專利名稱：細(xì)胞內(nèi)制備單鏈dna的制作方法
交叉參照相關(guān)申請此申請要求2001年12月14日提交的美國臨時申請No.60/340,803的權(quán)利。
美國政府對此發(fā)明擁有一定的權(quán)利，因為本發(fā)明由國立衛(wèi)生研究院(NIH)資助，編號為RO1 GM54731和RO1CA64186。
背景技術(shù)：
基因治療可以通過將異種DNA導(dǎo)入一種宿主細(xì)胞的方法來定義或通過在細(xì)胞內(nèi)改變內(nèi)源基因表達(dá)的方法來定義。這樣，基因治療方法可用于改變細(xì)胞的表型和/或基因型。一個例子是反義治療領(lǐng)域。在反義治療中，核酸分子被導(dǎo)入一種細(xì)胞，在那里該核酸分子雜交或結(jié)合于一種編碼特殊蛋白的mRNA。此反義分子結(jié)合于某種類mRNA降低了該mRNA的翻譯效率和速率。
改變細(xì)胞基因型的方法通常依賴導(dǎo)入該細(xì)胞中一個缺陷基因的一個完整置換拷貝、一個異源基因或一個小核酸分子如一條寡核苷酸來治療人類、動物和植物遺傳性疾病。被導(dǎo)入的基因或核酸分子通過隨機(jī)整合來補(bǔ)充內(nèi)源基因。這些途徑需要復(fù)雜的傳遞系統(tǒng)將置換基因?qū)爰?xì)胞中，比如基因工程化的病毒或病毒載體。基因治療正被用于人類已較了解的遺傳性疾病的實驗性治療，例如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、囊性纖維化和鐮狀細(xì)胞性貧血。然而，在體內(nèi)效率低下，因為實際上導(dǎo)致缺陷基因整合的重組事件是有限的。此外，基因能整合到染色體的某些部位，在那里或者表達(dá)受到限制，或者導(dǎo)致有害的結(jié)果，比如誘導(dǎo)某種癌基因。
通過基因替代對基因組有目的的修飾作為一種研究工具在基因治療中是有價值的。容易的方法是將新基因?qū)氩溉轭悇游锛?xì)胞，但該方法同源整合的頻率是有限的(Hanson et al.，(1995)Mol.Cell.Biol.15(1)，45-51)，并且分離具有位點特異性基因插入的細(xì)胞需要篩選程序(Capecchi，M.R.，(1989)Science 244(4910)，1288-1292)。以稀有核酸內(nèi)切酶而致雙鏈斷裂形成的位點特異性DNA損傷，在幾個細(xì)胞系統(tǒng)里可在染色體基因座位促進(jìn)染色體的同源重組，但這種操作方法需要將識別序列提前插入座位。
自從多年前Felsenfeld等，J.Am.Chem.Soc.792023(1957)最初發(fā)現(xiàn)三鏈DNA，由寡核苷酸引導(dǎo)的三鏈體(triplex)形成已經(jīng)成為分子生物學(xué)中一種有價值的工具。近來的知識提示寡核苷酸可以作為DNA的第三條鏈以一種序列特異性的方式結(jié)合于雙鏈DNA多聚嘌呤/多聚嘧啶的大溝中。在一個基序中，多聚嘧啶寡核苷酸以與二聚體中的嘌呤鏈平行的方向結(jié)合，如Moser和Dervan，Science 238645(1987)，Praseuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA851349(1988)，和Mergny等，Biochemistry 309791(1991)描述。在交替嘌呤基序中，多聚嘌呤鏈以與嘌呤鏈反向平行方向結(jié)合，如Beal和Dervan，Science2511360(1991)所描述。三鏈體形成的特異性源于氫鍵連接的堿基三聯(lián)體(嘌呤基序中的AAT和GGC)。錯配使該三鏈體(triple helix)不穩(wěn)定，如Mergny等，Biochemistry 309791(1991)和Beal和Dervan，Nuc.Acids Res.112773(1992)描述。
單鏈DNA(ssDNA)對一些分子生物學(xué)技術(shù)而言是有用的。單鏈DNA可以以序列特異性方式結(jié)合雙鏈DNA形成三股螺旋(triple helices)(Giovannangeli等，2000，Curr Opin.Mol.Ther.，2，288-296；Chan等，1997，JMol.Med.75，267-282)。在下文中提到的這種單鏈DNA指形成三鏈體的寡核苷酸(triplex forming oligonucleotide)，或TFO。研究顯示三鏈體形成能抑制基因表達(dá)(Faria et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，3862-3867；Kim等，1998，Biochemistry，37，2299-304)以及在哺乳類動物細(xì)胞中通過定向突變或被誘導(dǎo)的基因重組來介導(dǎo)靶基因組的修飾(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97，9003-9008 Vasquez et al.，2000，Science，290，530-533)。研究顯示TFO刺激重組的能力分別有賴于XPA和Rad51(Datta et al.，2001，J BioL Chem.，27，18018-18023；Faruqi et al.，2000，Mol.Cell.Biol.，20，990-1000)，以及核苷酸剪切修復(fù)和同源重組相關(guān)的因素。這些結(jié)論與三鏈體結(jié)構(gòu)驅(qū)使DNA修復(fù)的驗證研究相一致(Wang et al.，1996，Science，271，802-805)。
美國專利5,962,426和6,303,376至Glazer等描述了使用TFO來誘導(dǎo)位點特異性突變和/或供體寡核苷酸重組用于基因治療。研究證實一個富含G的30-mer TFO(AG30)，當(dāng)被轉(zhuǎn)染到小鼠纖維母細(xì)胞系(FL-10)時，能夠誘導(dǎo)染色體底物中單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)基因同向重復(fù)(direct repeat)拷貝間的重組，在該染色體中三鏈體形成靶點被置于基因間(Luo et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，97，9003-9008)。通過丙胺基團(tuán)的修飾，所述AG30 TFO的3’端受到保護(hù)從而免于降解，并且或者通過與陽離子脂質(zhì)體混合或者直接經(jīng)由微注射被轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。盡管脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了特異的和可檢測的重組誘導(dǎo)，但顯微注射卻產(chǎn)生高于300倍以上的重組體頻率。另外，高親和力、形成三鏈體的寡核苷酸和它的應(yīng)用方法已被描述并且被用于與一個目標(biāo)DNA分子的一個特異性DNA片斷形成三鏈核酸分子。在三鏈體形成時，寡核苷酸的結(jié)合在體內(nèi)應(yīng)用細(xì)胞DNA合成或修復(fù)機(jī)制刺激了目標(biāo)序列內(nèi)或其臨近的突變發(fā)生而沒有重組。
上述方法的缺點在于它們需要TFO誘導(dǎo)和，任選地，為進(jìn)行重組需要供體DNA進(jìn)入將被改造的細(xì)胞。而在體內(nèi)絕大多數(shù)傳遞方法效率很低。
因此提供一種在細(xì)胞內(nèi)傳遞提供大量TFO和/或用于重組的供體DNA的方法是本發(fā)明的一個目的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生具有介導(dǎo)三鏈體(triplex)依賴性或非依賴性染色體事件活性的單鏈DNA分子的方法。本方法所依據(jù)的發(fā)現(xiàn)即是將病毒載體或質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，它們在將被改造的細(xì)胞內(nèi)生成單鏈DNA分子，該DNA分子結(jié)合于目標(biāo)染色體DNA形成三鏈體，從而可以誘導(dǎo)所需要的突變，和/或基因重組并通過摻入供體DNA誘導(dǎo)染色體DNA的改變。上述載體或質(zhì)粒不僅可編碼TFO和任意供體DNA，而且可編碼逆轉(zhuǎn)錄酶，和任選限制酶，其在優(yōu)選實施例中呈現(xiàn)為一種融合蛋白形式，逆轉(zhuǎn)錄上述載體或質(zhì)粒編碼的RNA，接著在限制酶切位點切割產(chǎn)生單鏈DNA。該單鏈DNA可以被直接生成或最初作為雙鏈莖-單鏈環(huán)結(jié)構(gòu)(double stranded stem-single stranded loopstructure)，然后被切割生成單鏈DNA。
一旦在體內(nèi)產(chǎn)生，這些高親和力、形成三鏈體的寡核苷酸就被靶向到染色體序列，在那里它們結(jié)合并誘導(dǎo)染色體事件。這類事件包括重組、基因轉(zhuǎn)變、核苷酸取代、核苷酸缺失、核苷酸插入、在染色體位點改變或校正遺傳缺陷。所述突變或重組導(dǎo)致活化、滅活或改變靶基因的活性及功能的變化。若靶基因包含引起遺傳病的突變，那么這種寡核苷酸對恢復(fù)靶基因DNA序列至正常的誘變或重組的修復(fù)是有用的。如果靶基因是病毒存活或復(fù)制所需的病毒基因或是引起不受調(diào)控增生的癌基因，比如存在于癌細(xì)胞中的，那么所述誘變寡核苷酸導(dǎo)致突變是有益的，該突變滅活上述基因使其失去功能或阻止病毒的復(fù)制或者終止或減少癌細(xì)胞的不受控的增生。所述誘變寡核苷酸還是一種有用的抗癌劑，活化已經(jīng)失去其抑制增殖能力的阻抑物基因。
該形成三鏈體的寡核苷酸還可以用作一種分子生物學(xué)研究工具在一個細(xì)胞中引起靶向突變。靶向突變對于靶向正?；蚝蛯χT如DNA修復(fù)或基因組功能的任何類型的機(jī)理研究是有用的。動物卵母細(xì)胞中特異基因的靶向突變，比如一個小鼠的卵母細(xì)胞，提供了一種強(qiáng)而有用的工具，用于研究基因工程、治療及用于科研和農(nóng)業(yè)的新的“衍變(transmutated)”動物、植物株的生成。形成三鏈體的寡核苷酸作為分子研究工具在功能基因組領(lǐng)域是尤為有用的。
