專利名稱：一種以絲膠為氮源的培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于細菌、真菌等微生物培養(yǎng)或動植物組織、細胞等培養(yǎng)的培養(yǎng)基，特別涉及一種以絲膠為氮源的培養(yǎng)基。
背景技術：
目前，用于細菌、真菌等微生物培養(yǎng)和動植物組織、細胞等培養(yǎng)的培養(yǎng)基主要有氮源、碳源、無機鹽和水等成分組成。蛋白胨一直在培養(yǎng)基中作為氮源得到廣泛應用，在細菌(涂楚國，CN1047629C，1999；張培德等，CN1167826C，2001；Patrick A.et al，US5723308，1998)、真菌(錢國琛等，CN1362513A，2002)、支原體(王荷英，CN1098352C，2003)、動物細胞(Hubertus Stockinger，Penz.US5065167，1991)、植物組織(張賢譯，CN11083525A，1994)等各種培養(yǎng)基中是主要成份，其含量在0.1~2％不等，而蛋白胨是動物源蛋白，在生物相容性、安全性等問題受到了人們的特別關注；同時，由于普通培養(yǎng)基中作為氮源的蛋白胨等用量大，培養(yǎng)基制備成本相對較高。因此，對于能夠提供一種在生物相容性、安全性、培養(yǎng)效果等方面更優(yōu)于蛋白胨，且成本較低、用量小的蛋白質，用于制備微生物或動植物組織、細胞等培養(yǎng)的培養(yǎng)基，是十分必要。
蠶絲蛋白為一種天然高分子蛋白，它的主要成分是絲膠和絲素，絲膠蛋白約占絲蛋白總量20~30％。在繅絲廠、絲織廠、絲綢練染廠等繅絲、練染、精練等加工生產過程中需要不同程度脫膠處理；在絲棉廠、絹紡廠或在絲素蛋白新功能材料的研究與開發(fā)中，必須完全或部分去除絲膠才能進行后續(xù)加工與處理。目前，在上述蠶絲生產與加工過程中，脫去的絲膠幾乎全部不回收，作為廢液全部排除，由于排放污水中蛋白質含量過高，流入河道將會大量消耗水中溶解氧，使水體喪失自凈能力，造成大量的環(huán)境污染和能源浪費。所以，如果在蠶絲加工過程中能高效地回收和利用絲膠，就能免除對環(huán)境的污染，將會產生巨大的經濟效益和社會效益。
由于絲膠中含有人體所必需的氨基酸含量高達17％以上，在組成絲膠的18種氨基酸中有8種是人體必需氨基酸。最近有研究表明腦脊髓星形細胞分泌的非必需氨基酸—絲氨酸和甘氨酸都是由神經膠質細胞產生的營養(yǎng)因子(Mitoma J et al，Neurosci Res30(2)195-199，1998；Mitoma J et al，J Biol Chem273(31)19363-19366，1998)，它促進培養(yǎng)的小腦神經元生存、樹突發(fā)生以及電生理發(fā)育(Furuya S et al，Porc Natl Acad Sci USA，97(21)11528-11533，2000)。絲膠蛋白中L-絲氨酸占氨基酸總量33.3％，而甘氨酸也含16.05％，這兩種氨基酸約占總量一半。因此，多攝取絲膠蛋白或絲膠水解產物可以提高人的記憶力、防止腦老化、預防癡呆癥等。研究表明絲膠及其絲膠水解產物具有美容、養(yǎng)顏的護膚、護發(fā)功能，抗氧化作用和酪氨酸酶活性抑制作用(日本特開昭10-140154，10-265403，歐洲專利0841065)，對皮炎(特開昭10-245345，11-193210)、皮膚癌、腸癌發(fā)生的有抑制作用(特開昭2000-256210)，還能促進腸胃對礦物營養(yǎng)的吸收與消化等(特開昭2000-312568)。