專利名稱：用于疫苗和基因治療的改進(jìn)的腺病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及使用改良的腺病毒載體進(jìn)行免疫接種的領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及基因治療領(lǐng)域以及在用攜帶轉(zhuǎn)基因的病毒載體(如腺病毒)治療的患者中改變免疫應(yīng)答的方法和元件(means)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的疫苗的實(shí)例包括減毒活疫苗、完整的滅活疫苗、亞單位疫苗(無論是否基于重組蛋白)、肽疫苗、(裸)DNA疫苗、以及免疫原載體，例如改進(jìn)的痘苗病毒(MVA)、重組腺病毒、痘病毒或α病毒。由于對于許多疾病來說并不知道究竟是免疫系統(tǒng)的哪一種成分(抗體和/或T細(xì)胞)在起到保護(hù)作用，因此理想的疫苗應(yīng)該能夠引發(fā)細(xì)胞和體液兩種有效的應(yīng)答。腺病毒在本領(lǐng)域很受重視，這是因?yàn)槠淠軌蛞愿叩味冗M(jìn)行制備，已經(jīng)證明，對于多種病原體來說，其始終是一種高度有效的疫苗運(yùn)載工具(vaccine vehicle)(Bruna-Romero等，2001；Sullivan等，2000)，且在與例如MVA進(jìn)行的直接比較研究中，腺病毒被證實(shí)在非人靈長類動物HIV模型中能夠出色地誘導(dǎo)免疫和針對攻擊試驗(yàn)的保護(hù)作用(Shiver等，2002)。此外，腺病毒似乎能夠誘導(dǎo)針對由所包含的核酸所編碼的插入性抗原或蛋白質(zhì)的體液(抗體)和細(xì)胞(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞)兩種免疫應(yīng)答(Bruna-Romero等，2001；Shi等，2001；Shiver等，2002；Sullivan等，2000)。因此，在重組腺病毒中插入編碼來自各種不同病原體(病毒、細(xì)菌等等)的抗原性蛋白質(zhì)或通過在重組腺病毒中使用腫瘤特異性蛋白(腫瘤免疫接種)，原則上應(yīng)該能夠使宿主免疫系統(tǒng)被抗原激發(fā)，從而產(chǎn)生針對所述病原體的感染的保護(hù)作用(預(yù)防性免疫接種)或清除患病的和/或感染的細(xì)胞(治療性免疫接種)。
除了在疫苗中具有潛在應(yīng)用，腺病毒還廣泛用于基因治療方案中。用于兩種治療用途的其他的病毒載體系統(tǒng)的例子是α病毒(例如塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、辛德畢斯病毒(Sindbis virus)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis virus))、人免疫缺陷病毒(HIV)、痘病毒和流感病毒。使用腺病毒所遇到的一個問題是，人群中的大部分均曾經(jīng)數(shù)次遭遇腺病毒感染，因此會產(chǎn)生抗多種不同血清型的中和抗體(高)滴度。本領(lǐng)域面臨的一個主要任務(wù)是克服這一問題并提供與常規(guī)使用的腺病毒(例如Ad2、Ad3、Ad5、Ad7和Ad12)相比明顯較少被中和且仍然能夠感染目的靶細(xì)胞的(重組)腺病毒。盡管已經(jīng)提出了多種針對這些問題的解決方案(例如通過使用嵌合腺病毒或難于中和的血清型(WO 00/03029、WO 02/24730和WO 00/70071)，但現(xiàn)在已經(jīng)清楚的是，由于細(xì)胞過程可能并不限于所使用的血清型或存在因早期感染而產(chǎn)生的中和抗體，在感染水平，重組病毒仍然只能分選出有限的效應(yīng)。
一些研究指出，直接應(yīng)用腺病毒可產(chǎn)生針對插入抗原的有效的免疫應(yīng)答。就此而言，采用何種施用途徑似乎并不重要。但重要的是，僅有少數(shù)研究探討了各種不同的細(xì)胞類型在引發(fā)B細(xì)胞或T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中的作用(Shi等，2001；Xiang等，2002)。肌肉注射是本領(lǐng)域最常采用的免疫接種途徑。骨骼肌中的細(xì)胞類型主要是肌纖維或肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，以及很少的成肌細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
在一個研究中，通過體外培養(yǎng)并轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞，并隨后將固定數(shù)量的轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞移植入同基因型小鼠，來研究各種不同的細(xì)胞類型在引發(fā)免疫應(yīng)答中的作用(Mercier等，2002)。通過觀察這些小鼠針對插入性抗原(在該研究中為β-Gal)的免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞類型均能夠誘導(dǎo)針對β-Gal的抗體應(yīng)答，但只有移植了樹突狀細(xì)胞的小鼠能夠同時引發(fā)針對β-Gal的CD8+-T細(xì)胞應(yīng)答。這些研究清楚說明，樹突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中起了重要的作用。
致力于誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的兩種機(jī)制的疫苗應(yīng)該由能夠?qū)⒖乖斔椭廖挥谑┯昧艘呙绲慕M織中的樹突狀細(xì)胞的生物制劑組成。對于腺病毒血清型5(Ad5，經(jīng)常用于基因治療和免疫接種)，已知需要高病毒負(fù)荷才能轉(zhuǎn)導(dǎo)靈長類動物和嚙齒動物的樹突狀細(xì)胞，以便使得插入性抗原在這些細(xì)胞中以某種程度的表達(dá)(Rea等，2001)。樹突狀細(xì)胞對Ad5所具有的這種低易感性被認(rèn)為是由于Ad5受體(柯薩奇腺病毒受體(CoxsackieAdenovirus Receptor，CAR))表達(dá)的缺乏或過低引起的。本領(lǐng)域中現(xiàn)在已知一些這樣的腺病毒載體，即這些腺病毒載體具有不同的向性，以便使得載體能夠有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)樹突狀細(xì)胞，即那些由于外殼蛋白交換(coat-protein swaps)(例如纖維(fiber)、六鄰體(hexon)、五鄰體(penton)和/或纖維部分)而獲得了新的向性的嵌合腺病毒載體，以及那些具有不同于Ad5向性的一種天然向性(例如Ad11、Ad35以及來自其他不同于亞群C的subgroup的其他血清型)的腺病毒血清型(Farina等，2001；Havenga等，2002；Mastrangeli等，1996；Rea等，2001)。
本領(lǐng)域普遍接受這一認(rèn)識，即樹突狀細(xì)胞對于引起有效的抗外來抗原的免疫反應(yīng)來說是至關(guān)重要的(Guermonprez等，2002；Lanzavecchia等，2001)。樹突狀細(xì)胞在體內(nèi)可分為不同的階段(成熟的和未成熟的)，可通過將細(xì)胞培養(yǎng)于組織培養(yǎng)皿中且在存在一組確定的生長因子(例如IL-4和GM-CSF)的情況下在體外模擬這些階段?，F(xiàn)有的免疫學(xué)方面的知識認(rèn)為，未成熟的樹突狀細(xì)胞是“抗原清道夫(antigen scavengers)”且因此可有效地捕獲并加工抗原。捕獲抗原后即可誘導(dǎo)成熟過程。在這一過程中，可觀察到表面的肽-MHC復(fù)合體的數(shù)量發(fā)生上調(diào)，共刺激分子(co-stimululatory molecule)的表達(dá)增加，且細(xì)胞向淋巴器官遷移。經(jīng)過CD4+ T細(xì)胞充分激活后，原初 CD8+T細(xì)胞被樹突狀細(xì)胞刺激，產(chǎn)生細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)群，后者被激發(fā)以殺死體內(nèi)所有含有該抗原的細(xì)胞(Lanzavecchia 1998)。這些已經(jīng)獲得了“殺傷狀態(tài)”的CTL至少通過兩種機(jī)制誘導(dǎo)其靶細(xì)胞發(fā)生凋亡一種是通過攝取由CTL產(chǎn)生的名為粒酶B(GranzymeB)的蛋白而導(dǎo)致DNA片段化，而另一種涉及死亡受體的交聯(lián)。兩種機(jī)制均非常迅速，在樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的原初T細(xì)胞的活化過程中，兩種機(jī)制均被明顯誘導(dǎo)(Liu等，1989)。這后一種現(xiàn)象導(dǎo)致產(chǎn)生這樣一個疑問，即在樹突狀細(xì)胞激活CTL后，樹突狀細(xì)胞自身是否也被殺死呢？如果確是如此，那么這將是一種極其不適當(dāng)?shù)那闆r，其有可能導(dǎo)致針對抗原的T細(xì)胞應(yīng)答嚴(yán)重受限。重要的是，實(shí)際上在體外研究中的確發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生病毒感染后數(shù)天，感染病毒的樹突狀細(xì)胞顯示出對CTL的殺傷作用是敏感的(Knight等，1997)。
與這一現(xiàn)象不同的是，本領(lǐng)域普遍認(rèn)為，病毒可運(yùn)用多種不同的方法來躲避免疫系統(tǒng)并規(guī)避針對被感染的宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答。已經(jīng)鑒別出病毒基因組的許多區(qū)域，其編碼的蛋白在此類過程中具有作用。例如，腺病毒含有一個早期表達(dá)區(qū)域，即E3，通過它一些蛋白可例如下調(diào)細(xì)胞的MHC分子的表達(dá)，以降低宿主免疫應(yīng)答的作用。本領(lǐng)域普遍認(rèn)為，病毒，例如腺病毒，已經(jīng)經(jīng)過了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)化過程，可在一定程度上逃避宿主免疫應(yīng)答。
