專利名稱：一種以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及結核桿菌藥物，具體地說是一種以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物篩選方法。
背景技術：
結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起人類結核病的致病菌。結核病，尤其是肺結核，在歷史上曾經是一種烈性傳染病，由于醫(yī)藥科技的發(fā)展，結核病一度不再被認為是難治之癥；然而自1985年以來，全球結核病疫情大有卷土重來之勢，結核病的發(fā)病率及由此引起的死亡率都在顯著增加；據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，每年全世界約有八百萬人患肺結核病，其中兩百萬人死于該病，全世界三分之一的人口已被結核分枝桿菌所感染，其中10％感染者可能成為肺結核病的患者。WHO已宣布全球結核病疫情處于緊急狀態(tài)，并指出結核病現(xiàn)在已經成為人類傳染病中的第一殺手。造成全球結核病疫情回升的主要原因是具多耐藥性的結核分枝桿菌菌株(MDR-TB)的出現(xiàn)；因此，對于治療結核病的有效新藥的研制迫在眉睫。
目前，開發(fā)新的抗生素的戰(zhàn)略是尋找靶標(酶蛋白)→克隆目標基因→證明靶標的重要性(基因敲除)→表達目標酶蛋白→建立酶催化反應方法→建立高通量藥物篩選方法及分析酶蛋白的晶體結構→開發(fā)新的抗生素。
結核分枝桿菌細胞壁可作為新藥開發(fā)的靶標，因為細胞壁是分枝桿菌賴以生存的結構基礎(文獻1Young，D.B.and K.Duncan(1995)，Prospects for new interventions in the treatment and prevention ofmycobacterial disease，Annual Review of Microbiology 49641-673)。目前國外對分枝桿菌細胞壁的結構及其生物合成已有較深入的研究；其細胞壁核心部分主要由聚阿拉伯糖聚半乳糖、肽聚糖以及分枝菌酸三種成分組成(圖1)(文獻2McNeil，M.(1996)，Target preclinical drug development forMycobacterium avium complexa biochemical approach，InMycobacteriumavium-Complex Infection，pp 263-283，Edited by Korvick，J.A.and C.A.Benson，Marcel Dekker，Inc.，New York)；分枝菌酸和聚阿拉伯糖聚半乳糖通過銜接雙糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共價連接到肽聚糖大分子上，因此銜接雙糖是一個重要的結構成分(圖2)；銜接雙糖中的鼠李糖殘基的供體為dTDP-鼠李糖；結核分枝桿菌中有四種酶催化由底物葡萄糖-1-磷酸合成dTDP-鼠李糖的過程(文獻3Ma，Y.，Mills，J.，A.，Belisle，J.T.，et al.(1997)，Determination of the pathway for rhamnose biosynthesis inmycobacteriacloning，sequencing and expression of the Mycobacteriumtuberculosis gene encoding α-D-glucose-1-phosphate thymidylyltransferase，Microbiology 143937-945)，并且在分枝桿菌中不存在dTDP-鼠李糖生物合成的補救代謝途徑。
由于人體中不存在鼠李糖分子，鼠李糖可作為研發(fā)新一代抗結核藥物的重要靶標。對鼠李糖生物合成催化機理的深入研究將有助于建立一種篩選合成阻斷劑的方法，以篩選抗結核新藥。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種以結核桿菌細胞壁為靶點的具高度專一性且無毒副作用抗結核新藥物篩選方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為一種以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物篩選的方法，在含有50～100mMHEPES(pH7.6)，1～10mM NAD+，100～500nmol dTDP-Glc，4～12μg/ml蛋白的RmlB酶蛋白溶液中加入中藥、藏藥及天然產物的有效成分或組合化學產物，在25～37℃下培育1～5hr后，再加入1ml 0.1M NaOH培育10～40min，取出檢測318nm下吸光值的變化，根據(jù)體系吸光值的變化，確定所加入物質是否是以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物；利用這個酶活性測定方法，根據(jù)加入中藥、藏藥及天然產物的有效成分以及組合化學產物后RmlB酶蛋白的活性大小或有無建立了抗結核藥物的模型。
