專利名稱：用于高半胱氨酸和胱硫醚的酶促循環(huán)測定的制作方法
相關(guān)專利申請本申請是2000年11月1日提交的美國專利申請序列號09/704,036的部分繼續(xù)申請，該專利申請要求1999年11月2日提交的臨時專利申請序列號60/163,126和2000年5月10日提交的序列號60/203,349的權(quán)利，前面各申請的內(nèi)容和講授納入本文供參考。
序列列表與本發(fā)明有關(guān)的含21種序列的序列列表以計(jì)算機(jī)可讀的ASCII文檔形式納入本文供參考并附加兩張(2)根據(jù)37CFR 1.821(c)的原始光盤、其根據(jù)37CFR 1.821(e)的相同拷貝以及一張(1)其根據(jù)37CFR 1.52(e)的相同拷貝。
發(fā)明的背景人血漿中高半胱氨酸的高水平與冠心病、中風(fēng)、動脈硬化和其它疾病的風(fēng)險增加相關(guān)。結(jié)果需要篩選此氨基酸量提高的一般群體。為使大規(guī)模測試高半胱氨酸可行，需要開發(fā)新和花費(fèi)更少的測定。
常規(guī)測量血漿高半胱氨酸是通過高壓液相層析(HPLC)和氣相層析/質(zhì)譜(GC/MS)，花費(fèi)超過100美金每測定，使這些物理分離方法對于廣泛群體研究花費(fèi)太高。例如，可制備尿或血液樣品用于氨基酸層析，通過HPLC分離和檢測來測量L-高半胱氨酸。Fiskerstrand等.(Clin.Chem.，39263-271(1993))描述了測定L-高半胱氨酸的方法，用熒光標(biāo)記血清硫醇，接著通過HPLC分離和檢測來自多種其它含硫化合物的高半胱氨酸衍生物。然而，這種方法通常費(fèi)時、昂貴且不易為許多實(shí)驗(yàn)室所采用。
也開發(fā)了間接免疫測定高半胱氨酸，然而這些抗體方法仍相對昂貴，約24美金每測試。一種特定間接免疫測定使高半胱氨酸酶促轉(zhuǎn)變成腺苷高半胱氨酸且腺苷高半胱氨酸的量通過競爭性ELISA(酶聯(lián)免疫測定)確定，使用抗腺苷高半胱氨酸抗體(例如參見美國專利5,827,645，其內(nèi)容納入本文供參考)。
已開發(fā)間接酶測定用于定量L-高半胱氨酸。例如，酶S-腺苷-高半胱氨酸水解酶和腺苷加入測試樣品。反應(yīng)混合物中所得腺苷濃度或濃度變化用作樣品中高半胱氨酸起始濃度的指示。
也報(bào)導(dǎo)了直接酶測定用于測量高半胱氨酸。通常，這些操作使高半胱氨酸不可逆地轉(zhuǎn)變成其它可定量的化合物。例如，酶高半胱氨酸脫水酶用于從高半胱氨酸中去除巰基。然后測量取出的巰基部分的濃度。此時和其它，酶用于高半胱氨酸測定的主要缺點(diǎn)是所用酶與其它含硫的高半胱氨酸相關(guān)氨基酸和化合物反應(yīng)，導(dǎo)致背景高且不一致以及血漿的高半胱氨酸測量不精確。
已報(bào)導(dǎo)酶促(或酶)循環(huán)測定用于很少量的分析物。在酶促循環(huán)測定中，使用兩種或多種酶活性，重復(fù)利用底物且不可逆地轉(zhuǎn)變測量的化合物。催化使用“化合物”以控制轉(zhuǎn)變成測定中定量化合物的速度。結(jié)果，感興趣的分析物保持穩(wěn)態(tài)濃度，濃度足夠低以產(chǎn)生準(zhǔn)一級(pseudo-first order)反應(yīng)速度。因此分析物穩(wěn)態(tài)濃度與總體測定的速度線性相關(guān)。通過測量反應(yīng)速度可容易地確定分析物的量。酶促循環(huán)測定有時稱為“擴(kuò)增”測定，因?yàn)榉椒ㄍǔＪ狗治鑫锏臏y量敏感性增加100到1000倍。測量中的擴(kuò)增是不減少化合物的穩(wěn)態(tài)濃度的直接結(jié)果。沒未報(bào)導(dǎo)酶促循環(huán)測定用于測量高半胱氨酸。
本發(fā)明提供花費(fèi)較少的酶促循環(huán)測定用于高半胱氨酸和/或胱硫醚，提供的樣品通量高于目前采用的診斷測定。此外，發(fā)明提供重組生產(chǎn)酶的方法和載體以及評估樣品中高半胱氨酸和胱硫醚的量的測試試劑盒，酶可用于生產(chǎn)測定試劑。
發(fā)明的概述本發(fā)明提供酶促循環(huán)測定用于評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。測定利用高半胱氨酸和L-絲氨酸反應(yīng)通過酶胱硫醚β-合酶(CBS)或其衍生物形成胱硫醚，通過胱硫醚β-裂合酶(CBL)使胱硫醚酶促轉(zhuǎn)變成高半胱氨酸、丙酮酸和氨。測定提供高半胱氨酸和/或胱硫醚的穩(wěn)態(tài)濃度，穩(wěn)態(tài)濃度與與總體反應(yīng)速度線性相關(guān)。樣品中確定的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量以形成的丙酮酸和/或氨的量或從反應(yīng)混合物中取出的絲氨酸的量為基礎(chǔ)。用本發(fā)明測定的能測試溶液可包括血液、血清、血漿、尿和其它生物樣品的實(shí)驗(yàn)室樣品。此外，可測試任何其它液體樣品。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚的量的方法，包括步驟
(a)含高半胱氨酸和/或胱硫醚溶液接觸(進(jìn)行二硫化物還原步驟前和/或后)CBS或其衍生物、L-絲氨酸和CBL或其衍生物以形成反應(yīng)混合物，接觸時間足以催化高半胱氨酸循環(huán)轉(zhuǎn)變成胱硫醚且胱硫醚再轉(zhuǎn)變成高半胱氨酸并產(chǎn)生丙酮酸和氨；(b)確定反應(yīng)混合物中存在的丙酮酸和/或氨的量；(c)在形成的丙酮酸和/或氨量的基礎(chǔ)上評估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。
更特別的是，方法通過加入便宜的氨基酸L-絲氨酸提供高半胱氨酸量的評估。反應(yīng)混合物中存在的丙酮酸量可以一些方法測量。在本發(fā)明的一個特定實(shí)施方案中，乳酸脫氫酶(LDH)或其衍生物和NADH(還原的煙酰胺輔因子)或其衍生物存在于反應(yīng)混合物中。NADH存在時，LDH使丙酮酸轉(zhuǎn)變成乳酸，NADH氧化成NAD+(氧化的煙酰胺輔因子)。
NADH氧化成NAD+可通過本領(lǐng)域一些已知的方法測量，包括在340nm監(jiān)控反應(yīng)混合物。也可通過氧化染料以產(chǎn)生可觀察的顏色變化來監(jiān)控NAD+的產(chǎn)生。優(yōu)選用于本發(fā)明的染料包括但不限于5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、2，6-二氯苯靛酚、四唑氮化合物、吩嗪硫酸甲酯、甲基紫精或任何這些染料的衍生物。溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量以觀察到的顏色強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比為基礎(chǔ)，標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建用于已知濃度分析物的樣品。
在另外的實(shí)施方案中，丙酮酸氧化酶和辣有過氧化物酶在過氧化氫和色原存在時用于檢測樣品中存在的丙酮酸量。N-乙基-N-2-羥基3-磺丙基)-m-甲苯胺鈉(TOOS)和其它N-乙基-N-(2-羥基3-磺丙基)-苯胺衍生物是此比色反應(yīng)的優(yōu)選色原。如上所述，樣品中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量以觀察到的顏色強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比為基礎(chǔ)，標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建用于已知濃度分析物的樣品。
溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量也可在反應(yīng)混合物中存在的氨量基礎(chǔ)上測量。確定溶液中氨濃度的方法有很多。在本發(fā)明的一個特定實(shí)施方案中，測量氨量使用普遍可用的標(biāo)準(zhǔn)氨傳感器。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及評估樣品中高半胱氨酸和/或胱硫醚量的方法，包括步驟溶液接觸還原劑，接觸時間足以還原大體上所有的高半胱氨酸且使溶液中存在的其它二硫化物還原成高半胱氨酸。還原劑處理也可用于釋放高半胱氨酸，高半胱氨酸經(jīng)二硫鍵附于溶液中存在的蛋白質(zhì)和/或其它分子。還原后，溶液然后接觸CBS或其衍生物、L-絲氨酸和CBL或其衍生物，接觸時間足以催化高半胱氨酸循環(huán)轉(zhuǎn)變成胱硫醚且胱硫醚轉(zhuǎn)變成高半胱氨酸并產(chǎn)生丙酮酸和氨。為評估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量，反應(yīng)混合物中存在的丙酮酸和/或氨量可如上確定。用于本發(fā)明的優(yōu)選還原劑包括氫硼化鹽和硫醇還原劑。適用于本實(shí)施方案的典型硫醇還原劑包括二硫赤蘚糖醇(DTE)、二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇(βME)、tris-(羧乙基)磷化氫鹽酸鹽(TCEP)或硫代乙酸或它們的衍生物等。
在另外一個評估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量的實(shí)施方案中，溶液可用胱硫醚γ-裂合酶(CGL)或其衍生物預(yù)處理足夠的時間以通過胱硫醚轉(zhuǎn)變成α酮戊二酸從反應(yīng)混合物中去除任何胱硫醚。胱硫醚去除后，胱硫醚γ-裂合酶從反應(yīng)混合物中去除或破壞。在一個典型的實(shí)施方案中，破壞胱硫醚γ-裂合酶通過加熱溶液足夠的時間以大體上去除其酶活性。胱硫醚γ-裂合酶也可在不溶底物或表面上固定，例如容易去除微?；蛑?。
在本發(fā)明另一個實(shí)施方案中，提供評估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量的方法，包括使溶液與L-絲氨酸和CBS或其衍生物及CBL或其衍生物反應(yīng)，CBL固定在固體表面上。固體表面可以是例如紙、濾紙、尼龍、玻璃、陶瓷、硅石、氧化鋁、硅藻土、纖維素、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯和它們的衍生物。固體表面可以是測試容器的側(cè)面和底部或可以是加入測試容器的物質(zhì)。在較佳實(shí)施方案中，固體表面包括加入測試容器的珠。
用于本發(fā)明的CBS或其衍生物、CBL或其衍生物、胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物可作為粗提物從細(xì)胞獲得。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，胱硫醚β-合酶(CBS)或其衍生物、胱硫醚β-裂合酶(CBL)和/或胱硫醚γ-裂合酶(CGL)純化自人、酵母或細(xì)菌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個特別較佳實(shí)施方案中，編碼酶的基因被分離或合成且在宿主細(xì)胞中表達(dá)為重組蛋白。特別優(yōu)選的是編碼親和標(biāo)記的DNA序列加入基因構(gòu)建物以協(xié)助純化和/或檢測重組產(chǎn)生的酶。重組方法也可用于提供融合蛋白，在單個蛋白質(zhì)中包括CBS和CBL的酶活性。也可包含親和標(biāo)記作為部分融合蛋白構(gòu)建物以協(xié)助純化融合蛋白。
本發(fā)明也提供評估樣品中高半胱氨酸量的方法，此測定形式與高半胱氨酸/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體的量相關(guān)，復(fù)合體結(jié)合共有多核苷酸結(jié)合序列。在特定實(shí)施方案中，方法包括使樣品接觸還原劑一段足夠時間以從任何相關(guān)蛋白質(zhì)中釋放高半胱氨酸；在有助于復(fù)合體形成的條件下還原高半胱氨酸接觸高半胱氨酸代謝物結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，樣品與共有多核苷酸序列混合，序列由高半胱氨酸/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體特異識別；從結(jié)合共有多核苷酸序列的高半胱氨酸/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體的量評估樣品中存在的高半胱氨酸量?？蓱?yīng)用于方法的還原劑包括二硫赤蘚糖醇(DTE)、二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇、tris-(羧乙基)磷化氫(TCEP)或硫代乙酸或各自的任何鹽等。高半胱氨酸代謝物結(jié)合/轉(zhuǎn)錄因子包括識別共有多核苷酸序列的大腸桿菌MetR，例如SEQ ID NO11所述多核苷酸序列(Marconi等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1751057-1063(1991))或其衍生物。
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案提供的測試試劑盒包括保持待評估溶液的容器以及提供有助于高酶活性條件所需的任何緩沖液、輔助物質(zhì)和溶劑，評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚、L-絲氨酸、CBS或其衍生物、CBL或其衍生物的量。測試試劑盒可進(jìn)一步包括乳酸脫氫酶或其衍生物和NADH或其衍生物。當(dāng)氧化可包括時，NADH可在340nm直接測量或用能提供顏色改變的染料。高半胱氨酸和/或胱硫醚的量與吸光度測量隨著時間的變化相關(guān)。
在一個較佳實(shí)施方案中，提供的酶固定于固體支持物。固體支持物可包括保持測試樣品的容器表面或可以是珠或其它加入容器的物品。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可提供胱硫醚γ-裂合酶作為部分試劑盒以在酶促循環(huán)測定前從測試溶液中去除任何胱硫醚。在加入高半胱氨酸酶促循環(huán)的剩余成分前，大體上所有的胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物活性必須從反應(yīng)混合物中去除或破壞。
發(fā)現(xiàn)發(fā)明的優(yōu)選測定可在相對短的時間段和用相對少量的酶完成，使測定有顯著的商業(yè)優(yōu)勢。例如，優(yōu)選測定涉及反應(yīng)混合物的產(chǎn)生，混合物包括含高半胱氨酸的樣品、絲氨酸、CBS、CBL、乳酸脫氫酶、NADH和還原劑如DTE、DTT，混合物中CBS/CBL比例從約1∶1到25∶1，更優(yōu)選從約1∶10，最優(yōu)選從約2∶1到5∶1。有利的是，已發(fā)現(xiàn)還原劑可與檢測系統(tǒng)(即乳酸脫氫酶和NADH)一起存在而沒有不利影響測定。因此，進(jìn)行發(fā)明的測定可沒有單獨(dú)的還原步驟，從而減少總測定次數(shù)。因而，當(dāng)許多樣品通過在容器(如分光光度樣品池)中連續(xù)產(chǎn)生反應(yīng)混合物測定時，混合物由樣品、絲氨酸、CBS、CBL、乳酸脫氫酶、NADH和還原劑組成，評估產(chǎn)生反應(yīng)混合物中存在的丙酮酸量是通過監(jiān)控NAD+隨著時間的產(chǎn)生，各自反應(yīng)-產(chǎn)生步驟間的時間間隔可以短至10-50秒，特定樣品的總反應(yīng)時間至約20分鐘。特定樣品的總反應(yīng)時間更優(yōu)選至約15分鐘，更加優(yōu)選至約13分鐘。較慢儀器的每小時總樣品數(shù)可以是約15-30個，但對于更快儀器高達(dá)200-400個。在此優(yōu)選測定中，制備的第一種反應(yīng)混合物包括樣品、絲氨酸、乳酸脫氫酶、NADH和還原劑，適當(dāng)溫育一段時間以釋放樣品中以結(jié)合、氧化和/或游離狀態(tài)存在的大部分(優(yōu)選所有)高半胱氨酸(總高半胱氨酸)。因此，加入CBS和CBL以完成反應(yīng)混合物并起始高半胱氨酸和/或胱硫醚的酶促循環(huán)。
在另一個較佳實(shí)施方案中，胱硫醚可用于產(chǎn)生酶測定的校準(zhǔn)物(因?yàn)槊复傺h(huán)測定使高半胱氨酸和胱硫醚互變)。換句話說，多種已知水平的胱硫醚可用于測定系統(tǒng)以“校準(zhǔn)”或“標(biāo)準(zhǔn)化”測定和/或可定量樣品結(jié)果的儀器。在此實(shí)施方案中，已知濃度的胱硫醚加入生物樣品，然后進(jìn)行用于一個其它實(shí)施方案的測定。結(jié)果用于確定校準(zhǔn)線，由于兩條線間的高度相關(guān)性，校準(zhǔn)線然后用于確立高半胱氨酸線。另外，已知水平的胱硫醚可用作質(zhì)量控制測量，以確保測定正常地工作。在此質(zhì)量控制實(shí)施方案中，這些“已知”水平的胱硫醚作為未知樣品被測定，結(jié)果與它們已知(預(yù)期)值比較以確保測定系統(tǒng)正常地發(fā)揮功能。
優(yōu)選測定是用分離(純化)CBL和CBS酶完成的，這些酶與選自SEQ ID Nos.19和20的酶有至少約80％(優(yōu)選至少約90％)的序列同一性。如本文所用，“序列同一性”如本領(lǐng)域已知，指兩種或多種蛋白質(zhì)或多肽序列或兩種或多種多核苷酸序列間的關(guān)系，即參考序列和與參考序列比較的特定序列。確定序列同一性通過在最佳排列序列以產(chǎn)生最高程度序列相似性后比較特定序列和參考序列，序列相似性由這些序列串間的配對確定。這樣排列時，序列同一性在位置-位置基礎(chǔ)上確定，例如如果核苷酸或氨基酸殘基在特定位置相同，序列在此位置“相同”。然后這種位置同一性的總數(shù)除以參考序列中的核苷酸或殘基總數(shù)以給出％序列同一性。序列同一性可通過已知方法計(jì)算，包括但不限于《計(jì)算分子生物學(xué)》(ComputationalMolecular Biology)，Lesk，A.N.，主編.，Oxford University Press，NewYork(1988)，《生物計(jì)算信息學(xué)和基因組計(jì)劃》(BiocomputingInformatics andGenome Projects)，Smith，D.W.，主編.，Academic Press，New York(1993)；《計(jì)算機(jī)分析序列數(shù)據(jù)》(Computer Analysis of Sequence Data)，第1部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，主編.，Humana Press，New Jersey(1994)；《分子生物學(xué)的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)，von Heinge，G.，Academic Press，New York(1987)；《序列分析引物》(Sequence AnalysisPrimer)，Griboskov，M.和Devereux，J.，主編.，M.Stockton Press NewYork(1991)；Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)，所講授的納入本文供參考。設(shè)計(jì)確定序列同一性的優(yōu)選方法以給出測試序列間的最大配對。確定序列同一性的方法編纂入可公開獲得的計(jì)算機(jī)程序，程序確定特定序列間的序列同一性。這種程序的例子包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，等.，Nucleic Acids Research，12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等.，J.Molec.Biol.，215403-410(1990)。BLASTX程序可公開獲得自NCBI和其它來源(BLAST手冊，Altschul，S.等.，NCVINLM NIH Bethesda，MD20894，Altschul，S.F.等.，J.Molec.Biol.，215403-410(1990)，所講授的納入本文供參考)。這些程序用默認(rèn)間隔重量最佳排列序列以便產(chǎn)生特定和參考序列間最高水平的序列同一性。例如，多核苷酸的核苷酸序列與參考核苷酸序列有至少95％的“序列同一性”，則特定多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同，除非特定多核苷酸序列可包括多達(dá)5個點(diǎn)突變每100個參考核苷酸序列的核苷酸。換句話說，核苷酸序列相對參考核苷酸序列有至少95％同一性的多核苷酸中，參考序列中多達(dá)5％的核苷酸可缺失或由另外核苷酸取代，或者參考序列中多達(dá)5％總核苷酸的一些核苷酸可插入?yún)⒖夹蛄小＿@些參考序列的突變可在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置或末端位置間任何地方發(fā)生，單獨(dú)散布在參考序列的核苷酸中或在參考序列的一個或多個毗連基團(tuán)中。類似地，具有特定氨基酸序列的多肽與參考氨基酸序列有至少例如95％的“序列同一性”，則多肽的特定氨基酸序列與參考序列相同，除非特定多肽序列可包括多達(dá)5個氨基酸改變每100個參考氨基酸序列的氨基酸。換句話說，為獲得與參考氨基酸序列有至少95％序列同一性的特定多肽序列，參考序列中多達(dá)5％的氨基酸殘基可缺失或由另外氨基酸取代，或者參考序列中多達(dá)5％總氨基酸殘基數(shù)的一些氨基酸可插入?yún)⒖夹蛄?。這些參考序列的改變可在參考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或這些末端位置間任何地方發(fā)生，單獨(dú)散布在參考序列的殘基中或在參考序列的一個或多個毗連基團(tuán)中。優(yōu)選的是，不相同的殘基位置由保守性氨基酸取代區(qū)別。然而，在確定序列同一性時，保守性取代不包括作為配對。
