專利名稱：一種口蹄疫雙價多肽疫苗基因合成及高效表達方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種編碼口蹄疫雙價多肽疫苗基因的核苷酸序列及其合成方法和包含上述口蹄疫雙價多肽疫苗基因核苷酸序列的載體的構建以及高效表達該段核苷酸編碼多肽的方法。
2.背景技術口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot andmouth disease virus，F(xiàn)MDV)感染引起的致偶蹄類動物的一種急性、高度接觸性、發(fā)熱性、毀滅性傳染病，以流行廣、傳播快、發(fā)病率高而著稱(柳紀省，中國獸醫(yī)科技.1999，29(3)17-20)。由于豬、牛、羊等主要家畜均可感染此病并形成全球規(guī)模流行，被聯(lián)合國糧農組織和國際獸醫(yī)局(IEO)列為16種A類傳染病之首?？谔阋叩奈：π院艽?，可引起大面積牲畜的死亡，嚴重影響畜牧業(yè)生產和動物及其產品的國際貿易，給農業(yè)、畜牧業(yè)、國民經濟造成巨大的損失(江鵬斐，中國農業(yè)科學.1999，32(6)93-100)。因此，預防、控制和消滅口蹄疫的發(fā)生顯得尤為重要。
預防口蹄疫，注射口蹄疫疫苗是防治口蹄疫的有效方法。由于口蹄疫有不同的血清免疫類型，各類型之間的疫苗不能提供交叉保護，因此，預防口蹄疫，多采用與當地流行的病毒類型相匹配的口蹄疫疫苗?？谔阋攥F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有7種血清免疫類型，以及65個以上的亞型。7種類型分別是A、O、C、亞洲1型(Asia 1)和南非I、II、III型，其中以A型及O型口蹄疫最為普遍，我國即以O型及A型為主。如何能提供足夠數量，并能有效進行免疫的疫苗，對易感寄主進行綜合免疫，是控制和根除這種疾病的主要方法。
目前，我國抗口蹄疫病毒疫苗的傳統(tǒng)制備方法是采用組織培養(yǎng)法繁殖口蹄疫病毒，即利用鼠腎細胞系(BHK)傳代細胞系方法來生產滅活疫苗，還有一種方法是通過各種減毒方法制得弱毒疫苗。這兩種疫苗雖然都有較好的免疫能力，但是制備的安全性較差，因為在生產過程中需培養(yǎng)大量病毒，而該種病毒可通過空氣傳染，生產過程中與病毒接觸過的工具或器皿都有散毒的危險。而且傳統(tǒng)的滅活疫苗與弱毒疫苗一旦滅活或減毒不完全，在大規(guī)模對動物的免疫過程中，可能會導致極少量被免疫動物發(fā)病而成為疾病流行的病源中心與媒介(易建中，黃海斌，楊志軍，等，復旦學報(自然科學版)，1997，36(5)23-27)。因此，急需改變傳統(tǒng)的疫苗制備方法，建立安全有效的疫苗制備新技術體系。研究開發(fā)新型安全有效的口蹄疫疫苗，以控制和消滅口蹄疫。
利用基因工程技術進行口蹄疫疫苗的研究受到了廣泛的重視，目前所進行的疫苗基因研究包括單價、多價合成多肽疫苗基因、亞單位疫苗基因，即以病毒顆粒中的亞單位-VP1蛋白(具有免疫源性)的基因用作疫苗基因序列；還有報道用非結構蛋白基因等。目前研究較多的是合成肽疫苗基因，合成肽是人工合成的類似于天然抗原的小肽，由這種小肽制成的疫苗安全性好；或以多價的合成肽的DNA序列作為目的基因，通過原核表達系統(tǒng)表達疫苗組份。由于這種方法生產疫苗不是由病毒直接制備而成的，不涉及病毒本身，沒有感染性，所以不存在未滅活病毒釋放的問題，還可避免一些與特異性免疫無關的成分存在。所以可以確保是安全的(楊永欽，王家駒，云南畜牧獸醫(yī)，1997，127-29；趙凱，鄒士平，張震宇，等。中國免疫學雜志，2002，1889-92)。因此，采用安全的合成肽疫苗進行口蹄疫防治，受到國內外學者廣泛重視，合成肽類疫苗不僅安全性好，而且生產與運輸都很方便。
隨著對口蹄疫病毒的基因結構及其病毒顆粒空間結構更進一步的認識，發(fā)現(xiàn)VP1蛋白是FMDV最主要的抗原蛋白，VP1蛋白功能區(qū)包含F(xiàn)MDV的主要抗原位點，特別是在位點1，即VP1蛋白的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸殘基序列所組成FMDV的主要抗原區(qū)，能誘導動物產生中和抗體，是決定各種亞型FMDV免疫原性的主要抗原決定簇片斷，(楊永欽，王家駒，云南畜牧獸醫(yī)，1997，127-29；Dus Santos MJ，Vccine 2002，201141-1147)。所以利用VP1蛋白或其抗原決定簇部份成為FMD新型疫苗研究的主要途徑。國外有人發(fā)現(xiàn)化學合成的VP1的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸的肽段能引起一定的免疫反應(Kleid DG，Science，1981，214(1525)1125-1129)。
