專利名稱：肝細(xì)胞的長期培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及長期培養(yǎng)新鮮肝細(xì)胞并保持細(xì)胞的酶活性和酶誘導(dǎo)活性的方法。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞不僅產(chǎn)生白蛋白，還產(chǎn)生藥物代謝酶如那些屬于細(xì)胞色素P450(CYP)家族的酶和血凝固-纖維蛋白溶解相關(guān)的酶如α1-抗胰蛋白酶。因此，新鮮肝細(xì)胞的培養(yǎng)產(chǎn)物被廣泛用于測量這些酶的活性。
從肝臟收集的肝細(xì)胞通常保存在4℃或更低的冷藏環(huán)境中，以防止酶失活，此后，在用于進(jìn)行各種試驗(yàn)之前將溫度升至大約37℃并長期培養(yǎng)細(xì)胞。
近年來，由于人的肝細(xì)胞已經(jīng)難以獲得，就需要將已經(jīng)獲得的肝細(xì)胞長期保存或長途運(yùn)輸(如跨國運(yùn)輸)。為了滿足這種需求，必須將新鮮肝細(xì)胞保存至少2天，同時(shí)不引起酶活性或酶誘導(dǎo)活性的任何損失。
然而，在不高于4℃的常規(guī)低溫保存條件下，在2天或更長時(shí)間的保存期內(nèi)，酶活性和酶誘導(dǎo)活性通常會(huì)降低30％到60％，因此妨礙了這種活性的正確測量。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種長期培養(yǎng)肝細(xì)胞而不降低細(xì)胞的酶活性或酶誘導(dǎo)活性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人研究了能滿意地長期培養(yǎng)新鮮肝細(xì)胞的條件并獲得了下列發(fā)現(xiàn)。更確切地說，當(dāng)肝細(xì)胞在大約37℃下保存時(shí)(這代表了生理?xiàng)l件)，與細(xì)胞在常規(guī)采用的低溫(4℃)條件下保存相比，細(xì)胞的酶活性和酶誘導(dǎo)活性被保持在一定的較好的水平。然而，當(dāng)細(xì)胞在室溫下(即15到30℃之間)保存1到6天，然后再回到生理?xiàng)l件培養(yǎng)時(shí)，非常出乎意料的是，與在37℃下保存相比，甚至保持了更高的酶活性和酶誘導(dǎo)活性，活性被長期保持，當(dāng)長途運(yùn)輸肝細(xì)胞時(shí)，生物學(xué)試驗(yàn)如藥物代謝酶誘導(dǎo)試驗(yàn)得以準(zhǔn)確進(jìn)行。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供了長期培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法，其特征在于在15到30℃的培養(yǎng)基中保持新鮮肝細(xì)胞1到6天，接著在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)。
附圖簡要說明

圖1顯示了在各種條件下保存48小時(shí)以后培養(yǎng)的猴肝細(xì)胞的尿素合成(也就是尿素生成)能力。
圖2顯示了在25℃保存48小時(shí)以后培養(yǎng)的猴肝細(xì)胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
圖3顯示了在25℃保存96小時(shí)以后培養(yǎng)的猴肝細(xì)胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
圖4顯示了在25℃保存48小時(shí)以后培養(yǎng)的猴肝細(xì)胞的CYP3A4誘導(dǎo)能力(RIF表示暴露于利福平，UT表示沒有暴露于利福平)。
圖5顯示了在25℃保存48小時(shí)以后培養(yǎng)的人肝細(xì)胞的尿素合成(也就是尿素生成)能力。
圖6顯示了在25℃保存96小時(shí)以后培養(yǎng)的人肝細(xì)胞的尿素合成能力。
圖7顯示了在25℃保存144小時(shí)以后培養(yǎng)的人肝細(xì)胞的尿素合成能力。
圖8顯示了在25℃保存96小時(shí)以后培養(yǎng)的人肝細(xì)胞的白蛋白合成能力。
圖9顯示了在25℃保存96小時(shí)以后培養(yǎng)的人肝細(xì)胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