用于本發(fā)明的試劑包括CBS、CBL、L-絲氨酸、LDH、NADH、DTE、βME、DTT、TCEP、硫代乙酸和CGL。用于本發(fā)明的CBS酶濃度范圍從約0.1到約100KU/l。CBS濃度更優(yōu)選從約0.5到約75KU/l，更加優(yōu)選從約1到約50KU/l。CBS濃度最優(yōu)選從約1到約30KU/l。用于本發(fā)明的CBL酶濃度范圍從約0.01到約100KU/l。CBS濃度更優(yōu)選從約0.05到約50KU/l，更加優(yōu)選從約0.1到約30KU/l。CBS濃度最優(yōu)選從約0.1到約15KU/l。L-絲氨酸可以約1μM到約50mM的終濃度存在。L-絲氨酸更優(yōu)選以約10μM到約40mM的終濃度加入，更加優(yōu)選約100μM到約20mM的終濃度。加入的L-絲氨酸終濃度最優(yōu)選從約0.2mM到約10mM。當(dāng)用于任何實(shí)施方案時，LDH以約30到約5000U/L的終濃度存在于反應(yīng)混合物中。反應(yīng)混合物中存在的LDH終濃度更優(yōu)選從約30到約3000U/L，更加優(yōu)選從約50到約2500U/L。反應(yīng)混合物中存在的LDH終濃度最優(yōu)選從約100到約2000U/L。另外，當(dāng)NADH用于任何實(shí)施方案時，反應(yīng)混合物中存在的NADH量可在約0.1mM到約2mM間變化。反應(yīng)混合物中存在的NADH終濃度更優(yōu)選從約0.1mM到約1.5mM，更加優(yōu)選約0.1到約1mM間。反應(yīng)混合物中存在的NADH終濃度最優(yōu)選從約0.2到約0.8mM。當(dāng)DTE用于本發(fā)明時，它的終濃度范圍可從約0.01mM到約100mM。DTE濃度范圍更優(yōu)選從約0.01mM到約50mM，更加優(yōu)選從約0.1mM到約25mM。DTE終濃度范圍最優(yōu)選從約0.1mM到約10mM。類似地，當(dāng)DTT用于本發(fā)明時，它的終濃度范圍可從約0.01mM到約100mM。DTT濃度范圍更優(yōu)選從約0.01mM到約50mM，更加優(yōu)選從約0.1mM到約25mM。DTT終濃度范圍最優(yōu)選從約0.1mM到約10mM。最后，當(dāng)CGL用于本發(fā)明時，它的終濃度范圍可從約0.1KU/l到約100KU/l。CGL范圍更優(yōu)選從約0.5KU/l到約75KU/l，更加優(yōu)選從約1KU/l到約50KU/l。CGL終濃度范圍最優(yōu)選從約1KU/l到約30KU/l。
在一些較佳實(shí)施方案中，試劑1的緩沖液是pH8.4的250mM TRIS。然而，當(dāng)TRIS用作緩沖液時，pH范圍可從7.0-9.0。pH范圍更優(yōu)選從7.5-8.5，更加優(yōu)選從8.1-8.5。使用濃度增加的TRIS通過協(xié)助維持更恒定的pH來改進(jìn)測定一致性，因?yàn)樗歉鼭饪s的緩沖液。另外，CBS和CBL在此優(yōu)選pH范圍中顯然更具活性，尤其從約pH8.1-8.5。
本發(fā)明也提供用混濁樣品同樣工作很好的測定。通過加入脂肪酶和α-環(huán)糊精到R1來減少濁度問題。這些有助于降低濁度，這是通過甘油三酸酯被脂肪酶水解成甘油和游離脂肪酸以及通過α-環(huán)糊精與游離脂肪酸形成復(fù)合體。加入這兩種成分有助于在加入試劑3前澄清反應(yīng)混合物。用EDTA取代脂肪酶和α-環(huán)糊精提供另一種精確分析混濁樣品的方法。
本發(fā)明的另一個變化是測試不同體積的試劑的效果。這些變化對測定的精確性沒有顯著作用。
本發(fā)明也測試不同去污劑和其濃度的效果。例如，Genapol X-80可以約0.05-0.5％的濃度存在于試劑1。濃度更優(yōu)選在0.1-0.5％間，更加優(yōu)選在0.2-0.4％間。測試其中3個濃度(0.1％、0.3％和0.5％)，0.3％的濃度提供最精確的結(jié)果。Brij-35也在試劑1中變化濃度。Brij-35可用于本發(fā)明，在R1中的濃度約0.01-0.5％。此濃度范圍更優(yōu)選從約0.015到約0.1％，更加優(yōu)選從約0.020到約0.030％。測試的濃度(0.025％、0.05％、0.1％和0.5％)中，用0.025％濃度獲得最精確的一致的結(jié)果。
本發(fā)明也測試用Tris(2-羧乙基磷化氫)鹽酸鹽(TCEP)取代還原劑DTE，TCEP在純化水中穩(wěn)定一段延長的時間。這種取代使試劑空白反應(yīng)從約12-15mA/分鐘減少到約4-5mA/分鐘，使此測定的精確度更高。當(dāng)TCEP用于本發(fā)明時，它的濃度范圍可從約6-53mM。此濃度范圍更優(yōu)選從約10-45mM，更加優(yōu)選從約20-30mM。在此專利申請測試的濃度中，26.44mM提供最精確的測定結(jié)果。
含試劑3的混合物組成也變化。例如，Tris緩沖液被磷酸緩沖液取代且甘油加入緩沖液。磷酸鹽在約50mM到約500mM范圍的濃度，pH7.6有效。甘油濃度范圍從約0.5％到15.0％(v/v)。磷酸鹽和甘油用于提供酶更長的半衰期，這用TRIS緩沖液是不可能的。
本發(fā)明的一個優(yōu)點(diǎn)是它可使用任何一些儀器。例如，該測定適合在2種不同儀器Hitachi 911和Beckman CX5上測試。注意到用任一種機(jī)器獲得精確和一致的結(jié)果。另外，測定可僅用2種試劑進(jìn)行，通過在儀器要求基礎(chǔ)上將R1和R2成分以正確比例混合。
最后，本發(fā)明適用于單校準(zhǔn)點(diǎn)。重要的是，來自單校準(zhǔn)點(diǎn)的結(jié)果和多點(diǎn)校準(zhǔn)曲線一樣精確。
附圖的概述

圖1描述了吸光度相對時間圖，用丙酮酸水溶液(5-100μM)獲得，證明丙酮酸的定量。試劑成分描述于表1且儀器設(shè)置描述于表2。
圖2描述了吸光度值相對已知量丙酮酸(0-100μM)作圖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定時間是5分鐘；圖3描述了吸光度相對時間圖，用胱硫醚水溶液(0-100μM)獲得。測量胱硫醚是通過CBL將胱硫醚酶促轉(zhuǎn)變成高半胱氨酸、丙酮酸和氨。
圖4描述了胱硫醚測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，用胱硫醚水溶液(0-100μM)獲得。反應(yīng)時間是5或20分鐘；圖5描述了吸光度相對時間圖，證明CBS/CBL/丙酮酸氧化酶/過氧化物酶循環(huán)和信號系統(tǒng)。胱硫醚溶解于水以制備1和100μM間的濃度標(biāo)準(zhǔn)；圖6描述了吸光度相對時間圖，證明CBS/CBL/丙酮酸氧化酶/過氧化物酶循環(huán)和信號系統(tǒng)。高半胱氨酸溶解于水以制備0和100μM間的濃度標(biāo)準(zhǔn)；圖7描述了用高半胱氨酸水溶液(0-100μM)獲得的典型校準(zhǔn)曲線，使用CBS/CBL/PO/HRP循環(huán)和檢測系統(tǒng)；
圖8描述了用高半胱氨酸水溶液(0-100μM)獲得的典型吸光度相對時間圖，使用沒有二硫蘇糖醇的CBS/CBL/LDH系統(tǒng)；圖9描述了用高半胱氨酸水溶液(0-100μM)獲得的典型吸光度相對時間圖，使用有二硫蘇糖醇的CBS/CBL/LDH系統(tǒng)；圖10描述了有或沒有二硫蘇糖醇時高半胱氨酸濃度(0-100μM)相對吸光度的校準(zhǔn)圖。反應(yīng)時間是5分鐘；圖11描述了用CBS/CBL/LDH酶循環(huán)系統(tǒng)獲得的定量結(jié)果間的相互關(guān)系，系統(tǒng)用DTT作為還原劑測量人血漿樣品中的高半胱氨酸，與Abbott IMx高半胱氨酸方法所得定量結(jié)果相比較；圖12描述的相關(guān)圖闡明本發(fā)明測定(y)相對商業(yè)購買IMx測定(x)間的相互關(guān)系，如實(shí)施例7所述；圖13描述的相關(guān)圖闡明本發(fā)明測定(y)相對常規(guī)HPLC測定(x)間的相互關(guān)系，如實(shí)施例7所述；圖14描述的相關(guān)圖闡明IMx測定(x)和HPLC測定(y)間的相互關(guān)系，如實(shí)施例7所述；圖15描述了吸光度相對時間的圖，用于實(shí)施例9所述無DTT的丙酮酸測定。
圖16描述了吸光度相對時間的圖，用于實(shí)施例9所述含DTT的丙酮酸測定。
特定實(shí)施方案的描述本發(fā)明提供均相酶循環(huán)測定用于評估樣品中的高半胱氨酸量。酶循環(huán)維持高半胱氨酸的穩(wěn)態(tài)水平且進(jìn)一步增加測試高半胱氨的敏感性。此外，本發(fā)明提供基因和表達(dá)載體以重組產(chǎn)生用于本發(fā)明的酶。也提供測試試劑盒用于評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。
高半胱氨酸在細(xì)胞中作為中間氨基酸存在，在甲硫氨酸代謝成半胱氨酸時產(chǎn)生。一般，體內(nèi)產(chǎn)生的高半胱氨酸通過兩條途徑之一被迅速代謝(1)與絲氨酸縮合以形成胱硫醚或(2)轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸，正常情況下其在體內(nèi)的濃度(以及它的氧化形式高半胱氨酸)低。健康成人的平均血漿高半胱氨酸水平男性約為12μM，范圍從約8.6到約17.1μM，女性為10μM，范圍從約3.9到16.8μM(Vester等.，Eru.J.Clin.Chem.Biochem.，29549-554(1991)；Jacobsen等.，Clin.Chem.，40873-881(1994))。
近來，已確定生物樣品中高半胱氨酸水平的量在一些情況中具有臨床重要性。血液中高半胱氨酸量增加與動脈硬化癥的發(fā)展相關(guān)(Clarke等.，NewEng.J.Med.，3241149-1151(1991))。同樣，現(xiàn)在認(rèn)為中等高半胱氨酸血癥(homocysteinemia)是心血管病的危險因子。正常成人中發(fā)現(xiàn)的正常高半胱氨酸范圍的精確性很重要，因?yàn)橐汛_定的心臟病危險顯著增加，僅超過正常濃度30％會使相關(guān)危險因子增加3.4倍(Stampfer等.，JAMA 268877-881(1992))。
如本文所用，術(shù)語“評估”包括定量和定性確定測試溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。如本文所用，“溶液”或“測試溶液”指臨床或生物液體樣品或組織提取物，可包括例如血液、血液衍生物如血漿、或尿等。
酶CBS存在時，含高半胱氨酸的樣品與L-絲氨酸反應(yīng)以形成胱硫醚。胱硫醚然后可用第2種酶CBL轉(zhuǎn)變成高半胱氨酸、丙酮酸和氨。同時用這些合成代謝和分解代謝酶操作的結(jié)果是“無效循環(huán)”，其中(1)胱硫醚和高半胱氨酸連續(xù)互變，(2)絲氨酸被降解以及(3)產(chǎn)生丙酮酸和氨。
與高半胱氨酸相比，使用相對高濃度的絲氨酸提供有助于總反應(yīng)速度的條件，總反應(yīng)速度遵循準(zhǔn)一級動力學(xué)，直接取決于反應(yīng)中高半胱氨酸和胱硫醚的量。如果胱硫醚濃度與高半胱氨酸濃度相比低許多，總反應(yīng)速度會隨著高半胱氨酸量而線性變化。通過測量絲氨酸減少或者丙酮酸或氨的增加，未知溶液或樣品中高半胱氨酸的量可通過與對照反應(yīng)進(jìn)行相同酶反應(yīng)比較來確定，對照反應(yīng)包括已知濃度的高半胱氨酸。本發(fā)明的酶促循環(huán)方法提供擴(kuò)增過程，產(chǎn)生的最終產(chǎn)物量遠(yuǎn)大于測試溶液即血液中可能的高半胱氨酸量。因此，確定反應(yīng)產(chǎn)生的丙酮酸或氨量的測定不必須很敏感且可通過技術(shù)人員已知的現(xiàn)有方法測量。
丙酮酸通常通過酶轉(zhuǎn)變成乳酸來測量，用乳酸脫氫酶或其衍生物。此酶促轉(zhuǎn)變反應(yīng)需要輔因子NADH(還原的煙酰胺輔因子)或其衍生物，NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD+(氧化的煙酰胺輔因子)。通過測量340nm的吸光度可監(jiān)控反應(yīng)。如本文所用，關(guān)于輔因子的術(shù)語“衍生物”指鹽、溶劑化物和其它化學(xué)修飾形式，這些形式保持整體輔因子活性，但在水溶液中穩(wěn)定性擴(kuò)展。衍生物可包括但不限于NADH的乙酰衍生物，包括3-吡啶醛-NADH、3-乙酰吡啶-NADH、3-硫代煙酰胺-NADH等(參見例如美國專利5,801,006)。
其它確定NADH或其衍生物氧化的簡便測定包括例如熒光測量，如Passoneau等.，《酶促分析，實(shí)踐指南》(Enzymatic Analysis，A Practical Guide)，219-222頁(1993)所述(納入本文供參考)。在另一個實(shí)施方案中，NADH或其衍生物在乳酸脫氫酶存在時與丙酮酸反應(yīng)以形成NAD+，氧化時NAD+進(jìn)一步與能產(chǎn)生顏色變化的染料反應(yīng)，優(yōu)選在可見范圍。染料的顏色變化可用于確定NADH氧化成NAD+的總量，與酶促循環(huán)反應(yīng)形成的丙酮酸量相符合?？捎糜诒景l(fā)明的染料例子包括但不限于5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、2，6-二氯苯靛酚、四唑氮化合物、吩嗪硫酸甲酯、甲基紫精或各自的衍生物。
丙酮酸也可在用丙酮酸氧化酶或其衍生物的反應(yīng)中測量，存在過氧化物酶即辣奶過氧化物酶等。例如通過氧化縮合水溶性氫供體確定轉(zhuǎn)變成過氧化氫的丙酮酸量，此供體提供有色化合物用于光度測定過氧化物濃度。特別優(yōu)選的氫供體提供穩(wěn)定的顏色反應(yīng)產(chǎn)物，包括N-烷基-N-磺丙基苯胺衍生物的水溶性衍生物，即N-乙基-N-(2-羥基3-磺丙基)-m-甲苯胺(TOOS)的鈉鹽(Tamaoku等.，Chem.Pharm.Bull.302492-2497(1982))。H2O2的量也可電勢測量。這包括安培計(jì)和電位計(jì)測量。測定高半胱氨酸和/或胱硫醚的量由過氧化物量的相關(guān)性確定，過氧化物通過丙酮酸氧化酶在規(guī)定時間段從丙酮酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。
氨也可用不同方法測量，包括使用氨傳感器(Willems等.，Clih.Chem.342372(1988)。氨也可用已知比色技術(shù)檢測。例如，樣品中產(chǎn)生的氨能反應(yīng)形成有色產(chǎn)物，形成可分光光度檢測的產(chǎn)物。納入本文供參考的《酶促分析方法》(Methods ofEnzymatic Analysis)(Bergmeyer)11049-1056(1970)所述方法取決于次氯酸鹽存在時氨與苯酚在堿性條件反應(yīng)形成有色染料靛酚。硝普鈉可用作催化劑。也可使用修改的方法，例如使用多種衍生物。有色最終產(chǎn)物形成的量與氨濃度成正比，因而與高半胱氨酸成正比。其它方法可包括例如微擴(kuò)散分析(Seligson等.，J.Lab.Clin.Med.，.49962-974(1957)、陰離子交換技術(shù)(Forman，Clin.Chem.10497-508(1964)和多種酶方法(參見例如Mondzac等.，J.Lab.Clin.Med.，.66526-531(1979))。
評估高半胱氨酸和/或胱硫醚量的酶促循環(huán)方法減少其它先前測定法中的困難，其中背景化合物和背景反應(yīng)產(chǎn)生“噪音”。在本發(fā)明測定中，可加入大量廉價氨基酸如L-絲氨酸以使L-絲氨酸全轉(zhuǎn)變成丙酮酸和氨。在較佳實(shí)施方案中，可使用250μM或更高的絲氨酸濃度，隨后轉(zhuǎn)變成丙酮酸和氨。血漿通常含約100μM絲氨酸。此內(nèi)源絲氨酸的量對于本測定不重要，因?yàn)樵摐y定測量轉(zhuǎn)變的速度受高半胱氨酸量的限制而不是絲氨酸量的限制。不預(yù)期約0.1mM到10mM的L-絲氨酸濃度影響所示測定的敏感性或精確性。
此外，本發(fā)明酶促循環(huán)方法提供的L-絲氨酸轉(zhuǎn)化的速度取決于準(zhǔn)一級反應(yīng)中的高半胱氨酸濃度。正常血液丙酮酸水平通常在約0.4和2.5mg/100ml間(Lehniger，AL.《生化原理》(Principles of Biochemistry).1982.WorthingtonPublishers，Inc.707頁，納入本文供參考)，與約45-284μM相符合。此丙酮酸濃度可提供較小背景測量，但本測定測量隨著時間的變化并能方便調(diào)節(jié)用于溶液中起始水平的丙酮酸。另外，丙酮酸可在乳酸脫氫酶或其它酶溫育前去除。更重要的是，半胱氨酸和其它攜帶硫的化合物如血液不顯著有助于酶促循環(huán)反應(yīng)，因此被認(rèn)為是系統(tǒng)中不重要的嘈音。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可處理樣品以去除胱硫醚提高高半胱氨酸測量的精確性。作為一個特定例子，處理包括胱硫醚γ-裂合酶接觸溶液使胱硫醚轉(zhuǎn)變成α-酮戊二酸(不參與上述酶促循環(huán)的化合物)。進(jìn)行酶促循環(huán)測定以評估高半胱氨酸量前，胱硫醚γ-裂合酶必須從樣品中去除或破壞，即通過熱等。
發(fā)明的此特定實(shí)施方案也可用于評估胱硫醚的量，通過在進(jìn)行酶促循環(huán)測定前比較胱硫醚γ-裂合酶處理和未處理樣品中丙酮酸和/或氨的產(chǎn)生速度的差異。因此，本發(fā)明可用于確定未知樣品中胱硫醚的量，即使樣品包含高半胱氨酸。
在一些生物樣品如血液中，高半胱氨酸通常經(jīng)二硫鍵結(jié)合蛋白質(zhì)、硫醇和其它細(xì)胞成分。一般，處理樣品可用還原劑如硼氫化鈉或硼氫化鉀；硫醇如二硫赤蘚糖醇、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、巰基乙酸或谷胱甘肽；或者磷化氫或三烷基磷化氫如三丁基磷化氫和tris(2-羧乙基)磷化氫(TCEP)等，以釋放結(jié)合和二硫鍵連接的高半胱氨酸。先前測定法需要抗體用于檢測步驟，必須改變反應(yīng)混合物的氧化還原條件(大部分抗體用二硫鍵結(jié)合)。然而，本方法中不需要洗滌或改變氧化還原條件，因?yàn)樗肅BS和CBL在還原條件下具有活性。因此，本發(fā)明測定所需步驟少于許多現(xiàn)有技術(shù)的免疫測定。
