專利名稱：對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌0121的o－抗原特異的核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及痢疾志賀氏菌7型(Shigella dysenteriae 7)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特別是涉及痢疾志賀氏菌7型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用這些對(duì)O-抗原特異的寡核苷酸快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)人體及環(huán)境中的痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121(Escherichiacoli O121)并鑒定這些致病菌中的O-抗原。
O-抗原是革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖中的O特異性多糖成分，它由許多重復(fù)的寡糖單位組成。O-抗原的合成過(guò)程研究得較清楚先由糖基轉(zhuǎn)移酶將核苷二磷酸單糖轉(zhuǎn)移到一個(gè)固定在細(xì)胞內(nèi)膜的脂分子上，然后在內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)合成寡糖單位，O-抗原的寡糖單位再通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)酶被轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜外側(cè)，而后通過(guò)聚合酶聚合成多糖，再被連接到一個(gè)糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。編碼負(fù)責(zé)O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體上相鄰排列，形成一個(gè)基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志賀氏菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之間[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgeneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三類基因糖合成路徑基因，糖基轉(zhuǎn)移酶基因，寡糖單位處理基因。其中糖合成路徑基因編碼的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸單糖；糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的酶將核苷二磷酸單糖及其它分子轉(zhuǎn)到單糖上從而使單糖聚合成寡糖單位；寡糖單位處理基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，它們將寡糖單位轉(zhuǎn)移到細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)，再聚合成多糖。糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因只存在于攜帶這些基因的基因簇里。O-抗原中單糖的不同，單糖間聯(lián)結(jié)鍵的不同和寡糖單位之間聯(lián)結(jié)鍵的不同構(gòu)成了O-抗原的多樣性，而單糖的組成、單糖間的聯(lián)結(jié)鍵及寡糖單位之間的聯(lián)結(jié)鍵是由O-抗原基因簇中的基因控制著，所以O(shè)-抗原基因簇決定了O-抗原的合成，也決定了O-抗原的多樣性。
因?yàn)镺-抗原是極強(qiáng)的抗原，是志賀氏菌重要的致病因素之一，同時(shí)它又具有極強(qiáng)的多樣性，這啟示我們能研究一種快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)志賀氏菌及其O-抗原的特異性好、靈敏度高的方法。以表面多糖為目標(biāo)的血清學(xué)免疫反應(yīng)自上世紀(jì)30年代以來(lái)一直被用于對(duì)細(xì)菌的分型和鑒定，是鑒定致病菌的唯一的手段。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和儲(chǔ)存中也存在一些困難。另一方面此法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，所以，現(xiàn)在普遍認(rèn)為這種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法將為現(xiàn)代分子生物學(xué)方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙門(mén)氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特異核苷酸序列通過(guò)PCR方法鑒定了沙門(mén)氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是將相應(yīng)于沙門(mén)氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原內(nèi)的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到對(duì)不同血清型的沙門(mén)氏菌特異的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用針對(duì)E.coli O111的O-抗原特異的源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定了一株產(chǎn)毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminatedwith Shiga-like toxin producing Escherichiacoli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后來(lái)的研究表明Paton，A.Wet.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定E.coli O111的血清型的方法有假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。Bastin D.A.and Reeves，P.R.認(rèn)為，這是由于wbdI基因是一個(gè)推測(cè)的糖合成路徑基因[Bastin D.A.and Reeves，P.R.(1995)Sequence andanalysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coliO111.Gene 16417-23]，而在其它細(xì)菌的O-抗原的結(jié)構(gòu)中也可能有這個(gè)糖，所以糖合成路徑基因?qū)τ贠-抗原并不是高度特異的。
志賀氏菌有46種血清型，但只有33種不同的O-抗原，大腸桿菌有166種不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，nichespecific selection and bacterial populations”.FEMSMicrobiol.Lett，100509-516]，二者親緣關(guān)系非常近，并且有12種O-抗原是大腸桿菌和志賀氏菌共有的，其中痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121就擁有相同的O-抗原[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’sidentificationof the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichiacoli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and O164 andShigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)681-684]，傳統(tǒng)的血清型方法不能將它們區(qū)分。
本發(fā)明的次一目的是提供了痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的全長(zhǎng)核苷酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供了構(gòu)成痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的基因轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf9、orf13、orf14基因；糖合成路徑基因，包括orf1，orf2，rm1B，rm1A，vioA，orf6，orf7， orf10，orf12。
本發(fā)明的又一目的是提供了寡核苷酸，它們分別源于痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因包括orf9、orf13、orf14基因；源于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因、源于編碼聚合酶的基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；它們是上述基因內(nèi)的寡核苷酸，長(zhǎng)度在10-20nt；它們對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原是特異的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它們對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原是高度特異的，而且這些寡核苷酸還可重新組合，組合后的寡核苷酸對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原也是高度特異的。
本發(fā)明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列，從而通過(guò)這些方法來(lái)檢測(cè)和鑒定痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原及檢測(cè)和鑒定痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121。
本發(fā)明的還一目的是提供了分離痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以獲得其他細(xì)菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以獲得編碼其他多糖抗原的細(xì)菌的基因簇的全序列。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長(zhǎng)17433個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其由14個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
