glu Thr Pro Glu Gly Pro Asn Ile Gly Leu515 520 525Ile Asn Thr Leu Ser Ser Tyr Ala Lys Val Asn Glu Phe Gly Phe Met530 535 540Glu Thr Pro Tyr Arg Arg Val Asp Pro Glu Thr Gly Lys Val Thr Ala545 550 555 560Arg Ile Asp Tyr Leu Thr Ala Asp Glu Glu Asp Asn Tyr Val Val Ala565 570 575Gln Ala Asn Ala Lys Leu Asn Glu Asp Gly Ser Phe Val Asp Asp Asn580 585 590Ile Ile Ala Arg Phe Arg Gly Glu Asn Thr Val Val Pro Cys Asp Arg595 600 605Val Asp Tyr Met Asp Val Ser Pro Lys Gln Val Val Ser Ala Ala Thr610 615 620
Ser Cys Ile Pro Phe Leu Glu Asn Asp Asp Ser Asn Arg Ala Leu Met625 630 635 640Gly Ala Asn Met Gln Arg Gln Ala Val Pro Leu Leu Val Pro Glu Ala645 650 655Pro Leu Val Gly Thr Gly Met Glu His Val Ser Ala Lys Asp Ser Gly660 665 670Ala Ala Val Val Ser Lys Tyr Ala Gly Ile Val Glu Arg Val Thr Ala675 680 685Lys Glu Ile Trp Val Arg Arg Ile Glu Glu Val Asp Gly Lys Glu Thr690 695 700Lys Gly Asp Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Gln Lys Phe Val Arg Ser Asn705 710 715 720Gln Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Arg Pro Ile Val Arg Glu Gly Asp Arg725 730 735Val Glu Lys Arg Glu Ile Leu Ala Asp Gly Pro Ser Met Glu Met Gly740 745 750Glu Met Ala Leu Gly Arg Asn Val Leu Val Ala Phe Met Thr Trp Asp755 760 765Gly Tyr Asn Tyr Glu Asp Ala Ile Ile Leu Ser Glu Arg Leu Val Lys770 775 780Asp Asp Val Tyr Thr Ser Ile His Ile Glu Glu Tyr Glu Ser Asp Ala785 790 795 800Arg Asp Thr Lys Leu Gly Pro Glu Glu Ile Thr Arg Asp Ile Pro Asn805 810 815Val Gly Lys Asn Ala Leu Arg Asn Leu Asp Glu Arg Gly Ile Ile Arg820 825 830Ile Gly Ala Glu Val Lys Asp Gly Asp Ile Leu Val Gly Lys Val Thr835 840 845Pro Lys Gly Val Thr Glu Leu Thr Ala Glu Glu Arg Leu Leu His Ala850 855 860Ile Phe Gly Glu Lys Ala Arg Glu Val Arg Asp Thr Ser Leu Arg Ala865 870 875 880Pro His Gly Gly Asp Gly Ile Val Leu Asp Val Lys Ile Phe Asn Arg885 890 895
Glu Asp Gly Asp Glu Leu Pro Pro Gly Val Asn Gln Leu Val Arg Val900 905 910Tyr Ile Val Gln Lys Arg Lys Ile Asn Gln Gly Asp Lys Met Ala Gly915 920 925Arg His Gly Asn Lys Gly Val Ile Ser Arg Ile Leu Pro Glu Glu Asp930 935 940Met Pro Phe Leu Pro Asp Gly Thr Pro Val Asp Ile Met Leu Asn Pro945 950 955 960Leu Gly Val Pro Ser Arg Met Asn Ile Gly Gln Val Leu Glu Leu His965 970 975Leu Gly Met Ala Ala Arg Lys Leu Gly Ile His Val Ala Ser Pro Val980 985 990Phe Asp Gly Ala Ser Glu Glu Asp Val Trp Gly Thr Leu Glu Glu Ala995 10001005Gly Met Ala Arg Asp Gly Lys Thr Ile Leu Tyr Asp Gly Arg Thr101010151020Gly Glu Pro Phe Asp Asn Arg Val Ser Val Gly Ile Met Tyr Met102510301035Ile Lys Leu Ala His Met Val Glu Arg Pro Ser Ser Met Arg Val104010451050Asn Arg Pro Val Thr His Ser Leu Thr Gln Gln Leu Leu Gly Gly105510601065Lys Ala Gln Phe Gly Gly Gln Arg Phe Gly Glu Met Glu Val Trp107010751080Ala Leu Glu Ala Tyr Gly Ala Ala Tyr Thr Leu Pro Arg Asn Pro108510901095Ser Leu Leu Asn Ser Asp Asp Val Val Gly Arg Val Lys Thr Tyr110011051110Glu Ala Ile Val Lys Gly Glu Asn Val Pro Glu Pro Gly Val Pro111511201125Glu Ser Phe Lys Val Leu Ile Lys Glu Leu Gln Ser Leu Gly Met113011351140Asp Val Lys Met Leu Ser Ser Asn Glu Glu Glu Ile Glu Met Arg114511501155
