專利名稱：一種含人源導(dǎo)向溶栓抗體基因的大腸桿菌及其分泌產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含人源抗D-二聚體的特異性導(dǎo)向溶栓抗體基因的大腸桿菌及其分泌產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
溶解血栓，恢復(fù)血流通暢是治療急性心肌梗死和腦梗塞等血管栓塞性疾病的最有效的方法。組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、尿激酶(Urokinase，UK)是臨床常用的高效溶栓藥。但人體其它部位組織細(xì)胞存在較多的t-PA結(jié)合受體，可降低循環(huán)中t-PA的濃度，使其治療作用減弱。而加大用藥劑量，不僅治療成本提高，而且大劑量的t-PA或UK亦能激活循環(huán)血中的纖溶酶原，降解循環(huán)血中的纖維蛋白、α2-抗纖溶酶、凝血因子V、VIII及血小板GP IIb/IIIa受體復(fù)合物等凝血物質(zhì)，造成全身性出血傾向。近年來也有不少文獻(xiàn)資料報道導(dǎo)向溶栓，但其療效并不令人滿意，主要存在以下幾個方面的缺陷(1)在血栓靶向標(biāo)志物的選擇上多以纖維蛋白為主，而纖維蛋白β-鏈N端的特異性抗原決定區(qū)在溶栓早期隨纖維蛋白的聚合而部分遮蔽或喪失，降低了纖維蛋白單體的靶向性。(2)制備單克隆抗體所采用的細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，抗體生產(chǎn)的穩(wěn)定性差。(3)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體多為鼠源性，分子量大，對人具有免疫原性，降低溶栓效果，甚至可導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。(4)導(dǎo)向制劑多采用化學(xué)交聯(lián)方法連接特異性單克隆抗體與溶栓劑，其化學(xué)交聯(lián)的化學(xué)修飾作用可降低抗體與血栓部位的結(jié)合，并導(dǎo)致溶栓劑活性降低。因此，研究一種新型的溶栓藥物的導(dǎo)向劑就十分必要。
D-二聚體(D-Dimer，DD)在血栓形成過程中一直與血栓的核心相連，其抗原性不被遮蔽，是已交聯(lián)纖維蛋白降解形成的γ-γ鏈為主的纖維蛋白特異性降解產(chǎn)物，為纖維蛋白降解產(chǎn)物中的最小片段，在正常人血中基本無此物，是唯一直接反映凝血酶和纖溶酶生成的理想指標(biāo)，當(dāng)纖溶作用增強時血中才會大量出現(xiàn)，其含量的增高表明機體的凝血和纖溶系統(tǒng)的雙重相繼激活。因此D-二聚體可作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和繼發(fā)纖溶亢進(jìn)的分子標(biāo)志物之一。
噬菌體展示技術(shù)(phage display)的出現(xiàn)得益于用PCR的方法人為地設(shè)計一組引物擴增全套免疫球蛋白可變區(qū)基因，以及在大腸桿菌中表達(dá)并分泌出具有識別、結(jié)合抗原能力的免疫球蛋白分子的成功。20世紀(jì)80年代以來，噬菌體展示技術(shù)經(jīng)Dullbeclo提出并在隨后的時間里被廣泛應(yīng)用，成為一項制備特異性抗體的新方法，是一種基因表達(dá)篩選技術(shù)。它提供了一條從抗體庫中分離目的基因的有效手段，并可將目的基因克隆在特定表達(dá)載體中，使外源基因產(chǎn)物與外殼蛋白融合，展示在絲狀噬菌體表面?？梢岳@過雜交瘤途徑，甚至不經(jīng)過免疫制備具有診斷和治療價值的人源單克隆抗體，在新型藥物設(shè)計、研制導(dǎo)向轉(zhuǎn)移系統(tǒng)方面，具有廣闊的應(yīng)用前景。
pComb3H是專用于表達(dá)抗體基因的質(zhì)粒。噬菌體pComb3H質(zhì)粒有氨芐青霉素抗性基因。pComb3H通常在大腸桿菌XL1-Blue中表達(dá)。噬菌體的Fd-PIII融合蛋白基因被翻譯成蛋白后通過pelB先導(dǎo)序列被導(dǎo)入細(xì)菌的細(xì)胞膜間隙，重鏈Fd通過與PIII融合鑲嵌在膜上，而輕鏈通過ompA被引導(dǎo)入膜間隙，而細(xì)胞膜間隙又有良好的氧化環(huán)境，使重鏈和輕鏈得以形成良好穩(wěn)定的二硫鍵而組成有功能的Fab，由于噬菌體感染細(xì)菌后其外殼蛋白的合成也是通過上述類似途徑，致使功能性的Fab抗體可組裝在噬菌體表面。