所述RmlB酶蛋白(rmlB是結核桿菌的生長相關基因，其基因所表達的蛋白酶是結核桿菌細胞壁形成過程中必須的)是通過如下方法制得，將含有rmlB基因的大腸桿菌在25～37℃，用0.1～5mM IPTG誘導表達2～6小時，超聲破碎細胞，離心，取上清液，利用表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術純化得到RmlB酶蛋白；通過應用現(xiàn)代分子生物學技術，從結核分枝桿菌基因組文庫中克隆了rmlA、B、C和D四個基因，它們分別編碼α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉移酶(RmlA)、dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫氫酶(RmlB)、dTDP-4-酮基-6-脫氧-D-葡萄糖3，5差向異構酶(RmlC)、及dTDP-4-酮基-鼠李糖還原酶(RmlD)，所述的rmlB基因是利用基因工程的方法克隆獲得，具體過程如下，從結核分枝桿菌基因組文庫中調出rmlB基因，設計5′CATATGCGGTTGCTAGTCACCGG3′、3′TTGCGCCAGTTACTGAGCTC5′基因片斷為引物，PCR擴增rmlB，擴增產物連接到pMD18-T載體上，重組質粒轉化Novablue并篩選鑒定，純化rmlB基因片段，測序，rmlB與pET16b連接，連接產物rmlB-pET16b轉化DH5α并鑒定，陽性質粒轉化大腸桿菌BL21。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明建立了結核桿菌細胞壁為靶點的藥物篩選模型。rmlB是結核桿菌的生長相關基因，其基因所表達的蛋白(酶)是結核桿菌細胞壁形成過程中必需的；本發(fā)明從結核分枝桿菌基因組文庫中克隆了rmlB基因，其編碼dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫氫酶(RmlB)，并在大腸桿菌中表達了結核分枝桿菌的RmlB酶蛋白，建立了酶催化反應測試方法；RmlB酶是開發(fā)抑制結核分枝桿菌生長抗生素的理想靶標。
2.本發(fā)明篩選得到的抗結核新藥將具高度專一性并且無毒副作用。結核分枝桿菌細胞壁可作為新藥開發(fā)的靶標，因為細胞壁是分枝桿菌賴以生存的結構基礎，目前國外對分枝桿菌細胞壁的結構及其生物合成已有較深入的研究；其細胞壁核心部分主要由聚阿拉伯糖聚半乳糖、肽聚糖以及分枝菌酸三種成分組成；分枝菌酸和聚阿拉伯糖聚半乳糖通過銜接雙糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共價連接到肽聚糖大分子上，因此銜接雙糖是一個重要的結構成分；由于人體中不存在鼠李糖分子，鼠李糖可作為研發(fā)新一代抗結核藥物的重要靶標；對鼠李糖生物合成催化機理的深入研究將有助于建立一種篩選合成阻斷劑的方法，以篩選抗結核新藥。所選的靶酶RmlB為人體缺乏的酶，以后研發(fā)的抗結核新藥將對人體無害，克服了抗菌藥物也殺害正常細胞的缺點。
3.本發(fā)明所選的靶酶為結核分枝桿菌生存所必需的，以保證將來研發(fā)的抗結核新藥具有高藥效性。


圖1為分枝桿菌中dTDP-鼠李糖(dTDP-Rhamnose)的合成代謝途徑示意圖。其中RmlA，α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉移酶；RmlB，dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫氫酶；RmlC，dTDP-4-酮基-6-脫氧-D-葡萄糖3，5表異構酶；RmlD，dTDP-4-酮基-鼠李糖還原酶；Wbb1，鼠李糖基轉移酶。
圖2為分枝桿菌細胞壁的核心結構示意圖。其中分枝菌酸(Mycolicacid)與聚阿拉伯糖(Arabinan)和聚半乳糖(Galactan)通過L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖(Linker)共價連接到肽聚糖(Peptidoglycan)上。
圖3為結核分枝桿菌中分別編碼RmlA、B、C和D酶蛋白的rmlA、B、C基因在基因組中的位置示意圖。
具體實施例方式
實施例1(rmlB基因的克隆及在大腸桿菌中的表達)應用現(xiàn)代分子生物學技術，從結核分枝桿菌基因組文庫中調出rmlB基因，設計5′CATATGCGGTTGCTAGTCACCGG3′、3′TTGCGCCAGTTACTGAGCTC5′基因片斷為引物，PCR擴增rmlB，擴增產物連接到pMD18-T載體上，重組質粒轉化Novablue并篩選鑒定，純化rmlB基因片段，測序，rmlB與pET16b載體連接，連接產物rmlB-pET16b轉化DH5α(為一菌種)并鑒定，陽性質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)。
