專利名稱：制備純化的甲型肝炎病毒體和疫苗制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中純化甲型肝炎病毒以及制備純化的HAV抗原制劑的方法。本發(fā)明也涉及一種包含一種制劑的HAV疫苗組合物，其中該制劑含有充分量的在哺乳動物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的純化的成熟HAV粒子。
背景技術(shù)：
甲型肝炎不斷地引起散發(fā)性的、地方性的以及偶發(fā)性的死亡，并且是一個全球性的公共衛(wèi)生問題。所述感染是由微小RNA病毒家族的一個成員-甲型肝炎病毒(HAV)所引起的，其中的微小RNA病毒是一組小的非包膜的RNA病毒。所述病毒體的直徑為27-32nm，由從單個多肽前體分子裂解得到的VP1，VP2和VP3三個多肽組成。
甲型肝炎病毒(HAV)是唯一的嗜肝性病毒，其可分離自細(xì)胞培養(yǎng)物，但所述病毒通常難以增殖，具有長的潛伏期且沒有細(xì)胞致病作用。盡管一些靈長類動物細(xì)胞類型已經(jīng)被報(bào)道能夠支持HAV的復(fù)制，諸如胎恒河猴腎臟細(xì)胞系(FRhk-4)、初級的非洲綠猴腎臟細(xì)胞(AGKM)、連續(xù)的非洲綠猴腎臟細(xì)胞(BCS-1)，但這些細(xì)胞通常不能用于人的疫苗，因?yàn)楹镒拥哪I臟往往具有高含量的潛伏的猴病毒，其在用于病毒生產(chǎn)疫苗的過程中可變?yōu)榭梢姷?。其它的?xì)胞系不能被使用是因?yàn)橐恍┘?xì)胞的致腫瘤特性引起對其用于疫苗生產(chǎn)的抑制。用于繁殖HAV的初級人上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或腎臟細(xì)胞或細(xì)胞株的批量生產(chǎn)因這些細(xì)胞在培養(yǎng)物中的低傳代數(shù)而受到限制。事實(shí)上，世界衛(wèi)生組織(WHO)的應(yīng)用指南表明僅僅少數(shù)的一些細(xì)胞系被允許用于病毒疫苗的生產(chǎn)。
一種目前被接受并被證實(shí)適用于生產(chǎn)人疫苗的細(xì)胞系是VERO細(xì)胞。VERO細(xì)胞是已被許可用于人疫苗制備工藝的持續(xù)猴腎臟細(xì)胞，并且現(xiàn)在被用于脊髓灰質(zhì)炎和狂犬病疫苗的生產(chǎn)。
人們已經(jīng)嘗試使用VERO細(xì)胞來生產(chǎn)HAV，但在VERO細(xì)胞上復(fù)制HAV是受限制的，因?yàn)閂ERO細(xì)胞具有病毒生長的溫度限制且從未在被感染細(xì)胞的上清液中發(fā)現(xiàn)病毒(Locarnini等，1981，J.Virol.37216-225)。US4783407公開了在滾瓶中在不高于33℃的溫度下在VERO細(xì)胞上生產(chǎn)HAV來克服溫度限制。在此系統(tǒng)中，凍融培養(yǎng)細(xì)胞后，每搖瓶可獲得大約50μg的HAV抗原。目前尚沒有描述基于在VERO細(xì)胞上增殖HAV的商用疫苗。
迄今為止，福爾馬林滅活的HAV疫苗已被生產(chǎn)出來用于臨床試驗(yàn)(Andre等，1990，在Melnick(ed)Prog.Med.Virol.Basel，Karger 3772-95，Armstrong等，1993，J.Hepatology 1820-26)且四種疫苗已被許可，它們能誘導(dǎo)持久的免疫力并保護(hù)抵抗初次感染。目前有效的滅活HAV全病毒疫苗的生產(chǎn)方法利用人胚胎的肺成纖維細(xì)胞系MRC-5作為宿主細(xì)胞，其在組織培養(yǎng)物中生長緩慢且僅僅添加胎牛血清。
在細(xì)胞培養(yǎng)物中使用血清和/或在培養(yǎng)基中添加來自動物或人來源的蛋白添加劑帶來的問題，即不同批次的不同特性和組成以及被支原體、病毒或BSE-因子污染的風(fēng)險(xiǎn)所帶來的問題，是眾所周知的。因此，人們進(jìn)行許多嘗試來提供有效的宿主系統(tǒng)和不需要血清或其它來自血清的化合物的培養(yǎng)條件。此外，由于含有病毒抗原的原材料的污染較小，通過利用不含血清的培養(yǎng)基避免了污染，使得提純更為有效。
Binn等人(1984.J.Clincal.Microbiol.2028-33)測試了一些用于復(fù)制HAV的靈長類動物細(xì)胞和用于分離和生產(chǎn)大量病毒的最佳條件。通過在BSC-1細(xì)胞，一種迄今尚沒有被用于人疫苗制備的異雙倍體細(xì)胞系上，在搖瓶中進(jìn)行無血清HAV生產(chǎn)顯示出，在培養(yǎng)21天后可在上清液和細(xì)胞組分中發(fā)現(xiàn)病毒抗原。維持在支持病毒生長的無血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞等同于維持在血清中的細(xì)胞。通過低速離心維持在無血清培養(yǎng)基中的凍融細(xì)胞的上清液和受感染的BSC-1細(xì)胞的上清液獲得的候選HAV疫苗，由Binn等在1986年描述于J.Infect.Diseases153749-756中。
Flehmig等人(1987.J.Medical Virol.227-16)用分離自持續(xù)地受感染的正常人胚胎的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液的HAV來制備候選HAV疫苗，其中的胚胎成纖維細(xì)胞生長在含有血清的無細(xì)胞致病作用的培養(yǎng)基中。
因此，從由NUNC細(xì)胞工廠生產(chǎn)的大量上清液通過連續(xù)步驟分離和純化而得到的HAV抗原被用于疫苗接種試驗(yàn)。
然而，所有生長在細(xì)胞培養(yǎng)物中的HAV菌株具有不能有效率地釋放病毒到培養(yǎng)物的上清液中的特性。盡管有多達(dá)50％的傳染性病毒可被釋放，然而典型地少于30％的傳染性病毒是胞外的(Nasser等，1987.Appl.Environmental Microbiol.532967-2971)。因此，通常在未濃縮的培養(yǎng)物上清液中是不可檢測抗原的且大容量的濃縮增加了此方法中HAV提純的難度。因?yàn)镠AV抗原不是被有效地釋放到培養(yǎng)物的上清液中且大容量的濃縮是昂貴的(Bishop等，1994.J.Virol.Meth.47203-216)，因此所描述的大多數(shù)純化方法利用來自胞內(nèi)生產(chǎn)的病毒細(xì)胞溶解產(chǎn)物的HAV抗原作為生產(chǎn)HAV疫苗的來源(EP0339667；EP0583142，Andre等，1990，InMelnick(ed)Prog.Med.Virol.Basel，Karger 3772-95；Armstrong等，1993，J.Hepatology1820-26)；Hagen等，1996，Biotechnol.Appl.Biochem.23209-215；Bader等，1996，Amer.J.Gastroenterol.91217-222，Hennessey等，1999，Vaccine 172830-2885，WO00/23574)。然而，這些方法是費(fèi)時(shí)的，其使用細(xì)胞釋放胞內(nèi)生產(chǎn)的抗原所必需的去垢劑且需要強(qiáng)烈的和一系列純化步驟來去除細(xì)胞中的去垢劑和污染物。
為誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫應(yīng)答，有人提議，衣殼蛋白必須是折疊的且以正確的構(gòu)象進(jìn)行裝配成而且前體蛋白不能引發(fā)保護(hù)性的免疫應(yīng)答。成熟的HAV粒子由3個病毒衣殼蛋白(VP1，VP2，VP3)組成。通過幾個連續(xù)的裂解可以以單一的前體分子(P1)獲得這些蛋白。在病毒成熟和裝配過程中形成了不同的中間體。裂解前的蛋白首先裝配為五鄰體結(jié)構(gòu)，然后60個五鄰體形成一個前病毒體。前病毒體由VP1，VP0和VP3組成。在最后對VP2和VP4中的VP0進(jìn)行成熟切割后，由這些前病毒體獲得了成熟的病毒體。VP4不存在于成熟的病毒體中。
由細(xì)胞溶解產(chǎn)物和/或細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液得到的HAV的大規(guī)模制劑含有成熟病毒體、前病毒體和前衣殼的混合群體(Bishop等，1997.Arch.Virol.1422147-2160；EP 339667，EP 339668)。成熟的病毒由多肽VP1、VP2和VP3組成，其中衣殼蛋白VP1和VP3包含主要的抗原位點(diǎn)且能夠誘導(dǎo)中和抗體(Lemon等，1989，在Semler等編輯，微小RNA病毒的分子方面及檢測。華盛頓特區(qū)ASM p 193-208)。人們已經(jīng)進(jìn)行了很多嘗試來純化HAV以及分離各種形式的HAV粒子。1997年Bishop等人(同上)利用線性梯度離心來分離不同的HAV粒子形式，并且發(fā)現(xiàn)密度為1.32-1.33g/cm3的HAV粒子是顯示前病毒體和成熟病毒體不完全分離的含有VP0和VP2粒子的混合物。在主要包含成熟的HAV病毒體的組分中，發(fā)現(xiàn)VP2多于VP0，其相應(yīng)的比率為55％比45％。在細(xì)胞溶解產(chǎn)物和培養(yǎng)物上清液中還都檢測到了病毒體和前病毒體，且除了VP0之外，還檢測到釋放的含有可變水平的VP1前體蛋白PX的粒子，其具有大約67KD的分子量。Dubois等人(1991，J.Virol.Meth，32327-334)由包括通過等密度離心純化的完全粒子的1.33g/cm3密度的主要峰值組分制備了一種疫苗。US 5,268,292描述了由持續(xù)感染的細(xì)胞分離和純化HAV的方法，且發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的銀染蛋白為病毒多肽VP1，VP2和VP3，而且可檢測到一種大約67kD的多肽。