我國學者對口蹄疫合成肽疫苗也進行了研究，鄭兆鑫等(鄭兆鑫，賀沛富，嚴維耀，等，病毒學報，1989，5(1)41-45)將O型FMDV編碼VP1蛋白的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸串聯(lián)為20AA-14AA-20AA類型，并與β-半乳糖甘酶基因相連，在大腸桿菌中表達的融合蛋白，經動物實驗證明具有很強的免疫原性，成為安全有效的基因工程疫苗。易建中等(易建中，黃海斌，楊志軍，等，復旦學報(自然科學版)，1997，36(5)23-27)將A型FMDV編碼VP1蛋白的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸串聯(lián)為20AA-14AA-20AA類型，經斑點ELISA證明，大腸桿菌中表達的融合蛋白，具有A型FMDV抗原活性。然而用O型和A型FMDV編碼VP1蛋白研制雙價多肽疫苗方面，到目前為止尚未見報道。
我國口蹄疫的發(fā)生，以O型和A型口蹄疫病毒為主，因此，盡快研制O-A型雙價疫苗，用于邊界防疫及應急儲備，是防治FMD亟待解決的問題(張永光，王永錄，等。中國獸醫(yī)科技.1996，26(5)3-5)。
3.發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供一種編碼口蹄疫雙價多肽疫苗基因的核苷酸序列及其編碼蛋白及該口蹄疫雙價多肽疫苗核苷酸序列的合成方法。
在對口蹄疫雙價多肽疫苗的設計中首先選取來自中國的O型病毒的O58株系的第140-160氨基酸和200-213氨基酸組成的多肽，即O58的20肽、14肽，將其與A型病毒的A62株系第140-160氨基酸和200-213氨基酸組成的多肽，即A62的20肽、14肽，相互串聯(lián)起來，即成為O58系(20肽-14肽)-A62系(20肽-14肽)串聯(lián)序列，簡稱O-A型序列，即為SEQ ID NO1所示的序列。
還選取來自中國的A型病毒的A62株系為材料，以其第140-160氨基酸和200-213氨基酸組成的多肽，與O58株系第140-160氨基酸和200-213氨基酸組成的多肽，即O58株系的20肽、14肽，相互串聯(lián)起來，成為A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)串聯(lián)序列，簡稱A-O型序列，即為SEQ ID NO2所示的序列。
然后再將SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示的基因序列與綠色熒光蛋白基因相連，其表達產物即可用作疫苗。
經過設計，分別先合成如下各個序列的片段，然后再進行連接片段AO58株系病毒VP1蛋白的第141-160氨基酸的編碼序列。
5’gtg acc aaa gtg aga ggc gat ctg cag gtg ctg gcg cag aaa gcg gca cgc tctctg ccg片段BO58株系病毒VP1蛋白的第200-213氨基酸的編碼序列5’aga cat aaa cag aag att gtg gca cca ggc aaa cgc ctg ctg片段EA62株系病毒VP1蛋白的第141-160氨基酸的編碼序列5’aac gcg ggc cgt cgc ggc gat ctg ggc tct ctg gcg gcg cgt gtg gcg cagctg ccg gcg片段FA62株系病毒VP1蛋白的第200-213氨基酸的編碼序列cgc cat aaa cag cgt att att gcg ccg gcg aaa cag ctg ctg以O-A、A-O的方式串聯(lián)起來，如圖1所示。分別得到SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個目的是構建包含該口蹄疫雙價多肽疫苗基因的原核表達載體以及高效表達該雙價多肽疫苗基因編碼多肽的方法。將上述兩個口蹄疫雙價多肽疫苗基因直接構建到原核表達載體或將上述兩個口蹄疫雙價多肽疫苗基因與GFP(綠色熒光蛋白)基因串聯(lián)，構建融合基因，并將該兩種融合基因分別構建到原核表達載體中。采用人工合成方法合成這些多肽的基因片段，由于這些基因片段過小，所以還需要將它們與其它蛋白基因串聯(lián)，從而產生穩(wěn)定性更好的融合蛋白。目前，廣泛采用綠色熒光蛋白(GFP)基因為報告基因，如將其與疫苗多肽基因串聯(lián)，從而構建成融合基因，其表達產物可能發(fā)出綠色螢光，從中篩選轉化體就十分方便，兩種雙價多肽疫苗核苷酸序列與GFP基因串聯(lián)方式詳見SEQ ID NO5及SEQID NO6。SEQ ID NO1與GFP融合基因核苷酸序列為SEQ ID NO5。SEQ ID NO2與GFP融合基因核苷酸序列為SEQ ID NO6對上述多肽疫苗蛋白進行的免疫原性測定表明，合成基因具有較好的免疫原活性。牲畜經免疫后，可能預防A型及O型兩種口蹄疫，而且還可能用于制備檢測A型及O型兩種口蹄疫抗原。
4.


