專利名稱：序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及序列。具體而言，本發(fā)明涉及吡喃鄰酮醛糖(pyranosone)脫水酶的氨基酸序列，及編碼它的核酸序列。
背景技術：
和現(xiàn)有技術文獻中記載過葡萄糖可被吡喃糖2-氧化酶(EC 1.1.3.10，P2O)氧化形成葡糖醛酮(D-arabino-hexos-2-ulose)，然后被吡喃鄰酮醛糖脫水酶(PD)轉化成藍草菌酮(cortalcerone)[Koths，K.；Halenbeck，R.；Moreland，M.(1992)，Carbohydr Res.Vol.232 No.1，59-75頁；Gabriel，J.；Volc，J.；Sedmera，P.；Daniel，G.；Kubatova，E.(1993)，Arch.Microbi.，16027-34]。P2O和PD已經(jīng)在真菌中純化，P2O已被克隆。PD已經(jīng)由Koths等(1992)從卵形多孔菌(Polyporus obtusus)純化，并由Gabriel等(1993)從黃孢原毛平革菌(黃孢原毛平革菌)純化。然而，迄今為止，還沒有描述過PD的氨基酸或核苷酸序列。
現(xiàn)有技術中已經(jīng)公開了淀粉可被轉化成1，5-脫水-D-果糖(AF)[S.Yu和J.Marcussen，Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering；Gilbert，H.J.；Davies，G.J；Henrissat B.；Svensson，B.，Eds.；RoyalSociety of Chemistry(RS.C)Press，1999.242-250]。而且進一步顯示很多真菌和紅藻提取物都可將AF酶轉化成薄閉殼素，但還沒有分離，純化或描述過所涉及的酶[Baute，M-A.；Deffieux，G.；Baute，R.(1986)，Phytochemistry(Oxf)vol.251472-1473；Broberg，A.，Kenne，L.，和Pedersén，M.(1996)，Phytochemistry(oxf).41151-154]。迄今為止，還沒有暗示表明PD可在AF向薄閉殼素的轉化中起作用。
而且還記載了子囊吡喃酮(ascopyrone)P(APP)可從AF產(chǎn)生[Baute，M-A.；Deffieux，G.；Vercauteren，J.；Baute，R.；Badoc，A.(1993)，Phytochemistry(oxf)vol.33 no.1，41-45]。又，沒有證據(jù)表明PD涉及該過程。
發(fā)明概述從大方面講，本發(fā)明涉及編碼吡喃鄰酮醛糖脫水酶的氨基酸序列及核苷酸序列的描述。
本發(fā)明另一方面涉及先前未公開的吡喃鄰酮醛糖脫水酶的應用，包括AF向薄閉殼素和APP的轉化，以及葡糖醛酮向藍草菌酮的轉化。
本發(fā)明各方面是在權利要求和下列說明中給出的。
簡言之，本發(fā)明的一些方面涉及1.一種新的氨基酸序列2.一種新的核苷酸序列3.制備所述氨基酸序列的方法4.制備所述核苷酸序列的方法5.含有所述核苷酸序列的表達系統(tǒng)6.表達所述核苷酸序列的方法7.含有所述核苷酸序列的轉化宿主/宿主細胞8.所述氨基酸序列的應用9.所述核苷酸序列的應用本發(fā)明所用的術語“表達”，“被表達的”和“可表達的”分別與術語“轉錄”，“被轉錄的”和“可轉錄的”同義。
有關本發(fā)明核苷酸序列的其它方面包括含有本發(fā)明序列的構建體；含有本發(fā)明序列的載體；含有本發(fā)明序列的質粒；含有本發(fā)明序列的轉化細胞；含有本發(fā)明序列的轉化組織；含有本發(fā)明序列的轉化器官；含有本發(fā)明序列的轉化宿主；含有本發(fā)明序列的轉化生物。本發(fā)明還包括使用它們表達核苷酸序列的方法，如在宿主植物細胞中表達；包括轉化它們的方法。
為了便于參考，現(xiàn)在適當?shù)臉祟}下面討論本發(fā)明的這些及其它方面。然而，每個部分下面的教導并非必需限制為每個具體的部分。
發(fā)明詳述一方面，本發(fā)明涉及一種含有選自下列至少一個氨基酸序列的分離多肽，或其變體，同系物或衍生物(i)KPHCEPEQPAALPLFQPQLVQGGRPDXYWVEAFPFRSDSSK；(ii)SDIQMFVNPYATTNNQSSXWTPVSLAKLDFPVAMHYADITK；(iii)VSWLENPGELR；(iv)DGVDCLWYDGAR；(v)PAGSPTGIVRAEWTRHVLDVFGXLXXK；(vi)HTGSIHQVVCADIDGDGEDEFLYAMMGADPPDFQRTGVWCYK；(vii)TEMEFLDVAGK；(viii)KLTLVVLPPFARLDVERNVSGVK；(ix)SMDELVAHNLFPAYVPDSVR；(x)NDATDGTPVLALLDLDGGPSPQAWNISHVPPGTDMYEIAHAK；(xi)TGSLVCARWPPVK；(xii)NQRVAGTHSPAAMGLTSRWAVTK；(xiii)GQITFRLPEAPDHGPLFLSVSAIRHQ；(xiv)KPHXEPEQPAALPLFQPQLVV(Q)GGRPDXY；其中X是未知的氨基酸殘基。
另一方面，本發(fā)明涉及一種核苷酸序列，選自(a)編碼上述氨基酸序列的核苷酸序列；(b)一種核苷酸序列，它是(a)核苷酸序列的變體，同系物，衍生物或片段；(c)一種核苷酸序列，它是(a)核苷酸序列的互補序列；(d)一種核苷酸序列，它是(a)核苷酸序列的變體，同系物，衍生物或片段的互補序列；(e)能夠與(a)核苷酸序列雜交的核苷酸序列；(f)能與(a)核苷酸序列的變體，同系物，衍生物或片段雜交的核苷酸序列；(g)一種核苷酸序列，它是能與(a)核苷酸序列雜交的核苷酸序列互補序列；(h)一種核苷酸序列，它是能夠與(a)核苷酸序列的變體，同系物，衍生物或片段雜交的核苷酸序列的互補序列；
(i)一種能夠與(a)核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列；(j)一種能夠與(a)核苷酸序列的變體，同系物，衍生物或片段的互補序列雜交的核苷酸序列；(k)含有(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)，(i)，和/或(j)任何一個的核苷酸序列。
本發(fā)明另一方面包括本發(fā)明的分離核苷酸序列。
優(yōu)選方面在其中一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種含有選自下列(i)-(xiii)中至少一個氨基酸序列的分離多肽，或其變體，同系物或衍生物(i)KPHCEPEQPAALPLFQPQLVQGGRPDXYWVEAFPFRSDSSK或KPHXEPEQPAALPLFQPQLVV(Q)GGRPDXY；(ii)SDIQMFVNPYATTNNQSSXWTPVSLAKLDFPVAMHYADITK；(iii)VSWLENPGELR；(iv)DGVDCLWYDGAR；(v)PAGSPTGIVRAEWTRHVLDVFGXLXXK；(vi)HTGSIHQVVCADIDGDGEDEFLVAMMGADPPDFQRTGVWCYK；(vii)TEMEFLDVAGK；(viii)KLTLVVLPPFARLDVERNVSGVK；(ix)SMDELVAHN FPAYVPDSVR；(x)NDATDGTPVLALLDLDGGPSPQAWNISHVPPGTDMYEIAHAK；(xi)TGSLVCARWPPVK；(xii)NQRVAGTHSPAAMGLTSRWAVTK；(xiii)GQITFRLPEAPDHGPLFLSVSAIRHQ；其中X是未知的氨基酸殘基。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含有選自上述序列(i)-(xiii)的1個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含有選自上述序列(i)-(xiii)的2個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含有選自上述序列(i)-(xiii)的3個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含有選自上述序列(i)-(xiii)的4個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含有選自上述序列(i)-(xiii)的5個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含有選自上述序列(i)-(xiii)的6個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含有選自上述序列(i)-(xiii)的7個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含有選自上述序列(i)-(xiii)的8個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含有選自上述序列(i)-(xiii)的9個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含選自上述序列(i)-(xiii)的10個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含選自上述序列(i)-(xiii)的11個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含選自上述序列(i)-(xiii)的12個序列。
在其中一優(yōu)選實施方案中，所述多肽含選自上述序列(i)-(xiii)的13個序列。
優(yōu)選，本發(fā)明的多肽具有吡喃鄰酮醛糖脫水酶活性。
其中一個優(yōu)選實施方案涉及一種多肽，其可與相對于本發(fā)明的純化氨基酸序列培養(yǎng)的抗體進行免疫反應。
另一方面涉及一種編碼本發(fā)明多肽，或其變體，同系物，片段或衍生物的分離多核苷酸序列。
優(yōu)選，所述分離多核苷酸選自(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其互補序列的多核苷酸；(ii)含有能夠與SEQ ID NO.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或其片段的多核苷酸；
(iii)含有能夠與SEQ ID NO.1的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸；和(iV)含有由于SEQ ID NO.1多核苷酸的遺傳密碼簡并性而產(chǎn)生的多核苷酸序列的多核苷酸。
優(yōu)選，所述核苷酸序列可從黃孢原毛平革菌，卵形多孔菌或藍色伏革菌獲得。
在其中一個優(yōu)選實施方案中，所述核苷酸序列可從盤菌目，更優(yōu)選從橙黃網(wǎng)孢盤菌(Aleuria aurantia)，疣孢褐盤菌(Peziza badia)，多汁盤菌(P.succosa)，Sarcophaera eximia，尖頂羊肚菌(Morchella conica)，肋紋羊肚菌(M.costata)，彈絲羊肚菌(M.elata)，可食羊肚菌(M.esculenta)，圓形可食羊肚菌(M.esculenta var.rotunda)，M.Hortensis或赭鹿花菌(Gyromitra infula)獲得。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述核苷酸序列可從木耳目(Auriculariales)，更優(yōu)選從腸膜狀木耳(Auricularia mesenterica)獲得。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述核苷酸序列可從多孔菌目(Aphyllophorales)，更優(yōu)選從Pulcherricium caeruleum，櫟隔孢伏革菌(Peniophora quercina)，Phanerochaete sordida，Vuilleminia comedens，煙色韌革菌(Stereum gausapatum)，血痕韌革菌(S.sanguinolentum)，Lopharia spadicea，檸檬繡球菌(Sparassis laminosa)，Boletopsissubsquamosa，黑刺煙管菌(Bjerkandera adusta)，Trichaptum biformis，Cerrena unicolor，朱紅密孔菌(pycnoporus cinnabarinus)，血紅密孔菌(P.sanguineus)，Junghunia nitida，黃色枝瑚菌(Ramaria flava)，微黃擬鎖瑚菌(Clavulinopsis helvola)，微黃擬鎖瑚菌var.Geoglossoides或絢麗擬鎖瑚菌(V.pulchra)獲得。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述核苷酸序列可從蘑菇目(Agaricales)，更優(yōu)選從Clitocybe cyathiformis，C.dicolor，C.gibba，C.odora，Lepista caespitosa，L inversa，L luscina，L.nebularis，Mycenaseynii，Pleurocybella porrigens，Marasmius oreales或Inocybe pyriodora獲得。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述核苷酸序列可從Gracilariales，更優(yōu)選從Gracilaria varrucosa，Gracilaria tenuistipitata，Gracilariopsis sp，或Gracilariopsis lemaneiformis獲得。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述核苷酸序列可從Melanosporaceae，更優(yōu)選從Melanospora ornata，Microthecium compressum，Microtheciumsobelii獲得。
本發(fā)明另一方面涉及一種分離多核苷酸，選自(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其互補序列的多核苷酸；(ii)含有能夠與SEQ ID NO.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或其片段的多核苷酸；(iii)含有能夠與SEQ ID NO.1的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸；和(iv)含有由于SEQ ID NO.1多核苷酸的遺傳密碼簡并性而產(chǎn)生的多核苷酸序列的多核苷酸。
優(yōu)選，所述核苷酸序列與啟動子可操縱連接。
本發(fā)明另一方面涉及一種含有上述多核苷酸序列的構建體。
本發(fā)明另一方面涉及一種含有上述多核苷酸序列的載體。
本發(fā)明另一方面涉及一種宿主細胞，其中已經(jīng)摻入本發(fā)明的多核苷酸序列。
另一方面涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸序列的表達載體，所述多核苷酸序列與能夠指導所述多核苷酸在宿主細胞中表達的調節(jié)序列可操縱連接。
另一方面涉及一種由SEQ ID NO.1的多核苷酸序列編碼的分離多肽，或其變體，同系物，片段或衍生物。
在優(yōu)選實施方案中，所述分離多肽具有從N-末端除去的至多7個氨基酸。
更優(yōu)選，所述分離多肽具有與SEQ ID NO.1編碼的多肽序列相比，至少75％的同一性。
另一方面涉及一種能夠結合本發(fā)明多肽的抗體。
另一方面涉及制備本發(fā)明氨基酸序列的方法，其中所述方法包括表達本發(fā)明的核苷酸序列，并任選地分離和/或純化它們。優(yōu)選，本發(fā)明的核苷酸序列是在沒有表達酶底物的環(huán)境中表達的，例如，在沒有1，5-脫水果糖的環(huán)境中表達。
