專利名稱：一種以薄壁離心管為反應(yīng)容器的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，即一種以薄壁離心管為容器，使用帶加熱頂蓋基因擴(kuò)增儀的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。
背景技術(shù)：
PCR是一種簡(jiǎn)單，快速，專一，靈敏的擴(kuò)增特定DNA片段的方法。PCR反應(yīng)液由緩沖液，DNA聚合酶，鎂離子，腺嘌呤脫氧核糖核苷酸dATP，鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸dCTP，胞嘧啶脫氧核糖核苷酸dGTP，胸嘧啶脫氧核糖核苷酸dTTP，正引物，反引物等近十種試劑和含模板DNA的樣品組成，PCR反應(yīng)每一個(gè)循環(huán)則由變性、退火和延伸三步組成，每步的反應(yīng)溫度不同，通常采用具有良好傳熱性能的薄壁塑料離心試管作為反應(yīng)容器，反應(yīng)試管容量為0.5或0.2毫升。反應(yīng)液體積是PCR反應(yīng)重要參數(shù)之一，它對(duì)傳熱過程、反應(yīng)速度、反應(yīng)穩(wěn)定性，乃至反應(yīng)的成敗有重要影響。所以，盡管減少反應(yīng)液體積的經(jīng)濟(jì)價(jià)值顯而易見，但各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)指南和PCR試劑盒生產(chǎn)廠商至今仍推薦PCR使用50或100微升進(jìn)行反應(yīng)。限制PCR反應(yīng)液體積大幅度調(diào)降有以下幾個(gè)原因第一，為了防止在反復(fù)高溫加熱過程中水分蒸發(fā)和反應(yīng)液濃縮，傳統(tǒng)的PCR操作在反應(yīng)液上要覆蓋一層礦物油，如PCR反應(yīng)液體積太小就無法在反應(yīng)結(jié)束后取樣分析。第二，在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)參數(shù)條件下，PCR平坡或飽和期后的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度較低，不能用通常的染色方法檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物條帶。第三，PCR反應(yīng)液由近十種試劑組成，每種試劑的加量很小，如每管反應(yīng)液總體積太小，就無法用商品加液槍來準(zhǔn)確地配制單管反應(yīng)液。但是，現(xiàn)行PCR采用50或100微升的反應(yīng)體積不僅使試劑耗用量大，也極大地制約了完成PCR反應(yīng)所需要的時(shí)間。對(duì)DNA變性和引物及模板退火過程的研究表明，一旦達(dá)到變性或退火溫度，變性或退火能在瞬間或短短幾秒鐘內(nèi)完成，而每個(gè)Taq DNA聚合酶分子每秒鐘能延伸幾十個(gè)核苷酸。所以，PCR的每一步反應(yīng)時(shí)間理應(yīng)很短。但是，現(xiàn)行的變性步驟通常為30秒鐘，退火步驟通常為30秒鐘，延伸時(shí)間通常為1至幾分鐘，取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)短。這些數(shù)值大大高于根據(jù)理論分析所需要的時(shí)間，其主要原因在于采用離心管作反應(yīng)容器、PCR反應(yīng)液體積為50或100微升時(shí)，由于管壁與帶加熱頂蓋基因擴(kuò)增儀加熱板接觸部分的面積與反應(yīng)液體積比值較小，需要有一定的時(shí)間才能完成熱量從管壁到管中心的傳遞和交換、使管內(nèi)反應(yīng)液的各部分均達(dá)到所設(shè)定的溫度。換言之，反應(yīng)液體積較大、比表面積較小，傳熱過程較慢是PCR每一步反應(yīng)速度的瓶頸。為了增加比表面積、提高PCR反應(yīng)速度，人們?cè)噲D采用細(xì)長(zhǎng)的玻璃毛細(xì)管來代替離心管作為PCR反應(yīng)的容器，使熱傳遞過程加快，從而縮短完成每一循環(huán)所需時(shí)間。但是毛細(xì)管PCR不僅需要特制的PCR儀器，而且向毛細(xì)管內(nèi)加樣、起動(dòng)反應(yīng)和從中取樣分析均很不方便，既花費(fèi)時(shí)間又需操作經(jīng)驗(yàn)和輔助設(shè)施，所以，盡管毛細(xì)管PCR發(fā)明至今已近二十年，但仍未被推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對(duì)現(xiàn)有以薄壁離心管為容器、使用現(xiàn)有帶加熱頂蓋基因擴(kuò)增儀進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法存在試劑用量多、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，提供一種試劑用量少，整個(gè)PCR反應(yīng)過程大大加快的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。
本發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，仍以薄壁離心管為容器、使用普通帶加熱頂蓋基因擴(kuò)增儀。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)液體積為0.5-10微升，優(yōu)選2-5微升。采用全預(yù)混試劑，全預(yù)混試劑包括緩沖液、DNA聚合酶、鎂離子、腺嘌呤脫氧核糖核苷酸dATP，鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸dCTP，胞嘧啶脫氧核糖核苷酸dGTP，胸嘧啶脫氧核糖核苷酸dTTP，正引物，反引物和與以上試劑總量等量的甘油。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的變性溫度低、退火溫度高、二者之差為10-20℃，其引物長(zhǎng)度為31-50鹼基，或19-30鹼基，但G+C％＞55％。全預(yù)混試劑與樣品的加量體積比為1∶1.5至1∶4，反應(yīng)液中甘油的終濃度為10％-20％。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的變性時(shí)間，退火時(shí)間和延伸三者之和為2-30秒。
本發(fā)明的主要特征列于表一表一 本發(fā)明主要特征