在一個典型實(shí)施方案中，樣品包括血液、血液部分、血清、血漿或尿，用還原劑處理且直接測定高半胱氨酸。也優(yōu)選在測定前加熱樣品，用于加速釋放高半胱氨酸并使降解酶和其它可干擾測定的因子失活。用于高半胱氨酸測定的血液樣品的一般處理對于其它方法領(lǐng)域的技術(shù)人員已知，其它方法如HPLC測試。
CBS和CBL是自然界中常見的酶。人和酵母使用CBS合成甲硫氨酸；CBS的人cDNA可取代啤酒酵母中的CBS基因(Kruger等.，Hum.Molec.Genet.，41155-1161(1995))。CBL在許多細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，包括大腸桿菌(Laber等.，F(xiàn)EBS Lett.，37994-96(1996)。CBS和CBL基因的完整DNA序列在這些生物體和其它種類中已知，為給熟練的分子生物學(xué)家提供了易克隆或合成這些基因或其衍生物的來源。
如本文所用，關(guān)于酶的“衍生物”指通過氨基酸加入、缺失、取代和/或修飾產(chǎn)生的突變體；通過重組和/或DNA改組產(chǎn)生的突變體；鹽、溶劑化物和酶的其它化學(xué)修飾形式，修飾形式保持分離的天然酶的酶活性。通過DNA改組產(chǎn)生用于本發(fā)明的衍生酶的方法描述于美國專利5,605,793(納入本文供參考)。即使沒有克隆，兩種酶從一些不同生物體中純化。參見例如Ono等.，Yeast.，10333-339(1994)；Dwivedi等.，Biochemistry 213064-3069(1982)，納入本文供參考。在本發(fā)明的一個較佳實(shí)施方案中，提供遺傳修飾的生物體以產(chǎn)生CBS或其衍生物和產(chǎn)生CBL或其衍生物，它們可用于酶促循環(huán)測定以提供成本降低的試劑且純化酶更容易。
類似地，關(guān)于核苷酸序列的術(shù)語“衍生物”指通過核苷酸加入、缺失、取代和/或修飾和/或組合化學(xué)產(chǎn)生的變體和突變體；通過重組和/或DNA改組產(chǎn)生的突變體；鹽、溶劑化物和序列的其它化學(xué)修飾形式，修飾形式保持所需序列的活性如MetR的結(jié)合特性。當(dāng)使用修飾的衍生序列時，序列優(yōu)選與原始序列有至少約60％的序列同一性。此同一性更優(yōu)選為至少約70％，更加優(yōu)選為至少約85％。這些序列最優(yōu)選與原始序列有至少約95％的序列同一性。
CBS基因和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的完整基因組已被測序。同樣，CBL基因和大腸桿菌的剩余基因也已知。因此，使用分子生物領(lǐng)域的普通技術(shù)，編碼CBS和CBL的基因可在兩種生物體中克隆和表達(dá)。已知純化兩種酶的發(fā)表方法，使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法。然而各酶可構(gòu)建作為融合蛋白，包括例如協(xié)助活性酶溶解和/或重折疊的另一種蛋白質(zhì)部分或可加入?yún)f(xié)助純化的氨基酸序列。加入用于純化的氨基酸序列例子包括親和標(biāo)記如聚-His，或可加入谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)以在單個親和柱上更迅速純化蛋白質(zhì)。盡管酶不需要純化均勻用于本發(fā)明的診斷測試，蛋白酶和其它使絲氨酸轉(zhuǎn)變成丙酮酸的活性可通過純化降低到不重要水平。
此外，酶濃度一般在反應(yīng)期間和長期保存時產(chǎn)生穩(wěn)定性較高的酶活性。CBS和CBL來自除了釀酒酵母和大腸桿菌外的生物體，特別是嗜熱生物，預(yù)期是具更高穩(wěn)定性的酶來源。也可選擇與高半胱氨酸親和性較高的分離酶。另外，酵母CBS和細(xì)菌CBL的蛋白質(zhì)工程可產(chǎn)生商業(yè)性質(zhì)改進(jìn)的酶，包括較高親和性、較快反應(yīng)速度、較易純化和保存時較長的半衰期。
類似地，胱硫醚γ-裂合酶(CGL)在許多種類中詳細(xì)描述(參見例如Yamagata等.，J.Bacteriol.，1754800-4808(1993)，納入本文供參考)。操作編碼CGL的基因可通過標(biāo)準(zhǔn)重組方法進(jìn)一步遺傳修飾并插入宿主細(xì)胞以開發(fā)較高水平的生產(chǎn)菌株。
重組表達(dá)CBS、CBL和CGL基因是典型的。這些方法可提供大量純化酶且基因可被修飾，例如加入特定肽序列(親和標(biāo)記)以表達(dá)能用于親和純化的酶。通過在重組酶表達(dá)中使用親和標(biāo)記，可大大簡化這些酶的純化和固定，降低成本。親和標(biāo)記在本領(lǐng)域已知，包括但不限于如聚-組氨酸、GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)、p-標(biāo)記、“標(biāo)志”、c-myc序列等。標(biāo)記廣泛用于親和純化重組表達(dá)的蛋白質(zhì)，許多可商業(yè)購買。
在一個較佳實(shí)施方案中，CBS和CBL固定于固體表面，以維持酶活性和保持高半胱氨酸不直接與蛋白質(zhì)相互作用的方式。通過高密度固定酶，不同蛋白質(zhì)間的擴(kuò)散距離相對溶液中的酶減少。結(jié)果，測定的總反應(yīng)速度大大增加，因?yàn)橐环N酶的產(chǎn)物與另一種酶反應(yīng)且反之亦然。加速反應(yīng)速度是由于中間物濃度的局部提高，固定使中間物與下一個酶更接近。增加高半胱氨酸測定速度可以是診斷產(chǎn)品市場性的重要因素，因?yàn)镃BS和CBL的Km在毫摩爾范圍中，但高半胱氨酸的血液濃度約為10μM。已知擴(kuò)散-限制反應(yīng)需要高濃度的酶以提供快速的反應(yīng)速度。在循環(huán)測定中固定酶克服這兩種酶對它們各自底物低親和性可能產(chǎn)生的困難。
在另一個較佳實(shí)施方案中，CBS和CBL固定作為融合蛋白。兩種不同蛋白質(zhì)彼此的距離和方向可在融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建中控制。通過使兩種活性適當(dāng)位于融合蛋白中，高半胱氨酸和胱硫醚互變能在蛋白質(zhì)內(nèi)很迅速發(fā)生，因?yàn)閿U(kuò)散距離可在兩個活性中心間最小化。因此，高半胱氨酸在整體酶促循環(huán)反應(yīng)中表現(xiàn)像輔因子，從L-絲氨酸產(chǎn)生丙酮酸和氨。
本發(fā)明的酶促循環(huán)測定可以一些測定模式提供。最簡單的測定模式提供的試劑溶液包括L-絲氨酸、CBS或其衍生物、CBL或其衍生物、最優(yōu)化酶反應(yīng)所需的多種緩沖液和輔助物質(zhì)。在本發(fā)明的一個特別較佳實(shí)施方案中，CBS或其衍生物、CBL或其衍生物固定于固體表面。
酶固定于固體表面同時保持大體上所有酶活性在本領(lǐng)域熟知。用于固定的一些方法包括共價結(jié)合、物理吸收、截留和電化學(xué)沉積。作為一個例子，戊二醛用于固定肌酸酐脫氨酶和谷氨酸氧化酶到丙胺衍生控制的孔玻璃珠(Rui等.，Ann.NYAcad.Sci.，672264-271(1992))。其它例子包括但不限于用碳二亞胺使酶共價附于琥珀酸衍生玻璃珠(Rui等.，同上)、用異或同-雙功能交聯(lián)試劑(如SPDP、N-琥珀酰亞胺基3-(2-二硫代吡啶)丙酸鹽；SMPT、琥珀酰亞胺氧羰基-α-甲基-α-(2-二硫代吡啶)-甲苯；DSP、二硫雙(琥珀酰亞胺基丙酸鹽)(succinimidylpropionate)；DTSSP、3，3’-二硫雙(磺基-琥珀酰亞胺基丙酸鹽)；DSS、二琥珀酰亞胺基辛二酸酯等)使酶通過例如氨或巰基共價附于衍生固體表面(Wilson等.，Biosens.Bioe lectro.，11805-810(1996))。
如本文所用，“固體表面”可包括多孔或非多孔水不溶性物質(zhì)，能具有任何形狀如條、桿狀顆粒，包括珠等。合適材料在本領(lǐng)域熟知且可包括例如紙、濾紙、尼龍、玻璃、陶瓷、硅石、氧化鋁、硅藻土、纖維素、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯和它們各自的衍生物。固體表面可以是測試容器的側(cè)面和底部或可以是加入測試容器的物質(zhì)。在一個較佳實(shí)施方案中，固體表面包括加入測試容器的珠。
酵母和細(xì)菌都具有將L-絲氨酸轉(zhuǎn)變成丙酮酸的酶，活性有時稱為絲氨酸脫氨酶或絲氨酸脫水酶。很好確立的突變方法可用于大幅降低或除去這些活性，活性可顯著地產(chǎn)生高半胱氨酸測定中的背景。尤其是可遺傳操作釀酒酵母以去除絲氨酸脫氨酶活性，此活性對于(1)異亮氨酸合成和(2)以絲氨酸作為碳或氮源生長是必需的，使用稱為“基因破壞”的簡單方法。通過缺失酵母chal基因去除主要的絲氨酸脫氨酶活性，從而去除循環(huán)測定的一個潛在背景問題。此外，chal缺失可用于選擇CBS-CBL融合蛋白并用于遺傳改造這些融合蛋白。chal缺失菌株不能以絲氨酸作為唯一碳或氮源生長。CBS-CBL融合基因能互補(bǔ)缺失，只要有高半胱氨酸作為“輔因子”，因?yàn)檠h(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生的最終結(jié)果與絲氨酸脫氨酶相同。因此，chal缺失可用于選擇和維持改進(jìn)的CBS-CBL融合，特別是如果融合基因群被突變并置于單拷貝載體或酵母染色體上。在絲氨酸培養(yǎng)基上生長較快或高半胱氨酸需求減少的細(xì)胞可包含的突變編碼較快速酶或?qū)Ω甙腚装彼岷碗琢蛎延H和性較高的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也提供另外方法評估樣品中高半胱氨酸的量，使用代謝物結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)代謝物結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合它們各自的代謝物時，因子復(fù)合體結(jié)合特異受體多核苷酸序列?？杀O(jiān)控轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體結(jié)合其受體共有序列并與樣品中存在的代謝物量相關(guān)。
本領(lǐng)域已知的一些轉(zhuǎn)錄因子與小分子或代謝物相聯(lián)時，結(jié)合特異DNA結(jié)合位置。例如，大腸桿菌有操縱子調(diào)節(jié)元件，轉(zhuǎn)錄因子MetR調(diào)節(jié)響應(yīng)于結(jié)合高半胱氨酸的Met操縱子(Cai等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，16379-83(1989))。MetR或其衍生物調(diào)節(jié)基因如MetE(不依賴cobolamin的甲硫氨酸合酶)、MetH(依賴cobolamin的甲硫氨酸合酶)和GlyA(絲氨酸氫化酶)。MetR和其衍生物優(yōu)選在高半胱氨酸存在時結(jié)合其共有DNA序列且缺乏高半胱氨酸時不存在于細(xì)胞胞質(zhì)中。高半胱氨酸存在時結(jié)合MetR可用于評估懷疑含高半胱氨酸的樣品中高半胱氨酸的量。
在發(fā)明的一個特定實(shí)施方案中，測定包括多核苷酸序列編碼固定于固體支持物的MetR受體多核苷酸的共有序列，固定的方式能接近共有受體序列以結(jié)合MetR。
核苷酸可以是例如GTTAATGTTGAACAAATCTCATGTTGCGTG(SEQ ID NO11)處理樣品如血漿、血液或尿以在樣品混合試劑溶液前釋放任何結(jié)合蛋白質(zhì)的高半胱氨酸，溶液包括緩沖劑中的MetR，存在固定共有受體序列時，在有助于形成復(fù)合體的條件下。溫育階段后，洗滌固體支持物以去除未結(jié)合試劑且評估保持結(jié)合固體支持物的MetR量。確定保持結(jié)合固體表面的MetR量通?？梢允荅LISA、表面胞質(zhì)基因組共振即BIACORE或簡單的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測定，此量與樣品中存在的高半胱氨酸量相關(guān)。
處理樣品以釋放高半胱氨酸可用還原劑完成。上述一些試劑在本領(lǐng)域熟知。通常樣品混合含足夠量還原劑的緩沖溶液以從樣品中存在的任何相關(guān)蛋白質(zhì)中釋放大體上所有高半胱氨酸。普遍使用的還原劑包括但不限于硼氫化鈉和硼氫化鉀、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、巰基乙酸或谷胱甘肽；或者膦或三烷基膦，如三丁基膦和tris(2-羧乙基)膦(TCEP)等。
也可修飾MetR蛋白質(zhì)以摻合可檢測標(biāo)記，如生色團(tuán)、熒光團(tuán)等，以改進(jìn)測定的速度和敏感性。加入可檢測標(biāo)記能減少進(jìn)行測定所需時間段，這是通過去除一些樣品處理步驟，例如另外的洗滌步驟。摻合的熒光團(tuán)發(fā)出波長被寡核苷酸吸收到共有結(jié)合序列的光，能測量熒光能量轉(zhuǎn)移以定量蛋白與共有序列的結(jié)合?？捎糜跍y量熒光轉(zhuǎn)移的方法包括例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或鄰近閃爍測定。通過在結(jié)合結(jié)構(gòu)域中加入另外可檢測標(biāo)記對MetR結(jié)合共有序列另外修飾也可改進(jìn)測定的特異性。
此外，確定肽序列(親和標(biāo)記)可加入MetR蛋白質(zhì)以協(xié)助純化和檢測。親和標(biāo)記在本領(lǐng)域已知且包括但不限于例如聚-組氨酸、strep-標(biāo)記、“標(biāo)志”、c-myc序列等。標(biāo)記廣泛用于親和純化重組表達(dá)的蛋白質(zhì)，許多可商業(yè)購買。另外，改進(jìn)重組表達(dá)MetR的結(jié)合親和性的突變改變可用于提供其它的測定試劑。
在本發(fā)明的一個單獨(dú)實(shí)施方案中，樣品中高半胱氨酸的量可通過樣品中高半胱氨酸的酶利用來確定。細(xì)胞代謝中高半胱氨酸轉(zhuǎn)化通常從高半胱氨酸的巰基殘基中釋放質(zhì)子。釋放此質(zhì)子用于測量高半胱氨酸對大腸桿菌cobolamin依賴的甲硫氨酸合酶的結(jié)合親和性(Jerret等.，Biochemistry，3615739-15748(1997))。蛋白質(zhì)如甲硫氨酸合酶催化的酶反應(yīng)一般需要輔因子或另外的底物已完成反應(yīng)。如果這些輔因子和底物不存在，高半胱氨酸仍結(jié)合酶。在本方法中，測量釋放的質(zhì)子去除酶反應(yīng)釋放的質(zhì)子，推動反應(yīng)趨向消耗樣品中存在的高半胱氨酸。測量與釋放質(zhì)子相關(guān)的pH變化確定樣品中高半胱氨酸的量。例如在一個較佳實(shí)施方案中，不依賴cobolamin的甲硫氨酸合酶可用于測定。
為方便起見，本發(fā)明所用試劑可在用于測定方法的測試試劑盒中提供。典型試劑盒包括容納測試溶液的小型組合容器、L-絲氨酸、CBS或其衍生物、CBL或其衍生物、最佳反應(yīng)條件所需的輔助緩沖液和物質(zhì)。重要的是，多種防腐劑和/或穩(wěn)定劑也能包括在任何/所有試劑盒試劑和/或酶中以延長半衰期以及樣品測定的“聯(lián)機(jī)”壽命。試劑盒可進(jìn)一步包括還原劑或CGL以在循環(huán)測定前預(yù)處理樣品。此外，試劑盒可包括乳酸脫氫酶、NADH和氧化時能觀察到顏色改變的染料。
在合適情況下，試劑盒中一種或多種試劑可在溶液中提供(有或沒有防腐劑和/或穩(wěn)定劑)或作為干粉，通常凍干，包括賦形劑、防腐劑和/或穩(wěn)定劑，溶解時可提供具合適濃度的試劑溶液以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行測定。為提高發(fā)明的多功能性，試劑可在相同或不同容器中以小型組合提供，從而提供顯著最優(yōu)化方法和測定的試劑比例。試劑可各自在不同容器中或多種試劑能在一個或多個容器中結(jié)合，這取決于試劑的穩(wěn)定性。為方便起見，本發(fā)明測定方法所用試劑可以預(yù)定量提供。測試試劑盒也能包含書面說明，指導(dǎo)如何使用試劑和/或如何進(jìn)行特定測定，例如以包裝插入物形式。
提供以下例子用于闡述，而不用于限制。
實(shí)施例1大腸桿菌胱硫醚β-裂合酶基因的克隆和表達(dá)在此例子中，使用標(biāo)準(zhǔn)PCR過程克隆大腸桿菌CBL基因。分離基因插入具親和標(biāo)記序列(6HIS)的表達(dá)載體中，表達(dá)蛋白用親和柱純化。宿主細(xì)胞中大量CBL酶活性用表達(dá)載體構(gòu)建物轉(zhuǎn)化，從細(xì)胞裂解物中純化。
大腸桿菌胱硫醚β-裂合酶(CBL，EC 4.4.1.8)基因的克隆標(biāo)準(zhǔn)PCR過程使用擴(kuò)展高保真PCR系統(tǒng)(Roche Biochemicals)，用于擴(kuò)增大腸桿菌CBL基因，用ONE SHOT TOP10感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)作為基因組DNA來源。用于CBL克隆的PCR引物序列如下(CBL N-末端引物5’-CGACGGATCCGATGGCGGACAAAAAGCTTG-3’；SEQ ID NO1)和(CBL C-末端引物5’-CGCAGCAGCTGTTATACAATTCGCGCAAA-3’；SEQ ID NO2)。PCR擴(kuò)增的CBL基因產(chǎn)物然后通過瓊脂糖凝膠電泳純化，用BamHI和PvuII限制性內(nèi)切酶消化，再次通過瓊脂糖凝膠電泳純化。然后純化的大腸桿菌CBL基因連接入凝膠純化、BamHI/PvuII消化的pRSETB蛋白質(zhì)表達(dá)載體(Invitrogen)。所得構(gòu)建物提供T7轉(zhuǎn)錄啟動子控制下的CBL基因，與氨基末端6個組氨酸(6HIS)殘基前導(dǎo)序列(后稱為6HISCBL)框內(nèi)克隆，可方便表達(dá)、親和純化和免疫染色分析來自大腸桿菌細(xì)胞的重組6HISCBL蛋白。列出大腸桿菌胱硫醚β-裂合酶(CBL)基因的DNA序列(SEQ IDNO21)。也列出克隆的大腸桿菌胱硫醚β-裂合酶(CBL)蛋白質(zhì)序列(SEQ IDNO19)，它具有氨基-(NH3)-末端6個組氨酸(6HIS)親和標(biāo)記，由CBL基因克隆入pRSETB細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒產(chǎn)生。
胱硫醚β-裂合酶蛋白表達(dá)和純化pRSETB(6HISCBL)質(zhì)粒構(gòu)建物轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)pLysS大腸桿菌菌株(Invitrogen)，在LB/瓊脂平板上涂布，平板含(100μg/ml氨芐青霉素、35μg/ml氯霉素)，然后37℃培養(yǎng)過夜。然后轉(zhuǎn)移單細(xì)菌菌落并在含100ml LB生長培養(yǎng)基的燒瓶中生長過夜，培養(yǎng)基含氨芐青霉素和氯霉素。然后100ml過夜培養(yǎng)物加入多個含1L新鮮LB生長培養(yǎng)基的燒瓶，培養(yǎng)基含氨芐青霉素，使培養(yǎng)物生長直到A600為0.6(約2.5小時)。為誘導(dǎo)CBL蛋白表達(dá)(由T7啟動子驅(qū)動)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)然后加入生長培養(yǎng)基至0.1到1mM終濃度。CBL酶輔因子吡哆醛5’-磷酸(PLP)也在誘導(dǎo)中加入生長培養(yǎng)基至100μM終濃度。監(jiān)控細(xì)胞生長和6HISCBL蛋白表達(dá)5小時后，大腸桿菌細(xì)胞通過離心收集、重懸浮、在無EDTA的完整蛋白酶抑制劑(Roche Biochemicals)存在時加入BUGBUSTER蛋白質(zhì)提取試劑(Novagen Inc.)來裂解，如廠商規(guī)程所述。然后細(xì)胞裂解物用DNase I處理，通過離心澄清并上樣到親和柱，柱含聚-His蛋白質(zhì)純化樹脂(RocheBiochemicals)。然后柱用10床體積的平衡緩沖液(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl)洗滌，接著用5床體積的洗脫緩沖液1(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl、10mM咪唑；EB1)、5床體積的洗脫緩沖液2(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl、50mM咪唑；EB2)和5床體積的洗脫緩沖液3(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl、500mM咪唑；EB3)洗脫。然后純化過程各步驟中所取樣品通過變性蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)分析并用考馬斯亮藍(lán)染色或用綴合小鼠免疫球蛋白的單克隆抗聚組氨酸過氧化物酶進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析檢測，如廠商所述(Sigma)。