圖1合成的原始片段串聯(lián)方式示意2合成的原始片段及具體拼接示意3以O-A連接后的環(huán)形DNA鏈圖4以A-O連接后的環(huán)形DNA鏈圖5pUCm-F1滯后質粒電泳檢測結果。
3為pUCm-F1滯后質粒，其余為pUCm-T質粒圖6pUCm-F1雙酶切及PCR驗證1-NcoI/EcoRI酶切質粒pUCm-F1，2，3-PCR結果，4，DGL2000DNA Maker圖7FMDV雙價疫苗基因的原核表達載體構建8原核表達載體pET-FM1示意圖5.具體實施方式
實施例1.口蹄疫雙價多肽疫苗基因的獲得與原核表達1.口蹄疫雙價多肽疫苗基因的獲得隨著對口蹄疫病毒的基因結構及其病毒顆?？臻g結構更進一步的認識，發(fā)現(xiàn)VP1蛋白是FMDV最主要的抗原蛋白，VP1蛋白功能區(qū)包含F(xiàn)MDV的主要抗原位點，特別是在位點1，即VP1蛋白的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸殘基序列所組成FMDV的主要抗原區(qū)，能誘導動物產生中和抗體，是決定各種亞型FMDV免疫原性的主要抗原決定簇片斷，(楊永欽等，1997；Dus Santos MJ，2002)。所以利用VP1蛋白或其抗原決定簇部份成為FMD新型疫苗研究的主要途徑。國外有人發(fā)現(xiàn)化學合成的VP1的141-160位氨基酸和200-213位氨基酸的肽段能引起一定的免疫反應(Kleid DG，Yansura DJ，Bachrach HI，Science，1981，214(1525)1125-1129)。選取來自中國的O型病毒的O58(GeneBank號FDI131469)和A型病毒的A62株系(GeneBank號FDI 131666)，口蹄疫O58型病毒的VP1蛋白的第140-160氨基酸和200-213氨基酸組成的多肽，即O58型病毒的VP1蛋白的20肽、14肽相串聯(lián)起來的多肽，與A62型病毒的VP1蛋白的第140-160氨基酸和200-213氨基酸組成的多肽，即A62型病毒的VP1蛋白的20肽、14肽相串聯(lián)起來的多肽，以兩種方式串聯(lián)起來，成為O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)，簡稱為O-A的串聯(lián)序列，及A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)，簡稱為A-O的串聯(lián)序列，分別得到SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。雖然設計好的多肽片段的核苷酸序列不是很長，但仍很難直接合成全長序列，故將其分段合成。由上海博亞生物技術公司合成。
片段1是病毒O58及A62株系VP1蛋白基因序列(O58來源于GenBankFDI131469，A62來源于GenBank FDI 131666)上不存在的序列，在本工作中用于合成片段的環(huán)化及擴增引物，由于其序列5’端與片段6和片段16互補，3’端與片段2和片段11互補，故可使合成片段成為環(huán)狀。
gaa ttc taa tag ctc gag gtc gac aag ctt acc atgEcoRI SalI HindIII NcoI片段2用于片段A與片段1連接用，其中一部分序列與片段1互補，另一部分與片段A互補。為分析方便，在下面顯示的是片段2的互補鏈。
gtc gac aag ctt acc atg gtg acc aaaSalI HindIII NcoI片段3下面所示是片段3的互補序列，可以看出片段3與片段A的10-45堿基序列一致。
gtg aga ggc gat ctg cag gtg ctg gcg cag aaa gcg(需反轉)片段4用于連接片段A和片段B的互補鏈。下面所示為片段4的互補序列，它的一部分序列(15bp)與片段A的后15堿基互補，另一部分序列(37bp)和片段B頭部序列互補gca cgc tct ctg ccg-aga cat aaa cag aag att atg gca cca(需反轉)片段6用于連接片段B和片段1的互補鏈序列。以下顯示的是片段6的互補序列，其中一部分序列與片段B的3’端的15bp序列互補，另一部分與片段1的5’端18bp序列互補。
ggc aaa cgc ctg ctg-gaa ttc taa tag ctc gag(需反轉)片段11用于連接片段E和片段1的互補鏈序列。以下顯示的是片段11的互補序列，其中一部分序列與片段1的3’端的18bp序列互補，另一部分與片段E的5’端9bp序列互補。
gtc gac aag ctt acc atg-aac gcg ggc(需反轉)片段12是片段E的互補序列。以下顯示的是片段12的互補序列，序列與片段E的10-46堿基序列互補。
cgt cgc ggc gat ctg ggc tct ctg gcg gcg cgt gtg(需反轉)片段13用于連接片段E和片段F的互補鏈序列。以下顯示的是片段13的互補序列，其中一部分序列與片段E的3’端的15bp序列互補，另一部分與片段F的5’端45bp序列互補。
gcg cag ctg ccg gcg-cgc cat aaa cag cgt att att gcg ccg(需反轉)片段14用于連接片段F和片段A的互補鏈序列。以下顯示的是片段13的互補序列，其中一部分序列與片段F的3’端的15bp序列互補，另一部分與片段A的5’端45bp序列互補。
gcg aaa cag ctg ctg-gtg acc aaa(需反轉)片段15用于連接片段B和片段E的互補鏈序列。以下顯示的是片段15的互補序列，其中一部分序列與片段B的3’端的15bp序列互補，另一部分與片段E的5’端9bp序列互補。
ggc aaa cgc ctg ctg-aac gcg ggc(需反轉)片段16
用于連接片段F和片段1的互補鏈序列。以下顯示的是片段16的互補序列，其中一部分序列與片段F的3’端的15bp序列互補，另一部分與片段1的5’端18bp序列互補。