技術(shù)內(nèi)容為了解決溶栓藥物的導(dǎo)向性問題，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生人源抗D-二聚體的特異性導(dǎo)向溶栓抗體的大腸桿菌，其特征在于通過半套式PCR方法將人抗體的重鏈基因和輕鏈基因連入噬菌體質(zhì)粒pComb3H形成重組噬菌體質(zhì)粒pComb3H-HL，重組噬菌體質(zhì)粒pComb3H-HL在輔助噬菌體VCSM13的超感染下構(gòu)建成噬菌體抗體組合文庫；經(jīng)ELISA方法篩選出抗人纖維蛋白降解產(chǎn)物D-二聚體的特異株。
為了獲得人源導(dǎo)向溶栓抗體。首先經(jīng)PCR擴增出人免疫球蛋白基因分離人外周血中的淋巴細(xì)胞，用TRIZOL溶液提取細(xì)胞總RNA，用于cDNA的合成。擴增引物參照Kang等報道的序列加以改動進(jìn)行第一次PCR，用4組Fd前導(dǎo)肽引物與8組重鏈可變區(qū)3’端引物配對組成32對引物，Kappa鏈可變區(qū)前導(dǎo)肽引物與Kappa鏈可變區(qū)3’端引物配對，Lambda鏈可變區(qū)前導(dǎo)肽引物與Lambda鏈可變區(qū)3’端引物配對。
第一次PCR引物●人源重鏈Fd引物1)重鏈可變區(qū)前導(dǎo)肽引物506-15’-ATG GAC TAA ACC TGG AGG (A/G)TC (C/T)TC T(G/T)C-3’506-25’-ATG GAG (C/T)TT GGG CTG A(G/C)G TGG (G/C)TT T(C/T)T-3’506-35’-ATG(A/G)A(A/C) (A/C)(A/T)A CT(G/T) TG(G/T) (A/T)(G/C/T)C (A/T)(C/T)(G/C)CT(C/T)C(C/T)G-3’
2)重鏈可變區(qū)3’端引物CA1 5’-AGT TGAACT AGTTGG GCA GGG CAC AGT CAC-3’CE1 5’-GCT GAAACT AGTTTT GTC GAC CCA GTC TGT GGA-3’CD1 5’-TGC CTTACT AGTCTC TGG CCA GCG GAA GAT-3’CG4A5’-GCA TGAACT AGTTGG GGG ACC ATA TTT GGA-3’CG2A5’-CTC GACACT AGTTTT GCG CTC AAC TGT CTT-3’CG3A5’-TGT GTGACT AGTGTC ACC AAG TGG GGT TTT-3’CG1Z5’-GCA TGTACT AGTTTT GTC ACA AGA TTT GGG-3’CM1 5’-GCT CACACT AGTAGG CAG CTC AGG AAT CAC-3’●人源輕鏈引物3)Kappa鏈可變區(qū)前導(dǎo)肽引物506-45’-ATG GAC ATG (AG)(AG)(AG) (AGT)(CT)C C(ACT)(AGC) G(CT)(GT) CA(GC) CTT-3’4)Kappa鏈可變區(qū)3’端引物Ck1Z5’-GCG CCGTCT AGAACT AAC ACT CTC CTC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG ATC TCA G-3’5)Lambda鏈可變區(qū)前導(dǎo)肽引物507-15’-ATG (TG)CC TGG (AT)C(CT) CCT CTC (CT)T (CT) CT(CG) (AT)(CT)C-3’6)Lambda鏈可變區(qū)3’端引物CLZ5’-CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’取第一次PCR產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二次擴增，用5組重鏈可變區(qū)5’端引物與8組重鏈可變區(qū)3’端引物配對組成40對重鏈引物，用2組Kappa鏈可變區(qū)5’端引物與Kappa鏈可變區(qū)3’端引物配對組成兩對Kappa鏈引物，用8組Lambda鏈可變區(qū)5’端引物與Lambda鏈可變區(qū)3’端引物配對組成8對Lambda鏈引物。重鏈可變區(qū)5’端引物中含有XhoI酶切位點(CTCGAG)，重鏈可變區(qū)3’端引物含有SpeI酶切位點(ACTAGT)，輕鏈可變區(qū)5’端引物含有SacI酶切位點(GAGCTC)，輕鏈可變區(qū)3’端引物含有XbaI酶切位點(TCTAGA)。