前述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括關(guān)于轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf9、orf13、orf14基因；其中，所述的wzx基因是SEQID NO1中的7800至9194堿基的核苷酸；orf9基因是SEQ ID NO1中的9200至10090堿基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO1中的10646至11836堿基的核苷酸；orf13基因是SEQ ID NO1中的13691至14848堿基的核苷酸；orf14基因是SEQ ID NO1中的14849至15973堿基的核苷酸。
前述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基轉(zhuǎn)移酶基因orf9、orf13、orf14基因；或糖合成路徑基因中的寡核苷酸；以及它們的混合或它們的重組。
前述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述的源于orf9基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的9336至9353堿基的核苷酸和11117至10034堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9448至9465堿基的核苷酸和9864至9881堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9274至9292堿基的核苷酸和9746至9763堿基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的11120至11137堿基的核苷酸和11366至11383堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10957至10976堿基的核苷酸和11547至11564堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10707至10725堿基的核苷酸和11767至11785堿基的核苷酸；源于orf13基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的14084至14101堿基的核苷酸和14420至14437堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的13881至13899堿基的核苷酸和14761至14798堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的13975至13992堿基的核苷酸和14361至14379堿基的核苷酸；源于orf14基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的15225至15244堿基的核苷酸和15755至15782堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的14975至14993堿基的核苷酸和15911至14930堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的15011至15030堿基的核苷酸和15688至15706堿基的核苷酸；前述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸在檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原的應(yīng)用。
前述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，且通過(guò)插入表達(dá)可提供表達(dá)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原，并成為細(xì)菌疫苗。
前述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測(cè)、或者用于制造基因芯片或微陣列，檢測(cè)人體和環(huán)境中的細(xì)菌。
前述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)志賀氏菌，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分，之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃30分，加等體積酚抽提混合物，取上清液再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次，取上清液再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中，基因組DNA通過(guò)0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過(guò)PCR擴(kuò)增痢疾志賀氏菌7型中的O-抗原基因簇痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇通過(guò)Long PCR擴(kuò)增，首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動(dòng)子區(qū)的JumpStart序列設(shè)計(jì)上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATCAAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(#1524-TAGTCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)。用Boehringer Mannheim公司的ExpandLong Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分；然后94℃變性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后，在68℃繼續(xù)延伸7分，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性。合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫(kù)用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫(kù)。反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)。合并4管同樣的反應(yīng)體系，分別用等體積的酚和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等體積的乙醚抽提兩次后，用2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中。隨后在此混合物中加入2.5uldNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分，使DNA的3’端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時(shí)，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用BiO-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5 a細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5a混合后，轉(zhuǎn)到BiO-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了痢疾志賀氏7型的O-抗原基因簇文庫(kù)；(4)對(duì)文庫(kù)中的克隆測(cè)序從文庫(kù)中挑選插入片段在700bp以上的120個(gè)克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段單向進(jìn)行測(cè)序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率。剩余20％的序列再根據(jù)已得到的序列設(shè)計(jì)引物，該引物如下所示上游引物5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和下游引物3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’及上游引物5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和下游引物3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’再?gòu)牧〖仓举R氏菌7型的基因組DNA中直接PCR并對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。
(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國(guó)劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列，序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來(lái)保證1)對(duì)痢疾志賀氏菌7型的基因組作6個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫(kù)。2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到痢疾志賀氏菌7型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center forBiotechnology Informat ion，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到14個(gè)開(kāi)放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開(kāi)放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國(guó)sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所示。
(6)特異基因的篩選針對(duì)痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf9、orf13、orf14基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，所有引物都在痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121中得到陽(yáng)性結(jié)果，除wzx外，在其他組中都沒(méi)有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，即在大多數(shù)組中沒(méi)有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖然在少數(shù)組中得到PDR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，在1株大腸桿菌中，可以得到wzx的特異性擴(kuò)增，針對(duì)這株大腸桿菌的專門(mén)行研究已開(kāi)始。所以wzy、orf9、orf13、orf14基因?qū)α〖仓举R氏菌7型和大腸桿菌O121及其O-抗原都是高度特異的。