gcg aaa cag ctg ctg-gaa ttc taa tag ctc gag(需反轉)正鏈、互補鏈分成幾段合成，正鏈為4段，編碼的分別為病毒O58株系VP1蛋白上有免疫位點的20肽、14肽和A62株系的20肽、14肽，其核苷酸長度為60bp和42bp兩種，正鏈5’端全部磷酸化；互補鏈為了合成的方便，設計了多個鏈，其中不僅有與正鏈完全對應的片斷，也有與正鏈部分有互補關系的片斷。另外根據多肽基因的序列設計了引物，用以擴增已合成的片斷，而且在引物上加了限制性內切酶的識別序列。設計好的多肽基因及引物交由DNA合成公司合成。
(1)小片段拼接合成的寡核苷酸片段用雙蒸水溶解，其中用于合成基因的均稀釋到約800ng/μl，用作引物的合成片段溶解并稀釋到80ng/nl。然后按圖2所示方式進行拼接。
在圖2中，片段A和B分別代表O58株系的20肽和14肽的正鏈，E和F分別代表A62的20肽和14肽的正鏈寡核苷酸片段。1代表的是一個人工設計的正鏈寡核苷酸片段，主要是提供酶切序列和作引物用，同樣它的5’端磷酸化，2、3、4、6、11、12、13、14、15、16代表的分別是合成的互補鏈寡核苷酸片段，其中有些鏈能同時與不同的正鏈相互補，以便用于拼接不同株系的正鏈，其中片段1、6、16還將用作引物來擴增合成鏈。
按O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)(簡稱O-A)多肽順序的基因拼接操作分別將片段A、2、3為一組；片段B、4、15為一組；片段E、F、1、12、13、16為一組，按等摩爾混合。
按A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)(簡稱A-O)多肽順序的基因拼接操作分別將片段E、11、12為一組；片段F、13、14為一組；片段A、B、1、3、4、6為一組，按等摩爾混合。
混合好的片段溶液10μl放于已升溫到95℃的水浴鍋中，斷電后自然冷卻10小時。
(2)片段連接分別將O-A、A-O多肽順序三組拼接產物各取適量混合，取5μl加入等量的快速連接酶I(大連寶生生物公司產品)，于16℃連接16小時以上。將連接產物用TE緩沖液稀釋100倍，-20℃保存。
連接后的片段實際上是兩個環(huán)形DNA鏈。如圖3、圖4所示即是分別按O-A、A-O多肽順序連接的基因片段。
分別按O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)、A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)多肽順序的基因片段，由于片段正鏈寡核苷酸鏈5’端磷酸化，所以連接成一完整的環(huán)形DNA單鏈。下鏈在寡核苷片段間仍是缺口，分別利用片段1、16、1、6作為兩對引物，通過PCR可對其進行擴增。
(3)合成片段的PCR擴增
利用引物序列對上述連接產物進行PCR擴增。PCR反應體系10xPCR緩沖液5μl，10mmol/L dNTP4μl，Pfu DNA聚合酶2U，分別用片段1，片段16；片段1，片段6作為兩對引物，引物濃度為80ng/μl，各加入2μl，連接產物O-A及A-O分別加入1μl，分別加水到總體積50μl。PCR程序為95℃預變性5分鐘；然后94℃變性1分鐘，65℃復性1分鐘，72℃延伸2分鐘，循環(huán)30次。
2.口蹄疫雙價多肽疫苗基因原核表達載體的構建(1)口蹄疫雙價多肽疫苗基因的克隆以O-A、方式連接產物為模板，用片段1，片段16作為引物；以A-O方式連接產物為模板，用片段1，片段6作為引物，經PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，切出204bp的帶，用DNA純化回收試劑盒(購自鼎國公司)進行回收純化，用T4DNA連接酶(上海生工公司)，與載體pUCm-T Vector(上海生工公司)連接，16℃連接過夜，以O-A、A-O方式的連接產物，得到的克隆載體分別為pUCm-F1及pUCm-F2(pUCm-F1為以O-A方式連接產物構建的載體；pUCm-F2為以A-O方式連接產物構建的載體；)。
(2)轉化連接產物pUCm-F1及pUCm-F2通過熱激法轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。
轉化用感受態(tài)大腸桿菌的制備挑取DH5α的單菌落于10ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃ 250rpm培養(yǎng)過夜。取1ml培養(yǎng)菌液加到100ml新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃ 300rpm培養(yǎng)3h左右至OD600值為0.5-0.6。冰浴菌液30min，4℃ 6000rpm離心5min，收集菌體。棄掉上清，加入10ml冰浴無菌的0.1mol/LCaCl2溶液中懸浮菌體細胞，冰浴15min。4℃ 6000rpm離心5min。棄掉上清，將菌體重懸于2ml0.1mol/LCaCl2溶液中。分裝到預冷的1.5ml無菌Eppendorf管中(200μl/管)，加入15％的無菌甘油于-70℃貯存?zhèn)溆谩＿B接產物按以下方法進行大腸桿菌轉化分別取1μl的連接反應產物pUCm-F1及pUCm-F2，于200μl DH5α感受態(tài)細胞溶液中，混勻后，冰浴30min。42℃水浴熱擊90sec，立即置冰浴中1-2min。加入800μl LB液體培養(yǎng)基，37℃ 150rpm搖床培養(yǎng)1h。在附加AMP50ug/mlLB的固體平板上，涂布40μl X-gal(20μg/μl)和4μl IPTG(200μg/μl)溶液。從1ml轉化菌液中取100μl菌液涂布于平板上，風干。
37℃培養(yǎng)16小時，平板上出現(xiàn)蘭色和白色菌落，挑取白色菌落進行重組克隆的鑒定。
(3)轉化子鑒定首先對克隆載體pUCm-F1及pUCm-F2進行質粒DNA的提取。按Sambrook等(1989)堿法制備pUCm-F1(pUCm-F2)載體質粒DNA。隨機挑取含有pUCm-F1及pUCm-F2的載體的DH5α菌落，分別接種于3ml含卡那霉素100mg/L的LB細菌培養(yǎng)基中，37℃搖動過夜。在1.5ml的Eppendorf管中，12000rpm離心2min，重復一次，收集3ml菌體。
