專利名稱：一種褐藻膠裂合酶基因及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來源于海洋弧菌QY101的褐藻膠裂合酶基因。本發(fā)明還公開了含有該基因的載體和大腸桿菌菌株及其表達(dá)產(chǎn)物的生產(chǎn)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古羅糖醛酸(G)通過β-1，4糖苷鍵連接形成的線形陰離子多糖。兩種糖醛酸可以是均一或交替排列的，從而形成均聚甘露糖醛酸段(polyM)、均聚古羅糖醛酸段(polyG)和MG交替嵌段。褐藻和某些細(xì)菌均能產(chǎn)生褐藻膠，其中來源于褐藻的褐藻膠已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織、石油等工業(yè)。近來的研究表明，褐藻寡糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等多種生物活性，因此逐漸引起人們的注意。目前褐藻寡糖的制備多采用酸水解法，該方法難以控制降解程度，產(chǎn)物不均一，且對設(shè)備要求高，對環(huán)境污染嚴(yán)重。近來人們嘗試用褐藻膠裂合酶降解褐藻膠生產(chǎn)寡糖，該方法易于控制，產(chǎn)物特異性高，且不污染環(huán)境。另外，褐藻膠裂合酶與抗生素合用可以有效治療肺囊性纖維化。因此對褐藻膠裂合酶的需求越來越大。但現(xiàn)有的褐藻膠裂合酶生產(chǎn)菌株均存在酶產(chǎn)量低、難以分離純化的困難，導(dǎo)致生產(chǎn)成本居高不下，因此嚴(yán)重阻礙了褐藻寡糖的開發(fā)與應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種弧菌(Vibrio sp.)QY101褐藻膠裂合酶基因alyVI及其制備方法和應(yīng)用，它能彌補現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種褐藻膠裂合酶基因alyVI，其特征在于它是編碼弧菌(Vibriosp.)QY101的褐藻膠裂合酶的基因。
一種褐藻膠裂合酶基因alyVI的制備方法，其特征在于以弧菌(Vibrio sp.)QY101的總DNA為模板，經(jīng)簡并PCR和反向PCR的方法得到褐藻膠裂合酶基因alyVI的全序列，再通過PCR的方法得到該褐藻膠裂合酶基因alyVI。
將本發(fā)明的褐藻膠裂合酶基因alyVI用于制備大腸桿菌表達(dá)載體pET24-alyVI。
將本發(fā)明的褐藻膠裂合酶基因alyVI用于制備大腸桿菌重組株BL21-pET24-alyVI。
將本發(fā)明的褐藻膠裂合酶基因alyVI用于制備重組褐藻膠裂合酶。
將本發(fā)明的褐藻膠裂合酶基因alyVI用于降解褐藻膠制備褐藻寡糖。
本發(fā)明的褐藻膠裂合酶基因alyVI是編碼弧菌(Vibrio sp.)QY101褐藻膠裂合酶的基因，用其生產(chǎn)的重組褐藻膠裂合酶溫度和pH穩(wěn)定性好，活性高，能降解褐藻膠、聚甘露糖醛酸段和聚古羅糖醛酸段，降解產(chǎn)物主要為聚合度4-16的褐藻寡糖，因此可以用于褐藻寡糖的制備。本發(fā)明的大腸桿菌重組株BL21-pET24-alyVI所表達(dá)的重組褐藻膠裂合酶占總蛋白的35％，表達(dá)水平高，易于純化，且連續(xù)傳代20代后表達(dá)量未有降低，所以通過本發(fā)明可以大量生產(chǎn)重組褐藻膠裂合酶，成本較低。


附圖1為褐藻膠裂合酶基因aly的核苷酸序列附圖2為根據(jù)褐藻膠裂合酶基因aly的核苷酸序列推測的氨基酸序列具體實施方式
以下實施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實施例1 褐藻膠裂合酶基因alyVI的克隆及大腸桿菌表達(dá)載體pET24-alyVI的構(gòu)建在含3％(重量百分濃度)NaCl的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)弧菌QY101至對數(shù)末期，提取細(xì)菌總DNA。通過對已知褐藻膠裂合酶氨基酸序列的分析表明，褐藻膠裂合酶的N端和C端分別有一段保守區(qū)域。根據(jù)這兩段保守區(qū)域設(shè)計兩條簡并引物Paly1(5′-CGBTCDGARCTBCGBGMRATG-3′)和Paly2(5′-RTARTTRCCBGCYTTRAARTA-3′)，以弧菌QY101的總DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增得到褐藻膠裂合酶部分基因片段。該PCR的條件為94℃預(yù)變性3min，隨后以94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 60s進(jìn)行30個循環(huán)，最后在72℃延伸10min。瓊脂糖電泳顯示，0.51kb處有一特異條帶，將其從瓊脂糖凝膠上切下回收后克隆、測序并進(jìn)行分析。