圖10顯示了在25℃保存48小時(shí)、96小時(shí)或144小時(shí)以后培養(yǎng)的人肝細(xì)胞的CYP3A4誘導(dǎo)能力(RIF表示暴露于利福平，UT表示沒有暴露于利福平)。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式施用本發(fā)明方法的肝細(xì)胞是新鮮肝細(xì)胞，其從組織中取出后還沒有經(jīng)過傳代培養(yǎng)。換句話說，它們是原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞。肝細(xì)胞的例子包括那些從哺乳動(dòng)物尤其從靈長類動(dòng)物獲得的肝細(xì)胞。尤其優(yōu)選人肝細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，新鮮肝細(xì)胞必須在15到30℃的培養(yǎng)基中保持1到6天。當(dāng)肝細(xì)胞保持在低于15℃例如4℃(這是通常的保存溫度)的溫度下時(shí)，肝細(xì)胞的酶活性和酶誘導(dǎo)活性降低。同樣地，當(dāng)肝細(xì)胞保持在高于30℃例如大約37℃(這是生理?xiàng)l件)的溫度下時(shí)，和在15到30℃保存細(xì)胞的情況相比，肝細(xì)胞的酶活性和酶誘導(dǎo)活性降得更低。肝細(xì)胞保持的溫度優(yōu)選18到27℃，更優(yōu)選20到25℃。
用在本發(fā)明中保持新鮮肝細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是用于動(dòng)物細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的例子包括Lanford’s培養(yǎng)基、William’s E(WME)培養(yǎng)基、Isom’s培養(yǎng)基、Leibovitz L15培養(yǎng)基、添加了聚乙二醇的Leibovitz L15培養(yǎng)基及其任意組合。尤其優(yōu)選的培養(yǎng)基至少包含Lanford’s培養(yǎng)基。
加到保持新鮮肝細(xì)胞的培養(yǎng)基中的肝細(xì)胞數(shù)量是0.5×106到10×106細(xì)胞/mL，優(yōu)選1×106到10×106細(xì)胞/mL。
肝細(xì)胞在15到30℃的保持時(shí)間是1到6天，優(yōu)選2到6天。
肝細(xì)胞在15到30℃保持1到6天以后，細(xì)胞在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)。優(yōu)選地，在生理?xiàng)l件下的培養(yǎng)是在37±1℃的常規(guī)培養(yǎng)基中進(jìn)行。如此處所用的，對(duì)于培養(yǎng)基沒有特別限制，只要它能用于常規(guī)培養(yǎng)所用的動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，培養(yǎng)基和保持上述新鮮肝細(xì)胞時(shí)所采用的培養(yǎng)基是一樣的。特別優(yōu)選使用至少包含Lanford’s培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。
當(dāng)肝細(xì)胞如上所述在生理?xiàng)l件下進(jìn)行了持續(xù)培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的酶活性和酶誘導(dǎo)活性經(jīng)過較長時(shí)間，也就是說，經(jīng)過1個(gè)月或更長時(shí)間也不會(huì)降低，因此，肝細(xì)胞可以用于酶活性或藥物代謝的酶誘導(dǎo)活性的準(zhǔn)確測量?？蓽y量的酶活性的例子包括α1-抗胰蛋白酶活性、谷氨酰胺-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、GOT、GPT的尿素生成和白蛋白合成能力。酶誘導(dǎo)活性的例子包括誘導(dǎo)屬于CYP家族的酶，如CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E6和CYP3A4。
