專利名稱：重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在制備成人多能肌肉干細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的一種新的生物學(xué)應(yīng)用，具體為利用重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)生成一種具有體外多能分化能力的成人肌肉干細(xì)胞。
背景技術(shù)：
成年個體肌肉中存在著的成肌細(xì)胞是單能分化的肌肉干細(xì)胞。可以通過表達(dá)特異的成肌調(diào)節(jié)因子myf5、MyoD、myogenin和MRF4調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的成肌分化并最終形成肌管肌纖維，其中myf5和MyoD決定成肌細(xì)胞定向成肌分化，而myogenin和MRF4則促進(jìn)成肌細(xì)胞終末分化為肌管肌纖維(SealeP and Rudnicki MA.A new look at the origin，function，and“stem cell”atatus ofmuscle satellite cells.Develop Bio，2000，218115-124)。就成肌細(xì)胞本身而言，并不具備向其它組織類型細(xì)胞分化的能力。
睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF)是神經(jīng)生長因子家族以外的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，其主要生物學(xué)作用是支持神經(jīng)細(xì)胞的存活。CNTF可使胚胎干細(xì)胞保持在未分化的干細(xì)胞狀態(tài)(Conover JC，Ip NY，Poueymirou WT，et al.Ciliary neurotrophic factor maintains the pluripotentialityof embryonic stem cells.Development，1993，119559-565)，也能抑制神經(jīng)干細(xì)胞的分化并促進(jìn)其自我更新(Shimazaki T，Shingo T and Weiss S.The ciliaryneurotrophic factor/leukemia inhibitory factor/gp 130 receptor complex operates inthe maintenance of mammalian forebrain neural stem cells.JNeurosci，2001，21(19)7642-7653)。有關(guān)CNTF對成肌細(xì)胞直接作用的報(bào)道較少，僅鄧小華等(鄧小華，侍堅(jiān)，蔣春雷，等.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子對體外骨骼肌細(xì)胞的促增殖作用.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2000，16(1)59-63)報(bào)道增加外源性CNTF含量能促進(jìn)L6-TG肌母細(xì)胞和新生SD大鼠原代成肌細(xì)胞的體外增殖。但迄今未見有關(guān)重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)生成一種具有體外多能分化能力的成人肌肉干細(xì)胞的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)證明了hCNTF能誘導(dǎo)成人肌肉干細(xì)胞生成一種具有體外多能分化能力的成人肌肉干細(xì)胞的作用。
本發(fā)明中的含hCNTF的真核表達(dá)載體是通過以下步驟獲得的制備hCNTF基因片段，與真核表達(dá)質(zhì)粒連接，構(gòu)建含hCNTF的真核表達(dá)載體。
首先進(jìn)行成人成肌細(xì)胞的分離和單克隆擴(kuò)增。從成人胸小肌取樣，經(jīng)消化酶液消化等處理后接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，然后采用有限稀釋法接種細(xì)胞到96孔板，挑選Desmin+單個細(xì)胞，進(jìn)行單克隆擴(kuò)增，每株克隆傳代≥25代。將單克隆細(xì)胞進(jìn)行Desmin染色鑒定，Desmin+率約為1 00％。這些細(xì)胞在分化液中培養(yǎng)后形成肌管，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定表明myosin呈均一陽性?？梢姀某扇诵匦〖碓吹某杉〖?xì)胞能形成單克隆細(xì)胞株，且傳25代以上能保持其表型不變。