附圖簡述

圖1在哺乳類動物細(xì)胞中產(chǎn)生單鏈DNA的載體系統(tǒng)的設(shè)計。(A)載體pssXA表達(dá)由勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子驅(qū)動的RT-MboII融合蛋白。它還攜帶一個新霉素的抗性基因作為可選標(biāo)記。pssXB(AG30)被改造從而由巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子啟動表達(dá)一個這樣的轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本含有位于NotI位點內(nèi)的所需插入序列。設(shè)計該轉(zhuǎn)錄本使其還摻入MoMuLV RT的核心啟動子部位，因此允許生成其中含有插入序列的一條鏈的cDNA。(B)pssXB(AG30)載體的部分DNA序列。插入到pssXB Not1位點可生成pssXB(AG30)的片斷序列用印刷體大寫字母形式列出，其具有用粗體列出的AG30 TFO序列。所述LUIboII和NotI位點分別用下劃線和斜體標(biāo)出。(C)莖環(huán)結(jié)構(gòu)預(yù)測由pssXB(AG30)來源的轉(zhuǎn)錄本反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA形成。被預(yù)測在莖中形成的MboII識別位點和預(yù)期的MboII切割位點被指出。逆轉(zhuǎn)錄酶可與本領(lǐng)域已知的任何限制酶融合。例如，所述酶可選自如下的酶，但并不限于此EcoRI、MboI、HindIII、BamHI、NdeI、BglI、NotI、Pst1、SacI、SceI、SspI、或XbaI。，酶的篩選將與被切割的位點相一致。將逆轉(zhuǎn)錄酶融合到稀有切割酶上是令人期待的。比如一個18堿基對剪切器(cutter)，象SceI，限制消化特定的染色體DNA。(D)基于(C)中AllbolI切割的假定模式，預(yù)測34核苷酸單鏈DNA產(chǎn)物(AG34)產(chǎn)生自pssXA和pssXB(AG30)的聯(lián)合轉(zhuǎn)染。包含于AG34中的30核苷酸(nt)的AG30 TFO序列加下劃線標(biāo)出，從3′端額外的4nt區(qū)分出AG34中的該部分。
圖2。(A)單鏈DNA產(chǎn)物的序列。AG34和rev34與AG30(下劃線標(biāo)出)的比較，所述AG34和rev34預(yù)期分別由pssXA加pssXB(AG30)和pssXA加pssXB(rev)產(chǎn)生。(B)靶底物被設(shè)計用來研究由TFO誘導(dǎo)的染色體內(nèi)重組。LTK細(xì)胞在單一染色體座位攜帶TK基因的兩個突變拷貝為同向重復(fù)，其側(cè)面連接于一個多聚嘌呤三鏈結(jié)合位點，被用來檢測由載體產(chǎn)生的單鏈DNA在介導(dǎo)三鏈體形成和重組誘導(dǎo)方面的能力。該TK基因在指示的位置攜帶由XhoI連接子插入組成的滅活突變。潛在的重組體確定為生長于選擇性HAT培養(yǎng)基的TK+克隆。
發(fā)明詳述此處所描述的方法提供單鏈DNA分子，該分子在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并在介導(dǎo)有待治療的細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞區(qū)域(compartment)內(nèi)三鏈體依賴和/或重組基因的染色體事件中是有活性的。有三種基本情況(1)單鏈DNA與靶染色體DNA結(jié)合以形成足可以誘導(dǎo)位點特異性突變的三鏈體；(2)其中單鏈DNA結(jié)合靶染色體DNA并誘導(dǎo)該染色體DNA重組；和(3)(1)和(2)的組合，其中單鏈DNA既可形成三鏈體又可與靶染色體DNA重組。在此情況下，單鏈DNA可單獨(dú)由形成三鏈體的序列所組成，形成三鏈體的序列與重組基因序列連接，或者可以有兩個單鏈DNA，一個用以形成三鏈體，另一個是用于基因重組的(recombinagenic)。
這些寡核苷酸在將在被載體或質(zhì)粒改造的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，所述載體或質(zhì)粒既可在細(xì)胞內(nèi)生成寡核苷酸又可生成一種既是逆轉(zhuǎn)錄酶又是限制酶的融合蛋白。
雖然現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)我們能夠單獨(dú)應(yīng)用形成三鏈體的寡核苷酸或與重組基因的寡核苷酸結(jié)合應(yīng)用，但人們在知道單鏈DNA可被攝入胞核并能有效地向染色體DNA中導(dǎo)入改變之前，必須為確定形成三鏈體的寡核苷酸或重組基因的寡核苷酸是否能夠以病毒載體或質(zhì)粒的形式被導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行研究，還必須研究加工所述寡核苷酸的方法。
此處描述的方法是高度特異和有效的，并使基因工程改造的效率與寡核苷酸外源傳送入細(xì)胞相比，大大提高。
I.單鏈DNA分子形成三鏈體或重組于靶染色體序列。
如上所述，單鏈DNA分子可以是形成三鏈體的寡核苷酸、重組基因的寡核苷酸(recombinagenic oligonucleotide)，或者是它們的組合。
A.形成三鏈體的寡核苷酸TFO被定義為形成三鏈體的寡核苷酸，它以序列特異性方式作為第三條鏈與雙鏈DNA結(jié)合。優(yōu)選“TFOs”是單鏈DNA。單鏈DNA可以與雙鏈DNA形成三條鏈，也可以不與雙鏈DNA形成三條鏈。單鏈DNA能1)與雙鏈DNA一起形成三股螺旋(triple helices)，2)重組到靶染色體序列，或3)作為染色體片斷體內(nèi)修復(fù)的模板。此點下面會進(jìn)一步描述。
優(yōu)選的將會形成三鏈體結(jié)構(gòu)的條件是體外誘變的標(biāo)準(zhǔn)測定條件和體內(nèi)誘變的生理條件。(參見例如，Moser和Dervan，Science238645(1987)；Praseuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 851349(1988)；Mergny等，Biochemistry 309791(1991)；Beal和Dervan，Science 2511360(1991)；Mergny等，Biochemistry 309791(1991)及Beal和Dervan，Nuc.Acids Res.112773(1992)，它們納入本文作參考)。
三鏈體形成的一個有用指標(biāo)是三鏈體的平衡解離常數(shù)Kd，這可以用三鏈體形成到最大值的一半時寡核苷酸的濃度估算。優(yōu)選，寡核苷酸在生理性交互作用范圍內(nèi)對靶序列具有結(jié)合親和力。優(yōu)選的寡核苷酸具有的Kd約小于或等于10-7M。最優(yōu)選的，Kd小于或等于2×10-8M以實現(xiàn)顯著的細(xì)胞內(nèi)交互作用。有許多種方法可用來確定一個寡核苷酸/靶堿基對的Kd值。
在一個實施方案中，產(chǎn)生了高親和力的寡核苷酸(Kd＜2×10-8)，該寡核苷酸與靶基因DNA的特異性DNA片段形成三鏈。高親和力寡核苷酸的Kd小于或等于2×10-6是優(yōu)選的。更優(yōu)選高親和力寡核苷酸的Kd小于或等于2×10-7。高親和力寡核苷酸的Kd低于2×10-8甚至是更優(yōu)選的。高親和力寡核苷酸的Kd低于2×10-9是最優(yōu)選的。
寡核苷酸結(jié)合染色體靶基因或靶區(qū)域內(nèi)的靶序列，形成三螺旋區(qū)域。優(yōu)選，雙鏈分子的靶區(qū)域包含或毗鄰靶基因的缺陷或必須部分，比如能引起遺傳缺陷的突變部位，引起癌基因活化的部位，或引起對癌基因抑制子的抑制或滅活的部位。最優(yōu)選，這種基因是人類基因。
較好地，該寡核苷酸是長度在7和40核苷酸之間的單鏈核酸分子，用于體內(nèi)染色體的修飾，長度在10到30核苷酸最優(yōu)選。堿基構(gòu)成最好是同源嘌呤(homopurine)或同源嘧啶(homopyrimidine)。或者，堿基構(gòu)成是多聚嘌呤或多聚嘧啶。然而，其它構(gòu)成也是有用的。
在此描述的該寡核苷酸的核苷酸序列是依據(jù)所述靶序列的序列、為滿足寡核苷酸結(jié)合于靶區(qū)域大溝的需要所施加的物理約束力和寡核苷酸/靶序列之間有一個低的解離常數(shù)(Kd)的需要來選擇的。該寡核苷酸將有這樣的堿基構(gòu)成，該堿基構(gòu)成有助于三鏈體的形成，并且該寡核苷酸為第三鏈的結(jié)合將基于已知結(jié)構(gòu)基序之一而制成。在后面的實例所使用的基序中(反向平行嘌呤基序)，當(dāng)有GC配對時，G被使用，當(dāng)靶序列中有AT配對時，A就被使用。當(dāng)有插入，CG或TA對時，另外的殘基被使用，例如，對TA對來說，T就被使用。對第三鏈結(jié)合寡核苷酸的堿基構(gòu)成的論述在美國專利No.5,422,251中已經(jīng)提供。
優(yōu)選的是，寡核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)和高特異的條件下結(jié)合到靶核酸分子。最好該寡核苷酸以序列特異的方式結(jié)合在雙鏈DNA的大溝內(nèi)。針對一個核酸序列的一個寡核苷酸或引物在體外三鏈體形成的反應(yīng)條件隨寡核苷酸的改變而改變，取決于像寡核苷酸的長度、G:C和A:T堿基對的數(shù)目以及結(jié)合反應(yīng)中所用緩沖液的成份?；诘谌龡l鏈結(jié)合密碼，一個與雙鏈核酸分子的靶區(qū)域充分互補(bǔ)的寡核苷酸是優(yōu)選的。如此處所用的，如果說一個寡核苷酸與一個靶區(qū)域充分互補(bǔ)，那么該寡核苷酸就有一個允許與靶區(qū)域形成三鏈體的堿基構(gòu)成。這樣，一個寡核苷酸與靶區(qū)域充分互補(bǔ)，即使該寡核苷酸中存在非-互補(bǔ)堿基。有許多的結(jié)構(gòu)基序是有用的，它們可被用來確定一個充分互補(bǔ)的寡核苷酸的核苷酸序列。