Borrow等(1995)進(jìn)行了一個有趣的病毒誘導(dǎo)免疫抑制的研究，其中將Choriomeningitis病毒(LCMV)用于作為該病毒的天然宿主的小鼠中。該研究證實(shí)，給成年小鼠接種LCMV的“Armstrong”毒株后病毒顆粒被快速清除，由此小鼠仍然具有免疫活性。與此不同的是，給小鼠接種一種稱為“克隆3”的變異LCMV毒株(其與親代毒株具有2個氨基酸的差異)后導(dǎo)致持續(xù)的感染，且產(chǎn)生明顯的免疫抑制。隨后對這兩種LCMV毒株的生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，LCMV克隆3與Armstrong毒株不同，其能夠非常有效地感染樹突狀細(xì)胞，結(jié)果導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞被清除。導(dǎo)致病毒感染持續(xù)存在的原因是感染LCMV克隆3的樹突狀細(xì)胞被過多清除，而這與CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作用明顯相關(guān)。顯然，與Armstrong毒株相比，LCMV克隆3對樹突狀細(xì)胞具有不同的向性，這可以說明向性在病毒的致病性中具有關(guān)鍵的作用。顯然，一些病毒能夠通過殺死樹突狀細(xì)胞而建立持續(xù)的感染。根據(jù)在此所做的描述，與對樹突狀細(xì)胞具有向性的腺病毒血清型相似，LCMV克隆3很可能影響了CD8+細(xì)胞的有效殺傷樹突狀細(xì)胞的能力，且因此建立了一種與靶向非樹突狀細(xì)胞的病毒不同的免疫逃避機(jī)制。


圖1以6種不同的抗人mAb染色的CD14+細(xì)胞(單核細(xì)胞)、未成熟DC(粗灰線)和成熟DC(細(xì)黑線)、和感染了腺病毒的未成熟的和成熟的DC。單核細(xì)胞僅表達(dá)CD14。通過CD14減少并表達(dá)CD86、HLAABC(I類MHC)和HLA DR(II類MHC)可證明單核細(xì)胞分化為未成熟的DC。通過誘導(dǎo)CD83表達(dá)以及CD86、HLA ABC和HLA DR表達(dá)的增強(qiáng)可證明DC的成熟。感染腺病毒并未產(chǎn)生表達(dá)水平的明顯不同。
圖2CTL殺傷成熟的(空心符號)和未成熟的(實(shí)心符號)樹突狀細(xì)胞。(A)攜帶肽的成熟樹突狀細(xì)胞僅被中等程度殺傷，而未成熟樹突狀細(xì)胞對CTL介導(dǎo)的殺傷作用易感。(B)感染了腺病毒載體的成熟的和未成熟樹突狀細(xì)胞對殺傷作用均高度易感。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，樹突狀細(xì)胞受到病毒感染可導(dǎo)致該樹突狀細(xì)胞對細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的敏感性增加。因此，如果用樹突狀細(xì)胞特異性重組腺病毒(例如Ad35或嵌合病毒例如Ad5.fib35)感染樹突狀細(xì)胞，那么即使該細(xì)胞最初對CTL殺傷作用相對具有抗性，但感染的樹突狀細(xì)胞很可能會因腺病毒感染所誘導(dǎo)的效應(yīng)而被CTL快速清除。這顯然為在(腫瘤)免疫接種方面探索有效的可靠的藥物組合物提出了一個新的潛在的問題。也許人們會需要免疫原性轉(zhuǎn)基因在樹突狀細(xì)胞中能夠長期表達(dá)，由此產(chǎn)生更有效的疫苗。有趣的是，在另一方面，從基因治療的目的出發(fā)，顯然希望對用作藥物組合物中的基因運(yùn)載工具(gene deliveryvehicle)的病毒載體僅產(chǎn)生非常有限的免疫應(yīng)答。實(shí)際上是希望延長轉(zhuǎn)基因在目的靶組織中而非樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)時間。為此，應(yīng)該產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞-CTL級聯(lián)的短暫應(yīng)答，以確保僅對所使用的病毒載體產(chǎn)生低的免疫應(yīng)答。因此，盡管疫苗要求產(chǎn)生高CTL應(yīng)答并需要長期存在感染的樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞，但有益的是，基因治療藥物應(yīng)該對呈遞病毒抗原的樹突狀細(xì)胞具有短暫的CTL應(yīng)答，以降低針對運(yùn)載工具的蛋白的免疫應(yīng)答，并因此延長由感染了目的組織的該運(yùn)載工具所提供的轉(zhuǎn)基因的存在和活性。另一種用途是使用攜帶治療基因的病毒載體導(dǎo)向不需要的細(xì)胞。這可在攜帶治療性核酸序列的載體中引入一種異源性核酸序列，當(dāng)其表達(dá)后，可在所述細(xì)胞中下調(diào)PI-9，以便使得細(xì)胞對CTL相關(guān)性殺傷作用敏感。
為了克服至少一部分在此所面臨的問題，本發(fā)明提供了新的基因運(yùn)載工具，例如病毒載體，其能夠?qū)愒葱院怂彷斔椭量山邮茉摶蜻\(yùn)載工具的細(xì)胞中，其中所述基因運(yùn)載工具包含一種(異源性)核酸，所述核酸當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)后可引起細(xì)胞中的蛋白酶抑制劑-9(PI-9)的水平升高或保持在基本上穩(wěn)定的水平。本發(fā)明還提供了新的基因運(yùn)載工具，例如病毒載體，其能夠?qū)愒葱院怂彷斔椭量山邮茉摶蜻\(yùn)載工具的細(xì)胞中，其中所述基因運(yùn)載工具包含一種核酸，所述核酸當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)后可引起細(xì)胞中的PI-9的功能升高或保持在基本上穩(wěn)定的水平。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了新的基因運(yùn)載工具，例如病毒載體，其能夠?qū)愒葱院怂彷斔椭量山邮茉摶蜻\(yùn)載工具的細(xì)胞中，其中所述基因運(yùn)載工具包含一種(異源性)核酸，所述核酸當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)后可引起細(xì)胞中的PI-9的水平和/或功能降低。本發(fā)明的基因運(yùn)載工具可用于多種治療方案中，例如基因治療和/或免疫接種。
此外，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)細(xì)胞對CTL的敏感性的方法，其包含以下步驟用本發(fā)明的基因輸送載體感染所述細(xì)胞。
具體實(shí)施方案本發(fā)明的目的之一在于為至少一部分以上提及的問題提供一種解決方案，并在免疫接種過程中預(yù)防感染了病毒載體的樹突狀細(xì)胞對CTL的敏感性升高，并降低針對在基因治療用途中用作基因運(yùn)載工具的病毒載體的免疫應(yīng)答。為此，本發(fā)明提供了一種病毒載體，其能夠?qū)⑼鈦鞤NA輸送至能夠接受該外來DNA的細(xì)胞中，所述病毒載體包含一種核酸序列，所述核酸序列當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)后，可引起PI-9的水平升高或使之保持在穩(wěn)定的水平。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種病毒載體，其能夠?qū)⑼鈦鞤NA輸送至能夠接受該外來DNA的細(xì)胞中，所述病毒載體包含一種核酸序列，當(dāng)所述核酸序列在該細(xì)胞中表達(dá)時，可引起PI-9的水平降低。
本發(fā)明提供了一種基因運(yùn)載工具，例如一種病毒載體，其能夠?qū)愒葱院怂彷斔椭聊軌蚪邮茉摬《据d體的細(xì)胞中，其中所述病毒載體包含一種異源性核酸序列，當(dāng)所述異源性核酸序列在該細(xì)胞中表達(dá)時，可引起該細(xì)胞中的蛋白酶抑制劑-9(PI-9)的水平和/或活性升高或保持在基本上穩(wěn)定的水平。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒載體選自腺病毒、α病毒、痘病毒、痘苗病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒。在一個更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒載體是一種(重組)腺病毒，或其功能性衍生物。更為優(yōu)選的的是一種來自亞群B的腺病毒血清型其中所述來自亞群B的腺病毒血清型選自Ad11、Ad26、Ad35和Ad50。特別優(yōu)選的是重組腺病毒載體，其遇到的因曾經(jīng)感染該特定血清型的野生型或重組腺病毒而產(chǎn)生的中和抗體的水平較低。此類腺病毒的實(shí)例見于WO 00/70071，其中Ad35的功能性等價物為類似于Ad35的腺病毒血清型，不足大約10％的首次施用該腺病毒血清型的宿主中對其已經(jīng)存在免疫力，或者其能夠在超過大約90％的施用該腺病毒血清型的宿主中避免或減弱免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的一個具體方面，本發(fā)明的重組腺病毒包含一種嵌合殼體，其包含來自至少兩種不同腺病毒血清型的蛋白和/或蛋白片段。本領(lǐng)域已知，為了將重組病毒載體例如腺病毒靶向特定的靶細(xì)胞，可以使用來自不同腺病毒血清型的片段，其中主鏈血清型攜帶例如一種異源性核酸(如一種治療性基因)，而殼體由來自兩種或更多腺病毒血清型的片段組成。此類“嵌合”載體的實(shí)例為來自腺病毒血清型5(Ad5)的腺病毒，攜帶來自例如Ad11、Ad16或Ad35的纖維的全長或片段。此類載體也稱為Ad5.fib11、Ad5.fib16或Ad5.fib35，可用于將例如腺病毒載體導(dǎo)向抗原呈遞細(xì)胞(APC)，例如樹突狀細(xì)胞。本領(lǐng)域已知可產(chǎn)生眾多交換(swaps)，并將其用于靶向大量不同的靶組織和細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞、APC、平滑肌細(xì)胞、肺細(xì)胞、某些血細(xì)胞和上皮細(xì)胞。因此，在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種本發(fā)明的病毒載體，其中所述細(xì)胞是APC。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是樹突狀細(xì)胞或B細(xì)胞，其中所述樹突狀細(xì)胞是未成熟的或成熟的?？