加入100μl溶液I(25mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl，pH8.0，10mmol/L EDTA)，震蕩均勻。加入200μl溶液II(0.2mmol/L NaOH，1％SDS)，顛倒離心管數次混合內容物，放置冰上3min。
加入150μl溶液III(5mmol/L醋酸鉀60ml，冰醋酸11.5ml，蒸餾水28.5ml)，混合均勻，放置冰上。12000rpm離心10min，取上清移至新的Eppendorf管中。加入等體積酚∶氯仿(1∶1)，充分混合，12000rpm離心5min，取上清。加入1/10體積3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和兩倍體積預冷的無水乙醇，-20℃放置30min。
離心棄上清，冰預冷的70％乙醇洗沉淀兩次，充分吹干。加入20-50μl TE(pH8.0)，溶解pUCm-F1及pUCm-F2質粒。
a.電泳法鑒定將提取的轉化菌落載體pUCm-F1及pUCm-F2質粒，通過電泳確定質粒的大小，提取的質粒大于原始的pUCm-T質粒，符合克隆有目的基因的候選質粒比對照質粒增大的預期設想，見圖5。
b.酶切驗證用限制性內切酶NcoI和EcoRI對pUCm-F1及pUCm-F2質粒進行酶切，驗證目的基因O-A、A-O是否已經在pUCm-T載體中得到克隆，酶切產物進行電泳，檢測切出片段在204bp的為目的基因(即O-A、A-O雙價多肽疫苗基因)，見圖6。
c.測序法鑒定質粒將含有轉化質粒pUCm-F1及pUCm-F2的菌株DH5α用甘油管保存，交上海申友測序公司測序，測序引物為pUCm-T質粒上的T7啟動子區(qū)的引物。測序結果表明，目的基因O-A及A-O兩段基因片斷已正確插入載體pUCm-T中，兩段目的基因O-A及A-O核苷酸序列分別為SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 2，在DNAMAN中推測其氨基酸序列分別為SEQ ID NO 3及SEQ ID NO 4。鑒定結果表明，帶有目的基因的pUCm-F1(pUCm-F2)載體已導入到生產型原核表達宿主菌DH5α中。
(4)口蹄疫雙價多肽疫苗基因原核表達載體的構建經過測序、酶切及PCR驗證，以O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)、A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)兩種連接方式分別得到雙價多肽疫苗基因片段O-A、A-O，已經克隆進載體pUCm-T中，分別得到含有多肽疫苗基因片段O-A的克隆載體pUCm-F1及含有多肽疫苗基因片段A-O的pUCm-F2。用限制性內切酶NcoI和EcoRI從克隆載體pUCm-F1(pUCm-F2)上切出FMDV雙價基因O-A(A-O)約200bp的片段，用T4DNA連接酶，與經過同樣酶切質粒pET28a(+)所得的約5200bp的線性片段進行連接，得到含有雙價基因O-A的原核表達載體pET-28fmv1及含有雙價基因A-O的原核表達載體pET-28fmv2，轉化于感受態(tài)大腸桿菌BL21，見圖7。
(5)口蹄疫雙價多肽疫苗基因表達的蛋白檢測多肽基因的誘導表達和包涵體制備方法按pET技術說明書(Novagen公司)進行用質粒pET28fmv1(pET28fmv2)轉化大腸桿菌BL21，用IPTG進行誘導表達，收集菌體，分離并純化蛋白，用SDS-PAGE電泳，考馬斯亮蘭R-250染色，鑒定表達產物的分子量和表達水平，結果表明，表達產物以包涵體的形式存在于細胞內，誘導3小時達到表達量的最高峰，重組蛋白表達水平占菌體總蛋白的20％左右。Westernblotting分析表明，該含有雙價疫苗基因O-A及A-O基因表達的純化蛋白能與FMDV O型及A型陽性血清發(fā)生反應，說明含有雙價疫苗基因O-A及A-O基因的表達產物具有較好的免疫原活性。實施例2.FMDV雙價疫苗基因與GFP基因的原核表達載體的構建1.GFP基因的獲得及克隆GFP基因以一種融合蛋白的形式表達，可作為安全有效的報告基因用于原核生物的遺傳轉化，含有GFP表達盒的轉化材料，能在藍光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，便于檢測。
根據GenBank號#U55762上GFP的核苷酸序列，以質粒pEGFP-N1(CLONTECH Laboratories Inc.#6085-1)為模板DNA，設計如下一對引物引物55’GCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 3’EcoRI引物65’CGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC 3’SalI采用小量堿法提取質粒pEGFP-N1，作為模板，用引物5和6進行擴增。PCR程序為95℃預變性5分鐘；然后94℃變性1分鐘，65℃復性1分鐘，72℃延伸3分鐘，循環(huán)25次。反應結束后取10μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
電泳回收PCR產物約750bp的片段，用T4DNALigase與pUCm-T載體連接，得到載體pUCm-gfp。
將克隆載體pUCm-gfp轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，用藍白斑篩選克隆載體，采用小量堿法提取質粒pUCm-gfp，電泳進行質粒DNA檢測，同時用PCR擴增進行驗證、限制性內切酶EcoRI/SalI雙酶切驗證、以及上海開瑞測序公司測序驗證，均證明目的基因GFP已插入到載體pUCm-T中。