肝細(xì)胞尤其是人肝細(xì)胞的獲得并不容易。尤其當(dāng)從生物體獲得肝細(xì)胞的位置遠(yuǎn)離進(jìn)行試驗(yàn)的位置時(shí)，例如在跨越國界的情況下，肝細(xì)胞的運(yùn)輸通常需要2天或更多天。本發(fā)明的方法特別適合于長途運(yùn)輸細(xì)胞以后進(jìn)行試驗(yàn)的情況。
實(shí)施例下面將以實(shí)施例的形式更詳細(xì)地描述本發(fā)明，這不應(yīng)當(dāng)看作是對(duì)本發(fā)明的限制。
A.材料和方法(1)肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)從四個(gè)病人身上取出人肝。從年輕雄性猴子身上獲得猴肝。
從用已知方法(Drug Metab.Dispos.18595-606(1990)，Mol.Pharmacol.411047-1055(1992)，J.Pharmacol.Exp.Ther.269384-392(1994))進(jìn)行了肝葉切除術(shù)的肝臟收集人肝細(xì)胞并培養(yǎng)。用臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)檢查將進(jìn)行平皿培養(yǎng)的細(xì)胞的活力，發(fā)現(xiàn)是80％到90％。在放在培養(yǎng)瓶(25cm2)中的覆蓋有膠原I(5μm/cm2)的Isom’s培養(yǎng)基里接種肝細(xì)胞，以獲得融合(12.4×104細(xì)胞/cm2)。所采用的培養(yǎng)基是Ham F12和William’s E的1∶1混合物，它是按照Proc.Nat.Acad.Sci.USA；816378-6382(1984)中的描述制備的。在細(xì)胞接種后頭4個(gè)小時(shí)內(nèi)加入5％小牛血清以促進(jìn)細(xì)胞粘著。肝細(xì)胞平皿培養(yǎng)后4小時(shí)，去除添加了小牛血清的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，取而代之加入Lanford’s培養(yǎng)基。因此，在培養(yǎng)的第1天，更換了培養(yǎng)基，接著，在5％CO2、37℃的潮濕環(huán)境下保持肝細(xì)胞的培養(yǎng)產(chǎn)物3天或4天。按照這種方法，一旦確定了肝細(xì)胞培養(yǎng)體系，通過抽吸去除Lanford’s培養(yǎng)基。用5％CO2平衡的95％空氣凈化燒瓶內(nèi)部，裝入Lanford’s培養(yǎng)基(簡寫為“Lnf”)、添加了5％聚乙二醇的Leibovitz L15(Sigma化學(xué)品公司)培養(yǎng)基(簡寫為“L15+5％PEG”)或Isom’s培養(yǎng)基(37℃)。然后在冰凍條件或室溫下保持燒瓶2、4或6天。接著，含肝細(xì)胞的燒瓶的培養(yǎng)基被再次更換為Lnf，并在37℃長期培養(yǎng)。為了評(píng)價(jià)培養(yǎng)基、溫度和保存期對(duì)肝細(xì)胞活力和功能的影響，測試每次更換培養(yǎng)基后的24小時(shí)收集的細(xì)胞的代表細(xì)胞表型的幾個(gè)參數(shù)。特別地，測試參數(shù)包括尿素合成能力(通過酶/光譜分析)和α1-抗胰蛋白酶或白蛋白合成能力(通過蛋白質(zhì)印跡法)。以與最初值和對(duì)照組數(shù)據(jù)相比較的方式顯示結(jié)果(對(duì)照在試驗(yàn)期間于37℃下保持在Lnf中的那組)。此外，還研究了在細(xì)胞色素P450酶的誘導(dǎo)方面(利福平對(duì)CYP3A4的誘導(dǎo))的細(xì)胞的反應(yīng)。這種反應(yīng)被認(rèn)為是最好的表征了肝特異的表型是否得以保持的指數(shù)，由于它可以預(yù)期藥物相互作用，因此，在藥物開發(fā)中被用作評(píng)價(jià)因素。
(2)培養(yǎng)基組合物所采用的培養(yǎng)基組合物示于表1、2和3中。
表1Lanford’s培養(yǎng)基(Lnf)

表2L15+5％PEG


表3Isom’s培養(yǎng)基

(3)溶解產(chǎn)物的制備使用離心機(jī)，用已知方法從培養(yǎng)的細(xì)胞制備溶解產(chǎn)物，并保存至使用的時(shí)候。用bicinchoninate法測量溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度(Pierce化學(xué)品公司)。