本發(fā)明使用普通的薄壁離心管以帶加熱頂蓋的PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。通過采用全預(yù)混試劑來裝配反應(yīng)液及改進(jìn)引物設(shè)計(jì)和其他反應(yīng)參數(shù)，將PCR反應(yīng)液體積減少到0.5-10微升，比目前通用的50或100微升降低了5-200倍，經(jīng)濟(jì)效果十分可觀。而用現(xiàn)有常規(guī)方法制備超微體積反應(yīng)液相當(dāng)困難，因?yàn)镻CR反應(yīng)液試劑成份多，每種試劑加樣量又小。近年來發(fā)展了部分試劑的預(yù)混技術(shù)，即將PCR反應(yīng)緩沖液，鎂離子，dATP，dCTP，dGTP和dTTP等試劑預(yù)先混合，以減少裝配反應(yīng)液的加樣操作。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上發(fā)展了將正引物，反引物和DNA聚合酶也一起預(yù)先混合的全預(yù)混試劑方法。只需將全預(yù)混試劑與樣品按1∶1.5至1∶4的比例混合即可制備PCR反應(yīng)液，整個(gè)過程只需二次加樣操作，最小加樣量為0.2微升(見表二)，可用商品加樣槍來完成。為了保持全預(yù)混試劑中DNA聚合酶的活性，全預(yù)混試劑含有50％的甘油。全預(yù)混試劑與樣品以1∶1.5或1∶4混合后，最終反應(yīng)液含20％或10％的甘油(見表二)。如以1∶1.5至1∶4之間的比例混合后甘油終濃度在10％與20％之間。雖然10％以上甘油會(huì)使引物與模板的最高允許退火溫度顯著降低，但由于本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物具有極高的Tm，所以，仍能在68℃以上的高退火溫度下完成擴(kuò)增。
表二 全預(yù)混試劑超微體積PCR反應(yīng)液的配制

表三以全預(yù)混試劑與樣品加量為1∶1.5為例，進(jìn)行全預(yù)混試劑的配制。(表中各種試劑的濃度可根據(jù)需要調(diào)整，如引物的終濃度可為10uM或更高)表三 全預(yù)混試劑的配制