CNTF是一種細(xì)胞外活性因子，而所有的哺乳類CNTF均缺乏導(dǎo)致分泌的N末端疏水引導(dǎo)序列，因此在轉(zhuǎn)染CNTF的COS7，Hela或其它任何真核細(xì)胞的培養(yǎng)基中都不能檢測到被分泌的CNTF。由于CNTF在培養(yǎng)液中易于失活，發(fā)明人在觀察高濃度外源性CNTF對分離的成人肌肉干細(xì)胞作用的同時，將含或不含信號肽序列的s-hCNTF or hCNTF DNA片段連接到真核表達(dá)載體，制備了含rhCNTF的可分泌型表達(dá)載體和不可分泌型表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染Desmin+單克隆細(xì)胞，使rhCNTF在Desmin+單克隆細(xì)胞中瞬時表達(dá)。ELISA法測定培養(yǎng)液中rhCNTF蛋白的表達(dá)水平。ELISA分析表明，rhCNTF在轉(zhuǎn)染分泌型表達(dá)載體的成肌細(xì)胞中被特異表達(dá)并能夠分泌到培養(yǎng)基中，在局部產(chǎn)生較高的作用濃度。
分離Desmin+的單克隆成人成肌細(xì)胞，給予高濃度CNTF或轉(zhuǎn)染分泌型表達(dá)質(zhì)粒處理后，發(fā)明人在培養(yǎng)細(xì)胞中分離出呈小圓球形的、Desmin-和Nestin+表型的、未見報(bào)道的肌肉干細(xì)胞。單克隆培養(yǎng)這些肌肉干細(xì)胞，并在懸浮態(tài)下傳代25代以上獲得表型穩(wěn)定的單克隆株。當(dāng)誘導(dǎo)其多能分化時，這些克隆化的肌肉干細(xì)胞能分化產(chǎn)生表達(dá)NF160、NSE、TH和chAT蛋白的神經(jīng)元以及膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌和脂肪細(xì)胞。因此，體外培養(yǎng)時給予高濃度CNTF或轉(zhuǎn)染分泌型CNTF可誘導(dǎo)成人成肌細(xì)胞生成一種新的多能肌肉干細(xì)胞。本發(fā)明可為包括多種組織損傷和臨床退行性疾病的治療提供新的自體干細(xì)胞來源。


圖1pcDNA3-s-hCNTF重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建圖2pGEM-3-zf(+)-s-hCNTF的測序3重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-s-hCNTF的酶切電泳圖ApcDNA3-s-hCNTF KpnI+ApaI雙酶切BpcDNA3-s-hCNTF KpnI+BamI雙酶切CpcDNA3-s-hCNTF的HindIII單酶切MDNA/EcoRI+HindIII雙酶切的DNA標(biāo)準(zhǔn)圖4成肌細(xì)胞單克隆及其鑒定.單個成肌細(xì)胞(a)及其克隆(d)。這些克隆化細(xì)胞被分散接種在蓋玻片上12h(b)or誘導(dǎo)分化72h(e)，并分別用Desmin(c)或Myosin(f)進(jìn)行免疫組化鑒定，結(jié)果表明生長12h or誘導(dǎo)分化72h的細(xì)胞對Desmin或Myosin的反應(yīng)呈均一陽性。
圖5分泌型rhCNTF的表達(dá).轉(zhuǎn)染pcDNA3(P)，pcDNA3-CNTF(PC)和pcDNA3-s-CNTF(PSC)質(zhì)粒的培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)分化后0-3d被收集并濃縮10倍，采用hCNTF ELISA Kit(R&D system)分析分泌型rhCNTF在培養(yǎng)液中的表達(dá)量。p＜0.05，n＝3。
圖6分泌型rhCNTF抑制成肌細(xì)胞的體外分化.
A轉(zhuǎn)染pcDNA3(P)，pcDNA3-CNTF(PC)和pcDNA3-s-CNTF(PSC)質(zhì)粒的細(xì)胞被誘導(dǎo)分化72h的相差顯微鏡照相?？梢娹D(zhuǎn)染pcDNA3-s-CNTF的細(xì)胞中肌管，數(shù)量顯著減少，且有折光度強(qiáng)的小圓球形細(xì)胞生成。
B肌細(xì)胞的分化用融合率表示，融合率在轉(zhuǎn)染pcDNA3-s-CNTF的細(xì)胞中顯著降低。*p＜0.05，n＝5。
圖7成肌細(xì)胞(MB)和被轉(zhuǎn)化成肌細(xì)胞(CM)的鑒定.
A單個CM(a)及其單克隆(b)，以及懸浮擴(kuò)增的CM(c)。
B克隆化的CM細(xì)胞接種在蓋玻片上12h后，Desmin，Vimentin，Nestin，和CD34免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。
CWestern blot檢測MB和CM細(xì)胞中myf5和MyoD的表達(dá)。
圖8CM細(xì)胞的多能分化.
