專利名稱：檢測(cè)非典型性肺炎病毒的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)非典型性肺炎病毒的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
非典型性肺炎病毒，即SARS病毒是一種引起嚴(yán)重急性呼吸道疾病綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，又稱非典型性肺炎的病毒，屬冠狀病毒(coronavirus)類病毒，基因組共含29，737個(gè)核苷酸。該病主要通過(guò)近距離空氣飛沫和密切接觸傳播。該病毒目前還沒(méi)有有效的免疫化學(xué)檢測(cè)方法，只能根據(jù)臨床癥狀(高熱、干咳、肺部X光檢測(cè)有陰影等)來(lái)診斷，受到很大的局限，只能在受感染者發(fā)病后才能作出診斷，且不易與其它肺炎和一般流感區(qū)別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)非典型性肺炎病毒的方法及其試劑盒。
發(fā)明提供的檢測(cè)非典型性肺炎病毒的方法，它包括以下幾個(gè)步驟1)取可疑病人的血清、分泌物或組織等生物學(xué)樣本，提取RNA；提取RNA的方法可采用普通分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，如“分子克隆”介紹的方法，也可以采用商業(yè)試劑盒，如TrizolR，按說(shuō)明書進(jìn)行。
2)加入反向引物和逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA；加入的反向引物為根據(jù)非典型性肺炎病毒特異核酸序列和PCR反應(yīng)要求所設(shè)計(jì)，“非典型性肺炎病毒特異核酸序列”具有Seq.ID N6.1、Seq.ID No.2、Seq.ID No.3、Seq.ID No.4、Seq.ID No.5、Seq.ID No.6所示的核酸序列；發(fā)明中采用的引物序列，為表1所示的核酸序列，表1中R為反向引物；采用商品化試劑盒，如InvitrogenTM公司的SuperScript試劑盒，按說(shuō)明書步驟合成cDNA。
3)加入正向引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增非典型性肺炎病毒的基因組核酸序列；加入的正向引物為根據(jù)非典型性肺炎病毒特異核酸序列和PCR反應(yīng)要求所設(shè)計(jì)，“非典型性肺炎病毒特異核酸序列”為具有Seq.ID No.1、Seq.ID No.2、Seq.ID No.3、Seq.ID No.4、Seq.ID No.5、Seq.ID No.6所示的核酸序列；發(fā)明中采用的引物序列，為表1所示的核酸序列，表1中L為正向引物；
本發(fā)明中，PCR反應(yīng)體系的組成為一般的標(biāo)準(zhǔn)組成，包括PCR反應(yīng)緩沖液(Tris.Cl 125mM PH 8.1；(NH4)2SO4125mM；MgCl212.5mM；BSA 1mg/ml；Formamide 25％)；反應(yīng)條件指模板變性溫度為92℃-98℃，優(yōu)選95℃，時(shí)間為10秒-10分鐘，優(yōu)選30秒；模板退火溫度為45℃--65℃，優(yōu)選52℃，時(shí)間為10秒-10分鐘，優(yōu)選30秒；模板延伸溫度為65℃--85℃，優(yōu)選70℃，時(shí)間為10秒-10分鐘，優(yōu)選40秒；循環(huán)20--40次，優(yōu)選30次。
4)采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)DNA技術(shù)檢測(cè)結(jié)果；常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)DNA技術(shù)檢測(cè)，如采用1％瓊脂糖電泳檢測(cè)用溴乙錠染色，在紫外光下觀察，有條帶的為陽(yáng)性，無(wú)條帶的為陰性；也可采用熒光PCR法檢測(cè)以提高檢測(cè)靈敏度，其方法均可在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)查到。
本發(fā)明的用于檢測(cè)非典型性肺炎病毒的試劑盒，它包括以下試劑PBS緩沖液、溶液D(溶液D含2.5克異硫氰酸胍、1.76毫升0.75M的檸檬酸鈉(PH7.0)、2.46毫升10％的十二烷基肌酸鈉，加水29.3毫升，使用前加入7.2μl/ml的巰基乙醇)、酚、氯仿和4.0M(PH＝3.8)醋酸鈉、RT緩沖液dNTP、引物和使用說(shuō)明書。
本發(fā)明根據(jù)非典型性肺炎病毒的基因組序列分析結(jié)果，選取該病毒特有的核酸序列區(qū)，設(shè)計(jì)引物，并針對(duì)該病毒是一種核糖核酸病毒(RNA病毒)的特點(diǎn)，為臨床檢測(cè)非典型性肺炎病毒提供了快速、準(zhǔn)確的診斷方法和試劑盒。采用該方法能快速地對(duì)可疑感染者進(jìn)行基因檢測(cè)，解決了臨床對(duì)非典型性肺炎病毒感染者的早期快速診斷問(wèn)題。


圖1是瓊脂糖電泳檢測(cè)的結(jié)果，從左至右1-5為陽(yáng)性結(jié)果，7-8為陰性對(duì)照，10為分子量標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式
溶液D含2.5克異硫氰酸胍、1.76毫升0.75M的檸檬酸鈉(PH7.0)、2.46毫升10％的十二烷基肌酸鈉，加水29.3毫升，使用前加入7.2μl/ml的巰基乙醇。
2)振搖混合液15秒，冰上放置15分鐘。
3)14000rpm，4℃離心20分鐘。
4)取上清，加入等體積的異丙醇，冰上放置25分鐘。
5)4℃，14000rpm離心20-30分鐘。
6)沉淀用-20℃預(yù)冷的乙醇洗兩次，真空抽干，溶于DEPC水中。
2、加入反向引物和逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA；采用InvitrogenTM公司的SuperScript試劑盒1)適量樣品RNA、加入表1中所列的反向引物(0.5ug/ml)2.5μl，95℃保溫3-4分鐘，冰上冷卻。
