專利名稱：一種用于臨床細(xì)菌檢測(cè)的生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物芯片，特別是涉及一種用于臨床細(xì)菌檢測(cè)的生物芯片。
背景技術(shù)：
盡管病毒性感染如艾滋病、肝炎和出血熱等有愈演愈烈之勢(shì)，細(xì)菌感染仍然是人類健康的一大威脅。例如結(jié)核病造成的死亡人數(shù)仍然位居世界第一位，并且有卷土重來(lái)的跡象；B族鏈球菌感染對(duì)于兩個(gè)月以內(nèi)的新生兒往往是致命的；食物來(lái)源的沙門氏菌、李斯特氏菌和大腸桿菌等是造成腹瀉的重要因素；大型全封閉建筑的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)往往孕育著嗜肺軍團(tuán)菌，一種軍團(tuán)病的病原菌；引起肺炎的幾種病原如肺炎克雷伯氏菌、肺炎雙球菌、肺炎衣原體、肺炎枝原體等往往對(duì)抵抗力低下、年老或年幼人群構(gòu)成極大威脅；銅綠假單胞菌感染是燒傷、戰(zhàn)傷患者中最常見的感染類型，而且比較難以控制；流感嗜血桿菌是上呼吸道感染中的常見菌，很難分離培養(yǎng)；金黃色葡萄球菌感染十分頑固，而且耐藥性十分普遍；腦膜炎球菌對(duì)抵抗力尚不十分完善的兒童威脅較大。細(xì)菌性感染的診斷和檢測(cè)對(duì)于臨床治療有著重要的指導(dǎo)意義。盡管有各種各樣廣譜抗生素，但所謂的廣譜也是有一定作用范圍的，不是對(duì)所有臨床細(xì)菌都有效；而且抗生素濫用問(wèn)題越來(lái)越突出，一味使用新型廣譜抗生素可能為以后的抗生素治療埋下隱患，當(dāng)再次使用該類抗生素時(shí)，其功效便不能再正常發(fā)揮。
一旦確立了是哪一種細(xì)菌的感染，就可以拿出針對(duì)性強(qiáng)的治療方案，細(xì)菌感染很快就會(huì)得到有效控制。因此感染性細(xì)菌種類的檢測(cè)具有十分重要的臨床指導(dǎo)意義。細(xì)菌的檢測(cè)方法多種多樣，定性檢測(cè)當(dāng)然是臨床檢驗(yàn)的首要目標(biāo)；定量檢測(cè)對(duì)于細(xì)菌數(shù)目和感染程度會(huì)有更深入的了解。有的方法既可以定性又可以定量，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA，enzyme-linkedimmunosorbent assay)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR，polymerase chain reaction)和核酸雜交等。每種細(xì)菌檢測(cè)手段都有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，不能依靠單一手段來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定性，任何一種檢測(cè)方法都是臨床確證眾多方法中的一個(gè)因素。經(jīng)典方法存在兩個(gè)較明顯的缺陷一是檢測(cè)時(shí)間普遍較長(zhǎng)，二是屬于一對(duì)一的檢測(cè)模式即一次試驗(yàn)只能檢測(cè)一種細(xì)菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種寡核苷酸組合探針微陣列生物芯片，可用于多種病原細(xì)菌的一次性檢測(cè)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，縮短經(jīng)典檢測(cè)所需的時(shí)間。
本發(fā)明目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所涉及生物芯片是以細(xì)菌16S核糖體核酸為擴(kuò)增靶標(biāo)而設(shè)計(jì)。16S核糖體核酸廣泛存在于細(xì)菌這類原核生物中，例如古細(xì)菌、真細(xì)菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體和放線菌中都存在16S核糖體核酸序列。核糖體核酸序列由保守序列和可變序列交替排列構(gòu)成，我們所設(shè)計(jì)的寡核苷酸組合探針就位于可變區(qū)內(nèi)。選擇了核糖體核酸可變區(qū)變化較大的特異性序列設(shè)計(jì)探針，針對(duì)每種細(xì)菌設(shè)計(jì)4條，分別對(duì)應(yīng)細(xì)菌核糖體核酸的4個(gè)特征性可變區(qū)。應(yīng)用相應(yīng)生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)出多種病原細(xì)菌的探針，然后將探針與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，根據(jù)返回信息初步確定探針可行性。探針確定后交由商業(yè)化公司進(jìn)行核酸序列合成。合成好的探針使用GSI Flexys高密度點(diǎn)樣儀進(jìn)行點(diǎn)樣。