發(fā)現(xiàn)純化6HISCBL蛋白主要在洗脫緩沖液2和3(EB2和EB3)中洗脫。含CBL的洗脫物然后用離心過濾室(Amicon)濃縮且在4℃對貯存緩沖液(50mMTrisHCl，pH8、100mM NaCl、5mM PLP)透析過夜，等分并在-80℃冷凍保存。然后純化均一的CBL酶濃度在280nm消光系數(shù)和43，312 Da亞基重量的基礎(chǔ)上計(jì)算(Clausen等.Biochem.3612633-42(1997))。純化6HISCBL的典型產(chǎn)量在20-30mg6HISCBL每克大腸桿菌細(xì)胞團(tuán)范圍中。
CBL活性測定從pRSETB(6HISCBL)質(zhì)粒構(gòu)建物表達(dá)的親和純化重組6HisCBL蛋白的CBL活性如前所述進(jìn)行(Clausen等.Biochem.3612633-42(1997)，納入本文供參考)。簡單地，測定混合物在1mL的終反應(yīng)體積中含100mM Tris/HCl(pH8.5)、5mM L-胱硫醚、1mM 5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DNTB；Ellman試劑)和6HisCBL酶。反應(yīng)后記錄412nm吸光度隨著時間的增加。相同酶反應(yīng)也在具已知底物濃度的樣品上進(jìn)行以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。完整細(xì)胞裂解物中檢測到的大體上所有CBL活性被恢復(fù)并發(fā)現(xiàn)存在于重組6HisCBL酶的實(shí)驗(yàn)純化樣品中，酶產(chǎn)生自pRSETB(6HisCBL)質(zhì)粒構(gòu)建物。
實(shí)施例2酵母胱硫醚β-合酶(CBS)基因在酵母中的克隆和表達(dá)在此例子中，PCR方法用于從酵母中克隆CBS基因。含CBS基因的PCR片段插入有和沒有親和標(biāo)記的表達(dá)載體，標(biāo)記加入有助于表達(dá)基因產(chǎn)物的純化。
釀酒酵母的實(shí)驗(yàn)室菌株(5153-11-1(his3 met2))用作CBS基因來源。細(xì)胞在YEPD上32℃生長，離心，用水洗滌并轉(zhuǎn)移到200μl酵母質(zhì)粒緩沖液(100mM NaCl、10mM Tris(pH8)、1mM EDTA、0.2％SDS)中。細(xì)胞懸浮液與等體積的0.45mm玻璃珠混合并以高速渦旋3×30秒。液體通過移液管除去且在microfuge中離心2分鐘以去除細(xì)胞碎片。上清用PCI(酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和氯仿提取。加入氯化鈉(5M)(約20μl)，DNA用等體積異丙醇沉淀。
此基因組酵母DNA通過PCR用引物CI-001(CGGGGATCCTGATGCATGCATGATAAGGA；SEQ ID NO3)和CI-012(CGGCATTACCGTTTCACTAATTTATTG；SEQ ID NO4)擴(kuò)增，引物是發(fā)表的酵母CBS結(jié)構(gòu)基因側(cè)翼核苷酸序列。引物CI-001(SEQ ID NO3)包含在CBS基因的非翻譯3’側(cè)上發(fā)現(xiàn)的BamHI位點(diǎn)。為將BamHI序列加入PCR片段的5’側(cè)，基因進(jìn)一步通過PCR用CI-001(SEQ ID NO3)和CI-002(GTTGGATCCGGCATTA CCGTTTCAC；SEQ ID NO5)擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物是約1937個堿基對的DNA序列，包括1512個編碼CBS蛋白的堿基對。在編碼序列側(cè)翼的另外DNA包括酵母CBS基因的天然啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
一個強(qiáng)啟動子插入CBS基因上游以促進(jìn)蛋白質(zhì)高水平表達(dá)。酵母TPI1啟動子在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中從相同基因組酵母DNA克隆，使用引物CI-009(GGTGGATCCATCAATAGATACGTA CGTCCT；SEQ ID NO6)和CI-010(TTTTAGTTTATGTATGTGTTTTTTG；SEQ ID NO7)。為使CBS編碼區(qū)附于TPI1啟動子，使用銜接引物CI-011(AACACATACATAAACTAAAAATGACTAAATCTGAGCAGCAA；SEQ ID NO8)，它包含TPI1啟動子的20個堿基和CBS基因的前21個堿基。上面獲得的CBS序列通過PCR用引物CI-001(SEQ ID NO3)和CI-011(SEQ IDNO8)擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物與來自上面的TPI1啟動子產(chǎn)物混合，混合物通過PCR用引物CI-001(SEQ ID NO3)和CI-009(SEQ ID NO6)擴(kuò)增以產(chǎn)生命名為“TPICBS”的融合基因，基因包括TPI1啟動子、CBS編碼序列和CBS轉(zhuǎn)錄終止子。
CBS和TPICBS PCR產(chǎn)物各自在編碼區(qū)的5’和3’側(cè)包括BamHI位點(diǎn)。這些PCR產(chǎn)物用PCR WIZARD PREP(Promega)根據(jù)廠商建議純化，用BamHI切割。所得BamHI核苷酸片段在1％瓊脂糖TBE凝膠上跑并用NA45紙(S&S)純化。酵母、大腸桿菌穿梭載體C1-1在四環(huán)素抗性基因中具有獨(dú)特BamHI位點(diǎn)，用于表達(dá)CBS基因。C1-1載體用BamHI切割并根據(jù)廠商說明(Roche Biochemicals)用蝦堿性磷酸酶處理。CBS和TPICBS BamHI片段連接入線性化C1-1載體。連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化到TOP10細(xì)胞(Invitrogen)中，細(xì)胞在LB氨芐青霉素板上平板培養(yǎng)?？拱逼S青霉素的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到LB amp和LB tet平板以確定四環(huán)素敏感克隆。從LBamp平板選擇一些tet-敏感菌落，在LB amp平板上生長過夜，通過質(zhì)粒DNA的堿裂解法進(jìn)一步加工。DNA用BamHI切割并在1％瓊脂糖膠上分離以確定哪個質(zhì)粒含CBS或TPICBS插入物。
攜帶插入物的C1-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌株INVSc-1中，它是可從Invitrogen公司購買的二倍體菌株。INVSc-1在LEU2基因的2個拷貝中都有突變且需要來自C1-1質(zhì)粒的LEU2基因以在無亮氨酸的培養(yǎng)基上選擇性生長。INVSc-1用C1-1相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，根據(jù)廠商說明使用Invitrogen的酵母轉(zhuǎn)化試劑盒。此試劑盒包括用消解酶產(chǎn)生細(xì)胞的原生質(zhì)球，接著鈣處理用于DNA轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化子在合成培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)，培養(yǎng)基含1M山梨糖醇、酵母氮基礎(chǔ)組分和酵母補(bǔ)充物，除了亮氨酸。32℃培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)化子在覆蓋瓊脂中可見。
聚-組氨酸附于胱硫醚β-合酶用于酵母表達(dá)編碼6個組氨酸的DNA序列在CBS和TPICBS載體構(gòu)建物中加入CBS編碼區(qū)的3’末端。通過用引物CI-017(ATGATGATGATGATGATGACCTGCT AAGTAGCTCAGTAA；SEQ ID NO9)擴(kuò)增來自上面的CBS PCR片段，聚組氨酸的編碼序列加入原始CBS克隆。所得PCR產(chǎn)物包括天然CBS啟動子區(qū)、CBS編碼區(qū)以及進(jìn)一步的甘氨酸和6個組氨酸殘基編碼序列。加入甘氨酸殘基以增加翻譯后聚-his肽的空間靈活性。聚-his CBS PCR產(chǎn)物從原始CBS DNA膠純化，其后用引物CI-002(SEQ ID NO5)和CI-017(SEQ ID NO9)連續(xù)2次PCR擴(kuò)增以實(shí)際上去除原始CBS DNA。
類似地，來自上面的TPICBS PCR產(chǎn)物用引物CI-009(SEQ ID NO6)和CI-017(SEQ ID NO9)擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物是凝膠純化，并用CI-009(SEQ ID NO6)和CI-017(SEQ ID NO9)重?cái)U(kuò)增2次以大幅減少輸入TPICBS DNA序列。
CBS基因也通過PCR用引物CI-001(SEQ ID NO3)和CI-018(CATCATCATCATCATCATTAAATAAGAACCCACGCT；SEQ ID NO10)擴(kuò)增以產(chǎn)生具TAA終止密碼子的聚-組氨酸序列，接著是轉(zhuǎn)錄終止序列。此約190bp的短PCR產(chǎn)物(“終止子”)也是凝膠純化并通過PCR用相同引物克隆。聚-his CBS和“終止子”片斷結(jié)合在一個PCR反應(yīng)中，使用引物CI-001(SEQ ID NO3)和CI-002(SEQ ID NO5)。所得擴(kuò)增產(chǎn)生名為“CBSH”的核酸分子，包括天然CBS啟動子、完整CBS編碼區(qū)、一個另外的甘氨酸殘基、具終止密碼子的6個組氨酰殘基以及CBS轉(zhuǎn)錄終止子。
同樣，聚-his TPICBS和終止子片斷結(jié)合在一個PCR反應(yīng)中，使用引物CI-001(SEQ ID NO3)和CI-009(SEQ ID NO6)。所得名為“TPICBSH”的核酸產(chǎn)物與CBSH序列相同，除了TPI1啟動子取代天然CBS啟動子。CBSH和TPICBSH(各包含聚-組氨酸親和標(biāo)記序列)用BamHI切割并連接入C1-1，如以上適合于CBS和TPICBS序列。連接混合物轉(zhuǎn)化入INVSc-1。Tet-敏感菌落通過限制性酶分析檢測適當(dāng)?shù)目寺』虿迦隒1-1中。
實(shí)施例3酵母胱硫醚β-合酶(CBS)基因在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)和純化在此例子中，標(biāo)準(zhǔn)PCR和分子生物學(xué)技術(shù)用于克隆釀酒酵母(INVSc1)胱硫醚β-合酶(CBS)基因作為具氨基-末端谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。加入此谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶區(qū)域可從大腸桿菌培養(yǎng)基中單步親和純化CBS蛋白，也能協(xié)助活性形式酶的溶解和/或促進(jìn)適當(dāng)重折疊。
克隆釀酒酵母的實(shí)驗(yàn)室菌株(INVSc1)(Invitrogen)用作CBS基因來源。INVSc1酵母單菌落在100μl去離子水中煮沸5分鐘，在等體積0.45mm玻璃珠存在時迅速渦旋2分鐘。1微升此細(xì)胞裂解物然后用作酵母CBS基因的PCR擴(kuò)增的DNA來源，使用引物CI-024(GCGGGTCGACTATGACTAAATCTGAGCAGCAAGCC；SEQ IDNO12)和CI-025(GCGTGCGGCCGCGTTATGCTAAGTAGCTCAG；SEQ IDNO13)，引物包含發(fā)表CBS基因的側(cè)翼序列和克隆到pGEX-6P-2(AmershamPharmacia)表達(dá)載體的限制性位點(diǎn)。所得PCR產(chǎn)物(約1548bp)然后通過瓊脂糖凝膠分離和純化，DNA提取用商業(yè)試劑盒(Roche)。純化PCR產(chǎn)物所含CBS基因側(cè)翼有SalI(5’末端)和NotI(3’末端)限制性酶位點(diǎn)，然后被消化(通過SalI和NotI)、凝膠純化、連接入pGEX-6P-2表達(dá)載體(Amersham Pharmacia)。限制性酶圖譜用于確認(rèn)PCR擴(kuò)增的DNA作為酵母CBS基因的同一性。描述了克隆釀酒酵母胱硫醚β-合酶(CBS)基因的DNA序列(SEQ ID NO14)。也描述了克隆釀酒酵母CBS的蛋白質(zhì)序列(SEQ IDNO20)，此序列由于克隆到細(xì)菌表達(dá)載體pGEX-6P-2的結(jié)果附著具有氨基-(NH3)-GST融合蛋白。
表達(dá)和純化含克隆酵母CBS基因的pGEX6P-2表達(dá)載體(如上所述)轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)中。挑出單菌落且細(xì)胞培養(yǎng)物在含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中30EC生長直到600nm吸光度達(dá)到約0.5 OD。為誘導(dǎo)GST-CBS融合蛋白表達(dá)(由tac啟動子驅(qū)動)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入生長培養(yǎng)基至0.1mM終濃度。CBS酶輔因子吡哆醛5’-磷酸也在誘導(dǎo)中加入生長培養(yǎng)基至100μM終濃度。然后誘導(dǎo)細(xì)胞在30℃生長另外21小時，接著離心收集。
然后如廠商(Amersham Pharmacia)規(guī)程所述，用谷胱甘肽瓊脂糖4B親和樹脂親和純化GST-CBS蛋白。簡單地，細(xì)胞懸浮于磷酸緩沖鹽水(PBS)并在冰上由超聲波破壞。然后TritonX-100加至0.1％的終濃度(v/v)，超聲處理物在室溫?fù)u30-45分鐘。細(xì)胞裂解物然后通過離心清除不溶碎片，用DNase I處理，上樣到谷胱甘肽瓊脂糖4B親和樹脂柱。非特異結(jié)合的蛋白質(zhì)用10柱體積PBS洗去，然后所需GST-CBS蛋白從親和樹脂洗脫，洗脫是通過加入5柱體積的洗脫緩沖液(50mMTris，pH8、1.4mMβ-巰基乙醇(BME)、100mM NaCl、0.1％(v/v)TritonX-100、50mM還原型谷胱甘肽)。純化GST-CBS融合蛋白然后通過考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉，聚丙烯酰胺凝膠電泳)確認(rèn)。然后洗脫的GST-CBS透析到貯存緩沖液(50mM TrisHCl，pH8、100mM NaCl、5μM PLP)，等分并在-80℃冷凍保存。然后純化GST-CBS的濃度用MICRO BCA蛋白測定試劑盒(Pierce Chemical)確定。純化GST-CBS的典型產(chǎn)量在5-10mg GST-CBS每克大腸桿菌團(tuán)范圍中。
CBS活性測定純化酵母GST-CBS融合蛋白的CBS活性如Kashiwamata和Greenberg(Biomchem.Biophy.Acta 212488-500(1970))所述進(jìn)行。此測定以CBS從絲氨酸和高半胱氨酸合成胱硫醚的能力為基礎(chǔ)。然后分光光度確定CBS形成的胱硫醚量，通過檢測455nm的茚三酮反應(yīng)色原并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，標(biāo)準(zhǔn)曲線用已知胱硫醚濃度的樣品產(chǎn)生。CBS活性也通過下文所述酶測定或技術(shù)人員熟知的其它測定來確定。
實(shí)施例4ADH2CYS4融合構(gòu)建物的構(gòu)建酵母胱硫醚β-合酶在酵母中的表達(dá)和純化在此例子中，強(qiáng)啟動子ADH2插入CYS4基因上游且構(gòu)建與酵母CBS基因的融合以促進(jìn)較高蛋白質(zhì)表達(dá)。ADH2啟動子由Adrlp調(diào)節(jié)，當(dāng)酵母細(xì)胞在含葡萄糖的培養(yǎng)基中生長時被抑制，當(dāng)細(xì)胞在非發(fā)酵性碳源中生長時去抑制。如果超量產(chǎn)生蛋白質(zhì)對細(xì)胞致死，這可調(diào)節(jié)表達(dá)。
ADH2CYS4基因的構(gòu)建酵母基因組DNA用引物CI-029(CTATATCGTAATAATGACTAAATCTGAGCAGCAAGCCG ATTCA；SEQ ID NO15)和CI-017(ATGATGATGATGATGATGACCTCGTAAGTAGCTCAGTAA；SEQ ID NO9)擴(kuò)增以產(chǎn)生所有沒有終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止子的CYS4基因。除了CYS4基因的前10個密碼子，CI-029(SEQ ID NO15)引物包含克隆ADH2啟動子區(qū)域的至少13個堿基。引物CI-017(SEQ IDNO9)具有CYS4基因最后6個密碼子的序列，終止密碼子加甘氨酰殘基和6個組氨酰殘基除外。所得PCR產(chǎn)物包括CYS4編碼區(qū)以及的甘氨酸和6個組氨酸殘基的進(jìn)一步編碼序列。加入甘氨酸以增加翻譯后聚-his肽的空間靈活性。“終止子”片段通過擴(kuò)增相同基因組DNA產(chǎn)生，使用引物CI-018(CATCATCATCATCATCATAAAT000AAGAACCCACGCT；SEQ ID NO10)和CI-040(AGGGCTCGAGGATCCCGGGGGTGCTATTATGAATGCACGG；SEQ ID NO16)以產(chǎn)生具TAA終止密碼子的聚-組氨酸序列，接著是轉(zhuǎn)錄終止子。CI-029/CI-017 PCR反應(yīng)產(chǎn)生約1530bp的片段而CI-018/CI-040反應(yīng)產(chǎn)生約331bp的片段。通過混合它們的PCR產(chǎn)物并用引物CI-029/CI-040擴(kuò)增連接這兩個片段。所得產(chǎn)物命名為CYS4H且長度約1861bp。
為連接ADH2啟動子到CYS4H基因片段，首先用引物CI-027(CGGGGATCCGACGTTTTGCCCGCAGGCGGGAAACC，SEQ ID NO17)和引物CI-028(AGATTTAGTCATTATTACGATATAGTTAATAGTTGATAG；SEQ ID NO18)從相同酵母基因組DNA產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，用于產(chǎn)生ADH2啟動子序列。引物CI-028(SEQ ID NO18)包含CYS4基因編碼區(qū)的前12個核苷酸。因此，在引物CI-028(SEQ ID NO18)和CI-029(SEQ ID NO15)間有25個各自產(chǎn)物中互補(bǔ)DNA的核苷酸。ADH2 PCR產(chǎn)物與CYS4H片段混合并用引物CI-027(SEQ ID NO17)和CI-040(SEQ ID NO16)擴(kuò)增，用于產(chǎn)生約2201bp的產(chǎn)物片段命名為ADH2CYS4H。這些PCR產(chǎn)物各自通過限制性內(nèi)切酶分析確認(rèn)。