第二次PCR引物●人源重鏈Fd引物1)重鏈可變區(qū)5’端引物VH13A 5’-AG GTG CAGCTC GAG(C/G)AG TCT GGG-3’H58 5’-CAG GTA CAG CTGCTC GAGTCA GGT CCA-3’VH134F5’-AG GTG CAG CTGCTC GAGTC(T/G) GG-3’VH4FG 5’-CAG GTG CAG CT(A/G)CTC GAGTCT GG-3’
VH6A5’-CAG GTA CAGCTC GAGCAG TCA GG-3’2)重鏈可變區(qū)3’端引物CA1 5’-AGT TGAACT AGTTGG GCA GGG CAC AGT CAC-3’CE1 5’-GCT GAAACT AGTTTT GTC GAC CCA GTC TGT GGA-3’CD1 5’-TGC CTTACT AGTCTC TGG CCA GCG GAA GAT-3’CG4A5’-GCA TGAACT AGTTGG GGG ACC ATA TTT GGA-3’CG2A5’-CTC GACACT AGTTTT GCG CTC AAC TGT CTT-3’CG3A5’-TGT GTGACT AGTGTC ACC AAG TGG GGT TTT-3’CG1Z5’-GCA TGTACT AGTTTT GTC ACA AGA TTT GGG-3’CM1 5’-GCT CACACT AGTAGG CAG CTC AGG AAT CAC-3’●人源輕鏈引物3)Kappa鏈可變區(qū)5’端引物HK535’-GAT ATTGAG CTCACT CAG TCT CCA-3’VK1S5’-GAC ATCGAG CTCACC CAG TCT CC-3’4)Kappa鏈可變區(qū)3’端引物HK35’-GCG CCGTCT AGAACT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG ATC TCA G-3’5)Lambda鏈可變區(qū)5’端引物HL51 5’-AAT TTTGAG CTCACT CAG CCC CAC-3’HL53 5’-TCT GTGGAG CTCCAG CCG CCC TCA GTG-3’HL56 5’-CAG TCTGAG CTCACT CAG GAG CCC-3’VL5.75’-CAG (G/T)(C/T)TGAG CTCAC(G/T) CA(A/G) CCG CCC-3’VL1GP5’-AAT TTTGAG CTCACT CAG CCC CCC TCT GTG TC-3’VL2 5’-TCT G(A/C/T)(A/C/G)GAG CTCCAG (C/G)(A/C)(C/G/T) (C/G)C(C/T) (G/T)(C/T)(A/C/T)GTG-3’VL5.85’-CAG(A/G/T)CTGAG CTCACGCAG(C/G)(A/C)G(C/T)C(C/T)TCC-3’VL2.35’-TCT G(C/T)(C/G)GAG CTCCAG CC(T/G)(C/G)CC TC(A/C)GTG-3’6)Lambda鏈可變區(qū)3’端引物HL35’-CGC CGT CTA GAA CTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’含有人免疫球蛋白重鏈基因和輕鏈基因的噬菌體質(zhì)粒pComb3H-HL的構(gòu)建。輕鏈擴增產(chǎn)物經(jīng)SacI-XbaI雙酶切，pComb3H也經(jīng)SacI-XbaI雙酶切，T4DNA連接酶連接輕鏈基因和pComb3H，構(gòu)成pComb3H-L。重鏈擴增產(chǎn)物經(jīng)XhoI-SpeI雙酶切，pComb3H-L也經(jīng)XhoI-SpeI雙酶切，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)成pComb3H-HL。
富集篩選抗人纖維蛋白降解產(chǎn)物D-二聚體的pComb3H-HL噬菌體株。用pH9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液包被D-二聚體，噬菌體抗體庫吸附在上，經(jīng)吹打?qū)⑽讲簧匣蛭讲痪o的噬菌體抗體吸走，分別用pH2.2的甘氨酸-鹽酸洗脫緩沖液和Tris溶液洗脫并中和吸附緊密的噬菌體抗體，加入大腸桿菌XL1-Blue孵育1小時，再加入輔助噬菌體VCSM13培養(yǎng)，利用噬菌體的可增殖性擴增對D-二聚體特異的噬菌體抗體。