(4)培養(yǎng)肝細(xì)胞的細(xì)胞外培養(yǎng)基中包含的血清蛋白的量用人蛋白特異的抗體通過蛋白質(zhì)印跡法(western blotting)測量細(xì)胞外培養(yǎng)基(5到20μL培養(yǎng)基)中包含的白蛋白和α1-抗胰蛋白酶的量。從2個(gè)燒瓶(其中培養(yǎng)了細(xì)胞)中收集培養(yǎng)基樣品。合并收集的樣品，接著于11,000×g離心分離5分鐘并在-80℃保存直到用于分析。
(5)培養(yǎng)的肝細(xì)胞中包含的CYPs的量根據(jù)《肝臟病學(xué)》221143-1153(1995)中描述的方法，使用特異的多克隆或單克隆抗體，通過溶解產(chǎn)物的免疫印跡法(immunoblotting)對(duì)CYPs進(jìn)行定量。加到每個(gè)凝膠中的標(biāo)準(zhǔn)品是含有遺傳表達(dá)的CYP2C9、CYP2C19或CYP3A4(Gentest)的微粒體。
在轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上之前，對(duì)溶解產(chǎn)物進(jìn)行電泳(SDS 10％聚丙烯酰胺凝膠)。用ECL(增強(qiáng)的化學(xué)熒光)(Amersham)展開樣品點(diǎn)。根據(jù)LE程序進(jìn)行掃描，根據(jù)NIH成像1.6/ppc程序進(jìn)行質(zhì)量分析計(jì)算CYP的相對(duì)含量。
(6)細(xì)胞外培養(yǎng)基中包含的培養(yǎng)肝細(xì)胞的尿素合成能力用酶/光譜分析試劑盒(Sigma化學(xué)品公司)測量尿素合成能力。
B.結(jié)果(1)保存溫度對(duì)尿素合成能力的影響在0℃或25℃下，在Lnf或L-15+5％PEG中保持猴肝細(xì)胞2天。接著在37℃下于Lnf中培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)了1、2、3、8或11天后，猴肝細(xì)胞的尿素合成能力顯示在圖1中。從圖1清楚的看到，和在37℃下于Lnf中保存后再培養(yǎng)的對(duì)照組細(xì)胞的尿素合成能力相比，在0℃下保存再被培養(yǎng)的細(xì)胞組的尿素合成能力在下列兩種情況下都比較低；也就是說，細(xì)胞在Lnf中培養(yǎng)的情況和細(xì)胞在L-15+5％PEG中培養(yǎng)的情況。相反，發(fā)現(xiàn)在25℃保存后再在Lnf中培養(yǎng)的細(xì)胞組和在25℃保存后再在L-15+5％PEG中培養(yǎng)的細(xì)胞組都保持了較相應(yīng)的對(duì)照組高的尿素合成能力。Lnf比L-15+5％PEG提供了更好的結(jié)果。
(2)α1-抗胰蛋白酶合成能力和CYP3A4誘導(dǎo)能力在Lnf或L-15+5％PEG中，在25℃下保持猴肝細(xì)胞2天(48小時(shí))或4天(96小時(shí))。接著，在Lnf中，在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞，測量細(xì)胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。結(jié)果顯示在圖2和3中。圖2和3中顯示的數(shù)據(jù)是相對(duì)于細(xì)胞從一開始就在37℃下保存和培養(yǎng)的試驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)相比的相對(duì)值。
圖2和3清楚的顯示，細(xì)胞在25℃下保存了2天或4天后再培養(yǎng)的情況與細(xì)胞從一開始就在37℃下保存和培養(yǎng)的情況相比，在培養(yǎng)期的第8到15天保持了較高的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
猴肝細(xì)胞在25℃下分別在Lnf中或L-15+5％PEG中保持了2天(48小時(shí))。接著在Lnf中，在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞，測量細(xì)胞的CYP3A4誘導(dǎo)能力。結(jié)果顯示在圖4中。圖4還顯示了細(xì)胞從一開始就在37℃下保存和培養(yǎng)的情況獲得的相對(duì)值。
圖4清楚的顯示，細(xì)胞在25℃下保持了2天后再培養(yǎng)的情況與細(xì)胞從一開始就在37℃下保存和培養(yǎng)的情況(1.8倍)相比，在培養(yǎng)的第10到14天觀察到了較強(qiáng)的CYP3A4誘導(dǎo)能力(2.3倍和2.4倍)。