ADH2CYS4H產(chǎn)物克隆到Y(jié)Ep24，這是用BamHI切割DNA和用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(TOP10；Invitrogen)細(xì)胞并在LB-瓊脂加氨芐青霉素板上平板培養(yǎng)。質(zhì)粒根據(jù)廠商建議用質(zhì)粒制備試劑盒(Roche)從推定重組子中制備，通過限制性內(nèi)切酶分析。發(fā)現(xiàn)具有正確插入的克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母(BJ5460)且在補(bǔ)充2％葡萄糖的無尿嘧啶合成完全培養(yǎng)基(SC-ura)上平板培養(yǎng)。2天后推定重組子在相同類型平板上重劃線培養(yǎng)以分離菌落。通過在SC-ura加2％乙醇和1％蛋白胨中生長誘導(dǎo)細(xì)胞，通常補(bǔ)充0.1％葡萄糖以使細(xì)胞能在24小時內(nèi)生長。生長過夜后，細(xì)胞通過離心收集且細(xì)胞沉淀保存于-70℃直到裂解。通過細(xì)胞沉淀重懸浮于0.05體積的裂解緩沖液原始體積來裂解細(xì)胞。玻璃珠然后加入緩沖液的彎液面。
全部懸浮液渦旋1分鐘，各4次。渦旋之間，細(xì)胞在冰上冷卻1分鐘。裂解物轉(zhuǎn)移到新管并以10,000xg離心10分鐘。登清的裂解物在His-樹脂柱(Roche)上分層，根據(jù)廠商建議純化蛋白質(zhì)。部分純化的蛋白質(zhì)在3次洗脫中回收。
實(shí)施例5高半胱氨酶測定模式的非循環(huán)部分的例子在此例子中，證明丙酮酸和胱硫醚測定的非循環(huán)部分。
丙酮酸測定丙酮酸本發(fā)明提供高半胱氨酸測量，其基礎(chǔ)是用酶CBS和CBL使高半胱氨酸循環(huán)產(chǎn)生丙酮酸和氨。預(yù)測丙酮酸和氨產(chǎn)生的速度與樣品中原始高半胱氨酸濃度成正比。用適當(dāng)酶測量此速度提供均一高半胱氨酸方法的可能。
在發(fā)明的一方面，開發(fā)了丙酮酸定量的高度敏感方法。在此方法中，丙酮酸氧化酶使丙酮酸轉(zhuǎn)變成乙酰磷酸、二氧化碳和過氧化物。過氧化物酶隨后使過氧化物、TOOS和4-氨基安替比林轉(zhuǎn)變成顯示最大吸收接近550nm的色原。此色原的摩爾吸收率很高，約36L mol-1cm-1。
使用表1所示試劑和表2所列Cobas FARA(Roche，Basel，Switzerland)儀器參數(shù)，丙酮酸易通過早期-讀數(shù)空白和終點(diǎn)反應(yīng)在約5-10分鐘內(nèi)以μM范圍測量。含水校準(zhǔn)物的吸光度相對時間圖示于圖1。實(shí)際校準(zhǔn)曲線示于圖2。
胱硫醚測定通過CBL加入上述丙酮酸試劑來測量胱硫醚。CBL使胱硫醚轉(zhuǎn)變成高半胱氨酸、丙酮酸和氨。丙酮酸然后如上所述測量。用于測量胱硫醚的試劑組成示于表3。測量可用任何合適儀器進(jìn)行。在本例子中，使用Cobas FARA(Roche，Basel，Switzerland)。典型的反應(yīng)參數(shù)示于表4。圖3描述了吸光度相對時間圖，用胱硫醚水溶液獲得。反應(yīng)在少于10分鐘內(nèi)到達(dá)終點(diǎn)。

圖4描述了用胱硫醚的水溶液獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這些曲線至少在0-100μM的胱硫醚濃度范圍是線性的。形成的發(fā)色團(tuán)穩(wěn)定約15-20分鐘。然而，如果測定的樣品的所含胱硫醚濃度高10-20倍，發(fā)色團(tuán)明顯有些不穩(wěn)定。
在一些實(shí)驗(yàn)中，絲氨酸包括在反應(yīng)混合物中。250μM水平的絲氨酸沒有表現(xiàn)出顯著效果。；較高水平的絲氨酸也為本測定耐受。絲氨酸的非干擾性是一個重要的觀察，因?yàn)楦甙腚装彼釡y定需要絲氨酸存在。
實(shí)施例6高半胱氨酸的酶循環(huán)測定在此例子中，提供確定高半胱氨酸濃度的酶循環(huán)系統(tǒng)，使用丙酮酸氧化酶/過氧化物酶信號系統(tǒng)或乳酸脫氫酶信號系統(tǒng)。
循環(huán)的證明CBS/CBL/PO/HRP酶循環(huán)系統(tǒng)證明了循環(huán)系統(tǒng)，其中反應(yīng)用高半胱氨酸或胱硫醚起始。這些實(shí)驗(yàn)中所用的試劑成分示于表5。樣品與試劑1混合后，單獨(dú)加入CBS和絲氨酸，試劑1含所有其它成分。相關(guān)Cobas FARA參數(shù)示于表6。胱硫醚或高半胱氨酸溶于水以制備適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)。時間相對吸光度圖示于圖5和6。在3到6分鐘遲滯時間后，圖為線性。典型的高半胱氨酸校準(zhǔn)曲線(圖7)盡管不完全線性，可用于在合適樣品中定量高半胱氨酸濃度。使用合適曲線-配合技術(shù)。
二硫鍵還原高半胱氨酸很少以還原、非二硫鍵狀態(tài)存在于人血漿中。大部分高半胱氨酸經(jīng)二硫鍵偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或小分子。需要這些化合物的二硫化物還原以釋放高半胱氨酸用于通過任何確定總高半胱氨酸的方法測量。此例子證明使用還原劑與用乳酸脫氫酶和NADH的系統(tǒng)相容?？赡艿暮蜻x還原劑包括DTE、DTT、n-乙酰半胱氨酸、硫基乙酸、TCEP等。為在本發(fā)明方法中使用這些化合物，需要精確調(diào)節(jié)還原劑濃度和儀器參數(shù)。一些還原劑的早期指示會阻礙丙酮酸氧化酶或辣根過氧化物酶作用，導(dǎo)致研究下述另外的丙酮酸檢測系統(tǒng)。
循環(huán)的證明CBS/CBL/LDH系統(tǒng)丙酮酸在酶乳酸脫氫酶存在時與NADH反應(yīng)以產(chǎn)生乳酸和NAD。定量丙酮酸可通過測量在340nm的吸光度減少。NADH的摩爾吸收率比過氧化物酶產(chǎn)生的色原小約6倍。然而，這不影響本發(fā)明的系統(tǒng)，因?yàn)镃BL/CBS高半胱氨酸循環(huán)能產(chǎn)生相對大量的丙酮酸。
用于產(chǎn)生圖8、9、10&11所示數(shù)據(jù)的試劑系統(tǒng)包括HEPES緩沖液(pH7.2)中的絲氨酸、CBL和乳酸脫氫酶，作為第一種試劑。然后順次加入TRIS緩沖液(pH8.5)中的NADH和CBS。然而，所有成分可不同組合以形成2或3種試劑高半胱氨酸測量系統(tǒng)。試劑濃度示于表7且Cobas FARA參數(shù)示于表8。調(diào)節(jié)NADH濃度以提供足夠線性，同時血漿樣品在340nm吸收。
分析水溶液系統(tǒng)對于檢測水溶液中高半胱氨酸表現(xiàn)較好。典型的吸收相對時間圖示于圖8和9。這些圖是線性，明顯的延滯期少或沒有。NADH消失速度相對高。此外，高半胱氨酸濃度相對吸光度的校準(zhǔn)圖在0-100μM樣品濃度范圍為線性(圖10)。因此，校準(zhǔn)僅需要一個校準(zhǔn)物如25μM以及試劑空白。
高半胱氨酸溶液在不同濃度制備以證明方法在2-20μM高半胱氨酸濃度范圍的表現(xiàn)。DTT存在和缺乏時的結(jié)果示于表9。如上所述，DTT用于減少樣品(如血清、血漿等)中的二硫鍵。DTT不顯著干擾乳酸脫氫酶催化反應(yīng)。
分析以人血漿為基礎(chǔ)的對照產(chǎn)物本文證明了CBS/CBL/LDH循環(huán)系統(tǒng)的精確性能，使用Bio-Rad Co.生產(chǎn)的以人血漿為基礎(chǔ)的高半脫氨酸對照產(chǎn)物。使用不同濃度DTT，改變溫育時間以獲得最佳高半胱氨酸回收。用1.6-3.2mM濃度DTT溫育5-15分鐘時間產(chǎn)生的高半胱氨酸測量很好的在多種其它方法特定的范圍內(nèi)。
人血漿樣品高半胱氨酸循環(huán)測定證明用DTT作為還原劑的人血漿樣品性能良好。結(jié)果與獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室用Abbott IMx高半胱氨酸方法獲得的結(jié)果很一致(圖11)。此實(shí)驗(yàn)所用Cobas FARA參數(shù)示于表10且試劑成分示于表7。在此測定中，使用含水高半胱氨酸校準(zhǔn)物(25μM)。以水為基礎(chǔ)樣品的吸光度相對時間圖在DTT缺乏時為線性且在DTT存在時接近線性。然而，用血漿樣品獲得的圖不同，即前3分鐘后不是線性。在表7和表10概括的條件下，循環(huán)似乎隨著時間逐步減慢。然而，圖11所示相關(guān)性研究證明測試人血清樣品時，本方法(概括于表7和表10)與IMx所得的結(jié)果相對緊密一致。
在一個較佳實(shí)施方案中，速度在反應(yīng)起始后前3分鐘測量。系統(tǒng)的另外最優(yōu)化包括鹽和去污劑濃度變化，可能使含水和血漿樣品性能更一致。當(dāng)成分結(jié)合到2或3種試劑混合物中時，測定同樣精確。
實(shí)施例7高半胱氨酸測定的比較在此例子中，測試了根據(jù)發(fā)明的一個較佳實(shí)施方案并與兩個現(xiàn)有測定比較，即常規(guī)HPLC技術(shù)和商業(yè)購買的IMx測定。
發(fā)明的測定用表11所示3種試劑完成。第一種試劑R1開始以粉末形式且重建到1.5g粉末每100mL水的水平?？倻y定試劑盒也包括人血漿基質(zhì)中以不同水平猛增的校準(zhǔn)物以及加工人血漿基質(zhì)中組成的2個對照樣品，校準(zhǔn)物含L-胱硫醚。
進(jìn)行此測定時，使用商業(yè)購買的Cobas MIRA儀器。Cobas MIRA軟件能進(jìn)行50個可程序化、25秒的循環(huán)。尤其是儀器根據(jù)表12的參數(shù)編程。在循環(huán)1中，30μL樣品加入樣品池，接著加入25μL沖洗水和90μL液體試劑R1。在循環(huán)2開始時，加入25μL試劑SR1與另外的25μL沖洗水。隨后，混合物可溫育15個循環(huán)(6.25分鐘)以使還原劑釋放任何結(jié)合的高半胱氨酸并破壞任何內(nèi)源存在的丙酮酸。此時，加入35μL CBS/CBL酶試劑與另外的15μL沖洗水。循環(huán)18和32間隨著時間測量的340nm吸光度減小，作為樣品中高半胱氨酸的測量。樣品加入和最終吸光度讀數(shù)間的總測定時間是32個循環(huán)或13分鐘20秒。由于多個樣品平行運(yùn)行，另外的樣品結(jié)果通過MIRA以約每30-90秒1次的速度產(chǎn)生，這取決于運(yùn)行長度和所用儀器校準(zhǔn)物的數(shù)量。使用類似編程參數(shù)，此測定可適合甚至更快的儀器(如RocheINTEGRA，Hitachi，ACE等)，能產(chǎn)生甚至更高的通量速度。
總共24個樣品用發(fā)明測定和比較的已知測定來測試。下表13列出使用這三種方法得到的高半胱氨酸濃度。圖12-14是描述表13結(jié)果的各相關(guān)圖。如可見到的，發(fā)明方法與IMx和HPLC緊密相關(guān)，通常與IMx更一致。然而，本方法花費(fèi)低許多，運(yùn)行較快，可用一般商業(yè)購買的化學(xué)分析器進(jìn)行。
如表14所示，發(fā)明表現(xiàn)出非常好的運(yùn)行間精確性。通常高半胱氨酸濃度約為7-20μmol/L時，發(fā)現(xiàn)運(yùn)行內(nèi)濃度變化CV小于4％。
實(shí)施例8試劑濃度變化的效果在此例子中，實(shí)施例7中所述的發(fā)明優(yōu)選測定用改變一些試劑成分進(jìn)行，即LDH、NADH和絲氨酸。這是為了確定這些試劑成分的最佳量。測定如上所述進(jìn)行，各成分濃度有變化。表15列出這些測試的結(jié)果。
表15所示結(jié)果能選擇最終試劑成分水平，提供具最小空白速度的適當(dāng)敏感性，同時也嘗試將試劑成本減少到最低程度。
實(shí)施例9R1制劑變化對循環(huán)測定的效果此例子確定pH變化的效果，改變pH是通過將緩沖液變?yōu)閜H8.4的250mM TRIS并加入脂肪酶和α-環(huán)糊精到試劑1。進(jìn)行這些制劑變化后，然后測試該測定的性能。表16詳細(xì)描述了用于這些實(shí)驗(yàn)的試劑成分。
表16.CBS/CBL/LDH循環(huán)系統(tǒng)試劑成分
通過將試劑1的緩沖液變?yōu)閜H8.4的250mM TRIS，改進(jìn)測定一致性。這是因?yàn)镃BS和CBL在pH8.4明顯更活酰且循環(huán)速度增加到3倍。
加入脂肪酶和α-環(huán)糊精以對付有時在臨床實(shí)驗(yàn)室遇到的混濁(脂血癥)樣品相關(guān)問題。當(dāng)樣品取自的病人在取血樣前不久進(jìn)食過或病人患的某些疾病過程正在進(jìn)行中，可能產(chǎn)生這種樣品。混濁可干擾此測試結(jié)果，通過在340nm產(chǎn)生高吸光度從而儀器不能準(zhǔn)確測量NADH轉(zhuǎn)變成NAD所產(chǎn)生的吸光度小變化?；鞚嵋部蓮?qiáng)烈地干擾此測試結(jié)果，通過測量NADH到NAD轉(zhuǎn)化中隨著時間的改變。例如，如果混濁量減少，340nm的吸光度也降低，因?yàn)楣馍⑸湫?。此效果加大丙酮酸降低引起的吸光度減小，所得高半胱氨酸確定可能顯著太高。脂肪酶和α-環(huán)糊精加入R1降低樣品的混濁，大概通過脂肪酶水解甘油三酸酯為甘油和游離脂肪酸以及游離脂肪酸與α-環(huán)糊精形成復(fù)合體。因此，混濁反應(yīng)混合物在加入SR2(R3)時清除，加入SR2(R3)用于精確測量丙酮酸產(chǎn)生速度。許多混濁反應(yīng)混合物的340nm吸光度迅速減小且?guī)追昼妰?nèi)水平消失。高半胱氨酸結(jié)果精確。然而，一些混濁樣品在加入SR2(R3)前沒有完全清除，因而一些樣品的結(jié)果有點(diǎn)不精確。盡管如此，使用脂肪酶和α-環(huán)糊精似乎是混濁樣品獲得準(zhǔn)確結(jié)果的一種很有希望的方法。
除了試劑構(gòu)成的變化，體積也變化以評估它們對測定性能的效果。這些變化反映在表17中，它顯示Cobas MIRA的典型循環(huán)參數(shù)。這些變化后，對86個人樣品進(jìn)行相關(guān)性研究，結(jié)果示于表18。
實(shí)施例10使用其它去污劑和它們的濃度變化在此例子中，不同去污劑與EDTA組合使用作為R1成分。已知EDTA穩(wěn)定脂質(zhì)顆粒。此外，當(dāng)樣品混濁時目標(biāo)是獲得精確結(jié)果。尤其是研究去污劑Brij-35和Genapol X-80。發(fā)現(xiàn)EDTA在2.5mM濃度特別有效，在分析脂血癥的樣品時有助于使混濁變化引起的吸光度非特異減小到最低程度。去污劑濃度也如表19和20所示變化。試劑R1的一種優(yōu)選組成示于表21。Brij-35以0.025％v/v水平存在且EDTA以2.5mM存在。脂肪酶和α-環(huán)糊精不存在，因?yàn)镋DTA存在時獲得混濁樣品精確性似乎不需要它們。Brij-35(0.025％)也加入SR2(R3)，取代Triton X-100。這可能是一種有前途的取代，因?yàn)橐恍﹪艺J(rèn)為Triton X-100對環(huán)境有害。表22顯示用優(yōu)選試劑成分進(jìn)行的相關(guān)性研究的結(jié)果。
表19.改變的Genapol X-80濃度
表20.R1中改變的Brij-35濃度
表22.最佳改進(jìn)的相關(guān)性數(shù)據(jù)
當(dāng)Brij-35和EDTA取代Triton X-100和脂肪酶加α-環(huán)糊精時，清除一些混濁反應(yīng)混合物。然而，也許沒有同樣使用脂肪酶和α-環(huán)糊精的情況多。重要的是，340nm的吸光度用零變化速度迅速穩(wěn)定。然后加入SR2(R3)時，準(zhǔn)確測量丙酮酸產(chǎn)生的速度，甚至在樣品看上去像牛奶的情況中獲得精確結(jié)果。當(dāng)加入R1和SR2(R3)間的時間縮短2-4分鐘時也如此，這對于將本發(fā)明的高半胱氨酸測定應(yīng)用于其它自動儀器是必需的。
實(shí)施例11將還原劑變?yōu)門CEP和改變TCEP濃度的結(jié)果對于此例子，還原劑DTE用tris-(2-羧乙基磷化氫)鹽酸鹽(TCEP)取代。TCEP的優(yōu)點(diǎn)是在純化水中穩(wěn)定時間延長。TCEP取代DTE使試劑空白反應(yīng)從約12到15mA/分鐘減小到約4到5mA/分鐘。較低試劑空白能使高半胱氨酸測定更精確。為發(fā)現(xiàn)此高半胱氨酸測定的最佳TCEP濃度，測試了濃度范圍。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表23。
表23.R1中改變的TCEP濃度高半胱氨酸結(jié)果(μmol/L)
TCEP濃度A＝6.3mM；B＝13.85mM；C＝26.44mM；D＝32.74mM；E＝39.03mM；F＝52.88mM
實(shí)施例12確定將R3緩沖液變?yōu)榱姿猁}并加入甘油到緩沖液的效果為獲得穩(wěn)定性更長和與測定相容性的酶混合物，酶制劑變?yōu)榘胨テ陲@著長于前面制劑的混合物。重要的變化包括用磷酸鹽取代Tris緩沖液并加入甘油到緩沖液。使用濃度范圍從50mM到500mM的pH7.6磷酸鉀和濃度范圍從0.5％到15.0％(v/v)的甘油。這些變化使半衰期在4℃從幾周顯著增加到超過1年。在優(yōu)選形式中，磷酸鉀范圍可從約50mM到250mM。磷酸鉀范圍可更優(yōu)選從約75mM到150mM。此實(shí)驗(yàn)中特別有效的磷酸鉀濃度是100mM。甘油范圍可從約1-15％。此范圍更優(yōu)選從約5-13％。此實(shí)驗(yàn)中特別有效的甘油范圍是10％。
實(shí)施例13使用不同儀器獲得的結(jié)果為確定所有測定變化產(chǎn)生的總體改進(jìn)，通過特異于儀器的書面操作對一些儀器進(jìn)行精確評估。表24列出Roche Hitachi 911根據(jù)本發(fā)明所用參數(shù)和設(shè)置且表25列出用Beckman CX-5時的相同參數(shù)和設(shè)置。下表顯示這些精確測試的結(jié)果。這些結(jié)果顯著優(yōu)于測定早期制劑所得結(jié)果。在Hitachi 911(表26)和Beckman CX-5(表27)儀器中，所示各樣品運(yùn)行20X并確定運(yùn)行內(nèi)精確度。低達(dá)5.92μmol/L的樣品C.V.百分比為3.31％且范圍在23.01μmol/L到25.4μmol/L的樣品為1.9％到2.03％。7.3％和2.6％間的總精確度(表28)用高半胱氨酸值為4.6μmol/L和27.0μmol/L的樣品在Cobas MIRA Plus上獲得。各樣品重復(fù)2次運(yùn)行，2X每天，總共20天。
表24.Roche Hitachi 911的Catch高半胱氨酸方法參數(shù)
對于此實(shí)驗(yàn)，通過R1與去離子水以9到8.1的比例混合制備T1。試劑T2和T4分別與試劑SR1和SR2相符合。
表25.Beckman CX-5的Catch高半胱氨酸方法參數(shù)
對于此例子，通過R1與去離子水以9到8.1的比例混合制備A。試劑B和C分別與MIRA試劑SR1和SR2相符合。
表26.Hitachi 911的運(yùn)行內(nèi)精確度
表27.Beckman CX-5的的運(yùn)行內(nèi)精確度
表28.Roche MIRA-Plus的總精確度
實(shí)施例14測定對2-試劑系統(tǒng)的適應(yīng)性本發(fā)明也適用于僅使用2種試劑的系統(tǒng)。這使發(fā)明適應(yīng)范圍更廣的儀器，包括僅能使用2種試劑的儀器。表29顯示2-試劑系統(tǒng)的試劑成分且表30顯示測定如何在化學(xué)分析儀上進(jìn)行的MIRA-Plus參數(shù)。表31顯示用3-試劑系統(tǒng)相對2-試劑系統(tǒng)所獲得的比較數(shù)據(jù)。
表31.2-試劑系統(tǒng)相對3-試劑系統(tǒng)的比較
實(shí)施例15本發(fā)明對使用單點(diǎn)校準(zhǔn)的適應(yīng)性本發(fā)明的高半胱氨酸測定也適用于單校準(zhǔn)點(diǎn)，零校準(zhǔn)器作為空白。下表32顯示在Mira儀器上進(jìn)行單點(diǎn)校準(zhǔn)的參數(shù)。下面的數(shù)據(jù)(表33)顯示在斜率平均模式中使用單點(diǎn)校準(zhǔn)產(chǎn)生的結(jié)果與使用多點(diǎn)校準(zhǔn)曲線大體上相同。
表33.單點(diǎn)相對多點(diǎn)校準(zhǔn)