另一方面涉及一種使用本發(fā)明的氨基酸序列，或本發(fā)明核苷酸序列的表達產(chǎn)物制備薄閉殼素的方法。
另一方面涉及一種使用本發(fā)明的氨基酸序列，或本發(fā)明核苷酸序列的表達產(chǎn)物制備子囊吡喃酮P的方法。
優(yōu)選，該方法包括使所述氨基酸序列或所述核苷酸序列的表達產(chǎn)物與1，5-脫水-D-果糖反應。
甚至更優(yōu)選，所述方法還包括使用APP合酶。
在特別優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括使APP合酶及所述氨基酸序列或所述核苷酸序列的表達產(chǎn)物與1，5-脫水-D-果糖反應。
在可選擇性的優(yōu)選實施方案中，所述制備薄閉殼素(microthecin)的方法包括使本發(fā)明的多肽與葡聚糖裂合酶及淀粉糊精反應。
本發(fā)明另一方面涉及一種使用本發(fā)明的氨基酸序列或本發(fā)明核苷酸序列的表達產(chǎn)物制備藍草菌酮(cortalcerone)的方法。
優(yōu)選，該方法包括使氨基酸序列或核苷酸序列的表達產(chǎn)物與葡糖醛酮反應。
在可選擇性的優(yōu)選實施方案中，所述制備薄閉殼素的方法包括使本發(fā)明的多肽與葡萄糖及吡喃糖2-氧化酶反應。
本發(fā)明另一方面涉及一種制備薄閉殼素的方法，包括使吡喃鄰酮醛糖脫水酶與1，5-脫水-D-果糖反應。
本發(fā)明另一方面涉及一種制備子囊吡喃酮P的方法，包括使吡喃鄰酮醛糖脫水酶及APP合酶與1，5-脫水-D-果糖反應。
本發(fā)明其中一個方面涉及一種制備薄閉殼素的方法，包括使吡喃鄰酮醛糖脫水酶與葡萄糖及淀粉糊精反應。
本發(fā)明另一方面涉及制備藍草菌酮的方法，包括使吡喃鄰酮醛糖脫水酶與葡糖醛酮反應。
本發(fā)明另一方面涉及一種制備藍草菌酮的方法，包括使吡喃鄰酮醛糖脫水酶與葡萄糖及吡喃糖2-氧化酶反應。
本發(fā)明另一方面涉及薄閉殼素用于防止和/或抑制微生物在物質中的生長，和/或殺死物質中的微生物的應用。
本發(fā)明的可選擇性方面涉及藍草菌酮用于防止和/或抑制微生物在物質中的生長，和/或殺死物質中的微生物的應用。
本發(fā)明還涉及一種或多種薄閉殼素，藍草菌酮，或其衍生物或異構體用于防止和/或抑制微生物在物質中的生長，和/或殺死物質中的微生物的應用。
優(yōu)選，所述物質是食品。
優(yōu)選可使用藍草菌酮和/或薄閉殼素對其發(fā)揮作用的微生物是植物真菌病原體。
優(yōu)選可使用藍草菌酮和/或薄閉殼素對其發(fā)揮作用的微生物選自絲核菌屬，腐霉屬，絲囊霉屬和尾孢屬。
優(yōu)選可使用藍草菌酮和/或薄閉殼素對其發(fā)揮作用的微生物選自茄屬絲核菌，終極腐霉，螺殼狀絲囊霉和菾菜尾孢。
本發(fā)明另一方面涉及薄閉殼素，藍草菌酮，或其衍生物或異構體在防止和/或抑制病原體絲囊霉的生長，和/或殺死病原體絲囊霉中的用途。
優(yōu)選，所述病原體是螺殼狀絲囊霉。
在優(yōu)選實施方案中，薄閉殼素的衍生物是2-呋喃基-羥甲基-酮或4-脫氧-甘油-己-2，3-diluose(4-deoxy-glycero-hexo-2，3-diluose)。
在優(yōu)選實施方案中，藍草菌酮的衍生物是2-呋喃基乙二醛。
在特別優(yōu)選的實施方案中，所述薄閉殼素，藍草菌酮，或其衍生物或異構體用于處理植物或植物種子，甚至更優(yōu)選用于處理甜菜種子，豌豆植株或豌豆種子。
另一方面，本發(fā)明涉及薄閉殼素，藍草菌酮，或其衍生物或異構體作為植物或種子保護劑的應用。
本發(fā)明另一方面涉及薄閉殼素，藍草菌酮，或其衍生物或異構體作為植物生長調節(jié)劑的應用。
優(yōu)點本發(fā)明提供了先前未公開的，有關吡喃鄰酮醛糖脫水酶的氨基酸及核苷酸序列的信息。
本發(fā)明還涉及吡喃鄰酮醛糖脫水酶在從AF向APP及薄閉殼素轉化，以及在藍草菌酮產(chǎn)生中的應用。迄今為止，現(xiàn)有技術中還沒有教導或暗示PD涉及，或能夠影響這些轉化的任一方面。
因此，本發(fā)明能夠促進薄閉殼素，APP及藍草菌酮的大量生產(chǎn)。本發(fā)明還教導了薄閉殼素及藍草菌酮可作為抗菌劑使用，特別用于食品中。
測定法下列測定法可用于描述并鑒定本發(fā)明實際和推定的氨基酸序列。
分離的一方面，優(yōu)選所述序列為分離的形式。術語“分離的”是指序列不是存在于它的天然環(huán)境中(即，在自然中找到)。通常，術語“分離的”是指所述序列至少基本上沒有至少一種其它成分，所述其它成分與所述序列天然相關，并且可在自然中找到。這里，所述序列可從與它天然相關的至少一種其它成分中分離出來。
純化的一方面，優(yōu)選所述序列為純化的形式。術語“純化的”也指所述序列不是存在于它的天然環(huán)境中(即，在自然中找到)。通常，術語“純化的”是指所述序列至少基本上是從至少一個其它成分中分離出來的，所述其它成分與所述序列天然相關，并且可在自然中找到。
核苷酸序列本發(fā)明包括編碼具有此處定義的特殊性質的酶的核苷酸序列。這里所用的術語“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其變體，同系物，片段和衍生物(如，它的一部分)。所述核苷酸序列可以是基因組或合成或重組來源的，其可以是雙鏈或單鏈的，正義或反義鏈。
本發(fā)明中的術語“核苷酸序列”包括基因組DNA，cDNA，合成DNA，及RNA。優(yōu)選它是指DNA，更優(yōu)選本發(fā)明編碼序列的cDNA。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列本身不包括存在于其天然環(huán)境中的本發(fā)明的天然核苷酸序列，例如當它與同樣存在于其天然環(huán)境中的其天然相關序列連接時。為便于對照，我們稱該優(yōu)選實施方案為“非天然的核苷酸序列”。在這點上，術語“天然核苷酸序列”是指存在于其天然環(huán)境中的完整核苷酸序列，且當和與其天然相關的完整啟動子可操縱連接時，啟動子也存在于其天然環(huán)境中。然而，本發(fā)明的氨基酸序列可在核苷酸序列在其天然生物中表達之后，被分離和/或純化。然而，優(yōu)選本發(fā)明的氨基酸序列可被其天然生物中的核苷酸序列表達，但其中所述核苷酸序列不受該生物內與其天然相關啟動子的控制。
通常，本發(fā)明的核苷酸序列是利用重組DNA技術(即，重組DNA)制備的。然而，在本發(fā)明可選擇性的實施方案中，可利用本領域熟知的化學方法完整或部分合成所述核苷酸序列(見Caruthers MH等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等，(1980)Nuc AcidsRes Symp Ser 225-232)。
核苷酸序列的制備編碼具有此處定義的特殊性質的酶或適于修飾的酶的核苷酸序列可從產(chǎn)生所述酶的任何細胞或生物鑒定和/或分離和/或純化。用于鑒定和/或分離和/或純化核苷酸序列的各種方法都是本領域熟知的。例如，一旦已經(jīng)鑒定和/或分離和/或純化了一個適宜序列，就可利用PCR擴增技術制備不止一個序列。
例如，基因組DNA和/或cDNA庫可使用染色體DNA或信使RNA從產(chǎn)生所述酶的生物構造。如果酶的氨基酸序列是已知的，那么可合成標記寡核苷酸探針，并用于鑒定來源于從生物制備的基因組庫的編碼酶的克隆。可選擇性地，含有與其它已知酶基因同源的序列的標記寡核苷酸探針可用于鑒定編碼酶的克隆。在后一種情況中，使用較低嚴格度的雜交和清洗條件。
可選擇性地，編碼酶的克隆可通過在表達載體，如質粒中插入基因組DNA的片段，用所得基因組DNA庫轉化酶-陰性菌，然后將轉化細菌平板接種在含有酶底物(即，麥芽糖)的瓊脂上，由此鑒定表達所述酶的克隆而鑒定。
可選擇性地，編碼所述酶的核苷酸序列可通過已經(jīng)確定的標準方法制備，例如由Beucage S.L.等，(1981)Tetrahedron Letters 22，1859-1869頁描述的氨基磷酸鹽法，或Matthes等，(1984)EMBO J.3，801-805頁描述的方法。例如，在氨基磷酸鹽法中，在自動DNA合成儀中合成寡核苷酸，純化，退火，連接并在適宜的載體中克隆。
所述核苷酸序列可以是混合的基因組及合成來源，混合的合成及cDNA來源，或混合的基因組及cDNA來源，它們是按照標準技術，通過連接合成基因組或cDNA來源(適宜)的片段而制備的。每個連接的片段與完整核苷酸序列的各個部分相對應。所述DNA序列還可使用特殊引物，通過聚合酶鏈反應(PCR)制備，例如在US 4,683,202或Saiki R K等，(Science(1988)239，487-491頁)中描述的。
氨基酸序列本發(fā)明還包括此處定義的具有特殊性質的酶的氨基酸序列。
這里所用術語“氨基酸序列”與術語“多肽”和/或術語“蛋白”同義。在某些例子中，術語“氨基酸序列”與術語“肽”同義。在某些例子中，術語“氨基酸序列”與術語“酶”同義。
所述氨基酸序列可從適宜的來源制備/純化，或合成制備它或利用重組DNA技術制備它。
本發(fā)明的酶可與其它酶結合使用。因此，本發(fā)明還包括酶的組合，其中所述組合含有本發(fā)明的酶和其它酶，其可以是本發(fā)明的其它酶。此方面在后面的部分中討論。
優(yōu)選所述酶不是天然的酶。在這一點上，術語“天然的酶”是指完整的酶，它存在于其天然環(huán)境中，且它已經(jīng)由其天然核苷酸序列表達。
變體/同系物/衍生物本發(fā)明還包括本發(fā)明酶的氨基酸序列或編碼這種酶的任一核苷酸序列的變體，同系物，和衍生物的應用。這里，術語“同系物”是指與主體氨基酸序列和主體核苷酸序列具有一定同源性的實體。這里，術語“同源性”等同于“同一性”。
在本發(fā)明的范圍內，同源性序列包括與主體序列至少75，80，85或90％相同，優(yōu)選至少95，96，97，98或99％相同的氨基酸序列。通常，同系物含有與主體氨基酸序列相同的活性位點等。雖然同源性還可被考慮為相似性(即，具有相似化學性質/功能的氨基酸殘基)，但在本發(fā)明的范圍內，優(yōu)選以序列同一性來表示同源性。
在本發(fā)明的范圍內，同源性序列包括與編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列(主體(subject)序列)至少40，50，60，70，75，80，85或90％相同，優(yōu)選至少95，96，97，98或99％相同的核苷酸序列。通常，同系物包括編碼與主體序列相同的活性位點等的序列。雖然同源性還可被勞率為相似性(即，具有相似化學性質/功能的氨基酸殘基)，但在本發(fā)明的范圍內，優(yōu)選以序列同一性表示同源性。
同源性比較可通過肉眼進行，或更通常借助于很容易獲得的序列比較程序進行。這些商業(yè)可獲得的計算機程序可計算兩個或多個序列間的同源性％。
可對連續(xù)序列計算同源性％，即，將一個序列與另一序列進行排列對比，并將其中一個序列中的每個氨基酸直接與另一序列中的相應氨基酸進行比較，每次比較一個殘基。這被稱作“無空位”序列對比。通常，這種無空位序列對比只對相對較少數(shù)量的殘基進行。
雖然這是一種非常簡單且可靠的方法，但它不能考慮到，例如，在另一對相同序列中，一次插入或缺失可導致下列核酸殘基不能進行序列對比，從而當進行總體序列對比時，可能導致同源性％大大降低。因此，絕大多數(shù)序列比較法都被設計成既能產(chǎn)生最佳序列對比，又考慮到了插入和缺失，而不會不適當?shù)亓P分總的同源性值。這是通過在序列對比中插入“空位(gaps)”，從而盡力使局部同源性達到最大而實現(xiàn)的。
然而，這些更復雜的方法將“空位罰分(gap penalties)”賦予序列對比中出現(xiàn)的每個空位，這樣，對于同樣數(shù)目的相同氨基酸而言，序列對比具有盡可能少的空位-反映兩個比較序列之間更高的相關性-將獲得比具有多個空位更高的值。通常使用“親族空位值”，它給空位的存在注入相對較高的值，而給空位中的每個后續(xù)殘基賦予較小的罰分。這是最普遍使用的空位評分系統(tǒng)。較高的空位罰分當然可產(chǎn)生具有較少空位的最佳序列對比。絕大多數(shù)序列對比程序都可改變空位罰分。然而，當使用這種軟件進行序列比較時，優(yōu)選使用缺省值。例如，當使用GCG Wisconsin Bestfit軟件包時，對于空位而言，氨基酸序列的缺省空位罰分是-一個空位12，一次延伸4。
因此，最大同源性％的計算首先要求產(chǎn)生最佳序列對比，同時考慮空位罰分。進行這種序列對比的適宜計算機程序是GCG WisconsinBestfit軟件包(Devereux等，1984，Nuc Acids Research 12387)。可進行序列比較的其它軟件的例子包括，但不限制于BLAST軟件包(見Ausubel等，1999 Short Protocols in Molecular Biology，4thEd-Chapter18)，F(xiàn)ASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和比較工具的GENEWORKS程序組。BLAST和FASTA可脫機和在線檢索(見Ausubel等，1999，7-58-7-60頁)。然而，對于某些應用而言，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。一種被稱作BLAST 2 Sequences的新工具也可用于比較蛋白及核苷酸序列(見FEMS Microbiol Lett 1999174(2)247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
雖然，最終的同源性％可以同一性的形式測量，但通常序列對比過程本身并不是以全有或絕無的成對比較為基礎的。相反，通常使用一定的相似性得分矩陣，以化學相似性或進化距離為基礎，將值賦予每次成對比較。通常所用這種矩陣的例子是BLOSUM62矩陣-程序的BLAST程序組的缺省矩陣。GCG Wisconsin程序通常使用公共缺省值或自定義符號比較表(見詳述部分的用戶手冊)。對于某些應用而言，優(yōu)選使用GCG軟件包的公共缺省值，或對于其它軟件而言，使用缺省矩陣，如BLOSUM62。
可選擇性地，同源性百分比可以和CLUSTAL類似的算法為基礎，使用多序列對比特征在DNASISTM(Hitachi Software)中計算(HigginsDG & Sharp PM(1998)，Gene 73(1)，237-244)。
一旦所述軟件產(chǎn)生了最佳序列對比，那么就可計算同源性％，優(yōu)選計算序列同一性％。通常所述軟件是作為序列比較的一部分進行的，并產(chǎn)生數(shù)值結果。
所述序列還可具有氨基酸殘基的缺失，插入或置換，產(chǎn)生沉默改變及功能等價物質。氨基酸置換可以殘基的極性，電荷，溶解性，疏水性，親水性，和/或兩親性為基礎進行，只要能夠保留物質的次級結合活性。例如，帶負電的氨基酸包括天門冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性值的不帶電的極性端基的氨基酸包括亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天門冬酰胺，谷酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸，和酪氨酸。
保守置換可按照下表進行。第二欄同一區(qū)塊(block)內的氨基酸，優(yōu)選第三欄同一行的氨基酸可彼此置換
本發(fā)明還包括同源性置換(這里所用的置換和替代是指現(xiàn)有氨基酸殘基與可選擇性殘基的交換)，其可進行相似置換，如堿性置換堿性，酸性置換酸性，極性置換極性等。還可進行非同源性置換，即，從一類殘基置換成另一類殘基，或可選擇性地，涉及非天然的氨基酸，如鳥氨酸(此后稱作Z)，二氨基丁酸鳥氨酸(此后稱作B)，正亮氨酸鳥氨酸(此后稱作O)，吡啶基丙氨酸，噻吩基丙氨酸，萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