2.FMDV雙價疫苗與GFP融合基因的構建及克隆采用小量堿法提取質粒pUCm-F1(pUCm-F2)，用NcoI/EcoRI雙酶切，電泳檢測并用回收試劑盒回收純化所得的約200bp的片段；提取質粒pUCm-gfp，用EcoRI/SalI雙酶切，電泳檢測并用回收試劑盒回收純化約750bp片段；提取質粒pUCm-T，用NcoI/SalI雙酶切，回收純化線性片段，約2000bp。將以上所得的約200bp、750bp及約2000bp的三個片段，用T4連接酶進行連接，得到含有雙價基因O-A及GFP基因的克隆載體pUCm-FM1及含有雙價基因A-O的克隆載體pUCm-FM2。用此載體轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。用藍白斑篩選克隆載體，采用小量堿法提取質粒pUCm-FM1(pUCm-FM2)，電泳進行質粒DNA檢測，同時用PCR擴增進行驗證、雙酶切驗證、以及測序公司測序驗證，序列為SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6.經檢測證明目的基因FMDV雙價疫苗基因O-A及A-O與GFP融合基因已插入到載體pUCm-T中。
3.口蹄疫雙價多肽疫苗與GFP融合基因的原核表達載體的構建采用小量堿法提取質粒pUCm-F1(pUCm-F2)，用NcoI/EcoRI雙酶切，電泳檢測并用回收試劑盒回收純化所得的約200bp的片段；提取質粒pUCm-gfp，用EcoRI/SalI雙酶切，電泳檢測并用回收試劑盒回收純化約750bp片段；提取質粒pET28a(+)，用NcoI/SalI雙酶切，回收純化線性片段，約5200bp。將以上所得約200bp、750bp及約5200bp的三個片段，用T4連接酶進行連接，得到含有雙價疫苗基因O-A與GFP融合基因的原核表達載體pET-FM1及含有雙價疫苗基因A-O與GFP融合基因的原核表達載體pET-FM2。將表達載體分別轉化于感受態(tài)大腸桿菌BL21，進行SDS-PAGE蛋白檢測。含有原核表達載體pET-FM1及pET-FM2的克隆菌BL21，既能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長，又能在藍光下激發(fā)出綠色熒光。說明載體pET-FM1及pET-FM2含有雙價疫苗基因O-A與GFP融合基因及雙價疫苗基因A-O與GFP融合基因，見圖8。實施例3.原核表達產物免疫原性的檢測首先將構建好的雙價多肽和GFP的融合基因誘導表達并進行蛋白純化(方法按Novagen公司pET-28a(+)技術說明書進行)，然后檢測表達產物的免疫原性。
1.純化蛋白將含有原核表達載體pET-FM1及pET-FM2的克隆菌BL21細菌培養(yǎng)液在4℃、6500g條件下離心15min，以收集菌體，去上清。用原培養(yǎng)液1/10體積的1XIB緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.5，10mmol/L EDTA，1％TritonX-100)重懸沉淀。溶菌酶加超聲裂解加入溶菌酶至終濃度100μg/mL，30℃放置15min。攪拌后將樣品緩沖液置于冰浴中，利用超聲儀(國產新芝牌)，200-300W功率，按1秒鐘超聲，3秒種間隔的方式進行60-90次。再加蛋白酶抑制劑(PSMF)。在4℃下，10000g離心10min。去上清，用原培養(yǎng)液1/10體積的1XIB緩沖液重懸沉淀。上述步驟重復2次。然后，將懸液移入已知重的離心管中。在4℃ 10000g離心10min。徹底去上清。稱重，計算產量。
2.SDS-PAGE電泳SDS-PAGE電泳檢測對含有原核表達載體pET-FM1及pET-FM2的克隆菌BL21的蛋白表達產物按常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳，分離膠濃度8％，考馬斯亮蘭R-250染色，甲醇-乙酸脫色。
結果表明，含有原核表達載體pET-FM1及pET-FM2的克隆菌BL21的純化蛋白大小大于30KD，即大于GFP蛋白的大小，確認是目的蛋白。
3.Western blotting分析溶液的配制電轉移緩沖液含39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris·HCL(pH6.8)，037％SDS，20％甲醇。
配制1000mL稱取甘氨酸2.9g，Tris堿5.8g，SDS0.37g，溶解于750mL重蒸水后，加入200mL甲醇，定容至1000mL。
洗液溶液150mmol/L NaCL，50mmol/L Tris·HCL pH7.5；封閉液10mL PBST+0.3g BSA；0.5％氨基黑10B染液稱取氨基黑10B 0.5g，加入甲醇45mL，冰乙醇10mL，重蒸水45mL；氨基黑漂洗液45mL 95％的乙醇，5mL冰乙酸，50mL無離子水；底物溶液(30mL)30mL PBST中溶解15mg的DAB(二氨基聯(lián)苯胺)和9mg CoCL2，再加入10μL 30％H2O2。
電轉移剪6張與上述電泳凝膠大小一致的濾紙及一張NC膜，并用轉移緩沖液浸泡3-5min。依次將海綿、濾紙3張、凝膠、NC膜、濾紙3張、海綿放好，然后用篩孔板固定好，插入電轉移槽中，加入轉移緩沖液，確定凝膠在陰極，NC膜在陽極方向。接通電源，電壓為50-100V，4℃下電泳2-3h。電轉移完畢，取出NC膜，用鉛筆或剪去一角以標記膜的方向。切下標準分子量Marker，置氨基黑染液浸染5min，取出后用漂洗液脫色，直至藍色背景脫盡。其余NC膜用PBS沖洗，加10mL封閉液浸泡，室溫震蕩1-3h，以封閉未吸附蛋白質的位點。
免疫學檢測封閉結束后，將轉化含有雙價疫苗基因O-A及A-O與GFP融合基因表達的融合蛋白的NC膜用PBS漂洗液漂洗4-5次，每次5min。將NC膜轉至一塑料袋內，分別加入PBST1∶800稀釋的FMDO型及A型(是O還是A型，具體一點)陽性血清10mL(0.1mL/cm2)，封口。37℃輕微震蕩結合1.5h，用PBST沖洗4-5次，每次在搖床緩慢搖動。然后加入1∶800稀釋的兔抗豬IgG(二抗)，室溫下輕搖孵育1h，取出用PBST沖洗3-4次，每次10min。以除去未結合的二抗。
將NC膜轉入到底物溶液，室溫避光輕搖5-10min，觀察顯色情況，等出現(xiàn)條帶時，立即轉入PBST緩沖液終止反應。室溫保存，照相。
4.結果經Western blotting分析，含有雙價疫苗基因O-A及A-O與GFP融合基因在原核表達載體pET-FM1及pET-FM2中表達的純化蛋白，能被O型及A型口蹄疫陽性血清所識別，證明含有雙價疫苗基因O-A及A-O與GFP融合基因的表達產物具有免疫學活性。