作為PCR反應(yīng)的重要參數(shù)之一，反應(yīng)液體積長(zhǎng)期以來未能作大幅度調(diào)降的另一重要原因，是因?yàn)樵跇?biāo)準(zhǔn)PCR條件下單位體積反應(yīng)液內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的量較低。本發(fā)明通過改進(jìn)引物和其他反應(yīng)參數(shù)，提高了飽和期擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度。本發(fā)明選擇的引物Tm值很高，而擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值較低，從而使PCR反應(yīng)溫度參數(shù)達(dá)到表一所示的要求。符合要求的引物通常是鹼基數(shù)31-50的超常引物，也可以是G+C％高(大于55％)鹼基數(shù)18-30的普通長(zhǎng)引物。本發(fā)明采用的引物不僅能在72℃以上的高溫下與模板退火，并且有很強(qiáng)的對(duì)模板自身退火的競(jìng)爭(zhēng)力，使PCR的平坡期被推遲，飽和期擴(kuò)增產(chǎn)物濃度得以提高，因此當(dāng)反應(yīng)液體積僅為0.5微升時(shí)，也能得到足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物，在電泳膠上能用普通DNA染色劑檢出其條帶。
當(dāng)薄壁離心管的反應(yīng)液體積為0.5-10微升時(shí)，液體內(nèi)傳熱能迅速完成，使變性和退火步驟的持續(xù)反應(yīng)時(shí)間可由通常的30秒鐘縮短到1-5秒鐘；延伸步驟的持續(xù)反應(yīng)時(shí)間也可由通常的一分鐘縮短至1-25秒。延伸反應(yīng)最短時(shí)間取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，如擴(kuò)增產(chǎn)物較短可以僅僅用正常的坡道時(shí)間來完成。本發(fā)明超微體積PCR的變性，退火和延伸三步反應(yīng)的總持續(xù)時(shí)間為2-30秒鐘，而通常需要2分鐘(見表四)。
表四 標(biāo)準(zhǔn)PCR和本發(fā)明PCR每一循環(huán)所需時(shí)間*

*升溫速度以每秒2.5度計(jì)，降溫以每秒2.0度計(jì)。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物Tm值高，而擴(kuò)增產(chǎn)物Tm低，退火和延伸二個(gè)反應(yīng)步驟可以合二為一，變性溫度與退火溫度差值僅10-20℃，因此PCR反應(yīng)每一循環(huán)的升降溫坡道時(shí)間，可由通常的40多秒鐘縮短到10-20秒左右。由于每一步反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間和坡道時(shí)間大大減少，完成30個(gè)循環(huán)PCR的總時(shí)間由通常的約1個(gè)半小時(shí)縮短到10-24分鐘(見表四)，為快速臨床PCR診斷開辟了一條新路。如上面所述和以下實(shí)施例所示，本發(fā)明的超微體積PCR方法突破了PCR在三個(gè)不同溫度間循環(huán)的階梯型傳統(tǒng)模式，實(shí)現(xiàn)了在二個(gè)溫度間來回穿梭的模式。反應(yīng)模式的改變不僅僅使反應(yīng)速度實(shí)現(xiàn)了飛躍，而且通過溫度和時(shí)間的雙重控制限制了非專一產(chǎn)物的擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增產(chǎn)物的純度。穿梭模式的實(shí)現(xiàn)對(duì)簡(jiǎn)化PCR儀的設(shè)計(jì)也會(huì)產(chǎn)生影響。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明選擇甘油-3-磷酸脫氫酶，肌動(dòng)蛋白和腺苷酸環(huán)化酶為實(shí)施例的目標(biāo)基因。引物和PCR產(chǎn)物特性及引物順序分別列于表五和表六。
表五 引物和PCR產(chǎn)物的特性

表六 所用引物順序


實(shí)施例1，應(yīng)用代號(hào)為“A”的引物對(duì)進(jìn)行PCR試驗(yàn)，用擴(kuò)增結(jié)果，而不是以往根據(jù)幾何學(xué)或物理學(xué)的分析推斷，來說明反應(yīng)液體積對(duì)產(chǎn)物擴(kuò)增的影響。PCR按常規(guī)方法分變性，退火和延伸三步進(jìn)行。PCR反應(yīng)液的最終濃度為緩沖液40mM Tricine KOH，pH8.7，150mM KOAc，35mM Mg(OAc)2DNA聚合酶用量為每50微升反應(yīng)液15U，dATP，dCTP，dGTP，和dTTP均為0.2mM，每50微升反應(yīng)液含5微升模板c-DNA，c-DNA由商品人組織總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成，正，反引物濃度為1mM。本實(shí)施例分二個(gè)試驗(yàn)，第一個(gè)試驗(yàn)設(shè)定反應(yīng)液總體積為5微升，測(cè)試退火時(shí)間對(duì)最高允許退火溫度的影響。變性95℃30秒，延伸80℃1分半鐘，反應(yīng)35循環(huán)，退火時(shí)間試驗(yàn)范圍從1秒鐘至1分鐘，退火溫度試驗(yàn)范圍從74至80℃。反應(yīng)結(jié)束后每反應(yīng)管加10微升加樣緩沖液，混合后取出全部液體走電泳。電泳結(jié)束后用常規(guī)的溴乙錠染色方法檢測(cè)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。試驗(yàn)結(jié)果列于表六。
表七 退火時(shí)間對(duì)最高退火溫度的影響