用pComb3H-HL/XL1-Blue系統(tǒng)表達(dá)抗體。用SpeI-NheI雙酶切將geneIII基因及其后的終止子切去，利用SpeI和NheI是同裂酶的關(guān)系，用連接酶將線性質(zhì)粒連接成環(huán)，并在大腸桿菌XL1-Blue中表達(dá)，由于缺少了geneIII基因，不能表達(dá)PIII蛋白，噬菌體無法組裝，只能表達(dá)出抗體的重鏈片段和輕鏈片段，這兩個片段被引導(dǎo)肽引導(dǎo)入胞質(zhì)周間裝配成Fab。
經(jīng)過ELISA和Western blotting驗證，從噬菌體抗體庫中篩選及在大腸桿菌中表達(dá)的抗體確對人纖維蛋白降解產(chǎn)物D-二聚體具有抗性和特異性。
上述含pComb3H-HL的大腸桿菌已交“中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)”保藏，保藏號CCTCC NOM203009綜上所述，本發(fā)明獲得了一種人源導(dǎo)向溶栓抗體，該抗體對人纖維蛋白降解產(chǎn)物D-二聚體具有特異性結(jié)合能力。因此，該抗體能與溶栓藥物結(jié)合，將溶栓藥物專一引導(dǎo)到血栓上，集中發(fā)揮溶栓藥物的功效，避免了藥物的無效釋放，是一種高效的溶栓導(dǎo)向劑。具有極高的臨床應(yīng)用價值。
上述工程菌能分泌含以下人源抗體輕鏈氨基酸序列，其特征在于S V S E S P G K T V T I S C TG S S G S I A S N Y V Q W Y RQ R P G S A P T T V I Y E D NQ R P S G V P D R F S G S I DS S T N S A S L T I S G L K TE D E A D Y Y C Q S Y D S S NW V F G G G T K L T V L G Q PK A A P S V T L F P P S S E EL Q A N K A T L V C L I S D FY P G A V T V A W K A D S S PV K A G V E T T T P S K Q S NN K Y A A S S Y L S L T P E QW E S H K S Y S C Q V T H E GS T V E K T V A上述人源導(dǎo)向溶栓抗體的輕鏈的基因序列，其特征在于TCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGTAACCATCTCCTGCACCGGCAGCAGTGGCAGCATTGCCAGCAACTATGTGCAGTGGTACCGGCAGCGCCCGGGCAGTGCCCCCACCACTGTGATCTATGAGGATAACCAAAGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCACCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGAAGACTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATAGCAGCAATTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACGGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCC
GTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGGAGTCCCACAAAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCC上述工程菌能分泌含以下人源抗體重鏈氨基酸序列，其特征在于E S G G G V V Q P G R S L R LS C A A S G F T F S S Y A M SW V R Q A P G K G L E W V S AI S G S G G S T Y Y A D S V KG R F T I S R D N S K N T L YL Q M D S L R A E D T A V Y YC A K P H G R Y Y D S S G Y RT Y F D Y W G Q G T L V T V SS G S A S A P T L F P L V S CE N S P S D T S S V A V G C LA Q D F L P D S I T F S W K YK N N S D I S S T R G F P S VL R G G K Y A A T S Q V L L PS K D V