根據(jù)已獲得的褐藻膠裂合酶基因部分序列設(shè)計反向引物Paly3(5’-TATTTTCACCATCCCACTGC-3’)和Paly4(5’-AGCCATTCAGTGTCAACCTA-3’)。將弧菌QY101的總DNA用Bgl II完全酶切后進(jìn)行自連接，以所得的連接產(chǎn)物作為模板進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，得到褐藻膠裂合酶基因已知序列兩側(cè)未知序列。PCR條件為94℃預(yù)變性3min，隨后以94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 60s進(jìn)行30個循環(huán)，最后在72℃延伸10min。瓊脂糖電泳顯示4.5kb處有一特異條帶，將其從瓊脂糖凝膠上切下回收后克隆、測序并進(jìn)行分析，從而得到褐藻膠裂合酶基因aly全序列(附圖1)。其中編碼區(qū)為197-1211bp，編碼一個338個氨基酸的蛋白質(zhì)(附圖2)。
根據(jù)褐藻膠裂合酶基因aly全序列設(shè)計引物Paly7(5’-GGAATTCCATATGAAAACCTCATGGTTTATC-3’)和Paly8(5’-CCGCTCGAGTCTATGATCAATATTGATCTTC-3’)，以弧菌QY101的總DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增得到褐藻膠裂合酶基因全序列。該PCR的條件為94℃預(yù)變性3min，隨后以94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s進(jìn)行30個循環(huán)，最后在72℃延伸10min。瓊脂糖電泳顯示1.0kb處有一特異條帶，將其從瓊脂糖凝膠上切下回收后，用NdeI和XhoI酶切，再經(jīng)瓊脂糖電泳分離，回收1.0kb的DNA片段。將大腸桿菌表達(dá)載體pET-24a(+)同樣用NdeI和XhoI酶切，瓊脂糖電泳分離，回收5.3kb的DNA片段，將其與上述所得1.0kb的DNA片段連接后，按照標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈣法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli DH5α中，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。用標(biāo)準(zhǔn)的堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)NdeI和XhoI酶切得到1.0kb和5.3kb兩個片段，分別與褐藻膠裂合酶基因aly全長片段與表達(dá)載體pET-24a(+)大小相同，證明褐藻膠裂合酶全長序列已克隆到表達(dá)載體pET-24a(+)中，將此重組質(zhì)粒命名為pET24-alyVI。
實施例2 能高效表達(dá)褐藻膠裂合酶的大腸桿菌重組株BL21-pET24-alyVI的構(gòu)建將實施例1中所得的表達(dá)載體pET24-alyVI按照標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈣法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。用標(biāo)準(zhǔn)的堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)NdeI和XhoI酶切得到1.0kb和5.3kb兩個片段，分別與褐藻膠裂合酶基因aly全長片段與表達(dá)載體pET-24a(+)大小相同，證明獲得了能高效表達(dá)褐藻膠裂合酶的大腸桿菌重組株BL21-pET24-alyVI。