置換還可用非天然的氨基酸進行，包括α*和α-二置換的*氨基酸，N-烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的鹵化衍生物，如三氟酪氨酸*，對-Cl-苯丙氨酸*，對-Br-苯丙氨酸*，對-I-苯丙氨酸*，L-烷基-甘氨酸*，β-丙氨酸*，L-α-氨基丁酸*，L-γ-氨基丁酸*，L-α-氨基異丁酸*，L-ε-氨基己酸#，7-氨基庚酸*，L-甲硫氨酸砜#*，L-正亮氨酸*，L-正纈氨酸*，對-硝基-L-苯丙氨酸*，L-羥脯氨酸*，L-硫代脯氨酸*，苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物，如4-甲基-Phe*，五甲基-Phe*，L-Phe(4-氨基)#，L-Tyr(甲基)*，L-Phe(4-異丙基)*，L-Tic(1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸)*，L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-芐基)*。上面為進行討論所用的符號*(相對于同源性或非同源性置換)表示衍生物的疏水性，而所用的#表示衍生物的親水性，#*表示兩親性。
變體氨基酸序列包括適宜的間隔區(qū)，所述間隔區(qū)可被插入到序列的任意兩個氨基酸殘基之間，除了氨基酸間隔區(qū)，如甘氨酸或β-丙氨酸殘基之外，還包括烷基，如甲基，乙基或丙基。其它變化形式，包括一個或多個氨基酸殘基以類胨形式的存在，可由本領域那些技術人員了解。為了避免疑問，“類胨形式”用于指變體氨基酸殘基，其中α-碳取代基位于殘基的氮原子而不是α-碳上。用于制備類胨形式的肽的方法是本領域已知的，例如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
本發(fā)明所用的核苷酸序列可包括合成或修飾的核苷酸。對寡核苷酸進行的多種不同類型的修飾是本領域已知的。這些包括甲基膦酸鹽和phosphorothioate主鏈和/或在分子的3’和/或5’末端加入吖啶或聚賴氨酸鏈。對于本發(fā)明而言，應當了解這里所述的核苷酸序列可通過現(xiàn)有技術中任何可獲得的方法來修飾。進行這種修飾是為了提高本發(fā)明核苷酸序列的體內活性或有效期。
本發(fā)明還包括與這里給出的序列互補的核苷酸序列，或其任何衍生物，片段或衍生物的應用。如果序列與其片段互補，那么該序列可用作探針，來鑒定其它生物中的相似編碼序列。
并不與本發(fā)明序列100％同源，但落在本發(fā)明范圍內的多核苷酸可以很多方式獲得。這里所述序列的其它變體可通過使用從不同個體，例如不同種群的個體制備的DNA庫作為探針雜交而獲得。此外，還可獲得其它病毒/細菌，或細胞同系物，特別是在哺乳動物細胞(例如，大鼠，小鼠，牛和靈長類動物細胞)中發(fā)現(xiàn)的細胞同系物，且這種同系物及其片段通常能夠選擇性地與這里序列表中的序列雜交。這種序列可通過使用從其它動物的基因組DNA庫制備的cDNA庫作為探針雜交，并在中度到高度嚴格的條件下，使用所附序列表中任一序列的全部或一部分作為探針與這種庫雜交而獲得。類似的情況用于獲得本發(fā)明多肽或核苷酸序列的物種同系物及等位變體。
變體和株系/物種同系物還可利用簡并PCR獲得，其中使用的引物被設計針對編碼本發(fā)明序列內保守氨基酸序列的同系物及變體內的序列。通過將來源于若干變體/同系物的氨基酸序列進行排列對比，可預測保守序列。序列對比可使用本領域已知的計算機軟件進行。例如，廣泛使用的是GCG Wisconsin PileUp程序。
簡并PCR中所用的引物包括一個或多個簡并位置，而且與克隆序列所用的那些相比，可在較低的嚴格條件下使用，具有針對已知序列的單一序列引物。
可選擇性地，這種多核苷酸可通過特定序列的定點誘變獲得。這一點很有用，例如需要進行沉默密碼子序列改變來優(yōu)化其中表達多核苷酸序列的特定宿主細胞的偏愛密碼子。還可能需要進行其它序列改變，從而引入限制酶識別位點，或改變由多核苷酸編碼的多肽的性質或功能。
本發(fā)明還包括經(jīng)由隨機過程，選擇誘變或體外重組而進行分子進化的多核苷酸。作為非限制性的實施例，可于體內或體外，在核苷酸序列中產(chǎn)生若干定點或隨機突變，隨后利用各種方式篩選所編碼多肽的改進功能性。此外，多核苷酸序列的突變或天然變體可與野生型或其它突變或天然變體重組，從而產(chǎn)生新的變體。這種新變體還可被篩選所編碼多肽的改進功能性。新的優(yōu)選變體的產(chǎn)生可通過本領域已經(jīng)確定的各種方法獲得，例如Error Threshold Mutagenesis(WO92/18645)，寡核苷酸介導的隨機誘變(US 5,723,323)，DNA穿梭(US5,605,793)，外源介導的基因裝配WO 00/58517。這些以及類似的隨機定向分子進化法可鑒定并選擇本發(fā)明酶的變體，該變體具有優(yōu)選的特性而無需有關蛋白結構或功能的任何現(xiàn)有知識，并產(chǎn)生不可預測但有益的突變或變體。在本領域中，用于優(yōu)化或改變酶活性的分子進化的應用有很多，這種例子包括但不限制于下列的一種或多種在優(yōu)選環(huán)境條件，例如溫度，pH，底物下，宿主細胞中的優(yōu)化表達和/或活性，或體外酶活性增加，底物和/或產(chǎn)物特異性改變，酶或結構穩(wěn)定性增加或降低，酶活性/特異性改變。
本發(fā)明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于產(chǎn)生引物，例如PCR引物，可選擇性擴增反應的引物，探針，例如使用放射性或非放射性標記，通過常規(guī)方法暴露標記的探針，或將多核苷酸克隆到載體中。這種引物，探針和其它片段的長度為至少15，優(yōu)選至少20，例如至少25，30或40個核苷酸，而且也包括在本發(fā)明所用的術語多核苷酸之內。
本發(fā)明的多核苷酸，如DNA多核苷酸及探針可重組，合成，或利用本領域那些技術人員可獲得的任何方法產(chǎn)生。還可利用標準技術克隆它們。
通常，引物可通過合成方法產(chǎn)生，包括逐步地，每次制備所需核酸序列的一個核苷酸。使用自動化技術進行的技術在本領域中很容易獲得。
較長的多核苷酸通常是利用重組法產(chǎn)生的，例如使用PCR(聚合酶鏈反應)克隆技術。這包括制備一對引物(例如，大約15-30個核苷酸)，該引物與脂類導向序列區(qū)側面連接，其被克隆，使引物與從動物或人細胞獲得的mRNA或cDNA接觸，在使所需區(qū)擴增的條件下進行聚合酶鏈反應，分離擴增片段(例如，通過在瓊脂凝膠上純化反應混合物)并回收擴增的DNA。所述引物可被設計含有適宜的限制酶識別位點，從而使擴增的DNA克隆到適宜的克隆載體中。
生物活性優(yōu)選，所述變體序列等至少與這里給出的序列具有相同的生物活性。
這里所用的“生物活性”是指該序列具有與天然存在的序列相似的結構功能(但程度無需相同)，和/或相似的調節(jié)功能(但程度無需相同)，和/或相似的生化功能(但程度無需相同)。
同功酶本發(fā)明的多肽可以一種或多種不同的同功酶形式存在。這里所用術語“同功酶”包括多肽的變體，其可催化同一反應，但彼此的性質不同，如底物親和性及酶-底物反應的最大速率不同。由于氨基酸序列的差異，同功酶可由電泳或等電點聚焦技術區(qū)分。不同的組織常常具有不同的同功酶。序列差異通常為其中發(fā)現(xiàn)特定同功酶的細胞類型的特殊要求帶來不同的酶動力學參數(shù)，其有時被稱作微調。
同種型本發(fā)明還包括這里所述多肽不同的同種型。術語“同種型”是指具有相同功能(即，吡喃鄰酮醛糖脫水酶活性)的蛋白，其具有相似或相同的氨基酸序列，但屬于不同基因的產(chǎn)物。
雜交本發(fā)明還包括與本發(fā)明序列互補的序列或能夠與本發(fā)明序列或其互補序列雜交的序列。
這里所用的術語“雜交”應包括“通過堿基配對使核酸鏈與互補鏈連接的方法”以及在聚合酶鏈反應(PCR)中進行的擴增過程。
本發(fā)明還包括核苷酸序列或其任一衍生物，片段，或衍生物的應用，所述核苷酸序列能夠與這里給出序列的互補序列雜交。
術語“變體”還包括能夠與這里給出的核苷酸序列雜交的序列的互補序列。
優(yōu)選，術語“變體”包括在嚴格條件(例如，50℃和0.2×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉pH 7.0})下，能夠與這里給出的核苷酸序列雜交的序列的互補序列。
更優(yōu)選，術語“變體”包括在高度嚴格條件(例如，65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉pH 7.0})下，能夠與這里給出的核苷酸序列雜交的序列的互補序列。
本發(fā)明還涉及能夠與本發(fā)明的核苷酸序列(包括這里所給出那些的互補序列)雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及能夠與本發(fā)明的核苷酸序列(包括這里所給出那些的互補序列)雜交的序列的互補核苷酸序列。
能夠在中等至最大程度的嚴格條件下，與這里給出的核苷酸序列雜交的多核苷酸序列也包括在本發(fā)明的范圍之內。
在優(yōu)選方面，本發(fā)明包括能夠在嚴格條件(例如，50℃和0.2×SSC)下，與本發(fā)明的核苷酸序列，或其互補序列雜交的核苷酸序列。
在更優(yōu)選方面，本發(fā)明包括能夠在高度嚴格條件(例如，65℃和0.1×SSC)下，與本發(fā)明的核苷酸序列，或其互補序列雜交的核苷酸序列。
定點誘變一旦分離出編碼酶的核苷酸序列，或鑒定出推定的編碼酶的核苷酸序列，就可使序列發(fā)生突變，以便制備本發(fā)明的酶。
突變可利用合成寡核苷酸引入。這些寡核苷酸含有與所需突變位點側面連接的核苷酸序列。
適宜的方法在Morinaga等(Biotechnology(1984)2，646-649頁)中公開，其中DNA的單鏈空位，編碼酶的序列，是在攜帶酶基因的載體中創(chuàng)造的。然后使具有所需突變的合成核苷酸退火成單鏈DNA的同源性部分。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)填補剩余的空位，并用T4連接酶連接該構建體。
US 4,760,025公開了通過對序列盒(cassette)進行較小改變而引入編碼多次突變的寡核苷酸。然而，通過上述Morinaga法可在任何時候引入更多突變，這是因為可引入很多不同長度的寡核苷酸。
向編碼酶的核苷酸序列中引入突變的其它方法在Nelson and Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，147-151頁)中描述。該方法包括3-步產(chǎn)生含有所需突變的PCR片段，包括利用化學合成的DNA鏈作為PCR反應中的一個引物而引入所需突變。通過用限制性內切核酸酶裂解，可從PCR-產(chǎn)生的片段中分離攜帶突變的DNA片段，并將其重新插入到表達質粒中。
作為舉例，Sierks等(Protein Eng(1989)2，621-625和Protein Eng(1990)3，193-198)描述了曲霉葡糖淀粉酶中的定向誘變。
重組的在本發(fā)明其中一個方面中，所述序列是重組序列—即，使用重組DNA技術制備的序列。
合成的在本發(fā)明一個方面中，所述序列是合成序列—即通過體外化學或酶合成制備的序列。它包括但不限制于使用宿主生物，如甲基營養(yǎng)酵母畢赤氏酵母和漢遜氏酵母的最佳偏愛密碼子制備的序列。
酶的表達本發(fā)明所用的核苷酸序列可被摻入到重組復制型載體中。該載體可在和/或從適合的宿主細胞復制并表達酶形式的核苷酸序列。預期了同源及異源表達。
對于同源表達而言，優(yōu)選目標基因或目標核苷酸序列并不存在于其天然存在的基因背景中。在目標基因或目標核苷酸序列存在于其天然存在的基因背景中時，優(yōu)選表達是由不同于或除了其天然存在的表達機理之外的方式驅動的；例如，通過基因干預過量表達目標基因。
表達可使用控制序列控制，控制序列包括啟動子/增強子和其它表達調節(jié)信號。原核生物啟動子及在真核生物細胞中發(fā)揮作用的啟動子都可使用。還可使用組織特異或刺激物特異性啟動子。還可使用嵌合啟動子，其含有來源于上述兩種或多種不同啟動子的序列元件。
根據(jù)所用序列和/或載體的不同，通過表達核苷酸序列而由宿主重組細胞產(chǎn)生的酶可被分泌或胞內含有。編碼序列可用信號序列設計，其指導物質編碼序列通過特定的原核生物或真核生物細胞膜的分泌。
表達載體術語“表達載體”是指能夠體內或體外表達的構建體。
優(yōu)選，將所述表達載體摻入到適宜宿主生物的基因組中。術語“摻入的”優(yōu)選包括穩(wěn)定摻入到基因組中。
宿主生物可與目標來源生物的基因相同或不同，分別引起同源和異源表達。
優(yōu)選，本發(fā)明的載體含有本發(fā)明的構建體?？蛇x擇性表達地，優(yōu)選本發(fā)明的核苷酸序列存在于載體中，且其中所述核苷酸序列與調節(jié)序列可操縱連接，這樣調節(jié)序列就可通過適宜的宿主生物提供核苷酸序列的表達，即所述載體是表達載體。
本發(fā)明的載體可被轉化到下述適宜的宿主細胞中，從而提供本發(fā)明多肽的表達。因此，本發(fā)明另一方面提供制備隨后使用的多肽的方法，包括在一定條件下培養(yǎng)用表達載體轉化或轉染的宿主細胞，從而通過編碼所述多肽的編碼序列的載體提供表達，并回收所表達的多肽。
所述載體可以是，例如，用復制源提供的噬菌體載體，病毒或質粒，任選用于所述多核苷酸表達的啟動子以及任選的啟動子的調節(jié)子。載體的選擇通常取決于其所被引入的宿主細胞。
本發(fā)明的載體可含有一個或多個選擇性標記基因。工業(yè)用微生物的絕大多數(shù)適宜的選擇系統(tǒng)是通過選擇標記形成的那些，其無需在宿主生物中突變。適宜的選擇標記可以是源于枯草芽孢桿菌或地衣型芽孢桿菌的dal基因，或產(chǎn)生抗生素抗性，如氨芐西林，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性的基因?？蛇x擇的選擇標記可以是曲霉選擇標記，如amdS，argB，niaD和sC，或產(chǎn)生潮霉素抗性的標記。其它真菌選擇標記的例子是ATP合成酶，亞單位9(oliC)，乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶(pvrA)，腐草霉素及苯菌靈抗性(benA)基因。非-真菌選擇標記的例子是細菌G418抗性基因(其還可用于酵母中，但不能用于絲狀真菌中)，氨芐西林抗性基因(大腸桿菌)，新霉素抗性基因(芽孢桿菌)以及大腸桿菌uidA基因，編碼β-葡糖醛酸酶(GUS)。其它適宜的選擇標記包括源于枯草芽孢桿菌或地衣型芽孢桿菌的dal基因?？蛇x擇性地，選擇可通過共同-轉化完成(如WO 91/17243所述)。
載體可體外使用，例如產(chǎn)生RNA或用于轉染或轉化宿主細胞。
因此，本發(fā)明所用的核苷酸序列可被摻入到重組載體(通常是復制型載體)，例如克隆或表達載體中。所述載體可用于在適合的宿主細胞中復制核酸。因此在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種通過將本發(fā)明的核苷酸序列引入到復制型載體中，將載體引入到適合的宿主細胞中，并在進行載體復制的條件下使宿主細胞生長而制備本發(fā)明核苷酸序列的方法。載體可從宿主細胞回收。適宜的宿主細胞與表達載體一起在下面描述。
用于連接本發(fā)明的DNA構建體和調節(jié)序列，其中該DNA構造編碼具有此處定義的特殊性質的酶，并將它們插入到含有復制所需信息的適宜載體中的過程是本領域技術人員熟知的(例如，見Sambrook等，Molecular CloningA laboratory Manual，2nd Ed.(1989))。
所述載體還可含有能夠使載體在宿主細胞中復制的核苷酸序列。這種序列的例子是質粒pUC 19，pACYC 177，pUB 110，pE 194，pAMB1和pIJ702復制的來源。
表達載體通常包括克隆載體的成分，如允許載體在所選擇的宿主生物中自主復制的元件，和用于選擇目的的一個或多個表型可檢測的標記。表達載體通常含有編碼啟動子，操縱子，核糖體結合位點，翻譯起始信號，以及任選地，阻抑基因或一個或多個激活基因的控制核苷酸序列。此外，表達載體可含有編碼氨基酸序列的序列，其中所述氨基酸序列能夠將氨基酸序列對準宿主細胞的細胞器，如過氧物酶體或特定的宿主細胞區(qū)室。在本發(fā)明中，術語“表達信號”包括上述控制序列，阻抑序列或激活序列中的任何一個。在控制序列的指導下表達時，核苷酸序列以適于表達的方式與控制序列可操縱連接。
調節(jié)序列在某些應用中，本發(fā)明所用的核苷酸序列與調節(jié)序列可操縱連接，其能夠通過所選擇的宿主細胞提供核苷酸序列的表達。作為舉例，本發(fā)明包括的載體含有與調節(jié)序列可操縱連接的核苷酸序列，即所述載體是表達載體。
