專利名稱：丙型肝炎病毒高變區(qū)1合成肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。尤其涉及一種含有丙型肝炎病毒高變區(qū)1合成肽的多肽或其藥物可接受的鹽，該多肽作為制備預(yù)防和/或治療丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用，以及含有該多肽的藥物組合物、疫苗、編碼該多肽的多核苷酸。
丙型肝炎易慢性化的主要原因是由于丙型肝炎病毒極高的變異率，在免疫選擇作用下，形成丙型肝炎病毒高變區(qū)1(HVR1區(qū))基因的高度變異，以逃避免疫監(jiān)視。報道表明，HVR1也是主要的中和抗原區(qū)段，含有重要的中和性抗原表位，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和性抗體。因此闡明HVR1的中和抗原表位及這些抗原表位的變異規(guī)律，有助于保護(hù)性多肽及基因疫苗研制，是疫苗研究的關(guān)鍵。本發(fā)明人經(jīng)過大量的研究，發(fā)現(xiàn)中國人HCV的變異并非完全隨機(jī)，具有一定的保守性，各位點某種氨基酸的出現(xiàn)有特定的概率，且氨基酸的突變多是在具有相似理化性質(zhì)的氨基酸之間，由此可見HCV的生存具有一定的生物學(xué)限制，既然高變區(qū)的變異具有一定的規(guī)律性的，本發(fā)明人提出了中國人II/III型HCV～HVR1區(qū)的保守位點是構(gòu)成抗原的基本框架。另外有研究表明對不同HVR1序列誘生的抗HCV～HVR1的多肽之間有很強(qiáng)的交叉反應(yīng)，也提示本區(qū)內(nèi)有保守的抗原表位。
目前，對于丙型肝炎病毒致病機(jī)制尚不清楚，還沒有確實有效的治療方法和疫苗以防止其進(jìn)一步傳播，現(xiàn)在臨床上常使用的干擾素的長期有效率僅為20％，研究和發(fā)展降低HCV感染率，減輕病毒復(fù)制量的HCV疫苗是迫切需要完成的工作。對于HCV患者來說，研制針對丙型肝炎病毒的治療藥物更為有意義。
優(yōu)選本發(fā)明為如SEQ ID NO.1所述的合成肽GQTYTSGA或其藥物可接受的鹽；或如SEQ ID NO.2所述的合成肽GQTYTSGG或其藥物可接受的鹽。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的多肽在制備預(yù)防和/或治療丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防和/或治療丙型肝炎的藥物組合物，其含有有效量的本發(fā)明的多肽和必要時藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明還提供一種疫苗組合物，其含有有效量的本發(fā)明所述的多肽和有效量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。
本發(fā)明還提供一種編碼含有本發(fā)明多肽的多核苷酸。
本發(fā)明人在研究中國人群丙型肝炎病毒II/III型高變區(qū)1序列變異規(guī)律的基礎(chǔ)上，通過計算機(jī)模建分析設(shè)計并合成了本發(fā)明的多肽，并對這些多肽進(jìn)行了與HCV患者血清的反應(yīng)性的研究，體外刺激HCV感染PBMC細(xì)胞因子分泌的研究，以及免疫小鼠體內(nèi)免疫原性及血清中細(xì)胞因子研究。
本發(fā)明提供的多肽或其藥物可接受的鹽，其含有一個或多個如下所示的氨基酸序列的合成肽GQTYTSGX，X為A或G。
在本發(fā)明的實施方案中，本發(fā)明的多肽可以含有一個或多個如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列GQTYTSGA(肽A)或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列GQTYTSGG(肽B)。在相鄰的序列之間任選有適當(dāng)?shù)慕宇^或沒有接頭。換句話說，本發(fā)明的多肽分子中如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列可以任選通過適當(dāng)?shù)慕宇^相互連接，形成同聚或異聚的多聚體。本發(fā)明的多肽還可以與本發(fā)明人同一申請日提交的另一申請所公開的含有合成肽GQTYTSG的多肽連接，形成異聚的多聚體。另外，本發(fā)明多肽還可以與其它的蛋白形成融合蛋白，如可以與牛血清白蛋白形成融合蛋白，以增強(qiáng)其免疫原性。
優(yōu)選本發(fā)明多肽為如SEQ ID NO.1所述的合成肽GQTYTSGA(肽A)或如SEQ ID NO.2所述的合成肽GQTYTSGG(肽B)。