實施例3 利用大腸桿菌重組株BL21-pET24-alyVI生產(chǎn)重組褐藻膠裂合酶將實施例2中所得的大腸桿菌重組株BL21-pET24-alyVI的單克隆接種在3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶50接種至100ml含有50μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃ 200r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5，加入IPTG至終濃度1mM，繼續(xù)培養(yǎng)3h，4℃ 5000×g離心30min收集菌體，重懸于結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.8/0.5M NaCl)，加入溶菌酶至終濃度0.5mg/ml，室溫作用30min。將菌懸液于冰上超聲破碎細(xì)胞30min，每作用10s暫停10s。4℃ 12000×g離心30min去除細(xì)胞碎片，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，濾出液上至用結(jié)合緩沖液平衡好的PreBondTMcolumn(Invitrogen)。依次用結(jié)合緩沖液和沖洗緩沖液(20mM磷酸鹽緩沖液，pH6.0/0.5M NaCl)沖洗柱子至洗出液OD280＜0.01，最后依次用5ml含不同濃度咪唑的洗脫緩沖液(20mM磷酸鹽緩沖液，pH6.0/0.5M NaCl)(咪唑濃度依次為50mM、200mM、350mM、500mM)洗滌柱子，收集洗脫液。SDS-PAGE檢測洗脫液中蛋白分布，合并含單一目的條帶洗脫液，對20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.8)透析除去咪唑，用Lowry法測定目的蛋白濃度，分裝后凍存于-80℃。
實施例4 利用重組褐藻膠裂合酶制備褐藻寡糖重組褐藻膠裂合酶能降解袂藻膠、聚甘露糖醛酸段、聚古羅糖醛酸段。制備褐藻寡糖時，將褐藻膠(平均分子量20KDa)溶于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，配成重量百分比濃度為0.1％～1.0％的溶液，按重量比0.1-1∶100加入實施例3中所得的重組褐藻膠裂合酶，混合均勻后在30℃溫浴1～24h，60％-80％的產(chǎn)物為聚合度4-16的褐藻寡糖。
權(quán)利要求
1.一種褐藻膠裂合酶基因alyVI，其特征在于它是編碼弧菌(Vibriosp.)QY101褐藻膠裂合酶的基因。
2.一種褐藻膠裂合酶基因alyVI的制備方法，其特征在于以弧菌(Vibrio sp.)QY101的總DNA為模板，經(jīng)簡并PCR和反向PCR的方法得到褐藻膠裂合酶基因alyVI的全序列，再通過PCR的方法得到該褐藻膠裂合酶基因alyVI。
3.將權(quán)利要求1所述的褐藻膠裂合酶基因alyVI用于制備大腸桿菌表達(dá)載體pET24-alyVI。
4.將權(quán)利要求1所述的褐藻膠裂合酶基因alyVI用于制備大腸桿菌重組株BL21-pET24-alyVI。
5.將權(quán)利要求1所述的褐藻膠裂合酶基因alyVI用于制備重組褐藻膠裂合酶。
6.將權(quán)利要求1所述的褐藻膠裂合酶基因alyVI用于降解褐藻膠制備褐藻寡糖。
全文摘要
一種褐藻膠裂合酶基因alyVI，其特征在于它是編碼弧菌(Vibrio sp.)QY101褐藻膠裂合酶的基因。用其生產(chǎn)的重組褐藻膠裂合酶溫度和pH穩(wěn)定性好，活性高，能降解褐藻膠、聚甘露糖醛酸段和聚古羅糖醛酸段，降解產(chǎn)物主要為聚合度4－16的褐藻寡糖，因此可以用于褐藻寡糖的制備。本發(fā)明的大腸桿菌重組株BL21－pET24－alyVI所表達(dá)的重組褐藻膠裂合酶占總蛋白的35％，表達(dá)水平高，易于純化，且連續(xù)傳代20代后表達(dá)量未有降低，所以通過本發(fā)明可以大量生產(chǎn)重組褐藻膠裂合酶，成本較低。
文檔編號C12P19/34GK1513998SQ0311241
公開日2004年7月21日 申請日期2003年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月29日
發(fā)明者于文功, 韓峰, 宮倩紅, 路新枝, 李京寶 申請人:中國海洋大學(xué)