實施例2(RmlB酶蛋白的誘導表達與分離純化)取少量所得菌株(冷凍保存)pET16b-Tb rmlB in BL21(DE3)于3ml LB液體培養(yǎng)基內搖床培養(yǎng)，25℃，轉速150rpm，過夜，OD值約為0.6～0.7時取出，從中再取少量接入200ml LB液體培養(yǎng)基內，培養(yǎng)至OD值約為0.6～0.7時加入0.1mM IPTG(IPTG為異丙基-β-D硫代半乳糖苷)，繼續(xù)培養(yǎng)1hr，取出，離心，棄上清，沉淀用1×Binding Buffer(8×＝40mM imidazole，4MNaCl，160mM Tris-HclpH7.9)重懸(加入1mM的PMSF)，超聲破碎細胞，離心，取上清，利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術(在此親和層析用的為Novagen公司的His Bind Kits試劑盒，是一較成熟的純化帶組氨酸標記酶蛋白的方法)純化得到RmlB酶蛋白，用SDS-PAGE鑒定蛋白純度以及其分子量。RmlB酶蛋白分子量為37546.7Kda。
實施例3(RmlB酶蛋白的誘導表達與分離純化)取少量所得菌株(冷凍保存)pET16b-Tb rmlB in BL21(DE3)于3ml LB液體培養(yǎng)基內搖床培養(yǎng)，37℃，轉速150rpm，過夜，OD值約為0.6～0.7時取出，從中再取少量接入200ml LB液體培養(yǎng)基內，培養(yǎng)至OD值約為0.6～0.7時加入5mM IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)10hr，取出，離心，棄上清，沉淀用1×BindingBuffer(8×＝40mM imidazole，4M NaCl，160mM Tris-Hcl pH7.9)重懸(加入1mM的PMSF)，超聲破碎細胞，離心，取上清，利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術(在此親和層析用的為Novagen公司的His Bind Kits試劑盒，是一較成熟的純化帶組氨酸標記酶蛋白的方法)純化得到RmlB酶蛋白，用SDS-PAGE鑒定蛋白純度以及其分子量。RmlB酶蛋白分子量為37546.7Kda。
實施例4(RmlB酶蛋白的誘導表達與分離純化)取少量所得菌株(冷凍保存)pET16b-Tb rmlB in BL21(DE3)于3ml LB液體培養(yǎng)基內搖床培養(yǎng)，30℃，轉速150rpm，過夜，OD值約為0.6～0.7時取出，從中再取少量接入200ml LB液體培養(yǎng)基內，培養(yǎng)至OD值約為0.6～0.7時加入2mM IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5hr，取出，離心，棄上清，沉淀用1×BindingBuffer(8×＝40mM imidazole，4M NaCl，160mM Tris-Hcl pH7.9)重懸(加入1mM的PMSF(PMSF為苯甲基磺酰氟(蛋白酶抑制劑)))，超聲破碎細胞，離心，取上清，利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術(在此親和層析用的為Novagen公司的His Bind Kits試劑盒，是一較成熟的純化帶組氨酸標記酶蛋白的方法)純化得到RmlB酶蛋白，用SDS-PAGE鑒定蛋白純度以及其分子量。RmlB酶蛋白分子量為37546.7Kda。
實施例5(RmlB酶蛋白的活性測定與藥物篩選)dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫氫酶(RmlB)的活力測定是通過檢測該酶降解產物的出現(xiàn)而實施的。用考馬斯亮藍法測定RmlB酶蛋白溶液中RmlB酶蛋白的含量，分別取4μg蛋白加入二份200ml溶液中，其中樣品1包含50mMHEPES(pH7.6)(HEPES為N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)，1mM NAD+(NAD＝為氧化型輔酶I)，100nmol dTDP-Glc；樣品2包含50mM HEPES(pH7.6)，1mM NAD+。分別25～37℃，1～5hr培養(yǎng)后，加入1ml 0.1MnaOH，25℃下培育10min后，取出，然后以石英比色杯空白(空氣)為對照，在318nm下測定吸收值。結果樣品1吸光值為0.454，樣品2吸光值為0.003，兩者相差較大，說明RmlB酶蛋白以樣品1中的dTDP-Glc(dTDP-Glc為dTDP-D-葡萄糖)為底物，發(fā)生了催化反應，生成了在318nm下有吸收的dTDP-α-6-deoxy-D-xylo-4-hexulose。據(jù)此(利用酶活性測定方法，根據(jù)加入物后RmlB酶蛋白的活性大小或有無)，我們在RmlB酶蛋白的催化體系里加入中藥、藏藥及天然產物的有效成分以及組合化學產物，檢測318nm下吸光值的變化，如相對對照的RmlB酶蛋白的催化體系吸光值有明顯變小，則說明這些物質對RmlB這個靶酶有抑制或阻斷作用，這些物質就可能會是以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物。