每年全球市場對HAV疫苗的需求量為1億劑。有效的疫苗生產(chǎn)需要由宿主系統(tǒng)高產(chǎn)量大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)病毒的。此外，人們需要一種利用已可利用的材料以及需要最少數(shù)量的耗時(shí)操作來增殖病毒的方法，其中宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基、生長條件和生產(chǎn)系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)此有效的制備方法所必需的。大多數(shù)的疫苗沒有被純化來保持靈敏的對疫苗效果起關(guān)鍵作用的生物活性?？梢云谕环N純的產(chǎn)物用于生產(chǎn)具有較高免疫原性的穩(wěn)定的疫苗且從臨床角度考慮產(chǎn)生較小的副作用。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供一種由感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液純化HAV的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種由感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液分離完全的HAV粒子的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種由感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液分離成熟的HAV粒子的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)HAV粒子的純化制劑的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)包含完全的HAV粒子的純化制劑的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)包含成熟HAV粒子的純化制劑的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)包含滅活的、純化的成熟HAV粒子的純化制劑的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種包含純化的HAV粒子的制劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種純化的完全的HAV抗原疫苗。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種純化的成熟的HAV抗原疫苗。
附圖的簡要說明

圖1A顯示了HAV純化過程中的不同中間體的SDS-PAGE蛋白模式和銀染色。
圖1B顯示了利用HAV特異性豚鼠血清進(jìn)行的HAV純化過程中不同中間體的蛋白質(zhì)印跡分析。其顯示泳道1HAV濃縮物(原始材料)，泳道2開放的，泳道3超濾步驟10倍濃縮物的濾液；泳道4超濾步驟10倍濃縮物的保留物；泳道5開放的，泳道6滲濾步驟1的滲濾物1；泳道7滲濾步驟1的滲濾保留物1；泳道8用0.22μ過濾器過濾后的滲濾保留物1；泳道9開放的，泳道10滲濾保留物加Benzonase(處理3小時(shí)后)；泳道11滲濾保留物加蛋白酶(處理24小時(shí)后)；泳道12開放的；泳道13用緩沖液滲濾的滲濾濾液2；泳道14滲濾保留物2；泳道15開放的；泳道16滲濾保留物2(利用0.22u過濾器)；泳道17開放的以及泳道18分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖1C顯示了利用VERO細(xì)胞特異性抗血清的HAV純化過程中不同中間體的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2開放的；泳道3HAV濃縮物(原始材料)，泳道4開放的，泳道5超濾步驟10倍濃縮物的濾液；泳道6超濾步驟10倍濃縮物的保留物；泳道7滲濾步驟1的滲濾濾液1；泳道8滲濾步驟1的滲濾保留物1；泳道9用0.22μ過濾器過濾后的滲濾保留物1；泳道10開放的，泳道11滲濾保留物加Benzonase(處理3小時(shí)后)；泳道12滲濾保留物plus蛋白酶(處理24小時(shí)后)；泳道13開放的；泳道14用緩沖液滲濾的滲濾濾液2；泳道15滲濾保留物2；泳道16滲濾保留物2(利用0.22μ過濾器)。
圖2A顯示了利用增加的抗衣殼蛋白的豚鼠血清進(jìn)行蔗糖-梯度純化而得到的HAV制劑不同組分的蛋白質(zhì)印跡分析。
圖2B顯示了利用抗VP0的特異性豚鼠血清進(jìn)行蔗糖-梯度純化得到的HAV制劑不同組分的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2組分11，泳道3組分12，泳道4組分13；泳道5組分14；泳道6組分15；泳道7組分16；泳道8集合組分12-14。
圖3顯示了利用VERO細(xì)胞的特異性抗血清進(jìn)行的HAV純化過程中不同中間體的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1細(xì)胞培養(yǎng)上清液；泳道2滲濾保留物1(超/滲濾后)；泳道3滲濾保留物1加蛋白酶(處理24小時(shí)后)；泳道滲濾保留物2(用緩沖液滲濾后)；泳道5蔗糖-梯度的組分12-14。
圖4顯示了由本發(fā)明的成熟HAV粒子組成的HAV制劑以及兩種利用抗VP0、抗VP1和抗VP3抗體的許可疫苗的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2上清液的10倍濃縮物(超速離心前的)；泳道3蔗糖-梯度的峰組分1；泳道4蔗糖-梯度的峰組分2；泳道5VERO細(xì)胞的裂解物；泳道6VAQTA 10倍；泳道7HAVRIX 10倍；泳道8分子量標(biāo)準(zhǔn)。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中建立了一種方法，它允許在無血清條件下生產(chǎn)HAV抗原以及允許從受感染細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液簡單地純化HAV抗原。通過本發(fā)明的方法可有效地除去細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基中的污染雜質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的一個目的，提供一種純化HAV抗原的簡單方法，其在單一的純化步驟中產(chǎn)生高度的純度。
依據(jù)該方法，通過過濾濃縮含有產(chǎn)生并釋放到培養(yǎng)基中的HAV的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，用一種核酸降解試劑和一種蛋白酶處理濃縮的HAV制劑，過濾經(jīng)所述試劑和蛋白酶處理的制劑，以及分離完全純化HAV粒子的制劑，從而由HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液純化得到了HAV抗原。
然后進(jìn)一步對完全的HAV粒子的純化HAV制劑進(jìn)行分離步驟，從完全HAV粒子的純化的HAV制劑中分離出純化的成熟HAV粒子的步驟。包含純化和分離步驟的本發(fā)明的方法產(chǎn)生了適于人臨床應(yīng)用的純化HAV制劑，所述制劑基本上不含來自細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)物的污染物。
術(shù)語“完全的HAV粒子”是指由衣殼蛋白VP1、VP2和VP3組成的成熟的、傳染性HAV病毒體的含有RNA的HAV粒子，以及含有VP1、VP3和VP0前體多肽的不成熟的前病毒體。
術(shù)語“成熟的HAV粒子”是指僅反由衣殼蛋白VP1、VP2和VP3組成的含有RNA的HAV病毒體。
術(shù)語“適于人臨床應(yīng)用”是指通過發(fā)色體LAL試驗(yàn)測定的10μg抗原的內(nèi)毒素含量小于大約2IU。此外，根據(jù)本發(fā)明，通過定量PCR利用內(nèi)標(biāo)測定的污染DNA的水平，尤其是VERO細(xì)胞的DNA水平小于大約100pg/100IU HAV抗原，優(yōu)選地小于大約50pg，更優(yōu)選地小于大約40pg。因此具有大約20IU HAV抗原的疫苗劑量具有小于大約20pg，優(yōu)選地小于大約10pg，最優(yōu)選地小于大約8pg的污染DNA。此外，通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析測定的每劑量病毒抗原的細(xì)胞污染物水平小于總蛋白含量的大約0.1％，優(yōu)選地小于大約0.05％。