勺鳛榘械臉渫粻罴?xì)胞的其他實(shí)例為動脈周圍并指狀樹突狀細(xì)胞(peri-arterial inter-digitating DC)。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的病毒載體，其中所述異源性核酸包含編碼PI-9的核酸或其功能性等價物。功能性等價物可以是衍生物、片段、部分、突變體等等，它們在正常表達(dá)PI-9或所述等價物的細(xì)胞中均仍然具有控制和/或調(diào)節(jié)該細(xì)胞對CTL的敏感性的功能。應(yīng)該理解的是，如果存在以類似方式調(diào)節(jié)CTL敏感性的同源性PI-9，那么這些功能物(和/或序列同源物)可用于類似的基因運(yùn)載工具中，以達(dá)到在此所討論的目的。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種病毒載體，其能夠?qū)愒葱院怂彷斔椭聊軌蚪邮茉摬《据d體的細(xì)胞中，其中所述病毒載體包含一種異源性核酸序列，當(dāng)所述異源性核酸序列在該細(xì)胞中表達(dá)時，可引起該細(xì)胞中PI-9的水平和/或功能降低。優(yōu)選地，該病毒載體包含一種編碼反義PI-9 RNA的核酸或其功能性等價物。任何降低靶細(xì)胞的PI-9水平和/或功能的核酸均為一種功能性等價物。應(yīng)該理解的是，如果基因存在抑制PI-9的功能和/或降低PI-9蛋白水平的編碼因子，那么此類基因也可用于本發(fā)明的病毒載體中，以達(dá)到在此討論的目的。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含一種本發(fā)明的病毒載體；和一種藥物可接受的載體。此外，本發(fā)明提供了一種接觸和/或感染了本發(fā)明的基因運(yùn)載工具的樹突狀細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一個方面中，提供了一種調(diào)節(jié)細(xì)胞對CTL的敏感性的方法，所述方法包含以下步驟用包含一種異源性核酸序列的病毒載體感染該細(xì)胞，當(dāng)所述異源性核酸序列在該細(xì)胞中表達(dá)時，可引起該細(xì)胞中PI-9的水平和/或活性升高或保持在基本上穩(wěn)定的水平，同時，在另一方面提供了一種調(diào)節(jié)細(xì)胞對CTL的敏感性的方法，所述方法包含以下步驟用包含一種異源性核酸序列的病毒載體感染該細(xì)胞，當(dāng)所述異源性核酸序列在該細(xì)胞中表達(dá)時，可引起該細(xì)胞中PI-9的水平和/或活性降低。
可以預(yù)見一些升高或降低對CTL的殺傷作用敏感的細(xì)胞內(nèi)的PI-9和/或其等價物的水平和/或功能的方法。一種優(yōu)選的方法是采用基因輸送載體?；蜉斔洼d體的實(shí)例是包含待輸送的核酸的病毒載體和微顆粒。病毒載體的實(shí)例是DNA病毒以及RNA病毒。因此，輸送至目的細(xì)胞的本發(fā)明的核酸可以是RNA以及DNA。
“異源性”在此指的是所有對于摻入其中的基因輸送載體來說是外來的核酸。例如，如果一種“異源性”核酸被克隆入一種腺病毒基因組，這意味著該異源性核酸不存在于該特定的腺病毒的野生型中。異源性核酸的實(shí)例是治療性基因，例如那些編碼腫瘤抗原、來自病原體例如細(xì)菌和病毒的免疫原性抗原、誘導(dǎo)凋亡蛋白、激素和細(xì)胞因子。異源性核酸還可以來自與摻入其中的血清型不同的一種血清型。
人蛋白酶抑制劑-9(PI-9)及其許多序列同源物、分布同源物、和功能同源物是本領(lǐng)域已知的，例如小鼠絲氨酸蛋白酶抑制劑-6(SPI-6)(Sprecher等，1995；Sun等，1997)。SPI-6是絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白家族(serpin protein family)的成員。該蛋白最有可能特異性滅活粒酶B(見下文)，由此預(yù)防CTL誘導(dǎo)的凋亡。最近的研究顯示，來自小鼠和人的未成熟樹突狀細(xì)胞對CTL的殺傷作用具有易感性，但當(dāng)其成熟后，CTL變不能再破壞樹突狀細(xì)胞(Medema等，2001)。一種假設(shè)認(rèn)為，存在一種能夠保護(hù)樹突狀細(xì)胞免于CTL介導(dǎo)的殺傷作用的細(xì)胞機(jī)制。這種對CTL敏感性的降低已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)上被證明是由小鼠樹突狀細(xì)胞內(nèi)的SPI-6表達(dá)升高所致。盡管認(rèn)為保護(hù)原初成熟樹突狀細(xì)胞免于CTL的細(xì)胞殺傷作用的原因是SPI-6/PI-9的上調(diào)，但一個有趣的問題涉及伴隨SPI-6/PI-9上調(diào)和下調(diào)的生物學(xué)途徑。如上所述，可以是來自病毒的蛋白質(zhì)直接影響細(xì)胞表達(dá)SPI-6/PI-9，或者可以是來自樹突狀細(xì)胞的應(yīng)激應(yīng)答導(dǎo)致蛋白酶抑制劑的上調(diào)和下調(diào)。
CTL對樹突狀細(xì)胞的殺傷作用至少由兩種機(jī)制引起第一種機(jī)制包括釋放成孔分子、穿孔素和細(xì)胞毒蛋白質(zhì)粒酶B(Heusel等，1994；Kagi等，1994)。自CTL分泌后，粒酶B結(jié)合6-磷酸甘露糖受體并經(jīng)由受體介導(dǎo)的胞吞作用被靶細(xì)胞攝取(Motyka等，2000)。通過穿孔素，粒酶B自內(nèi)體釋放至靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(Shi等，1997)。一旦粒酶B出現(xiàn)在胞漿中，其可通過裂解細(xì)胞底物例如caspase-3、caspase-7、caspase-8和Bid(caspase活化的DNAase的抑制劑)而誘導(dǎo)凋亡，導(dǎo)致DNA片段化(Trapani等，2000)。CTL殺死其靶細(xì)胞所采用的第二種機(jī)制是通過死亡受體的交聯(lián)。這一過程涉及Fas-Fas配體相互作用，該相互作用誘導(dǎo)caspase途徑，導(dǎo)致殺死靶細(xì)胞(Berke 1995)。
如上所述，已經(jīng)開發(fā)了一些基因運(yùn)載工具，例如重組腺病毒，以用于基因治療以及免疫接種。在免疫接種方面，希望能夠激發(fā)針對插入性抗原的免疫應(yīng)答，以獲得針對該抗原的有效的T細(xì)胞反應(yīng)。對于這種策略，針對載體的T細(xì)胞應(yīng)答受損可同樣引起針對該抗原的受損的或非最佳的T細(xì)胞應(yīng)答。除了這種直接的體內(nèi)免疫接種措施，可使用腺病毒載體將抗原離體(ex vivo)加載到來自患者的樹突狀細(xì)胞上，所述患者的免疫應(yīng)答不足以控制腫瘤細(xì)胞或感染(Dhodapkar等，1999；Steinman等，2001；Zhong等，2000)。將目的抗原加載至樹突狀細(xì)胞之后，細(xì)胞被重新輸注到患者體內(nèi)，用于激發(fā)腫瘤或病毒特異性免疫。一個最近才認(rèn)識到的問題是，所輸注的加載了抗原的樹突狀細(xì)胞成了CTL攻擊的靶(Hermans等，2000)，且再次輸注的效果降低，原因可能在于CTL介導(dǎo)的對輸注的樹突狀細(xì)胞的殺傷作用，這使得無法重新激活并激發(fā)記憶T細(xì)胞應(yīng)答(Ludewig等，2001；Ribas等，2000；Ronchese等，2001)。顯然，樹突狀細(xì)胞對CTL的激活可持續(xù)數(shù)天之久，這與激活時間僅持續(xù)數(shù)小時相比，可產(chǎn)生針對該抗原的更多的T細(xì)胞和更廣泛的T細(xì)胞庫。對于由重復(fù)(第二次或更多次)施用而引起的CTL活化來說很可能也是這種情況。因此，在此所提及的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣可用來獲得那些能夠更有效地引發(fā)針對插入性抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的、基于腺病毒的疫苗運(yùn)載工具。例如，可產(chǎn)生在其基因組中攜帶編碼SPI-6或其人同源物PI-9的基因的重組腺病毒載體，該核酸被置于一種強(qiáng)真核細(xì)胞啟動子的控制下。在腺病毒感染未成熟樹突狀細(xì)胞后數(shù)小時內(nèi)，可獲得高水平的PI-9(或SPI-6)蛋白。這種升高的表達(dá)隨后可用于兩種目的(i)其通降低(例如)粒酶B的活性而保護(hù)成熟樹突狀細(xì)胞免于被CTL殺傷，以及(ii)其使得含有該病毒的未成熟樹突狀細(xì)胞得以存活，否則，由于未成熟樹突狀細(xì)胞未受到保護(hù)，其將被有效殺傷。兩種機(jī)制均保證了可有更多的樹突狀細(xì)胞來激發(fā)原初T細(xì)胞，并保證成熟樹突狀細(xì)胞具有更長的存活時間，這兩種機(jī)制最終使得T細(xì)胞數(shù)量增加。確保PI-9水平在病毒感染后不會降低的另一種途徑是確定病毒所采用的降低該水平的機(jī)制。這些機(jī)制可以是直接的或間接的，但關(guān)閉該機(jī)制的一種合理的途徑是應(yīng)用一種缺乏參與PI-9轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控的功能性區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的重組病毒。因此，本發(fā)明公開了至少兩種途徑來確保PI-9蛋白的水平達(dá)到足夠高，并由此保護(hù)感染的樹突狀細(xì)胞免于通過CTL殺傷作用而被清除其一是將一種置于強(qiáng)啟動子控制下的編碼PI-9的核酸或其同源物(例如SPI-6)引入病毒主鏈，而第二種是使得病毒主鏈中參與下調(diào)感染細(xì)胞內(nèi)的PI-9表達(dá)的區(qū)域缺失或削弱其功能。這兩種不同機(jī)制的組合也屬于本發(fā)明的一部分。