M Q G T D E H V V C KV Q H P N G N K E K N V P L PV I A E L P上述人源導(dǎo)向溶栓抗體的重鏈的基因序列，其特征在于GAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGGCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAGCCCCACGGGCGATACTATGATAGTAGTGGTTATCGAACCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGTGAGAATTCCCCGTCGGATACGAGCAGCGTGGCCGTTGGCTGCCTCGCACAGGACTTCCTTCCCGACTCCATCACTTTCTCCTGGAAATACAAGAACAACTCTGACATCAGCAGCACCCGGGGCTTCCCATCAGTCCTGAGAGGGGGCAAGTACGCAGCCACCTCACAGGTGCTGCTGCCTTCCAAGGACGTCATGCAGGGCACAGACGAACACGTGGTGTGCAAAGTCCAGCACCCCAACGGCAACAAAGAAAAGAACGTGCCTCTTCCAGTGATTGCAGAGCTGCCT


圖1重組質(zhì)粒pComb3H-HL結(jié)構(gòu)示意2人Kappa鏈片段PCR電泳圖實施方案本發(fā)明通過以下實施例進(jìn)一步闡述。
淋巴細(xì)胞的分離純化和細(xì)胞總RNA的提取抽取人外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，按照常規(guī)方法提取細(xì)胞總RNA。用無RNAase的純水重懸RNA，置于冰浴用于cDNA合成或置-70℃保存。(注病人和正常人的血液分別各自混合，提取總RNA)將上述從淋巴細(xì)胞提取的RNA5ul置于無RNAase的Eppendorf管中，組成如下體系Oliga(dT) 1μlRNA5μlDEPC處理水 4μl將Eppendorf管置于65℃5min，然后置冰浴。在用前將cDNA合成緩沖液振蕩5s。制備以下反應(yīng)體系5×cDNA合成緩沖液 4μl0.1M DTT 1μlRNAase抑制劑 1μlDEPC處理水1μl10mM dNTP Mix 2μl反轉(zhuǎn)錄酶THERMOSCRIPTRT 1μltotal 10μl將上述反應(yīng)混合液加到每個置冰浴的RNA引物混合管中，置50℃ 20～50分鐘。置85℃5分鐘終止反應(yīng)。瞬時離心，加1μlRNAaseH于每個反應(yīng)管中，37℃反應(yīng)20分鐘。馬上用于PCR或-20℃長期保存。
半套式PCR擴增Fab抗體基因分別采用病人與正常人的cDNA為模板，用上述第一次PCR引物擴增。程序如下94℃變性5min后，加入TaqDNA聚合酶，再94℃變性1min，熱降落55℃～45℃退火1min，72℃延伸1min，10個循環(huán)后，再94℃變性1min，48℃退火1min，72℃延伸1min，15個循環(huán)后，72℃延伸5min。
反應(yīng)體系如下
信號肽端引物 0.5μl3’端引物0.5μl10×PCR緩沖液 2μldNTPs 1μl去離子水 14μlcDNA 1μlTaq酶 1μlTotal 20μl取上述制備的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)前先在94℃變性5min，然后加入TaqDNA聚合酶，再94℃變性1min，熱降落62℃～50℃退火1min，72℃延伸1min，12個循環(huán)后，再94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，20個循環(huán)后，72℃延伸5min。
反應(yīng)體系如下5’端引物 1μl3’端引物 1μl10×PCR緩沖液 5μldNTPs 1μl去離子水 40μlcDNA 1μlTaq酶 1μlTotal50μl取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果表明均獲得～700bp的目的條帶(圖2所示為人抗體Lambda鏈片段PCR產(chǎn)物電泳圖，“1～8”分別為引物對HL3/HL51、HL3/HL53、HL3/HL56、HL3/VL5.7、HL3/VL1GP、HL3/VL2、HL3/VL5.8和HL3/VL2.3的PCR產(chǎn)物，“9”為陰性對照，“10”為100bp Marker)噬菌體抗體庫的構(gòu)建將載體pComb3H DNA和經(jīng)過純化的輕鏈PCR產(chǎn)物分別用Xba I和Sac I酶切，T4DNA連接酶連接，16℃12～16小時。