也就是，本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的全長(zhǎng)核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全長(zhǎng)17433個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通過(guò)本發(fā)明的方法得到了痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)(在表3中列出)，它總共由11個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇中的基因，即轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因(wzx基因或與wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或與wzy有相似功能的基因)；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf9、orf13、orf14基因；細(xì)菌多糖抗原中特殊的糖合成路徑基因，包括orf1，orf2，rmlB，rmlA，vioA，orf6，orf7，orf10，orf12基因，它們?cè)贠-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中。本發(fā)明尤其涉及到糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，因?yàn)樘呛铣陕窂交蚣春铣珊塑斩姿釂翁堑幕颥F(xiàn)在被預(yù)示對(duì)較多胞外多糖是常見(jiàn)的、共同的，對(duì)細(xì)菌的O-抗原并不是很特異的，而本發(fā)明涉及到的糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因?qū)α〖仓举R氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原是高度特異的。
本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了源于痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf9、orf13、orf14基因的寡核苷酸，它們是這些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，優(yōu)先被用的是列于表1中的寡核苷酸對(duì)，在表1中也列出了這些寡核苷酸對(duì)在O-抗原基因簇中的位置及以這些寡核苷酸對(duì)為引物所做的PCR反應(yīng)的產(chǎn)物的大小，這些PCR反應(yīng)可用表中的退火溫度進(jìn)行。這些引物只在以痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增中得到預(yù)期大小的產(chǎn)物，而在以表2所列的166株大腸桿菌和43株志賀氏菌為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增中都未得到預(yù)期大小的產(chǎn)物。更詳細(xì)地說(shuō)，以這些寡核苷酸對(duì)為引物所做的PCR反應(yīng)在大多數(shù)細(xì)菌中均未得到任何產(chǎn)物，雖然在有些菌中得到了PCR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，這是由于引物結(jié)合到基因組的別的位置造成，這種問(wèn)題可通過(guò)用基因內(nèi)的其它引物做PCR來(lái)避免。所以，可以確定這些引物即表1所列的寡核苷酸對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121及它們的O-抗原是高度特異的。
本發(fā)明提供的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟(1)基因組的提取；(2)通過(guò)PCR擴(kuò)增鮑氏志賀氏菌7型中的O-抗原基因簇；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫(kù)；(4)對(duì)文庫(kù)中的克隆測(cè)序；(5)核苷酸序列的拼接及分析；(6)特異基因的篩選。
本發(fā)明的其他方面由于本文的技術(shù)的公開(kāi)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
如本發(fā)明所用，“寡核苷酸”是指來(lái)源于O-抗原基因簇中的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因和編碼聚合酶的基因內(nèi)的一段核苷酸分子，它們?cè)陂L(zhǎng)度上可改變，一般在10到20個(gè)核苷酸范圍內(nèi)改變。更確切的說(shuō)這些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的7800至9194堿基)，orf9基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的9200至10090堿基)，wzy基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的10646至11836堿基)，orf13基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的13691至14848堿基)，orf14基因(核苷酸位置是從SEQID NO1的14849至15973堿基)。源于以上基因內(nèi)的寡核苷酸對(duì)痢疾志賀氏菌7型(SEQ ID NO1)和大腸桿菌O121都是高度特異的。
此外，有時(shí)兩個(gè)遺傳相似的編碼不同O-抗原的基因簇通過(guò)基因重組或突變產(chǎn)生新的O-抗原，從而產(chǎn)生新的細(xì)菌類型，新的突變株。在這種環(huán)境中，需要篩選出多對(duì)寡核苷酸同重組基因雜交以提高檢測(cè)的特異性。因此，本發(fā)明提供了一整套多對(duì)寡核苷酸的混合物，它們?cè)从谔腔D(zhuǎn)移酶基因；源于轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因；也源于糖合成路徑基因。這些基因的混合物對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖抗原來(lái)說(shuō)是特異的，從而使這套寡核苷酸對(duì)這個(gè)細(xì)菌的多糖抗原是特異的。更具體地說(shuō)，這些寡核苷酸的混合物是源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy或與wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸與源于糖合成路徑基因中的寡核苷酸的組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸的鑒定，它們可以用于檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌和在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原。
本發(fā)明涉及到一種檢測(cè)食品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是痢疾志賀氏菌7型或大腸桿菌O121?？捎肞CR方法檢測(cè)，更可以將本發(fā)明方法中的核苷酸標(biāo)記后作為探針通過(guò)雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測(cè)，或通過(guò)基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品中的抗原及細(xì)菌。
本發(fā)明者考慮到以下情況當(dāng)單個(gè)的特異的寡核苷酸檢測(cè)無(wú)效時(shí)，寡核苷酸的混合物能與靶區(qū)域特異性雜交以檢測(cè)樣品。因此本發(fā)明提供了一套寡核苷酸用于本發(fā)明所述的檢測(cè)方法。這里所說(shuō)的寡核苷酸是指源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。這套寡核苷酸對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌的O-抗原來(lái)說(shuō)是特異的，這一特殊的細(xì)菌O-抗原是由痢疾志賀氏菌7型或大腸桿菌O121表達(dá)的。
另一方面，本發(fā)明涉及到一種檢測(cè)排泄物中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交。這些細(xì)菌是痢疾志賀氏菌7型或大腸桿菌O121。可用本發(fā)明中的寡核苷酸作引物通過(guò)PCR的方法檢測(cè)樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸分子標(biāo)記后作為探針通過(guò)雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測(cè)，或者通過(guò)基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品中的抗原及細(xì)菌。
一般一對(duì)寡核苷酸可能與同樣的基因雜交也可與不同的基因雜交，但它們中必須有一個(gè)寡核苷酸能特異性雜交到特殊抗原型的特異序列上，另一個(gè)寡核苷酸可雜交于非特異性區(qū)域。因此，當(dāng)特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新組合時(shí)，至少能選出一對(duì)寡核苷酸與多糖抗原基因簇中特異基因混合物雜交，或者選出多對(duì)寡核苷酸與特異基因的混合物雜交。甚至即使當(dāng)一個(gè)特殊的基因簇中所有基因都獨(dú)一無(wú)二時(shí)，此方法也能應(yīng)用于識(shí)別此基因簇內(nèi)的基因混合物的核苷酸分子。因此本發(fā)明提供了一整套用于檢測(cè)本發(fā)明方法的多對(duì)寡核苷酸，在這里多對(duì)寡核苷酸是源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因，這套寡核苷酸對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖來(lái)說(shuō)是特異的，這套寡核苷酸可能是糖合成中必須基因的核苷酸。