具體步驟如下1 組合探針設(shè)計(jì)利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索多種細(xì)菌的核糖體核酸基因序列，細(xì)菌數(shù)目可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需要而定，例如50-100種。使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal-X等軟件進(jìn)行引物、探針設(shè)計(jì)和序列比較，常規(guī)合成所有涉及到的寡核苷酸序列。每種細(xì)菌設(shè)計(jì)4條探針。
本發(fā)明組合探針設(shè)計(jì)中以16SrRNA為擴(kuò)增靶標(biāo)，通用擴(kuò)增引物為S15’-AGA GTT TGA TC(A/C)TGG CTC AG-3’和S25’-CCG TCA ATT C(A/C)T TT(A/G)AGT TT-3’，擴(kuò)增片段大小為890-bp-930-bp。
2 點(diǎn)樣將合成好的探針用40-60％DMSO溶解，最終濃度為1-3g/l。將生物芯片置于GSI Flexys點(diǎn)樣儀中，設(shè)置點(diǎn)樣程序，布陣點(diǎn)樣，如附圖點(diǎn)樣形式。制成本發(fā)明的基因芯片。
本發(fā)明基因芯片的使用方法是，將各種臨床標(biāo)本包括血、腦脊液、腹水、痰、漱口液、胸積液等經(jīng)過(guò)處理后提取核酸，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法將熒光素(Cy5-dCTP)摻入到PCR產(chǎn)物中，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)熱變性加到生物芯片上進(jìn)行雜交反應(yīng)。反應(yīng)后的芯片使用芯片掃描儀掃描，根據(jù)雜交結(jié)果判定病原細(xì)菌的種類。
本發(fā)明生物芯片利用核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，結(jié)合核酸雜交的特異性，使檢測(cè)時(shí)間能夠在6小時(shí)內(nèi)完成；并且可以輕松容納成百上千個(gè)特異探針，一次試驗(yàn)可以檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)，無(wú)需重復(fù)，因此所需樣品量也只有一份。使用組合探針提高了檢測(cè)的特異性。細(xì)菌核糖體核酸盡管具有一定的種屬鑒別意義，但是由于其保守性，某些進(jìn)化上十分近源的種類其核糖體核酸十分相似。單獨(dú)采用一條探針區(qū)分這些近源細(xì)菌十分困難，依靠4條探針的組合來(lái)對(duì)應(yīng)一種細(xì)菌，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。這對(duì)于克服常規(guī)方法雜交所產(chǎn)生的交叉反應(yīng)和假陽(yáng)性結(jié)果具有十分重要的意義。
本發(fā)明實(shí)施例所涉及細(xì)菌都是在臨床上具有重要意義的致病菌。常規(guī)檢測(cè)手段費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且準(zhǔn)確程度不高，本發(fā)明生物芯片由于一次反應(yīng)就可以檢測(cè)出所涉及的細(xì)菌，無(wú)需重復(fù)和嘗試，因而在臨床檢驗(yàn)中具有很大的優(yōu)越性。另外，在我國(guó)存在有引起重要傳染病的病原，如在牧區(qū)引起人畜共患疾病的炭疽桿菌和布氏桿菌、暴發(fā)流行危險(xiǎn)呈逐年上升的鼠疫、每年都有發(fā)生的腸道流行病、細(xì)菌性食物中毒等。對(duì)于這些烈性病原體的診斷，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有簡(jiǎn)便快速的診斷試劑商品。本發(fā)明生物芯片同樣可以用于海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)等多項(xiàng)領(lǐng)域，因而具有巨大的市場(chǎng)前景。
恐怖分子利用烈性病原體作為生物恐怖手段制造的生物恐怖事件給國(guó)家和社會(huì)安全造成極大的威脅，生物安全和生物恐怖防御已成為今天各國(guó)政府和廣大人民普遍關(guān)注的國(guó)家與社會(huì)安全大事?？焖贆z測(cè)出生物恐怖事件中的烈性病原體對(duì)采取正確手段消除恐怖事件造成的危害至關(guān)重要，本發(fā)明生物芯片將有助于提高我們應(yīng)對(duì)突發(fā)生物事件的能力，而有效地預(yù)防和控制生物恐怖事件可平息人們的心理恐慌、防止造成社會(huì)動(dòng)蕩、保證社會(huì)安全，其產(chǎn)生的社會(huì)作用與影響十分巨大。除生物恐怖事件外，烈性傳染病的爆發(fā)流行，往往會(huì)使很多人感染、甚至奪去很多人的生命，也會(huì)造成人們巨大的心理恐慌及社會(huì)動(dòng)蕩，快速做出診斷、采取措施控制疾病流行同樣會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)大的社會(huì)作用與影響。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)具體表現(xiàn)為特異準(zhǔn)確由于本發(fā)明采用了組合探針，由多條探針指向一個(gè)細(xì)菌，因此大大增加了檢測(cè)特異性。