實(shí)施例16WO 00/28071所述高半胱氧酸測定的研究PCT出版物WO 00/28071詳細(xì)描述了兩種高半胱氨酸測定。在“第一個實(shí)施方案”中，測定是沒有還原步驟進(jìn)行的。為將此方法轉(zhuǎn)變成用于人血漿高半胱氨酸測量，必須結(jié)合單獨(dú)的脫機(jī)(off-line)或均勻還原步驟。出版物WO 00/28071描述了一個單獨(dú)的脫機(jī)還原步驟，也許是因?yàn)槭褂帽嵫趸秆h(huán)系統(tǒng)。此步驟需要分析還原樣品前的20分鐘溫育，這大幅增加總測定時間和勞動成本。此外，如果樣品要在臨床實(shí)驗(yàn)室中分析超過一個分析物，主要血清或血漿樣品必須分成兩等分，一個用于高半胱氨酸測試，一個用于任何其它有序?qū)嶒?yàn)室測試。相反，由于使用LDH循環(huán)系統(tǒng)(實(shí)施例7)，本發(fā)明能還原高半胱氨酸。
在實(shí)施例16(表34)中，顯示DTT確實(shí)干擾WO 00/28071的“第二個實(shí)施方案”所述丙酮酸氧化酶檢測系統(tǒng)。特別，使用“第二個實(shí)施方案”所述試劑和DTT組合物，有和沒有DTT的測定用Cobas FARA儀器相對已知丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(12.5、25和50μmol/L)進(jìn)行。在DTT測試情況中，40μL的各標(biāo)準(zhǔn)混合30μL DTT溶液，接著溫育100秒。然后，加入90μL丙酮酸氧化酶試劑并溫育30秒。然后在30、60、90、120、150、180和220秒取吸光度讀數(shù)。在“無DTT”測試中，進(jìn)行相同過程，除了沒有DTT加入。表34列出用210秒讀數(shù)的此實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖15和16進(jìn)一步闡述此測試結(jié)果。
表1
MEA＝單乙醇胺 ToSA＝對-甲苯磺酸NMEA＝N-甲基乙醇胺NDSA＝1，5-萘二磺酸DMSO＝二甲基亞砜EBSA＝4-乙苯基磺酸 DMAc＝二甲基乙酰胺DBSA＝十二烷基苯磺酸序列表<110>G.川崎(KAWASAKI，GLENN)H.K.韋伯(WEBB，HEATHER K.)J.歐文斯(OVENS，JEFFREY)R.里德克(LIEDTKE，RAYMOND)D.弗里斯特(FOREST，DOREEN)M.萊加茲(LEGAZ，MARK)G.羅森(LAWSON，SOBOMABO)<120>用于高半胱氨酸和胱硫醚的酶促循環(huán)測定<130>30865<150>60/163,126<151>1999-11-02<150>09/704,036<151>2000-11-01<150>60/203,349<151>2000-05-10<160>21<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<223>人工序列的描述PCR引物<400>1cgacggatcc gatggcggac aaaaagcttg 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<223>人工序列的描述PCR引物<400>2cgcagcagct gttatacaat tcgcgcaaa29<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<223>人工序列的描述PCR引物<400>3cggggatcct gatgcatgca tgataagga29<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<223>人工序列的描述PCR引物<400>4cggcattacc gtttcactaa tttattg 27<210>5
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<223>人工序列的描述PCR引物<400>5gttggatccg gcattaccgt ttcac25<210>6<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<220>
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<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<223>人工序列的描述PCR引物<400>7ttttagttta tgtatgtgtt ttttg25
<210>8<211>41<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<223>人工序列的描述PCR引物<400>8aacacataca taaactaaaa atgactaaat ctgagcagca a 41<210>9<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<223>人工序列的描述PCR引物<400>9atgatgatga tgatgatgac ctgctaagta gctcagtaa 39<210>10<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc feature<223>人工序列的描述PCR引物
<400>10catcatcatc atcatcatta aataagaacc cacgct36<210>11<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>共有MetR受體序列<220>
<221>misc_feature<223>人工序列的描述共有MetR受體序列<400>11gttaatgttg aacaaatctc atgttgcgtg 30<210>12<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc feature<223>人工序列的描述PCR引物<400>12gcgggtcgac tatgactaaa tctgagcagc aagcc 35<210>13<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>misc_feature<223>人工序列的描述PCR引物<400>13gcgtgcggcc gcgttatgct aagtagctca g 31<210>14<211>1524<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>14atgactaaat ctgagcagca agccgattca agacataacg ttatcgactt agttggtaac 60accccattga tcgcactgaa aaaattgcct aaggctttgg gtatcaaacc acaaatttat 120gctaagctgg aactatacaa tccaggtggt tccatcaaag acagaattgc caagtctatg 180gtggaagaag ctgaagcttc cggtagaatt catccttcca gatctactct gatcgaacct 240acttctggta acaccggtat cggtctagct ttaatcggcg ccatcaaagg ttacagaact 300atcatcacct tgccggaaaa aatgtctaac gagaaagttt ctgtcctaaa ggctctgggt 360gctgaaatca tcagaactcc aactgctgct gcctgggatt ctccagaatc acatattggt 420gttgctaaga agttggaaaa agagattcct ggtgctgtta tacttgacca atataacaat 480atgatgaacc cagaagctca ttactttggt actggtcgcg aaatccaaag acagctagaa 540gacttgaatt tatttgataa tctacgcgct gttgttgctg gtgctggtac tggtgggact 600attagcggta tttccaagta cttgaaagaa cagaatgata agatccaaat cgttggtgct 660gagggattcg gttcaatttt agcccaacct gaaaacttga ataagactga tatcactgac 720tacaaagttg agggtattgg ttatgatttt gttcctcagg ttttggacag aaaattaatt 780gatgtttggt ataagacaga cgacaagcct tctttcaaat acgccagaca attgatttct 840aacgaaggtg tcttggtggg tggttcttcc ggttctacct tcactgcggt tgtgaaatac 900tgtgaagacc accctgaact gactgaagat gatgtcattg ttgccatatt cccagattcc 960atcaggtcgt acctaaccaa attcgtcgat gacgaatggt tgaaaaagaa caatttgtgg 1020
gatgatgacg tgttggcccg ttttgactct tcaaagctgg aggcttcgac gacaaaatac 1080gctgatgtgt ttggtaacgc tactgtaaag gatcttcact tgaaaccggt tgtttccgtt 1140aaggaaaccg ctaaggtcac tgatgttatc aagatattaa aagacaatgg ctttgaccaa 1200ttgcctgtgt tgactgaaga cggcaagttg tctggtttag ttactctctc tgagcttcta 1260agaaaactat caatcaataa ttcaaacaac gacaacacta taaagggtaa atacttggac 1320ttcaagaaat taaacaattt caatgatgtt tcctcttaca acgaaaataa atccggtaag 1380aagaagttta ttaaattcga tgaaaactca aagctatctg acttgaatcg tttctttgaa 1440aaaaactcat ctgccgttat cactgatggc ttgaaaccaa tccatatcgt tactaagatg 1500gatttactga gctacttagc ataa 1524<210>15<211>43<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<220>
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<221>misc feature<223>人工序列的描述PCR引物<400>18agatttagtc attattacga tatagttaat agttgatag 39<210>19<211>428<212>PRT<213>大腸桿菌Escherichia coli)<400>19Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp20 25 30Pro Met Ala Asp Lys Lys Leu Asp Thr Gln Leu Val Asn Ala Gly Arg35 40 45Ser Lys Lys Tyr Thr Leu Gly Ala Val Asn Ser Val Ile Gln Arg Ala50 55 60Ser Ser Leu Val Phe Asp Ser Val Glu Ala Lys Lys His Ala Thr Arg65 70 7580Asn Arg Ala Asn Gly Glu Leu Phe Tyr Gly Arg Arg Gly Thr Leu Thr85 9095His Phe Ser Leu Gln Gln Ala Met Cys Glu Leu Glu Gly Gly Ala Gly100 105 110Cys Val Leu Phe Pro Cys Gly Ala Ala Ala Val Ala Asn Ser Ile Leu115 120 125Ala Phe Ile Glu Gln Gly Asp His Val Leu Met Thr Asn Thr Ala Tyr130 135 140Glu Pro Ser Gln Asp Phe Cys Ser Lys Ile Leu Ser Lys Leu Gly Val145 150 155 160Thr Thr Ser Trp Phe Asp Pro Leu Ile Gly Ala Asp Ile Val Lys His165 170175Leu Gln Pro Asn Thr Lys Ile Val Phe Leu Glu Ser Pro Gly Ser Ile180 185 190Thr Met Glu Val His Asp Val Pro Ala Ile Val Ala Ala Val Arg Ser
195 200 205Val Val Pro Asp Ala Ile Ile Met Ile Asp Asn Thr Trp Ala Ala Gly210215 220Val Leu Phe Lys Ala Leu Asp Phe Gly Ile Asp Val Ser Ile Gln Ala225 230 235 240Ala Thr Lys Tyr Leu Val Gly His Ser Asp Ala Met Ile Gly Thr Ala245 250255Val Cys Asn Ala Arg Cys Trp Glu Gln Leu Arg Glu Asn Ala Tyr Leu260 265 270Met Gly Gln Met Val Asp Ala Asp Thr Ala Tyr Ile Thr Ser Arg Gly275 280 285Leu Arg Thr Leu Gly Val Arg Leu Arg Gln His His Glu Ser Ser Leu290 295 300Lys Val Ala Glu Trp Leu Ala Glu His Pro Gln Val Ala Arg Val Asn305 310 315 320His Pro Ala Leu Pro Gly Ser Lys Gly His Glu Phe Trp Lys Arg Asp325 330 335Phe Thr Gly Ser Ser Gly Leu Phe Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Leu340345 350Asn Asn Glu Glu Leu Ala Asn Tyr Leu Asp Asn Phe Ser Leu Phe Ser355 360 365Met Ala Tyr Ser Trp Gly Gly Tyr Glu Ser Leu Ile Leu Ala Asn Gln370 375 380Pro Glu His Ile Ala Ala Ile Arg Pro Gln Gly Glu Ile Asp Phe Ser
385 390395 400Gly Thr Leu Ile Arg Leu His Ile Gly Leu Glu Asp Val Asp Asp Leu405 410415Ile Ala Asp Leu Asp Ala Gly Phe Ala Arg Ile Val420 425<210>20<211>1252<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>20Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 510 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 2530Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 707580Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu210 215 220Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Met Thr225 230 235240Lys Ser Glu Gln Gln Ala Asp Ser Arg His Asn Val Ile Asp Leu Val245 250 255Gly Asn Thr Pro Leu Ile Ala Leu Lys Lys Leu Pro Lys Ala Leu Gly260265 270Ile Lys Pro Gln Ile Tyr Ala Lys Leu Glu Leu Tyr Asn Pro Gly Gly275280 285Ser Ile Lys Asp Arg Ile Ala Lys Ser Met Val Glu Glu Ala Glu Ala290 295300Ser Gly Arg Ile His Pro Ser Arg Ser Thr Leu Ile Glu Pro Thr Ser305 310 315 320
Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Leu Ile Gly Ala Ile Lys Gly Tyr325330 335Arg Thr Ile Ile Thr Leu Pro Glu Lys Met Ser Asn Glu Lys Val Ser340 345 350Val Leu Lys Ala Leu Gly Ala Glu Ile Ile Arg Thr Pro Thr Ala Ala355 360 365Ala Trp Asp Ser Pro Glu Ser His Ile Gly Val Ala Lys Lys Leu Glu370 375 380Lys Glu Ile Pro Gly Ala Val Ile Leu Asp Gln Tyr Asn Asn Met Met385 390 395 400Asn Pro Glu Ala His Tyr Phe Gly Thr Gly Arg Glu Ile Gln Arg Gln405 410 415Leu Glu Asp Leu Asn Leu Phe Asp Asn Leu Arg Ala Val Val Ala Gly420 425 430Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ile Ser Gly Ile Ser Lys Tyr Leu Lys Glu435 440 445Gln Asn Asp Lys Ile Gln Ile Val Gly Ala Asp Pro Phe Gly Ser Ile450 455 460Leu Ala Gln Pro Glu Asn Leu Asn Lys Thr Asp Ile Thr Asp Tyr Lys465 470 475480Val Glu Gly Ile Gly Tyr Asp Phe Val Pro Gln Val Leu Asp Arg Lys485490 495Leu Ile Asp Val Trp Tyr Lys Thr Asp Asp Lys Pro Ser Phe Lys Tyr500 505 510
Ala Arg Gln Leu Ile Ser Asn Glu Gly Val Leu Val Gly Gly Ser Ser515 520 525Gly Ser Ala Phe Thr Ala Val Val Lys Tyr Cys Glu Asp His Pro Glu530 535 540Leu Thr Glu Asp Asp Val Ile Val Ala Ile Phe Pro Asp Ser Ile Arg545 550 555560Ser Tyr Leu Thr Lys Phe Val Asp Asp Glu Trp Leu Lys Lys Asn Asn565 570 575Leu Trp Asp Asp Asp Val Leu Ala Arg Phe Asp Ser Ser Lys Leu Glu580 585 590Ala Ser Thr Thr Lys Tyr Ala Asp Val Phe Gly Asn Ala Thr Val Lys595600 605Asp Leu His Leu Lys Pro Val Val Ser Val Lys Glu Thr Ala Lys Val610 615 620Thr Asp Val Ile Lys Ile Leu Lys Asp Asn Gly Phe Asp Gln Leu Pro625 630 635 640Val Leu Thr Glu Asp Gly Lys Leu Ser Gly Leu Val Thr Leu Ser Glu645 650 655Leu Leu Arg Lys Leu Ser Ile Asn Asn Ser Asn Asn Asp Asn Thr Ile660 665 670Lys Gly Lys Tyr Leu Asp Phe Lys Lys Leu Asn Asn Phe Asn Asp Val675 680 685Ser Ser Tyr Asn Glu Asn Lys Ser Gly Lys Lys Lys Phe Ile Lys Phe690 695 700