另一方面，本發(fā)明也涉及到一種檢測(cè)源于病人的樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法。樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因中的一對(duì)寡核苷酸中的一個(gè)特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與樣品中的至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是痢疾志賀氏菌7型或大腸桿菌O121?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過(guò)PCR的方法檢測(cè)樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸標(biāo)記后作為探針通過(guò)雜交反應(yīng)，或通過(guò)基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品的抗原及細(xì)菌。
更詳細(xì)地說(shuō)，以上描述的方法可以理解為當(dāng)寡核苷酸對(duì)被使用時(shí)，其中的一個(gè)寡核苷酸分子能雜交到一個(gè)并不是來(lái)源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的序列上。此外，當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸都能雜交上時(shí)，它們可能雜交于同一基因也可能雜交到不同基因上。也即，當(dāng)交叉反應(yīng)出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，可選擇寡核苷酸的混合物來(lái)檢測(cè)混合的基因以提供檢測(cè)的特異性。
本發(fā)明者相信本發(fā)明不必限于以上所提的核苷酸序列編碼的特定的O-抗原，而且廣泛應(yīng)用于檢測(cè)所有表達(dá)O-抗原和鑒定O-抗原的細(xì)菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如細(xì)菌胞外抗原)合成之間的相似性，發(fā)明者相信本發(fā)明的方法和分子也應(yīng)用于這些其他的多糖抗原。
本發(fā)明首次公開(kāi)了痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的全長(zhǎng)序列，而且可從這個(gè)未被克隆的全長(zhǎng)基因簇的序列中產(chǎn)生重組分子，通過(guò)插入表達(dá)可產(chǎn)生表達(dá)痢疾志賀氏菌7型的O-抗原，并成為有用的疫苗。
在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)志賀氏菌，離心收集細(xì)胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃30分。加等體積酚抽提混合物，取上清液再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次，取上清液再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中?；蚪MDNA通過(guò)0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。實(shí)施例2通過(guò)PCR擴(kuò)增痢疾志賀氏菌7型中的O-抗原基因簇。
痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇通過(guò)Long PCR擴(kuò)增。首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動(dòng)子區(qū)的JumpStart序列設(shè)計(jì)上游引物(#1523-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)。用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分；然后94℃變性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后，在68℃繼續(xù)延伸7分，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性。合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。實(shí)施例3構(gòu)建O-抗原基因簇文庫(kù)。
首先是連接產(chǎn)物的獲得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫(kù)。反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)。合并4管同樣的反應(yīng)體系，分別用等體積的酚和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等體積的乙醚抽提兩次后，用2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，并用70％7醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中。隨后在此混合物中加入2.5uldNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分，使DNA的3’端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時(shí)，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物。
其次是感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Bio-Rad公司提供的方法制備感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α。取一環(huán)大腸桿菌DH5α單菌落于5ml的LB培養(yǎng)基中，180rpm培養(yǎng)10小時(shí)后，取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到200ml的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)到OD600 0.5左右，然后冰浴冷卻20分，于4℃4000rpm離心15分。傾盡上清液，用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水200ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分。再用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水100ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分。用冷的冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，4℃6000rpm離心10分，棄上清液，最后沉淀用1ml冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞。將制得的感受態(tài)細(xì)胞分裝為50ul一管，-70℃保存。
最后是電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒-6.0ms毫秒。電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇。然后立即將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇文庫(kù)。實(shí)施例4對(duì)文庫(kù)中的克隆測(cè)序。
從文庫(kù)中挑選插入片段在700bp以上的120個(gè)克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段單向進(jìn)行測(cè)序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率。剩余20％的序列再根據(jù)已得到的序列設(shè)計(jì)引物，再?gòu)牧〖仓举R氏菌7型的基因組DNA中直接PCR并對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。在痢疾志賀氏菌7型中我們?cè)O(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，如下所示上游引物5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和下游引物3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’及上游引物5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和下游引物3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’實(shí)施例5核苷酸序列的拼接及分析。
用英國(guó)劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列(見(jiàn)序列列表)。序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來(lái)保證1)對(duì)痢疾志賀氏菌7型的基因組作6個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫(kù)。2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到痢疾志賀氏菌7型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到14個(gè)開(kāi)放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開(kāi)放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國(guó)sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所示。