B.基因重組或供體DNA分子基因重組供體(recombinagenic donor)DNA片段是與靶序列同源的。供體分子優(yōu)選長度是在35-1500個核苷酸之間；長度在50-500個核苷酸之間更優(yōu)選?？梢岳斫猓绢I(lǐng)域中與靶DNA同源位置的數(shù)量越大，該片段被重組到靶序列、靶區(qū)域、或靶位點的概率就越大。此處應(yīng)用的術(shù)語“基因重組的((recombinagenic)”被用來定義能夠重組到靶位點或序列的DNA片段、寡核苷酸，或成分(composition)。
所述重組基因供體DNA可產(chǎn)生自載體或質(zhì)粒，作為與形成三鏈體的DNA分子分離的DNA分子或通過混合序列接頭與形成三鏈體的寡核苷酸連接。所述核苷酸接頭是可變的，有賴于與三鏈體形成相關(guān)的所需染色體變化的定位。然而，接頭長度在1-100核苷酸之間是較好的。接頭長度在1-15核苷酸之間更好。所述DNA供體和TFO可被直接連接(亦即，沒有一個接頭序列)。
經(jīng)由三鏈體形成，這種“供體連接”的排列促進(jìn)靶位點的識別，并且同時為可能的重組和信息轉(zhuǎn)移定位供體片段。這種策略也打算用于開發(fā)三螺旋自身激發(fā)DNA修復(fù)的能力，潛在地增加與同源供體DNA重組的可能性。以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)用于與人類細(xì)胞提取物(亦即，不是在細(xì)胞內(nèi))接合，以促進(jìn)靶向重組(Datta等，2001，J.Biol.Chem.，27，18018-18023；chan等，1999，J.Biol.Chem，274，17，11541-11548)，所述系統(tǒng)摻入了被序列特異TFOs所限定的同源片段、指示菌和含有報告基因突變版本的質(zhì)粒載體。通過混合的序列接頭，TFO被限定到(tethered)與靶基因區(qū)同源的供體DNA片段。在雙功能A-AG30分子中，供體片段，由長度為40的單鏈組成，與靶基因中除位置144外的位置同源，在這些位置所述序列與所述功能基因的序列相配，從而實現(xiàn)所需表型的篩選/選擇。
三鏈體形成以促進(jìn)與人無細(xì)胞提取物重組的能力在樣品中得到了檢測，在所述樣品中，AG和供體寡核苷酸不相連接，但作為單獨(dú)的分子與質(zhì)粒底物一起簡單地混合。這導(dǎo)致重組水平的提高，頻率為40×10-5，幾乎與連接的A-AG30所產(chǎn)生的一樣高。該結(jié)果提供了進(jìn)一步的證據(jù)證明，TFO能刺激供體片段與靶座位之間的重組。另外，由于在這種情況下供體片段是與TFO分離的，因此該結(jié)果尤其證明TFO在刺激重組方面的作用，而這與其傳送供體片段至靶位點的能力是不同的。
II.逆轉(zhuǎn)錄酶-限制酶融合蛋白編碼形成三鏈體的單鏈DNA或供體DNA的載體或質(zhì)粒還必須包括從RNA轉(zhuǎn)錄DNA的工具，并且在一些實施方案中，還包括切割用作形成三鏈體的寡核苷酸或重組基因供體DNA的寡核苷酸的工具。在優(yōu)選實施方案中，所述載體或質(zhì)粒編碼逆轉(zhuǎn)錄酶-限制酶融合蛋白。可以理解，逆轉(zhuǎn)錄酶和限制酶當(dāng)然還可以被表達(dá)為單獨(dú)的酶。
A.逆轉(zhuǎn)錄酶許多逆轉(zhuǎn)錄酶和編碼它們的核苷酸序列是商業(yè)上可購買的并且可能會運(yùn)用在本文提供的方法中。逆轉(zhuǎn)錄酶包括，但不限于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(鳥髓母細(xì)胞過多癥病毒(Avian myeloblastosis Virus)和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶。病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(例如MuLV和AMV)也可使用。展現(xiàn)固有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的耐熱DNA聚合酶也可用。
B.限制酶在本領(lǐng)域中已知任何限制酶(restriction enzyme)都可在此處所述的方法中應(yīng)用。例如，所述限制酶可選自如下的酶，但并不只限于此EcoRI、MboI、HindIII、BamHI、NdeI、BglI、NotI、PstI、SacI、SeeI、SspI或XbaI。而且，另外的商用II型限制酶和某些內(nèi)含子及intein編碼的內(nèi)切核酸酶也可應(yīng)用。酶的篩選將與被切割的位點相符。運(yùn)用一種稀有切割酶是令人期待的。比如18堿基對的切割器(cutter)，例如SceI，來限制消化某個染色體DNA。用RecA輔助的限制酶(RARE)進(jìn)行DNA分割也是可用的，藉此顯著地限制染色體DNA的限制性消化。
III.傳輸寡核苷酸的載體/質(zhì)?！拜d體”或“質(zhì)粒”是指任何一種能指導(dǎo)由載體編碼的蛋白和/或mRNA轉(zhuǎn)錄本合成的自主遺傳單位。本領(lǐng)域技術(shù)人員對這樣的載體已熟知?！拜d體”是指多核苷酸分子，優(yōu)選是衍生自，例如質(zhì)粒、噬菌體或植物病毒的DNA分子，多聚核苷酸可插入其中或被克隆。載體最好包含一個或更多單一限制位點且能在特定的宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制，所述宿主細(xì)胞包括靶細(xì)胞或組織或其祖(progenitor)細(xì)胞或組織，在其中或是可與特定宿主的基因組整合，這樣使得所克隆的序列是可復(fù)制的。相應(yīng)地，所述載體可以是自主復(fù)制載體，亦即，載體作為一個額外的染色體實體存在，它的這種復(fù)制是不依賴于染色體而復(fù)制的，例如，線性或閉合環(huán)型質(zhì)粒，染色體外的成份，微染色體，或人工染色體。
所述載體可選擇性地含有一些確保自我復(fù)制的工具?；蛘咴撦d體當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)時，被整合到宿主基因組并隨被整合的染色體一起復(fù)制。一個載體系統(tǒng)可由單個載體或質(zhì)粒、兩個或更多載體或質(zhì)粒組成，它們還包含將被導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的總DNA，或轉(zhuǎn)座子。載體的選擇通常依賴于載體和載體將被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的兼容性。該載體也可包括篩選標(biāo)記例如抗生素抗性基因可被用于相配的轉(zhuǎn)化子。這樣的抗性基因?qū)嵗绢I(lǐng)域技術(shù)人員都熟悉，包括nptII基因(賦予對抗生素卡那霉素和G418(Geneticin.RTM.)的抗性)和hph基因(賦予對抗生素潮霉素B抗性)。各種各樣的載體系統(tǒng)在本領(lǐng)域中都是很熟知的。例如，這樣的系統(tǒng)包括但不僅僅限于腺病毒載體系統(tǒng)、腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。
還可以使用質(zhì)粒。
IV.治療的方法和組合物任何上述載體可在其內(nèi)生成所述ssDNA的真核細(xì)胞都能被上面所描述的系統(tǒng)改造。在所述優(yōu)選實施例中，所述細(xì)胞是在一組織中或更優(yōu)選在一動物體內(nèi)。最優(yōu)選的動物是人。適當(dāng)?shù)募?xì)胞系可以包括例如CV-1細(xì)胞、COS細(xì)胞或酵母細(xì)胞。所述細(xì)胞也可以是原核來源的。
有許多遺傳疾病或缺陷可用所述系統(tǒng)治療。例如，那些存在缺陷基因的疾病，如珠蛋白生成障礙性貧血、囊性纖維化、重度復(fù)合性免疫缺陷病(SCIDS)、血友病和鐮狀細(xì)胞性貧血。該方法也可以用于滅活基因特別是參與癌癥和病毒性疾病的基因，在此情況下，所靶向的DNA是原癌基因或病毒基因。
在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞的核部位生成的單鏈DNA分子通常重組到靶染色體序列。靶定重組的誘導(dǎo)最好用于，例如，校正靶基因的突變，而該突變就是導(dǎo)致遺傳疾病的原因?；蛘?，如果所述靶基因是病毒存活或復(fù)制所必需的病毒基因或者是導(dǎo)致非可控增殖的癌基因，例如在癌細(xì)胞內(nèi)，那么所述重組基因TFOs通過同源重組對誘導(dǎo)突變或校正該突變是有用的，從而滅活該基因使之失去功能(incapacitate)或阻止病毒的復(fù)制或者終止或減少所述癌細(xì)胞的不可控增殖。所述寡核苷酸與特定基因序列的靶區(qū)域結(jié)合在哺育動物細(xì)胞內(nèi)刺激在染色體座位的重組。例如，已經(jīng)證明直接細(xì)胞核內(nèi)顯微注射寡核苷酸后，在含有單純皰疹病毒胸苷激酶基因的兩個串聯(lián)拷貝的染色體座位，重組被刺激。(Luo，Zet al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(16)，9003-9008)。
優(yōu)選的是，所述供體寡核苷酸和/或生成它們的病毒載體和/或質(zhì)粒被溶解于生理可接受的載體，如一種水溶液或被整合于脂質(zhì)體內(nèi)，然后該載體或脂質(zhì)體被注射入機(jī)體內(nèi)，如需要基因治療或抗-病毒療法的動物體內(nèi)，進(jìn)行基因操作。對哺乳動物的優(yōu)選注射途徑是靜脈內(nèi)注射。本領(lǐng)域技術(shù)人員都會知道，不用特殊的傳送方法、載體或溶液，寡核苷酸就會被哺乳動物和如小鼠這樣的動物的細(xì)胞或組織攝取。