術語“可操縱連接”是指一種鄰接，其中所述成分的關系允許它們以其預定的方式發(fā)揮作用。調節(jié)序列與編碼序列“可操縱連接”是指編碼序列的表達是在與控制序列適合的條件下獲得的。
術語“調節(jié)序列”包括啟動子和增強子以及其它表達調節(jié)信號。
本領域通常意義上的術語“啟動子”是，例如，RNA聚合酶結合位點。
編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列的增強表達還可通過異源調節(jié)區(qū)，例如啟動子，分泌前導序列和終止區(qū)的選擇而獲得，其可增加表達且，如果需要，增加目標蛋白自所選擇的表達宿主分泌的水平和/或提供本發(fā)明酶表達的誘導型控制。在真核生物中，多腺苷酸化序列可與編碼該酶的核苷酸序列可操縱連接。
優(yōu)選，本發(fā)明的核苷酸序列可與至少一個啟動子可操縱連接。
除了編碼本發(fā)明核苷酸序列的基因的天然啟動子之外，其它啟動子可用于指導本發(fā)明多肽的表達。根據(jù)指導本發(fā)明核苷酸序列在所需表達宿主中表達的效能選擇啟動子。
在另一實施方案中，可選擇組成型啟動子來指導本發(fā)明所需核苷酸序列的表達。這種表達構建體還可提供其它優(yōu)點，這是因為它包含了在含有誘導底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)表達宿主的需要。
指導核苷酸序列在細菌宿主中轉錄的適宜啟動子的例子包括大腸桿菌lac操縱子的啟動子，天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因dagA的啟動子，地衣型芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)的啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽淀粉酶基因(amyM)的啟動子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)的啟動子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子，以及源于乳球菌衍生啟動子的啟動子，包括P170啟動子。當核苷酸序列在細菌，如大腸桿菌中表達時，可從噬菌體啟動子，包括T7啟動子以及噬菌體λ啟動子中選擇適宜的啟動子。
在真菌中轉錄時，有效啟動子的例子是來源于編碼米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天門冬氨酸蛋白酶，黑色曲霉中性α-淀粉酶，黑色曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶，黑色曲霉葡糖淀粉酶，Rhizomucormiehei脂酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉磷酸丙糖異構酶或構巢曲霉乙酰胺酶的基因的那些。
優(yōu)選用于真菌表達宿主中的強組成型和/或誘導型啟動子的例子是從木聚糖酶(xlnA)，肌醇六磷酸酶，ATP-合成酶，亞單位9(oliC)，磷酸丙糖異構酶(tpi)，醇脫氫酶(AdhA)，α-淀粉酶(amy)，淀粉葡糖苷酶(AG-源于glaA基因)，乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動子的真菌基因獲得的那些。用于在真菌宿主中轉錄的啟動子的其它例子是源于編碼米曲霉TAKA淀粉酶，釀酒酵母的TPI(磷酸丙糖異構酶)啟動子(Alber等，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1，419-434頁)，Rhizomucor miehei天門冬氨酸蛋白酶，黑色曲霉中性α-淀粉酶，黑色曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶，黑色曲霉葡糖淀粉酶，Rhizomucor miehei脂酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉磷酸丙糖異構酶或構巢曲霉乙酰胺酶的基因的那些。
在酵母中表達的適宜啟動子的例子包括但不限制于，釀酒酵母的Gal 1和Gal 10啟動子，以及巴斯德畢赤氏酵母的AOX1或AOX2啟動子。
雜種啟動子還可用于改善表達構建體的誘導型調節(jié)。
此外，啟動子還包括確?；蛟黾釉谶m宜宿主中表達的特征。例如，所述特征可能是保守區(qū)，如Pribnow Box或TATA盒。啟動子甚至可含有影響(如維持，提高，降低)本發(fā)明核苷酸序列表達水平的其它序列。例如，適宜的其它序列包括Shl-內含子或ADH內含子。其它序列包括誘導型元件—如溫度，化學品，光或應力誘導型元件。且，可存在提高轉錄或翻譯的適宜元件。后者元件的例子是TMV 5’信號序列(見Sleat 1987 Gene 217，217-225和Dawson 1993 Plant Mol.Biol.2397)。
構建體術語“構建體”—其與術語“接合物”、“序列盒”和“雜種”同義—包括直接或間接與啟動子連接的本發(fā)明核苷酸序列。間接連接的例子是提供適宜的間隔區(qū)，如內含子序列，如Shl-內含子或ADH內含子，連接本發(fā)明的啟動子及核苷酸序列。同樣，本發(fā)明的術語“融合的”包括直接或間接連接。在某些情況下，該術語不包括編碼通常與野生型基因啟動子有關的蛋白的核苷酸序列的天然組合，且它們都存在于其天然環(huán)境中。
所述構建體甚至可含有或表達標記，從而選擇細菌，優(yōu)選芽孢桿菌屬中的，或已經(jīng)轉移到植物中的基因構建體?，F(xiàn)有的各種標記都可使用，如編碼甘露糖-6-磷酸異構酶的那些(特別對于植物而言)或提供抗生素抗性的那些標記，例如，對G418，潮霉素，博來霉素，卡那霉素和慶大霉素。
對于某些應用而言，優(yōu)選本發(fā)明的構建體至少含有與啟動子可操縱連接的本發(fā)明核苷酸序列。
宿主細胞本發(fā)明中的術語“宿主細胞”包括含有上述核苷酸序列或表達載體的任何細胞，其可用于重組生產(chǎn)具有此處定義的特殊性質的酶。目標核苷酸與宿主細胞可以是同源或異源的。
因此，本發(fā)明另一實施方案提供用表達本發(fā)明酶的核苷酸序列轉化或轉染的宿主細胞。優(yōu)選所述核苷酸序列攜帶于復制或表達核苷酸序列的載體中。選擇與所述載體適合的細胞，它可以是原核生物(例如細菌)，真菌，酵母或植物細胞。
適宜的細菌宿主生物的例子是革蘭氏陽性菌，如芽孢桿菌科，包括枯草芽孢桿菌，地衣型芽孢桿菌，緩慢芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌，鏈霉菌屬，如鼠灰鏈霉菌，乳酸菌，如乳球菌亞種，如乳酸乳球菌，乳桿菌亞種，包括路氏乳桿菌，明串珠菌亞種，片球菌亞種和鏈球菌亞種?？蛇x擇性地，屬于包括大腸桿菌的腸桿菌科，或屬于假單胞菌科的革蘭氏陰性菌株可被選作宿主生物。
革蘭氏陰性菌大腸桿菌被廣泛用作異源基因表達的宿主。然而，大量異源蛋白傾向于在細胞內積聚。隨后從大量大腸桿菌胞內蛋白純化所需蛋白時較難。
與大腸桿菌相反，革蘭氏陽性菌，如芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌，地衣型芽孢桿菌，緩慢芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，變青鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，可能非常適合作為異源宿主，這是由于它們分泌蛋白到培養(yǎng)基中的能力。適合作為宿主的其它細菌是源于鏈霉菌屬和假單胞菌屬的那些。
根據(jù)編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列的性質，和/或進一步加工所表達蛋白的需要性，優(yōu)選真核生物宿主，如酵母或其它真菌。通常，酵母細胞優(yōu)于真菌細胞，這是因為它們更易于操縱。然而，某些蛋白或者很難從酵母細胞中分泌，或在某些情況下不能適當加工(例如，酵母中的過度糖基化)。在這些例子中，應選擇不同的真菌宿主。
典型的真菌表達宿主可選自黑色曲霉，黑色曲霉var.tubigenis，黑色曲霉var.awamori，棘孢曲霉，構巢曲霉，米曲霉，Trichodermareesei，枯草芽孢桿菌，地衣型芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，乳克魯維氏酵母和釀酒酵母。
適宜的絲狀真菌可以是，例如屬于曲霉的菌株，如米曲霉或黑色曲霉，或尖孢鐮孢菌株，禾谷鐮孢菌株(理想狀態(tài)稱為Gribberellazeae，先前的Sphaeria zeae，與玫瑰色赤霉和玫瑰色赤霉f.sp.Cereals同義)，或硫色鐮孢(理想狀態(tài)稱為虱狀赤霉，F(xiàn)usariumtrichothercioides，與桿孢狀鐮孢，接骨木鐮孢，玫瑰色鐮孢和玫瑰色鐮孢var.graminearum同義)，F(xiàn)usarium cerealis(與Fusariumcrokkwellnse同義)或Fusarium venenatum。
適宜的酵母生物可選自克魯維氏酵母，糖酵母或裂殖糖酵母，例如，釀酒酵母，或漢遜氏酵母(UK專利申請?zhí)柕?927801.2)。
適宜宿主細胞—如酵母，真菌和植物宿主細胞的應用—可提供翻譯后修飾(例如，十四?；?，糖基化，截短，脂化(lapidation)和酪氨酸，絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，這可能是賦予本發(fā)明的重組表達產(chǎn)物以最佳生物活性所需的。
所述宿主細胞可以是蛋白酶缺損或蛋白酶不足株。例如，可為蛋白酶缺損株米曲霉，它具有“alp”缺失的堿性蛋白酶基因。該菌株在WO97/35956中描述。
生物(organism)本發(fā)明的術語“生物”包括任何生物，它含有編碼本發(fā)明酶和/或由此獲得的產(chǎn)物的核苷酸序列，和/或當存在于生物中時，其中的啟動子可表達本發(fā)明的核苷酸序列。
適宜的生物可包括原核生物，真菌，酵母或植物。
本發(fā)明的術語“轉基因生物”包括任何生物，它含有編碼本發(fā)明酶和/或由其獲得的產(chǎn)物的核苷酸序列，和/或其中的啟動子可使本發(fā)明的核苷酸序列在生物內表達。優(yōu)選，所述核苷酸序列被摻入到生物的基因組中。
當受到也存在于其天然環(huán)境中的它們天然啟動子的控制時，術語“轉基因生物”不包括它們天然環(huán)境中的天然核苷酸編碼序列。
因此，本發(fā)明的轉基因生物包括的生物含有編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列的任何一個或組合，含有本發(fā)明的構建體，本發(fā)明的載體，本發(fā)明的質粒，本發(fā)明的細胞，本發(fā)明的組織，或其產(chǎn)物。例如，轉基因生物還可含有在異源啟動子的控制下，編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列。
宿主細胞/生物的轉化如前面所述，宿主生物可以是原核生物或真核生物。適宜的原核生物宿主的例子包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。
有關原核生物宿主轉化的教導在現(xiàn)有技術中已有記載，例如見Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)和Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc。如果使用原核生物宿主，那么需要在轉化之前，適當修飾核苷酸序列—如除去內含子。
絲狀真菌細胞可通過包括原生質體形成，原生質體轉化，及細胞壁再生的過程，按已知方式轉化。曲霉作為宿主微生物的應用在EP 0238 023中描述。
其它宿主生物可以是植物。構造遺傳修飾植物的基本原理是在植物基因組中插入遺傳信息，以便穩(wěn)定維持所插入的遺傳物質?，F(xiàn)有插入遺傳信息的技術有很多，兩個主要的原理是直接引入遺傳信息和利用載體系統(tǒng)引入遺傳信息。常用技術可在Potrykus(Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章中找到。有關植物轉化的其它教導可在EP-A-0449375中找到。
有關真菌，酵母和植物轉化的一般教導在下列部分中提出。
轉化的真菌宿主生物可以是真菌—如霉菌。這種宿主的適宜例子包括屬于Phanerochaete，Thermomyces，支頂孢屬，曲霉屬，青霉屬，毛霉屬，鏈孢霉屬，木霉屬等—如Thermomyces lanuginosis，Acremoniumchrysogenum，黑色曲霉，米曲霉，泡盛曲霉，產(chǎn)黃青霉，爪哇毛霉，粗糙鏈孢霉，綠色木霉，黃孢原毛平革菌等的任一成員。
在其中一個實施方案中，所述宿主生物可以是絲狀真菌。
幾乎一個世紀以來，絲狀真菌已經(jīng)廣泛用于很多類型的工業(yè)中，用于生產(chǎn)有機化合物和酶。例如，傳統(tǒng)的日本酒曲和醬油發(fā)酵已經(jīng)使用了曲霉。且，在本世紀，黑色曲霉已經(jīng)用于生產(chǎn)有機酸，如檸檬酸，以及工業(yè)所用的各種酶。
絲狀真菌廣泛用于工業(yè)中有2個主要原因。第一，絲狀真菌可產(chǎn)生大量胞外產(chǎn)物，例如酶和有機化合物，如抗生素或有機酸。第二，絲狀真菌可在低成本底物，如谷粒，麩糠，甜菜粕等上生長。同樣的原因使得絲狀真菌成為進行本發(fā)明異源表達的宿主的有吸引力的生物。
為了制備轉基因曲霉，表達構建體是通過將本發(fā)明的核苷酸序列插入到被設計用于在絲狀真菌中表達的構建體中而制備的。
目前，已經(jīng)研究了幾種類型用于異源表達的構建體。這些構建體優(yōu)選含有一個或多個指導所分泌氨基酸序列的信號序列，其通常屬于真菌來源，以及終止表達系統(tǒng)的終止子(通常在真菌中是活性的)。
其它類型的表達系統(tǒng)已經(jīng)在真菌中研究出來，在那里，本發(fā)明的核苷酸序列可與編碼穩(wěn)定蛋白的真菌基因的較小或較大部分融合。這樣可使氨基酸序列穩(wěn)定。在這種系統(tǒng)中，由特異性蛋白酶識別的裂解位點可被引入到真菌蛋白和氨基酸序列之間，這樣所產(chǎn)生的融合蛋白就可在該位點被特異性蛋白酶裂解，由此釋放氨基酸序列。作為舉例，可引入由至少在某些曲霉中發(fā)現(xiàn)的KEX-2樣肽酶識別的位點。這種融合導致體內裂解，產(chǎn)生所表達的產(chǎn)物，但不產(chǎn)生較大的融合蛋白。
編碼細菌，真菌，脊椎動物和植物蛋白的若干基因已經(jīng)被報道在曲霉中異源表達。如果本發(fā)明的核苷酸序列不與信號序列融合，那么蛋白可胞內沉積。這種蛋白將在胞質中積聚，通常不會糖基化，這對于某些細菌蛋白而言是有利的。如果本發(fā)明的核苷酸序列具有信號序列，那么蛋白將胞外積聚。
對于產(chǎn)物穩(wěn)定性和宿主株的修飾而言，當它們被分泌到真菌的培養(yǎng)液中時，某些異源蛋白并不十分穩(wěn)定。絕大多數(shù)真菌都可產(chǎn)生很多胞外蛋白酶，其可降解異源蛋白。為了避免這種問題，已經(jīng)使用所減少蛋白酶產(chǎn)生的特殊真菌株作為宿主進行異源產(chǎn)生。
有關轉化絲狀真菌的教導見US-A-5741665，其中記載了轉化絲狀真菌和培養(yǎng)真菌的標準技術是本領域熟知的。用于N.Crassa的其它技術參見，例如Davis和de Serres，Methods Enzymol(1971)17A79-143。標準過程通常用于菌株的維持和分生孢子的制備。Mycelia通常在液體培養(yǎng)物中生長約14小時(25℃)，見Lambowitz等，J Cell Biol(1979)8217-31。宿主菌株通常在Vogel’s或Fries基本培養(yǎng)基中生長，所述培養(yǎng)基中還補充了適宜的營養(yǎng)物，如his，arg，phe，tyr，trp，對-氨基苯甲酸，和肌醇的任何一種或多種。