通過(guò)檢索和比較，發(fā)現(xiàn)orf1與Shigella sonnei的合成酶ORF1S基因在426個(gè)氨基酸的序列中都有71％的相同性，表明它們之間有高度的同源性。所以可以確定orf1是合成酶基因。orf2與Shigella sonnei的合成酶ORF2S基因在339個(gè)氨基酸的序列中都有70％的相同性，表明它們之間有高度的同源性。所以可以確定orf2是合成酶基因。orf3與Salmonella enterica的rmlB基因在360個(gè)氨基酸的序列中有71％的相同性，表明它們之間有高度的同源性。所以，可以確定orf3是rmlB基因。orf4與Aeromonas hydrophila的rmlA基因在287個(gè)氨基酸的序列中有72％的相同性，表明它們之間也有高度的同源性。所以，可以確定orf4是rmlA基因。Orf8與大腸桿菌的wzx基因在307個(gè)氨基酸序列中有21％的相同性，并且通過(guò)Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.et al(1984).Analysis of membrane andsurface protein sequences with the hydrophobic momentplot.J.Mol.Biol.179125-142]發(fā)現(xiàn)orf8有12個(gè)潛在的穿膜區(qū)，它與許多wzx蛋白相似，而且在wzx蛋白的氨基端有一個(gè)大約50個(gè)氨基酸的保守基序，所以可以確定orf8是wzx基因，命名為wzx。Orf9與Clostridiumacetobutylicum的glycosyltansferase基因在238個(gè)氨基酸中有27％的相同性，是一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因，命名為orf9。Orf10與Thermotoga maritima的乙?；D(zhuǎn)移酶基因在171個(gè)氨基酸序列中有39％的相同性，59％的相似性，所以確定orf10是一個(gè)乙?；D(zhuǎn)移酶基因，命名為orf10。Orf11與大腸桿菌的wzy基因在366個(gè)氨基酸序列中有22％的相同性，另外通過(guò)Eisenberg算法得知orf11有10個(gè)潛在的穿膜區(qū)，與其他的O-抗原聚合酶有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，所以確定orf11就是wzy基因，命名為wzy。Orf12與Pseudomonas aeruginosa的合成酶wbpS基因在628個(gè)氨基酸序列中有56％的相同性，72％的相似性，所以確定orf12是一個(gè)合成酶酶基因，命名為orf12。Orf13與Pseudomonasaeruginosa的glycosyltansferase基因在373個(gè)氨基酸序列中有46％的相同性，68％的相似性，所以可以確定orf13是糖基轉(zhuǎn)移酶基因，命名為orf13。Orf14與Pseudomonas aeruginosa的glycosyltansferase基因在372個(gè)氨基酸序列中有54％的相同性，71％的相似性，所以可以確定orf14是糖基轉(zhuǎn)移酶基因，命名為orf14。實(shí)施例6特異基因的篩選。針對(duì)痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf9、orf13、orf14基因設(shè)計(jì)引物，這些基因在核苷酸序列中的位置見(jiàn)表1。
表1列出了痢疾志賀氏菌7型的O抗原基因簇中糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因及基因內(nèi)的引物及PCR數(shù)據(jù)。在表中列出了痢疾志賀氏菌7型的O抗原基因簇的糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因及它們的相應(yīng)的功能和大小。在每個(gè)基因內(nèi)，我們各設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方以確保其特異性。在表中還列出了每個(gè)引物在SEQ IDNO1中的位置和大小。以每對(duì)引物用表中所列的相應(yīng)的退火溫度以表2中的所有菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，得到了相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大腸桿菌的基因組中且高度保守的一個(gè)基因，所以我們根據(jù)mdh基因設(shè)計(jì)了引物#101(-TTC ATC CTAAAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后從166株大腸桿菌中提取基因組，方法如前所述。用這對(duì)引物從166株大腸桿菌的基因組中PCR以鑒定大腸桿菌并檢測(cè)其基因組質(zhì)量。
表2是用于篩選特異基因的166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來(lái)源，為了檢測(cè)的方便，我們將它們每8-10個(gè)菌分為一組，總共27組，它們的來(lái)源都列于表中。
在第25組中含有痢疾志賀氏菌7型的基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。以每組菌做模板，用表1中的每對(duì)引物按如下條件做PCR在94℃預(yù)變性2分后，94℃變性15秒，退火溫度因引物的不同而不同(參照表1)，退火時(shí)間是50秒，72℃延伸2分，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后在72℃繼續(xù)延伸10分，反應(yīng)體系是25ul。反應(yīng)完畢后，取10ulPCR產(chǎn)物通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增出的片段。
對(duì)于wzx、wzy、orf9、orf13、orf14基因，每個(gè)基因都有3對(duì)引物被檢測(cè)，每對(duì)引物除了在第25組中做PCR后得到了預(yù)期大小的正確的一條帶外，在第3組中也都得到同樣大小的特異性帶。以第3組中的每個(gè)菌的基因組DNA做模板PCR后，發(fā)現(xiàn)只在大腸桿菌O121中得到了陽(yáng)性結(jié)果。更詳細(xì)地說(shuō)，以上每個(gè)基因的每一對(duì)引物都在大腸桿菌O121中得到預(yù)期大小的正確的PCR產(chǎn)物帶。據(jù)報(bào)道，痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原結(jié)構(gòu)是一樣的，我們的結(jié)果從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)了這一點(diǎn)。此外，所有的引物在其他組中都沒(méi)有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，也就是說(shuō)，在大多數(shù)組中沒(méi)有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖然在少數(shù)組中得到PCR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，所以wzx、wzy、orf9、orf13、orf14基因?qū)α〖仓举R氏菌7型和大腸桿菌O121及其O-抗原都是高度特異的。
最后，通過(guò)PCR從痢疾志賀氏菌7型中篩選到對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原高度特異的基因wzy和四個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因。而這些基因內(nèi)的任何一段10-20nt的寡核苷酸對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原是特異的，尤其是上述每個(gè)基因中的引物即寡核苷酸對(duì)經(jīng)PCR檢測(cè)后證實(shí)對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121是高度特異的。所有的這些寡核苷酸都可用于快速準(zhǔn)確地檢測(cè)人體和環(huán)境中的痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121，并能鑒定它們的O-抗原。
表3是痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)表，在表中列出了痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，共由14個(gè)基因組成，每個(gè)基因用方框表示，并在方框內(nèi)寫(xiě)入基因的名稱，數(shù)字表示的是O-抗原基因簇中的開(kāi)放閱讀框(orf)的順序。在O-抗原基因簇的兩端是galF基因和gnd基因，這兩個(gè)基因不負(fù)責(zé)O-抗原的合成，我們只是用它們的一段序列設(shè)計(jì)引物來(lái)擴(kuò)增O-抗原基因簇的全長(zhǎng)序列。
表4是痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇中的所有開(kāi)放閱讀框在全序列中的準(zhǔn)確位置，在每個(gè)開(kāi)放閱讀框的起始密碼子和終止密碼子的下面劃線。序列列表SEQUENCE LISTING<110>南開(kāi)大學(xué)<120>對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸<130>對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>17433<212>DNA<213>Shigella dysenteriae<400>1ctcctggtaa ctcacgcgtc caagaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcttatgaa60ttagaatctc tccttgaact gcgcgtgaag cgtcaactgc tggcggaagt acagtccatt 120tgcccgccgg gcgtgacaat tatgaacgtg cgtcagggtg aacctttagg tttgggccac 180tccattttat gtgcacgacc tgccattggt gacaatccat ttgtcgtggt gctgccagac 240gttgtgatcg acgacgccag cgccgacccg ctgcgctaca accttgctgc catgattgcg 300cgcttcaacg aaacgggccg cagccaggtg ctggcaaaac gtatgccggg tgacctctct 360gaatactcct tcatccagac caaagaacct ctggatcgcg aaggtaaagt cagccgcatt 420gttgaattca tcgaaaaacc ggatcagcca caaacgctgg aatcagacat catggccgtg 480ggccgttatg tgctttctgc cgatatttgg ccggaacttg aacgcactca gccaggtgca 540tggggacgta ttcagctgac tgatgccatt gccgaactgg cgaaaaaaca 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caaagtgggg aagggcgtta cttatcattc aaatcgcatt 10920tattattttt aacacacaaa tgggcgttaa tacagccggt agtgttgaaa ggatagaagg 10980acaatcatta agcaactatc tttttataat tttacaaccc gatattctag tagccgttat 11040ttcagtatgc ttaaattcag gtttcctatt ttggactaat atcttagtat acctgctatc 11100catgttcctt agaggttgga tgggtggaac ctttgtcata ctctttttga tattatcacg 11160ttatcaaaat ttaaggatct cactaaaaac ttttttggta tccttatgtt ctctattgct 11220tcttttctcc