在基因治療領(lǐng)域，正在研究多種不同的載體系統(tǒng)以用于治療各種不同的致命性人類疾病，包括遺傳學(xué)貯積病(genetic storage disorders)(高雪氏病(Gaucher)、II型糖原貯積病(Pompe)、粘多糖病I型(Hurler)、Scheie、Hunter、粘多糖病III型(Sanfilippo’s)、Moquio’s、神經(jīng)酰胺代謝溶酶體貯積病(Farber)、Niemann-Pick、半乳糖腦苷類脂沉積病(Krabbe)、異染性白質(zhì)營養(yǎng)不良(metachromatic leucodystrophy)、海洋性貧血(thallassemias)等)、心血管疾病及相關(guān)應(yīng)用(狹窄、再狹窄、血管移植)、以及關(guān)節(jié)炎，僅舉數(shù)例。為了有效治療此類種種疾病，希望能夠長期表達(dá)轉(zhuǎn)基因。而這將需要一種不同于免疫接種措施的機(jī)制，也就是說，對于免疫接種來說需要的是針對抗原的更強(qiáng)的和長期的免疫應(yīng)答。對于基因治療則不希望對所使用的基因運(yùn)載工具產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng)；為此，希望產(chǎn)生一種微弱的應(yīng)答且以基因運(yùn)載工具感染的樹突狀細(xì)胞能夠快速消失。如果使用一種感染樹突狀細(xì)胞(因其天然具有的向性)和目的靶細(xì)胞的基因運(yùn)載工具，則希望通過樹突狀細(xì)胞-CTL途徑的應(yīng)答能夠盡可能弱些。可例如通過使用PI-9來獲得這種微弱CTL應(yīng)答的效果。一種措施是在重組腺病毒中插入一種可在樹突狀細(xì)胞中有效對抗例如SPI-6或人同源物PI-9表達(dá)的基因、核酶、反義核酸和/或其他核酸。該策略大體上可在腺病毒感染未成熟樹突狀細(xì)胞數(shù)小時后降解SPI-6或PI-9和/或降低其表達(dá)，導(dǎo)致成熟樹突狀細(xì)胞內(nèi)的SPI-6或PI-9基因產(chǎn)物的水平較低。不然，這會導(dǎo)致直接的由CTL介導(dǎo)的殺傷作用，最終可嚴(yán)重妨礙針對治療性載體的T細(xì)胞應(yīng)答，例如對用來輸送轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒載體的T細(xì)胞應(yīng)答?？蓪⒁环NPI-9抑制物，例如反義核酸，置于樹突狀細(xì)胞特異性啟動子的控制下，例如CD83啟動子?；蛘?，使PI-9或其同源物過表達(dá)，例如通過共表達(dá)與插入基因運(yùn)載工具中的治療性轉(zhuǎn)基因鄰近的PI-9基因，可保護(hù)被感染的細(xì)胞免于CTL介導(dǎo)的殺傷作用，并延長治療性(免疫原性)基因的表達(dá)，這可能會對免疫接種非常有益。
對于另一個本領(lǐng)域熟知的方面，即“腫瘤免疫接種”，則希望針對由病毒主鏈中的核酸編碼的抗原產(chǎn)生強(qiáng)烈的反應(yīng)。因此，受損的CTL應(yīng)答將是有益的，且因此應(yīng)該優(yōu)選過表達(dá)PI-9蛋白或其功能性同源物，而非快速的CTL應(yīng)答。因此本發(fā)明的措施與其說是基因治療用途，還不如說是為了免疫接種的目的。如在此所述的，已經(jīng)研究過如果細(xì)胞感染了腺病毒載體是否會損害抗CTL殺傷作用的保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)感染了腺病毒的成熟樹突狀細(xì)胞不能免于被CTL殺傷，且與未感染的加載了肽的樹突狀細(xì)胞相比，感染的加載了肽的成熟的和未成熟的樹突狀細(xì)胞均對CTL介導(dǎo)的殺傷作用高度敏感。這些實(shí)驗(yàn)顯示，一旦腺病毒進(jìn)入成熟樹突狀細(xì)胞即可改變細(xì)胞的正常的生物學(xué)行為，使其變得對快速CTL介導(dǎo)的殺傷作用敏感?？乖蔬f細(xì)胞被清除可削弱針對腺病毒的T細(xì)胞應(yīng)答，因此其是腺病毒用來逃避宿主免疫系統(tǒng)的一種新方法?；蛘?，免疫系統(tǒng)可用這種機(jī)制來預(yù)防病毒在樹突狀細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行不受控制的復(fù)制，否則這種復(fù)制將逃脫由CTL介導(dǎo)的清除作用。
如上所述，在此揭示了一種新的免疫學(xué)現(xiàn)象，該現(xiàn)象導(dǎo)致被病毒感染的成熟樹突狀細(xì)胞對CTL介導(dǎo)的殺傷作用變得敏感。此外，根據(jù)具體的用途，在此揭示了適合用于下調(diào)宿主T細(xì)胞免疫應(yīng)答的新的腺病毒載體以及更適合用于增強(qiáng)宿主T細(xì)胞應(yīng)答的新的腺病毒載體。
可通過若干途徑在使用小鼠的實(shí)驗(yàn)中造成SPI-6過表達(dá)以及造成人PI-9過表達(dá)。一種途徑是將該特定的核酸置于強(qiáng)啟動子控制下并克隆入腺病毒主鏈的E3區(qū)域，而將目的轉(zhuǎn)基因克隆入E1區(qū)域?？刹捎玫膹?qiáng)啟動子的實(shí)例為SV40啟動子、PGK-啟動子和RSV啟動子。轉(zhuǎn)基因的實(shí)例是多種多樣的，可包括細(xì)胞因子、治療性基因、腫瘤抗原、抗體或其部分，或任何編碼一種以腫瘤免疫接種、抗病原體免疫接種和/或基因治療為目的的蛋白或治療性物質(zhì)的核酸。
如上所述，可自患者分離樹突狀細(xì)胞，經(jīng)過離體導(dǎo)向、培養(yǎng)并重新導(dǎo)入分離出該樹突狀細(xì)胞的個體，以引發(fā)抗原特異性免疫應(yīng)答(Dhodapkar等，1999；Steinman和Dhodapkar 2001；Zhong等，2000)。延長加載的樹突狀細(xì)胞的壽命有可能增強(qiáng)免疫接種的效力。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方案自骨髓中分離鼠樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞并培養(yǎng)。通過對標(biāo)記物(例如CD11c和/或CD86，僅舉數(shù)例)進(jìn)行染色并進(jìn)行FACS分析來確定樹突狀細(xì)胞的分化。使用載體引入用于抗原呈遞目的的轉(zhuǎn)基因和用于樹突狀細(xì)胞存活目的的SPI-6基因(或PI-9)。要實(shí)現(xiàn)這一目的，可采用同時以兩種載體進(jìn)行感染，一種攜帶抗原(轉(zhuǎn)基因)，而另一種在E1區(qū)域(或E3區(qū)域)攜帶SPI-6(PI-9)，或反之亦然，或者采用以一種載體進(jìn)行單次感染，該載體在E1結(jié)構(gòu)域攜帶抗原(轉(zhuǎn)基因)而在例如E3區(qū)域攜帶PI-9(SPI-6)，或反之亦然，但也可使用其他區(qū)域來攜帶各種轉(zhuǎn)基因如抗原或PI-9基因。總之，使用小鼠的實(shí)驗(yàn)需要的是編碼SPI-6的重組載體，但應(yīng)該理解的是，本發(fā)明也涵蓋用于治療人類疾病的重組載體，其需要的是編碼PI-9的核酸。如上所述，需要下調(diào)PI-9或SPI-6的方案當(dāng)然應(yīng)該包括特異性靶向物種特異性基因表達(dá)的方案。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在能夠引發(fā)由樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的針對一種抗原的CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答的系統(tǒng)中調(diào)節(jié)針對該抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含給所述系統(tǒng)提供所述抗原和一種用于調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件。
能夠引發(fā)樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的針對一種抗原的CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答的系統(tǒng)可以是一種體外系統(tǒng)。可將樹突狀細(xì)胞和原初T細(xì)胞在存在所述抗原的情況下在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，由此可產(chǎn)生對所述抗原具有特異性的CD8+T細(xì)胞?？蓪@種體外培養(yǎng)進(jìn)行各種方式的補(bǔ)充以提高產(chǎn)生所述CD8+T細(xì)胞的效力。此類補(bǔ)充可包含(部分)淋巴結(jié)、胸腺、或其他支持。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包含一個個體。在這種實(shí)施方案中，本發(fā)明可用來調(diào)節(jié)該個體的免疫應(yīng)答，特別是在該個體中產(chǎn)生抗原特異性CD8+ T細(xì)胞。
可通過不同的途徑將所述抗原提供給所述系統(tǒng)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過病毒載體提供所述抗原。病毒載體特別適合用于將抗原和/或核酸輸送至靶細(xì)胞。如上所述，本發(fā)明的方法可采用多種類型的病毒載體。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒載體包含一種腺病毒載體。
在一種實(shí)施方案中，通過提供一種用于降低由抗原特異性CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件而增強(qiáng)免疫應(yīng)答。通過降低由抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用，可提高所述樹突狀細(xì)胞的存活機(jī)會，且由此提高所述樹突狀細(xì)胞參與進(jìn)一步活化免疫系統(tǒng)的傾向。其結(jié)果是擴(kuò)大了所述系統(tǒng)中的特異于所述抗原的CD8+T細(xì)胞庫。本發(fā)明的這一方面特別適用于免疫接種的用途，在這種用途中需要有效的抗原特異性免疫應(yīng)答。