有關轉化絲狀真菌的其它教導見US-A-5674707，其中記載了一旦已經(jīng)獲得了一個構建體，可以線性形式或質粒形式，例如基于pUC或其它載體的形式，將它引入到所選擇的絲狀真菌宿主中，所使用的技術如DNA-介導的轉化，電穿孔，粒子槍轟擊，原生質體融合等。此外，Ballance 1991(ibid)記載了用于制備轉化真菌的轉化方案是以制備原生質體，然后用PEG和Ca2+離子將DNA引入到原生質體中為基礎的。然后，所轉化的原生質體再生，并使用各種選擇性標記選擇轉化真菌。
為了選擇所得的轉化體，所述轉化通常包括可選擇的基因標記，其是用表達序列盒而被引入到相同載體上，或通過共同轉化，而被引入到其中的基因標記是可選擇性的宿主菌株中。各種標記/宿主系統(tǒng)都是可以獲得的，包括與構巢曲霉的營養(yǎng)缺陷型菌株使用的pyrG，argB和niaD基因；米曲霉營養(yǎng)缺陷體的pyrG和argB基因；產(chǎn)黃青霉營養(yǎng)缺陷體的pyrG，trpC和niaD基因；和Trichoderma reesei營養(yǎng)缺陷體的argB基因。顯性可選擇標記包括amdS，oliC，hyg和phleo，現(xiàn)在它們也是可以得到的，并與如下絲狀真菌一起使用黑色曲霉，米曲霉，無花果曲霉，P.chrysogenum，枝頂頭孢，異紋旋孢霉，蘋果枯腐病霉，F(xiàn)ulvia fulva和Leptosphaeria maculans(見Ward in ModernMicrobial Genetics，1991，Wiley-Liss，Inc.，455-495頁)。通常所用的轉化標記是構巢曲霉的amdS基因，其以較高的拷貝數(shù)使真菌與作為獨立氮源的丙烯酰胺一起生長。
對于絲狀真菌的轉化而言，已經(jīng)相對于很多絲狀真菌研究出了若干轉化方案。在用于轉化的標記之中，有很多營養(yǎng)缺陷型標記，如argB，trpC，niaD和pyrG，抗生素抗性標記，如苯菌靈抗性，潮霉素抗性以及腐草霉素抗性。
一方面，所述宿主生物可以是曲霉屬，如黑色曲霉。
本發(fā)明的轉基因曲霉還可通過下列教導制備，見Rambosek，J.和Leach，J.1987(絲狀真菌中的重組DNA發(fā)展和展望CRC Crit Rev.Biotechnol.6357-393)，Davis R.W.1994(曲霉中的異源基因表達和蛋白分泌Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(編輯)曲霉工業(yè)微生物學的50年發(fā)展vol 29.Elsevier Amsterdam 1994.525-560頁)，Ballance，D.J.1991(絲狀真菌的轉化系統(tǒng)和真菌基因構建體的概述Leong，S.A.，Berka R.M.(編輯)Molecular Industrial Mycology.絲狀真菌的系統(tǒng)和應用Marcel Dekker Inc.New York 1991.1-29頁)和Turner G.1994(基因操縱的載體Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(編輯)曲霉工業(yè)微生物學的50年發(fā)展vol 29.Elsevier Amsterdam 1994.641-666頁)。
轉化酵母在另一實施方案中，所述轉基因生物可以是酵母。
在這點上，酵母也已經(jīng)被廣泛用作異源基因表達的載體。
作為舉例，釀酒酵母具有很長的工業(yè)使用歷史，包括用于異源基因表達。異源基因在釀酒酵母中的表達已經(jīng)由Goodey等，(1987，YeastBiotechnology，D R Berry等，編輯，401-429頁，Allen and Unwin，London)和King等，(1989，Molecular and Cell Biology of Yeasts，E FWalton和G TYarrontoh，編輯，107-133頁，Blackie，Glasgow)描述。
釀酒酵母適于異源基因表達的原因有幾個。第一，它對于人是非致病性的，且不會產(chǎn)生某些內毒素。第二，它具有很長的安全使用歷史，幾個世紀以來，已經(jīng)被用于各種不同目的。它還具有廣泛的公眾可接受性。第三，廣泛的商業(yè)應用和對該生物投入的研究產(chǎn)生了有關遺傳學和生理學的知識資源以及釀酒酵母的大規(guī)模發(fā)酵特性描述。
在釀酒酵母中進行異源基因表達的原理以及基因產(chǎn)物分泌的原理由E Hinchcliffe E Kenny(1993，“酵母作為異源基因表達的載體”，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose和J Stuart Harrison，編輯，第2nd版，Academic Press Ltd.)給出。
很多類型的酵母載體都是可以獲得的，包括整合載體，其需要與維持它們的宿主基因組，和自主復制型質粒載體重組。
為了制備轉基因糖酵母，通過將本發(fā)明的核苷酸序列插入到被設計用于在酵母中表達的構建體中來制備表達構建體。已經(jīng)研究出了若干類型用于異源表達的構建體。所述構建體可含有在酵母中發(fā)揮活性的啟動子，如酵母來源的啟動子，如GAL1啟動子。通常使用酵母來源的信號序列，如編碼SUC2信號肽的序列。在酵母中發(fā)揮活性的終止子可終止表達系統(tǒng)。
相對于酵母的轉化而言，已經(jīng)研究出了若干轉化方案。例如，本發(fā)明的轉基因糖酵母可通過下列教導制備，見Hinnen等，(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等，(1983，J Bacteriology 153，163-168)。
轉化酵母細胞可用各種選擇標記選擇。在用于轉化的標記之中，有很多是營養(yǎng)缺陷型標記，如LEU2，HIS4和TRP1，以及顯性抗生素抗性標記，如氨基苷類抗生素標記，例如G418。
轉化植物/植物細胞適于本發(fā)明的優(yōu)選宿主生物是植物。
在這點上，構造遺傳修飾植物的基本原理是將遺傳信息插入到植物基因組中，以便穩(wěn)定維持所插入的基因物質。
插入遺傳信息的技術有幾個，兩個主要的原理是直接引入遺傳信息和利用載體系統(tǒng)引入遺傳信息。一般技術可見Potrykus(Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。
雖然本發(fā)明的啟動子沒有在EP-B-0470145和CA-A-2006454中公開，但那兩篇文獻都提供了某些關于技術類型的有用的背景說明，從而用于制備本發(fā)明的轉基因植物。這些背景教導中的一些現(xiàn)包括在下列說明中。
構造遺傳修飾植物的基本原理是將遺傳信息插入到植物基因組中，從而穩(wěn)定維持所插入的遺傳物質。
因此，一方面，本發(fā)明涉及一種載體系統(tǒng)，其攜帶有本發(fā)明的核苷酸序列或構建體，而且能夠將所述核苷酸序列或構建體引入到生物，如植物的基因組中。
所述載體系統(tǒng)可含有一個載體，但也可含有2個載體。在兩個載體的情況下，所述載體系統(tǒng)通常被稱作組合載體系統(tǒng)。組合載體系統(tǒng)在Gynheung An等(1980)，Binary Vectors，Plant Molecular BiologyManualA3，1-19中詳細描述。
用于轉化具有已知啟動子或核苷酸序列或構建體的植物細胞的一個廣泛使用的系統(tǒng)是以使用源于根癌土壤桿菌的Ti質粒或源于發(fā)根病土壤桿菌的Ri質粒為基礎的，見An等(1986)，Plant Physiol.81，301-305和Butcher D.N.等(1980)，Tissue Culture Methods for PlantPathologists，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。
若干不同的Ti和Ri質粒已經(jīng)構造出來，其適于構造上述植物或植物細胞構建體。這種Ti質粒的非限制性粒子是pGV3850。
本發(fā)明的核苷酸序列或構建體應優(yōu)選插入到T-DNA的末端序列或相鄰T-DNA序列之間的Ti-質粒中，從而避免圍繞在T-DNA邊緣的序列立即斷裂，因為這些區(qū)中的至少一個似乎是將修飾T-DNA插入到植物基因組中所必需的。
從上述說明應當可以了解，如果生物是植物，那么本發(fā)明的載體系統(tǒng)優(yōu)選含有感染植物所需的序列(例如，vir區(qū))和T-DNA序列的至少一個邊緣部分，所述邊緣部分位于與基因構建體相同的載體上。優(yōu)選所述載體系統(tǒng)是根癌土壤桿菌Ti-質?；虬l(fā)根病土壤桿菌Ri-質粒或其衍生物，因為這些質粒是熟知的，且廣泛用于構造轉基因植物，現(xiàn)有的很多載體系統(tǒng)都是以這些質?；蚱溲苌餅榛A的。
在構造轉基因植物時，本發(fā)明的核苷酸序列或構建體首先是在微生物中構造的，載體可在其中復制，而且在插入到植物中前，易于操縱。有效微生物的例子是大腸桿菌，但也可使用具有上述性質的其它微生物。當已經(jīng)在大腸桿菌中構造上述載體系統(tǒng)的載體時，如果需要，可將它轉化到適宜的土壤桿菌，例如根癌土壤桿菌中。因此，優(yōu)選將隱匿本發(fā)明核苷酸序列或構建體的Ti-質粒轉化到適宜的土壤桿菌，如根癌土壤桿菌中，從而獲得隱匿本發(fā)明核苷酸序列或構建體的土壤桿菌細胞，隨后將DNA轉移到所要修飾的植物細胞中。
如CA-A-2006454所報道的，大量克隆載體都是可以獲得的，其含有大腸桿菌中的復制系統(tǒng)和選擇轉化細胞的標記。所述載體包括，例如，pBR 322，pUC系列，M13mp系列，pACYC 184等。
這樣，本發(fā)明的核苷酸或構建體可被引入到載體的適當限制性位置中。所含的質粒用于在大腸桿菌中轉化。大腸桿菌細胞是在適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，然后采集并溶解。之后回收質粒。作為分析方法，通常使用序列分析，限制分析，電泳和其它生化-分子生物學方法。每次操作后，所用的DNA序列可被限制并與下一個DNA序列連接。每個序列可被克隆到相同或不同的質粒中。
每次將本發(fā)明所需的啟動子或構建體或核苷酸序列引入到植物中后，其它DNA序列的存在和/或插入可能是必需的。如果，例如，進行轉化時，使用植物細胞的Ti-或Ri-質粒，作為所引入基因的側翼區(qū)，至少Ti-和Ri-質粒T-DNA的右邊界，然而常常是右邊界和左邊界可被連接。T-DNA用于轉化植物細胞的應用已經(jīng)被集中研究，且在EP-A-120516；Hoekema，The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，Chapter V；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，41-46；和An等，EMBO J.(1985)4277-284中描述。
用土壤桿菌直接感染植物組織是一種簡單的技術，已經(jīng)廣泛使用，并在Butcher D.N.等(1980)，植物病理學家的組織培養(yǎng)法，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。有關這個論題的其它教導見Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)中描述。使用這種技術，可在植物的特定部分或組織，即葉，根，莖或植物其它部分上進行植物的感染。
通常，用攜帶啟動子和/或GOI的土壤桿菌直接感染植物組織時，所感染的植物是受過損傷的，即用剃刀切割植物或用針刺穿植物或用磨料研磨植物。然后在傷口中接種土壤桿菌。接著，使所接種的植物或植物的一部分在適宜的培養(yǎng)基上生長，并發(fā)育為成熟的植物。
當植物細胞被構造時，這些細胞可按照熟知的組織培養(yǎng)方法生長并維持，例如在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，所述培養(yǎng)基中補充了必需的生長因子，如氨基酸，植物激素，維生素等。轉化細胞在基因修飾植物中的再生可使用從細胞或組織培養(yǎng)物中再生植物的已知方法完成，例如使用抗生素選擇轉化的芽，在含有適宜營養(yǎng)物，植物激素等的培養(yǎng)基上再次培養(yǎng)該芽。
轉化植物的其它技術包括沖擊(ballistic)轉化，碳化硅晶須(siliconwhisker carbide)技術(見Frame BR，Drayton PR，Bagnaall SV，LewnauCJ，Bullock WP，Wilson HM，Dunwell JM，Thompson JA & Wang K(1994)利用碳化硅晶須-介導的轉化產(chǎn)生可繁殖的轉基因玉蜀黍，ThePlant Journal 6941-948)和病毒轉化技術(例如，見Meyer P，HeidmannI & Niedenhof I(1992)木薯花斑病病毒作為植物載體系統(tǒng)的應用，Gene 110213-217)。有關沖擊轉化的教導在下面的部分中提出。
有關植物轉化的其它教導可在EP-A-0449375中找到。
植物和植物組織的沖擊轉化正如所述，產(chǎn)生轉基因植物的技術是本領域熟知的。通常，完整的植物，細胞或原生質體可用編碼鋅指分子或靶DNA的適宜核酸構建體轉化(見上面核酸構建體的例子)。將轉化DNA構建體引入到細胞中的方法有很多，但并不都適于把DNA送遞給植物細胞。適宜的方法包括土壤桿菌感染(見，Turpen等，1993，J.Virol.Methods，42227-239)或直接送遞DNA，例如，通過PEG-介導的轉化，電穿孔或DNA涂覆粒子的加速。加速法通常是優(yōu)選的，包括如，微粒轟擊。
最初研究產(chǎn)生的植物穩(wěn)定轉化體可抗根癌土壤桿菌所致的轉化，植物組織的沖擊轉化可將DNA引入到金屬粒子表面上的細胞中，現(xiàn)在已經(jīng)用于檢測瞬時表達過程中，基因構建體的性能。這樣，基因表達可在瞬時轉化的細胞中研究，沒有基因在目標中的穩(wěn)定整合，并由此沒有穩(wěn)定轉化體的耗時產(chǎn)生。
更具體而言，沖擊轉化技術(也被稱作粒子轟擊技術)首先由Klein等，Sanford等和Klein等描述并普及，這是由于易于操縱，且無需在目標中進行細胞或組織的預處理。
粒子轟擊技術的原理是通過驅動力(例如放電或壓縮空氣)直接將DNA-涂覆的微粒送遞到完整的植物細胞中。微粒刺穿細胞壁和細胞膜，僅具有微小的損傷，然后轉化細胞表達啟動子構建體。
可進行的其中一個粒子轟擊技術使用Particle Inflow Gun(PIG)，它是由Finer等和Vain等研制并描述的。PIG使流動氦流中的微粒加速，通過不完全真空，進入到植物細胞中。
PIG的其中一個優(yōu)點是微粒的加速可通過計時器中繼螺線管以及通過調節(jié)所提供的氦壓來控制。加壓氦作為驅動力的使用具有惰性，沒有殘留物和產(chǎn)生可再現(xiàn)性加速的優(yōu)點。真空可降低對粒子的拖拉，在沖擊之前，減少氦氣分散對組織的損害[Finer等，1992]。
在某些情況下，PIG系統(tǒng)的有效性和簡便性使它成為產(chǎn)生瞬時轉化的瓜兒豆組織的良好選擇，并測試了啟動子/報道基因融合體的瞬時表達。
下面所述產(chǎn)生轉基因植物的典型方案(特別是單子葉植物)見美國專利號第5,874,265。
用于將轉化DNA片段送遞給植物細胞的方法的實施例是微粒轟擊。在該方法中，非生物粒子可用核酸涂覆，并通過推進力送遞到細胞中。舉例的粒子包括由鎢、金、鉑等組成的那些。
微粒轟擊的特殊優(yōu)點，除了可再現(xiàn)地穩(wěn)定轉化雙子葉植物和單子葉植物外，還有就是既不需要分離原生質體，又不需要對土壤桿菌感染敏感。通過加速將DNA送遞到植物細胞中的方法的舉例實施方案是Biolistics Particle Delivery System，其可用于通過屏幕，如不銹鋼或Nytex屏幕，將用DNA涂覆的粒子推進到用在混懸液中培養(yǎng)的植物細胞涂覆的濾器表面上。屏幕可將鎢-DNA粒子分散，這樣它們就不能被送遞給較大聚集體中的受體細胞。據(jù)信在發(fā)射設備與所要轟擊的細胞，發(fā)射聚集體之間沒有屏幕干擾，且可能對于獲得較高的轉化頻率而言太大。這可能是由于通過發(fā)射施加在受體細胞上的損害太大。
進行轟擊時，優(yōu)選在濾器上濃縮細胞的混懸液。含有所要轟擊細胞的濾器位于macroprojectile終止平板下的適當距離。如果需要，一個或多個屏幕還可位于槍和所要轟擊的細胞之間。通過上述技術的使用，可在轟擊濾器上獲得瞬時表達基因標記的1000或更多簇細胞(“集落”)。轟擊48小時后，表達外源基因產(chǎn)物的集落中的細胞數(shù)為1-10，平均為2-3。