根據(jù)計算機(jī)多肽HLA(人白細(xì)胞抗原)結(jié)合力分析及本發(fā)明的實施例2、3和4所示的結(jié)果，肽A和肽B表現(xiàn)出廣泛的交叉反應(yīng)性和強(qiáng)的誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力。這說明其中包含完整的抗原表位，另外，從本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)也可以看出，肽A和肽B結(jié)構(gòu)簡單，生物活性好，是很好的活性肽分子，并具有優(yōu)良的誘導(dǎo)內(nèi)源性γ-IFN因子及Th2類細(xì)胞因子的功能。
本發(fā)明的多肽可以單獨使用，也可以以藥物可接受的鹽形式使用。“藥物可接受的鹽”指適于與人或動物的組織接觸，而無過多的毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng)等的鹽。藥物可接受的鹽是本領(lǐng)域熟知的。這種鹽可以在本發(fā)明多肽的最終分離和純化的過程中制備，也可以將多肽與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)或無機(jī)酸或堿反應(yīng)單獨制備。代表性酸加成鹽包括但不限于乙酸鹽、二己酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、3-苯基丙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。能用于形成藥物可接受鹽的優(yōu)選的酸是鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、草酸、馬來酸、琥珀酸和檸檬酸。藥物可接受的堿加成鹽中的陽離子包括但不限于堿金屬或堿土金屬離子如鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和鋁等，以及非毒性季銨陽離子如銨、四甲基銨、四乙基銨、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。優(yōu)選的堿加成鹽包括磷酸鹽、tris和乙酸鹽。
如實施例2、3和4所示，本發(fā)明的多肽或其藥物可接受的鹽具有誘導(dǎo)細(xì)胞因子γ-IFN、IL-4、IL-10和抗體產(chǎn)生的作用。由于γ-IFN主要是Th1分泌的細(xì)胞因子，是人體免疫系統(tǒng)抵抗病毒感染的主要細(xì)胞因子之一，而針對HCV的細(xì)胞免疫反應(yīng)對于HCV的清除具有相當(dāng)重要的意義。因此，本發(fā)明同時提供了一種具有預(yù)防和/或治療丙型肝炎的作用的多肽。
本發(fā)明的多肽可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)固相合成方法合成。例如本發(fā)明多肽肽可以按Steward and Young(Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2ndEd.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成儀或PioneerTM肽合成儀按固相化學(xué)技術(shù)合成。也可以先合成多個片段，然后連在一起形成更大的片段。對于固相肽合成，在Steward，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，1963和J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1973中可以找到許多技術(shù)的介紹。一般，這些方法包括向成長的肽鏈上依次添加一個或多個氨基酸或適當(dāng)保護(hù)的氨基酸。一般，第一個氨基酸的氨基或羧基用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)，然后將保護(hù)的氨基酸連在惰性固相載體上，隨后在適于形成酰胺鍵的條件下加入相應(yīng)氨基或羧基被適當(dāng)保護(hù)的序列中的下一個氨基酸。然后從新加入的氨基酸殘基上除去保護(hù)基，再加入必要時適當(dāng)保護(hù)的下一個氨基酸，如此重復(fù)操作。當(dāng)所有氨基酸以正確的順序連接后，相繼或同時除去任何剩余的保護(hù)基和固相支持物，得到最終的多肽。通過簡單修改此一般程序，可能一次向成長鏈添加一個以上的氨基酸。