(3)對(duì)尿素合成能力的影響(人肝細(xì)胞)在25℃下，在Lnf或Isom中保存人肝細(xì)胞2、4或6天。接著在37℃下，在Lnf中培養(yǎng)細(xì)胞，測量細(xì)胞的尿素合成能力。結(jié)果顯示在圖5、6和7中。
圖5、6和7清楚的顯示，與細(xì)胞從一開始就在37℃下保存和培養(yǎng)的對(duì)照組相比，在25℃下，在Lnf或Isom中保存了2、4或6天后再被培養(yǎng)的細(xì)胞顯示了較強(qiáng)的尿素合成能力。
(4)白蛋白合成能力和α1-抗胰蛋白酶合成能力(人肝細(xì)胞)在25℃下，在Lnf或Isom中保存人肝細(xì)胞4天。接著在37℃下，在Lnf中培養(yǎng)細(xì)胞，測量白蛋白合成能力和α1-抗胰蛋白酶合成能力。結(jié)果顯示在圖8和9中。
圖8和9清楚的顯示，與細(xì)胞從一開始就在37℃下保存和培養(yǎng)的對(duì)照組相比，在25℃下保存了4天后再培養(yǎng)的細(xì)胞顯示了較強(qiáng)的白蛋白合成能力和較強(qiáng)的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
(5)CYP3A4誘導(dǎo)能力(人肝細(xì)胞)在25℃下，在Lnf中或L-15+5％PEG中保持人肝細(xì)胞2、4或6天。接著在37℃下，在Lnf中培養(yǎng)細(xì)胞，測量細(xì)胞的CYP3A4誘導(dǎo)能力。結(jié)果顯示在圖10中。
圖10清楚的顯示，與細(xì)胞從一開始就在37℃下保存和培養(yǎng)的對(duì)照組相比，在25℃下，在Lnf中或L-15+5％PEG中保存了2、4或6天后再培養(yǎng)的細(xì)胞顯示了較強(qiáng)的CYP3A4誘導(dǎo)能力。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的方法可以長期培養(yǎng)肝細(xì)胞而不會(huì)引起酶活性或酶誘導(dǎo)活性降低。而且，由于細(xì)胞可以在近似于室溫的條件下保存1到6天，本發(fā)明的方法對(duì)于肝細(xì)胞分離后長途運(yùn)輸是很有用的。
權(quán)利要求
1.一種長期培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法，其特征在于在15到30℃下，在培養(yǎng)基中保持新鮮肝細(xì)胞1到6天，接著在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的長期培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法，其中，新鮮肝細(xì)胞的培養(yǎng)基至少含有Lanford’s培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的長期培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法，其中，在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)是在37±1℃下，在至少含有Lanford’s培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中進(jìn)行的。
全文摘要
一種長期培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法，其特征在于在15到30℃下，在培養(yǎng)基中保持新鮮肝細(xì)胞1到6天，接著在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)。本發(fā)明的方法可以長期培養(yǎng)肝細(xì)胞而不會(huì)引起酶活性或酶誘導(dǎo)活性降低。而且，由于細(xì)胞可以在近似于室溫的條件下保存1到6天，本發(fā)明的方法對(duì)于肝細(xì)胞分離后長途運(yùn)輸是很有用的。
文檔編號(hào)C12N5/071GK1628166SQ0282898
公開日2005年6月15日 申請日期2002年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月4日
發(fā)明者島田典招, P·毛雷爾 申請人:第一化學(xué)藥品株式會(huì)社