通過上述任何一種方法將外源DNA送遞給受體細胞之后，優(yōu)選的步驟是鑒定轉化細胞，用于進一步培養(yǎng)和植物再生。該步驟可包括根據(jù)可篩選特征直接測定培養(yǎng)物，或使受到轟擊的培養(yǎng)物與選擇劑接觸。
可篩選標記特征的例子是在玉蜀黍中R-座位的控制下產(chǎn)生的紅色。該顏色可通過在含有營養(yǎng)培養(yǎng)基的固體支持物上培養(yǎng)細胞而檢測，其中所述培養(yǎng)基能夠在該階段支持生長，在18℃和大于180μEm-2s-1的條件下培養(yǎng)細胞，并從已經(jīng)著色的克隆中選擇細胞(細胞的可見聚集體)。這些細胞可在混懸液中或固體培養(yǎng)基上進一步培養(yǎng)。
鑒定轉化細胞的舉例性方法包括使受轟擊的培養(yǎng)物與選擇劑，如代謝抑制劑，抗生素，除草劑等接觸。已經(jīng)轉化并穩(wěn)定整合的細胞，賦予所用選擇劑抗性的標記基因在培養(yǎng)物中生長并分化。敏感細胞不能進一步培養(yǎng)。
為了使用bar-bialaphos選擇系統(tǒng)，將濾器上的轟擊細胞重懸浮在非選擇性液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)(例如1-2周)并轉移到覆蓋了含有1-3mg/l bialaphos的固體培養(yǎng)基的濾器上。通常優(yōu)選1-3mg/l，建議在本發(fā)明中使用0.1-50mg/l。轟擊所用濾器的類型并不特別重要，可包括任何固體，多孔，惰性支持物。
與選擇劑接觸存活的細胞可在支持植物再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將組織維持在含有激素的基礎培養(yǎng)基上約2-4周，然后轉移到?jīng)]有激素的培養(yǎng)基中。2-4周后，芽的發(fā)育預示了轉移到其它培養(yǎng)基中的時間。
再生通常要求培養(yǎng)基的發(fā)展，其中所述培養(yǎng)基的組成已經(jīng)被改變，從而在從轉化的愈合組織向更成熟植物連續(xù)發(fā)育的階段，提供適宜的營養(yǎng)物和激素信號。將正在發(fā)育的幼苗(plantlet)轉移到土壤中，使之變硬，例如，在大約85％相對適度的環(huán)境可控室中，600ppmCO2，和250μE m-2s-1的光。植物優(yōu)選在生長室或溫室中成熟。再生通常需要大約3-12周的時間。再生過程中，細胞在組織培養(yǎng)容器中的固體培養(yǎng)基上生長。這種容器的例子是陪替氏培養(yǎng)皿。再生植物優(yōu)選在大約19-28℃下生長。再生植物已經(jīng)發(fā)芽并生根后，可把它們轉移到溫室中進一步生長并檢測。
基因組DNA可從愈傷組織細胞系及植物中分離，從而通過本領域那些技術人員熟知的技術，如PCR和/或DNA印跡來確定外源基因的存在。
很多技術都可用于插入遺傳信息，兩個主要原理是直接引入遺傳信息，以及利用載體系統(tǒng)引入遺傳信息。一般性技術見Potrykus(AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章。
培養(yǎng)和產(chǎn)生用核苷酸序列轉化的宿主細胞可在有助于產(chǎn)生編碼酶并促進酶從細胞和/或培養(yǎng)基中回收的條件下培養(yǎng)。
用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基可以是適于使宿主細胞生長并獲得酶表達的任何常規(guī)培養(yǎng)基。適宜的培養(yǎng)基可從供應商處獲得或按照公開的方法制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述)。
由重組細胞產(chǎn)生的蛋白可在細胞表面上展示(display)。如果需要，且正如本領域那些技術人員所了解的，含有編碼序列的表達載體可用信號序列來設計，其指導編碼序列通過特定原核生物或真核生物細胞膜的分泌。其它重組構建體可將編碼序列與編碼多肽結構域的核苷酸序列連接起來，其可促進可溶性蛋白的純化(Kroll DJ等(1993)DNACell Biol 12441-53)。
所述酶可從宿主細胞分泌，而且可通過熟知的過程，很方便地從培養(yǎng)基中回收，包括利用離心或過濾分離培養(yǎng)基中的細胞，利用鹽，如硫酸銨使培養(yǎng)基中的蛋白成分沉淀，接著使用色譜過程，如離子交換色譜，親和色譜等。
分泌常常希望由表達宿主分泌的酶進入到培養(yǎng)基中，這樣更容易回收該酶。根據(jù)本發(fā)明，分泌前導序列可根據(jù)所需的表達宿主來選擇。雜種信號序列也可在本發(fā)明的范圍內使用。
異源分泌前導序列的典型例子是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24個氨基酸譯本，例如來源于曲霉)，a-因子基因(酵母，例如糖酵母，克魯維氏酵母和漢遜氏酵母)或α-淀粉酶基因(桿菌)的那些。
檢測檢測及測量氨基酸序列表達的各種方法都是本領域已知的。例子包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，放射免疫測定法(RIA)和熒光活化細胞分選法(FACS)。利用對POI上兩個非-干擾抗原決定部位反應的單克隆抗體進行的雙位點、基于單克隆的免疫測定法也可使用，或使用競爭結合測定法。這些以及其它測定法都已經(jīng)被描述，見Hampton R等，(1990，Serological Methods，A Laboratory Manual，APS Press，St Paul MN)和Maddox DE等(1983，J Exp Med 15 8121 1)。
多種標記和接合技術都是本領域那些技術人員已知的，可用于各種核酸及氨基酸測定法中。產(chǎn)生標記雜交或PRC探針，用于檢測氨基酸序列的方法包括寡標記，切口翻譯，末端標記或使用標記核苷酸的PCR擴增?？蛇x擇性地，NOI，或它的任一部分，可被克隆到載體中，用于產(chǎn)生mRNA探針。這種載體是本領域已知的，可商業(yè)獲得，并可通過加入適當?shù)腞NA聚合酶，如T7，T3或SP6以及標記核苷酸而用于體外合成RNA探針。
很多公司，如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)，Promega(Madison，WI)，和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)都可提供商業(yè)試劑盒以及這些過程的方案。適宜的報道分子或標記包括那些放射性核素，酶，熒光，化學發(fā)光，或顯色劑以及底物，輔因子，抑制劑，磁性粒子等。教導使用這種標記的專利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350；US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。而且，重組免疫球蛋白可按照US-A-4,816,567所述生產(chǎn)。
測量氨基酸序列表達的其它方法包括放射性標記(Melby PC等，1993 J Immunol Methods 159235-44)或生物素化(Duplaa C等，1993Anal Biochem 229-36)核苷酸，控制核酸的共同擴增，插入實驗結果的標準曲線。多個樣品的量化可通過運行ELISA測定而加速，其中目標低聚物以各種稀釋度給出，且分光光度或量熱反應可快速量化。
雖然標記基因表達存在與否都可表示核苷酸序列的存在，但它的存在和表達都應被證實。例如，如果核苷酸序列被插入到標記基因序列中，那么可通過標記基因功能的缺失鑒定含有核苷酸序列的重組細胞?？蛇x擇性地，在本發(fā)明啟動子或可選擇性啟動子(優(yōu)選本發(fā)明的同一啟動子)的控制下，可將標記基因與核苷酸序列一前一后放置。應答誘導或選擇時，標記基因的表達通常也表示氨基酸序列的表達。
可選擇性地，含有核苷酸序列的宿主細胞可利用本領域那些技術人員已知的各種過程來鑒定。這些過程包括，但不限制于，DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白生物測定或免疫測定技術，其包括基于膜，基于溶液，基于芯片的技術，從而檢測和/或量化核酸或蛋白。
融合蛋白本發(fā)明的氨基酸序列可作為融合蛋白產(chǎn)生，例如，有助于提取和純化。融合蛋白配偶體的例子包括谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA結合和/或轉錄活化結構域)及(β-半乳糖苷酶)。它還可在融合蛋白配偶體與目標蛋白序列之間包括蛋白裂解位點，從而除去融合蛋白序列。優(yōu)選，融合蛋白不阻礙蛋白序列的活性。
融合蛋白可含有與本發(fā)明物質融合的抗原或抗原決定子。在該實施方案中，所述融合蛋白可以是非天然存在的融合蛋白，其含有在提供免疫系統(tǒng)全身刺激時作為助劑發(fā)揮作用的物質。所述抗原或抗原決定子可與物質的氨基或羧基末端連接。
在本發(fā)明另一實施方案中，所述氨基酸序列可與異源序列連接，從而編碼融合蛋白。例如，篩選能夠影響物質活性的肽庫時，它可用于編碼表達異源抗原決定部位的嵌合物質，所述異源抗原決定部位可由商業(yè)獲得的抗體識別。
其它POI本發(fā)明的序列可與一個或多個其它目標蛋白(POI)或目標核苷酸序列(NOI)結合使用。
POI的非限制性例子包括涉及淀粉代謝的蛋白或酶，涉及糖原代謝的蛋白或酶，乙?；ッ福彪拿?，淀粉酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶(arabinofuranosidases)，羧肽酶，過氧化氫酶，纖維素酶，殼多糖酶，凝乳酶，cutinase，脫氧核糖核酸酶，差向異構酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡聚糖酶，葡聚糖裂合酶，內切-β-葡聚糖酶，葡糖淀粉酶，葡糖氧化酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，半纖維素酶，己糖氧化酶，水解酶，轉化酶，異構酶，漆酶，脂酶，裂合酶，甘露糖苷酶，氧化酶，氧化還原酶，果膠酸酯裂合酶，果膠乙?；ッ?，果膠解聚酶，果膠甲酯酶，pectinolytic enzymes，過氧化物酶，酚氧化酶，肌醇六磷酸酶，聚半乳糖醛酸酶，蛋白酶，鼠李-galacturonases，核糖核酸酶，祝馬丁，轉移酶，轉運蛋白，轉谷氨酰胺酶，木聚糖酶，己糖氧化酶(D-己糖O2-氧化還原酶，EC 1.1.3.5)或其組合。POI甚至可以是那些序列任何一個的反義序列。
POI甚至可以是融合蛋白，例如幫助提取和純化。
融合蛋白配偶體的例子包括麥芽糖結合蛋白，谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA結合和/或轉錄活化結構域)及β-半乳糖苷酶。它還可在融合組份之間包括蛋白裂解位點。
POI甚至可與分泌序列融合。分泌前導序列的例子是來源于淀粉葡糖苷酶基因，α-因子基因，α-淀粉酶基因，脂酶A基因，木聚糖酶A基因的那些。
其它序列還可促進分泌或增加分泌POI的產(chǎn)率。這種序列可編碼伴侶蛋白，例如，在UK專利申請9821198.0中描述的黑色曲霉cyp基因的產(chǎn)物。
對NOI進行工程改造從而改變它們活性的原因有很多，包括但不限制于，改變其表達產(chǎn)物的加工和/或表達。例如，可使用本領域熟知的技術，例如，定點誘變引入突變，從而插入新的限制性位點，改變糖基化模式或偏愛密碼子。作為舉例，還可對NOI進行修飾，從而優(yōu)化在特定宿主細胞中的表達。還可進行其它序列改變，從而引入限制性酶識別位點。
NOI內可包括合成或修飾的核苷酸。對寡核苷酸進行的各種不同類型的修飾是本領域已知的。這些包括甲基膦酸鹽或硫代磷酸鹽主鏈，在分子的3’和/或5’末端加入吖啶或聚賴氨酸鏈。對于本發(fā)明而言，應當理解NOI可被本領域的任何方法修飾。進行這種修飾可提高NOI的體內活性或使用期限。
NOI可被修飾增加胞內穩(wěn)定性及半衰期?？赡艿男揎棸?，但不限制于，加入分子5’和/或3’末端的側翼序列，或使用硫代磷酸鹽或2’O-甲基，而不是分子主鏈內的磷酸二酯酶。
抗體本發(fā)明一方面涉及與權利要求1的一個或多個氨基酸序列進行免疫反應的氨基酸序列。
抗體可通過標準技術，如用本發(fā)明的物質免疫，或使用噬菌體展示庫產(chǎn)生。
對于本發(fā)明而言，除非另有說明，術語“抗體”包括但不限制于，多克隆，單克隆，嵌合，單鏈，F(xiàn)ab片段，由Fab表達庫產(chǎn)生的片段，及其模擬物。這種片段包括整個抗體的片段，其保留了它們對靶物質的結合活性，F(xiàn)V，F(xiàn)(ab’)和F(ab’)2片段，以及單鏈抗體(scFv)，融合蛋白和其它合成蛋白，其含有抗體的抗原-結合位點。此外，抗體及其片段還可以是人源化抗體。中和抗體，即抑制物質多肽生物活性的那些，對于診斷和治療是特別優(yōu)選的。
如果需要多克隆抗體，用本發(fā)明的序列(或含有其免疫抗原決定部位的序列)使所選擇的哺乳動物(例如，小鼠，兔子，山羊，馬等)免疫。根據(jù)宿主種類的不同，可使用各種助劑來增加免疫應答。這種助劑包括，但不限制于Freund’s，礦物質凝膠，如氫氧化鋁，和表面活性物質，如溶血卵磷脂，pluronic polyols，聚陰離子，肽，油乳膠，匙孔戚血藍蛋白，和二硝基酚。BCG(Bacilli Calmette-Guerin)和Corynebacterium parvum是潛在有效的人類助劑，如果將純化物質的多肽給予無免疫應答的個體來刺激系統(tǒng)防御，那么可使用它。
采集免疫動物的血清，并按照已知的過程處理。如果含有本發(fā)明序列(或含有其免疫抗原決定部位的序列)的多克隆抗體的血清含有其它抗原的抗體，那么所述多克隆抗體可利用免疫親和色譜純化。生產(chǎn)并加工多克隆抗血清的技術是本領域已知的。為了制備這種抗體，本發(fā)明還提供相對于其它多肽haptensied本發(fā)明多肽或其片段作為動物或人的免疫原。
針對本發(fā)明序列的單克隆抗體(或含有其免疫抗原決定部位的序列)可由本領域的技術人員很容易地生產(chǎn)出來。利用雜交瘤制備單克隆抗體的一般性方法是熟知的。產(chǎn)生無限增殖抗體的細胞系可通過細胞融合創(chuàng)造，還可利用其它技術，如用致癌基因DNA直接轉化B淋巴細胞，或用Epstein-Barr病毒轉染而創(chuàng)造。篩選相對于軌道抗原決定部位產(chǎn)生的單克隆抗體組的各種性質，即同型和抗原決定部位的親和性。
本發(fā)明序列(或含有其免疫抗原決定部位的序列)的單克隆抗體可使用任何技術制備，其利用培養(yǎng)物中的連續(xù)細胞系生產(chǎn)抗體分子。這些包括，但不限制于，最初由Koehler和Milstein(1975 Nature256495-497)描述的雜交瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術(Kosbor等，(1983)Immunol Today 472；Cote等，(1983)Proc Natl Acad Sci802026-2030)和EBV-雜交瘤技術(Cole等，(1985)MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss Inc，77-96頁)。此外，為生產(chǎn)“嵌合抗體”而研究的技術，可使用從小鼠抗體基因向人抗體基因剪接，從而獲得具有適宜抗原特異性和生物活性分子的方法(Morrison等，(1984)Proc Natl Acad Sci 816851-6855；Neuberger等，(1984)Nature 312604-608；Takeda等，(1985)Nature 314452-454)?？蛇x擇性地，生產(chǎn)單鏈抗體的技術(美國專利號第4,946,779)適于生產(chǎn)物質特異性單鏈抗體。
抗體還可通過在淋巴細胞群中誘導體內產(chǎn)生或篩選重組免疫球蛋白庫或高度特異性結合試劑組而生產(chǎn)，見Orlandi等，(1989，Proc NatlAcad Sci 863833-3837)，和Winter G和Milstein C(1991；Nature349293-299)。