在另一個實(shí)施方案中，通過提供一種用于增強(qiáng)由抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件而降低所述免疫應(yīng)答。通過增強(qiáng)由抗原特異性CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用，可降低所述樹突狀細(xì)胞的存活機(jī)會，且由此降低所述樹突狀細(xì)胞參與進(jìn)一步活化免疫系統(tǒng)的傾向。其結(jié)果是減小了所述系統(tǒng)中的CD8+T細(xì)胞庫。本發(fā)明的這一方面特別適用于所謂的功能獲得性用途(gain of function applications)。這些功能獲得性用途是通常(但并非絕對)以病毒載體產(chǎn)生，例如典型的基因治療用途。通常通過提供一種具有目的基因的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)功能獲得，其中所述基因給該細(xì)胞提供了額外的功能。目的基因的產(chǎn)物以及與病毒載體相關(guān)的產(chǎn)物可作為本發(fā)明的系統(tǒng)的抗原，由此刺激特異于所述抗原的免疫應(yīng)答。在功能獲得性用途中，本發(fā)明可優(yōu)選地用于至少部分預(yù)防不希望出現(xiàn)的針對目的基因產(chǎn)物或病毒載體相關(guān)性產(chǎn)物的免疫應(yīng)答。
可通過若干途徑實(shí)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的對樹突狀細(xì)胞的殺傷作用。在前言部分已經(jīng)給出了一些非限制性的實(shí)例且包括至少兩種在樹突狀細(xì)胞中誘導(dǎo)DNA片段化的機(jī)制。至少一種機(jī)制包含攝取一種由CTL產(chǎn)生的被稱為粒酶B的蛋白質(zhì)，而至少一種其他機(jī)制包含一或多種類型的死亡受體的交聯(lián)。在本發(fā)明中，由CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的對樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的至少一種途徑的活性受本發(fā)明的一種元件的調(diào)節(jié)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)了粒酶B介導(dǎo)的DNA片段化途徑的活性。該途徑特別易于進(jìn)行操控。在一種實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)了在樹突狀細(xì)胞中起破壞作用的可利用的粒酶B蛋白。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的所述元件包含PI-9蛋白或其功能性等價物。上面已經(jīng)詳細(xì)描述了這種優(yōu)選實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，通過給所述樹突狀細(xì)胞提供一種包含至少部分PI-9基因的核酸或其衍生物和/或類似物，而將所述元件提供給所述樹突狀細(xì)胞。所述核酸可包含PI-9基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域的任何部分。所述部分典型地包含該區(qū)域的至少20個堿基，優(yōu)選地為連續(xù)的堿基。不過，根據(jù)具體的設(shè)計要求可以有中斷，以便例如提供或干擾mRNA的剪切。在這種實(shí)施方案中，通過提供PI-9反義核酸，典型地為至少20個核苷酸，或通過提供在所述細(xì)胞中的條件下能夠與PI-9(m)RNA雜交的所述反義的同源物，得以例如下調(diào)細(xì)胞內(nèi)的PI-9的表達(dá)。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述元件包含一種編碼PI-9蛋白或其具有蛋白酶活性的部分、衍生物和/或類似物的核酸。在這種實(shí)施方案中，粒酶B途徑的活性至少部分地被降低。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過病毒載體提供用于調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的所述元件。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原和用于調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的所述元件均由同一種病毒載體提供。這樣可將所述抗原和所述元件同時提供給樹突狀細(xì)胞，由此提高總體功效，并簡化本發(fā)明的方法的工作。在這種實(shí)施方案中，所述病毒載體優(yōu)選地包含允許對樹突狀細(xì)胞進(jìn)行有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的向性。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含抗原和用于調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的對樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種試劑盒(a kit of parts)，其包含抗原和用于調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的對樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件。
在一種實(shí)施方案中，所述組合物或試劑盒包含一種病毒載體，其中所述載體優(yōu)選地包含所述抗原和/或編碼所述抗原的核酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種病毒載體，其包含一種用于特異性調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的對樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的病毒載體在制備用于在個體中調(diào)節(jié)抗原特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的藥物中的用途。優(yōu)選地，在所述用途中，所述調(diào)節(jié)對由所述病毒載體提供的抗原具有特異性。
實(shí)施例實(shí)施例1.保護(hù)成熟樹突狀細(xì)胞免于CTL介導(dǎo)的裂解作用首先，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以期重復(fù)其他人的研究結(jié)果未成熟樹突狀細(xì)胞對CTL介導(dǎo)的殺傷作用敏感而成熟樹突狀細(xì)胞可得到保護(hù)。為此，自一個健康成人個體分離血液并隨后用于通過ficoll步驟分離周圍血單個核細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的Variomacs技術(shù)和CD14特異性抗體(Miltenyi Biotec GmbH)自細(xì)胞群體中分離單核細(xì)胞。將這些單核細(xì)胞在存在100ng/ml IL-4(Bioscource International，Inc.)和800IU/ml GM-CSF(Leucomax；Novartis)的情況下培養(yǎng)6天以獲得未成熟樹突狀細(xì)胞。通過FACScalibur以抗體(來自BD Pharmingen)測定細(xì)胞表面的表達(dá)來監(jiān)測單核細(xì)胞向未成熟樹突狀細(xì)胞的正確分化。如普通免疫學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，與未分化的CD14+單核細(xì)胞相比，未成熟樹突狀細(xì)胞的標(biāo)記物CD1a、CD86、HLA ABC和HLA DR發(fā)生上調(diào)；可通過CD83的表達(dá)來辨別成熟樹突狀細(xì)胞。圖1顯示了采用這種分離/分化策略所得到的結(jié)果，此外還給出了確定繼續(xù)處理所依據(jù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。顯然，通過采用這種技術(shù)自人的血液中得到了基本上純的未成熟樹突狀細(xì)胞群。
為使得樹突狀細(xì)胞在體外人工化成熟，可將多種不同的刺激物添加到未成熟樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)基中，以獲得這些完全成熟的樹突狀細(xì)胞。這些刺激物可單獨(dú)應(yīng)用，包括200ng/ml脂多糖(LPS)，50μg/ml PolyIC(均來自Sigma)，30％(終體積)單核細(xì)胞條件化培養(yǎng)基(MCM)，CD40L，或100ng/ml TNF-α(PreproTech，Inc.)。使用FACScalibur和特異性抗體(CD1a，CD14，CD83，CD86，HLA-A，-B，-C和/或-DR)來監(jiān)測成熟過程。結(jié)果顯示于圖1。
培養(yǎng)6天后，將成熟和未成熟樹突狀細(xì)胞在10mM銪，25mMDTPA和硫酸葡聚糖(Sigma)的混合物中在冰上標(biāo)記30分鐘。以100mM CaCl2(Sigma)在冰上孵育5分鐘以回收細(xì)胞。該孵育步驟后，將細(xì)胞洗滌并置于室溫(RT)30-60分鐘，然后再洗滌一次以去除絕大部分自發(fā)性銪泄漏。
下一步給細(xì)胞加載被CTL克隆所識別的抗原。為此，將熟知的gp100黑色素瘤抗原與gp100特異性CTL克隆8J聯(lián)合使用，后者在小鼠Kb單元型以及人HLA-A2單元型的情況下均可識別gp100蛋白(Dr R.Offringa，Dept.Immunohematology，LUMC，The Netherlands惠贈)。將成熟或未成熟樹突狀細(xì)胞以2000細(xì)胞/孔的濃度接種在96孔培養(yǎng)板中，使用的是RPMI培養(yǎng)基。隨后將8J CTL作為效應(yīng)細(xì)胞添加到成熟或未成熟樹突狀細(xì)胞中，各種效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞比為25∶1，12.5∶1和6.25∶1。
最后，將10μg/ml的合成的肽(gp100肽，氨基酸154-162)添加到細(xì)胞中，并將細(xì)胞在37℃孵育4小時。收集20μl上清液并轉(zhuǎn)移至平底微滴定板中(Maxisorp F-96，Nunc)，每孔含有200μl的Enhancement溶液(Wallac/Perkin Elmer Life Science)。銪釋放可代表CTL介導(dǎo)的對成熟或未成熟DC的裂解作用，使用時間分辯熒光劑(Wallac/Perkin ElmerLife Science)對銪釋放進(jìn)行測定。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖2A，其說明，正如文獻(xiàn)(Medema等，2001)所述，未成熟樹突狀細(xì)胞對CTL介導(dǎo)的裂解作用敏感，而成熟樹突狀細(xì)胞受到保護(hù)而免于被裂解。因此，這些結(jié)果驗(yàn)證了所采用的目的在于研究基于致敏抗原呈遞細(xì)胞的病毒免疫逃脫機(jī)制的檢測方法的有效性。