電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌XL1-Blue，于SOC培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。取1μl培養(yǎng)液分別稀釋100倍、1000倍涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB平板，以檢測轉(zhuǎn)化效率。其余菌液轉(zhuǎn)入10mlSB(含Amp20μg/ml)培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時。加入140ml SB(含有Amp100μg/ml)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日提取重組質(zhì)粒pComb3H-L DNA，進(jìn)行以下操作1.鑒定插入效率。隨機挑取20個克隆，用菌落PCR法鑒定重組率在超凈臺中用滅菌牙簽從37℃過夜的LB平板上隨機挑取20個菌落，混入含已配好的20μlPCR反應(yīng)體系中，94℃變性5min，再94℃30s，54℃40s，72℃50s，35個循環(huán)后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物在新鮮的TAE緩沖液中用2％的瓊脂糖凝膠電泳，擴增出680bp左右的片段者，為重組克隆。鑒定輕鏈重組率的引物5’端 5’-GGC TGG TTT CGC TAC CGT GGC CCA G-3’3’端 5’-GCT GCC GTA GGC AAT AGG TAT TTC A-3’鑒定重鏈重組率的引物5’端 5’-CTG CCC AAC CAG CCA TGG CCG AAG-3’3’端 5’-CCT CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG-3’2.重鏈基因的克隆及噬菌體抗體庫的建立。將上述經(jīng)過純化的重鏈Fd PCR產(chǎn)物和含有輕鏈基因的pComb3H-L分別進(jìn)行Xho I和Spe I酶切反應(yīng)。連接、轉(zhuǎn)化以及鑒定方法同上。得到重組質(zhì)粒pComb3H-HL(圖1)。
噬菌體抗體庫的富集篩選將D-二聚體用0.1mmol/l碳酸鈉-碳酸氫鈉(PH9.6)溶液稀釋為10μg/ml，每孔50μl，4℃過夜。次日洗去板中未吸附抗原，用3％BSA-PBS 37℃封閉1小時。棄封閉液，在每孔中加入70μl噬菌體抗體庫，37℃孵育2小時。棄孔中未結(jié)合噬菌體，用TBS/Tween 20溶液洗每一孔，共洗10次，可用帶有吸頭的移液器反復(fù)吹打每孔，但切勿過度。用蒸餾水洗兩遍，將每孔中的液體吸干。每孔加入50μl甘氨酸-鹽酸(pH2.2)洗脫緩沖液，室溫孵育10分鐘，在此期間用移液器吸頭反復(fù)吹打每孔，注意切勿吹出過多氣泡。加入3～5μl 2mol/lTris，使溶液的pH值在7左右，以中和洗脫下來的噬菌體溶液。立即加入2ml新鮮制備的約OD600＝0.7～1.3的E.coli XL1-Blue菌，室溫孵育15～20分鐘。轉(zhuǎn)入一200ml三角瓶中，加入含20μg/ml氨芐青霉素、10μg/ml四環(huán)素的SB培養(yǎng)基，立即取1μl，0.1μl，0.01μl涂LB氨芐平皿以滴定洗脫下來的噬菌體，其余部分加入100ml含100μg/ml氨芐青霉素，10μg/ml四環(huán)素的SB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)1小時。加入1012pfu的輔助噬菌體VCSM13，37℃振蕩培養(yǎng)2小時。加入卡那霉素70μg/ml，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。重復(fù)以上富集篩選步驟二輪。經(jīng)二輪富集篩選后，將洗脫下來的噬菌體感染新鮮制備的感受態(tài)XL1-Blue菌，37℃過夜培養(yǎng)后，保存長有單個菌落的平皿于4℃待用。