ACM培養(yǎng)在DM1中14-20days，然后進(jìn)行NF160，TH，NES和chAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
BCM培養(yǎng)在DM2中10-14days，然后進(jìn)行CNPase和免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
CCM CM培養(yǎng)在DM3中15-20days，然后進(jìn)行SMA和Oil Red O染色。
圖9多能CM細(xì)胞的定向分化.Western blot分析CM細(xì)胞在基礎(chǔ)分化液(DMEM-F12，3∶1，1％penicillin/streptomycin/2％B-27/3％FBS)中7days(CM7)，DM-1中14-20days(CM-NGF)或DM2中10-14days(CM-CNTF)的NFM，GFAP，Nestin表達(dá)的變化。肝細(xì)胞為陰性對照(-ve)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 含rhCNTF重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其鑒定首先構(gòu)建測序載體pGEM-3zf(+)-s-hCNTF(圖1)，以T7，SP6通用測序引物為引物，按DyedeosyTM Terminator Cycle Sequencing Kit提供的方法，在Appied Biosystems 373A型DNA自動測序儀上進(jìn)行DNA序列分析(圖2)，可見連接的NGF信號肽序列及hCNTF cDNA序列均正確，且沒有移碼突變，因此，克隆入pGEM-3zf(+)質(zhì)粒中的帶信號肽的hCNTF基因序列是正確的。于是，我們用KpnI，SalI對pGEM-3zf(+)-s-hCNTF雙酶切，并將產(chǎn)生的s-hCNTF片段連接入pcDNA3質(zhì)粒上。插入方向，大小正確的pcDNA3-s-hCNTF(6.1kb)質(zhì)粒(圖3)，用KpnI+ApaI雙酶切可產(chǎn)生5.4，0.7kb的片段，用KpnI+BamI雙酶切可產(chǎn)生5.5，0.6kb的片段，用HindIII單酶切可產(chǎn)生5.8，0.3kb的片段，因此，帶信號肽的hCNTF片段已成功插入pcDNA3載體中。
實(shí)施例二 成人成肌細(xì)胞的分離和單克隆擴(kuò)增取男性42歲自愿者胸小肌稱重并剪成約1mm3碎片，按每克組織加入2ml混合消化酶液(dispasegrade II，2.4U ml-1，Boehringer Mannheim Corp；collagenaseclass II，1％；Boehringer Mannheim Corp.；2.5mM.CaCl2)，37℃消化45min，且每15min用槍頭吹打。加入5倍體積10％胎牛血清，并用6號針頭反復(fù)吹打，200目網(wǎng)過濾，濾液300g離心10min，底層細(xì)胞用生長液(GM；Hams F10加10％馬血清，10％胎牛血清，1％雞胚滲出液，1％青鏈霉素和bFGF 2.5ng ml-1)重懸，生長液中馬血清、胎牛血清、雞胚滲出液和青鏈霉素均為HyClone公司產(chǎn)品，人bFGF為R&D Systems產(chǎn)品。按5×105cells ml-1密度接種細(xì)胞于涂有collagen I(Sigma-Aldrich)的培養(yǎng)瓶，接種后2h(preplate1pp1)，將含有未貼壁細(xì)胞的懸液轉(zhuǎn)入涂有collagen I的培養(yǎng)瓶(pp2，以后每隔24h收集未貼壁細(xì)胞懸液到涂有collagen I的培養(yǎng)皿獲得pp3-5，去除pp1-2。
采用有限稀釋法(Chen XP，Liu H，Guo Q，et al.Isolation and clonalanalysis of satellite cells from adult rats.Chin J Biomed Engeneering.2001，10(2)56-59)，接種細(xì)胞到涂有collagen I的96孔板，挑選Desmin+單個細(xì)胞，進(jìn)行單克隆擴(kuò)增，每株克隆傳代≥25代，凍存?zhèn)溆谩?br> 分離提取的骨骼肌細(xì)胞中成肌細(xì)胞特異標(biāo)記Desmin的陽性率為＞97％，提示有約3％的其它種類細(xì)胞存在，為更準(zhǔn)確地探討rhCNTF對成肌細(xì)胞體外分化的影響，我們挑選Desmin+細(xì)胞進(jìn)行單克隆擴(kuò)增(圖4，a，d)。為鑒定成肌細(xì)胞的純度，將單克隆細(xì)胞接種在涂有collagen I的蓋玻片上，貼壁后12h進(jìn)行Desmin染色鑒定，Desmin+率約為100％(圖4，c)。這些細(xì)胞在分化液中72h培養(yǎng)后形成肌管，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定表明myosin呈均一陽性(圖4，f)。可見從成人胸小肌來源的成肌細(xì)胞能形成單克隆細(xì)胞株，且傳25代以上能保持其表型不變。