實(shí)施例2.腺病毒介導(dǎo)致敏成熟樹突狀細(xì)胞如上所述，已經(jīng)大致描述了自人外周血單個核細(xì)胞獲得成熟和未成熟樹突狀細(xì)胞、給細(xì)胞加載銪、以及加載gp100肽的過程。將樹突狀細(xì)胞與復(fù)制缺陷型腺病毒載體一起孵育48小時(每個細(xì)胞1000該病毒顆粒(vp/cell))。對照組不與腺病毒載體孵育。所用的腺病毒載體基于腺病毒血清型5(Ad5)，但缺失整個腺病毒E1區(qū)域。此外，所用的載體經(jīng)遺傳工程化而攜帶了來自腺病毒血清型35的纖維分子，為其提供更佳的對的樹突狀細(xì)胞向性。WO 00/03029和WO 02/24730詳細(xì)描述了如何產(chǎn)生攜帶來自各種(其他)血清型的纖維的Ad5病毒。該載體在E1區(qū)域含有一個真核細(xì)胞表達(dá)盒，該表達(dá)盒由位于一個3’端具有來自乙型肝炎病毒的聚腺苷酸化信號的多接頭上游的CMV啟動子組成。如文獻(xiàn)(WO00/03029；WO 00/31285)所述，將編碼螢火蟲螢光素酶蛋白的cDNA克隆入該多接頭。
圖2B顯示了在感染的、加載了銪且加載了gp100肽的細(xì)胞中進(jìn)行銪檢測的結(jié)果。暴露于腺病毒的成熟和未成熟樹突狀細(xì)胞均對CTL介導(dǎo)的殺傷作用非常敏感。這些結(jié)果說明，缺失E1的腺病毒(也稱為第一代基因轉(zhuǎn)移載體)可致敏樹突狀細(xì)胞，導(dǎo)致CTL介導(dǎo)的殺傷作用。
為了進(jìn)一步探討其中涉及了哪些腺病毒蛋白，使用如下腺病毒載體重復(fù)進(jìn)行了上述實(shí)驗(yàn)，所述腺病毒載體為E1，E2A，E3，E4陽性或陰性，或者為例如E4表達(dá)是減弱的。還測試了攜帶各種缺失/突變的組合的病毒，例如E1和E2A缺失的病毒?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)產(chǎn)生此類病毒，并自病毒主鏈中引入此類區(qū)域的缺失以及將缺失的區(qū)域的反式互補(bǔ)(trans-complementation)引入腺病毒包裝細(xì)胞系中(WO01/05945、WO 01/07571、WO 01/20014)。通過這些實(shí)驗(yàn)可鑒別早期腺病毒蛋白是否參與了對成熟樹突狀細(xì)胞的致敏。
實(shí)施例3.調(diào)節(jié)重組腺病毒對成熟樹突狀細(xì)胞的致敏作用據(jù)文獻(xiàn)記載，上調(diào)小鼠的SPI-6或人的PI-9或者保持其水平穩(wěn)定至少部分地參與了成熟樹突狀細(xì)胞對抗CTL介導(dǎo)的殺傷作用的生物學(xué)途徑。為了研究腺病毒是否通過PI-9途徑致敏樹突狀細(xì)胞，進(jìn)行了兩種不同的實(shí)驗(yàn)策略(i)以Western印跡分析和/或反轉(zhuǎn)錄PCR來確定暴露于或未暴露于腺病毒載體的人樹突狀細(xì)胞中PI-9蛋白和/或RNA的表達(dá)水平。(ii)產(chǎn)生攜帶PI-9 cDNA的腺病毒載體，隨后感染成熟的和未成熟樹突狀細(xì)胞，繼而確定PI-9過表達(dá)對CTL介導(dǎo)的殺傷作用的影響。
為了確定PI-9的表達(dá)水平，如上所述獲取來自人單核細(xì)胞的成熟和未成熟樹突狀細(xì)胞。將細(xì)胞以每孔2.5×106個細(xì)胞的濃度接種于3個6孔板中。然后加入1000vp/細(xì)胞的Ad5.螢光素酶(陰性對照)或Ad5.PI-9病毒或者不加入病毒，進(jìn)行感染24小時(同時使用了成熟和未成熟的人樹突狀細(xì)胞，每個參數(shù)一式三份)。24小時后，收集每個孔的細(xì)胞用于銪細(xì)胞裂解分析(1個孔)，產(chǎn)生蛋白裂解物(1個孔)，以及自細(xì)胞群(1個孔)中分離RNA用于逆轉(zhuǎn)錄酶PCR。如上所述進(jìn)行銪細(xì)胞裂解分析。根據(jù)制造商的說明，將10μg總蛋白加載到蛋白分離膠(Invitrogen，NP0321，Nupage4-12％Bis-Tris膠，或Biorad，標(biāo)準(zhǔn)膠)上，進(jìn)行Western印跡分析以確定PI-9蛋白表達(dá)水平。將蛋白轉(zhuǎn)移至Immunobilon-P PVDF膜(孔徑0.45μm)。將膜在封閉緩沖液(5％奶粉和0.1％Tween-20，溶于PBS)中封閉1小時。使用抗血清MoAb17和/或PI9-K來觀察PI-9蛋白小鼠單克隆抗體MoAb17(亞型IgG1)特異于人PI-9蛋白并可與小鼠SPI-6蛋白發(fā)生有效的交叉反應(yīng)(Bladergroen等，2001)。為了測定PI-9蛋白，將MoAb17稀釋于PBS(3.6μg/ml)，加至Western印跡膜上，并在室溫孵育3小時。然后以10ml的PBS將膜洗滌2次以去除抗體溶液。為了觀察MoAb17與膜的結(jié)合，使用了辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgG1的二抗以及ECL檢測系統(tǒng)，根據(jù)制造商的說明(Amersham)和本領(lǐng)域人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行。
為了以反轉(zhuǎn)錄PCR確定PI-9的表達(dá)水平，根據(jù)制造商的說明，用TRIzol(Life Technologies)自每群106個細(xì)胞中分離總RNA。將得到的RNA溶解于無RNAse的水中，并根據(jù)制造商的說明與DNAse(Lifetechnologies)一起孵育。然后，在存在1μg oligo dT引物和100ng隨機(jī)六聚體引物的情況下，將RNA溶液在70℃孵育10分鐘，總體積為15μl。將RNA置于冰上，并加入dNTP、DTT、5μl第一鏈緩沖液和1單位RNAseH-superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(所有試劑均來自Invitrogen)，然后在42℃孵育50分鐘。在70℃孵育10分鐘以終止反應(yīng)。
對于PI-9特異性PCR，在PCR反應(yīng)中使用1μl的cDNA溶液。加入定位于一個外顯子中的正向引物(PI-9F5’-GGC ATT TGG GAA TTG TTGATG-3’)和反向引物(PI-9R5’-TGG CGA TGA GAA CCT GCC AC-3’)，濃度為每種引物每個反應(yīng)10pmol。此外，在每個反應(yīng)中加入2mmoldNTP、1x MgCl2、2.5U Taq聚合酶、1x Taq緩沖液(均來自Invitrogen)，并加入H2O以使體積達(dá)到50μl。PCR一般采用以下基本程序進(jìn)行94℃，5分鐘；繼以35個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃，1分鐘，60℃，30秒，72℃，1分鐘。20個循環(huán)后，每3個循環(huán)自反應(yīng)管中取出5μl的PCR產(chǎn)物樣品，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，以對PI9 PCR產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析。
為了確定在成熟和未成熟樹突狀細(xì)胞中過表達(dá)PI-9蛋白是否導(dǎo)致產(chǎn)生對抗CTL殺傷作用的保護(hù)作用，可用攜帶人PI-9 cDNA的腺病毒感染此類未成熟和成熟樹突狀細(xì)胞。首先需要克隆PI-9 cDNA。為此，根據(jù)制造商的說明，用TRIzol試劑(Life Technologies)自大約5×105個來自成熟的人單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞中分離總RNA。根據(jù)制造商的說明，使用隨機(jī)六聚體RT-PCR試劑盒(Applied Biosystems，N808-0234)通過反轉(zhuǎn)錄PCR自這種細(xì)胞中產(chǎn)生cDNA。接下來，將cDNA用作模板通過PCR擴(kuò)增人PI-9的完整編碼區(qū)。為此，合成了寡核苷酸PI-9Forw(5’-GGG GTACCG CCA CCA TGG AAA CTC TTT CTA AGT GG-3’)和PI-9Rev(5’-CGG GAT CCT TAT GGC GAT GAG AAC CTG C-3’)(InvitroGen)。PI-9Forw含有KpnI限制性位點(diǎn)，而PI-9Rev含有BamHI限制性位點(diǎn)。采用以下PCR程序94℃，5分鐘；繼以30個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃，1分鐘，59℃，30秒，72℃，1分鐘。通過在72℃孵育10分鐘而終止PCR反應(yīng)。取5μl PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是一個1153堿基對的片段。隨后，以限制性酶KpnI和BamHI消化20μl PCR產(chǎn)物，同樣方式消化質(zhì)粒pAdapt(WO 00/63403)。簡言之，pAdapt含有Ad5基因組的大約5000堿基對的左翼。在該腺病毒區(qū)域內(nèi)，編碼E1蛋白的區(qū)域被整個去除，并替換為一種真核細(xì)胞表達(dá)盒，其包含CMV啟動子和BGH poly(A)。隨后采用分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將KpnI/BamHI消化的PI-9核酸克隆入KpnI/BamHI消化的pAdapt質(zhì)粒中。通過限制性消化圖譜和/或測序確定了人PI-9編碼序列在pAdapt中的正確插入和正確擴(kuò)增。為獲得攜帶PI-9核酸的重組腺病毒(其中該病毒對人樹突狀細(xì)胞具有向性)，首先以PacI消化攜帶PI-9序列的pAdapt質(zhì)粒，以便自質(zhì)粒中釋放出病毒序列，隨后將其與PacI消化的粘粒(cosmid)一同轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞，例如PER.C6TM細(xì)胞，所述PacI消化的粘粒含有Ad5基因組其余的31,000堿基對的右翼(這些過程詳見WO 99/55132)。通過將Ad5主鏈的纖維部分替換為來自另一種攜帶樹突狀細(xì)胞特異性向性的血清型的纖維部分，或者通過使用對細(xì)胞例如樹突狀細(xì)胞具有天然關(guān)聯(lián)的腺病毒血清型，來提供對樹突狀細(xì)胞的向性。對例如樹突狀細(xì)胞具有向性的腺病毒的實(shí)例為腺病毒血清型11和35(Ad11和Ad35)。本實(shí)施例僅使用了Ad5fib35.PI-9嵌合病毒，但其他實(shí)驗(yàn)中使用了Ad11和/或Ad35主鏈，其中這些腺病毒載體攜帶編碼PI-9蛋白的核酸。在這些情況下，沒有必要交換纖維或纖維部分、或病毒外殼的其他部分。將Ad11、Ad35和其他非C群腺病毒用于此類導(dǎo)向目的已有報導(dǎo)(WO 00/70071和WO02/40665)。經(jīng)轉(zhuǎn)染后形成了一種功能性的腺病毒基因組，借助于包裝細(xì)胞提供的輔助功能其得以復(fù)制，并被包裝成子代病毒，后者在宿主細(xì)胞裂解后釋放入培養(yǎng)基。病毒制備、純化、以及滴定均采用腺病毒制備領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)和方案進(jìn)行。該嵌合病毒的代碼為Ad5.Fib35.PI-9。