還可產(chǎn)生含有物質特異性結合位點的抗體片段。例如，這種片段包括，但不限制于，F(xiàn)(ab’)2片段，其可通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生，和Fab片段，其可通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生?？蛇x擇性地，可構造Fab表達庫，從而快速并簡單地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段(Huse WD等，(1989)Science 2561275-1281)。
大規(guī)模應用在本發(fā)明其中一個優(yōu)選實施方案中，大規(guī)模應用所述氨基酸序列。
優(yōu)選，培養(yǎng)宿主生物后，所述氨基酸序列以1g/升-約2g/升總細胞培養(yǎng)物體積的量生產(chǎn)。
優(yōu)選，培養(yǎng)宿主生物后，所述氨基酸序列以100mg/升-約900mg/升總細胞培養(yǎng)物體積的量生產(chǎn)。
優(yōu)選，培養(yǎng)宿主生物后，所述氨基酸序列以250mg/升-約500mg/升總細胞培養(yǎng)物體積的量生產(chǎn)。
概述總之，本發(fā)明涉及氨基酸序列及核苷酸序列，還涉及含有它們的構建體。本發(fā)明還涉及已知酶的新用途。
參考附圖，在下列非限制性實施例中進一步舉例說明本發(fā)明，其中

圖1表示在8-25％梯度的凝膠上，對PD1(吡喃鄰酮醛糖脫水酶同種型1)進行電泳。更具體而言，圖1A表示SDS-PAGE(左數(shù))第1和2道分別是源于Novex和Pharmacia的蛋白標記，第3，4和5道是純化的PD1。圖1B，表示Native PAGE第1，2和3道是純化的PD1，第4道是源于Pharmacia的蛋白標記，第5道是部分純化的。凝膠用源于Pharmacia的PhastGel Blue R染色。
圖2表示吡喃鄰酮醛糖脫水酶的部分氨基酸序列。
圖3A舉例說明1，5-脫水-D-果糖和PD用于生產(chǎn)薄閉殼素的應用。反應混合物含有1，5-脫水-D-果糖5μl(3.0％)，PD制劑5μl，65μl磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)和補足至0.7ml終體積的水。反應可通過在350-190nm之間掃描來監(jiān)測。將第0分鐘的反應時間用作空白。約230nm處的吸光度峰值表示薄閉殼素的形成。265nm處的吸光度表示在轉化成薄閉殼素之前，從AF首先形成中間體。
圖3B舉例說明薄閉殼素的產(chǎn)生及其中間體。反應混合物含有10μl部分純化的PD(源于黃孢原毛平革菌、沒有細胞的提取物的25-50％飽和度之間的硫酸銨部分)，25μl AF(3.0％，w/v)，100μl磷酸鈉緩沖液(0.1M，pH6.5)和0.84ml水。反應是通過加入底物AF而開始的。反應在22℃進行。薄閉殼素及其中間體的形成分別在230nm和263nm處監(jiān)測?？梢姷绞紫刃纬芍虚g體，且水平在大約20分鐘后穩(wěn)定。薄閉殼素的形成延遲，但它的形成一直持續(xù)到反應混合物中的所有AF幾乎都被消耗。
圖4表示SEQ ID NO.1，編碼源于真菌Phaherochaete chrysosporium的吡喃鄰酮醛糖脫水酶(PD)的基因，其包括上游調節(jié)區(qū)(-1--288)，編碼區(qū)(1-3146)和下游區(qū)(3147-3444)。推定的起始密碼子是ATG(粗體)，終止密碼子是TGA TAG(粗體)。如果假設翻譯從粗體密碼子ATG開始，那么純化的功能性PD對應于從PD N-末端截短的7-氨基酸。
圖5表示源于真菌黃孢原毛平革菌的吡喃鄰酮醛糖脫水酶(PD)基因的上游區(qū)，編碼區(qū)和下游區(qū)。理論上，所述DNA序列可編碼具有不同氨基酸序列的3種蛋白。粗體氨基酸是通過對純化功能性PD進行氨基酸測序而找到的那些。鑒定的內含子是下面劃線的那些。
圖6表示按照實施例3處理過的甜菜種子的最終萌發(fā)(emergence)。
圖7表示相對于引起甜菜根腐爛的病原體螺殼狀絲囊霉，篩選不同濃度薄閉殼素的作用。圖8和9分別表示相對于引起甜菜根腐爛的病原體終極腐霉和茄屬絲核菌，篩選不同濃度薄閉殼素的作用。
實施例從真菌Phanerochaete chrysosporium純化的吡喃鄰酮醛糖脫水酶黃孢原毛平革菌(白腐真菌)是生物技術上很重要的真菌，這是由于它較高的生長最佳溫度(40℃)及其產(chǎn)生各種胞外氧化酶的能力。因此，這種真菌已經(jīng)用于處理各種垃圾，包括爆炸污染物，農(nóng)藥，和有毒垃圾。此外，黃孢原毛平革菌是被測序的第一個擔子菌基因組(University of California and Department of Energy，USA)。
在尋找代謝脫水果糖(AF)的酶時，純化的熱穩(wěn)定性吡喃鄰酮醛糖脫水酶(PD)是從P.chrysosporium獲得的。研究顯示，這種純化PD不僅使用AF作為底物，而且它較之天然底物葡糖醛酮更有效。此外，產(chǎn)物為薄閉殼素，一種用于植物保護的抗真菌劑。
用兩種蛋白酶水解后，闡明PD的N-末端序列，和PD的內切-N-末端序列。以它具有97kDa的Mr的假設為基礎，這些加在一起為332個氨基酸或占PD蛋白全長的37％。
通過使用上述部分氨基酸序列在真菌基因組上進行數(shù)據(jù)庫檢索，在Scaffold 62中鑒定了全長PD基因(圖4)。鑒定了轉錄起始和終止密碼子及3個內含子(圖4)。似乎純化PD是從N-末端截下來的7個氨基酸，但仍然是功能性的。因為在培養(yǎng)基中沒有發(fā)現(xiàn)酶PD，因此它可能沒有信號肽。
測定法測量PD活性反應混合物含有25μl脫水果糖溶液(3.0％)，10μl PD制劑，93μl0.1M磷酸鈉(pH 6.5)，和補足至1ml終體積的水?；旌戏磻?，每5分鐘于室溫(22℃)在190-320nm之間掃描，或30分鐘后在Perkin ElmerLambda 18 uv/vis分光光度計上掃描。記錄260和230nm處的吸光度值。將PD的一個活性單位定義為22℃、230nm下，每分鐘吸光度單位增加0.01。
蛋白測定法是用Bio-Rad法(Bradford method)進行的，其中使用了源于Bio-Rad實驗室的試劑和規(guī)程[Peterson，GL總蛋白的測定，Methods Enzymol.91，95-119(1983)]。
分離葡糖醛酮，AF和薄閉殼素的TLC是在使用乙酸乙酯，醋酸，甲醇和水(12∶3∶3∶2)的溶劑系統(tǒng)之前，按照所述進行的[Yu S，AhmadT，Pedersén M，Kenne Lα-1，4-葡聚糖裂合酶，一類新的淀粉/糖原降解酶.III.底物特異性，作用模式，和裂解機理，Biochim Biophys Acta12441-9(1995)]。使用厚度為0.15mm的Merck硅膠60(20×20cm)平板。1，5-脫水-D-果糖是利用DNS法測定的[Yu S，Olsen CE，MarcussenJ1，5-脫水-D-果糖和α-1，4-葡聚糖裂合酶的測定法，Carbohydr.Res.30573-82(1998)]。
PD的純化所用的純化過程基本上與Gabriel等，(1993)描述的相同，區(qū)別在于所用菌株不同。此外，還包括了額外的硫酸銨分級分離步驟。本次使用的菌株是源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的黃孢原毛平革菌(ATCC 32629)和(ATCC 24725)，而Gabriel等，(1993)所用的菌株是從Czechish保藏中心獲得的黃孢原毛平革菌k-3。
將Phanerochaete crysosporium沒有細胞的提取物培養(yǎng)至55％硫酸銨飽和。然后輕輕混合2小時，4℃、10000xg離心20分鐘。將具有PD活性的沉淀物溶解在相同體積的提取緩沖液中，再次離心，通過Gabriel等(1993)描述的過程，從上清液中純化PD。
PD純化后，進行SDS-PAGE，并按照制造商的說明，使用8-25％梯度凝膠的PhastSystem(Pharmacia)進行天然-PAGE。凝膠上的蛋白帶是用考馬斯亮藍(PhastGel Blue R)染色觀察的。從圖1A可看出，PD1具有97kDa的分子量，以及與蛋白標記磷酸化酶b(97.4kDa)相似的遷移速率。
氨基酸測序對純化PD進行氨基酸測序。PD的氨基酸測序是按照先前所述進行的[Yu.S.；Christensen TMIE，Kragh KM，Bojsen K，Marcussen J源于真菌的2個α-1，4-葡聚糖裂合酶的有效純化，特性描述，和部分氨基酸測序Biochim Biophys Acta 1339311-320(1997)]。首先用蛋白酶部分水解PD。在HPLC上分離所產(chǎn)生的肽片段。收集每個單個的多肽，通過質譜測定分子量，并使用脈沖-液體快速循環(huán)在AppliedBiosystems 476A測序儀上測序。進一步描述PD的pH和最佳溫度，活性，穩(wěn)定性，及其它動力學性質的離子要求。
從真菌黃孢原毛平革菌純化的吡喃鄰酮醛糖脫水酶獲得的氨基酸序列下列氨基酸序列是通過胰蛋白酶或內切蛋白酶LysC消化而獲得的。利用反相HPLC進行肽的純化，并利用MALDI-TOF質譜儀產(chǎn)生分子量的信息。然后將所獲得的序列與由加利福尼亞大學進行的White Rot Genome(黃孢原毛平革菌)工程中的DNA序列進行比較。序列相似性對比是用BLAST算法進行的。
產(chǎn)生顯著序列對比的所有肽都是在Scaffold 62中找到的。
LysC肽肽27.3(N末端)KPHCEPEQPAALPLFQPQLVQGGRPDXYWVEAFPFRSDSSKV可能的異質性該肽是從堿基對38620-38742找到的。在堿基對38599和38317處有一個起始密碼子，表示可能的信號肽。通過對蛋白PD2，一種同功酶進行測序證實了這是蛋白的N末端。
殘基27上的X是數(shù)據(jù)庫中的G，這與MS數(shù)據(jù)匹配。
MSc+＝4669.10 MSo+＝4668.01-0.023％N-末端吡喃鄰酮醛糖脫水酶的同功酶I(PDI)的N-末端是KPHXEPEQPAALPLFQPQLVV(Q)GGRPDXYX未知。V(Q)是指它可以是V或Q或兩者皆可(由于異質性)。
上述N-末端序列(肽27.3)是同功酶II(PDII)。PDI和PDII的N-末端非常相似或相同。
肽31.4bSDIQMFVNPYATTNNQSSXWTPVSLAKLDFPVAMHYADITKD可能的異質性這個肽是從堿基對38788-38963發(fā)現(xiàn)的。數(shù)據(jù)庫序列被源于堿基對38836-38889的內含子中斷。殘基28-41的序列是利用胰蛋白酶肽8.4證實的。
殘基19上的X是數(shù)據(jù)庫序列中的S，與MS數(shù)據(jù)匹配。
MSc+＝4591.22 MSo+＝4591.55+0.007％胰蛋白酶肽肽6aVSWLENPGELR該肽是從堿基對39096-39128發(fā)現(xiàn)的。
MSc+＝1300.44 MSo+＝1300.45+0.001％肽5DGVDCLWYDGAR該肽是從堿基對39426-39461發(fā)現(xiàn)的。
MSc+＝1427.48 MSo+＝1427.48LysC肽肽27.4aPAGSPTGIVRAEWTRHVLDVFGXLXXK該肽是從堿基對39673-39753發(fā)現(xiàn)的。
3個X’是數(shù)據(jù)庫中的PNG，與MS數(shù)據(jù)匹配。
MSc+＝2876.27 MSo+＝2876.80+0.021％肽29.4.8HTGSIHQVVCADIDGDGEDEFLVAMMGADPPDFQRTGVWCYK該肽是從堿基對39754-39879發(fā)現(xiàn)的。
MSc+＝4727.13 MSo+＝4727.70+0.012％肽13.11TEMEFLDVAGK該肽是從堿基對40244-40276發(fā)現(xiàn)的。
MSc+＝1240.42 MSo+＝1240.53+0.009％肽14.2KLTLVVLPPFARLDVERNVSGVK該肽是從堿基對40277-40345發(fā)現(xiàn)的。
MSc+＝2552.08 MSo+＝25551.35-0.029％胰蛋白酶肽肽10.5SMDELVAHNLFPAYVPDSVR該肽是從堿基對40526-40585發(fā)現(xiàn)的。
MSc+＝2259.55 MSo+＝2259.77+0.009％LysC肽肽31.4aNDATDGTPVLALLDLDGGPSPQAWNISHVPPGTDMYEIAHAK該肽是從堿基對41293-41469發(fā)現(xiàn)的，并含有源于堿基對41362-41416的內含子。
MSc+＝4289.73 MSo+＝4289.45-0.007％肽2bTGSLVCARWPPVK該肽是從堿基對41470-41508發(fā)現(xiàn)的。
MSc+＝1471.71 MSo+＝1472.62+0.062％肽2aNQRVAGTHSPAAMGLTSRWAVTK該肽是從堿基對41509-41577發(fā)現(xiàn)的。
MSc+＝2440.71 MSo+＝2441.58+0.036％肽11.3GQITFRLPEAPDHGPLFLSVSAIRHQ該肽是從堿基對41641-41718發(fā)現(xiàn)的。
MSc+＝2888.34 MSo+＝2888.25-0.031％該肽不用K終止，其表示C末端。該序列后面還接有終止密碼子。
該蛋白的分子量約為97KD?；诎被岬钠骄肿恿繛?10的假設，殘基數(shù)應為880，可產(chǎn)生總數(shù)為2640的堿基對。
根據(jù)數(shù)據(jù)庫序列計算的堿基對數(shù)為3100。兩個已知的內含子含有53和54個堿基對，如果假設該數(shù)字是標準的，那么預期數(shù)據(jù)庫序列含有約8個內含子。
這里測序的殘基總數(shù)為332個氨基酸，占蛋白的37％。
實施例11，5-脫水-D-果糖和PD在生產(chǎn)薄閉殼素中的應用反應混合物含有1，5-脫水-D-果糖5μl(3.0％)，PD制劑5μl，65μl磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)和補足至0.7ml體積的水。反應是通過在350-190nm之間掃描而監(jiān)測的。將第0分鐘的反應時間用作空白。230nm附近的吸光度峰值表示薄閉殼素的形成。265nm處的吸光度表示在轉化成薄閉殼素之前，首先從AF形成中間體。
所形成的薄閉殼素可通過TLC上的相對遷移速率被進一步證實，2-呋喃羥甲基酮的轉化在275nm處顯示出典型的吸光度峰值[BauteM.-A.等，1986]。
在大規(guī)模生產(chǎn)薄閉殼素時，使用0.4％-20％的AF。反應之后，使用DNS法除去反應混合物中的AF[Yu.S.；Christensen TMIE，KraghKM，Bojsen K，Marcussen J，Biochim Biophys Acta 1339311-320(1997)]。薄閉殼素的形成是在265nm處監(jiān)測的，然后移至230nm處，并利用TLC法進一步監(jiān)測。
較之天然底物葡糖醛酮，1，5-脫水-D-果糖是吡喃鄰酮醛糖脫水酶(PD)的更好底物。使用AF獲得的Vmax比使用葡糖醛酮獲得的要高約4.7倍(表1)。
表1
反應系統(tǒng)含有AF或葡糖醛酮1-15μl，25μl磷酸鈉緩沖液(6.5.0.1M)，水，1.4μl PD，終體積200μl。反應在22℃進行5.5小時。在226nm處監(jiān)測薄閉殼素自AF的形成，和藍草菌酮自葡糖醛酮的形成。
實施例2藍草菌酮的產(chǎn)生藍草菌酮可一步產(chǎn)生，如通過將淀粉型底物，如含蠟淀粉，糊精，與淀粉水解酶，如淀粉葡糖苷酶和脫支酶或環(huán)糊精轉移酶，吡喃糖2-氧化酶，和PD一起培養(yǎng)。培養(yǎng)后，通過使用300-30,000，優(yōu)選10,000的截止膜超濾而分離出反應混合物中的藍草菌酮。