實(shí)施例三 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分泌型rhCNTF水平檢測0.7或0.6kb含或不含NGF信號肽序列的s-hCNTF or hCNTF DNA片段被連接到pcDNA3(Invitrogen)，構(gòu)成分泌型和非分泌型的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-s-hCNTF和pcDNA3-hCNTF(咸海青博士惠贈)。用DOPAT脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Desmin+單克隆細(xì)胞，使重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)在Desmin+單克隆細(xì)胞中瞬時表達(dá)。按DOPAT(Roche)脂質(zhì)體法操作程序轉(zhuǎn)染細(xì)胞。主要步驟為60mm培養(yǎng)皿中的Desmin+單克隆細(xì)胞生長到亞融合密度時，用無雙抗無血清的DMEM液(GIBCO-BRL)洗細(xì)胞2-3次，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。5μg DNA(pcDNA3-s-hCNTF，pcDNA3-hCNTF or pcDNA3)，30μl DOPAT和2ml無雙抗無血清DMEM室溫孵育15min，然后加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞8h后換為生長液，24h后換分化液(DMEM/2％HS)繼續(xù)培養(yǎng)0-3天，并每隔24h收集培養(yǎng)液，按ELISA Kit(R&D Systems)操作程序測定培養(yǎng)液中rhCNTF蛋白的表達(dá)水平。
ELISA分析(圖5)表明，分泌型rhCNTF在轉(zhuǎn)染pcDNA3-s-rhCNTF質(zhì)粒組24h后較轉(zhuǎn)染pcDNA3-rhCNTF和pcDNA3質(zhì)粒組顯著增加?？梢?，分泌型rhCNTF在轉(zhuǎn)染pcDNA3-s-rhCNTF質(zhì)粒的細(xì)胞中特異表達(dá)。
實(shí)施例四 轉(zhuǎn)染rhCNTF以及直接加入外源性rhCNTF對肌肉干細(xì)胞成肌分化的影響轉(zhuǎn)染細(xì)胞8h后換為生長液，24h后換分化液(DMEM/2％HS)繼續(xù)培養(yǎng)72h，誘導(dǎo)細(xì)胞成肌分化。分化程度由細(xì)胞的膜融合率(Fusion％)表示，膜融合率為融和細(xì)胞核的數(shù)目占總核數(shù)目的百分比，而融合細(xì)胞定義為含有≥3個核的細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)3個平行生長皿。
將rhCNTF(20-50ng/ml)直接加到亞融合的細(xì)胞孵育72h，每12h更換含rhCNTF的新鮮培養(yǎng)基。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3-rhCNTF或pcDNA3質(zhì)粒組的細(xì)胞中有大量肌管形成，而轉(zhuǎn)染pcDNA3-s-rhCNTF質(zhì)粒的細(xì)胞很少肌管產(chǎn)生，細(xì)胞融合率也顯著降低，且有大量折光度較強(qiáng)的小圓球細(xì)胞出現(xiàn)。因此，分泌型rhCNTF能抑制成肌細(xì)胞的體外分化并誘導(dǎo)成肌細(xì)胞產(chǎn)生一種新的小圓球細(xì)胞。給予高濃度CNTF有類似的作用。
實(shí)施例五 被轉(zhuǎn)化成肌細(xì)胞(CM)的分離和單克隆擴(kuò)增用槍頭分離轉(zhuǎn)染pcDNA3-s-hCNTF或高濃度CNTF誘導(dǎo)成肌分化72h培養(yǎng)細(xì)胞中的小圓球型細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)Desmin+單克隆細(xì)胞通過轉(zhuǎn)染pcDNA3-s-hCNTF或高濃度CNTF后轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了Desmin-細(xì)胞，發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化。我們將其定義為被轉(zhuǎn)化的成肌細(xì)胞(converted myoblasts CM)。為分析Desmin-細(xì)胞的特性，將這些Desmin-細(xì)胞接種于50cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃/5％CO2孵箱生長液(GMDMEM-F12，3∶1，1％penicillin/streptomycin+2％B-27，20ng ml-1EGF and 100ng ml-1bFGF)中培養(yǎng)，7-10d以后許多小圓球細(xì)胞呈團(tuán)狀懸浮生長。每7-10d收集包含懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液離心，并用生長液重懸，接種擴(kuò)增培養(yǎng)。用有限稀釋法Chen XP，Liu H，Guo Q，et al.Isolation and clonalanalysis of satellite cells from adult rats.Chin J Biomed Engeneering.2001，10(2)56-59)進(jìn)行單克隆培養(yǎng)(圖7，A)，并挑選Desmin-的單克隆進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化。
以免疫細(xì)胞化學(xué)分析鑒定CM細(xì)胞，結(jié)果(圖7，B)表明CM細(xì)胞Desmin，Vimentin和CD34染色均為陰性，而Nestin染色為均一陽性。提示CM細(xì)胞已由中胚層起源的成肌干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)前體細(xì)胞樣的多能肌肉干細(xì)胞。Western blot分析(圖7，C)也表明CM細(xì)胞缺乏成肌細(xì)胞特異蛋白myf5和MyoD的表達(dá)。