Asp Glu Asn Ser Lys Leu Ser Asp Leu Asn Arg Phe Phe Glu Lys Asn705 710 715 720Ser Ser Ala Val Ile Thr Asp Gly Leu Lys Pro Ile His Ile Val Thr725 730 735Lys Met Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Ala Met Thr Lys Ser Glu Gln Gln740 745 750Ala Asp Ser Arg His Asn Val Ile Asp Leu Val Gly Asn Thr Pro Leu755 760 765Ile Ala Leu Lys Lys Leu Pro Lys Ala Leu Gly Ile Lys Pro Gln Ile770 775 780Tyr Ala Lys Leu Glu Leu Tyr Asn Pro Gly Gly Ser Ile Lys Asp Arg785 790 795 800Ile Ala Lys Ser Met Val Glu Glu Ala Glu Ala Ser Gly Arg Ile His805 810 815Pro Ser Arg Ser Thr Leu Ile Glu Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile820 825830Gly Leu Ala Leu Ile Gly Ala Ile Lys Gly Tyr Arg Thr Ile Ile Thr835840 845Leu Pro Glu Lys Met Ser Asn Glu Lys Val Ser Val Leu Lys Ala Leu850 855 860Gly Ala Glu Ile Ile Arg Thr Pro Thr Ala Ala Ala Trp Asp Ser Pro865 870875 880Glu Ser His Ile Gly Val Ala Lys Lys Leu Glu Lys Glu Ile Pro Gly885890 895
Ala Val Ile Leu Asp Gln Tyr Asn Asn Met Met Asn Pro Glu Ala His900 905 910Tyr Phe Gly Thr Gly Arg Glu Ile Gln Arg Gln Leu Glu Asp Leu Asn915 920 925Leu Phe Asp Asn Leu Arg Ala Val Val Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly930 935 940Thr Ile Ser Gly Ile Ser Lys Tyr Leu Lys Glu Gln Asn Asp Lys Ile945 950955 960Gln Ile Val Gly Ala Asp Pro Phe Gly Ser Ile Leu Ala Gln Pro Glu965970 975Asn Leu Asn Lys Thr Asp Ile Thr Asp Tyr Lys Val Glu Gly Ile Gly980 985 990Tyr Asp Phe Val Pro Gln Val Leu Asp Arg Lys Leu Ile Asp Val Trp995 1000 1005Tyr Lys Thr Asp Asp Lys Pro Ser Phe Lys Tyr Ala Arg Gln Leu1010 1015 1020Ile Ser Asn Glu Gly Val Leu Val Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala10251030 1035Phe Thr Ala Val Val Lys Tyr Cys Glu Asp His Pro Glu Leu Thr10401045 1050Glu Asp Asp Val Ile Val Ala Ile Phe Pro Asp Ser Ile Arg Ser10551060 1065Tyr Leu Thr Lys Phe Val Asp Asp Glu Trp Leu Lys Lys Asn Asn10701075 1080
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<210>21<211>1188<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>21atggcggaca aaaagcttga tactcaactg gtgaatgcag gacgcagcaa aaaatacact 60ctcggcgcgg taaatagcgt gattcagcgc gcttcttcgc tggtctttga cagtgtagaa 120gccaaaaaac acgcgacacg taatcgcgcc aatggagagt tgttctatgg acggcgcgga 180acgttaaccc atttctcctt acaacaagcg atgtgtgaac tggaaggtgg cgcaggctgc 240gtgctatttc cctgcggggc ggcagcggtt gctaattcca ttcttgcttt tatcgaacag 300ggcgatcatg tgttgatgac caacaccgcc tatgaaccga gtcaggattt ctgtagcaaa 360atcctcagca aactgggcgt aacgacatca tggtttgatc cgctgattgg tgccgatatc 420gttaagcatc tgcagccaaa cactaaaatc gtgtttctgg aatcgccagg ctccatcacc 480atggaagtcc acgacgttcc ggcgattgtt gccgccgtac gcagtgtggt gccggatgcc 540atcattatga tcgacaacac ctgggcagcc ggtgtgctgt ttaaggcgct ggattttggc 600atcgatgttt ctattcaagc cgccaccaaa tatctggttg ggcattcaga tgcgatgatt 660ggcactgccg tgtgcaatgc ccgttgctgg gagcagctac gggaaaatgc ctatctgatg 720ggccagatgg tcgatgccga taccgcctat ataaccagcc gtggcctgcg cacattaggt 780gtgcgtttgc gtcaacatca tgaaagcagt ctgaaagtgg ctgaatggct ggcagaacat 840ccgcaagttg cgcgagttaa ccaccctgct ctgcctggca gtaaaggtca cgaattctgg 900aaacgagact ttacaggcag cagcgggcta ttttcctttg tgcttaagaa aaaactcaat 960aatgaagagc tggcgaacta tctggataac ttcagtttat tcagcatggc ctactcgtgg 1020ggcgggtatg aatcgttgat cctggcaaat caaccagaac atatcgccgc cattcgccca 1080caaggcgaga tcgattttag cgggaccttg attcgcctgc atattggtct ggaagatgtc 1140gacgatctga ttgccgatct ggacgccggt tttgcgcgaa ttgtataa 1188
權(quán)利要求
1.一種評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚量的酶促循環(huán)測定，其特征在于，所述測定包括(a)含高半胱氨酸和/或胱硫醚的溶液接觸胱硫醚β-合酶或其衍生物、L-絲氨酸和胱硫醚β-裂合酶或其衍生物以形成反應(yīng)混合物，接觸時間足以催化高半胱氨酸循環(huán)轉(zhuǎn)變成胱硫醚且胱硫醚再轉(zhuǎn)變成高半胱氨酸并產(chǎn)生丙酮酸和氨；(b)確定反應(yīng)混合物中存在的丙酮酸和/或氨的量；(c)在產(chǎn)生的丙酮酸和/或氨量的基礎(chǔ)上評估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，L-絲氨酸加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約1μM到約50mM。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述L-絲氨酸加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約10μM到約40mM。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，丙酮酸的量通過丙酮酸酶促轉(zhuǎn)變成乳酸來確定。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，丙酮酸轉(zhuǎn)變成乳酸是通過加入乳酸脫氫酶或其衍生物以及NADH或其衍生物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述乳酸脫氫酶加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約30U/l到約5000U/l。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述乳酸脫氫酶加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約30U/l到約3000U/l。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述NADH加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約0.1mM到約2mM。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述NADH加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約0.1mM到約1.5mM。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，NADH或其衍生物氧化成NAD+或其衍生物的總量是通過NAD+或其衍生物與氧化時能進(jìn)行顏色變化的染料反應(yīng)確定的。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述染料選自5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、2，6-二氯苯靛酚、四唑氮化合物、吩嗪硫酸甲酯、甲基紫精或各自的衍生物。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，丙酮酸的量是通過丙酮酸酶促轉(zhuǎn)變成過氧化氫確定的。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述酶是丙酮酸氧化酶。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，測定進(jìn)一步包括過氧化物酶和水溶性氫供體，供體提供氫時形成可分光光度檢測的穩(wěn)定有色產(chǎn)物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，水溶性氫供體是N-烷基-N-磺丙基苯胺的衍生物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，N-烷基-N-磺丙基苯胺是N-乙基-N-(2-羥基3-磺丙基)-m-甲苯胺的鈉鹽。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括用還原劑處理溶液的步驟，處理時間足以還原大體上所有任何高半胱氨酸且溶液中存在的含半高半胱氨酸的混合二硫化物還原成高半胱氨酸。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述處理步驟在步驟(a)-(c)前進(jìn)行。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述還原劑包括硼氫化鹽或硫醇還原劑。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述還原劑選自β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、TCEP或硫代乙酸或各自的衍生物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述二硫蘇糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述二硫赤蘚糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述硫代乙酸存在的量從約0.2mM到約3mM。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述β-巰基乙醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
25.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述TCEP存在的量從約6mM到約53mM。
26.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，確定氨量通過氨傳感器、微擴(kuò)散測定、比色測定或酶測定。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括用試劑處理溶液的步驟，試劑包括胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物，處理時間足以使溶液中存在的任何胱硫醚轉(zhuǎn)變成α-酮戊二酸。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述處理步驟步驟(a)-(c)前進(jìn)行。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括去除大體上所有胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物活性的步驟，它在所述處理步驟后并在步驟(a)-(c)進(jìn)行前。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述胱硫醚γ-裂合酶活性通過加熱去除。
31.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述胱硫醚β-合酶或其衍生物或胱硫醚β-裂合酶或其衍生物作為分離自真核細(xì)胞或原核細(xì)胞的提取物提供。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述真核細(xì)胞包括酵母細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述酵母細(xì)胞包括釀酒酵母。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述原核細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌細(xì)胞選自大腸桿菌、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)或鳥博德特氏菌(Bordetella avium)細(xì)胞。
36.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述胱硫醚β-合酶或其衍生物或胱硫醚β-裂合酶或其衍生物從所述提取物中充分分離。
37.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述胱硫醚β-合酶或其衍生物或胱硫醚β-裂合酶或其衍生物通過重組表達(dá)基因產(chǎn)生，基因編碼胱硫醚β-合酶或其衍生物或胱硫醚β-裂合酶或其衍生物。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述胱硫醚β-合酶或其衍生物和胱硫醚β-裂合酶或其衍生物作為融合蛋白產(chǎn)生。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白表達(dá)自重組產(chǎn)生的基因，基因包括胱硫醚β-合酶或其衍生物的編碼區(qū)，與含編碼胱硫醚β-裂合酶或其衍生物的基因區(qū)操作地相聯(lián)。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白固定在固體支持物上。
41.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述胱硫醚β-合酶加至約0.1KU/l到約100KU/l的終濃度。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述胱硫醚β-合酶加至約0.5KU/l到約75KU/l的終濃度。
43.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述胱硫醚β-裂合酶加至約0.01KU/l到約100KU/l的終濃度。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述胱硫醚β-裂合酶加至約0.05KU/l到約50KU/l的終濃度。
45.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物包括緩沖液。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述緩沖液可操作用于維持所述反應(yīng)混合物的pH在約7到約9間。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述緩沖液選自HEPES、TRIS和磷酸鹽。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述TRIS的pH約8.4。
49.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括加入甘油到所述緩沖液的步驟。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述緩沖液濃度從約0.5％到約15.0％v/v。
51.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括減少所述溶液濁度的步驟。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括使所述溶液接觸脂蛋白清除劑的步驟。
53.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述試劑包括脂肪酶和α-環(huán)糊精。
54.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述脂蛋白清除劑在所述反應(yīng)混合物中。
55.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物接觸去污劑。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述去污劑可操作用于減少所述溶液的濁度。