抗D-二聚體單克隆抗體的制備最后一次富集后洗脫下來的噬菌體感染新鮮制備的感受態(tài)XL1-Blue菌，37℃過夜培養(yǎng)后，在長有單個菌落的平皿上挑取60個菌落，接種到2ml含100μg/ml氨芐青霉素，10μg/ml四環(huán)素的SB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。次日以150接種于10ml含100μg/ml氨芐青霉素，10μg/ml四環(huán)素的SB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD＝0.1～0.5，加入輔助噬菌體，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。次日離心取上清，即為噬菌體抗體。將上清用4％PEG8000和3％Nacl濃縮為200μl，存放于-20℃?？笵-二聚體噬菌體抗體的篩選按購自Amersham phamacia公司的重組噬菌體抗體鑒定試劑盒說明書進(jìn)行。
Fab抗體在原核細(xì)胞中的可溶性表達(dá)經(jīng)上述富集篩選后的陽性克隆，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA并測定DNA濃度。取1μg質(zhì)粒DNA，經(jīng)SpeI和NheI酶切消化，電泳純化消化后的單一條帶，分子量約4700bp。重懸DNA于無菌水中，加2U連接酶及相應(yīng)連接緩沖液，在總量20μl體系中，16℃連接過夜。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌XL1-Blue。挑取單個菌落，培養(yǎng)擴增后提取質(zhì)粒DNA，檢測geneIII基因是否被切除用XhoI和NotI雙酶切，應(yīng)切出約700bp的片段，如geneIII基因仍存在，則切出約1200bp的片段。取上述陽性菌種10μl接種入4mlSB培養(yǎng)液(含100μg/ml氨芐青霉素)，37℃過夜培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種于50mlSB培養(yǎng)液(含100μg/ml氨芐青霉素)，37℃振蕩培養(yǎng)至OD＝0.1～0.3。加入1mmol/L IPTG，置30℃振蕩培養(yǎng)約10～12小時。4000r/min 4℃離心15分鐘。棄上清，用1/10體積PBS(pH7.4)重懸細(xì)菌沉淀，超聲破碎，程序設(shè)置為功率300W，超聲4s，間歇4s，重復(fù)99次為1循環(huán)，共2～3循環(huán)。10000r/min 4℃離心20分鐘。上清即含有表達(dá)的可溶性Fab抗體。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生人源抗D-二聚體的特異性導(dǎo)向溶栓抗體的大腸桿菌，其特征在于通過半套式PCR方法將人抗體的重鏈基因和輕鏈基因連入噬菌體質(zhì)粒pComb3H形成重組噬菌體質(zhì)粒pComb3H-HL，重組噬菌體質(zhì)粒pComb3H-HL在輔助噬菌體VCSM13的超感染下構(gòu)建成噬菌體抗體組合文庫；經(jīng)ELISA方法篩選出抗人纖維蛋白降解產(chǎn)物D-二聚體的特異株。
2.一種權(quán)利要求1所述含人源抗D-二聚體的特異性導(dǎo)向溶栓抗體的大腸桿菌分泌的抗體輕鏈的氨基酸序列，其特征在于S V S E S P G K T V T I S C TG S S G S I A S N Y V Q W Y RQ R P G S A P T T V I Y E D NQ R P S G V P D R F S G S I DS S T N S A S L T I S G L K TE D E A D Y Y C Q S Y D S S NW V F G G G T K L T V L G Q PK A A P S V T L F P P S S E EL Q A N K A T L V C L I S D FY P G A V T V A W K A D S S PV K A G V E T T T P S K Q S NN K Y A A S S Y L S L T P E QW E S H K S Y S C Q V T H E GS T V E K T V A