如上所述產(chǎn)生成熟和未成熟樹突狀細(xì)胞。將成熟的和未成熟的DC均以每孔1×106個細(xì)胞的濃度接種于6孔板中，并暴露于1000vp/細(xì)胞的Ad5.Fib35(缺少轉(zhuǎn)基因)或Ad5.Fib35.PI-9，以非感染細(xì)胞作為對照。48小時后，收集細(xì)胞并如上所述制備細(xì)胞裂解物。使用MoAb17和Western印跡分析來確定成熟和未成熟樹突狀細(xì)胞中的PI-9蛋白水平。為進(jìn)一步確定PI-9蛋白表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)是否與CTL介導(dǎo)的殺傷作用相關(guān)且因此是否可保護(hù)成熟和未成熟樹突狀細(xì)胞抵抗CTL介導(dǎo)的殺傷作用，平行進(jìn)行了上述實(shí)驗(yàn)，但將細(xì)胞用于銪細(xì)胞毒性分析。感染Ad.luc病毒的成熟和未成熟樹突狀細(xì)胞均大部分被CTL應(yīng)答殺傷，但感染攜帶PI-9基因的病毒則明顯存活。
實(shí)施例4.以編碼SPI-6的病毒在體內(nèi)測定抗腺病毒的體液和細(xì)胞應(yīng)答的效力為了研究在未成熟和成熟抗原呈遞細(xì)胞中過表達(dá)PI-9對抗腺病毒體液和細(xì)胞應(yīng)答的體內(nèi)影響。還產(chǎn)生了攜帶編碼人PI-9在小鼠中的同源物，即絲氨酸蛋白酶抑制劑-6(SPI-6)的cDNA的腺病毒載體。為此，首先產(chǎn)生了SPI-6 cDNA。為PCR擴(kuò)增SPI-6 cDNA，自小鼠樹突狀細(xì)胞或SPI-6 RNA高表達(dá)組織中分離總細(xì)胞RNA，SPI-6 RNA高表達(dá)組織例如為肺、脾臟、腎臟或心臟，隨后如上所述將其轉(zhuǎn)換為cDNA。通過PCR擴(kuò)增完整的編碼序列，引物為SPI-6 F(5’-GGG GTA CCG CCA CCATGA ATA CTC TGT CTG AAG G-3’)和SPI-6 R(5’-CGG GAT CCT TATGGA GAT GAG AAC CTG CC-3’)，產(chǎn)生了一種1147堿基對的PCR產(chǎn)物。如上所述以KpnI和BamHI進(jìn)行消化后，將該產(chǎn)物克隆入pAdApt。該嵌合載體命名為Ad5.Fib35.SPI-6，隨后將其用于產(chǎn)生在宿主細(xì)胞例如PER.C6TM中不復(fù)制的重組病毒。然后，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法如上所述純化病毒并滴定。
給單獨(dú)的各只小鼠肌肉注射對照病毒Ad5.Fib35以及Ad5.Fib35.SPI-6病毒，劑量為1010病毒顆粒。注射后2周，將來自這些小鼠的脾臟用于分析抗該載體的T細(xì)胞應(yīng)答，而血清用于分析抗該載體的抗體應(yīng)答。采用免疫學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)和方案進(jìn)行這些分析，如中和分析、IFN-γ的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)染色。通過這些實(shí)驗(yàn)可鑒別SPI-6在體內(nèi)引起抗腺病毒載體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用。
實(shí)施例5.SPI-6在針對病毒載體的免疫中的作用給單獨(dú)的各只小鼠肌肉注射Ad5.Fib35和Ad5.Fib35.SPI-6，劑量為1010病毒顆粒。2周后，給每只小鼠肌肉注射1010病毒顆粒的Ad5.Fib35.luc，隨后在第1，2，4，8和12天將小鼠處死，并分離肌肉組織。在600μl冷PO4緩沖液中，pH 7.8，進(jìn)行組織勻漿，隨后加入400μl裂解緩沖液(PO4緩沖液，pH 7.8，1mM DTT+0.1％Triton X-100)。將裂解的肌肉樣品進(jìn)行凍融，然后取20μl轉(zhuǎn)移至白色酶標(biāo)板(ThermoLifescience)中。將板置于酶標(biāo)儀(Thermo Lifescience)中，加入20μl螢光素酶底物(Luciferase-assay systems，Promega)并測定螢光素酶活性10秒鐘。螢光素酶活性的量代表表達(dá)該轉(zhuǎn)基因的肌肉細(xì)胞的數(shù)量。由于以Ad5.Fib35.SPI-6激發(fā)的小鼠的抗病毒載體的免疫得到增強(qiáng)，因此該活性會降低，與以Ad5.Fib35(無轉(zhuǎn)基因)激發(fā)的小鼠的延長的表達(dá)相比也是如此。以空載體進(jìn)行預(yù)注射的小鼠產(chǎn)生明顯的抗載體T細(xì)胞應(yīng)答。在注射組的肌肉中螢光素酶活性很快升高，但由于腺病毒感染的肌肉細(xì)胞被T細(xì)胞清除，因此數(shù)日后降低。與此不同，預(yù)注射Ad5.fib35.SPI-6的小鼠預(yù)期引起一種與對照小鼠相比更弱的載體特異性T細(xì)胞免疫，且預(yù)期在肌肉細(xì)胞中出現(xiàn)延長的螢光素酶表達(dá)。
總之，使用攜帶編碼靶抗原的異源性核酸的病毒載體并與置于強(qiáng)啟動子(例如CMV啟動子)控制下的編碼PI-9的核酸相結(jié)合以導(dǎo)向一種抗原呈遞細(xì)胞，可導(dǎo)致在這種通常會對CTL殺傷作用變得敏感的細(xì)胞中，在表達(dá)該靶抗原的過程中可發(fā)生PI-9過表達(dá)。這種過表達(dá)將防止細(xì)胞被CTL應(yīng)答清除，并因此產(chǎn)生針對該靶抗原的更持久的(且可能是更強(qiáng)的)免疫應(yīng)答。這在免疫接種用途中是非常有益的。
與此不同，將病毒載體用于基因治療用途中(例如用于導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞)，其中這些病毒載體攜帶編碼一種治療性蛋白的目的基因并與一種下調(diào)PI-9表達(dá)的核酸或物質(zhì)相結(jié)合，可降低針對所使用的病毒載體的免疫應(yīng)答，這是由于表達(dá)來自病毒的抗原的抗原呈遞細(xì)胞會被快速清除。這些病毒抗原呈遞細(xì)胞的快速清除可能會導(dǎo)致產(chǎn)生針對所導(dǎo)向的腫瘤細(xì)胞的更強(qiáng)的也是更持久的效應(yīng)。
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權(quán)利要求
1.一種病毒載體，其能夠?qū)愒葱院怂彷斔椭聊軌蚪邮茉摬《据d體的細(xì)胞，其中所述病毒載體包含一種異源性核酸序列，當(dāng)所述異源性核酸序列在該細(xì)胞中表達(dá)時，引起該細(xì)胞中的蛋白酶抑制劑-9(PI-9)的水平和/或活性升高或保持在基本上穩(wěn)定的水平。
2.權(quán)利要求1的病毒載體，其中所述病毒載體選自腺病毒、α病毒、痘病毒、痘苗病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒。
3.權(quán)利要求2的病毒載體，其中所述病毒載體是腺病毒或其功能性衍生物。
4.權(quán)利要求3的病毒載體，其中所述腺病毒是來自亞群B的腺病毒血清型。
5.權(quán)利要求4的病毒載體，其中所述來自亞群B的腺病毒血清型選自Ad11、Ad26、Ad35和Ad50。
6.權(quán)利要求3的病毒載體，其中所述腺病毒包含一種嵌合殼體，所述嵌合殼體包含來自至少兩種不同腺病毒血清型的蛋白和/或蛋白片段。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的病毒載體，其中所述細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞(APC)。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的病毒載體，其中所述細(xì)胞是樹突狀細(xì)胞或B細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的病毒載體，其中所述樹突狀細(xì)胞是未成熟的。
10.權(quán)利要求8的病毒載體，其中所述樹突狀細(xì)胞是成熟的。
11.權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的病毒載體，其中所述樹突狀細(xì)胞是動脈周圍并指狀樹突狀細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的病毒載體，其中所述異源性核酸包含編碼PI-9的核酸或其功能性等價物。
13.一種病毒載體，其能夠?qū)愒葱院怂彷斔椭聊軌蚪邮茉摬《据d體的細(xì)胞，其中所述病毒載體包含一種異源性核酸序列，當(dāng)所述異源性核酸序列在該細(xì)胞中表達(dá)時，引起該細(xì)胞中PI-9的水平和/或功能降低。
14.權(quán)利要求13的病毒載體，其中所述病毒載體選自腺病毒、α病毒、痘病毒、痘苗病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒。
15.權(quán)利要求14的病毒載體，其中所述病毒載體是腺病毒或其功能性衍生物。
16.權(quán)利要求15的病毒載體，其中所述腺病毒是來自亞群B的腺病毒血清型。
17.權(quán)利要求16的病毒載體，其中所述來自亞群B的腺病毒血清型選自Ad11、Ad26、Ad35和Ad50。