制備本發(fā)明的較短的多肽，例如肽A或肽B優(yōu)選的方法是固相肽合成，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使用413A自動合成儀(PE公司的產(chǎn)品)制備本發(fā)明的多肽。其中使用α氨基被酸或堿敏感性基團(tuán)保護(hù)的氨基酸。這種保護(hù)基應(yīng)該在肽鍵形成條件下穩(wěn)定，又容易除去而不破壞成長的肽鏈、不會引起其中的任何手性中心外消旋。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基有9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、芐氧羰基(Cbz)、2-氰基叔丁氧羰基等。9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)是合成本發(fā)明肽特別優(yōu)選的?？梢允褂梦於┙宦?lián)的方法，也可以使用基因表達(dá)的方式獲得。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的多肽作為制備預(yù)防和/或治療丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的實施例3和4中，可以看出在人PBMC培養(yǎng)上清和免疫小鼠血清中γ-IFN、白介素-4、白介素-10都有不同程度的提高，尤其是γ-IFN水平的升高是一個非常令人感興趣的現(xiàn)象，因為γ-IFN主要是Th1分泌的細(xì)胞因子，是人體免疫系統(tǒng)抵抗病毒感染的主要細(xì)胞因子之一，它通過誘導(dǎo)2-5A合成酶，進(jìn)而活化RNaseL，降解病毒RNA，從而抑制病毒蛋白的合成。根據(jù)本發(fā)明的實驗結(jié)果，本發(fā)明的多肽具有激活一定強(qiáng)度的細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，而針對HCV的細(xì)胞免疫反應(yīng)對于HCV的清除具有相當(dāng)重要的意義。雖然丙型肝炎的治療與預(yù)防是兩個不同的方面，在治療中發(fā)揮作用的細(xì)胞因子與抗體水平并不緊密相關(guān)。但本發(fā)明的實施例2和4中，同時也證明肽A和肽B也具有誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力。
本發(fā)明提供一種藥物組合物，其含有治療有效量的本發(fā)明多肽和必要時藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他制劑輔料?？梢愿鶕?jù)預(yù)防和/或治療目的，給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型，例如溶液劑、脂質(zhì)體包裹劑、微膠囊劑及其他緩釋制劑。載體或賦形劑的例子包括生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇及上述溶液的組合。可根據(jù)需要在組合物中添加輔助成份，例如與本發(fā)明多肽有協(xié)同作用的化合物；人血清白蛋白、低分子量肽、氨基酸和金屬陽離子等蛋白保護(hù)劑；等等。例如，本發(fā)明提供一種上述藥物組合物，其含有本發(fā)明的多肽和Al(OH)3，其中每毫升生理鹽水或中性磷酸鹽緩沖液(PBS)中含有如SEQ IDNO.1所示合成肽和/或SEQ ID NO.2所示合成肽約1.0-15mg(即以肽A或肽B為基準(zhǔn))，含有Al(OH)3約0.5-2mg。所述中性磷酸鹽緩沖液為本領(lǐng)域熟知的，優(yōu)選pH約7.2-7.4。上述試劑經(jīng)滅菌過濾后，約2ml/安培瓶，使用時采用肌肉注射方式。上述藥物組合物更優(yōu)選含有本發(fā)明的多肽和Al(OH)3，其中每毫升生理鹽水或中性磷酸鹽緩沖液(PBS)中含有如SEQ IDNO.1所示合成肽和/或SEQ ID NO.2所示合成肽約1.0-12mg/ml，Al(OH)3約1mg。當(dāng)然，藥物組合物也可以直接由有效量的本發(fā)明的多肽和生理鹽水構(gòu)成，使用時采用靜脈滴注方式。
本發(fā)明還提供一種丙型肝炎疫苗組合物，其含有有效量本發(fā)明的多肽和有效量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。在本發(fā)明的實施例4中，肽A和肽B在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)對應(yīng)抗體的產(chǎn)生，三組免疫小鼠血清學(xué)結(jié)果同陰性對照組進(jìn)行T檢驗，P＜0.05。為了進(jìn)一步提高本發(fā)明多肽的免疫原性，本發(fā)明多肽可以進(jìn)一步與其它蛋白形成融合肽。例如，可以與牛血清白蛋白形成的融合肽，以通過結(jié)合大的免疫原性強(qiáng)的分子，來提高目的多肽的免疫原性。