實(shí)施例六 CM單克隆的體外多能分化將克隆化的CM接種于涂有多聚賴氨酸的蓋玻片，置37℃/5％CO2孵箱分化液(DM0；DMEM-F12，3∶1，1％penicillin/streptomycin+2％B-27，3％FBS)中誘導(dǎo)分化7d，再進(jìn)行如下定向分化。
誘導(dǎo)向神經(jīng)和膠質(zhì)樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)分化7d的CM細(xì)胞換為分化液DM1(DMEM-F12，3∶1，1％penicillin/streptomycin+2％B-27，50ng ml-1NGF)繼續(xù)誘導(dǎo)分化14-20d，或在分化液DM2(DMEM-F12，3∶1，1％penicillin/streptomycin+2％B-27，30ng ml-1CNTF)中繼續(xù)誘導(dǎo)分化10-14d，每天換液。觀察是否產(chǎn)生神經(jīng)元樣細(xì)胞或膠質(zhì)樣細(xì)胞，并進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定和Western Blot分析。
誘導(dǎo)向中胚層其它組織細(xì)胞的分化誘導(dǎo)分化7d的CM細(xì)胞換為分化液DM3(DMEM-F12，3∶1，1％penicillin/streptomycin+2％B-27，10％FBS)繼續(xù)誘導(dǎo)分化15-20d，每3d換液一次，觀察是否產(chǎn)生中胚層其它組織細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。
結(jié)果表明(圖8)CM細(xì)胞在不同的多能分化的誘導(dǎo)條件下，能產(chǎn)生表達(dá)NF160，TH，NSE和chAT等蛋白的成熟神經(jīng)元，表達(dá)CNPase和GFAP蛋白的膠質(zhì)細(xì)胞，也能分化為平滑肌和脂肪細(xì)胞。Western blot分析(圖9)進(jìn)一步證明了CM細(xì)胞能在一定條件下定向分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞。
實(shí)施例七 免疫細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色免疫細(xì)胞化學(xué)染色，一抗為小鼠抗人Desmin(1∶200，Zymed)，Myosin，Vimentin，SMA(1∶1000，Zymed)單抗和小鼠抗人Nestin，NF160，CNPase(1∶5000，Sigma)，CD34(1∶500，R&D Systems)單抗，小鼠抗大鼠TH，NSE，chAt單抗(1∶5000，Sigma)以及兔抗人GFAP(1∶1000；Zymed)。Desmin和Myosin分別作為肌衛(wèi)星細(xì)胞及其終末分化的特異標(biāo)記，SMA作為平滑肌細(xì)胞的特異標(biāo)記，Vimentin作為中胚層起源細(xì)胞的特異標(biāo)志，CD34是造血干細(xì)胞的特異標(biāo)志，Nestin作為神經(jīng)前體細(xì)胞的特異標(biāo)志，而CNPase和GFAP作為膠質(zhì)細(xì)胞的特異標(biāo)志，NF160，TH，NSE，chAt是成熟神經(jīng)元的特異表達(dá)蛋白。二抗為Alexa 488或Texas Red-conjugated goat anti-mouse或rabbit IgG(1/200；Molecular Probes)。主要步驟4％多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫30min，用0.01MPBS(pH7.4)洗3次。0.2％Triton X-100/0.01M PBS室溫30min，加5％正常羊血清封閉4℃過夜，加一抗入0.1％Triton X-100/0.01M PBS和2％正常羊血清4℃過夜。PBS洗3-4次，進(jìn)行二抗反應(yīng)室溫1h，PBS洗3-4次，Hoechst染核5min，PBS洗2次，置RADIANCE 210(BIO-RAD)confocal圖像分析。(注Desmin，Myosin在Desmin+單克隆鑒定時進(jìn)行常規(guī)ABC染色)Oil Red O細(xì)胞化學(xué)染色鑒定脂肪細(xì)胞，主要步驟為4％多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫10min，70％酒精洗3次，2％Oil Red O室溫5min，70％酒精洗3次去除剩余染料，然后蘇木素復(fù)染。
實(shí)施例八 Western Blot分析采用Gredinger等(Gredinger，E，Gerber，AN，Tamir，Y，et al.Mitogen-activatedprotein kinase pathway is involved in the differentiation of muscle cells.J BiolChem，1998，27310436-10444)報(bào)道的方法收集細(xì)胞裂解液，并置冰浴搖床1h，加入等體積2×SDS loading buffer，100℃ 15min，然后12,000rpm離心15min，收集上清并取等量蛋白(50-100μg)在10％SDS-PAGE上電泳，用semidrytransfer(Bio-Rad)轉(zhuǎn)到PVDF膜(Millipore)。膜在含10％脫脂奶粉，0.5％BSA(Sigma)，0.1％Tween 20和0.1％NaN3的TBS中封閉過夜，一抗小鼠單克隆抗p21(1∶400；PharMingen)，Nestin，NF160(1∶500，Sigma)抗體，兔多克隆抗myf5，MyoD，myogenin(1∶200；Santa Cruz)和GFAP(1∶500；Zymed)抗體，室溫3h，TBS洗3次，二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記的抗小鼠或抗兔IgG；1∶5000，Sigma)室溫孵育2h。ECL Kit(Amersham)顯色。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在制備成人多能肌肉干細(xì)胞中的應(yīng)用<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>600<212>DNA<213>
