專利名稱：中藥浙貝母聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物及鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于鑒定中藥浙貝母的引物及其鑒定方法，涉及中藥材鑒定的本發(fā)明設(shè)計(jì)的浙貝母聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定引物DNA序列為引物15’-CTAAATAGGCGG GCGAGCTAATC-3’引物25’-TATTAGCATTAATCGATCGAATTC-3’用全自動(dòng)DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進(jìn)行合成，即可得到鑒定引物的白色粉未結(jié)晶。
中藥材浙貝母聚合酶鏈反應(yīng)鑒定的方法為
(1)藥材DNA提取按常規(guī)進(jìn)行，用無離子水將供試品DNA模板濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA質(zhì)量的鑒定用另一對(duì)通用引物鑒別模板DNA的質(zhì)量，該對(duì)引物可擴(kuò)增各種植物的5S rRNA間區(qū)序列。引物的DNA序列為AS5’-GGATCC GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA-3’；AS-15’-GGA TCC TTA GTG CTGGTA TGA TCG CA-3’(Cai ZH，Li P，Dong TX et，al.The molecular diversity of5S-rRNA spacer domain in Fritillaria species revealed by PCR analysis.PlantaMedica，1999，65360-364.)；引物濃度為30pmol/μl，除將反應(yīng)體系中引物1、引物2改為AS、AS-1外，其它各物品用量同(3)；除復(fù)性溫度改為53℃外，擴(kuò)增反應(yīng)條件同(4)；電泳分析同(5)。若得到陽性擴(kuò)增，則表明模板合格，可進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)；若無擴(kuò)增條帶，則需改進(jìn)DNA提取條件，待獲得合格的模板后再進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)。
(3)鑒別性PCR引物用無離子水溶解并稀釋至30pmol/μL。以反應(yīng)體系均為30μL為參考點(diǎn)，各物品的用量為10×TaqDNA聚合酶緩沖液 3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM) 0.6μl引物1、引物2各 0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0單位供試品DNA模板 1.0～2.0μl無離子水 加到30μl(4)PCR循環(huán)在PCR儀上，95℃予變性4min，然后按下列參數(shù)進(jìn)入30循環(huán)變性95℃ 10～50秒復(fù)性60～65℃ 20～50秒延伸72℃ 20～60秒循環(huán)結(jié)束后在72℃保持2～10分鐘補(bǔ)齊。
(5)電泳觀察取出PCR反應(yīng)液4μl與加樣緩沖液1μl混合，2％瓊脂糖凝膠電泳(含0.5％溴化乙錠，即EB)檢測擴(kuò)增結(jié)果。
如總的反應(yīng)體積不為30μl，反應(yīng)物品的用量以30μl反應(yīng)劑量的比例為參考點(diǎn)，相應(yīng)地增加或減少。
若有陽性擴(kuò)增，則供試品為浙貝母；若為陰性，即無擴(kuò)增條帶，則供試品不為浙貝母。
本發(fā)明的效果是本發(fā)明解決貝母類藥材浙貝母的鑒別問題。我們在對(duì)浙貝母的鑒別中，設(shè)計(jì)了鑒別浙貝母的一對(duì)高特異性引物，該鑒定引物在給定的PCR條件下，只能特異地鑒別浙貝母，而對(duì)于任何其他種類的貝母或生物材料提取的總DNA均不能擴(kuò)增出該基因片段。當(dāng)供試樣品用本鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察有無擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)，即可準(zhǔn)確地判定藥材的真?zhèn)巍Ｓ么藢?duì)引物可以制造用于浙貝母鑒別的試劑盒。本發(fā)明對(duì)于中藥生產(chǎn)、銷售部門快速、準(zhǔn)確地鑒別浙貝母藥材，搞好藥材的質(zhì)量控制，是十分必要的，對(duì)于各地市藥檢部門打擊假冒偽劣，凈化藥材市場具有十分重要的價(jià)值。
具體實(shí)施例方式首先從貝母類藥材不同種的原植物中提取總DNA，用PCR方法擴(kuò)增多個(gè)基因片段并分別純化，對(duì)各純化片段進(jìn)行DNA序列分析，建立浙貝母及其近緣種、混淆種的DNA序列數(shù)據(jù)庫，在比較數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，選擇合適的DNA片段，針對(duì)藥材偽、混品出現(xiàn)的情況，設(shè)計(jì)一對(duì)鑒別性PCR引物引物15’-CTAAATAGGCGG GCGAGCTAATC-3’引物25’-TATTAGCATTAATCGATCGAATTC-3’用全自動(dòng)DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進(jìn)行合成，即可得到鑒定引物的白色粉未結(jié)晶。
采用上述引物對(duì)浙貝母的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，以反應(yīng)體系30μl為例，采用以下步驟進(jìn)行浙貝母的鑒別性聚合酶鏈反應(yīng)(1)藥材DNA提取按常規(guī)進(jìn)行，用無離子水將供試品DNA模板濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA質(zhì)量的鑒定用另一對(duì)通用引物鑒別模板DNA的質(zhì)量，該對(duì)引物可擴(kuò)增各種植物的5S rRNA基因間區(qū)序列。引物的DNA序列為AS5’-GGA TCC GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA-3’；AS-15’-GGA TCC TTAGTG CTG GTA TGA TCG CA-3’；引物濃度為30pmol/l，除將反應(yīng)體系中引物1、引物2改為AS、AS-1外，其它各物品用量同(3)；除復(fù)性溫度為53℃外，擴(kuò)增反應(yīng)條件同(4)；電泳分析同(5)。若得到陽性擴(kuò)增，則表明模板合格，可進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)；若無擴(kuò)增條帶，則需改進(jìn)DNA提取條件，待獲得合格的模板后再進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)。