術(shù)語“基本上不含”是指污染雜質(zhì)諸如來自細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)或污染細(xì)胞的核酸的量，低于本領(lǐng)域檢測方法的最靈敏狀態(tài)的檢測極限。蛋白質(zhì)印跡分析和光密度方法被用于測定樣品中污染蛋白質(zhì)的量。US 5,858,658中所描述的用于核酸定量分析，特別是用于基因組VERO細(xì)胞DNA的高靈敏度PCR法，可用于定量測定樣品中核酸的殘余量。
術(shù)語“來自細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基的污染物”是指細(xì)胞片段、細(xì)胞多肽和蛋白質(zhì)、細(xì)胞核酸以及其它來自細(xì)胞的高分子和來自培養(yǎng)基的多肽以及蛋白質(zhì)。
術(shù)語“細(xì)胞核酸″是指獲自用于繁殖所述病毒的已經(jīng)被病毒感染的細(xì)胞的異源DNA或RNA。
本發(fā)明的純化的HAV抗原基本上不含污染蛋白質(zhì)和核酸，適用于人臨床應(yīng)用并且是穩(wěn)定的?！凹兓募仔透窝撞《究乖笔侵竿ㄟ^SDS-PAGE(銀染或考馬斯染色)和蛋白質(zhì)印跡測定的純度和HAV抗原與總蛋白量的比值，所述純度優(yōu)選地大于大約98％。
根據(jù)本發(fā)明的目的，提供了一種生產(chǎn)完全HAV粒子的純化制劑的方法，包括用核酸降解試劑和蛋白酶處理獲自HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的HAV制劑以及分離完全HAV粒子的制劑的步驟。用核酸降解度劑和蛋白酶處理之前，收集和濃縮含有HAV的上清液。含有HAV的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液可來自任意能產(chǎn)生和釋放HAV到上清液中的細(xì)胞培養(yǎng)物。細(xì)胞培養(yǎng)物優(yōu)選地為一種不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)物。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案，所提供的細(xì)胞培養(yǎng)上清液來自HAV感染的VERO細(xì)胞。VERO細(xì)胞存在于在懸浮液、搖瓶或燒瓶中。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，VERO細(xì)胞優(yōu)選地為一種微載體培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞與所述微載體結(jié)合。該微載體可為一種選自右旋糖酐、骨膠原、塑料、膠質(zhì)和纖維素以及其它如Butler描述的(1988，在Spier& Griffiths，Animal cell Biotechnology 3283-303)組的微載體。所述細(xì)胞優(yōu)選培養(yǎng)在不含血清或不含血清和蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中。不含血清或不含血清和蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基可以是如Kistner等(1998，Vaccine 16960-968)，Merten等(1994.Cytotech.1447-59)，Cinatl.等(1993.Cell Biology Internat.17885-895)，Kessler等(1999.Dev.Biol.Stand.9813-21)，WO 96/15231，US 6,100,061所描述的實(shí)例或本領(lǐng)域已知的任意其它不含血清或不含血清和蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。所述細(xì)胞優(yōu)選地從安瓿瓶中在不含血清或不含血清和蛋白質(zhì)培養(yǎng)基生長到生物量，并在細(xì)胞培養(yǎng)生長、病毒增殖和病毒生產(chǎn)過程期間保持在各自的培養(yǎng)基條件下。
然而，本發(fā)明的方法可被用于任意的已知能釋放HAV粒子到細(xì)胞培養(yǎng)基中的HAV-感染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，該培養(yǎng)基的實(shí)例被Binns等(1984，同上文)或Flehmig等(1987，同上文)描述，其中可使用任意的易受HAV感染并釋放HAV到培養(yǎng)基中的宿主細(xì)胞。
由于在HAV感染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中的HAV粒子被稀釋，通過減少培養(yǎng)基的體積來濃縮培養(yǎng)基中的HAV抗原。這些可通過任意已知的減少液體體積以及濃縮含有病毒的液體的方法，諸如離心、過濾、沉淀、兩相分配的方法來實(shí)施。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面中，通過過濾來濃縮含有HAV的培養(yǎng)基收集物。根據(jù)本發(fā)明的方法，超濾是優(yōu)選的。這具有其它的優(yōu)點(diǎn)，可以在同一步驟中除去比HAV粒子小的污染物。然后用核酸降解試劑和蛋白酶處理所獲得的含有HAV的濃縮物。試劑和蛋白酶可能需要針對其活性的特定條件，諸如離子強(qiáng)度、pH和緩沖液。為提供所述活性的有效緩沖液條件，可通過使得核酸降解試劑和蛋白酶在含HAV的制劑中具有有效活性的緩沖液來除去和交換細(xì)胞培養(yǎng)基。這些可通過本領(lǐng)域已知的方法，諸如通過超濾或色譜法進(jìn)行的透析和緩沖液交換來實(shí)施。根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的方面，其是通過過濾來實(shí)施的。此過濾優(yōu)選通過滲濾來進(jìn)行。
本發(fā)明的核酸降解試劑可以為一種降解核酸的酶，優(yōu)選為一種核酸降解酶，諸如核酸酶、脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或內(nèi)切酶，諸如來自粘質(zhì)沙雷氏菌(Serrati amarcescens)，市售的Benzonase(Benzon PharmaA/S)。
用于降解高分子量蛋白質(zhì)和多肽的蛋白酶可以是本領(lǐng)域公知的任意蛋白酶，諸如例如蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶。
然而，動物來源的蛋白酶，諸如?；蜇i胰蛋白酶帶有被感染劑如BSE污染的危險(xiǎn)。
因此，根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選方面，含有HAV的制劑用微生物來源的蛋白酶進(jìn)行處理。微生物蛋白酶可以為鏈霉蛋白酶。鏈霉蛋白酶為來自灰色鏈霉菌(S.g.)的不同酶的混合物，并且可以從市售獲得。這種混合物包含許多不同的蛋白，包括蛋白酶、磷酸酶、膠原酶以及胰蛋白酶類蛋白酶，通常稱作S.g.胰蛋白酶(SGT)。這種酶的選擇性以及活性顯示出與動物來源的胰蛋白酶較大程度的相似性。因?yàn)殒溍沟鞍酌笧椴煌傅慕M合物，其中的酶活性之一也許對制劑中的HAV具有副作用。
根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，使用微生物蛋白酶的純化的胰蛋白酶類酶。尤其是，使用一種鏈霉蛋白酶的純化組分，胰蛋白酶類酶灰色鏈霉菌胰蛋白酶(SGT)。純化的SGT優(yōu)選地通過在芐脒上的親和層析，并用包括0.5到1.2M精氨酸的洗脫劑洗脫純化的SGT的方法獲得。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過這種方法純化的SGT非常有效，并且由于其較高的比活度，可以通過向培養(yǎng)基中加入較低的蛋白載量進(jìn)行使用。通過本領(lǐng)域公知的其它已知方法從鏈霉蛋白酶純化得到的SGT也可用于本發(fā)明的方法中。這種方法包括諸如由Yokosawa等描述的方法(1976.Biochem.79757-763)或者其它層析法。
用核酸降解試劑以及蛋白酶處理HAV制劑后，從制劑中除去試劑和蛋白酶以及源于它們的活性產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，例如高分子量大分子的低分子量片段如核酸或者蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法，通過過濾進(jìn)行雜質(zhì)的去除。從而，獲得含有小于30pg的污染核酸/IUHAV抗原的純化制劑。該制劑具有最少5000IU的HAV抗原/mg蛋白。
人們發(fā)現(xiàn)，通過過濾能有效地去除雜質(zhì)，并且在一個單獨(dú)的步驟內(nèi)分離了完全的HAV粒子。因此，如上所述獲得的完全HAV粒子的純化制劑基本上由完全的HAV粒子組成，其中的完全HAV粒子是通過過濾從HAV感染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中純化而來的。
通過如上所述方法獲得的完全HAV粒子的純化制劑可被用作分離成熟的HAV粒子以及產(chǎn)生成熟的HAV粒子的純化HAV制劑的來源。制劑中不同的HAV粒子形式(病毒體以及原病毒體)可以通過傳統(tǒng)的離心作用，諸如蔗糖梯度上的等密度離心、CsCl-梯度或者凝膠層析或者制備性場流分級法分離開來。