18.權(quán)利要求15的病毒載體，其中所述腺病毒包含一種嵌合殼體，所述嵌合殼體包含來自至少兩種不同腺病毒血清型的蛋白和/或蛋白片段。
19.權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)的病毒載體，其中所述細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞(APC)。
20.權(quán)利要求13-19中任一項(xiàng)的病毒載體，其中所述細(xì)胞是樹突狀細(xì)胞或B細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的病毒載體，其中所述樹突狀細(xì)胞是未成熟的。
22.權(quán)利要求20的病毒載體，其中所述樹突狀細(xì)胞是成熟的。
23.權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的病毒載體，其中所述樹突狀細(xì)胞是動脈周圍并指狀樹突狀細(xì)胞。
24.權(quán)利要求13-23中任一項(xiàng)的病毒載體，其中所述核酸包含編碼反義PI-9 RNA的核酸或其功能性等價物。
25.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的病毒載體；和一種藥物可接受的載體。
26.一種接觸和/或感染了權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的病毒載體的樹突狀細(xì)胞。
27.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞對CTL的敏感性的方法，其包含以下步驟用包含一種異源性核酸序列的病毒載體感染該細(xì)胞，當(dāng)所述異源性核酸序列在該細(xì)胞中表達(dá)時，引起該細(xì)胞中PI-9的水平和/或活性升高或保持在基本上穩(wěn)定的水平。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述病毒載體選自腺病毒、α病毒、痘病毒、痘苗病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述病毒載體是腺病毒或其功能性衍生物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述腺病毒是來自亞群B的腺病毒血清型。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述來自亞群B的腺病毒血清型選自Ad11、Ad26、Ad35和Ad50。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述腺病毒包含一種嵌合殼體，所述嵌合殼體包含來自至少兩種不同腺病毒血清型的蛋白和/或蛋白片段。
33.權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞(APC)。
34.權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是樹突狀細(xì)胞或B細(xì)胞。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述樹突狀細(xì)胞是未成熟的。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述樹突狀細(xì)胞是成熟的。
37.權(quán)利要求34-36中任一項(xiàng)的方法，其中所述樹突狀細(xì)胞是動脈周圍并指狀樹突狀細(xì)胞。
38.權(quán)利要求27-37中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸包含編碼PI-9的核酸或其功能性等價物。
39.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞對CTL的敏感性的方法，其包含以下步驟用包含一種異源性核酸序列的病毒載體感染該細(xì)胞，當(dāng)所述異源性核酸序列在該細(xì)胞中表達(dá)時，引起該細(xì)胞中PI-9的水平和/或活性降低。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述病毒載體選自腺病毒、α病毒、痘病毒、痘苗病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述病毒載體是腺病毒或其功能性衍生物。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述腺病毒是來自亞群B的腺病毒血清型。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述來自亞群B的腺病毒血清型選自Ad11、Ad26、Ad35和Ad50。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述腺病毒包含一種嵌合殼體，所述嵌合殼體包含來自至少兩種不同腺病毒血清型的蛋白和/或蛋白片段。
45.權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞(APC)。
46.權(quán)利要求39-45中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是樹突狀細(xì)胞或B細(xì)胞。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述樹突狀細(xì)胞是未成熟的。
48.權(quán)利要求46的方法，其中所述樹突狀細(xì)胞是成熟的。
49.權(quán)利要求46-48中任一項(xiàng)的方法，其中所述樹突狀細(xì)胞是動脈周圍并指狀樹突狀細(xì)胞。
50.權(quán)利要求39-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸包含編碼反義PI-9 RNA的核酸或其功能性等價物。
51.一種用于在能夠引發(fā)由樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的針對一種抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的系統(tǒng)中調(diào)節(jié)針對該抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含給所述系統(tǒng)提供所述抗原和一種用于調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述抗原由一種病毒載體提供。
53.權(quán)利要求51或權(quán)利要求52的方法，其中所述病毒載體包含腺病毒載體。
54.權(quán)利要求51-53中任一項(xiàng)的方法，其中通過提供一種用于降低由抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件而增強(qiáng)所述免疫應(yīng)答。
55.權(quán)利要求51-53中任一項(xiàng)的方法，其中通過提供一種用于增強(qiáng)由抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件而降低所述免疫應(yīng)答。
56.權(quán)利要求54或權(quán)利要求55的方法，其中所述元件可調(diào)節(jié)粒酶B介導(dǎo)的DNA片段化途徑。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述元件包含PI-9蛋白或其功能性等價物。
58.權(quán)利要求56的方法，其中通過給所述樹突狀細(xì)胞提供一種包含至少部分PI-9基因的核酸或其衍生物和/或類似物而將所述元件提供給所述樹突狀細(xì)胞。
59.權(quán)利要求57或權(quán)利要求58的方法，其中所述元件包含一種編碼PI-9蛋白或其具有蛋白酶活性的部分、衍生物和/或類似物的核酸。
60.權(quán)利要求51-59中任一項(xiàng)的方法，其中由病毒載體提供用于調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的對所述樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的所述元件。
61.一種組合物，其包含一種抗原和一種用于調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的對樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件。
62.一種試劑盒，其包含一種抗原和一種用于調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的對樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件。
63.權(quán)利要求61的組合物或權(quán)利要求62的試劑盒，包含一種病毒載體。
64.一種病毒載體，其包含一種用于特異性調(diào)節(jié)由抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的對樹突狀細(xì)胞的殺傷作用的元件。
65.權(quán)利要求1-24或64中任一項(xiàng)的病毒載體在制備用于調(diào)節(jié)個體的抗原特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的藥物中的用途。
66.權(quán)利要求65的用途，其中所述調(diào)節(jié)特異于由所述病毒載體提供的抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于影響經(jīng)病毒感染的抗原呈遞細(xì)胞例如樹突狀細(xì)胞對CTL的敏感性的新的方法和元件。本發(fā)明提供了可用于不同治療方案例如免疫接種和/或基因治療的新的基因運(yùn)載工具。
文檔編號C12N15/861GK1668751SQ02829623
公開日2005年9月14日 申請日期2002年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月20日
發(fā)明者斯特凡·科斯滕斯, 奧爾佳·約翰娜·阿伯丁娜·埃莉薩·奧霍斯特, 曼佐·揚(yáng)斯·埃姆柯·哈文加 申請人:克魯塞爾荷蘭公司