將核酸和/或載體傳送入細(xì)胞內(nèi)可經(jīng)由多種機(jī)制。作為一個例子如經(jīng)由脂質(zhì)體傳送，用商業(yè)上可買到的脂質(zhì)體制劑例如LIPOFECTIN，LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，Md.)，SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，Wis.)，依據(jù)本領(lǐng)域操作標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)的其它脂質(zhì)體也一樣。另外，本發(fā)明所述核酸或載體可在體內(nèi)通過電穿孔來傳送，該技術(shù)可從Genetronics，Inc.(San Diego，Calif.)獲得，并籍助于SONOPORATION儀器(ImaRxPharmaceutical Corp.，Tucson，Ariz.)實施。
作為一個例子，載體傳遞可以是經(jīng)由病毒系統(tǒng)，例如一個能包裝重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。所述重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以用于感染并因此傳遞核酸到被感染的細(xì)胞。誘導(dǎo)該核酸進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的精確方法當(dāng)然不是僅限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用。其它技術(shù)在該操作中也是普遍可行的，包括腺病毒載體的使用、腺相關(guān)病毒(AAV)載體、慢病毒載體、假型(pseudotyped)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。物理轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)也可以使用，如脂質(zhì)體傳送和受體介導(dǎo)的和其它的胞飲機(jī)制。
盡管核酸或載體經(jīng)靜脈內(nèi)和/或直腸內(nèi)給藥通常是優(yōu)選的，但也可口服、腸胃外(例如靜脈內(nèi))給藥，通過肌肉內(nèi)注射、通過腹膜內(nèi)注射、皮內(nèi)(transdermally)、體外(extracorporeally)、直腸內(nèi)，局部給藥等等。所需的核酸或載體的精確量隨對象的不同而不同，取決于物種、年齡、體重和對象的一般情況、被治療疾病的嚴(yán)重性、所用的具體核酸或載體，其給藥方式，等等。因此，不可能對每一種核酸或載體都給出一個精確的用量。然而，在本文的指導(dǎo)下，本領(lǐng)域任何一位普通技術(shù)人員僅通過常規(guī)實驗即能確定一個適當(dāng)?shù)挠昧?參見，例如，Remington的“Pharmaceutical Sciences”一書)。
所述核酸和載體的非腸胃給藥，如果被使用的話，一般使用注射。注射劑以常規(guī)形式制備，或者是液體溶液或者是懸浮液，固體形式注射前懸浮于液體作為溶液或作為乳劑。更新修訂的非腸胃給藥方法包括使用一個緩慢釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)，這樣可以維持一個恒定的劑量。參見，例如引入本文作參考的美國專利號No.3,610,795。
適當(dāng)?shù)妮d體包括但不限于無熱原鹽水。對于非腸胃給藥，無菌溶液或懸液是在鹽水中制備的，其可含有添加劑，如油酸乙酯或十四酸異丙酯，并且可以被注射入例如皮下或肌內(nèi)組織。
核酸口服給藥的適合載體包含一種或多種物質(zhì)，該物質(zhì)可用作調(diào)味劑、潤滑劑、懸浮劑或作為保護(hù)劑。適合的固體載體包括磷酸鈣、碳酸鈣、硬脂酸鎂、糖、淀粉、明膠、纖維素、羧基多聚甲叉(carboxypolymethylene)、或環(huán)右旋糖酐(cyclodextrans)。適合的液體運(yùn)載體可以是水、藥用油或者二者的混合物。所述液體可以含有其它適合的制藥添加劑如緩沖液、防腐劑、調(diào)味劑、粘度或滲透壓-調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或懸浮劑。適合的液體載體實例包括有或沒有添加劑的水，包括羧基多聚甲叉作為一種ph-調(diào)節(jié)膠。
例如，一名患者遭受一種病毒或遺傳病可以通過體內(nèi)或體外的方法治療。例如，對于體內(nèi)治療，傳送載體可以給藥該患者，所述載體優(yōu)選是以一種生物相容性的溶液或一種可藥用載體，通過攝食、注射、吸入或任何其它方法給藥。所述給藥劑量將隨患者不同而變化?！爸委熡行┝俊睂⑼ㄟ^被轉(zhuǎn)移基因物質(zhì)后功能的提高水平與任何風(fēng)險或有害的副作用相平衡后來確定。監(jiān)測基因?qū)氲乃?、基因表達(dá)和/或所編碼的抗病毒蛋白的存在或水平將有助于選擇和調(diào)節(jié)給藥劑量。一般來說，包含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組合物將以單一劑量給藥，劑量在10ng-100μg/kg體重的范圍內(nèi)，優(yōu)選范圍在100ng-10μ/kg體重，這樣至少一個治療載體拷貝被傳送到每個靶細(xì)胞內(nèi)。所述治療載體當(dāng)然將在靶細(xì)胞內(nèi)與適當(dāng)?shù)幕虮磉_(dá)調(diào)節(jié)序列有關(guān)。
回體(ex vivo)治療也是被期待的。細(xì)胞群可從患者中移除或者以治療構(gòu)建體提供，轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后重新導(dǎo)入患者。通常，回體細(xì)胞劑量將依據(jù)平衡任何有害的副作用后所希望的治療效果來確定。該劑量范圍通常在每周每天或間歇地每個患者10,000-100,000,000個細(xì)胞；優(yōu)選每個患者1,000,000-10,000,000個細(xì)胞。
對于體外的研究，一種含有所述載體的溶液被直接加到一種含有感興趣的DNA分子的溶液中，這與本領(lǐng)域技術(shù)人員很熟悉的方法一致并在下面的實例中有更具體的細(xì)節(jié)描述。體內(nèi)的研究可通過質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞并且為了載體有足夠時間進(jìn)入細(xì)胞與表達(dá)的單鏈寡核苷酸形成三鏈體，可在溶液如生長介質(zhì)中與轉(zhuǎn)染細(xì)胞一起孵育該載體。被轉(zhuǎn)染細(xì)胞可在懸浮液中或在附著于固相的單層中，或者可能是在一組織中的細(xì)胞，其中所述載體是在細(xì)胞外液。對于體外的研究，含有所述載體的溶液被直接加到含有感興趣的DNA分子的溶液中，這與本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法一致。
V.實施例下面所描述的實施例示范了所設(shè)計的載體系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)生成ssDNA，該系統(tǒng)能夠在小鼠細(xì)胞中產(chǎn)生所需要的34個核苷酸的TFO序列，就如通過引物延伸分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物所得到的證據(jù)一樣。在先前報告三鏈體誘導(dǎo)事件的小鼠細(xì)胞測定中，所述ssDNA作為一個TFO起作用，能刺激染色體內(nèi)重組(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)。具體地，組合的載體組pssXA和pssXB(AG30)，被特異性地改造以表達(dá)34個核苷酸的富含G的ssDNA，發(fā)現(xiàn)該組合的載體組以實質(zhì)上高于本底水平45×10-6的196×10-6的頻率在FL-10細(xì)胞中突變體TK基因間誘導(dǎo)重組。相反，單個應(yīng)用的載體成份不產(chǎn)生高于本底的重組。當(dāng)pssXA加pssXB(rev)時，后者含有與pssXB(AG30)完全一樣的插入但方向相反，所希望的富含C的ssDNA可通過引物延伸測定法在細(xì)胞中被檢測到，但沒有發(fā)現(xiàn)被誘導(dǎo)的重組。生理條件下，所述富含C的ssDNA的無效性與該序列的ODN無能力在FL-10細(xì)胞的多聚嘌呤靶定位點處形成三鏈體相一致。
最近，Chen等描述了一個被設(shè)計為在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)ssDNA的載體系統(tǒng)，并證明了其在產(chǎn)生反義DNA或者催化DNA以介導(dǎo)靶向的mRNA的降解(Chen等，2000，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，10，415-422)。在該系統(tǒng)中，設(shè)計一種逆轉(zhuǎn)錄酶-MboII融合蛋白的一個載體連同來自第二個載體的mRNA的共表達(dá)，以產(chǎn)生具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的cDNA分子，其中所述的第二個載體含有Moloney小鼠白血病病毒(MoMuLV)核心啟動子下游反向重復(fù)序列。MboII在所述莖基底部切割來釋放包含在環(huán)中的感興趣的ssDNA序列。
該載體系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ssDNA的能力能使其充當(dāng)TFO以誘導(dǎo)染色體內(nèi)事件。被披露的ssDNA表達(dá)系統(tǒng)可在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生可檢測數(shù)量的所需TFO，導(dǎo)致誘導(dǎo)重組水平比當(dāng)合成的AG30用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞時先前所觀察到的高了7倍(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，97，9003-9008)。此處呈現(xiàn)的這些結(jié)果顯示所述ssDNA表達(dá)系統(tǒng)提供了一種有用的方法，用以體內(nèi)生成活性TFO，以介導(dǎo)在產(chǎn)生TFO的細(xì)胞中基因組DNA的定點修飾。