根據(jù)本發(fā)明的另一目的，提供了制備純化的成熟的HAV粒子制劑的方法。所述方法包括下列步驟提供HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，用核酸降解試劑以及蛋白酶處理所述的HAV制劑，從所述的完全HAV粒子的制劑中分離完全的HAV粒子制劑并且分離純化的成熟HAV病毒體。所述的成熟HAV病毒體可以通過離心作用，諸如等密度離心進(jìn)行分離。離心作用優(yōu)選為使用蔗糖-梯度的等密度離心、利用蔗糖墊層的?；蛘唠x心作用。因此所述方法提供了成熟HAV粒子的純化的HAV制劑的生產(chǎn)方法，其中成熟的HAV粒子從完全HAV粒子的制劑中分離而來。成熟的HAV粒子的制劑通過過濾以及等密度離心從HAV感染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液獲得。所描述的方法簡單、有效并且減低了成本，而且提供了在現(xiàn)有技術(shù)中尚未描述的純粹產(chǎn)物。
通過對從生長在不含血清并且不含蛋白的培養(yǎng)基上的細(xì)胞培養(yǎng)物開始的特定條件進(jìn)行組合，利用HAV感染的不含血清以及不含蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)物的無細(xì)胞上清液作為產(chǎn)生純化HAV的來源，避免了來自細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基的可能污染物的主要來源。然而，不能期望與微載體結(jié)合的細(xì)胞能將產(chǎn)生的病毒釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中，可以利用本發(fā)明的方法從所述細(xì)胞培養(yǎng)基中有效純化HAV粒子。通過過濾純化使得所述方法適合于大規(guī)模純化的方案。另外用核酸降解試劑和蛋白酶處理破壞了所有的高分子量的大分子，然后也通過過濾將大分子除去。
本發(fā)明的純化的HAV制劑不含來自細(xì)胞或者細(xì)胞培養(yǎng)基的污染蛋白。這通過利用抗宿主細(xì)胞蛋白的特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡分析以及測定HAV抗原與制劑中總蛋白量的比例來進(jìn)行確定。去除來源于細(xì)胞的污染核酸的效率通過如美國專利5,858,658描述的殘余核酸的高靈敏度定量分析方法來進(jìn)行確定。也可以使用本領(lǐng)域公知的其它核酸定量分析方法。本發(fā)明方法的純化HAV制劑具有小于約0.5pg的污染核酸/IU HAV抗原。
減毒的HAV為本領(lǐng)域公知的并且降低了傳播傳染性粒子的風(fēng)險(xiǎn)。然而，在人類疫苗中使用滅活甚至減毒的疫苗病毒提高了疫苗的安全性。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，所述方法包括用病毒滅活試劑處理純化的HAV粒子的步驟。滅活試劑可以為本領(lǐng)域公知的具有滅活活性的任何試劑，諸如福爾馬林、BEI、激光、紫外線、化學(xué)處理諸如亞甲基藍(lán)、補(bǔ)骨脂素或其任意組合。優(yōu)選地，用福爾馬林滅活病毒。
病毒滅活可以在純化過程的任一階段進(jìn)行，然而最方便地是在最后純化步驟之前用病毒滅活試劑進(jìn)行處理，借此從完全的HAV粒子形式的制劑中分離得到成熟的HAV粒子。
根據(jù)本發(fā)明的這個方面，所述方法提供了完全HAV粒子的純化滅活HAV制劑的生產(chǎn)方法，其中完全HAV粒子是通過過濾和病毒滅活處理從HAV感染細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化而來。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，所述方法提供了成熟HAV粒子的純化滅活HAV制劑的生產(chǎn)方法，其中成熟的HAV粒子從是通過過濾和離心作用從HAV感染細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液純化而來?？梢栽陔x心和分離成熟的HAV粒子之前或者之后進(jìn)行HAV粒子的滅活，優(yōu)選在離心作用之前進(jìn)行滅活處理。這就使得通過最后的純化和分離步驟去除滅活劑的污染殘余物成為可能。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了從HAV感染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中分離完全的HAV粒子的病毒體的方法。此方法包括如下步驟過濾無細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的HAV收集物、用核酸降解試劑和蛋白酶處理過濾后的HAV制劑以及分離完全的HAV粒子。分離的完全HAV粒子不含任何HAV的前體多肽，諸如P1或者PX。所述方法不包括除過濾以外的任何其它純化和分離步驟。
通過如上所述的方法，提供了純化的HAV制劑，所述制劑由純化的完全HAV粒子組成，基本上不含HAV的前體多肽P1并且不含來自細(xì)胞或者細(xì)胞培養(yǎng)物的污染蛋白。該制劑具有小于30pg的污染核酸/IUHAV抗原，并且具有至少5000IU的HAV抗原/mg蛋白。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了從HAV感染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中分離成熟的HAV粒子的方法。這種方法包括如下步驟用核酸降解試劑和蛋白酶處理來源于HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的過濾后的HAV制劑，分離完全的HAV粒子并且進(jìn)一步分離成熟的HAV病毒體顆粒。在用核酸降解試劑和蛋白酶處理之前過濾無細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液HAV。成熟HAV粒子的分離優(yōu)選通過離心作用進(jìn)行。所述方法不包括任何其它的純化或分離方法諸如層析步驟。
通過如上所述的方法，提供了成熟HAV粒子的純化制劑，也就是說不含來自細(xì)胞或者細(xì)胞培養(yǎng)物的污染蛋白。純化的成熟HAV病毒體顆粒不含HAV前體多肽P1并且不含HAV原病毒體。該制劑具有小于0,5pg/IU HAV抗原的來自細(xì)胞或者細(xì)胞培養(yǎng)物的污染核酸，并且具有至少5000IU的HAV抗原/mg蛋白。
該制劑可以進(jìn)一步包括生理學(xué)上可接受的載體和/或穩(wěn)定劑。
可以把該制劑配制成免疫原性組合物。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，免疫原性組合物為HAV粒子的水溶液并且可以直接使用。
純化的HAV粒子可以用任意各種公知的佐劑混合或者吸附。這種佐劑包括但不限于氫氧化鋁、磷酸鋁、皂草苷，諸如Quil A，單磷酰基脂質(zhì)A(MPL)以及3-脫?；膯瘟柞；|(zhì)A(3D-MPL)或者QS21。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了生產(chǎn)HAV疫苗的方法，所述方法包括如下步驟用核酸降解試劑和蛋白酶處理HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液的HAV制劑，分離完全的HAV粒子制劑并且將純化的完全HAV粒子配制在免疫原性組合物中。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了生產(chǎn)HAV疫苗的方法，所述方法包括如下步驟用核酸降解試劑和蛋白酶處理HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液的HAV制劑，分離完全的HAV粒子的制劑，從所述完全的HAV粒子制劑中分離純化的成熟HAV病毒體并且制備包括純化的成熟HAV病毒體制劑的免疫原性組合物。所述疫苗可以包括已經(jīng)用病毒滅活試劑處理的純化的HAV粒子。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了制備包括滅活的HAV粒子的HAV疫苗的方法，所述滅活的HAV粒子可以是純化的完全HAV粒子或者成熟的HAV病毒體顆粒。因此所述方法包括用滅活劑處理完全的HAV的純化制劑的步驟。然后通過傳統(tǒng)方法從HAV制劑中除去滅活劑。所述滅活劑還可以通過過濾和分離如上所述的滅活的成熟的HAV粒子來除去。在最后一步，制備了包括純化的滅活的完全或者成熟HAV病毒體制劑的免疫原性組合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種HAV疫苗，它包括宿主保護(hù)量的純化的成熟HAV粒子的制劑，所述制劑不含來自細(xì)胞或者細(xì)胞培養(yǎng)物的污染物。用于配制疫苗的制劑不含HAV前體多肽P1以及HAV原病毒體。