57.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述去污劑選自Triton X-100、Brij-35和Genapol X-80。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述去污劑是Genapol X-80。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述Genapol X-80存在的濃度從約0.05到約0.5％uμmol/L。
60.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述去污劑是Brij-35。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述Brij-35存在的濃度從約0.01到約0.5％μmol/L。
62.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物包括磷酸鹽。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述磷酸鹽存在的濃度范圍從約50mM到約500mM。
64.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物包括EDTA。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述EDTA存在的濃度從約0.5mM到約10mM。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述EDTA存在的濃度從約2mM到約3mM。
67.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物包括至少2種試劑組合物。
68.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液體積從約10μl到約40μl。
69.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述測定在臨床化學(xué)分析儀上進(jìn)行。
70.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述測定不需要脫離儀器步驟。
71.一種用于評估樣品溶液中高半胱氨酸量的測試試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括胱硫醚β-合酶或其衍生物、L-絲氨酸、胱硫醚β-裂合酶或其衍生物。
72.如權(quán)利要求71所述的測試試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括容納所述樣品的容器。
73.如權(quán)利要求71所述的測試試劑盒，其特征在于，所述胱硫醚β-合酶存在的終濃度從約0.1到約100KU/l。
74.如權(quán)利要求73所述的測試試劑盒，其特征在于，所述胱硫醚β-合酶存在的終濃度從約0.5到約75KU/l。
75.如權(quán)利要求71所述的測試試劑盒，其特征在于，所述L-絲氨酸存在的終濃度從約1μM到約50mM。
76.如權(quán)利要求75所述的測試試劑盒，其特征在于，所述L-絲氨酸存在的終濃度從約10μM到約40mM。
77.如權(quán)利要求71所述的測試試劑盒，其特征在于，所述胱硫醚β-裂合酶存在的終濃度從約0.01到約100KU/l。
78.如權(quán)利要求77所述的測試試劑盒，其特征在于，所述胱硫醚β-裂合酶存在的終濃度從約0.05到約50KU/l。
79.如權(quán)利要求71所述的測試試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括乳酸脫氫酶或其衍生物以及NADH或其衍生物。
80.如權(quán)利要求79所述的測試試劑盒，其特征在于，所述乳酸脫氫酶存在的終濃度從約30到約5000U/l。
81.如權(quán)利要求80所述的測試試劑盒，其特征在于，所述乳酸脫氫酶存在的終濃度從約30到約3000U/l。
82.如權(quán)利要求79所述的測試試劑盒，其特征在于，所述NADH存在的終濃度從約0.1mM到約2mM。
83.如權(quán)利要求82所述的測試試劑盒，其特征在于，所述NADH存在的終濃度從約0.1mM到約1.5mM。
84.如權(quán)利要求71所述的測試試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括氧化時能進(jìn)行顏色變化的染料。
85.如權(quán)利要求84所述的測試試劑盒，其特征在于，所述染料選自5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、2，6-二氯苯靛酚、四唑氮化合物、吩嗪硫酸甲酯、甲基紫精或各自的衍生物。
86.如權(quán)利要求71所述的測試試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括單獨(dú)的容器，所述單獨(dú)容器含還原劑。
87.如權(quán)利要求86所述的測試試劑盒，其特征在于，所述還原劑包括硼氫化鹽或硫醇還原劑。
88.如權(quán)利要求87所述的測試試劑盒，其特征在于，所述還原劑選自β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、TCEP或硫代乙酸或各自的任何鹽。
89.如權(quán)利要求88所述的測試試劑盒，其特征在于，所述二硫蘇糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
90.如權(quán)利要求89所述的測試試劑盒，其特征在于，所述二硫赤蘚糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
91.如權(quán)利要求88所述的測試試劑盒，其特征在于，所述硫代乙酸存在的量從約0.2mM到約3mM。
92.如權(quán)利要求88所述的測試試劑盒，其特征在于，所述β-巰基乙醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
93.如權(quán)利要求88所述的測試試劑盒，其特征在于，所述TCEP存在的量從約6mM到約53mM。
94.如權(quán)利要求71所述的測試試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物。
95.如權(quán)利要求72所述的測試試劑盒，其特征在于，所述胱硫醚β-合酶或其衍生物、胱硫醚β-裂合酶或其衍生物、胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物、乳酸脫氫酶或其衍生物固定在所述容器內(nèi)。
96.一種評估樣品中高半胱氨酸量的方法，其特征在于，所述方法包括(a)使樣品接觸還原劑，接觸時間足以從高半胱氨酸結(jié)合蛋白中釋放還原高半胱氨酸；(b)在有助于所述還原型高半胱氨酸和所述高半胱氨酸代謝物結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子間形成復(fù)合體的條件下，使所述還原型半胱氨酸接觸高半胱氨酸代謝物結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子；(c)所述樣品與共有多核苷酸序列或其衍生物混合，序列由所述高半胱氨酸/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體或其衍生物特異識別，以便使所述高半胱氨酸/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體結(jié)合所述共有多核苷酸序列；(d)確定由共有多核苷酸序列結(jié)合的高半胱氨酸/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體的量。(e)使所述樣品中存在的高半胱氨酸量與所述確定量相互關(guān)聯(lián)。
97.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，所述還原劑包括硼氫化鹽或硫醇還原劑。
98.如權(quán)利要求97所述的測試試劑盒，其特征在于，所述還原劑選自β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、TCEP或硫代乙酸或各自的任何鹽。
99.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，所述高半胱氨酸代謝物結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子包括MetR或其衍生物。
100.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，所述共有多核苷酸序列包括SEQID NO11的多核苷酸序列或其衍生物。
101.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，所述高半胱氨酸/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體的確定量通過熒光確定。
102.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，所述方法在適于檢測所述信號的分析儀上進(jìn)行。
103.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，所述方法用一種儀器進(jìn)行。
104.一種評估樣品中高半胱氨酸量的測定，其特征在于，所述測定包括步驟產(chǎn)生反應(yīng)混合物，包括所述樣品、絲氨酸、乳酸脫氫酶、NADH和能釋放樣品中蛋白質(zhì)-結(jié)合高半胱氨酸的還原劑、或它們各自的衍生物；溫育反應(yīng)混合物，溫育時間足以還原大部分所述蛋白質(zhì)-結(jié)合的高半胱氨酸；加入酶混合物，包括胱硫醚β-合酶和胱硫醚β-裂合酶或它們各自的衍生物，使高半胱氨酸循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)殡琢蛎亚译琢蛎言俎D(zhuǎn)變成高半胱氨酸，伴隨丙酮酸產(chǎn)生；和測量隨著時間產(chǎn)生的NAD+生成或NADH的消失，作為樣品中高半胱氨酸的測量。
105.如權(quán)利要求104所述的測定，其特征在于，所述L-絲氨酸加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約1μM到約50mM。
106.如權(quán)利要求105所述的測定，其特征在于，所述L-絲氨酸加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約10μM到約40mM。
107.如權(quán)利要求104所述的測定，其特征在于，所述乳酸脫氫酶加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約30U/l到約5000U/l。
108.如權(quán)利要求104所述的測定，其特征在于，所述乳酸脫氫酶加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約30U/l到約3000U/l。
109.如權(quán)利要求104所述的測定，其特征在于，所述NADH加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約0.1mM到約2mM。
110.如權(quán)利要求109所述的測定，其特征在于，所述NADH加入反應(yīng)混合物至終濃度至少約0.1mM到約1.5mM。
111.如權(quán)利要求104所述的測定，其特征在于，所述胱硫醚β-合酶存在的終濃度從約0.1到約100KU/l。
112.如權(quán)利要求111所述的測定，其特征在于，所述胱硫醚β-合酶存在的終濃度從約0.5到約75KU/l。
113.如權(quán)利要求104所述的測定，其特征在于，所述胱硫醚β-裂合酶存在的終濃度從約0.01到約100KU/l。
114.如權(quán)利要113所述的測定，其特征在于，所述胱硫醚β-裂合酶存在的終濃度從約0.05到約50KU/l。
115.如權(quán)利要求104所述的測定，其特征在于，所述測定在多達(dá)15分鐘的時間段中完成。
116.如權(quán)利要求115所述的測定，其特征在于，所述測定在約5-12分鐘的時間段中完成。
117.如權(quán)利要求104所述的測定，其特征在于，所述還原劑選自二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、TCEP和其組合。
118.如權(quán)利要求117所述的測定，其特征在于，所述二硫蘇糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
119.如權(quán)利要求118所述的測定，其特征在于，所述二硫赤蘚糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
120.如權(quán)利要求104所述的測定，其特征在于，所述測定在臨床化學(xué)分析儀上進(jìn)行。
121.如權(quán)利要求104所述的測定，其特征在于，所述測定在單個儀器上進(jìn)行。
122.一種評估樣品中高半胱氨酸量的測定，其特征在于，所述測定包括步驟產(chǎn)生反應(yīng)混合物，包括所述樣品、絲氨酸、胱硫醚β-合酶和胱硫醚β-裂合酶或它們各自的衍生物，使高半胱氨酸循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)殡琢蛎亚译琢蛎言俎D(zhuǎn)變成高半胱氨酸，伴隨丙酮酸產(chǎn)生，胱硫醚β-合酶與胱硫醚β-裂合酶的比例范圍從約1∶1到25∶1；和評估所述反應(yīng)混合物中存在的丙酮酸量，通過加入乳酸脫氫酶和NADH到所述反應(yīng)混合物并監(jiān)控所述反應(yīng)混合物中隨著時間產(chǎn)生的NAD+或NADH的消失。
123.如權(quán)利要求122所述的測定，其特征在于，所述測定包括在所述乳酸脫氫酶和NADH存在時加入還原劑到反應(yīng)混合物的步驟，以減少樣品中至少部分蛋白質(zhì)-結(jié)合的高半胱氨酸。
124.如權(quán)利要求123所述的測定，其特征在于，所述還原劑選自二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、TCEP或硫代乙酸和其組合。
125.如權(quán)利要求123所述的測定，其特征在于，所述二硫蘇糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
126.如權(quán)利要求125所述的測定，其特征在于，所述二硫赤蘚糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
127.如權(quán)利要求122所述的測定，其特征在于，所述測定在多達(dá)20分鐘的時間段中完成。
128.如權(quán)利要求127所述的測定，其特征在于，所述測定在多達(dá)15分鐘的時間段中完成。
129.如權(quán)利要求122所述的測定，其特征在于，所述測定在臨床化學(xué)分析儀上進(jìn)行。
130.如權(quán)利要求122所述的測定，其特征在于，所述測定在單個儀器上進(jìn)行。
131.一種連續(xù)測定含許多液體高半胱氨酸樣品的方法，其特征在于，所述測定包括步驟(a)產(chǎn)生反應(yīng)混合物，通過將所述樣品之一與絲氨酸、胱硫醚β-合酶和胱硫醚β-裂合酶、乳酸脫氫酶、NADH和能釋放樣品中蛋白質(zhì)-結(jié)合的高半胱氨酸的還原劑、或它們各自的衍生物一起置于容器中；(b)在所述反應(yīng)混合物中使高半胱氨酸循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)殡琢蛎亚译琢蛎言俎D(zhuǎn)變?yōu)楦甙腚装彼?，伴隨丙酮酸產(chǎn)生；(c)評估反應(yīng)混合物中存在的丙酮酸量，通過監(jiān)控其中隨著時間的NAD+的產(chǎn)生或NADH的消失；(d)對各所述樣品重復(fù)步驟(a)-(c)，各所述樣品的反應(yīng)混合物-產(chǎn)生步驟間的時間間隔多達(dá)約15分鐘。
132.如權(quán)利要求131所述的方法，其特征在于，所述時間間隔多達(dá)約13分鐘。
133.如權(quán)利要求131所述的方法，其特征在于，所述方法包括步驟首先產(chǎn)生第一種反應(yīng)混合物，含所述樣品、絲氨酸、乳酸脫氫酶、NADH和所述還原劑，使所述第一種反應(yīng)混合物溫育一段時間以釋放大部分所述蛋白質(zhì)-結(jié)合的高半胱氨酸，之后加入所述胱硫醚β-合酶和胱硫醚β-裂合酶。
134.如權(quán)利要求131所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)混合物中胱硫醚β-合酶與胱硫醚β-裂合酶的比例從約1∶1到25∶1。
135.如權(quán)利要求134所述的方法，其特征在于，所述比例從約1∶1到10∶1。
136.如權(quán)利要求131所述的方法，其特征在于，所述方法在臨床化學(xué)分析儀上進(jìn)行。
137.如權(quán)利要求131所述的方法，其特征在于，所述方法在單個儀器上進(jìn)行。
138.一種分離酶，其特征在于，所述酶與選自SEQ ID No19和20的酶有至少約80％的序列同一性。
139.一種分離酶，其特征在于，所述酶選自SEQ ID No19和20。
140.一種使用胱硫醚作為高半胱氨酸測定校準(zhǔn)物的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(a)取已知濃度的胱硫醚；(b)加入所述已知濃度到生物樣品；(c)用含脫硫醚的所述樣品在酶反應(yīng)中，使胱硫醚轉(zhuǎn)變?yōu)楦甙腚装彼崆腋甙腚装彼嵩俎D(zhuǎn)變?yōu)殡琢蛎?，伴隨丙酮酸和氨的產(chǎn)生；(d)測量產(chǎn)生的丙酮酸和氨的量；和(e)使用所述測量的丙酮酸或氨的量作為所述高半胱氨酸測定的參考標(biāo)準(zhǔn)。
141.一種控制涉及高半胱氨酸的酶反應(yīng)總體速度的過程，其特征在于，高半胱氨酸不被酶反應(yīng)消耗且高半胱氨酸的穩(wěn)態(tài)濃度與這種酶反應(yīng)總體速度成正比。
142.一種使用胱硫醚作為高半胱氨酸測定校準(zhǔn)物的方法，其特征在于，所述方法包括步驟加入胱硫醚到高半胱氨酸測定；和使用所述測定結(jié)果作為高半胱氨酸校準(zhǔn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供酶促循環(huán)測定用于評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚的量，如血液、血液衍生物或尿。測定包括步驟含高半胱氨酸和/或胱硫醚溶液接觸CBS或其衍生物、L－絲氨酸和CBL或其衍生物以形成反應(yīng)混合物，接觸時間足以催化高半胱氨酸形式循環(huán)轉(zhuǎn)變成胱硫醚且胱硫醚再轉(zhuǎn)變成高半胱氨酸并產(chǎn)生丙酮酸和氨；確定反應(yīng)混合物中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量；在形成的丙酮酸和/或氨量的基礎(chǔ)上確定溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。也提供CBS或其衍生物和CBL或其衍生物的表達(dá)載體和分離過程以及進(jìn)行測定的測試試劑盒。在較佳實(shí)施方案中，測定可用最少的酶在15分鐘或更少進(jìn)行中。
文檔編號C12Q1/32GK1612937SQ02826808
公開日2005年5月4日 申請日期2002年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月6日
發(fā)明者H·K·韋伯, J·歐文斯, R·里德克, D·弗里斯特, M·萊加茲, G·川崎, S·羅森 申請人:凱奇股份有限公司