快速本發(fā)明生物芯片檢測(cè)包括樣品前處理、PCR擴(kuò)增和芯片雜交，總共耗時(shí)6小時(shí)左右，常規(guī)的細(xì)菌分離培養(yǎng)需要3天左右，而且臨床細(xì)菌分離成功率較低，更有甚者有些細(xì)菌分離培養(yǎng)需要半個(gè)月至一個(gè)月，如結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明可以縮短診斷時(shí)間。
靈敏本發(fā)明生物芯片結(jié)合了PCR擴(kuò)增技術(shù)，因此具有較高的靈敏度。
一對(duì)多檢測(cè)模式一次試驗(yàn)檢測(cè)目的標(biāo)本中的所有細(xì)菌，減少樣品量，同時(shí)減少了由于多次嘗試帶來(lái)的高成本和時(shí)間。雖然一次性成本相對(duì)稍高，但是如果考慮到是幾十種細(xì)菌的同時(shí)檢測(cè)，其相對(duì)成本仍然是非常低的。下面實(shí)驗(yàn)例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例1細(xì)菌純培養(yǎng)物的雜交按照相關(guān)文獻(xiàn)培養(yǎng)80種細(xì)菌。使用QIAGEN DNeasy Tissue Kit(Cat.No.69504)提取細(xì)菌染色體DNA。使用S1和S2引物擴(kuò)增相應(yīng)細(xì)菌染色體DNA，10mM Tris-HCl(pH 8.4)；50mM KCl；1.5mM MgCl2；gelatin 0.01％；TritonX-100 0.1％；Tween 20 0.01％；40μM of dATP，dTTP and dGTP，30μm ofdCTP(Promega)，10μM of Cy5-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech)，0.1μM of each primer，2 U of Taq polymerase(上海生工生物工程有限公司)，和15ng擴(kuò)增模板。PCR參數(shù)為預(yù)變性95℃，15min，然后是94℃，10s；63℃，10s；72℃，15s；29個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物使用Amicon Microcon-PCR colums(Millipore，USA)純化，最終洗脫體積為25μl。取熒光標(biāo)記并純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物10μl加入到90μl雜交液中形成雜交工作液，將芯片放入GSI GeneTACHybridization Station雜交儀中進(jìn)行雜交，在80℃加入探針，預(yù)變性10min，雜交溫度為45℃，雜交時(shí)間1小時(shí)。完畢后取出生物芯片，使用GSI GeneTAC1000生物芯片掃描儀掃描、分析和保存結(jié)果。利用細(xì)菌純培養(yǎng)物的雜交結(jié)果表明本發(fā)明生物芯片可以將大部分涉及細(xì)菌鑒定至種的位置。
實(shí)驗(yàn)例2敏感性試驗(yàn)用LB斜面轉(zhuǎn)接金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，37℃培養(yǎng)12小時(shí)。用接種環(huán)刮取一環(huán)到5ml 0.03mol/L PBS中，然后做10倍系列稀釋直至10-9。利用平板涂抹法對(duì)兩種細(xì)菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取各個(gè)稀釋度進(jìn)行芯片雜交實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)菌系列稀釋后芯片雜交靈敏度。取嗜肺軍團(tuán)菌染色體DNA 15ng/ml，1.5ng/ml，150pg/ml，15pg/ml，1.5pg/ml四個(gè)稀釋度分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Cy5熒光素標(biāo)記，然后用熒光素標(biāo)記物與芯片雜交，觀察染色體稀釋后雜交靈敏度。經(jīng)過(guò)平板計(jì)數(shù)，計(jì)算出菌液原始濃度。金黃色葡萄球菌為2.35×107CFU/ml(colony forming unit)，銅綠假單胞菌為2.0×107CFU/ml。對(duì)于兩種菌液來(lái)說(shuō)，生物芯片檢測(cè)靈敏度為235和200 CFU。而模擬血標(biāo)本靈敏度，150pg/ml染色體經(jīng)過(guò)PCR可以觀察到陽(yáng)性信號(hào)，而15pg/ml雖然PCR已經(jīng)觀察不到條帶，但生物芯片仍然可以檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，生物芯片比PCR-電泳法靈敏度高10倍。