此外，本發(fā)明還涉及一種編碼含有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示合成肽的多肽的多核苷酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，可以根據(jù)不同氨基酸對應(yīng)的密碼子，確定編碼含有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示合成肽的多肽的多核苷酸，當(dāng)然，由于密碼子的簡并性，所述的多核苷酸可以有不同的形式，優(yōu)選根據(jù)不同生物密碼子的使用頻率，選擇相應(yīng)的密碼子。本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的DNA，DNA可以是雙鏈或是單鏈形式，單鏈DNA可以是編碼鏈或是非編碼鏈(反義鏈)。本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明肽A的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示；本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明肽B的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示。
合成肽的序列如下HCV包膜區(qū)(E2)383 389↑↑肽A GQTYTSGASEQ ID NO.1肽B GQTYTSGGSEQ ID NO.2合成肽產(chǎn)品經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)分析進(jìn)行純度鑒定，純度均大于95％，符合設(shè)計要求。
實施例2本發(fā)明合成肽同丙型肝炎患者血清的反應(yīng)性研究1.血清來源30份抗HCV抗體陽性血清，隨機(jī)從2000-2001年解放軍302醫(yī)院HCV感染住院的患者中選取，PCR檢測血清HCV RNA90％為陽性。對照血清取自解放軍總醫(yī)院輸血科健康獻(xiàn)血人員，化驗檢查各項指標(biāo)均正常。乙型肝炎(HBV)患者血清選自解放軍302醫(yī)院乙型肝炎住院患者，化驗檢查均呈乙型肝炎病毒表面抗原陽性。
2.方法本發(fā)明合成肽同患者血清反應(yīng)性的檢測采用間接ELISA分別用本發(fā)明合成肽肽A，肽B，和肽(A+B)各10ug，加于堿性包被液中(0.1M NaHCO3，35ml；0.1M Na2CO3，15ml；DDH2O，50ml)包被聚丙乙烯微孔條，4℃過夜。每種樣品作2個復(fù)孔。加120ulFCS-PBS 37℃封閉2小時。依次加入各組患者血清(1∶100稀釋，37℃孵育1小時)和羊抗人IgG(1∶1000，孵育同上)。最后每孔加入ELISA洗液A、B液(北京科衛(wèi)試劑廠產(chǎn)品)50ul，置暗處放5分鐘，于450nm波長下檢測光吸收度(A)。采用DG3022型酶聯(lián)免疫檢測儀(PE公司的產(chǎn)品)。
3.結(jié)果3.1本發(fā)明多肽結(jié)合HCV患者血清(30份)的陽性結(jié)果如下表1
其中肽A，肽B，和肽(A+B)的結(jié)合百分比分別達(dá)到50％、46.6％和56.6％。
此組同HBV患者血清及健康人血清結(jié)合試驗結(jié)果均為陰性。
3.2根據(jù)試驗結(jié)果作出表，如下
表2本發(fā)明肽A同實驗組HCV感染病人血清及陰性對照組正常人血清反應(yīng)結(jié)果比較
經(jīng)STATA軟件分別對兩組間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，卡方檢驗P＝0.00，＜0.01，兩組的陽性率差異有顯著性意義。也就是說，此組合成肽可以引起HCV感染病人血清反應(yīng)，與陰性對照組正常人血清無反應(yīng)。
表3本發(fā)明肽A同實驗組HCV感染病人血清及HBV感染病人血清反應(yīng)比較
分別對兩組間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，卡方檢驗P＝0.00，＜0.01，兩組的陽性率差異有顯著性意義。也就是說，此組合成肽可以引起HCV感染病人血清反應(yīng)，與HBV感染病人血清無反應(yīng)。
表4本發(fā)明肽B同實驗組HCV感染病人血清及HBV感染病人血清反應(yīng)比較