Glu Leu Asp Asp Glu Glu Asp Gln Thr Ser Glu Lys Leu Asn Leu116011651170Asn Leu Glu Thr Asn Glu Ser Gln Leu11751180
權(quán)利要求
1.一種分離的突變真細(xì)菌，其包含至少一個(gè)突變，上述突變導(dǎo)致了由rpoB基因編碼的RNA聚合酶β-亞基中至少一個(gè)氨基酸發(fā)生取代，在同等的生長條件下，與等基因親本株系產(chǎn)生的相同目的產(chǎn)物的產(chǎn)量相比，上述突變作用導(dǎo)致了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變，其中所述的至少一個(gè)氨基酸取代發(fā)生在SEQ ID NO2中位置469、478、482、485或487中的任何位置，或者任何真細(xì)菌RNA聚合酶β-亞基家族成員的等價(jià)位置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個(gè)氨基酸取代改善了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，或提供了較高的目的產(chǎn)物產(chǎn)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個(gè)氨基酸取代包括Q469R、A478D、A478V、H482R、H482P、R485H或S487L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個(gè)氨基酸取代包括在SEQ ID NO2中位置469或478處的任何隨機(jī)取代，或在任何真細(xì)菌RNA聚合酶β-亞基家族成員的等價(jià)位置所發(fā)生的取代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個(gè)氨基酸取代包括在SEQ ID NO2中位置469、478、和/或487處的任何隨機(jī)取代，或在任何真細(xì)菌RNA聚合酶β-亞基家族成員的等價(jià)位置所發(fā)生的取代。
6.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個(gè)氨基酸取代包括Q469R、A478D、和/或S487L。
7.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中至少一個(gè)氨基酸取代包括Q469R或A478D。
8.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中來源于細(xì)菌的RpoB蛋白與SEQ ID NO2第461到500位置處氨基酸序列所述蛋白之等價(jià)區(qū)域具有至少80％的同源性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離的突變真細(xì)菌，其中來源于細(xì)菌的RpoB蛋白與SEQ ID NO2第461到500位點(diǎn)處氨基酸序列所述蛋白的等價(jià)區(qū)域具有至少90％的同源性。
10.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中所述細(xì)菌包括了革蘭氏陽性菌。
11.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中所述細(xì)菌包括了芽孢桿菌的各個(gè)種。
12.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其包括了Bacillusalkalophilus，解淀粉芽孢桿菌，短芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，Bacillus clausii，凝結(jié)芽孢桿菌，Bacillus lautus，緩慢芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽胞桿菌。
13.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其包括了緩慢芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，Bacillus clausii，嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。
14.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為地衣芽孢桿菌。
15.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是基因產(chǎn)物或代謝途徑的產(chǎn)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的突變真細(xì)菌，其中基因包含在操縱子中。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的分離的突變真細(xì)菌，其中基因是突變真細(xì)菌外源或內(nèi)源基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任何所述的分離的突變真細(xì)菌，其中基因以至少兩個(gè)拷貝的形式存在。
19.根據(jù)權(quán)利要求15-18中任何所述的分離的突變真細(xì)菌，其中基因以至少十個(gè)拷貝的形式存在。