而且，隨著研究的深入，將會發(fā)現(xiàn)絲膠肽或絲膠及其降解產物的許多未知生物功能。分子量較大的絲膠蛋白可用于合成纖維和天然纖維的紡織品衛(wèi)生功能性涂層整理，這種經絲膠涂層處理的紡織物，因纖維外層被絲膠被覆，可有效防止化學纖維與皮膚直接接觸，從而避免化學纖維對皮膚的不良刺激作用。應用這種新素材開發(fā)的紡織品有床上用品、連襪褲、內褲、汗衫、嬰兒內衣、尿布、尿不濕無紡布等。絲膠還可以與其它高分子材料混合或交聯(lián)制成功能性高分子材料或生物可降解材料。分子量較小的絲膠肽、小分子量低聚肽及其水解產物可以用于化妝品潤膚霜、潔面乳、洗面奶、沫浴露、洗發(fā)香波、護發(fā)素、護膚肥皂等，也可以用作醫(yī)用藥物、整腸劑、功能性保健食品、保健飲料等。但是，將絲膠用于微生物或動植物組織與細胞等培養(yǎng)，至今未見有關產品的面世和相關的研究報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種具有良好的生物相容性、安全性和微生物或動植物組織、細胞等培養(yǎng)效果，且成本較低、蛋白用量小的液體培養(yǎng)基。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案是，一種液體培養(yǎng)基，它以絲膠為氮源，碳源、無機鹽和水為主要組分。
還在于其氮源中包括蛋白胨；絲膠與蛋白胨以任何比例混合；所述的絲膠為水溶性絲膠肽及其水解產物。
采用本發(fā)明所述的技術方案，具有以下明顯的特點與有益效果1.本發(fā)明利用蠶絲的絲膠作為培養(yǎng)基氮源，由于絲膠蛋白與人體具有良好的生物相容性，因此，用于細菌、真菌等微生物或動植物組織、細胞的培養(yǎng)，安全可靠；2.本發(fā)明所利用的絲膠為水溶性絲膠肽或水溶性絲膠肽及其水解物，原料豐富，且可回收利用蠶絲加工過程中的絲膠，不僅降低了培養(yǎng)基的生產成本，而且能減少環(huán)境污染；3.在一般的概念中，替換培養(yǎng)基中的氮源，其效果應相差不大，而且，蛋白胨是目前經試驗證實使用效果較好而被廣泛選用的培養(yǎng)基氮源，但在本發(fā)明中，經改變培養(yǎng)基中的氮源，試驗證明，在不同用量、比例下，吸光度分別增加幾十倍至上百倍不等，獲得了意想不到的效果，因而，并發(fā)明具有很高的創(chuàng)造性；4.與以蛋白胨為氮源的普通細菌培養(yǎng)基相比，在本發(fā)明所述的含有絲膠的液體培養(yǎng)基中，絲膠用量大大減少，僅為蛋白胨十分之一，其細菌生長與增殖速度快，培養(yǎng)效果佳。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例一制備絲膠溶液以繭殼、繭衣、廢絲為原料，稱取1000g，先在溫水中漂洗除去雜質和塵埃，然后加入20～30倍量(V/W)的純水中浸漬，使繭衣或繭殼充分膨潤后，置于高溫高壓鍋中在120℃(2個大氣壓)處理5～120min，取出脫膠后的生絲用熱水反復沖洗，合并洗滌液和脫膠液。接著將這種高溫脫膠液繼續(xù)用0.5～3.0N鹽酸進行絲膠降解處理，取出降解絲膠液用NaOH調節(jié)pH為7.0，過濾，即得淡黃色的絲膠及其水解物，經凝膠電泳分析，分子量在6萬以下，將這種絲膠溶液稱為S1絲膠及其水解物。將上述絲這種絲膠溶液噴霧干燥(塔底溫度穩(wěn)定在70～80℃，塔頂溫度調整至120℃左右)制成S1水溶性絲膠蛋白粉末。