attttgcctg cactcattga agcgaaatgg gcaatgagga ccggtatatc 11280tctatcagta tttataagca atatgagttc atatgttact ccagagaatt attatgctgg 11340cataaactat ctgttaaata gatttcaaca tgtcggccat ttagcgttga tatatgaaaa 11400tgcagatgat atatttaaaa aatataacgc aggttatttt agctcatatt atatggatgg 11460cattcctcag tatcttcttg ttaagatgta taacttagat atgtataagc tcagctttta 11520tcttgttcaa tatttctttg atataacaga accgacttgg aatattaaca cgggcgtggt 11580tggatggctt tatatattaa ggtatgaatc catacttttt gcgttttata taatgttatt 11640gttgctggtt ccttattatg tagttagtag atttgctggt aagagaatgt tgagtgtttt 11700ggcttgcttt tctattattt atttatttca cggatggttg ggagcctatg ttaacttagc 11760attttacgca tgtataataa gtctgcttgc aaatataaga ttatacagaa ctgtatatat 11820tccatgtgag aaataggatt gttatgtgtg gattagctgg tttccttgaa tcaaatttaa 11880atgataataa tagtgctaaa gttttacatt cgatgggtga atccatatac cgaaggggac 11940cagatggtac aggaatatgg tttgaaaaca ttgagaataa aataaatgtt ggttttgttc 12000atactcgatt agctattatt gatctctcag acgccggtca acagccgatg cattctcact 12060gcggtcgtta tgtaattgca ttcaatggtg aaatatataa tcatcttgaa ctaagatatc 12120tattagaaag taataatcat atttcctggc gtggccattc tgatacggaa acgcttttgg 12180catgctttgg tatatggggt attgataaga cattgcaggc atgtgttgga atgtttgcaa 12240tagccttatg ggacaaaaaa gaacatcggt taacattagc acgtgataga gttggtgaaa 12300aaccgttgta ctggggatgg caagatgatg cccttctttt tggctcagaa ttaaaagcgt 12360tgaaaactca tccggcattt agtgcagaaa taaacagaga cgcactttgc ttgctattaa 12420ggcataacta tattcctgca ccacatacaa tatatcgagg gatccaaaaa ctacaaccgg 12480gccactatct aagtgttgag ttatcaaatg atgaaagaaa ggagacactt catcagtact 12540ggtcatatga gaaagtagta 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gatttgattt aactaaacta tcgccagata aattttccag 14280aagcgattta agaaaagaaa tcggcttagc agaaaatgat gttgtggtat gttcagttgg 14340tcgctatagt ccagtaaaag atcactcaac ctttatttca gcagctcttc aacttgcaga 14400agaatttagt aatgtacgct tcttattagt cggtcgtggc ttgaccaccc agaataaaat 14460aataatgaca cagcttagtg taagctgtca ctcagataaa tttattcttc ttggtgagcg 14520tagcgatgtt cctgcatgtt taaatgcttc tgatattttt tgccttcatt cagtaacaga 14580aggcttccct aatgtcttag gagaagcaat ggcaatggga attccttccg tgacttcaaa 14640cgttggtgat gccgcatttt tacttgataa ggttgatttt gttgttccag ccggaaactc 14700gtatttatta gcacagaaac tgcgggaagt tattttgtta agtcgaaaaa accgcactaa 14760gttaggtcgt atattaaggc tgcgaattga gaatgagttt tctatggata ctgtagccaa 14820taaatattta tccttatata aaaattaaat gaaaaagatt gtttttataa tcaataatgt 14880cgatttctta atatctcatc gattacctat cttactcgag gctcagaaaa atgggtttca 14940ggttcatgtg attgctccta attccaggaa taatgagcta ctaaagaagc ataaaataat 15000gggtcatgat ctctttcttt ccagaggagg taataaccct ttttatgatt tatttatttt 15060gcttcagctt acaaaaattc 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aacatatagt gaatcagcac ttatccattt acaatgactt 15960aattcactcc tgacgcttag tgctggtgcc atttatgatc attctttttg catcctattt 16020ggcacttgat gctatccatc gcgccctaac ctaagttaac atcttcaata cattcaagcc 16080gcgcatacgt cgcgtggtga ccacacctga caggagtatg taatgtcaaa gcaacagatc 16140ggcgtcgtcg gtatggcagt gatggggcgc aaccttgcgc tcaacatcga aagccgtggt 16200tataccgtct ctattttcaa ccgttcccgt gagaaaacgg aagaagtaat tgccgaaaac 16260ccaggcaaga aactggttcc ttactatacg gtgaaagagt ttgttgaatc tctggaaacg 16320cctcgtcgca tcctgttaat ggtgaaagca ggtgcaggca cggatgctgc tattgattcc 16380ctcaaaccat atctcgataa aggtgacatc atcattgatg gcggtaacac cttcttccag 16440gacaccattc gtcgtaaccg tgagctttct gccgaaggct ttaacttcat tggtaccggt 16500gtctccggtg gtgaagaagg cgcgctgaaa ggtccttcca ttatgcctgg tgggcagaaa 16560gaagcctatg aactggttgc accgatcctg accaaaatcg ccgcagtggc tgaagacggt 16620gagccatgcg ttacctatat tggtgccgat ggcgcaggtc actatgtgaa gatggttcac 16680aacggtattg aatacggcga tatgcagctg attgctgaag cctattctct gcttaaaggt 16740ggcctgaatc tcaccaacga agaattggcg cagaccttta ccgagtggaa taacggtgaa 16800ctgagcagct acctgatcga catcaccaaa gacattttca ctaaaaaaga tgaagacggt 16860aactacctgg ttgatgtgat tctggatgaa gcagcaaaca aaggtaccgg taaatggact 16920agccagagcg cgctggatct cggcgaaccg ctgtcgctga ttacagagtc tgtgtttgca 16980cgttatatct cttctctgaa agagcagcgc gttgccgcgt ctaacgtact gactggtccg 17040caagcgcagc cagcaggcga caaggctgag tttatcgaaa aagttcgccg tgcgctgtat 17100ctgggcaaaa tcgtttctta cgctcagggc ttttctcagc tgcgtgctgc gtctgaagag 17160tacaactggg acctgaatta cggcgaaatc gcgaagattt tccgtgctgg ctgcatcatt 17220cgtgcgcagt tcctgcagaa aattaccgat gcttatgccg aaaatccgca gatcgctaac 17280ctgctgctgg ctccgtactt caagcaaatt gccgatgatt accagcaggc gctgcgtgat 17340gtcgttgctt atgcggtaca gaacggtatc ccggttccga ccttcgctgc tgcggttgcc 17400tattacgata gctaccgtgc cgctgttctg cct17433表1 痢疾志賀氏菌7型O抗原基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因及其中的引物及PCR數(shù)據(jù)