20.根據(jù)權(quán)利要求15-19中任何所述的分離的突變真細(xì)菌，其中基因以至少100個(gè)拷貝的形式存在。
21.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物包括多肽、維生素、氨基酸、抗生素、碳水化合物或表面活性劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是一種多肽，優(yōu)選是一種酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離的突變真細(xì)菌，其中酶選自分類系統(tǒng)中的下述酶類氧化還原酶(EC 1)、轉(zhuǎn)移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、異構(gòu)酶(EC 5)或連接酶(EC 6)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的分離的突變真細(xì)菌，其中酶選自具有下述活性的酶類氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、haloperoxidase、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或者木聚糖酶。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的突變真細(xì)菌，其中酶是淀粉酶或甘露聚糖酶。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是包括纖維素結(jié)合區(qū)、淀粉結(jié)合區(qū)、抗體、殺微生物肽、激素或者融合蛋白多肽的多肽。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是碳水化合物，優(yōu)選透明質(zhì)酸。
28.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中真細(xì)菌是重組真細(xì)菌。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是重組多肽。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的分離的突變真細(xì)菌，其中編碼多肽的基因被整合到突變真細(xì)菌的宿主染色體上，但在整合位點(diǎn)處并未留有任何抗生素抗性標(biāo)記基因。
31.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變與生長在等同條件下的等基因親本株系正常水平相比，其產(chǎn)量至少增長5％到1000％。
32.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變與生長在等同條件下的等基因親本株系正常水平相比，其產(chǎn)量至少增長5％到500％。
33.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變與生長在等同條件下的等基因親本株系正常水平相比，其產(chǎn)量至少增長5％到250％。
34.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的改變包括改善產(chǎn)量或改善生產(chǎn)力。
35.根據(jù)上述任何權(quán)利要求所述的分離的突變真細(xì)菌，其中目的產(chǎn)物是分泌型、膜結(jié)合型或存在于細(xì)胞內(nèi)。
36.一種在突變真細(xì)菌中生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的方法，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1-35中任意之一所定義的突變真細(xì)菌，由此產(chǎn)生所述目的產(chǎn)物。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其進(jìn)一步包含分離或純化目的產(chǎn)物。
38.權(quán)利要求1-35中任意之一所述的突變真細(xì)菌在生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物中的用途，其中包括了在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)上述突變真細(xì)菌，由此產(chǎn)生所述目的產(chǎn)物。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的用途，其進(jìn)一步包含分離或純化目的產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的突變真細(xì)菌，其包含至少一個(gè)突變，上述突變導(dǎo)致了由rpoB基因編碼的RNA聚合酶β－亞基中至少一個(gè)氨基酸發(fā)生取代，因此在同等的生長條件下，與等基因親本株系產(chǎn)生的目的產(chǎn)物的產(chǎn)量相比，上述突變作用導(dǎo)致了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生了改變，其中所述的至少一個(gè)氨基酸取代發(fā)生在SEQ ID NO2中位置469、478、482、485或487中的任意一個(gè)，或者任一真細(xì)菌RNA聚合酶β－亞基家族成員的等價(jià)位置。本發(fā)明的另一方面涉及一種在突變真細(xì)菌中生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物的方法以及本發(fā)明突變真細(xì)菌在生產(chǎn)至少一種目的產(chǎn)物中的用途。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1610740SQ02826472
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月29日
發(fā)明者斯蒂恩·T·喬根森, 詹斯·T·安德森, 尼爾斯·班克, 普雷本·尼爾森 申請(qǐng)人:諾維信公司