實施例31，5-脫水-D-果糖，PD及子囊吡喃酮P合酶生產(chǎn)APP的應用反應混合物含有1，5-脫水-D-果糖50μl(3.0％)，PD制劑5μl，子囊吡喃酮P合酶5μl，0.1ml磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)和補足至0.8ml的水。通過289nm處APP的形成而分光光度監(jiān)測該反應。反應溫度為22℃，反應時間為24小時。最后，有90％的AF轉化成了APP。APP的結構是用先前所述的NMR證實的[WO 00/56838，于16/3/00提交，要求19/3/99提交的GB9906457.8的優(yōu)先權]。
PD基因的表達利用本領域熟知的技術和此前說明書中提到的參考文獻，可在生物，如巴斯德畢赤氏酵母，黑色曲霉，和多形漢遜氏酵母中表達PD基因。
抗體產(chǎn)生用純化酶給兔子注射，并分離抗血清中的免疫球蛋白，可培養(yǎng)本發(fā)明氨基酸的抗體，見N Harboe和A Ingild(“免疫，免疫球蛋白的分離，抗體滴定度的評估”，A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis，Methods and Applications，N H Axelsen等，(編輯)，Universitetsforlaget，Oslo，1973)和T G Cooper(“The Tools ofBiochemistry”，John Wiley & Sons，New York，1977)。
薄閉殼素抗真菌真菌在植物中生長可引起巨大的經(jīng)濟損失。例子是它們對甜菜幼苗和它們葉子的損害。只要甜菜種子在土壤中發(fā)芽，它就會立即與真菌如茄屬絲核菌，終極腐霉，螺殼狀絲囊霉接觸，受到攻擊。在本發(fā)明中，人們發(fā)現(xiàn)薄閉殼素能夠抑制引起這些疾病的真菌的生長。因此，用含有50-2000ppm薄閉殼素的糊狀物涂覆經(jīng)濟作物的種子，如甜菜種子，并在種植前干燥?？蛇x擇性地，可將薄閉殼素的水溶液直接噴在植物及其葉子上。
實驗基礎薄閉殼素溶液24mg/ml Batch no.Mic20011016所用稀釋度
所有溶液都是通過用于滅菌的0.22μm過濾器過濾的。
相對于下列真菌測試該溶液
將新鮮菌絲體的環(huán)狀孢塞(直徑10mm)放在含有PDA培養(yǎng)基的陪替氏培養(yǎng)皿(直徑9cm)的中央。(PDA＝馬鈴薯葡萄糖瓊脂Difcono.213400)。沿著瓊脂平板的周圍切割一個直徑5mm的孔。在每個孔中放50μl試驗溶液。可選擇性地，將20μl各試驗溶液沿著平板周圍直接放在瓊脂上。并且，將50μl各試驗溶液直接放在真菌菌絲體的孢塞上。
室溫時，將瓊脂平板放在日光下，但避免直接日曬。
真菌對試驗物質的反應(抑制區(qū))如下判斷茄屬絲核菌 生長2-3天后終極腐霉生長1-2天后螺殼狀絲囊霉生長3-4天后菾菜尾孢生長3-4周后結果作為真菌生長調節(jié)劑的薄閉殼素可抑制，終極腐霉，螺殼狀絲囊霉和菾菜尾孢。薄閉殼素對真菌的最小抑制濃度(mic)分別為240，480，1200和2400ppm。
實施例4薄閉殼素對顆粒狀(pelleted)甜菜種子的作用薄閉殼素對植物病原性真菌終極腐霉，茄屬絲核菌和螺殼狀絲囊霉的體外作用是通過篩選瓊脂平板上病原體的生長抑制而研究的(圖6，7，8)。
圖7表示不同濃度薄閉殼素對螺殼狀絲囊霉的篩選作用，而圖8和9分別表示對終極腐霉和茄屬絲核菌的篩選作用。在各種情況下，都是將薄閉殼素溶解在水中，放在周圍的孔中。將含有病原體的瓊脂塊放在中央。使病原體在PDA-瓊脂平板上生長3-5天。這些研究結果顯示，極低濃度的薄閉殼素能夠減少絲囊霉的生長。
使用其它微生物進行的類似試驗表明，薄閉殼素對尾孢沒有作用。對假單胞菌(熒光假單胞菌DS96.578，門多茜娜假單胞菌DS98.124)的影響較小，而對芽孢桿菌的生長沒有影響(短小芽孢桿菌DS96.734，巨大芽孢桿菌DS98.124)。
以這些發(fā)現(xiàn)為基礎，在田間試驗中進一步研究薄閉殼素的作用。該試驗的播種時間相對較晚，這樣病原體絲囊霉在試驗田中存在的機會更高。
材料和方法Pellet TKW1.Manhattan CAC-7-2306 kb5，3,0-4,25mm，19,2(7)19,1(1)2.Tower MIT-1-0290 kb5，3,0-4,25mm，17,3(8)17,8(2)使用具有(1，2)或沒有(7，8)Thiram的標準P1造粒使種子成顆粒狀。
標準種子涂覆內層涂覆0.3gai/U薄閉殼素，0.5％水溶液或14.7gai/U Hymexazol60gai/U Imidacloprid標準金屬綠的種子覆蓋薄膜試驗包括下列組合R FO 沒有殺真菌劑R FT Thiram(顆粒狀)R FH HymexazolR FM 薄閉殼素R P1 STD Thiram(顆粒狀)+HymexazolR FTM Thiram(顆粒狀)+薄閉殼素試驗位置 Bukkehave，DK.(4reps，200個種子/塊地)試驗播種 21.05.2002
1.Count28.05.2002(速度)2.Count29.05.2002(速度)3.Count24.06.2002(最終)結果實驗室和田間的數(shù)字在表2中給出(試驗性FEHCP034絲囊霉)。最終數(shù)字在圖6中表示。
表2
實驗室研究的結果表明，薄閉殼素可降低實驗室發(fā)芽的速度(4天)，但在4天＞15mm的圖中沒有反映。這與hymexazol的作用相反，其具有較低的4天＞15mm發(fā)芽。
有關發(fā)芽速度，田間試驗表明，單獨含有hymexazol，或者同時含有hymexazol及Thiram的顆粒發(fā)芽相對較慢(正如根據(jù)4天＞15mm的實驗室發(fā)芽預期的)。含有薄閉殼素的顆粒的發(fā)芽速度可與僅含Thiram的顆粒相比較。
與含有Thiram顆粒的快速發(fā)芽相反，含有薄閉殼素的顆粒顯示較高的最終發(fā)芽(可與含Hymexazol的顆粒相比較)。
雖然引起根腐爛的病原體的試劑攻擊十分有限，但FT-區(qū)中的(約)4％幼苗的缺失是由病原體對幼苗的攻擊所引起，所述病原體(大概絕大多數(shù)絲囊霉)可由Hymexazol控制。FT-區(qū)中的最終幼苗數(shù)低于FO(沒有殺真菌劑)區(qū)中的幼苗數(shù)。這可由Thiram的作用來解釋，其可控制其它微生物，但不能控制絲囊霉，由此使得絲囊霉很容易進入幼苗中。
含薄閉殼素的顆粒是限制快速發(fā)芽和較高的最終發(fā)芽的唯一顆粒。因此，據(jù)信薄閉殼素可成為昂貴的化學品hymexazol的替代品。
上面說明書中的提到的所有公開出版物都引入此處作為參考。在不背離本發(fā)明范圍和精神的前提下，本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種改進和變化對于本領域那些技術人員而言是顯而易見的。雖然已經(jīng)聯(lián)系具體優(yōu)選的實施方案對本發(fā)明進行了描述，但應當理解，本發(fā)明的保護范圍不應被限制在這種具體的實施方案。事實上，進行本發(fā)明的所述模式的各種改進對于分子生物學或相關領域的那些技術人員而言是顯而易見的，被認為包括在下列權利要求的范圍之內。
權利要求
1.一種含有選自下列至少一個氨基酸序列的分離多肽，或其變體、同系物或衍生物(i)KPHCEPEQPAALPLFQPQLVQGGRPDXYWVEAFPFRSDSSK或KPHXEPEQPAALPLFQPQLVV(Q)GGRPDXY；(ii)SDIQMFVNPYATTNNQSSXWTPVSLAKLDFPVAMHYADITK；(iii)VSWLENPGELR；(iv)DGVDCLWYDGAR；(v)PAGSPTGIVRAEWTRHVLDVFGXLXXK；(vi)HTGSIHQVVCADIDGDGEDEFLVAMMGADPPDFQRTGVWCYK；(vii)TEMEFLDVAGK；(viii)KLTLVVLPPFARLDVERNVSGVK；(ix)SMDELVAHNLFPAYVPDSVR；(x)NDATDGTPVLALLDLDGGPSPQAWNISHVPPGTDMYEIAHAK；(xi)TGSLVCARWPPVK；(xii)NQRVAGTHSPAAMGLTSRWAVTK；(xiii)GQITFRLPEAPDHGPLFLSVSAIRHQ；其中X是未知的氨基酸殘基。
2.根據(jù)權利要求1所述的多肽，其含有選自權利要求1的至少一個序列。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的多肽，其具有吡喃鄰酮醛糖脫水酶活性。
4.一種多肽，其可與針對純化的權利要求1-3任何一項所述的多肽產(chǎn)生的抗體進行免疫反應。
5.一種分離多核苷酸，它編碼權利要求1-4任何一項所述的多肽或其變體、同系物、片段或衍生物。
6.根據(jù)權利要求5所述的分離多核苷酸，其選自(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其互補序列的多核苷酸；(ii)含有能夠與SEQ ID NO.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列或其片段的多核苷酸；(iii)含有能夠與SEQ ID NO.1的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸；和(iv)含有由于SEQ ID NO.1多核苷酸的遺傳密碼簡并性而產(chǎn)生的多核苷酸序列的多核苷酸。
7.根據(jù)權利要求5，6或7任何一項所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可從黃孢原毛平革菌，卵形多孔菌或藍色伏革菌獲得。
8.根據(jù)權利要求5，6或7任何一項所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可從盤菌目，木耳目，多孔菌目，蘑菇目或Gracilariales獲得。
9.根據(jù)權利要求5，6或7任何一項所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可從橙黃網(wǎng)孢盤菌，疣孢褐盤菌，多汁盤菌，Sarcophaeraexinaia，尖頂羊肚菌，肋紋羊肚菌，彈絲羊肚菌，可食羊肚菌，圓形可食羊肚菌，M.hortensis，赭鹿花菌，腸膜狀木耳，Pulcherriciumcaeruleum，櫟隔孢伏革菌，Phanerochaete sordida，Vuilleminiacomedens，煙色紉革菌，血痕韌革菌，Lopharia spadicea，檸檬繡球菌，Boletopsis subsquamosa，黑刺煙管菌，Trichaptum biformis，Cerrenaunicolor，朱紅密孔菌，血紅密孔菌，Junghunia nitida，黃色枝瑚菌，微黃擬鎖瑚菌，微黃擬鎖瑚菌var.geoglossoides，絢麗擬鎖瑚菌，Clitocybe cyathiformis，C.dicolor，C.gibba，C.odora，Lepistacaespitosa，L inversa，L.luscina，L.nebularis，Mycena seynii，Pleurocybella porrigens，Marasmius oreales，Inocybe pyriodora，Gracilaria varrucosa，Gracilaria tenuistipitata，Gracilariopsis sp，或Gracilariopsis lemaneiformis獲得。
10.一種分離多核苷酸，其選自(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其互補序列的多核苷酸；(ii)含有能夠與SEQ ID NO.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列或其片段的多核苷酸；(iii)含有能夠與SEQ ID NO.1的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸；和(iv)含有由于SEQ ID NO.1多核苷酸的遺傳密碼簡并性而產(chǎn)生的多核苷酸序列的多核苷酸。
11.一種含有權利要求5-10任何一項所述的核苷酸序列的構建體。
12.一種含有權利要求5-10任何一項所述的核苷酸序列的載體。
13.一種含有權利要求5-10任何一項所述的多核苷酸序列的表達載體，所述多核苷酸序列與能夠指導所述多核苷酸在宿主細胞中表達的調節(jié)序列可操縱連接。
14.一種宿主細胞，其中已經(jīng)摻入權利要求5-10任何一項所述的核苷酸序列。
15.一種由SEQ ID NO.1的多核苷酸序列編碼的分離多肽，或其變體、同系物、片段或衍生物。
16.一種根據(jù)權利要求15所述的分離多肽，其從N-末端除去至多7個氨基酸。
17.一種根據(jù)權利要求15或16所述的分離多肽，它具有與SEQID NO.1編碼的多肽序列相比至少75％的同一性。
18.一種能夠結合權利要求1-4或15-17任何一項所述多肽的抗體。
19.一種制備權利要求1-4或15-17任何一項所述多肽的方法，其中所述方法包括表達權利要求5-10任何一項所述的核苷酸序列，并任選地分離和/或純化它們。
20.一種使用權利要求1-4或15-17任何一項所述多肽制備薄閉殼素的方法。
21.一種使用權利要求1-4或15-17任何一項所述多肽制備子囊吡喃酮P的方法。
22.根據(jù)權利要求20或21所述的方法，包括使所述多肽與1，5-脫水-D-果糖反應。
23.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中所述方法還包括在制備子囊吡喃酮P中使用APP合酶。
24.根據(jù)權利要求23所述的方法，包括使APP合酶及所述多肽與1，5-脫水-D-果糖反應。
25.根據(jù)權利要求20所述的方法，包括使所述多肽與葡聚糖裂合酶及淀粉糊精接觸。
26.一種使用權利要求1-4或15-17任何一項所述多肽制備藍草菌酮的方法。
27.根據(jù)權利要求26所述的方法，包括使所述多肽與葡糖醛酮反應。
28.根據(jù)權利要求26所述的方法，包括使所述多肽與葡萄糖及吡喃糖2-氧化酶反應。
29.一種制備薄閉殼素的方法，包括使吡喃鄰酮醛糖脫水酶與1，5-脫水-D-果糖反應。
30.一種制備薄閉殼素的方法，包括使吡喃鄰酮醛糖脫水酶與葡萄糖及淀粉糊精反應。
31.一種制備子囊吡喃酮P的方法，包括使吡喃鄰酮醛糖脫水酶及APP合酶與1，5-脫水-D-果糖反應。
32.一種制備藍草菌酮的方法，包括使吡喃鄰酮醛糖脫水酶與葡糖醛酮反應。
33.一種制備藍草菌酮的方法，包括使吡喃鄰酮醛糖脫水酶與葡萄糖及吡喃糖2-氧化酶反應。
34.薄閉殼素、藍草菌酮或其衍生物或異構體在防止和/或抑制病原體絲囊霉的生長，和/或殺死病原體絲囊霉中的應用。
35.根據(jù)權利要求34所述的應用，其中所述病原體是螺殼狀絲囊霉。
36.根據(jù)權利要求34或35所述的應用，其中所述薄閉殼素的衍生物是2-呋喃基-羥甲基-酮或4-脫氧-甘油-己-2，3-diluose。
37.根據(jù)權利要求34或35所述的應用，其中所述藍草菌酮的衍生物是2-呋喃基乙二醛。
38.根據(jù)權利要求34-37任何一項所述的應用，其用于處理植物或植物種子。
39.薄閉殼素、藍草菌酮或其衍生物或異構體作為植物或種子保護劑的應用。
40.根據(jù)權利要求34-39任何一項所述的應用，其用于處理甜菜種子。
41.一種具有基本上根據(jù)本文并參考實施例所述的吡喃鄰酮醛糖脫水酶活性的酶。
42.一種編碼酶的核苷酸序列，所述酶具有基本上根據(jù)本文并參照實施例所述的吡喃鄰酮醛糖脫水酶活性。
43.一種基本上根據(jù)本文并參照實施例所述的制備子囊吡喃酮P的方法。
44.一種基本上根據(jù)本文并參照實施例所述的制備薄閉殼素的方法。
45.一種基本上根據(jù)本文并參照實施例所述制備藍草菌酮的方法。
46.一種基本上根據(jù)本文并參照實施例所述防止和/或抑制病原體絲囊霉的生長，和/或殺死病原體絲囊霉的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了有關吡喃鄰酮醛糖脫水酶的序列信息。本發(fā)明還涉及吡喃鄰酮醛糖脫水酶在從AF向APP和薄閉殼素轉化及從葡糖醛酮向藍草菌酮轉化中的應用。
文檔編號C12P17/06GK1802433SQ02826518
公開日2006年7月12日 申請日期2002年10月30日 優(yōu)先權日2001年10月31日
發(fā)明者A·J·莫甘, 于書坤, I·維爾岡, H·C·彼得森 申請人:丹尼斯科有限公司