2)加入5×RT緩沖液4.0μl、dNTP(10mM)1.0μl、0.1M DTT 2.0μl、Superscript(200u/μl)1.0μl、Rnasein(25u)1.0μl，40℃保溫1小時(shí)，70℃保溫5分鐘，冰上冷卻。
3、加入正向引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增非典型性肺炎病毒的基因組核酸序列；取步驟2合成的cDNA模板1.0μl、加入表1中所列的正向引物1.0μl、10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl、Mg2+(25mM)1.75μl、dNTP(2.5mM)0.8μl、Taq(5u/μl)0.25μl，加水至25μl；95℃保溫5分鐘。95℃，30秒；54℃，45秒；72，1分鐘，循環(huán)30次，72℃保溫7分鐘。
4、結(jié)果檢測(cè)1％瓊脂糖電泳檢測(cè)，用溴乙錠染色，紫外光下觀察，有條帶的為陽(yáng)性，無(wú)條帶的為陰性。
表1用于檢測(cè)的引物序列





核酸序列表<110>杭州華大基因研發(fā)中心*<120>非典型性肺炎病毒的基因檢測(cè)法及試劑盒<160>6<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>1953<212>DNA<213>coronavirus SARS<400>1ctacccagga aaagccaacc aacctcgatc tcttgtagat ctgttctcta aacgaacttt 60aaaatctgtg tagctgtcgc tcggctgcat gcctagtgca cctacgcagt ataaacaata 120ataaatttta ctgtcgttga caagaaacga gtaactcgtc cctcttctgc agactgctta 180cggtttcgtc cgtgttgcag tcgatcatca gcatacctag gtttcgtccg ggtgtgaccg 240aaaggtaaga tggagagcct tgttcttggt gtcaacgaga aaacacacgt ccaactcagt 300ttgcctgtcc ttcaggttag agacgtgcta gtgcgtggct tcggggactc tgtggaagag 360gccctatcgg aggcacgtga acacctcaaa aatggcactt gtggtctagt agagctggaa 420aaaggcgtac tgccccagct tgaacagccc tatgtgttca ttaaacgttc tgatgcctta 480agcaccaatc acggccacaa ggtcgttgag ctggttgcag aaatggacgg cattcagtac 540ggtcgtagcg gtataacact gggagtactc gtgccacatg tgggcgaaac cccaattgca 600taccgcaatg ttcttcttcg taagaacggt aataagggag ccggtggtca tagctatggc 660atcgatctaa agtcttatga cttaggtgac gagcttggca ctgatcccat tgaagattat 720gaacaaaact ggaacactaa gcatggcagt 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1.一種檢測(cè)非典型性肺炎病毒的方法，它包括以下幾個(gè)步驟1)取可疑病人的血清、分泌物或組織等生物學(xué)樣本，提取RNA。2)加入反向引物和逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA。3)加入正向引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增非典型性肺炎病毒的基因組核酸序列。4)采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)DNA技術(shù)檢測(cè)結(jié)果。
2.按權(quán)利要求1所述的檢測(cè)非典型性肺炎病毒方法，其特征在于所說(shuō)的PCR反應(yīng)擴(kuò)增的非典型性肺炎病毒的基因組核酸序列具有序列Seq.ID No.1、Seq.IDNo.2、Seq.ID No.3、Seq.ID No.4、Seq.ID No.5、Seq.ID No.6所示的核酸序列。
3.按權(quán)利要求1所述的檢測(cè)非典型性肺炎病毒方法，其特征在于加入的正、反向引物具有如表1的核酸序列，表中L為正向引物，R為反向引物。
4.按權(quán)利要求1所述的檢測(cè)非典型性肺炎病毒方法的試劑盒，其特征在于它包括以下試劑PBS緩沖液、溶液D(溶液D含2.5克異硫氰酸胍、1.76毫升0.75M的檸檬酸鈉(PH7.0)、2.46毫升10％的十二烷基肌酸鈉，加水29.3毫升，使用前加入7.2μl/ml的巰基乙醇)、酚、氯仿和4.0M(PH＝3.8)醋酸鈉、RT緩沖液dNTP、引物和使用說(shuō)明書。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種臨床檢測(cè)非典型性肺炎病毒的方法及其試劑盒。根據(jù)非典型性肺炎病毒基因組序列的特征分析，選取特異性的區(qū)域，又根據(jù)該病毒是核糖核酸病毒的特點(diǎn)，利用特定的引物序列，采用RT－PCR和PCR相關(guān)的試劑與技術(shù)，建立了一套快速檢測(cè)非典型性肺炎病毒的方法。本發(fā)明的有益效果是解決了臨床對(duì)非典型性肺炎病毒感染者的早期快速診斷問(wèn)題，具有較高的準(zhǔn)確性，為臨床檢測(cè)本病提供了快速、準(zhǔn)確的診斷方法和試劑盒。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1450172SQ03116659
公開(kāi)日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2003年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月26日
發(fā)明者汪建, 王俊, 李蔚, 徐祖元, 林偉, 胡詠武, 張曉偉, 鄧亞軍, 楊喚明 申請(qǐng)人:杭州華大基因研發(fā)中心