參考以下非限制實施例可對本發(fā)明作進(jìn)一步理解。
實例1ssDNA載體系統(tǒng)的設(shè)計在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ssDNA的所設(shè)計的載體系統(tǒng)的關(guān)鍵特征圖示于圖1a(Chen等，2000，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，10，415-422)。所示兩種成分的系統(tǒng)由一個表達(dá)RT-MboII融合蛋白的質(zhì)粒(pssXA)和表達(dá)可生成所需ssDNA的經(jīng)改造的RNA轉(zhuǎn)錄本的另一個質(zhì)粒(pssXB)組成。逆轉(zhuǎn)錄酶可以與本領(lǐng)域任一已知的限制酶融合。例如，所述酶可以非限制性地選自EcoRI、MboI、HindIII、BamHI、NdeI、BglI、NotI、PstI、SacI、SspI、SceI或XhaI。所述pssXB構(gòu)建體含有表達(dá)盒，其摻入了兩端為反向重復(fù)序列的所需的插入DNA序列(在這種情況下雙螺旋摻入了AG30 TFO序列)(圖1b)。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本包括MoMuLV核心啟動子和在3’端的tRNA引物結(jié)合位點(Chen等，2000，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，10，415-422)，從中RT可產(chǎn)生cDNA，該cDNA由于所述的反向重復(fù)序列可形成內(nèi)部的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1c)。設(shè)計莖部的MboII切割來釋放環(huán)作為含有插入序列加少數(shù)外來核苷酸的ssDNA。在插入子摻入有AG30序列的情況下，所期待的34個核苷酸的ssDNA如圖1d所示。在本工作中，使用了兩個pssXB來源的載體；一個是pssXB(AG30)，其具有插入序列，該插入序列具有產(chǎn)生AG34 ssDNA的方向，見圖1d；另一個載體有反向的NotI插入，因而產(chǎn)生一個充分但不完全與AG34互補(bǔ)的富含C的ssDNA序列(見下面)。
材料和方法載體所述pssXA和pssXB載體的構(gòu)建(圖.1a)前面已描述(Chen等，2000，Antisense Nucleic Acid DrugDev.，10，415-422)。上述載體分別含有7869和5459bp。為使載體表達(dá)所需的含有AG30 TFO序列或者與之互補(bǔ)序列的ssDNA，合成的寡核苷酸序列5′d(GGGCCGCAGGCTCCCCCTCCCCCACCACCCCCCCCTTCCTGC)3′(SEQ ID NO1)和5′d(GGCCGCAGGAAGGGGGGGGTGGTGGGGGAGGGGGAGCCTGC)3′(SEQ ID NO2)退火產(chǎn)生具有NotI粘末端的合成的雙鏈，在除去存在于原載體中的填充片段后連接入pssXB的NotI位點。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后，通過直接測序鑒定包含有質(zhì)粒的克隆，所述質(zhì)粒有兩個可能方向的插入序列。設(shè)計所述方向以產(chǎn)生摻入有所述AG30 TFO的34個核苷酸的G豐富序列，見圖1，命名為pssXB(AG30)。反方向的載體命名為pssXB(rev)。
寡核苷酸通過Midland Certified Reagent Co.(Midland，TX)合成ODNs，并用凝膠電泳或高壓液相層析(HPLC)純化，然后用雙蒸餾水通過Centricon-3過濾(Amecon，Beverly，MA)。ODNs由磷酸酯鍵組成，并在一些情況下(如所示的)被合成含有3′丙胺基團(tuán)(Zendugui等，1992，Nucleic AcidsRes.20，307-314)。
三鏈體結(jié)合試驗通過電泳遷移率改變分析法(Electrophoretic mobilityshift assays)確定表觀分離常數(shù)(Kds)。退火包含30bp多聚嘌呤TFO結(jié)合位點的ODNs(57bp)以形成合成的靶雙螺旋(Wang et al.，1995，Mol.Cell.Biol.，15，1759-1768)。用T4多聚核苷酸激酶和[γ-32P]ATP在5’末端放射標(biāo)記雙螺旋，凝膠純化，并在包含10mM Tris-HC(pH7.6)，1mM精胺和10％甘油的緩沖液中，與濃度逐漸增加的所選TFOs，在37℃溫育18小時。使樣品在含89mM Tris、89 mM硼酸、pH8.0和10mMMgCl2的12％天然凝膠中，60伏特電壓，聚丙烯酰胺凝膠電泳4小時，接著放射自顯影。
細(xì)胞小鼠FL-10細(xì)胞的構(gòu)建和特征前面已有描述(Luo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)。上述細(xì)胞來源于LTK-細(xì)胞并被確定含有單拷貝的pTK2supF構(gòu)建體作為三鏈體誘導(dǎo)的染色體內(nèi)重組的靶底物。所述FL-10細(xì)胞在含10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。
載體轉(zhuǎn)染和重組測定每平方厘米1.67×104密度的FL-10細(xì)胞(1×106在100mm皿中)用3μg每種所選的載體DNA轉(zhuǎn)染，按照生產(chǎn)者的指示所述載體DNA都提前與66μl的GenePorter轉(zhuǎn)染試劑混合并稀釋入總體積為2ml的無血清培養(yǎng)基中(Gene Therapy Systems，San Diego，CA)。5小時后，上述培養(yǎng)基用標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基置換。細(xì)胞在非選擇培養(yǎng)基中再孵育24小時以便重新構(gòu)建的(reconstituted)TK基因發(fā)生重組和表達(dá)，之后培養(yǎng)基換成含1×10-4M次黃嘌呤、2×10-6M氨基喋呤和1.6×10-5M胸苷(HAT)的DMEM來篩選表達(dá)野生型TK的潛在重組體。細(xì)胞在含HAT培養(yǎng)基中維持10天，在此時記數(shù)存活的集落。
ODN轉(zhuǎn)染如制造商描述的那樣，每平方厘米1.67×104濃度的細(xì)胞(1×106細(xì)胞在100mm皿中)在每個培養(yǎng)皿中用與66μl的GenePorter混合并稀釋入總體積為2ml的無血清培養(yǎng)基中的10μg ODN DNA轉(zhuǎn)染(Gene TherapySystems，San Diego，CA)。如上所述，轉(zhuǎn)染5小時后，將所述細(xì)胞放到含10％FBS的完全生長培養(yǎng)基中。24小時以后培養(yǎng)基被換成HAT篩選。
細(xì)胞內(nèi)ssDNA的檢測象上面提到的使用陽離子脂質(zhì)體用所示載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24小時后，為分析所ssDNA的產(chǎn)生收獲細(xì)胞。細(xì)胞層用PBS洗3次并通過每60mm皿加5ml Trizol試劑(Life Technologies，Gaithersburg，MD)裂解。裂解物中的高分子量DNA通過用巴斯德吸管反復(fù)吹打被剪斷。該溶液被轉(zhuǎn)移到50ml試管，與氯仿(每1ml Trizol溶液加0.2ml)混合，8000rpm離心30分鐘。水樣上清液與0.5ml異丙醇每毫升初始加入的Trizol混合，5500rpm 4℃再離心30分鐘。
所得片狀沉淀物(pellet)用75％的乙醇洗滌、風(fēng)干，溶于水中。加入RNaseA(20μg/ml)，所得溶液在37℃孵育2小時。接著酚/氯仿抽提，-70℃用乙醇沉淀DNA，14,000rpm 4℃離心30分鐘分離。所得片狀沉淀物用75％的乙醇洗滌，溶于水中，該樣品被用于引物延伸反應(yīng)。對于引物延伸，25μl的每個樣品與所選引物(用T4多核苷酸激酶和[Y-32P]ATP在5’端標(biāo)記)在34μl中以80pmol混合，從10mM儲存液中每種dNTP取2μl，2μl vent聚合酶(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和7μl 10X Thermopol緩沖液(隨vent聚合酶供給)。該反應(yīng)在一個熱循環(huán)儀中加熱到95℃2分鐘，然后進(jìn)行30個循環(huán)第一步，95℃30秒；第二步，48℃1分鐘；第三步，70℃2分鐘，接著70℃10分鐘。通過15％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和接著放射自顯影，產(chǎn)物可被看到。所述引物為15個堿基，設(shè)計為與預(yù)期產(chǎn)物(或者AG34或者rev34)3’端互補(bǔ)，且序列分別是5′d(CAGGCTCCCCCTCCC)3′(SEQ ID NO3)和5′d(CAGGAAGGGGGGGGT)3′(SEQ ID NO4)。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)ssDNA的定量轉(zhuǎn)染24小時后，細(xì)胞用PBS洗3次并裂解用于制備低分子量DNA(同上)。同時，用合成的AG34 ODN(pssXA和pssXB(AG30)的預(yù)期產(chǎn)物)，以設(shè)計模擬每個細(xì)胞104～107個分子的濃度鍥入(spike)平行檢測的樣品，假定裂解時大約4×106個細(xì)胞存在。通過引物延伸的所述檢測的其余部分同上。