制備液體培養(yǎng)基用S1水溶性絲膠蛋白粉末1克、牛肉膏3.0克、NaCl5.0克，用去離子水定容至1000ml，pH值為7.0～7.2，即制得本發(fā)明所述的以絲膠為氮源的培養(yǎng)基。
實施例二將上述實施例一中獲得的高溫脫膠液用1.0～6.0N鹽酸進行絲膠降解處理一定時間，取出絲膠降解液用NaOH調節(jié)pH為7.0，過濾，即得黃色的絲膠肽及其水解物液體，經同樣凝膠電泳分析其分子量在2萬以下，制得絲膠蛋白溶液，經噴霧干燥，制成水溶性絲膠蛋白粉末，將它稱為S2絲膠蛋白粉末。
制備液體培養(yǎng)基取S2絲膠蛋白粉末5克、蛋白胨5克、牛肉膏3.0克、NaCl5.0克，用去離子水定容至1000ml，pH值為7.0～7.2，即制得本發(fā)明所述的以絲膠為氮源的培養(yǎng)基。
實施例三將上述實施例二中所獲得的絲膠蛋白溶液S2注入到截留分子量10k的透析袋中，用蒸餾水流動透析后，過濾去除雜質，即得無游離氨基酸的絲膠肽溶液(MW≤20k)，經噴霧干燥，制成水溶性絲膠蛋白粉末，將它稱為S3絲膠蛋白粉末。
制備液體培養(yǎng)基取S3絲膠蛋白粉末0.75克、蛋白胨0.25克、牛肉膏3.0克、NaCl5.0克，用去離子水定容至1000ml，pH值為7.0～7.2，即制得本發(fā)明所述的以絲膠為氮源的培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述的技術方案，通過以上實施例做出了進一步闡述，三個實施例分別闡述了制備分子量范圍不同的三種絲膠蛋白S1、S2和S3，用于細菌培養(yǎng)試驗。經實驗和測試，效果由表1、表2和表3提供的數據加以證明。
表1是蛋白互補型培養(yǎng)基細菌試驗；表2是二種蛋白等量混合、總量降低型培養(yǎng)基細菌試驗結果；表3是蛋白總量降低型培養(yǎng)基細菌試驗結果。
試驗中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)液，被稱為普通細菌培養(yǎng)液。培養(yǎng)液成分為蛋白胨10克，牛肉膏3.0克，NaCl5.0克，用去離子水定容至1000ml，pH值為7.0～7.2。
按試驗要求配制好的培養(yǎng)液裝入試管，每管5ml，1.05kg/cm2，121.3℃蒸汽滅菌20分鐘。
革蘭氏陽性菌大腸桿菌(Escherichia coli)、革蘭氏陰性菌枯草桿菌(Bacillus subtilis)和靈菌(Serratia marcescens)用普通細菌培養(yǎng)液37℃振動培養(yǎng)18～20h后，取0.1ml培養(yǎng)液加入5ml無菌水配成菌懸液備用。
每一個試驗組設試驗區(qū)3個(接3種菌)，每區(qū)重復3次，每組以不接菌培養(yǎng)液作空白對照實驗。滅菌后的培養(yǎng)液在無菌條件下，用無菌的移液器取試驗用菌懸液定量加入試管進行接種，接種大腸桿菌和枯草桿菌的培養(yǎng)液36℃振蕩培養(yǎng)24小時，而接種靈菌培養(yǎng)液用25℃水浴振蕩培養(yǎng)24小時。按文獻報道的方法(范秀容等，微生物學實驗(第二版)，1989年)，用日立U-3000分光光度計測定各種樣品在560nm的吸光度值。