<400>1atggctttca cagagcattc accgctgacc cctcaccgtc gggacctctg tagccgctct 60atctggctag caaggaagat tcgttcagac ctgactgctc ttacggaatc ctatgtgaag 120catcagggcc tgaacaagaa catcaacctg gactctgcgg atgggatgcc agtggcaagc 180actgatcagt ggagtgagct gaccgaggca gagcgactcc aagagaacct tcaagcttat 240cgtaccttcc atgttttgtt ggccaggctc ttagaagacc agcaggtgca ttttacccca 300accgaaggtg acttccatca agctatacat acccttcttc tccaagtcgc tgcctttgca 360taccagatag aggagttaat gatactcctg gaatacaaga tcccccgcaa tgaggctgat 420gggatgccta ttaatgttgg agatggtggt ctctttgaga agaagctgtg gggcctaaag 480gtgctgcagg agctttcaca gtggacagta aggtccatcc atgaccttcg tttcatttct 540tctcatcaga ctgggatccc agcacgtggg agccattata ttgctaacaa caagaaaatg 600
權(quán)利要求
1.重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在制備成人多能肌肉干細(xì)胞中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子能誘導(dǎo)人成肌細(xì)胞成為一種具有體外多能分化能力的成人多能肌肉干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因具有在序列表中序列1的核苷酸序列基礎(chǔ)上任選地一點(diǎn)或多點(diǎn)發(fā)生缺失、替換、增加等突變，并具有重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子功能的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的誘導(dǎo)作用是通過外源性的重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和含重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的可分泌型表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中含重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的可分泌型表達(dá)載體是通過如下步驟獲得的(1)制備分泌型和非分泌型人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子基因；(2)將(1)制備的基因與真核表達(dá)載體連接，構(gòu)建含重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌型和非分泌型表達(dá)載體；
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在制備成人多能肌肉干細(xì)胞中的應(yīng)用。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)證明了重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的一種新的生物學(xué)作用，能誘導(dǎo)生成一種具有體外多能分化能力的成人肌肉干細(xì)胞。發(fā)明人觀察到體外培養(yǎng)時給予高濃度人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子或轉(zhuǎn)染分泌型人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子都可誘導(dǎo)成人成肌細(xì)胞生成一種新的多能肌肉干細(xì)胞。這一發(fā)明可為包括多種組織損傷和臨床退行性疾病的治療提供新的自體干細(xì)胞來源，具有較廣闊的市場前景。
文檔編號C12N15/11GK1537937SQ0310974
公開日2004年10月20日 申請日期2003年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月15日
發(fā)明者陳曉萍, 范明, 劉紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)