實(shí)驗(yàn)例3特異性試驗(yàn)使用牛分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌和蟾分枝桿菌這幾個(gè)與結(jié)核分枝桿菌相近的菌種進(jìn)行芯片雜交，觀察與結(jié)核分枝桿菌交叉情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，與結(jié)核分枝桿菌近緣的牛分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌4條探針中的3條發(fā)生雜交，蟾分枝桿菌和鳥分枝桿菌只與2條探針發(fā)生雜交。也就是說(shuō)，組合探針在這里起到了關(guān)鍵性的鑒別作用，如果不使用組合探針，很難區(qū)分這么多種類相近的細(xì)菌。
實(shí)驗(yàn)例4實(shí)際應(yīng)用本發(fā)明生物芯片經(jīng)過(guò)了模擬血標(biāo)本和雙盲法測(cè)試，證明其具有相當(dāng)大的可靠性。將實(shí)驗(yàn)例2中系列稀釋的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌菌液20μl加入到180μl馬血中，形成系列濃度的模擬血標(biāo)本。按照QIAamp全血DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取DNA，并以此為模板進(jìn)行Cy5熒光素標(biāo)記，按照上述方法進(jìn)行芯片雜交，觀察模擬血標(biāo)本雜交靈敏度。模擬血標(biāo)本靈敏度分別為23500和2000CFU。
取3個(gè)未知樣品的染色體DNA，標(biāo)號(hào)為1，2和3。進(jìn)行1，2，3，1+2，1+3，2+3和1+2+3組合，其中組合順序和方式未知，由另外一人完成樣品組合。此8份樣品(含水)進(jìn)行模擬盲測(cè)，然后與組合方式對(duì)照，判斷多樣品檢測(cè)的可行性?；旌蠘?biāo)本盲測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品中如果存在一個(gè)以上的待測(cè)對(duì)象也可以同時(shí)檢測(cè)出來(lái)。兩種細(xì)菌混合能同時(shí)檢測(cè)出來(lái)，三種菌混合起來(lái)一般能同時(shí)檢測(cè)出其中占優(yōu)勢(shì)的兩種菌。如果實(shí)際感染中的幾種細(xì)菌濃度大致一致，則生物芯片可以同時(shí)將它們檢測(cè)出來(lái)。
實(shí)驗(yàn)例5某醫(yī)院送檢標(biāo)本兩份，懷疑有銅綠假單胞菌。經(jīng)過(guò)生物芯片雜交之后，發(fā)現(xiàn)一株菌與銅綠假單胞菌的4條探針發(fā)生雜交，而另一株菌則與傷寒沙門氏菌的4條探針發(fā)生雜交。因而分別判定為銅綠假單胞菌和傷寒沙門氏菌。細(xì)菌培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)前者產(chǎn)生綠色色素，而后者沒(méi)有，這與銅綠假單胞菌的特征相符合。然后用經(jīng)典細(xì)菌鑒定程序和核酸鑒定方法證明與生物芯片的判定相吻合。


附圖1是組合探針式生物芯片排列圖，其中實(shí)線框內(nèi)的點(diǎn)為陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、探針設(shè)計(jì)利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索80種細(xì)菌的核糖體核酸基因序列，使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal-X等軟件進(jìn)行引物、探針設(shè)計(jì)和序列比較，所有涉及到合成的寡核苷酸序列均由上海生工生物工程有限公司合成。16S rRNA通用擴(kuò)增引物為S15’-AGA GTT TGA TC(A/C) TGGCTC AG-3’和S25’-CCG TCA ATT C(A/C)T TT(A/G) AGT TT-3’，擴(kuò)增片段大小為890-bp-930-bp。80種細(xì)菌共計(jì)設(shè)計(jì)320條探針(見附表2)。每種細(xì)菌設(shè)計(jì)4條探針。
點(diǎn)樣將合成好的探針用適量50％DMSO溶解，最終濃度為2g/l。生物芯片置于GSI Flexys點(diǎn)樣儀中，設(shè)置點(diǎn)樣程序，布陣點(diǎn)樣，點(diǎn)成如附圖樣形式。其中80種細(xì)菌的點(diǎn)樣對(duì)應(yīng)關(guān)系如表1所示表1組合式寡核苷酸探針與附圖對(duì)應(yīng)關(guān)系

注A1至A4代表E.coli的1到4號(hào)探針，A5至A8代表Citrobacter koseri的1到4號(hào)探針，余類推。
附表280種細(xì)菌16S rRNA特異性探針