術(shù)語“宿主保護(hù)量”是指疫苗中病毒抗原的臨界保護(hù)劑量，其中所述量可以有效地免疫易感的哺乳動物使其抗甲型肝炎病毒感染并且誘導(dǎo)宿主的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的成熟HAV粒子的制劑比已知的可以從市售得到的HAV制劑對試驗(yàn)的動物模型具有更高的免疫原性。獲得有效免疫反應(yīng)所需要的本發(fā)明的疫苗制劑中的抗原劑量(IU)比其它疫苗制劑中的低。這至少可以部分地由本發(fā)明制劑的更高純度來解釋。另外，該制劑由成熟的HAV粒子構(gòu)成，所述成熟HAV粒子僅僅由HAV衣殼蛋白VP1、VP2和VP3組成，這些衣殼蛋白含有誘導(dǎo)中和抗體的主要抗原位點(diǎn)。該制劑不包括將減少HAV制劑中免疫原性位點(diǎn)比例的不成熟粒子、前病毒體或者HAV前體多肽。
因此，本發(fā)明的疫苗組合物優(yōu)選包括小于約25IU的HAV抗原/劑，優(yōu)選地小于約20IU的HAV抗原/劑的宿主保護(hù)量的HAV抗原。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，疫苗中宿主保護(hù)量為約5至約25IU的HAV抗原/劑。然而可以使用更高的濃度。該疫苗組合物中來自細(xì)胞的污染核酸的量小于約0.5pg/IU抗原。該疫苗組合物為穩(wěn)定的，是指組合物中的成熟的HAV粒子沒有發(fā)生可覺察程度的降解，即在2-8℃保存1年后，與標(biāo)準(zhǔn)參考相比，超過95％的HAV抗原保持了通過抗原ELISA和動物體內(nèi)的效力研究測定的粒子結(jié)構(gòu)。
由純化的成熟HAV粒子組成的免疫原性組合物可以進(jìn)一步包含緩沖液和/或生理學(xué)上可接受的載體。該組合物可以包括佐劑。同樣顯示包含低濃度佐劑的組合物能誘導(dǎo)比包含更高佐劑濃度的組合物更高的抗體和中和抗體滴度(參見實(shí)施例5)。因此疫苗組合物可以包括少量的佐劑。疫苗中佐劑的終濃度可以為約0.001％至約0.5％(w/v)，優(yōu)選地為約0.05至約0.1％(w/v)。佐劑可以為標(biāo)準(zhǔn)佐劑、氫氧化鋁或者磷酸鋁。免疫原性HAV制劑可以包括諸如免疫刺激劑的其它成分。
根據(jù)另一方面，疫苗進(jìn)一步至少包括來自病原體的第二抗原。該抗原可以來自于對人類來說是致病的病毒或者細(xì)菌。
根據(jù)一個實(shí)施方案，疫苗更進(jìn)一步包括乙型肝炎病毒抗原。
優(yōu)選地，HBV抗原為HBV表面抗原(HBsAg)，其中HBV表面抗原選自HBVpreS1-preS2-S(大抗原)、preS2-S抗原(中抗原)或者S-抗原(小抗原)或其混合物。HBsAg可以與純化的HAV粒子混合以獲得HAV/HBV疫苗組合物。HBV抗原可與免疫刺激劑或者與佐劑諸如鋁鹽或者如上所述的任意其它佐劑組合。
根據(jù)另一方面，疫苗可以更進(jìn)一步包括來源于選自流感嗜血菌、腦膜炎球菌A、B、C、W或者Y、肺炎鏈球菌、肺炎球菌的病原體的抗原。
在下列實(shí)施例中對本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行說明。實(shí)施例是對本發(fā)明的詳細(xì)說明而非限制其范圍。
實(shí)施例1通過VERO細(xì)胞生產(chǎn)HAV抗原在細(xì)菌質(zhì)粒pHAV/7中克隆來自減毒株HM175/7的基因組的全長cDNA(Cohen等，1987，J.Virol.613035-3039)，用來通過體外轉(zhuǎn)錄制備全長基因組RNA。在34℃用體外轉(zhuǎn)錄的HAV RNA轉(zhuǎn)染不含血清的VERO細(xì)胞以產(chǎn)生不含外來試劑的HAV HM175/7病毒原種。
把VERO細(xì)胞(非洲綠猴，Cercopthecus aethiops，腎)用作生產(chǎn)細(xì)胞系。細(xì)胞獲自美國典型細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，馬里蘭，傳代數(shù)124，保藏號為ATCC CCL 81。細(xì)胞適合于生長在不含血清或者不含血清和蛋白的培養(yǎng)基上，如Kistner等人于1998年(同上文)或者WO96/15231所描述的。為了在不含血清的培養(yǎng)基中生長，使用添加了無機(jī)鹽、氨基酸、碳酸氫鈉和酵母或者大豆提取物的基礎(chǔ)DMEM HAM′sF12培養(yǎng)基。不使用任何動物來源的培養(yǎng)基組分來制備工作細(xì)胞庫。
將一安瓿培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中的VERO細(xì)胞的工作細(xì)胞庫(WCB)與Ham′s F12養(yǎng)分混合物以1∶1的比例再懸浮在包含血清的培養(yǎng)基以及不含血清的、補(bǔ)充了大豆或酵母抽提物的培養(yǎng)基中。
通過利用純化的灰色鏈霉菌胰蛋白酶(1μg/ml)進(jìn)行轉(zhuǎn)種以避免動物來源的任何試劑，所述試劑可以包括任何致病性試劑。在扁瓶以及滾瓶中傳代培養(yǎng)后，將6-8×107個細(xì)胞/克微載體(Cytodex III；Pharmacia)接種在12L的攪拌發(fā)酵罐中。細(xì)胞在37℃生長共6-8天?？刂?0％+/-10％的氧飽和度以及pH7.1+/-0.2以及攪拌速度30-60rpm的培養(yǎng)條件。在以6×105到1×106個細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度接種的第二天，將感染復(fù)數(shù)(m.o.i.)在0.1和1.0之間的HAV HM175/7病毒懸浮液在34℃的溫度下泵入發(fā)酵罐中。兩小時(shí)后開始讓病毒吸附，進(jìn)行培養(yǎng)基灌注。用新鮮的培養(yǎng)基每天更換一半的發(fā)酵罐體積。通過篩子將微載體以及附著的細(xì)胞保持在發(fā)酵罐中。在發(fā)酵過程期間，控制pH7.1，O2(30％)，攪拌速度30-60rpm)以及34℃的溫度。
為了大規(guī)模生產(chǎn)HAV HM175/7病毒，將生物量為1×1011的VERO細(xì)胞培養(yǎng)物接種在微載體上并37℃在不含血清的培養(yǎng)基的條件下在100L的發(fā)酵罐中進(jìn)行繁殖。將溫度降低到34℃并在隨后的發(fā)酵周期中細(xì)胞數(shù)目增加8到10倍。在最后的發(fā)酵罐中，用感染復(fù)數(shù)為0.01到1.0的HAV對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過持續(xù)灌注細(xì)胞培養(yǎng)基，可以在34℃進(jìn)行感染細(xì)胞的繁殖至350天。當(dāng)在培養(yǎng)基中檢測到病毒抗原時(shí)，收集包含上清液的病毒并保藏在4℃。在感染后35-45天開始收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液。
實(shí)施例2純化病毒收集物將實(shí)施例1的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的病毒收集物通過在ProstakUltrafilter 200K上超濾濃縮100倍，然后將緩沖液更換為50mM的Tris緩沖液pH8.0，0.01吐溫進(jìn)行透濾步驟(Prostak 200K，Diafilter)。通過用Benzonase(Sigma)1000U/L(在1mM MgCl2中)在室溫下培養(yǎng)Diaretenate 3小時(shí)來除去可能存在于制劑中的殘余寄主細(xì)胞核酸。隨后，添加濃度為0.5到5U/ml的純化的灰色鏈霉菌(SGT)的胰蛋白酶類微生物蛋白酶，并且在室溫下進(jìn)一步培養(yǎng)保留物24小時(shí)。將寄主細(xì)胞污染物，即核酸和/或蛋白通過在100K膜上用20mM PBS pH7.4作為緩沖液的滲濾法除去。
實(shí)施例3HAV的最初純化效率使用兩種細(xì)胞培養(yǎng)收集物在連續(xù)發(fā)酵過程期間以不同時(shí)間間隔對第一個純化步驟的效率進(jìn)行研究。在通過超濾/透濾后以及酶處理繼之以最終的透濾步驟后，如實(shí)施例2所述進(jìn)行純化并從原材料提取樣品。
A.蛋白質(zhì)印跡分析在每一過濾步驟期間取出包含至少1000ELISA單位/ml HAV抗原的樣品，進(jìn)行SDS-PAGE并進(jìn)行銀染以觀察總蛋白并通過蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行分析以確定HAV特異性抗原。
圖1A顯示了銀染色后各種中間體的蛋白圖譜。在原材料和純化過程的第一中間體中可以檢測到廣泛的多肽(圖1A，泳道1-11)，然而在蛋白酶處理和透濾后只剩下一條輕微的蛋白譜帶(圖1A，泳道14和16)。
通過銀染，HAV特異性衣殼蛋白在原材料和純化的滲濾保留物中都可以檢測到。
利用HAV衣殼蛋白的特異性抗血清進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析鑒定了HAV特異性抗原(圖1B)?？梢娫诩兓^程中除去了HAV前體蛋白(P1)(圖1B，泳道1-11)。用蛋白酶處理后，在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的原材料中檢測到HAV特異性多肽，該多肽不存在于滲濾保留物中，而HAV特異性衣殼蛋白VP1、VP2和VP3不受蛋白酶處理的影響(圖B，泳道14和16)。通過銀染和蛋白質(zhì)印跡分析不同的中間體，清楚地證明了純化過程的效果。