*在一株大腸桿菌中得到1條正確大小的帶**在所有組中得到3條錯(cuò)誤大小的帶***在所有組中得到1條錯(cuò)誤大小的帶表2 166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來(lái)源組號(hào)該組中含有的菌株 來(lái)源1野生型大腸桿菌O1，O2，O3，O10，O16，O18，O39 IMVSa2野生型大腸桿菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100 IMVS3野生型大腸桿菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137 IMVS4野生型大腸桿菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12 IMVS5野生型大腸桿菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22IMVS6野生型大腸桿菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30 IMVS7野生型大腸桿菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42 IMVS8 野生型大腸桿菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53 IMVS9 野生型大腸桿菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61 IMVS10野生型大腸桿菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70 IMVS11野生型大腸桿菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81 IMVS12野生型大腸桿菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90 IMVS13野生型大腸桿菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101 IMVS14野生型大腸桿菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118 IMVS15野生型大腸桿菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171 See b16野生型大腸桿菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132，See c17野生型大腸桿菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143 IMVS18野生型大腸桿菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152 IMVS19野生型大腸桿菌O153，0154，O155，O156，O157，O158，O159，O164 IMVS20野生型大腸桿菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111IMVS21野生型大腸桿菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110IMVS22鮑氏志賀氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14 See d23鮑氏志賀氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18See d24痢疾志賀氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D8 See d25痢疾志賀氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13See d26弗氏志賀氏菌F6a，F(xiàn)1a，F(xiàn)1b，F(xiàn)22a，F(xiàn)2b，F(xiàn)3，F(xiàn)4a，F(xiàn)4b，F(xiàn)5(v7)F5(v4) See d27宋內(nèi)氏志賀氏菌D5，DR See da. Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab. O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc. 172and173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd. 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)研究所表3 是痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)表 1kb表4 是痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇中的基因的位置表ctcctggtaa ctcacgcgtc caagaacgcg gtcgaaaacc acttcgacac ctcttatgaa60ttagaatctc tccttgaact gcgcgtgaag cgtcaactgc tggcggaagt acagtccatt 120tgcccgccgg gcgtgacaat tatgaacgtg cgtcagggtg aacctttagg tttgggccac 180tccattttat gtgcacgacc tgccattggt gacaatccat ttgtcgtggt gctgccagac 240gttgtgatcg acgacgccag cgccgacccg ctgcgctaca accttgctgc catgattgcg 300cgcttcaacg aaacgggccg cagccaggtg ctggcaaaac gtatgccggg tgacctctct 360gaatactcct tcatccagac caaagaacct ctggatcgcg aaggtaaagt cagccgcatt 420gttgaattca tcgaaaaacc ggatcagcca caaacgctgg aatcagacat catggccgtg 480ggccgttatg tgctttctgc cgatatttgg ccggaacttg aacgcactca gccaggtgca 540tggggacgta ttcagctgac tgatgccatt gccgaactgg cgaaaaaaca gtctgttgac 600gccatgctga tgactggtga cagctacgac tgtggtaaaa 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taatgtaata tgcttgccct catatcgaga agggttacct aaatgtctgg ttgaagccgc 15720agcgtgtggt agggcagttg ttacaactga tgtaccaggt tgcagggatg cgatagtggc 15780aaatgttact gggatgttag tcgcagttcg ggatcctgta tcgttagcag atgcgattga 15840gtttctgcta aaaaatccag atgaaagaat aaaaatgggg aaggcgggga gattgttagc 15900tgaaaatgag tactcaatcg aacatatagt gaatcagcac ttatccattt acaatgactt 15960orf14的中止aattcactcctgacgcttag tgctggtgcc atttatgatc attctttttg catcctattt 16020ggcacttgat gctatccatc gcgccctaac ctaagttaac atcttcaata cattcaagcc 16080gcgcatacgt cgcgtggtga ccacacctga caggagtatg taatgtcaaa gcaacagatc 16140ggcgtcgtcg gtatggcagt gatggggcgc aaccttgcgc tcaacatcga aagccgtggt 16200tataccgtct ctattttcaa ccgttcccgt gagaaaacgg aagaagtaat tgccgaaaac 16260ccaggcaaga aactggttcc ttactatacg gtgaaagagt ttgttgaatc tctggaaacg 16320cctcgtcgca tcctgttaat ggtgaaagca ggtgcaggca cggatgctgc tattgattcc 16380ctcaaaccat atctcgataa aggtgacatc atcattgatg gcggtaacac cttcttccag 16440gacaccattc gtcgtaaccg tgagctttct gccgaaggct ttaacttcat tggtaccggt 16500gtctccggtg gtgaagaagg cgcgctgaaa ggtccttcca ttatgcctgg tgggcagaaa 16560gaagcctatg aactggttgc accgatcctg accaaaatcg ccgcagtggc tgaagacggt 16620gagccatgcg ttacctatat tggtgccgat ggcgcaggtc actatgtgaa gatggttcac 16680aacggtattg aatacggcga tatgcagctg attgctgaag cctattctct gcttaaaggt 16740ggcctgaatc tcaccaacga agaattggcg cagaccttta ccgagtggaa taacggtgaa 16800ctgagcagct acctgatcga catcaccaaa gacattttca ctaaaaaaga tgaagacggt 16860aactacctgg ttgatgtgat tctggatgaa gcagcaaaca aaggtaccgg taaatggact 16920agccagagcg cgctggatct cggcgaaccg ctgtcgctga ttacagagtc tgtgtttgca 16980cgttatatct cttctctgaa agagcagcgc gttgccgcgt ctaacgtact gactggtccg 17040caagcgcagc cagcaggcga caaggctgag tttatcgaaa aagttcgccg tgcgctgtat 17100ctgggcaaaa tcgtttctta cgctcagggc ttttctcagc tgcgtgctgc gtctgaagag 17160tacaactggg acctgaatta cggcgaaatc gcgaagattt tccgtgctgg ctgcatcatt 17220cgtgcgcagt tcctgcagaa aattaccgat gcttatgccg aaaatccgca gatcgctaac 17280ctgctgctgg ctccgtactt caagcaaatt gccgatgatt accagcaggc gctgcgtgat 17340gtcgttgctt atgcggtaca gaacggtatc ccggttccga ccttcgctgc tgcggttgcc 17400tattacgata gctaccgtgc cgctgttctg cct17433以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長(zhǎng)17433個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照權(quán)利要求1所述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其由14個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
3.按照權(quán)利要求2所述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf9、orf13、orf14基因；其中，所述的wzx基因是SEQ ID NO1中的7800至9194堿基的核苷酸；orf9基因是SEQ ID NO1中的9200至10090堿基的核苷酸；wzy基因是SEQ ID NO1中的10646至11836堿基的核苷酸；orf13基因是SEQ ID NO1中的13691至14848堿基的核苷酸；orf14基因是SEQ ID NO1中的14849至15973堿基的核苷酸。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是源于所述wzy基因或糖基轉(zhuǎn)移酶基因orf9、orf13、off14基因；或糖合成路徑基因中的寡核苷酸；以及它們的混合或它們的重組。