權(quán)利要求
1.一種生物芯片，其特征在于該芯片含有寡核苷酸組合探針。
2.如權(quán)利要求1所述的一種生物芯片，其特征在于該芯片組合探針設(shè)計(jì)中以16S rRNA為擴(kuò)增靶標(biāo)。
3.如權(quán)利要求2所述的一種生物芯片，其特征在于該芯片組合探針設(shè)計(jì)中通用擴(kuò)增引物為S15’-AGA GTT TGA TC(A/C)TGG CTC AG-3’和S25’-CCG TCA ATT C(A/C)T TT(A/G)AGT TT-3’，擴(kuò)增片段大小為890-bp-930-bp。
4.如權(quán)利要求3所述的一種生物芯片，其特征在于該芯片組合探針設(shè)計(jì)是利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索50-100種細(xì)菌的核糖體核酸基因序列，使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal-X軟件進(jìn)行引物、探針設(shè)計(jì)和序列比較，常規(guī)合成所有涉及到的寡核苷酸序列，每種細(xì)菌設(shè)計(jì)4條探針。
5.如權(quán)利要求4所述的一種生物芯片，其特征在于該芯片組合探針設(shè)計(jì)是利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索50-100種細(xì)菌的核糖體核酸基因序列，使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal-X等軟件進(jìn)行引物、探針設(shè)計(jì)和序列比較，常規(guī)合成所有涉及到的寡核苷酸序列，每種細(xì)菌設(shè)計(jì)4條探針；將合成的探針用40-60％DMSO溶解，最終濃度為1-3g/l，生物芯片置于GSI Flexys點(diǎn)樣儀中，設(shè)置點(diǎn)樣程序，點(diǎn)成布陣式。
6.如權(quán)利要求5所述的一種生物芯片，其特征在于該芯片組合探針設(shè)計(jì)是利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索80種細(xì)菌的核糖體核酸基因序列，使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal-X等軟件進(jìn)行引物、探針設(shè)計(jì)和序列比較，合成所有涉及到的寡核苷酸序列；16S rRNA通用擴(kuò)增引物為S15’-AGA GTT TGA TC(A/C)TGG CTC AG-3’和S25’-CCG TCA ATT C(A/C)T TT(A/G)AGT TT-3’，擴(kuò)增片段大小為890-bp-930-bp；80種細(xì)菌共計(jì)320條探針；點(diǎn)樣將合成好的探針用適量50％DMSO溶解，最終濃度為2g/l；將生物芯片置于GSI Flexys點(diǎn)樣儀中，設(shè)置點(diǎn)樣程序，點(diǎn)成布陣式。
7.如權(quán)利要求6所述的一種生物芯片，其特征在于該芯片組合探針?lè)謩e由說(shuō)明書附表2所述基因序列組成。
8.如權(quán)利要求7所述的一種基因芯片，其特征在于該芯片含有附表2所述320種探針當(dāng)中的任意組合。
9.如權(quán)利要求7所述的一種基因芯片，其特征在于該芯片含有附表2所述全部320種探針。
10.如權(quán)利要求1-9所述的任一權(quán)利要求，其特征在于該基因芯片用于細(xì)菌檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物芯片，其特征在于該芯片組合探針設(shè)計(jì)是利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索50－100種細(xì)菌的核糖體核酸基因序列，使用Primer Premiere，DNAStar，Clustal－X等軟件進(jìn)行引物、探針設(shè)計(jì)和序列比較，常規(guī)合成所有涉及到的寡核苷酸序列，每種細(xì)菌設(shè)計(jì)4條探針；將合成的探針用40－60％ DMSO溶解，最終濃度為1－3g/l，生物芯片置于GSI Flexys點(diǎn)樣儀中，設(shè)置點(diǎn)樣程序，點(diǎn)成布陣式。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)為特異準(zhǔn)確、快速、靈敏并體現(xiàn)了一對(duì)多檢測(cè)模式。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1519328SQ0310067
公開日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2003年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月21日
發(fā)明者翟俊輝, 楊瑞馥, 宋亞軍, 郭兆彪, 王津 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物