分別對兩組間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，卡方檢驗P＝0.00，＜0.01，兩組的陽性率差異有顯著性意義。也就是說，此組合成肽可以引起HCV感染病人血清反應(yīng)，與陰性對照組正常人血清無反應(yīng)。
表5本發(fā)明肽A同實驗組HCV感染病人血清及HBV感染病人血清反應(yīng)比較
分別對兩組間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，卡方檢驗P＝0.00，＜0.01，兩組的陽性率差異有顯著性意義。也就是說，此組合成肽可以引起HCV感染病人血清反應(yīng)，與HBV感染病人血清無反應(yīng)。
實施例3本發(fā)明多肽體外刺激HCV感染PBMC細(xì)胞因子分泌的研究1.外周血細(xì)胞來源23份HCV感染陽性血標(biāo)本取自302醫(yī)院HCV感染住院的患者中選取，PCR檢測血清HCV RNA90％為陽性。血清HCV抗體陽性。
2.方法2.1標(biāo)本PBMC的提取取新鮮靜脈肝素抗凝血3ml，加等量Hank’s液稀釋，混勻，輕鋪到與血體積等量的淋巴細(xì)胞分離液液面上，1500-2000rpm/min，離心30分鐘，吸出云霧狀的淋巴細(xì)胞層，用Hank’s液洗兩次，可獲得大量的淋巴細(xì)胞。
2.2細(xì)胞培養(yǎng)將獲得的淋巴細(xì)胞在顯微鏡下計數(shù)，按每份的細(xì)胞數(shù)大約為1*105/100ul將細(xì)胞平均分配，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入一定量(10ug/孔)的抗原合成肽，另設(shè)不加肽的陰性對照孔及PHA刺激的陽性對照孔，(每種樣品設(shè)三復(fù)孔)，震蕩混勻，置入37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，觀察。培養(yǎng)過程中連續(xù)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，記錄。
2.3培養(yǎng)上清的收集用多頭細(xì)胞收集器仔細(xì)將細(xì)胞收獲于試管中，1000-rpm/min，離心10分鐘沉淀細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清。
2.4細(xì)胞因子的檢測采用ELASA法(1)除空白孔外，分別將標(biāo)本或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(100微升/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(20-25℃)孵育120分鐘。
(2)洗板4次。
(3)除空白孔外，加入檢測劑工作液(100微升/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(20-25℃)孵育60分鐘。
(4)洗板4次。
(5)加入底物A、B(各50微升/孔)，閉光室溫10-30分鐘。
2.5標(biāo)本熒光標(biāo)記(1)收集培養(yǎng)細(xì)胞。
(2)2％FCS清洗兩遍。
(3)加入熒光抗體1微升/105細(xì)胞。避光室溫靜置20分鐘。
(4)2％FCS清洗一遍。
(5)加入1％多聚甲醛2毫升，4℃保存。
2.6淋巴細(xì)胞分類檢測對培養(yǎng)后集落出現(xiàn)好的樣本進(jìn)行培養(yǎng)，并利用流式細(xì)胞儀(BD公司FACSCALIBUR型)檢測熒光CD4和CD8抗體標(biāo)記細(xì)胞。
2.7統(tǒng)計學(xué)方法Stata統(tǒng)計軟件計算肽A組和肽B組測定結(jié)果分別與陰性組結(jié)果進(jìn)行t檢驗。由于測定IL-10和γ-IFN的結(jié)果同陰性組方差不齊，統(tǒng)計學(xué)方法采用秩和檢驗。
3.結(jié)果3.1光鏡觀察HCV感染病人的PBMC加入合成肽后第二天，鏡下觀察可見細(xì)胞生活良好，體大，個圓，透光性好，陽性對照孔可見滿視野多個小細(xì)胞增殖團(tuán)，實驗孔可見散在的小細(xì)胞增殖團(tuán)，培養(yǎng)4天左右，可見散在的小細(xì)胞團(tuán)較前增大，形成明顯的集落團(tuán)。陰性對照孔未見明顯的集落團(tuán)出現(xiàn)。HBV病人的PBL加入合成肽后未見集落團(tuán)。
3.2體外培養(yǎng)HCV患者增殖PBMC FACS淋巴細(xì)胞分類結(jié)果多肽刺激后培養(yǎng)72小時增殖細(xì)胞群淋巴細(xì)胞分類中CD4+細(xì)胞所占比重增加(肽A平均上升4.6％，肽B平均上升3.7％)，而CD8+細(xì)胞比重下降(肽A平均下降3.4％，肽B平均下降3.2％)，說明增殖細(xì)胞重要為CD4+細(xì)胞。