SEQ ID NO 1的信息序列特征(A)(長度)204個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)(拓撲結構)線性(1)分子類型cDNA(2)序列描述SEQ ID NO 1(3)gtg acc aaa gtg aga ggc gat ctg cag gtg ctg gcg cag aaa gcg gca cgc tct ctg ccg aga cat aaa cagaag att gtg gca cca ggc aaa cgc ctg ctg aac gcg ggc cgt cgc ggc gat ctg ggc tct ctg gcg gcg cgtgtg gcg cag ctg ccg gcg cgc cat aaa cag cgt att att gcg ccg gcg aaa cag ctg ctgSEQ ID NO 2的信息序列特征(A)(長度)204個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)(拓撲結構)線性序列描述SEQ ID NO 2aac gcg ggc cgt cgc ggc gat ctg ggc tct ctg gcg gcg cgt gtg gcg cag ctg ccg gcg cgccat aaa cag cgt att att gcg ccg gcg aaa cag ctg ctg gtg acc aaa gtg aga ggc gat ctg caggtg ctg gcg cag aaa gcg gca cgc tct ctg ccg aga cat aaa cag aag att gtg gca cca ggcaaa cgc ctg ctg(4)SEQ ID NO 3的信息序列特征(A)(長度)68個氨基酸(B)類型多肽(C)鏈性單鏈(D)(拓撲結構)線性序列描述SEQ ID NO 31 V T K V R G D L Q V L A Q K A A R S L P21R H K Q K I V A P G K R L L N A G R R GD L G S L A A R V A Q L P A R H K Q R I61 I A P A K Q L LSEQ ID NO 4的信息序列特征
(A)(長度)68個氨基酸(B)類型多肽(C)鏈性單鏈(D)(拓撲結構)線性序列描述SEQ ID NO 41 N A G R R G D L G S L A A R V A Q L P A21R H K Q R I I A P A K Q L L V T K V R GD L Q V L A Q K A A R S L P R H K Q K I61V A P G K R L LSEQ ID NO 5的信息序列特征(A)(長度)924個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)(拓撲結構)線性序列描述SEQ ID NO 51 GTGACCAAAG TGAGAGGCGA TCTGCAGGTG CTGGCGCAGA AAGCGGCACG CTCTCTGCCG61 AGACATAAAC AGAAGATTGT GGCACCAGGC AAACGCCTGC TGAACGCGGG CCGTCGCGGC121GATCTGGGCT CTCTGGCGGC GCGTGTGGCG CAGCTGCCGG CGCGCCATAA ACAGCGTATT181ATTGCGCCGG CGAAACAGCT GCTGATGGTG AGCAAGGGCG AGGAGCTGTT CACCGGGGTG241GTGCCCATCC TGGTCGAGCT GGACGGCGAC GTAAACGGCC ACAAGTTCAG CGTGTCCGGC301GAGGGCGAGG GCGATGCCAC CTACGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCATCTG CACCACCGGC361AAGCTGCCCG TGCCCTGGCC CACCCTCGTG ACCACCCTGA CCTACGGCGT GCAGTGCTTC421AGCCGCTACC CCGACCACAT GAAGCAGCAC GACTTCTTCA AGTCCGCCAT GCCCGAAGGC481TACGTCCAGG AGCGCACCAT CTTCTTCAAG GACGACGGCA ACTACAAGAC CCGCGCCGAG541GTGAAGTTCG AGGGCGACAC CCTGGTGAAC CGCATCGAGC TGAAGGGCAT CGACTTCAAG601GAGGACGGCA ACATCCTGGG GCACAAGCTG GAGTACAACT ACAACAGCCA CAACGTCTAT661ATCATGGCCG ACAAGCAGAA GAACGGCATC AAGGTGAACT TCAAGATCCG CCACAACATC721GAGGACGGCA GCGTGCAGCT CGCCGACCAC TACCAGCAGA ACACCCCCAT CGGCGACGGC781CCCGTGCTGC TGCCCGACAA CCACTACCTG AGCACCCAGT CCGCCCTGAG CAAAGACCCC841AACGAGAAGC GCGATCACAT GGTCCTGCTG GAGTTCGTGA CCGCCGCCGG GATCACTCTC901GGCATGGACG AGCTGTACAA GTAA(斜體部分為O-A型FMD雙價疫苗基因正體部分為GFP基因)SEQ ID NO 6的信息序列特征(A)(長度)924個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)(拓撲結構)線性序列描述SEQ ID NO 61AACGCGGGCC GTCGCGGCGA TCTGGGCTCT CTGGCGGCGC GTGTGGCGCAGCTGCCGGCG61 CGCCATAAAC AGCGTATTAT TGCGCCGGCG AAACAGCTGC TGGTGACCAAAGTGAGAGGC121GATCTGCAGG TGCTGGCGCA GAAAGCGGCA CGCTCTCTGC CGAGACATAAACAGAAGATT181GTGGCACCAG GCAAACGCCT GCTGATGGTG