實例2合成的TFOs和潛在的ssDNA產(chǎn)物的結(jié)合比較在所述載體系統(tǒng)cDNA產(chǎn)物中所預(yù)期的莖環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)，MboII切割發(fā)生在所述莖內(nèi)(圖1c)。維持莖保存MboII切割位點要求插入序列在5’和3’端摻入互補(bǔ)核苷酸。以AG30序列為例，這就意味著，在最后產(chǎn)生的ssDNA中，4個額外的核苷酸將不得不被包括在5’端或3’端。盡管以前的工作已經(jīng)顯示在FL-10細(xì)胞重組底物中AG30 TFO高親和力結(jié)合于多聚嘌呤靶點，但我們關(guān)注TFO 5’或3’端額外核苷酸可充分地減少結(jié)合。為了確定5’或3’尾對AG30三鏈體結(jié)合的作用，用合成的57bp的雙螺旋作為結(jié)合靶進(jìn)行凝膠遷移率改變分析。為了對照，我們也通過AG30 TFO與3’丙胺(與以前小鼠細(xì)胞和小鼠內(nèi)靶向?qū)嶒炈褂玫囊粯?(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008；Vasquez etal.，2000，Science，290，530-533)和AG30與3’OH檢測了結(jié)合，因為預(yù)期在細(xì)胞內(nèi)通過載體系統(tǒng)產(chǎn)生的ssDNA會有一個3’OH。象顯示的那樣，AG30和5’尾及AG30和3’尾都顯示相對于AG30結(jié)合均減少，平衡解離常數(shù)(Kds)范圍在5×10-7M，對應(yīng)AG30的5×10-8。因此，所述4個核苷酸尾減少了但并沒有消除三鏈體的結(jié)合親和力。在我們實驗使用的pssXB(AG30)構(gòu)建體中，所預(yù)測的ssDNA相對于AG30序列將有一個3’尾(圖1d)。
實例3檢測小鼠細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)的染色體內(nèi)重組一種三鏈體誘導(dǎo)的染色體內(nèi)重組的檢測被用于測試載體系統(tǒng)產(chǎn)生ssDNA的能力，該ssDNA能作為TFO結(jié)合染色體靶點。小鼠LTK細(xì)胞(FL-10)的亞克隆攜帶一對在單一基因座中作為同向重復(fù)的突變TK基因(圖2)。在該構(gòu)建體中，上述TK基因間的區(qū)域被改造成含有30bp富含G的多聚嘌呤序列，其負(fù)責(zé)通過所述AG30TFO(Wang等，1995，Mol.Cell.Biol.，15，1759-1768)在反向平行三鏈體基序中高親和力的第三條鏈的結(jié)合(Beal等，1991，Science，251，1360-1363)。上述TK基因在不同位點(位置在TK26的735和在TK8的1220)含有滅活XhoI的接頭插入突變。在該測定中，所述兩個TK基因之間的重組有產(chǎn)生功能基因的潛力。因為親代LTk細(xì)胞缺乏細(xì)胞的TK，那些突變體TK基因已經(jīng)重組產(chǎn)生野生型TK的細(xì)胞能通過在HAT培養(yǎng)基上生成而被篩選出來。通過轉(zhuǎn)染所選的載體或ODNs誘導(dǎo)的重組是通過計數(shù)HAT抗性克隆，以所處理細(xì)胞總數(shù)的比例來定量的。在以前的工作中，在所述FL-10細(xì)胞中重組底物偏向報告基因轉(zhuǎn)化事件而不是交叉重組(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)，因此該測定事實上可能低估了三鏈體誘導(dǎo)事件的頻率。
實例4ssDNA載體誘導(dǎo)的重組所述FL-10細(xì)胞被一系列載體(或單個或成對地)轉(zhuǎn)染，然后HAT抗性克隆的誘導(dǎo)在至少三次獨(dú)立實驗中被測定。在這一系列的實驗中，重組的本底頻率在45×10-6的范圍，而當(dāng)pssXA、pssXB，或pssXA加pssXB被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞時，高于此水平的誘導(dǎo)沒有見到。然而，當(dāng)pssXA加pssXB(AG30)被共同轉(zhuǎn)染時，重組體卻以196×10-6的頻率產(chǎn)生。當(dāng)pssXA與含有反向的AG30插入序列的pssXB(rev)組合時，也沒見到效果。該載體裝置是期望表達(dá)富含C的rev34 ssDNA(圖2)，其在生理pH條件下由于胞嘧啶質(zhì)子化作用的需要，在多聚嘌呤靶點不形成三鏈體。
在所述測定中去除自發(fā)重組本底，pssXA和pssXB(AG30)對所述FL-10細(xì)胞的轉(zhuǎn)染平均產(chǎn)生在106中有151個重組的誘導(dǎo)頻率。為了對照，在以前工作中，當(dāng)AG30-NH2(末端保護(hù)用丙胺取代3′OH)通過陽離子脂質(zhì)體被轉(zhuǎn)染到相同的細(xì)胞時，高于本底的誘導(dǎo)是在106中有21個重組(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)。為進(jìn)一步比較，AG34的合成版本(被設(shè)計成匹配預(yù)測的ssDNA分子，因此沒有丙胺保護(hù))通過陽離子脂質(zhì)體被轉(zhuǎn)染到所述FL-10細(xì)胞時，沒有誘導(dǎo)重組?？傊?，這些結(jié)果提示使用ssDNA系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)生成AG34，在實現(xiàn)染色體打靶方面比用合成的TFOs，無論是AG30-NH2還是AG34，實際上更有效。另外，上述結(jié)果也證明，與預(yù)期的一樣，當(dāng)被轉(zhuǎn)染到所述FL-10細(xì)胞時，合成的AG34版本比AG30活性更低。這與AG34與AG30相比，AG34對這些細(xì)胞內(nèi)30bp的多聚嘌呤靶點的結(jié)合親和力降低是一致的，而且可能也反應(yīng)出AG34末端保護(hù)阻斷核酸酶降解的缺乏。
實例5在細(xì)胞內(nèi)檢測ssDNA產(chǎn)物為確定所預(yù)期的ssDNA分子是被轉(zhuǎn)染的載體產(chǎn)生的，低分子量DNA在載體轉(zhuǎn)染24小時后被從細(xì)胞分離，并用5’端標(biāo)記引物進(jìn)行引物延伸測定。從未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和用單獨(dú)pssXA、單獨(dú)pssXB、pssXA加pssXB或用pssXA加pssXB(AG30)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中獲得的裂解物，使用被設(shè)計與所述AG34序列互補(bǔ)的15核苷酸引物來測定(圖1d)。來自轉(zhuǎn)染有pssXA和pssXB(rev)的細(xì)胞裂解物用設(shè)計檢測rev34序列的15核苷酸的引物進(jìn)行測定(圖2)。就像顯示的那樣，34個核苷酸的ssDNA只有分別用AG34-和rev34-特異引物，在從轉(zhuǎn)染有pssXA加pssXB(AG30)或pssXA加pssXB(rev)的細(xì)胞來的裂解物中才能被顯現(xiàn)。只有用pssXA加pssXB(AG30)的轉(zhuǎn)染才產(chǎn)生誘導(dǎo)的重組。
實例6細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ssDNA的定量為了確定每個細(xì)胞所述載體組pssXA加pssXB產(chǎn)生ssDNA分子的大概產(chǎn)量，小鼠FL-10細(xì)胞或用pssXA加pssXB(AG30)(經(jīng)用陽離子脂質(zhì)體共混合)，或為進(jìn)行對照，用合成的ODN、AG34(也通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)轉(zhuǎn)染。所述AG34寡聚體用丙胺作3’端保護(hù)并被設(shè)計精確地匹配所預(yù)期的pssXA加pssXB(AG30)載體的產(chǎn)物。與上面一樣，低分子量DNA在載體轉(zhuǎn)染24小時后被從細(xì)胞分離，然后引物延伸測定被用于顯現(xiàn)和定量ssDNA(圖6)。在裂解的時候，平行檢測樣品用已知量的AG34鍥入，所用AG34的濃度為所計算的模仿每個細(xì)胞從104到107的濃度。所得數(shù)據(jù)通過磷屏成像儀(phosphorimager)定量，且標(biāo)準(zhǔn)曲線通過線性回歸決定。實驗樣品中每個細(xì)胞ssDNA的量從上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中通過內(nèi)插法評估，對于pssXA加pssXB(AG30)樣品而言，每個細(xì)胞生成6.2×105個分子和AG34樣品生成1.9×105個分子。
以前，不僅確定在FL-10細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染的TFOs能在雙TK底物中誘導(dǎo)重組(Luo etal.，2000，Proc.Natl.Acad Sci.USA，97，9003-9008)，而且也已經(jīng)確定，該檢測能報告超過一個頻率范圍，即從10-6到10-2的誘導(dǎo)重組。重要的是該之前的工作透露了TFO誘導(dǎo)的重組水平是非常依賴TFOs的細(xì)胞內(nèi)傳送效率的。當(dāng)所述AG30 TFO用陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染時，見到了超過本底的21×10-6的誘導(dǎo)重組頻率(Luo等，2000，Proc.Natl.iliad.Sci.USA，97，9003-9008)。當(dāng)所述TFOs被用顯微注射導(dǎo)入時，1％范圍的重組頻率被檢測到了。
