專利名稱：一種抗血液腫瘤的反義vegf基因序列及其重組真核表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸反義技術(shù)，具體地說，涉及一種含反向序列的444堿基的VEGF121基因片段重組真核表達(dá)載體的制備及體內(nèi)外的應(yīng)用。
本發(fā)明之目的是要尋找一種有效的基因治療方法下調(diào)白血病細(xì)胞內(nèi)源性VEGF的分泌，從而達(dá)到抑制血管新生和降低對化療藥物的耐受性，促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡，以克服當(dāng)前白血病臨床治療中存在毒副作用大，耐藥性強(qiáng)，緩解率低和復(fù)發(fā)率高等缺點。具體地說，本發(fā)明提供了一種能在mRNA水平即和VEGF基因互補(bǔ)，阻斷其蛋白翻譯，從而下調(diào)白血病細(xì)胞內(nèi)源性VEGF分泌的反義VEGF基因片段，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體作為基因治療組合物。
本發(fā)明選用了反義VEGF基因片段的序列(SEQ ID NO.1)。本發(fā)明根據(jù)已知序列，設(shè)計了引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物5’GGG CTC GAG TCA CCG CCTCGG CTT GTA AC 3’(SEQ ID NO.2)；下游引物5’GGG GGA TCC ATG AACTTT CTG CTG TCT TG 3’(SEQ ID NO.3)。擴(kuò)增后獲得一444bp的基因片段。將該基因片段籍Xho I和BamH I位點克隆到pIRES2載體(購自Clontech公司)，獲得的重組載體質(zhì)粒經(jīng)酶切檢測和雙脫氧法DNA序列測定確定了方向性和完整性。測序鑒定后，按QIAGEN質(zhì)粒純化試劑盒操作說明，純化重組的pIRES2-反義VEGF載體(

圖1)和pIRES2空載體以備轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞系。進(jìn)一步按照Lipofactamine 2000試劑的操作說明，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染上述兩個載體到K562細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞甲基纖維素半固體培養(yǎng)，G418篩選兩周后挑選陽性克隆，96-孔板培養(yǎng)，逐級擴(kuò)增。擴(kuò)增的轉(zhuǎn)染攜帶反義VEGF的重組質(zhì)粒和空載體對照質(zhì)粒的K562細(xì)胞通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測以及對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測插入的反義片段，并進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)及體外的活性檢測。
本發(fā)明經(jīng)過上述過程克隆反義VEGF基因片段，構(gòu)建重組的pIRES2載體，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，G418篩選并擴(kuò)增陽性克隆，采用RT-PCR，ELISA和Western blot方法證明目的基因片段在K562細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且從mRNA水平和蛋白水平下調(diào)了內(nèi)源性的VEGF的表達(dá)，獲得了低水平表達(dá)VEGF的K562細(xì)胞株，并在體外細(xì)胞培養(yǎng)水平和體內(nèi)裸鼠移植瘤水平進(jìn)行了多參數(shù)的研究。實驗證明(1)表達(dá)反義VEGF的K562細(xì)胞的培養(yǎng)上清可顯著抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；(2)表達(dá)反義VEGF的K562細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下增殖被抑制，細(xì)胞凋亡水平增高；(3)裸鼠移植瘤實驗觀察到實驗組移植瘤的發(fā)生率低，生長速度明顯緩慢，移植瘤中新生血管的密度明顯降低，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多。結(jié)果證實pIRES2介導(dǎo)的反義VEGF基因具有抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖和轉(zhuǎn)移，以及白血病細(xì)胞自身的增殖，促進(jìn)其凋亡，在體內(nèi)抑制腫瘤生長和新生血管形成的作用。
以下列舉部分實施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不限制本發(fā)明。實施例1K562陽性克隆細(xì)胞表達(dá)反義VEGF效果測定和內(nèi)源性VEGF在mRNA水平及蛋白水平表達(dá)的分析分別將K562-反義VEGF、K562-空載體細(xì)胞以1.5×106/mL接種于6孔板，在無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，離心沉淀每孔細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清-20貯存，以備后用。分別提取K562-反義VEGF、K562-空載體細(xì)胞的基因組DNA和細(xì)胞總RNA，用PCR和RT-PCR方法外源基因的整和和內(nèi)源性VEGF的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果在K562-反義VEGF細(xì)胞中檢測到目的條帶，而K562-空載體細(xì)胞未見特異條帶，說明重組載體攜帶的反義基因片段已成功地整合到K562細(xì)胞基因組中。RT-PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)K562-反義VEGF細(xì)胞的內(nèi)源性VEGF的mRNA水平相比于K562-空載體明顯下降，可能是反義VEGF基因片段在RNA水平特異性地和VEGF基因序列互補(bǔ)，引起RNA的降解。