3.3體外細(xì)胞因子分泌水平變化研究第5號標(biāo)本對肽A和肽B組都有較好的增殖反應(yīng)，故對它的細(xì)胞因子分泌水平隨時間的變化進(jìn)行了研究。
結(jié)果表明IL-4、IL-10、γ-IFN水平是隨培養(yǎng)時間的延長而升高的。并且在培養(yǎng)后48-72小時間達(dá)到最高水平。
3.4培養(yǎng)72小時的上清中細(xì)胞因子水平結(jié)果見表6
γ-IFN檢測結(jié)果表明肽A組和肽B組γ-IFN都明顯的分泌升高，分別為59.0±56.8，59.8±56.2(pg/ml)，與陰性對照組(7.1±2.6)相比明顯升高，差異有顯著意義(P＜0.05)。
IL-4檢測結(jié)果表明肽A組和肽B組IL-4都明顯的分泌升高，分別為38.4±26.0，35.0±34.3(pg/ml)，與陰性對照組(6.6±2.2)相比明顯升高，差異有顯著意義(P＜0.05)。
IL-10檢測結(jié)果表明肽A組和肽B組IL-10都明顯的分泌升高，分別為114.8±111.6，102.6±91.8(pg/ml)，與陰性對照組(4.6±1.5)相比明顯升高，差異有顯著意義(P＜0.05)。
表7不同病人PBMC經(jīng)合成肽刺激后細(xì)胞因子水平的變化
實施例4 本發(fā)明的多肽在小鼠體內(nèi)免疫原性和血清中細(xì)胞因子的研究1.實驗動物BALB/c小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，均為雄性性6周齡。
2.方法2.1免疫小鼠本發(fā)明多肽直接免疫小鼠，分為2小組分別命名肽A組，肽B組。每組5只小鼠。肽A組和肽B組分別用上述肽A和肽B合成肽免疫小鼠。另設(shè)一組陰性對照組，第一次免疫合成肽用量為50ug，將弗氏完全佐劑(GIBCOBRL公司)與合成肽抗原各50ul等體積混合，用微量攪拌器充分混勻，多點注射小鼠足墊，陰性對照組只注射完全弗氏佐劑。2周后進(jìn)行第二次免疫，即加強(qiáng)免疫。用同樣的合成肽量，改用不弗氏完全佐劑(GIBCOBRL公司)，注射體積和方法同上。免疫進(jìn)行兩次后進(jìn)行沖擊免疫，用PBS 200ul溶解100ug的合成肽，經(jīng)肌肉注射，陰性對照組只注射200ul的PBS。第一次及第二次加強(qiáng)免疫后一天對小鼠進(jìn)行剪尾取血，第二次加強(qiáng)免疫三天后，摘除小鼠眼球放血，收取血清作標(biāo)本。
2.2小鼠血清抗體檢測，采用ELASA法(1)分別用各種合成肽作為抗原包被聚丙乙烯微孔條，每種樣品用三復(fù)孔，合成肽用量分別用10ug，加入到100ul堿性包被液中，4℃過夜。
(2)用120ul PBS封閉，37℃孵育2小時。
(3)加入各組小鼠血清，1∶100稀釋，37℃孵育1小時。
(4)每孔加入羊抗鼠IgG(華美生物制品公司)100ul(1∶1000)稀釋，37℃孵育1小時。
(5)每孔加入A、B液50ul，置暗處放5分鐘，檢測450nm波長下的光密度(OD)值。
2.3小鼠血清細(xì)胞因子檢測，采用ELASA法。
(1)除空白孔外，分別將標(biāo)本或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(100微升/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(20-25℃)孵育120分鐘。
(2)洗板4次。
(3)除空白孔外，加入檢測劑工作液(100微升/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫(20-25℃)孵育60分鐘。
(4)洗板4次。
(5)加入底物A、B(各50微升/孔)，閉光室溫10-30分鐘。
(6)加入終止液(50微升/孔)，混勻后即刻測量450nm波長下OD值。
3.結(jié)果3.1合成肽免疫效果表8450nm波長下檢測抗合成肽抗體對應(yīng)的平均OD值(1∶100稀釋)
3.2小鼠血清細(xì)胞因子水平結(jié)果如下所示，表9實驗小鼠血清中各細(xì)胞因子濃度(pg/ml)
上述實驗結(jié)果表明小鼠脾臟細(xì)胞對上述肽A和肽B都表現(xiàn)出了明顯的增殖反應(yīng)。這與血清中各肽特異性抗體滴度高低的趨勢是一致的。而且，血清中γ-IFN、IL-4、IL-10，都有不同程度的提高。尤其是γ-IFN水平的升高是一個非常令人感興趣的現(xiàn)象，因為γ-IFN主要是Th1分泌的細(xì)胞因子，是人體免疫系統(tǒng)抵抗病毒感染的主要細(xì)胞因子之一，它通過誘導(dǎo)2-5A合成酶，進(jìn)而活化RNaseL，降解病毒RNA，從而抑制病毒蛋白的合成。說明本發(fā)明的多肽具有激活一定強(qiáng)度的細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，而針對HCV的細(xì)胞免疫反應(yīng)對于HCV的清除具有相當(dāng)重要的意義。