利用因VERO細(xì)胞蛋白而產(chǎn)生的抗血清進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析(圖1C)顯示出在原材料和純化中間體中可檢測到廣泛的主要是高分子量的VERO蛋白。在最終的保留物中，僅僅可檢測到少量的VERO細(xì)胞污染物(圖1C，泳道15-16)。
發(fā)現(xiàn)只利用連續(xù)過濾步驟的初步純化過程在除去寄主細(xì)胞污染物以及病毒前體蛋白中是卓有成效的。高分子量VERO細(xì)胞蛋白通過蛋白酶處理被分解成片段然后通過透濾步驟有效地除去。此外，純化過程產(chǎn)生傳染性HAV粒子的純化制劑。傳染性HAV粒子由三種病毒衣殼蛋白(VP1、VP2、VP3)組成。通過在病毒的成熟和組裝過程中的幾個相繼的裂解，從單個的多肽前體分子(P1)獲得這些蛋白。為了誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫應(yīng)答，認(rèn)為衣殼蛋白必須是折疊的且裝配成正確的結(jié)構(gòu)，而且前體蛋白不能引發(fā)保護(hù)性的免疫應(yīng)答。已經(jīng)證明，前體蛋白對處理的反應(yīng)靈敏并且可以被除去，而病毒衣殼蛋白VP1、VP2和VP3則不受蛋白酶的影響。
因此，在HAV疫苗的生產(chǎn)過程中的第一個純化步驟在去除VERO細(xì)胞蛋白以及不成熟的前體蛋白方面效率很高。
B.HAV抗原含量用測試試劑盒E12(Mediagnost，Tübingen，德國)依照廠商的說明進(jìn)行競爭性EIA。
在稀釋緩沖液中對每一樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋并測定100μl的每一樣品。利用統(tǒng)計(jì)計(jì)算程序(Softmax，Molecular Devices)通過四參數(shù)分析測定抗原的濃度。
C.總蛋白濃度的測定通過市售的雙辛可寧酸(bicinchoninic acid)(BCA)分析(Pierce)，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白制劑相比來進(jìn)行總蛋白含量的確定。
向100μl的每一樣品中添加2ml的BCA溶液并在60℃保溫30分鐘。隨后，利用光度計(jì)在562nm的波長處測定樣品的光密度。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。
D.測定純化HAV的組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)通過連續(xù)的1log稀釋在細(xì)胞培養(yǎng)基中制備的樣品，通過FRhK-4細(xì)胞進(jìn)行TCID50的測定。與生長在微量滴定板上的FRhK-4細(xì)胞平行添加100μl的每一連續(xù)稀釋液8次。
計(jì)算截止值，表示為負(fù)對照微孔的平均光密度。
所有光密度比截止值高兩倍的位置被認(rèn)為是陽性的。通過根據(jù)Poission分布的最大相似法測定TCID50并表示為log10TCID50。
E.利用PCR測定ERO細(xì)胞的DNA濃度如US 5,858,658所述，通過定量PCR測定VERO細(xì)胞的DNA量。
如表1所示，病毒的傳染性(通過TCID50測定的)不受純化過程的影響，而HAV抗原的量減少了大約50％，在第1批中從485,000IU減少到263,940且在第2批中從490,00減少到216,558。
總蛋白的量在第1批由26,670mg減少到37mg且從在第1批由26,100減少到42mg。VERO細(xì)胞的DNA量通過簡單過濾法減少了大約9,000倍。在酶處理和滲濾后，在滲濾保留物中檢測到2.97μg和6.36μg的VERO細(xì)胞DNA。假定20IU相當(dāng)于一個疫苗抗原劑量，在通過過濾初始純化后，經(jīng)計(jì)算VERO細(xì)胞DNA的量/疫苗劑量分別為590pg和230pg。
表1HAV純化效果的測定
此外，純化過程的不同中間體的純度等級是通過用HAV抗原與總蛋白的相對數(shù)量來計(jì)算的。如表2所示，純度等級分別從18.2IU/mg增加到7134IU/mg和從18.8IU增加到5156IU/mg。
表2過濾過程中間體純度等級的評價(jià)
發(fā)現(xiàn)在傳染性HAV粒子失活之前的過濾方法在宿主細(xì)胞污染物的減少方面是穩(wěn)定和高效的。純度的等級增加了大約300倍，而VERO細(xì)胞DNA減少了大約9000倍。在純化過程期間HAV抗原的損失，而并非傳染性的損失最可能是由于除去了病毒特異性前體蛋白像原聚體和五鄰體而致。
因此，在滅活HAV疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用的第一純化步驟在去除宿主細(xì)胞污染物像VERO細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA和不成熟的HAV前體多肽方面是高效的。
實(shí)施例4純化HAV的滅活以及滅活HAV粒子的分離將實(shí)施例3的純化的傳染性甲型肝炎病毒制劑通過用0.1％福爾馬林在37℃溫育120小時(shí)來滅活。
滅活的HAV制劑然后在pH7.3的PBS緩沖液中的0-65％蔗糖梯度上進(jìn)行梯度離心。區(qū)帶離心后通過蛋白質(zhì)印跡分析來研究不同組分(組分11到16)，以及0-65％蔗糖梯度的集合峰組分(組分12到14)。
A.通過抗HAV抗體鑒定純化的HAV通過用特異性多克隆豚鼠的抗HAV衣殼抗體(附圖2B)或多克隆豚鼠的抗VPO抗體(附圖2B)溫育對每一組分進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析而分析HAV抗原。
顯示了單一組分11到16(附圖2A和B，泳道2-7)以及集合組分12到14(圖2 A和B，泳道8)的純化HAV粒子的蛋白模式。在組分12-14(圖2A，泳道3-5和8)中檢測到病毒衣殼蛋白VP1，VP2和VP3。利用對VP0的特異性抗血清對各組分進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，揭示了缺乏VP0前體蛋白且僅僅有衣殼蛋白VP2存在于純化制劑中(圖2B，泳道3-5和8)。因此純化組分僅僅含有獲自細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的成熟HAV病毒體。
B.通過抗VERO抗體檢測純化的HAV通過與特異性多克隆山羊抗VERO細(xì)胞蛋白抗體一起溫育通過蛋白質(zhì)印跡分析對病毒收集物以及每一純化步驟后的樣品進(jìn)行分析來分析HAV抗原(附圖3)。
通過蛋白質(zhì)印跡分析對初始過濾過程的中間體進(jìn)行分析清楚地顯示了純化方法的效果。圖3顯示了利用針對VERO細(xì)胞蛋白而產(chǎn)生的抗血清進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析后的中間體樣品的蛋白模式?？稍诩兓椒ǖ脑疾牧虾偷谝恢虚g體中檢測到廣泛的多肽(附圖3，泳道1-3)，而在蛋白酶處理以及滲濾之后僅留下細(xì)微的蛋白帶(附圖3，泳道4)。在通過例如0-65％蔗糖梯度的最終純化之后，沒有檢測到VERO細(xì)胞的特異性蛋白(附圖3，泳道5)。
純化方法被證明在去除VERO細(xì)胞污染物方面是高效的。通過蛋白酶處理，高分子量的蛋白質(zhì)被分裂成片段且通過之后的在初始純化中的滲濾步驟，通過過濾而被除去。和滅活方法一樣，通過最終純化步驟能有效地去除來自核酸降解試劑和蛋白酶處理的殘余污染物。
C.通過VERO細(xì)胞DNA的PCR鑒定純化的HAV如US 5,858,658所描述的，對集合組分12到14的純化成熟HAV粒子制劑進(jìn)行分析，以分析來自VERO細(xì)胞培養(yǎng)物的污染核酸。對VERO核酸的計(jì)算顯示有少于40pg的VERO核酸/100IU HAV抗原。因此，具有20IU HAV抗原/劑的抗原劑量將具有小于8pg的VERO細(xì)胞核酸。
實(shí)施例5純化的成熟HAV粒子的HAV疫苗用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS pH7.3)和用不同濃度的佐劑配制純化的、滅活的成熟HAV病毒體制劑。作為一個實(shí)例，使用佐劑氫氧化鋁。以0.05％，0.1％和0.2％(w/v)的最終濃度把氫氧化鋁加到純化的制劑中。測試制劑以測定佐劑對抗原的吸附。連續(xù)稀釋測試的物質(zhì)但不改變佐劑的濃度。給由10小鼠組成的測試組中的每一只皮下注射0.5ml的制劑，免疫該動物4周后分析血清的轉(zhuǎn)化率(ED50有效劑量)、抗體滴度和中和活性。結(jié)果顯示在表3和4中。
表3顯示了在不同佐劑濃度時(shí)抗原制劑的血清轉(zhuǎn)變比率和ED50值。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在組合物中較低濃度(0.05％)的佐劑對于誘導(dǎo)較高的血清轉(zhuǎn)變率比用較高濃度的佐劑(0.2％)更為有利。因此，對于本發(fā)明的成熟HAV粒子的純化制劑，在低濃度佐劑存在下要使動物50％的血清發(fā)生轉(zhuǎn)變只需較少的病毒抗原。
表3用不同濃度的HAV抗原和佐劑免疫小鼠時(shí)的血清轉(zhuǎn)變比率和ED50值
表4用不同濃度的HAV抗原和佐劑免疫小鼠時(shí)的抗體滴度和中和抗體滴度