結(jié)果表明當(dāng)退火時(shí)間超過30秒鐘時(shí)，所有測(cè)試管均能在78.5退火溫度下完成目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增，說明當(dāng)PCR體積為5微升，在設(shè)定退火溫度下維持30秒鐘，管壁及管中心的溫度能達(dá)到均衡。但是，當(dāng)退火時(shí)間小于30秒鐘時(shí)最高表觀退火溫度隨退火時(shí)間減少而降低，這說明在退火時(shí)間較短的情況下管壁溫度達(dá)到了指定的退火溫度，但管內(nèi)液體還未充分冷卻，其實(shí)際溫度還高于78.5℃，因而未能完成退火。本反應(yīng)試驗(yàn)的第二部分固定退火時(shí)間為30秒鐘，測(cè)試分析不同反應(yīng)體積對(duì)最高表觀退火溫度的影響。反應(yīng)參數(shù)與檢測(cè)方法與第一部分相同，反應(yīng)體積試驗(yàn)從5微升至100微升，結(jié)果見表八。
表八 反應(yīng)體積對(duì)最高退火溫度的影響

結(jié)果表明當(dāng)反應(yīng)液體積為5和10微升時(shí)最高退火溫度高達(dá)78.5℃。但是，反應(yīng)體積超過10微升時(shí)，最高表觀退火溫度隨反應(yīng)體積增大而降低，說明反應(yīng)體積越大管內(nèi)液體溫度達(dá)到均衡所需的時(shí)間越長(zhǎng)。說明采用超微量反應(yīng)體積不僅大大節(jié)約了試劑，也使反應(yīng)體系在極短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到勻一的溫度，從而縮短循環(huán)每一步的時(shí)間。
實(shí)施例2，用代號(hào)為“B”的引物對(duì)進(jìn)行“超速穿梭式”PCR。第一個(gè)試驗(yàn)測(cè)試變性溫度和退火延伸溫度對(duì)“超速穿梭式”PCR的影響。反應(yīng)中所有試驗(yàn)的各管的反應(yīng)體積均為1微升，變性時(shí)間1秒鐘，退火延伸時(shí)間也為1秒鐘，引物濃度為5uM，反應(yīng)30循環(huán)。各種試劑和樣品的用量及產(chǎn)物檢測(cè)方法與實(shí)施例1相同。測(cè)試結(jié)果列于表九。
表九 不同變性和退火延伸溫度下的超速穿梭式PCR反應(yīng)

結(jié)果表明當(dāng)變性溫度大于88℃，退火溫度低于76℃，在此前提下應(yīng)用1微升的超微量反應(yīng)體積，能利用1秒鐘的反應(yīng)加上坡道時(shí)間即能完成擴(kuò)增。全部反應(yīng)時(shí)間包括30個(gè)循環(huán)，PCR儀預(yù)熱，首次變性及最后一次后延伸少于15分鐘。
第二個(gè)試驗(yàn)測(cè)試不同反應(yīng)體積時(shí)的“超微超速穿梭式”PCR反應(yīng)的影響。反應(yīng)條件與第一個(gè)試驗(yàn)相同，所有試驗(yàn)的變性溫度為88℃、時(shí)間1秒鐘，退火延伸溫度為72℃、時(shí)間1秒鐘，反應(yīng)體積分別為0.5，1，2.5，5和10微升，結(jié)果表明，經(jīng)30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增所有測(cè)試管均顯示強(qiáng)的目標(biāo)產(chǎn)物條帶。
第三個(gè)試驗(yàn)測(cè)試不同濃度甘油對(duì)PCR反應(yīng)的影響。所有反應(yīng)體積均為1微升，引物濃度為1uM，變性和退火延伸時(shí)間均為5秒鐘，反應(yīng)數(shù)32個(gè)循環(huán)，其他參數(shù)和檢測(cè)方法與上相同。試驗(yàn)結(jié)果列于表十。
表十 不同濃度甘油時(shí)對(duì)產(chǎn)物擴(kuò)增的影響