(3)鑒別性PCR引物用無離子水溶解并稀釋至30pmol/μL。以反應(yīng)體系均為30μL為參考點(diǎn)，各物品的用量為10×TaqDNA聚合酶緩沖液 3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM) 0.6μl引物1、引物2各 0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0單位供試品DNA模板 1.0～2.0μl無離子水 加到30μl(4)PCR循環(huán)在PCR儀上，95℃予變性4min，然后按下列參數(shù)進(jìn)入30循環(huán)變性95℃10～50秒復(fù)性60～65℃20～50秒延伸72℃20～60秒循環(huán)結(jié)束后在72℃保持2～10分鐘補(bǔ)齊。
(5)電泳觀察取出PCR反應(yīng)4μl與加樣緩沖液1μl混合，2％瓊脂糖凝膠電泳(含0.5％溴化乙錠，即EB)檢測擴(kuò)增結(jié)果。
若有陽性擴(kuò)增，則供試品為浙貝母；若為陰性，即無擴(kuò)增條帶，則供試品不為浙貝母。中藥浙貝母聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物及鑒定方法<110>中國藥科大學(xué)<120>中藥浙貝母聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物及鑒定方法<160>2<210>1<211>23<212>DNA<2 13>浙貝母(Fritillaria thunbergii Miq.)<400>1ctaaataggc gggcgagcta atc<210>2<211>24<212>DNA<213>浙貝母(Fritillaria thunbergii Miq.)<400>1tattagcatt aatcgatcga attc
權(quán)利要求
1.一種中藥浙貝母聚合酶鏈反應(yīng)鑒定引物，其特征在于鑒定引物DNA序列為引物15’-CTAAATAGGC GGGCGAGCTA ATC-3’；引物25’-TATTAGCATTAATCGATCGAATTC-3’，用全自動(dòng)DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進(jìn)行合成，即得到鑒定引物的白色粉未結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒定引物鑒定中藥浙貝母的方法，其特征在于中藥材浙貝母聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒定步驟為(1)藥材DNA提取按常規(guī)進(jìn)行，用無離子水將供試品DNA模板濃度調(diào)節(jié)至0.2～0.5μg/μL。(2)模板DNA質(zhì)量的鑒定用另一對(duì)通用引物鑒別模板DNA的質(zhì)量，該對(duì)引物擴(kuò)增各種植物的5S rRNA間區(qū)序列。引物的DNA序列為AS5’-GGATCCGTG CTT GGG CGA GAG TAG TA-3’；AS-15’-GGA TCC TTA GTG CTG GTATGA TCG CA-3’；引物濃度為30pmol/μl，除將反應(yīng)體系中引物1、引物2改為AS、AS-1外，其它各物品用量同(3)；除復(fù)性溫度改為53℃外，擴(kuò)增反應(yīng)條件同(4)；電泳分析同(5)。若得到陽性擴(kuò)增，則表明模板合格，可進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)；若無擴(kuò)增條帶，則需改進(jìn)DNA提取條件，待獲得合格的模板后再進(jìn)行后續(xù)步驟的檢驗(yàn)。(3)鑒別性PCR引物用無離子水溶解并稀釋至30pmol/μL。以反應(yīng)體系均為30μL為參考點(diǎn)，各物品的用量為10×TaqDNA聚合酶緩沖液3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM)0.6μl引物1、引物2各0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0單位供試品DNA模板 1.0～2.0μl無離子水 加到30μl(4)PCR循環(huán)在PCR儀上，95℃予變性4min，然后按下列參數(shù)進(jìn)入30循環(huán)變性95℃ 10～50秒復(fù)性60～65℃ 20～50秒延伸72℃ 20～60秒循環(huán)結(jié)束后在72℃保持2～10分鐘補(bǔ)齊。(5)電泳觀察取出PCR反應(yīng)液4μl與加樣緩沖液1μl混合，2％瓊脂糖凝膠電泳(含0.5％溴化乙錠，即EB)檢測擴(kuò)增結(jié)果。如總的反應(yīng)體積不為30μl，反應(yīng)物品的用量以30μl反應(yīng)劑量的比例為參考點(diǎn)，相應(yīng)地增加或減少。若有陽性擴(kuò)增，則供試品為浙貝母；若為陰性，即無擴(kuò)增條帶，則供試品不為浙貝母。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒定引物，其特征在于鑒定引物DNA序列為引物15’-CTAAATAGGC GGGCGAGCTA ATC-3’；引物25’-TATTAGCATTAATCGATCGA ATTC-3’，用該引物設(shè)計(jì)的用于鑒別浙貝母的鑒別性聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒及其鑒定方法。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥鑒定技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于鑒定中藥浙貝母的引物及其鑒定方法。本發(fā)明設(shè)計(jì)的浙貝母聚合酶鏈反應(yīng)的鑒定引物DNA序列為引物15’－CTAAATAGGCGGGCGAGCTA ATC－3’；引物25’－TATTAGCATT AATCGATCGAATTC－3’。鑒定方法為提取藥材的總DNA；用一對(duì)引物AS、AS－1進(jìn)行擴(kuò)增以檢查總DNA的質(zhì)量，若有陽性擴(kuò)增則模板DNA質(zhì)量合格；用本發(fā)明的一對(duì)鑒定引物進(jìn)行擴(kuò)增；電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，若用鑒定引物得到陽性擴(kuò)增，則供試品為浙貝母，若無陽性擴(kuò)增則供試品不為浙貝母。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)浙貝母的快速、準(zhǔn)確地鑒別。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1438326SQ0311300
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月20日
發(fā)明者李萍, 王沖之, 彭昕 申請人:中國藥科大學(xué)