5.按照權(quán)利要求4所述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述的源于orf9基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ IDNO1中的9336至9353堿基的核苷酸和11117至10034堿基的核苷酸；SEQ IDNO1中的9448至9465堿基的核苷酸和9864至9881堿基的核苷酸；SEQ IDNO1中的9274至9292堿基的核苷酸和9746至9763堿基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的11120至11137堿基的核苷酸和11366至11383堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10957至10976堿基的核苷酸和11547至11564堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10707至10725堿基的核苷酸和11767至11785堿基的核苷酸；源于orf13基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ IDNO1中的14084至14101堿基的核苷酸和14420至14437堿基的核苷酸；SEQID NO1中的13881至13899堿基的核苷酸和14761至14798堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的13975至13992堿基的核苷酸和14361至14379堿基的核苷酸；源于orf14基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的15225至15244堿基的核苷酸和15765至15782堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的14975至14993堿基的核苷酸和15911至14930堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的15011至15030堿基的核苷酸和15688至15706堿基的核苷酸。
6.權(quán)利要求1所述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸在檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，而且通過(guò)插入表達(dá)可提供表達(dá)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原，并成為細(xì)菌疫苗。
8.按照權(quán)利要求1所述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測(cè)、或者用于制造基因芯片或微陣列，檢測(cè)人體和環(huán)境中的細(xì)菌。
9.按照權(quán)利要求1所述的對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)志賀氏菌，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分，之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃30分，加等體積酚抽提混合物，取上清液再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次，取上清液再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中，基因組DNA通過(guò)0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過(guò)PCR擴(kuò)增鮑氏志賀氏菌7型中的O-抗原基因簇痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇通過(guò)Long PCR擴(kuò)增，首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動(dòng)子區(qū)的JumpStart序列設(shè)計(jì)上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATCAAA GAA AT-3’)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(5’-TAGTCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分；然后94℃變性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后，在68℃繼續(xù)延伸7分，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性。合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫(kù)用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫(kù)。反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)。合并4管同樣的反應(yīng)體系，分別用等體積的酚和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等體積的乙醚抽提兩次后，用2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中。隨后在此混合物中加入2.5uldNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分，使DNA的3’端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時(shí)，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用BiO-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5a細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5 a混合后，轉(zhuǎn)到BiO-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了痢疾志賀氏7型的O-抗原基因簇文庫(kù)；(4)對(duì)文庫(kù)中的克隆測(cè)序從文庫(kù)中挑選插入片段在700bp以上的120個(gè)克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段單向進(jìn)行測(cè)序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率。剩余20％的序列再根據(jù)已得到的序列設(shè)計(jì)引物，該引物如下所示上游引物5’-GCATGGGTTACTGTACTAGC-3’和下游引物3’-AATGGCATCAATACCCGC-5’及上游引物5’-TGGCGGTATTGAGAGAGT-3’和下游引物3’-TTACAGGCTACTTCTCTTC-5’再?gòu)牧〖仓举R氏菌7型的基因組DNA中直接PCR并對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國(guó)劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列，序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來(lái)保證1)對(duì)痢疾志賀氏菌7型的基因組作6個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫(kù)。2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到痢疾志賀氏菌7型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到14個(gè)開(kāi)放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開(kāi)放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國(guó)sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因的篩選針對(duì)痢疾志賀氏菌7型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf9、orf13、orf14基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，所有引物都在痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121中得到陽(yáng)性結(jié)果，除wzx外，在其他組中都沒(méi)有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，即在大多數(shù)組中沒(méi)有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖然在少數(shù)組中得到PDR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，在1株大腸桿菌中，可以得到wzx的特異性擴(kuò)增，針對(duì)這株大腸桿菌的專門(mén)行研究已開(kāi)始。所以wzy、orf9、orf13、orf14基因?qū)α〖仓举R氏菌7型和大腸桿菌O121及其O-抗原都是高度特異的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種是對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O－抗原特異的核苷酸，其是痢疾志賀氏菌7型(Shigella dysenteriae 7)中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長(zhǎng)17433個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。還包括源于痢疾志賀氏菌7型的O－抗原基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因的寡核苷酸，并且包括獲得細(xì)菌O－抗原基因簇的方法；本發(fā)明通過(guò)PCR證實(shí)它們對(duì)痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的O－抗原都有高度的特異性；本發(fā)明還公開(kāi)了用本發(fā)明的寡核苷酸檢測(cè)和鑒定人體及環(huán)境中的痢疾志賀氏菌7型和大腸桿菌O121的方法。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1451663SQ03100358
公開(kāi)日2003年10月29日 申請(qǐng)日期2003年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月20日
發(fā)明者王磊, 陶江, 馮露 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)