在此報告的工作中，pssXA和pssXB(AG30)通過與陽離子脂質(zhì)混合被共轉(zhuǎn)染，超過本底的平均誘導(dǎo)是151×10-6。這一結(jié)果可與基于引物延伸測定的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ssDNA的定量相關(guān)，通過pssXA加pssXB(AG30)載體組每個細(xì)胞產(chǎn)生估計6.2×105個分子的ssDNA。相反，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，合成的ODN、AG34的轉(zhuǎn)染每個細(xì)胞大約產(chǎn)生1.9×105個分子。載體組產(chǎn)生ssDNA的相對水平是的大量的(substantial)，考慮到這一點，在這些實驗中，兩個載體的共轉(zhuǎn)染沒有被優(yōu)化，因此有可能相當(dāng)大數(shù)目的細(xì)胞沒有被兩個載體共轉(zhuǎn)染。
對該載體系統(tǒng)的改進(jìn)，例如重要元件合并(例如編碼逆轉(zhuǎn)錄酶-限制性酶融合蛋白的核酸和編碼單鏈三鏈體形成的寡核苷酸的核酸)到單個質(zhì)粒并摻入到病毒載體，提高轉(zhuǎn)染效率和導(dǎo)致活性增加。
在相關(guān)術(shù)語中，在以前的工作中(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)通過將合成的AG30 TFO顯微注射到FL-10細(xì)胞得到重組子的產(chǎn)量比此處pssXA加pssXB(AG30)所誘導(dǎo)的重組子高66倍。另一方面，發(fā)現(xiàn)ssDNA載體系統(tǒng)產(chǎn)生重組子在頻率上較用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AG30刺激的超出本底七倍(數(shù)據(jù)依然來源于以前的研究(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008))。通過這些方法每個細(xì)胞產(chǎn)生的ODN或ssDNA分子的估計數(shù)量分別為7×104，6×105，和1.9×105。
與預(yù)期的ssDNA產(chǎn)物相匹配的合成的34-mer具有的結(jié)合親和力較AG30本身低大約10倍。ssDNA系統(tǒng)雖然親和力下降但在誘導(dǎo)重組時仍然有效，這更證明了該系統(tǒng)的效力，并且這也提示，當(dāng)額外的核苷酸被剔除時TFO活性大量增加是可能的。另外，親和力的不同部分解釋了為什么顯微注射精確的AG30分子比ssDNA載體系統(tǒng)更有效(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)。
所述資料在此描述了誘導(dǎo)重組的方法和所預(yù)期的ssDNA產(chǎn)生的文獻(xiàn)。依據(jù)Chen等(Chen等，2000，AntisenseNucleic Acid Drug Dev.，10，415-422)第一次報道反義DNA生成的途徑，ssDNA之類來源于逆轉(zhuǎn)錄酶的活性(見Chen等，其中它們提供了在載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)RT活性的證據(jù))。
而這里第一次使用為在細(xì)胞內(nèi)染色體三鏈體形成生產(chǎn)ssDNA的載體系統(tǒng)。以前的一些研究已經(jīng)探索了細(xì)胞內(nèi)生成的RNA轉(zhuǎn)錄本用于此目的的應(yīng)用(Noonberg等，1994，Nucleic AcidsRes.，22，2830-2836；Shevelev et al.，1997，Cancer Gene Therapy，4，105-112)。但RNA基礎(chǔ)上的方法有數(shù)種缺點。RNA不能與DNA重組。天然生成的RNA被用于三鏈體形成的反向平行的嘌呤基序排除，而更偏愛富含G:C堿基對的靶點，如在此處實驗中所使用的(Beal等，1991，Science，251，1360-1363；Roberts etal.，1992，Science，258，1463-1466；Semerad etal.，1994，Nucleic Acids Res.，22，5321-5325)。另一方面，通過自然產(chǎn)生的RNA或DNA在并行嘧啶基序中的三鏈體形成因為胞嘧啶質(zhì)子化的需要而需要酸性的PH值。(Asensio等，1998，J Mol.Biol.，275，811-822；Singletonetal.，1992，Biochemistry，31，10995-1003)。克服該問題的策略需要化學(xué)修飾C殘基，這不能在生物學(xué)制備分子的情況下完成。另外，還沒有一種機(jī)制能夠轉(zhuǎn)錄后修飾RNA(以類似于這里使用MboII活性的方式)，因此轉(zhuǎn)錄本通常攜帶大量額外的減少第三條鏈結(jié)合親和力的核苷酸。另一方面，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的經(jīng)過改造的RNA轉(zhuǎn)錄本的用途也顯示了在反義應(yīng)用方面的巨大前景(Gorman等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，4929-4934)。
綜上所述，這里提供的結(jié)果證明ssDNA可在哺乳類動物細(xì)胞中有效制備，實現(xiàn)制備針對靶染色體位點的TFO的目的。三鏈體技術(shù)的其它應(yīng)用，比如靶基因敲除或轉(zhuǎn)錄抑制，可適應(yīng)于使用這里描述的方法。在哺乳動物細(xì)胞中高效率產(chǎn)生抗基因(anti-gene)TFO的能力提供了一種新的、重要的研究工具，并且還為一種新的治療形式奠定了基礎(chǔ)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會識別，或能夠確認(rèn)只是應(yīng)用常規(guī)實驗方法的，本發(fā)明所述的特定實施方案的很多等同情況。所述等同包括在下述權(quán)利要求中。
序列表<110>耶魯大學(xué)<120>細(xì)胞內(nèi)制備單鏈DNA<130>YU 1224<150>60/340，803<151>2001-12-14<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>42<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的寡核苷酸；pssXB(AG30)載體的部分ss序列；與SEQ ID NO2部分互補(bǔ)<400>1gggccgcagg ctccccctcc cccaccaccc cccccttcct gc 42<210>2<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸；pssXB(AG30)載體的部分ss序列；與SEQ ID NO1部分互補(bǔ)<400>2ggccgcagga aggggggggt ggtgggggag ggggagcctg c 41<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AG34(或)rev34的合成的寡核苷酸PCR引物<400>3caggctcccc ctccc 15<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AG34(或)rev34的合成的寡核苷酸PCR引物
<400>4caggaagggg ggggt 15<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>指向大腸桿菌supF基因的合成的寡核苷酸<400>5aggaaggggg gggtggtggg ggagggggag cctg 34<210>6<211>85<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸形成的單鏈AG30，MboII剪切位點，和雙鏈莖(莖-環(huán)結(jié)構(gòu))<400>6ggtcggcggc cttgaacagc ggccgcagga aggggggggt ggtgggggag ggggagcctg 60cggccgctct tcaaggccgc cgacc85<210>7<211>88<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pssXB(AG30)載體的部分序列；互補(bǔ)于SEQ ID NO8<400>7ctaggtcggc ggccttgaag agcggccgca ggctccccct cccccaccac cccccccttc 60ctgcggccgc tcttcaaggc cgccgacc 88<210>8<211>88<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pssXB(AG30)載體的部分序列；互補(bǔ)于SEQ ID NO7<400>8ggtcggcggc cttgaagagc ggccgcagga aggggggggt ggtgggggag ggggagcctg 60cggccgctct tcaaggccgc cgacctag 88
<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>指向大腸桿菌supF基因的合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>用丙胺取代3′OH來保護(hù)AG30末端<400>9aggaaggggg gggtggtggg ggagggggag 30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AG30靶向的富含G的多聚嘌呤；與SBQ ID NO11互補(bǔ)<400>10gagggggagg gggtggtggg gggggaagga 30<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO10的互補(bǔ)鏈<400>11tccttccccc cccaccaccc cctccccctc 30<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸；相反方向的AG30序列<400>12aggctccccc tcccccacca cccccccctt cctg 3權(quán)利要求