ELISA和western blot檢測K562-反義VEGF細(xì)胞和K562-空載體細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF蛋白分泌水平，兩者結(jié)果一致，均發(fā)現(xiàn)K562-反義VEGF細(xì)胞的內(nèi)源性VEGF蛋白分泌水平明顯低于K562-空載體細(xì)胞，說明K562細(xì)胞表達(dá)反義VEGF能夠有效的阻斷VEGF蛋白的翻譯過程，下調(diào)內(nèi)源性VEGF蛋白分泌水平(圖2)。實施例2K562陽性克隆細(xì)胞的培養(yǎng)上清對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖、遷移的影響臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以5×103/mL接種于96孔板，以含8％胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)為50％的K562-反義VEGF細(xì)胞或K562-空載體細(xì)胞培養(yǎng)上清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)2天后MTT法計數(shù)每孔加入100μL MTT，孵育4小時后，每孔加入10μLDMSO終止反應(yīng)，570nm波長下測定吸光度值(圖3)。500μL K562-反義VEGF細(xì)胞或K562-空載體細(xì)胞培養(yǎng)上清加入穿孔板的下層，105臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞重新懸浮于100μL M199培養(yǎng)液，孵育4小時后，流式計數(shù)遷徙到穿孔板下層的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明K562-反義VEGF細(xì)胞的培養(yǎng)上清促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖和遷徙作用明顯弱于K562-空載體細(xì)胞培養(yǎng)上清(圖4)。實施例3K562陽性克隆細(xì)胞體外自身的增殖和凋亡K562-反義VEGF細(xì)胞或K562-空載體細(xì)胞以1×104/mL接種于96孔板，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，從接種第一天開始每24小時各取4孔直至培養(yǎng)到72小時，MTT法測定細(xì)胞的生長曲線。或者K562-反義VEGF細(xì)胞或K562-空載體細(xì)胞以1×105/mL接種于6孔板，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24小時個取3孔，胎盤藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞直至72小時。結(jié)果表明表達(dá)反義VEGF的K562細(xì)胞在體外自身增殖能力低于轉(zhuǎn)染空載體的K562對照細(xì)胞(圖5A)。
K562-反義VEGF細(xì)胞或K562-空載體細(xì)胞以1×105/mL接種于6孔板，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時，離心沉淀細(xì)胞，標(biāo)記annexinV，流式檢測annexinV+的凋亡細(xì)胞。結(jié)果表明表達(dá)反義VEGF的K562細(xì)胞體外無血清培養(yǎng)的凋亡水平高于轉(zhuǎn)染空載體的K562對照細(xì)胞(圖5B)。實施例4K562陽性克隆細(xì)胞在體內(nèi)的生長購買雌性，6-8周齡的胸腺免疫缺陷小鼠，無病原菌條件下飼養(yǎng)。實驗分2組，每組5只。裸鼠以4Gy137Cs的劑量進(jìn)行全身照射，在裸鼠右側(cè)前肢皮下分別接種1.5×107/200μL的K562-反義VEGF細(xì)胞或K562-空載體細(xì)胞。每周兩次觀察裸鼠腫瘤的生長情況，并用游標(biāo)卡尺測量，按照橢圓體積公式計算腫瘤體積體積＝π/6×長徑×短徑×短徑。2周或3周后處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤，固定腫瘤組織，做免疫組化染色CD31標(biāo)記瘤組織的微血管密度和TUN-EL檢測瘤組織細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果表明接種K562-反義VEGF細(xì)胞移植瘤生長速度明顯慢于接種K562-空載體細(xì)胞移植瘤(圖6)，與對照組相比，瘤組織微血管密度低，凋亡細(xì)胞數(shù)多。
圖1重組pIRES2-反義VEGF載體的構(gòu)建圖2K562-反義VEGF細(xì)胞內(nèi)源性VEGF在RNA和蛋白水平的下調(diào)圖3K562-反義VEGF細(xì)胞培養(yǎng)上清對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖的作用圖4K562-反義VEGF細(xì)胞培養(yǎng)上清對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外遷徙的作用圖5K562-反義VEGF細(xì)胞體外增殖和凋亡圖6裸鼠K562-反義VEGF細(xì)胞移植瘤平均生長曲線(SEQ ID NO.1)基因序列CTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCACATTTTTCTTGTCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAGGAAGCTCATCTCTCCTATGTGCTGGCCGTGGTGAGGTTTGATCCGCATAATCTGCATGGTGATGTTGGACTCCTCAGTGGGCACACACTCCAGGCCCTCGTCATTGCAGCAGCCCCCGCATCGCATCAGGGGCACACAGGATGGCTTGAAGATGTACTCGATCTCATCAGGGTACTCCTGGAAGATGTCCACCAGGGTCTCGATTGGATGGCAGTAGCTGCGCTGATAGACATCCATGAACTTCACCACTTCGTGATGATTCTGCCCTCCTCCTTCTGCCATGGGTGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGGTGGAGGTAGAGCAGCAAGGCAAGGCTCCAATGCACCCAAGACAGCAGAAAGTTCATGGATCC
權(quán)利要求
1.一種抗血液腫瘤的反義VEGF基因序列，通過真核載體介導(dǎo)，具有靶向性抑制血液腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移作用，其特征在于所說的基因序列系由444個堿基組成(SEQ ID NO.1)。
2.一種用于表達(dá)反義VEGF基因序列的重組真核載體，其特征在于該載體含有權(quán)利1所述的DNA分子。
3.按照權(quán)利2所述的重組真核載體，其特征在于將所述的DNA分子以合適的酶切位點克隆至真核表達(dá)載體如pIRES2，獲得重組真核表達(dá)載體。
4.一種含反向序列的VEGF基因片段重組真核表達(dá)載體在制備基因治療制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗血液腫瘤的反義VEGF基因序列及其重組真核表達(dá)載體，提供了一種真核載體介導(dǎo)的抗白血病VEGF基因治療方法，具有靶向性抗血管新生，促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制白血病和其它血液腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移的作用。
文檔編號C12N15/63GK1431304SQ0310065
公開日2003年7月23日 申請日期2003年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月20日
發(fā)明者韓忠朝, 何睿 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所