結(jié)果表明最低允許變性溫度隨甘油濃度增加而降低，甘油濃度為20％時(shí)能在82至83℃變性溫度下完成擴(kuò)增。雖然，最高允許退火溫度也隨甘油濃度增加而降低。但當(dāng)甘油濃度為20％時(shí)仍能在68度高溫下完成擴(kuò)增，在此溫度下TaqDNA聚合酶顯示高的活力，退火和延伸仍能合為一步。
實(shí)施例3，用代號(hào)為“C”的引物測(cè)試超微反應(yīng)條件下的最小允許變性溫度與退火溫度的差值，所有試驗(yàn)反應(yīng)液的總體積均為2微升，鎂離子濃度為6mM，變性84℃5秒鐘，測(cè)試分析的退火溫度范圍為74-80℃，退火時(shí)間為15秒，結(jié)果見表十一。
表十一 不同變性和退火溫度下的擴(kuò)增結(jié)果

結(jié)果表明在超微體積和超速條件下，能完成擴(kuò)增的最高退火溫度為79℃，與變性溫度僅差5℃。這種超小溫差的PCR反應(yīng)不僅縮短了PCR反應(yīng)的坡道時(shí)間，而且通過低變性溫度，高退火溫度，延伸時(shí)間三重機(jī)制有效的限制非專一擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。
權(quán)利要求
1.一種以薄壁離心管為反應(yīng)容器的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，使用帶加熱頂蓋基因擴(kuò)增儀，其特征在于所說的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)液總體積為0.5-10微升。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的反應(yīng)液總體積為2-5微升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于采用全預(yù)混試劑，全預(yù)混試劑包括緩沖液、DNA聚合酶、鎂離子、腺嘌呤脫氧核糖核苷酸dATP，鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸dCTP，胞嘧啶脫氧核糖核苷酸dGTP，胸嘧啶脫氧核糖核苷酸dTTP，正、反引物和與以上試劑總量相等的甘油。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的變性溫度低，退火溫度高，二者之差為10-20℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的引物長(zhǎng)度為31-50鹼基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的引物長(zhǎng)度為18-30鹼基、但G+C＞55％。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的全預(yù)混試劑與樣品的加量體積比為1∶1.5至1∶4，反應(yīng)液中甘油的終濃度為10％-20％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或5或6所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于所說的變性時(shí)間，退火時(shí)間和延伸時(shí)間三者之和為2-30秒。
全文摘要
本發(fā)明是對(duì)以薄壁離心管為反應(yīng)容器、使用帶加熱頂蓋基因擴(kuò)增儀的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的改進(jìn)。其特點(diǎn)是PCR的反應(yīng)液總體積為0.5－10微升。采用全預(yù)混試劑，全預(yù)混試劑與樣品的加量體積比為1∶1.5至1∶4，反應(yīng)液中甘油的終濃度為10－20％。PCR的變性溫度低，退火溫度高，二者之差為10－20℃。變性時(shí)間、退火時(shí)間和延伸時(shí)間三者之和為2－30秒。其引物長(zhǎng)度為31－50鹼基。本發(fā)明PCR反應(yīng)液體積的超微化和隨之的超速化，能通過溫度和時(shí)間的雙重機(jī)制來限制非專一產(chǎn)物的擴(kuò)增，從而提高PCR的穩(wěn)定性和擴(kuò)增產(chǎn)物的純度。在分子生物學(xué)研究和臨床快速診斷上有廣闊的應(yīng)用和實(shí)際意義。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1515677SQ0310002
公開日2004年7月28日 申請(qǐng)日期2003年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月6日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 徐文慧, 黃貞華 申請(qǐng)人:徐定邦, 徐文慧