AGCAAGGGCG AGGAGCTGTTCACCGGGGTG241GTGCCCATCC TGGTCGAGCT GGACGGCGAC GTAAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGTCCGGC301GAGGGCGAGG GCGATGCCAC CTACGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCATCTGCACCACCGGC361AAGCTGCCCG TGCCCTGGCC CACCCTCGTG ACCACCCTGA CCTACGGCGTGCAGTGCTTC421AGCCGCTACC CCGACCACAT GAAGCAGCAC GACTTCTTCA AGTCCGCCATGCCCGAAGGC481TACGTCCAGG AGCGCACCAT CTTCTTCAAG GACGACGGCA ACTACAAGACCCGCGCCGAG541GTGAAGTTCG AGGGCGACAC CCTGGTGAAC CGCATCGAGC TGAAGGGCATCGACTTCAAG601GAGGACGGCA ACATCCTGGG GCACAAGCTG GAGTACAACT ACAACAGCCACAACGTCTAT661ATCATGGCCG ACAAGCAGAA GAACGGCATC AAGGTGAACT TCAAGATCCGCCACAACATC721GAGGACGGCA GCGTGCAGCT CGCCGACCAC TACCAGCAGA ACACCCCCATCGGCGACGGC781CCCGTGCTGC TGCCCGACAA CCACTACCTG AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCAAAGACCCC841AACGAGAAGC GCGATCACAT GGTCCTGCTG GAGTTCGTGA CCGCCGCCGGGATCACTCTC901GGCATGGACG AGCTGTACAA GTAA(斜體部分為A-O型FMD雙價疫苗基因，正體部分為GFP基因)
權利要求
1.編碼一種口蹄疫雙價疫苗的核苷酸序列，其特征在于，該段核苷酸序列由兩部分串聯(lián)構成一部分是編碼口蹄疫A型病毒的第140-160氨基酸和200-213氨基酸的核苷酸序列，即編碼A型病毒的20肽、14肽的核苷酸序列相串聯(lián)起來核苷酸序列；另一部分是編碼O型病毒的第140-160氨基酸和200-213氨基酸的核苷酸序列，即編碼O型病毒的20肽、14肽的核苷酸序列相串聯(lián)起來核苷酸序列；這兩部分核苷酸序列再串聯(lián)成為A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)或O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)的串聯(lián)核苷酸序列。
2.一段如權利要求1所述的編碼口蹄疫雙價疫苗的核苷酸序列，其特征在于，它具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
3.一段如權利要求1所述的編碼口蹄疫雙價多肽疫苗的核苷酸序列編碼的多肽，其特征在于該多肽具有SEQ ID NO3或SEQID NO4所示的氨基酸序列。
4.一種構建A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)或O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)的核苷酸序列相串聯(lián)序列的方法，其特征在于，采用多個片段拼接的方法，將編碼A型病毒的20肽、14肽的核苷酸序列與編碼O型病毒的第140-160氨基酸和200-213氨基酸的核苷酸序列共同串聯(lián)起來。
5.一種包含權利要求1-4任意一項所述的核苷酸序列的原核表達載體。
6.一種如權利要求5所述的原核表達載體，其特征在于，該原核表達載體包含A62(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)或O58(20肽-14肽)-A62(20肽-14肽)的核苷酸串聯(lián)序列；或者包含該核苷酸串聯(lián)序列與報告基因—綠色熒光蛋白(Greenfluorescence protein，GFP)基因的串聯(lián)序列。
7.一種如權利要求5或6所述的原核表達載體，其特征在于，該載體為pET28fmv1或pET28fmv2或pET-FM1或pET-FM2。
8.一種利用權利要求5-7的任意一項所述的含有口蹄疫雙價疫苗的核苷酸序列的原核表達載體生產口蹄疫雙價疫苗的方法，其特征在于，將權利要求5-7任意一項所述的原核表達載體轉化到工程菌中，進行誘導表達，然后提取、純化表達的重組蛋白。
9.一種權利要求1所述的口蹄疫雙價多肽疫苗的核苷酸序列編碼多肽的用途，其特征在于，該多肽可作為疫苗預防O型及A型兩種口蹄疫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種合成的A型及O型口蹄疫雙價多肽疫苗的基因序列及合成方法，合成的基因序列為SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的序列，以及根據這兩個序列分別可推導出其編碼的氨基酸序列SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的序列。將該兩段基因序列分別與綠色熒光蛋白基因串聯(lián)，使之成為雙價多肽疫苗融合基因。將該兩段雙價多肽疫苗融合基因分別構建到原核表達載體中，并使該兩段融合基因表達為兩種雙價多肽疫苗蛋白，該兩種蛋白的免疫原性測定表明，合成的兩段多肽疫苗基因具有較好的免疫原活性。如牲畜經免疫注射后，可預防A型及O型兩種口蹄疫，而且該兩段雙價多肽疫苗基因可以用于制備檢測A型及O型兩種口蹄疫的抗原。
文檔編號C12N15/63GK1468958SQ0310058
公開日2004年1月21日 申請日期2003年1月20日 優(yōu)先權日2003年1月20日
發(fā)明者周長生, 陶玲, 張勇, 陳正華 申請人:甘肅亞盛鹽化工業(yè)集團有限責任公司