序列表<110>程云中國人民解放軍傳染病研究所<120>丙型肝炎病毒高變區(qū)1合成肽及其應(yīng)用<130>D0301060F<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒高變區(qū)1合成肽<400>1Gly Gln Thr Tyr Thr Ser Gly Ala1 5<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒高變區(qū)1合成肽<400>2Gly Gln Thr Tyr Thr Ser Gly Gly1 5<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(3，9，15，18，21，24)<223>n＝u或c或a或g<220><221>misc_feature<222>(6)<223>r＝a或g<220><221>misc_feature<222>(12)<223>y＝u或c<400>3gancaracnu ayacnucnga ngcn<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(3，9，15，18，21，24)<223>n＝u或c或a或g<220><221>misc_feature<222>(6)<223>r＝a或g<220><221>misc_feature<222>(12)<223>y＝u或c<400>4gancaracnu ayacnucnga ngan
權(quán)利要求
1.一種多肽或其藥物可接受的鹽，其含有一個或多個如下所示的氨基酸序列的合成肽GQTYTSGX，其中，X為A或G。
2.權(quán)利要求1所述的多肽或其藥物可接受的鹽，其特征在于其為如SEQ ID NO.1所述的合成肽GQTYTSGA或其藥物可接受的鹽。
3.權(quán)利要求1所述的多肽或其藥物可接受的鹽，其特征在于其為如SEQ ID NO.2所述的合成肽GQTYTSGG或其藥物可接受的鹽。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的多肽或其藥物可接受的鹽，其具有誘導(dǎo)細(xì)胞因子γ-IFN、IL-4、IL-10和抗體產(chǎn)生的功能。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽或其藥物可接受的鹽，其具有預(yù)防和/或治療丙型肝炎的作用。
6.權(quán)利要求1-5任一項所述的多肽或其藥物可接受的鹽，在制備預(yù)防和/或治療丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用。
7.一種用于預(yù)防和/或治療丙型肝炎的藥物組合物，其含有治療有效量的權(quán)利要求1-5任一項的多肽和必要時藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
8.權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-5任一項的多肽和Al(OH)3，其中每毫升生理鹽水或中性磷酸鹽緩沖液含有如SEQ IDNO.1所示合成肽和/或SEQ ID NO.2所示合成肽1.0-15mg，含有Al(OH)30.5-2mg。
9.一種丙型肝炎疫苗組合物，其含有有效量的權(quán)利要求1-5任一項所述的多肽和有效量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。
10.一種編碼權(quán)利要求1-5任一項多肽的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有丙型肝炎病毒高變區(qū)1合成肽的多肽或其藥物可接受的鹽，其含有一個或多個如下所示的氨基酸序列的合成肽GQTYTSGX，其中，X為A或G。本發(fā)明還涉及上述多肽作為制備預(yù)防和/或治療丙型肝炎的藥劑的應(yīng)用，以及含有上述多肽的治療丙型肝炎的藥物組合物、疫苗、編碼該多肽的多核苷酸。
文檔編號C12N15/51GK1429836SQ0310088
公開日2003年7月16日 申請日期2003年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月24日
發(fā)明者程云, 李靖, 舒翠麗, 陳昊, 趙軍, 王國志, 鄭宇 , 張英起 申請人:程云, 中國人民解放軍傳染病研究所