參見表1，在蛋白互補型培養(yǎng)基細菌試驗中，加入蛋白是蛋白胨和分子量不同的絲膠蛋白即，加入蛋白總量為10克，在細菌培養(yǎng)試驗時，絲膠蛋白(分別用S1、S2和S3)按不同比例代替蛋白胨，觀察細菌培養(yǎng)的情況。可以發(fā)現(xiàn)，三種菌無論是大腸桿菌、枯草桿菌，還是靈菌，都隨著培養(yǎng)基中絲膠蛋白的增加(蛋白胨減小)而增殖明顯，但各細菌間的增殖強弱在不同絲膠濃度下表現(xiàn)不同。如枯草桿菌和靈菌的增殖與生長隨著絲膠蛋白含量的增加(而蛋白胨含量減少)而大大提高，其吸光度增加50～100倍之多。而大腸桿菌在全絲膠培養(yǎng)基中的生長也遠遠大于全蛋白胨(無絲膠蛋白)培養(yǎng)基，不過，這種細菌在絲膠蛋白和蛋白胨定量加入而培養(yǎng)基中增殖情況最佳。不管怎樣，絲膠培養(yǎng)基中三種細菌的增殖與生長遠遠大于普通的蛋白胨培養(yǎng)基。
從表1可以發(fā)現(xiàn)，MW≤20k絲膠及其水解物(S2)以不同比例代替蛋白胨后，細菌在培養(yǎng)液中的增殖與生長情況相似，三種菌在添加絲膠蛋白的培養(yǎng)基中的增殖與生長較無絲蛋白的全蛋白胨培養(yǎng)液要好得多，但它們在添加S2絲膠蛋白的培養(yǎng)基中增殖與生長趨勢與上述S1稍有差異，其增殖與生長趨勢相同，即都是在各含絲膠蛋白2.5克、5.0克或7.5克和蛋白胨7.5克、5.0克或2.5克的培養(yǎng)液中生長最佳。其中大腸桿菌的吸光度增加100多倍，枯草桿菌和靈菌也增加30倍以上。
當上述S2絲膠肽及其水解物經過透析，去除小分子肽和游離氨基酸后剩下的分子量為10～20Kda絲膠肽(S3)，以不同比例替代蛋白胨加入到培養(yǎng)液中進行了細菌培養(yǎng)試驗，結果同樣由表1所示。這三種菌的增殖與生長趨勢與S2情況相似。大腸桿菌的增殖在含有2.5克和5.0克絲膠肽蛋白胨的液體培養(yǎng)液中最高，枯草桿菌的增殖在含有7.5克、5.0克和2.5克絲膠肽液體培養(yǎng)液中最高。
三種細菌在全絲膠培養(yǎng)液中的增殖與生長都大大優(yōu)于無絲膠的蛋白胨液體培養(yǎng)液，其中，分子量較大的絲膠蛋白培養(yǎng)液中細菌的生長優(yōu)于分子量較小的絲膠蛋白培養(yǎng)液，在分子量較小的絲膠蛋白培養(yǎng)液中，細菌在經過透析去除游離氨基酸的S3培養(yǎng)液中增殖速度要比含游離氨基酸的S2慢。這三種細菌在無絲膠蛋白的培養(yǎng)液中生長都很慢，而在含絲膠蛋白與蛋白胨相同比例或更高比例的培養(yǎng)液中生長最好，其增殖速度最快，其培養(yǎng)液吸光度要高出無絲膠培養(yǎng)液100多倍。
參見表2，它是二種蛋白等量混合、總量降低型培養(yǎng)基細菌試驗的結果數據表，為了確定絲膠蛋白部分替換蛋白胨作為普通培養(yǎng)基主要成分對細菌生長與增殖的影響究竟有多大，采用以等量加入、二者總量降低2、4和10倍的方式進行試驗。試驗中，標準培養(yǎng)基配方為1000mL中含蛋白胨10g，樣品培養(yǎng)基以胨蛋白和絲膠蛋白(分別用S1、S2和S3)等量加入，二者之和為蛋白總量。
由表2可知，無論培養(yǎng)基中添加S1，還是S2或S3，無論蛋白總量降低2倍、4倍甚至降低10倍，無論進行哪種細菌培養(yǎng)，其培養(yǎng)液的吸光度都比對照培養(yǎng)基高得多。其中蛋白總量降低10倍的培養(yǎng)基菌液吸光度都至少是對照組2倍以上。也就是說，在普通培養(yǎng)基中加入絲膠蛋白及其水解物以后，其加入蛋白總量可下降10倍，即原來1000mL中蛋白胨量10g，現(xiàn)在只需蛋白胨和絲膠各加入0.5g，細菌培養(yǎng)的效果還能比原有培養(yǎng)基好。