實施例6(RmlB酶蛋白的活性測定與藥物篩選)dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫氫酶(RmlB)的活力測定是通過檢測該酶降解產物的出現(xiàn)而實施的。用考馬斯亮藍法測定RmlB酶蛋白溶液中RmlB酶蛋白的含量，分別取12μg蛋白加入二份200ml溶液中，其中樣品1包含100mM HEPES(pH7.6)，10mM NAD+，100nmol dTDP-Glc；樣品2包含100mMHEPES(pH7.6)，10mMNAD+。分別25～37℃，1～5hr培養(yǎng)后，加入1m10.1MnaOH，37℃下培育40min后，取出，然后以石英比色杯空白(空氣)為對照，在318nm下測定吸收值。結果樣品1吸光值為0.454，樣品2吸光值為0.003，兩者相差較大，說明RmlB酶蛋白以樣品1中的dTDP-Glc為底物，發(fā)生了催化反應，生成了在318nm下有吸收的dTDP-α-6-deoxy-D-xylo-4-hexulose。據(jù)此(利用酶活性測定方法，根據(jù)加入物后RmlB酶蛋白的活性大小或有無)，我們在RmlB酶蛋白的催化體系里加入中藥、藏藥及天然產物的有效成分以及組合化學產物，檢測318nm下吸光值的變化，如相對對照的RmlB酶蛋白的催化體系吸光值有明顯變小，則說明這些物質對RmlB這個靶酶有抑制或阻斷作用，這些物質就可能會是以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物。
權利要求
1.一種以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物篩選方法，其特征在于在含有50～100mM HEPES(pH7.6)、1～10mM NAD+、100～500nmol dTDP-Glc、4～12μg/ml蛋白的RmlB酶蛋白溶液中加入中藥、藏藥、天然產物的有效成分或組合化學產物，在25～37℃下培育1～5hr后，再加入1m10.1MNaOH培育10～40min，取出檢測318nm下吸光值的變化，根據(jù)體系吸光值的變化，確定所加入物質是否是以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物。
2.按照權利要求1所述以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物篩選方法，其特征在于所述RmlB酶蛋白是通過如下方法制得，將含有rmlB基因的大腸桿菌在25～37℃，用0.1～5mM IPTG誘導表達2～6小時，超聲破碎細胞，離心，取上清液，利用表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術純化得到RmlB酶蛋白。
3.按照權利要求2所述以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物篩選方法，其特征在于所述的rmlB基因是利用基因工程的方法克隆獲得，具體過程如下，從結核分枝桿菌基因組文庫中調出rmlB基因，設計引物，PCR擴增rmlB，擴增產物連接到pMD18-T載體上，重組質粒轉化Novablue并篩選鑒定，純化rmlB基因片段，測序，將rmlB與pET16b連接，連接產物rmlB-pET16b轉化DH5α并鑒定，陽性質粒轉化大腸桿菌BL21。
4.照權利要求3述以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物篩選方法，其特征在于所述的引物為基因片斷5′CATATGCGGTTGCTAGTCACCGG3′和3′TTGCGCCAGTTACTGAGCTC5′。
全文摘要
本發(fā)明是通過應用現(xiàn)代分子生物學技術從結核分枝桿菌基因組文庫中克隆了rmlB基因，其編碼dTDP－D－葡萄糖－4，6－脫氫酶(RmlB)，并在大腸桿菌中表達了結核分枝桿菌的RmlB酶蛋白(rmlB是結核桿菌的生長相關基因，其基因所表達的蛋白酶是結核桿菌細胞壁形成過程中必須的)，菌株經過超聲破碎細胞，離心，取上清液，利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸－Ni
文檔編號C12Q1/32GK1523118SQ0311103
公開日2004年8月25日 申請日期2003年2月21日 優(yōu)先權日2003年2月21日
發(fā)明者杜昱光, 馬郁芳, 陸海峰, 趙小明, 白雪芳, 李曙光 申請人:中國科學院大連化學物理研究所