表4的結(jié)果表明，在免疫原性制劑中相同的抗原濃度依賴于佐劑濃度而誘導(dǎo)不同的抗體滴度。佐劑濃度較低時(shí)的抗體滴度高于佐劑濃度較高時(shí)的。在相同的HAV抗原濃度和不同佐劑的濃度時(shí)誘導(dǎo)的中和抗體滴度是相當(dāng)?shù)?。因此，本發(fā)明的含有成熟HAV粒子的純化制劑的免疫原性組合物在低濃度的佐劑時(shí)顯示出增加的免疫原性。
含有低濃度的佐劑(0.05％)和不含有任何佐劑的HAV疫苗的比較免疫研究顯示在豚鼠表5中。
表5用含有和不含有佐劑的HAV疫苗免疫動物
表3-5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可顯著地減少有效疫苗劑量中的抗原和佐劑濃度來誘導(dǎo)抗HAV感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。甚至，沒有任何佐劑的疫苗的免疫原性和效果與含有低濃度佐劑的疫苗的相當(dāng)。
實(shí)施例6本發(fā)明的兩種已被許可的HAV疫苗的比較A.免疫原性的比較比較本發(fā)明的兩種已被許可的包含成熟的HAV病毒體的純化制劑的疫苗與市售的疫苗，VAQTA50U(MERCK)和HAVRIX1440(Smithkline Beecham)的免疫原性，其中所述的成熟HAV病毒體具有15-20IU的HAV抗原含量和0.05％最終濃度的Al(OH)3。疫苗被連續(xù)稀釋但不改變鋁的濃度。用0.5ml的不同疫苗制劑通過皮下給藥方式免疫測試組的小鼠。匯集每一組的血清并如實(shí)施例5所述測定抗體滴度和中和抗體。
表6顯示了用不同疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度和中和抗體滴度。當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明的未稀釋的疫苗時(shí)得到較高的抗體滴度?；旌涎宓目贵w滴度為3541mIU/ml，用本發(fā)明疫苗得到的抗體滴度為15-20IU ml。未稀釋的已被許可的疫苗VAQTA和HAVRIX能夠分別誘導(dǎo)2541mIU/ml和691mIU/ml的滴度。對匯集的血清的中和活性進(jìn)行的分析證明了用本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)了較高的中和抗體滴度。
表6不同疫苗的抗體滴度和中和抗體滴度的比較數(shù)據(jù)
盡管不同的市售疫苗的抗原含量沒有標(biāo)準(zhǔn)化且每個種疫苗的生產(chǎn)具有其自己的測試系統(tǒng)，然而侯選疫苗和市售疫苗的免疫原性可通過免疫實(shí)驗(yàn)以及通過血清轉(zhuǎn)變和抗體滴度測定的對免疫應(yīng)答的有效誘導(dǎo)來進(jìn)行比較。對比較數(shù)據(jù)的分析證明了15-20IU濃度的本發(fā)明的成熟HAV粒子的純化制劑和低濃度的佐劑(或無佐劑)能夠誘導(dǎo)有效的抵抗HAV的免疫應(yīng)答。
B.疫苗中HAV粒子的比較通過用抗VP0、抗VP1和抗VP3抗體的單克隆抗體的混合物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析來比較本發(fā)明的HAV制劑與兩種市售的疫苗VAQTA和HAVRIX。
如圖4所示，本發(fā)明的制劑僅僅由成熟的HAV粒子組成，由于檢測到VP2是通過蛋白水解裂解從前體多肽VP0獲得的并且是成熟病毒體的一部分，而VP0僅僅存在于前病毒體和缺陷型病毒體中。市售疫苗同樣包括前病毒體和前原病毒體(preprovirions)，然而其數(shù)量大于成熟粒子。這些觀察被Armstrong等人的發(fā)現(xiàn)所證實(shí)(1993，J.Hepatol，820-26)VAQTAHAV疫苗含有3∶1的空的前病毒體和完全成熟的粒子。
實(shí)施例7由鏈霉蛋白酶純化灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)胰蛋白酶
A.離子交換色譜將30g的鏈霉蛋白酶(Boehringer Ingelheim)溶于緩沖液A(0.02吡啶，pH5.0)中，最終濃度為40mg鏈霉蛋白酶/ml。將25ml的該溶液置于用緩沖液A平衡的CM瓊脂糖凝膠C1 6B(Pharmacia)上進(jìn)行陽離子交換層析。在室溫下利用5倍柱體積的緩沖液A(0.02M吡啶)和緩沖液B(0.75M吡啶pH5.0)的線性梯度進(jìn)行洗脫。
被通過以1∶10的比率混合組分的樣品和大豆抑制因子，然后利用S2222進(jìn)行色譜底物分析來測定所收集的組分抑制特性(例如，1mg大豆抑制因子/100μg蛋白)。結(jié)果被表示為每分鐘的吸光度單位(ΔA/min)。進(jìn)一步通過SDS-PAGE并用考馬斯染色分析對大豆抑制因子具有最高抑制活性的組分。
通過利用N-苯甲?；?L-精氨酸乙酯(BAEE，在Tris緩沖液中，pH8.0，20mM CaCl2，25℃)作為底物并測定每分鐘的吸光率單位進(jìn)行產(chǎn)色分析來測定胰蛋白酶活性。使用具有13×103U/mg比活度的豬胰蛋白酶溶液(1mg/ml)作為對照參考。比活度被定義為每毫克蛋白的胰蛋白酶酶活單位。結(jié)果被概括在表7中。
通過利用3-羧基甲氧基丙?；?L-精氨?；鵏-丙基-L-酪氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽(S-2586，Chromogenix)進(jìn)行產(chǎn)色分析來測定糜蛋白酶活性。結(jié)果被表示為每分鐘的吸光率單位(ΔA/min)。
表7通過離子交換色譜純化鏈霉蛋白酶
n.d.未測定表7顯示，包含具有類胰蛋白酶活性的蛋白的組分，通過用大豆抑制因子進(jìn)行的抑制試驗(yàn)測定，可通過離子交換色譜法來純化而具有比鏈霉蛋白酶高大約10倍的比活度以及具有大約70％的回收率。然而，蛋白是不穩(wěn)定的且在SDS-PAGE上不顯示為一個單一的條帶，而是顯示為不同的條帶。這指示蛋白發(fā)生了斷裂和自動裂解。
B.在固定化的芐脒上進(jìn)行親和層析在用緩沖液A(50mM Tris，0.5M NaCl pH7.0)平衡的芐脒瓊脂糖6B速流(Pharmacia)柱上裝載40ml的鏈霉蛋白酶溶液(75mg/ml，緩沖液A)。用緩沖液B(50mM Tris，0.5M NaCl pH7.0，10mM芐脒鹽酸鹽pH7.0)，緩沖液C(0.5M NaCl，0.6M精氨酸，pH5.5)或緩沖液D(0.5M NaCl，1M精氨酸，pH5.5)進(jìn)行洗脫。
如實(shí)施例7A所述，利用大豆抑制因子測定所收集的組分的抑制特性，以及胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性。比活度被測定為每毫克蛋白的酶活力單位。
表8通過親和層析在固定化的芐脒上純化鏈霉蛋白酶以及用芐脒洗脫
概括在表8中的結(jié)果表明，通過用芐脒進(jìn)行競爭性洗脫，60％的純化的鏈霉蛋白酶的胰蛋白酶樣活性得到回收并具有大約140U/μg蛋白的比活度。然而，優(yōu)選將包含純化的胰蛋白酶樣蛋白酶的組分進(jìn)一步純化，且在應(yīng)用于人的與細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)或生物制品生產(chǎn)有關(guān)的方法之前除去芐脒。
表9通過親和層析在固定化的芐脒上純化鏈霉蛋白酶并用0.6M精氨酸和1M精氨酸洗脫
由表9的結(jié)果可見，當(dāng)利用含有0.6M精氨酸的緩沖液時(shí)，約63％的鏈霉蛋白酶的初始胰蛋白酶類活性得到回收，而使用含有1M精氨酸的緩沖液時(shí)，約71％的活性得到回收。用精氨酸從芐脒親合載體上洗脫下來的純化SGT與通過離子交換色譜法或用芐脒從芐脒載體上洗脫下來的SGT相比同樣具有較高的比活度。
此外，當(dāng)使用含有增加的克分子濃度的精氨酸時(shí)獲得了較高純度和比活度的產(chǎn)物。
提供上述實(shí)施例用來說明本發(fā)明然而并非是對其范圍的限制。其它對本發(fā)明的改變對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說將是顯而易見的并且包括在所附的權(quán)利要求書中。所有在這里引用的出版物、專利和專利申請都被引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)完全的HAV粒子的方法，包括下列步驟用核酸降解試劑和蛋白酶處理來自HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的HAV制劑，以及分離所述的完全的HAV粒子的純化制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，它進(jìn)一步地包括在用所述的核酸降解試劑和蛋白酶之前處理濃縮所述的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其包括通過過濾來濃縮所述的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的核酸降解試劑是一種酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的酶是一種脫氧核糖核酸酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶是一種微生物蛋白酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的蛋白酶是鏈霉蛋白酶或其酶促活性組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的蛋白酶是純化的灰色鏈霉菌胰蛋白酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的細(xì)胞培養(yǎng)物是一種VERO細(xì)胞培養(yǎng)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的細(xì)胞被培養(yǎng)在不含血清或不含血清和蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基上。