參見表3，它是蛋白不定量混合、蛋白總量降低型培養(yǎng)基細菌試驗的結果，標準培養(yǎng)基配方為1000mL中含蛋白胨10g，樣品培養(yǎng)基中加入蛋白種類和總量表示絲膠和蛋白胨量以3∶1比例或全絲膠替換原蛋白胨，且總量降低10倍。從表3中可以發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中無論添加全絲膠還是絲膠與蛋白胨(3∶1)混合物，也不論添加絲膠的分子量范圍大小，當蛋白總量降低10倍后，三種細菌在培養(yǎng)基中的生長與增殖速度均比原蛋白胨培養(yǎng)基快。其中大腸桿菌的生長與增殖速度略優(yōu)于對照培養(yǎng)基；靈菌高于對照組2倍以上；而枯草桿菌高于對照組7倍以上。所以，在普通培養(yǎng)基中絲膠蛋白或絲膠與蛋白胨混合物(3∶1)完全可以以低10倍的量替代蛋白胨用于各種細菌培養(yǎng)，其效果比原有培養(yǎng)基還好。
我國是產絲大國，在蠶桑、繅絲和紡織生產中有大量的水溶性絲膠及其水解產物可以制備和回收，并加以利用。本發(fā)明證實水溶性絲膠或水溶性絲膠及其水解物具有十分豐富的營養(yǎng)價值，能促進各種細菌的快速生長與增殖。特別適用于作為新配方培養(yǎng)基的主要氮源加以利用，完全可以替代目前常規(guī)液體培養(yǎng)基中大量使用的蛋白胨或酪蛋白等氮源，應用于現(xiàn)代生物工程中細菌發(fā)酵、實驗室培養(yǎng)基等領域。這項發(fā)明不僅大大降低培養(yǎng)基的成本，提高微生物培養(yǎng)的效率。而且大大拓寬了絲膠蛋白的應用范圍，將具有明顯經濟效益；由于蠶絲加工過程中絲膠的回收利用而消除或減小了環(huán)境污染，具有重要的社會效益，促進了蠶絲業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
表1蛋白互補型培養(yǎng)基細菌試驗

表2二種蛋白等量混合、總量降低加入培養(yǎng)基后細菌試驗

a)標準培養(yǎng)基配方即1000mL中含蛋白胨10g；b)指樣品培養(yǎng)基中胨蛋白和絲膠以等量加入，二者之和稱為蛋白總量。
表3蛋白總量降低型培養(yǎng)基細菌試驗

a)標準培養(yǎng)基配方即1000mL中含蛋白胨10g。
權利要求
1.一種微生物或動植物組織或細胞液體培養(yǎng)基，它由氮源、碳源、無機鹽和水為主要組分組成，其特征在于所述氮源中包括有絲膠。
2.根據權利要求1所述的液體培養(yǎng)基，其特征在于所述氮源中還包括蛋白胨。
3.根據權利要求2所述的液體培養(yǎng)基，其特征在于所述氮源中絲膠與蛋白胨可以任何比例混合。
4.根據權利要求1或2所述的液體培養(yǎng)基，其特征在于所述的絲膠為水溶性絲膠肽或水溶性絲膠肽及其水解物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于細菌、真菌等微生物培養(yǎng)或動植物組織、細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，特別涉及一種以絲膠為氮源的培養(yǎng)基。它以繭殼、繭衣、廢絲經脫膠處理后制得的絲膠蛋白為氮源，碳源、無機鹽和水為主要組分配制而成。該培養(yǎng)基不僅具有良好的生物相容性、安全性、蛋白用量少的特點，而且能促進各種微生物或動植物組織、細胞的快速生長與增殖，效果明顯，適用于現(xiàn)代生物工程中細菌發(fā)酵、實驗室培養(yǎng)基等領域。
文檔編號C12N1/00GK1443840SQ0311325
公開日2003年9月24日 申請日期2003年4月17日 優(yōu)先權日2003年4月17日
發(fā)明者張雨青, 沈衛(wèi)德, 毛建萍, 丁悅, 馬燕, 周文林 申請人:蘇州大學