3.一種產(chǎn)生權(quán)利要求2所述人源導(dǎo)向溶栓抗體的輕鏈的基因序列，其特征在于TCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGTAACCATCTCCTGCACCGGCAGCAGTGGCAGCATTGCCAGCAACTATGTGCAGTGGTACCGGCAGCGCCCGGGCAGTGCCCCCACCACTGTGATCTATGAGGATAACCAAAGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCACCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGAAGACTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATAGCAGCAATTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACGGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGGAGTCCCACAAAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCC
4.一種權(quán)利要求1所述含人源抗D-二聚體的特異性導(dǎo)向溶栓抗體的大腸桿菌分泌的抗體重鏈的氨基酸序列，其特征在于E S G G G V V Q P G R S L R LS C A A S G F T F S S Y A M SW V R Q A P G K G L E W V S AI S G S G G S T Y Y A D S V KG R F T I S R D N S K N T L YL Q M D S L R A E D T A V Y YC A K P H G R Y Y D S S G Y RT Y F D Y W G Q G T L V T V SS G S A S A P T L F P L V S CE N S P S D T S S V A V G C LA Q D F L P D S I T F S W K YK N N S D I S S T R G F P S VL R G G K Y A A T S Q V L L PS K D V M Q G T D E H V V C KV Q H P N G N K E K N V P L PV I A E L P
5.一種產(chǎn)生權(quán)利要求4所述人源導(dǎo)向溶栓抗體的重鏈的基因序列，其特征在于GAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAGCCCCACGGGCGATACTATGATAGTAGTGGTTATCGAACCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGTGAGAATTCCCCGTCGGATACGAGCAGCGTGGCCGTTGGCTGCCTCGCACAGGACTTCCTTCCCGACTCCATCACTTTCTCCTGGAAATACAAGAACAACTCTGACATCAGCAGCACCCGGGGCTTCCCATCAGTCCTGAGAGGGGGCAAGTACGCAGCCACCTCACAGGTGCTGCTGCCTTCCAAGGACGTCATGCAGGGCACAGACGAACACGTGGTGTGCAAAGTCCAGCACCCCAACGGCAACAAAGAAAAGAACGTGCCTCTTCCAGTGATTGCAGAGCTGCCT
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含人源抗D－二聚體的特異性導(dǎo)向溶栓抗體基因的大腸桿菌及其分泌產(chǎn)物。其特征在于通過半套式PCR方法將人抗體的重鏈基因和輕鏈基因連入噬菌體質(zhì)粒pComb3H形成重組噬菌體質(zhì)粒pComb3H－HL，該重組噬菌體質(zhì)粒在輔助噬菌體VCSM13的超感染下構(gòu)建成噬菌體抗體組合文庫；經(jīng)ELISA方法篩選出抗人纖維蛋白降解產(chǎn)物D－二聚體的特異株。因此，該抗體具有對血栓降解物D－二聚體特異的免疫性，能夠與溶栓藥物組成導(dǎo)向溶栓劑，在治療血管栓塞性疾病方面具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。
文檔編號C12N1/21GK1534092SQ03114010
公開日2004年10月6日 申請日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者陳敏生, 吳文言, 黃少華, 黃漫翔, 藍(lán)崇鈺, 田朝偉, 楊曉儀, 陳穎 申請人:廣州醫(yī)學(xué)院, 中山大學(xué), 廣東省大日生物化學(xué)藥業(yè)有限公司