1.在目標(biāo)染色體核酸分子中誘導(dǎo)一種特異變化的方法，包括以下步驟(a)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的一種核酸分子；和(b)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)一種編碼RNA的核酸分子，該RNA分子將在該細(xì)胞內(nèi)被逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA；這其中上述單鏈DNA分子結(jié)合于細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)染色體核酸分子形成螺旋以誘導(dǎo)位點特異性變化和/或介導(dǎo)與目標(biāo)染色體核酸分子的重組。
2.權(quán)利要求1的方法，其中單鏈DNA介導(dǎo)與目標(biāo)的重組。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述三鏈體的形成誘導(dǎo)重組。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述三鏈體誘導(dǎo)突變而非重組。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述重組是染色體內(nèi)重組。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述重組是染色體間重組。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述RNA是被逆轉(zhuǎn)錄成DNA并形成雙鏈莖-單鏈環(huán)結(jié)構(gòu)，其中該雙鏈莖被與逆轉(zhuǎn)錄酶一起導(dǎo)入的限制酶從單鏈環(huán)結(jié)構(gòu)中切除。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述限制酶選自Mbo II、Sce I、EcoRI、MboI、Hind III、Bam HI、Nde I、BglI、NotI、PstI、Sac I、Ssp I、SceI或XbaI。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述限制酶是一種罕見的切割性限制酶。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述罕見的切割性限制酶是Sce I。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述三鏈體誘導(dǎo)重組。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述重組是染色體內(nèi)重組。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述重組是染色體間重組。
14.權(quán)利要求7的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶和限制酶是在一種融合蛋白內(nèi)。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述單鏈DNA刺激外源提供的DNA片斷與目標(biāo)染色體序列的重組。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述單鏈DNA刺激被限定的DNA片斷與目標(biāo)染色體序列的重組。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述目標(biāo)染色體基因是一種癌基因。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述目標(biāo)染色體基因是一種缺陷型基因，選自缺陷型血紅素基因、血友病基因、囊性纖維化基因、干皮病色素形成基因、核苷酸剪切修復(fù)途徑的基因或血友病基因。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述目標(biāo)染色體序列是病毒基因組的全部或一部分。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述單鏈DNA是由同源嘌呤或同源嘧啶核苷酸組成。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述單鏈DNA是由多聚嘌呤或多聚嘧啶核苷酸組成。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶和限制酶及所述RNA是從兩種或兩種以上載體表達(dá)的。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶、限制酶及所述RNA是從同一種載體表達(dá)的。
24.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括(C)向所述細(xì)胞中導(dǎo)入一種編碼基因重組供體DNA片斷的核酸。
25.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括(C)向所述細(xì)胞中導(dǎo)入一種合成來源的基因重組DNA供體片斷。
26.一種在細(xì)胞中生成單鏈DNA的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述單鏈DNA結(jié)合到所述細(xì)胞中的目標(biāo)染色體序列上，該表達(dá)系統(tǒng)包含(a)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸分子；和(b)編碼RNA的核苷酸分子，該RNA被所述逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成所述的單鏈DNA。
27.權(quán)利要求26所述表達(dá)系統(tǒng)，其中所述單鏈DNA結(jié)合到所述目標(biāo)染色體序列形成三鏈體。
28.權(quán)利要求26所述表達(dá)系統(tǒng)，其中所述單鏈DNA是一種重組基因供體DNA分子。
29.權(quán)利要求26所述表達(dá)系統(tǒng)，包含形成三鏈體的單鏈DNA和重組基因單鏈DNA分子。
30.權(quán)利要求26所述表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)一步編碼限制酶，該系統(tǒng)包含編碼RNA的核苷酸分子，所述RNA被逆轉(zhuǎn)錄成形成雙鏈莖-單鏈環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA，其中雙鏈莖被所述限制酶從單鏈環(huán)結(jié)構(gòu)處切除。
31.權(quán)利要求30所述表達(dá)系統(tǒng)，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶和限制酶被表達(dá)為一種融合蛋白。
32.權(quán)利要求26所述表達(dá)系統(tǒng)，其中所述RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶和限制酶是由同一個核苷酸分子表達(dá)的。
33.權(quán)利要求26所述表達(dá)系統(tǒng)，其中所述RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶和限制酶是由兩個或兩個以上單獨(dú)的核苷酸分子表達(dá)的。
34.權(quán)利要求26所述表達(dá)系統(tǒng)，其中所述編碼RNA的DNA和編碼所述逆轉(zhuǎn)錄酶-限制酶融合蛋白的DNA是可以整合于所述染色體的。
35.權(quán)利要求30所述表達(dá)系統(tǒng)，其中所述限制酶選自Mbo II，Sce I、Eco RI、Mbo I、Hind III、Bam HI、Nde I、Bgl I、Not I、PstI、SacI、Ssp I、SceI或XbaI。
全文摘要
本發(fā)明提供細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生單鏈DNA分子的方法，該DNA分子在介導(dǎo)三鏈體依賴性或非依賴性染色體事件中具有活性。該方法所依據(jù)的發(fā)現(xiàn)即是將病毒載體或質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，它們在被改造的細(xì)胞內(nèi)生成單鏈DNA分子，該DNA分子結(jié)合于目標(biāo)染色體DNA從而形成三鏈體，該三鏈體可以誘導(dǎo)所需要的突變和/或進(jìn)行基因重組并通過摻入供體DNA分子誘導(dǎo)染色體DNA的改變。上述載體或質(zhì)粒不僅可編碼TFO和任意供體DNA，而且可編碼一種逆轉(zhuǎn)錄酶和任選一種限制酶，這在優(yōu)選實施例中呈現(xiàn)為一種融合蛋白，逆轉(zhuǎn)錄上述載體或質(zhì)粒編碼的RNA，接著在一個限制酶切位點切割產(chǎn)生單鏈DNA。該單鏈DNA可以被直接生成或最初作為雙鏈莖－單鏈環(huán)結(jié)構(gòu)，然后被切割生成單鏈DNA。
文檔編號C12N15/10GK1620503SQ02828039
公開日2005年5月25日 申請日期2002年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月14日
發(fā)明者彼得·M·格拉澤 申請人:耶魯大學(xué)