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10中任意一項(xiàng)的方法，其中通過過濾來分離所述純化的完全HAV粒子的制劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的完全HAV粒子的制劑具有小于大約30pg的污染核酸/IU HAV抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到12中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的完全HAV粒子的制劑具有至少大約5000IU的HAV抗原/毫克蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到13中任意一項(xiàng)的方法，它進(jìn)一步包括用一種病毒滅活試劑處理完全HAV粒子的制劑的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到14中任意一項(xiàng)的方法，它進(jìn)一步包括從所述的完全HAV粒子的制劑中分離純化的成熟HAV病毒體的步驟。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的制劑基本上不含來自細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基的污染蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法，其中所述制劑具有小于大約0.5pg的污染核酸/IU HAV抗原。
18.根據(jù)權(quán)利要求15到17中任意一項(xiàng)的方法，它進(jìn)一步包括用一種病毒滅活試劑處理純化的HAV粒子的步驟。
19.一種不含HAV前體多肽和污染的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白的完全HAV粒子的制劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的制劑，其中所述制劑具有小于大約30pg的污染核酸/IU HAV抗原。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的制劑，其中所述制劑具有至少大約5000IU的HAV抗原/毫克蛋白。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的制劑，它由滅活的、純化的完全HAV粒子組成。
23.一種純化的成熟HAV粒子的制劑，它不含有HAV前體多肽和污染的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的制劑，它不含HAV前病毒體。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的制劑，其中所述制劑具有少于大約0.5pg的來自細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物的的污染核酸/IU HAV抗原。
26.根據(jù)權(quán)利要求23或24的制劑，它由滅活的、純化的成熟HAV粒子組成。
27.一種生產(chǎn)純化的完全HAV粒子制劑的方法，它包括通過過濾從HAV感染細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中純化完全的HAV粒子。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，它進(jìn)一步地包括用一種病毒滅活試劑處理所述的制劑。
29.一種生產(chǎn)純化的成熟HAV粒子制劑的方法，它包括通過過濾和離心從HAV感染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中純化成熟的HAV粒子。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，它進(jìn)一步地包括用一種病毒滅活試劑處理。
31.一種從HAV感染的細(xì)胞的不含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中分離完全的HAV粒子的方法，包括下列步驟用核酸降解試劑和蛋白酶處理獲自HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液的HAV制劑，以及分離所述的完全HAV粒子的純化制劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述的制劑不含HAV前體多肽。
33.一種HAV感染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的HAV收集物中分離成熟的HAV粒子的方法，包括下列步驟用核酸降解試劑和蛋白酶處理來自HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液的HAV制劑，分離所述的完全HAV的純化制劑，以及從所述的完全HAV粒子的制劑分離由成熟的HAV粒子組成的制劑。
34.一種用于生產(chǎn)HAV疫苗的方法，包括下列步驟用核酸降解試劑和蛋白酶處理來自HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的HAV制劑，分離所述的完全HAV粒子的純化制劑，以及制備含有由純化的、完全的HAV病毒體組成的制劑的免疫原性組合物。
35.一種用于生產(chǎn)HAV疫苗的方法，包括下列步驟用核酸降解試劑和蛋白酶處理來自HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液的HAV制劑，分離所述的完全HAV粒子的純化制劑并從所述的完全HAV粒子的制劑中分離純化的成熟HAV病毒體，以及制備含有由純化的、成熟HAV病毒體組成的制劑的免疫原性組合物。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述的疫苗基本上不含有來自細(xì)胞培養(yǎng)物的污染蛋白。
37.一種用于生產(chǎn)滅活的HAV疫苗的方法，包括下列步驟用核酸降解試劑和蛋白酶處理來自HAV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液的HAV制劑，分離所述的完全HAV粒子的純化制劑并從所述的完全HAV粒子的制劑中分離純化的成熟HAV病毒體，以及制備含有制劑的免疫原性組合物，其中在分離成熟的HAV病毒體顆粒之前或之后用滅活試劑處理所述的HAV制劑。
38.一種含有宿主保護(hù)量的權(quán)利要求23到26中任意一項(xiàng)的成熟HAV粒子制劑的HAV疫苗。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的疫苗，其中所述的制劑不含HAV前體多肽和HAV前病毒體。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或39的疫苗，其中所述的宿主保護(hù)量是小于大約25IU的HAV抗原/劑。
41.根據(jù)權(quán)利要求38或39的疫苗，其中所述的宿主保護(hù)量為大約10至大約25IU的HAV抗原/劑。
42.根據(jù)權(quán)利要求38到41中任意一項(xiàng)的疫苗，它含有一種免疫刺激試劑。
43.根據(jù)權(quán)利要求38到42中任意一項(xiàng)的疫苗，它進(jìn)一步含有乙型肝炎病毒抗原。
44.根據(jù)權(quán)利要求38到43中任意一項(xiàng)的疫苗，它進(jìn)一步含有一種來自病毒或細(xì)菌性病原體的抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供了從感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中純化甲型肝炎病毒以及制備純化的HAV抗原制劑的方法。本發(fā)明也涉及一種包含一種制劑的HAV疫苗組合物，其中所述的制劑含有一定量的足以在哺乳動物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的純化的成熟HAV粒子。
文檔編號C12N15/09GK1617741SQ02827827
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月10日
發(fā)明者C·陶爾, H·邁爾, A·米特雷爾, N·巴雷特 申請人:巴克斯特健康護(hù)理股份有限公司