專利名稱：高度特異性的重組免疫毒素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以TH1細胞為靶細胞，特異攻擊并殺傷活化的TH1細胞的重組免疫毒素及其制備方法。
背景技術(shù)：
免疫毒素(Immunotoxins，ITs)是由導(dǎo)向分子和毒素分子共同構(gòu)成的雜合分子，又稱生物導(dǎo)彈。最早的免疫毒素(即第一代免疫毒素)是將載體與毒素分子通過化學(xué)偶聯(lián)而成，這類免疫毒素分子量大、穩(wěn)定性及均一性較差，且難以大規(guī)模生產(chǎn)，因而限制了其應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來人們通過基因工程的重組技術(shù)，將載體基因與毒素基因融合，經(jīng)表達及純化制備而得重組免疫毒素。這種新工藝產(chǎn)生的免疫毒素能有效克服第一代免疫毒素的缺陷，極大地推動了免疫毒素在相關(guān)領(lǐng)域的深入研究。有關(guān)免疫毒素在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，主要都集中于對某些惡性腫瘤及與免疫相關(guān)的人類疾病的導(dǎo)向治療。其中，以T細胞為靶細胞的免疫毒素在治療T細胞性自身免疫性疾病及移植物抗宿主疾病(GvHD)取得了良好療效(參見Hu HZ，et al.CellImmunol.1997，17726；BrennerT，et al.Immunol lett.1999，68403)。這些免疫毒素的作用靶點主要是選擇針對T細胞表面抗原或細胞因子受體，如CD3、CD5、IL-2等，在接受這些免疫毒素的治療后，相應(yīng)的自身免疫性疾病或GvHD病情雖有減退，但毒副作用也較顯著，甚至使臨床治療被迫終止。這些毒副作用的主要原因之一是由于這類免疫毒素所選擇的導(dǎo)向分子特異性欠佳，往往導(dǎo)致無選擇性地殺死所有T細胞。隨著基礎(chǔ)免疫學(xué)的研究進展，人們認識到識別各種自身抗原的自身反應(yīng)性T細胞，實際上是由CD4+TH1細胞所承擔(dān)的，而CD4+TH2僅具有一定的調(diào)節(jié)作用(參見LiblauRS，et al.Immunol.Today.1995，1634；Costa GL，et al.J.Immunol.2000，1643581)。由此提示，如果能利用特異性更高的免疫毒素只將這些活化的自身反應(yīng)性TH1細胞殺死，則有可能彌補上述缺陷，建立相應(yīng)的特異性自身免疫耐受，實現(xiàn)治療自身免疫性疾病的目的。自身免疫性疾病(autoimmune disease)是由于各種原因?qū)е旅庖呦到y(tǒng)對自身抗原發(fā)起攻擊，造成自身組織損傷和功能障礙的一大類疾病。目前的治療措施主要是采用各種非特異的免疫抑制劑，但往往使患者免疫系統(tǒng)受到普遍性抑制而導(dǎo)致感染、腫瘤的發(fā)生及骨髓抑制等，且不能有效地防止疾病的復(fù)發(fā)。因而促使相關(guān)領(lǐng)域的研究者從免疫治療的角度，尋求一種特異、安全、有效的治療方法如MHC阻斷法、CD4分子阻斷法、TCR阻斷法、細胞因子治療、T細胞接種以及口服抗原誘導(dǎo)耐受等等，但這些方法或因特異性不高、療效不穩(wěn)定，或因技術(shù)難度大、難以克服的毒副作用等而不能順利地過渡到臨床(參見Waldor MK，et al.Science.1985，227415；ChenY，et al.Nature.1995，376177；Weiner HL，Immunology Today.1997，18355)，因而自身免疫性疾病的治療至今仍然是困擾臨床的一大難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種新型的特異攻擊TH1細胞的重組免疫毒素，為臨床急待解決的自身免疫性疾病治療提供一種新方案，為重組免疫毒素的應(yīng)用開辟一條新途徑。
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種制備重組免疫毒素的質(zhì)粒，此種質(zhì)粒具有附圖1所述的IL-18cDNA堿基序列(來自gene bank)和附圖2所述的綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38cDNA堿基序列(來自gene bank)連接而成。提供一種高度特異性的重組免疫毒素，此種重組免疫毒素由上述質(zhì)粒表達、純化形成，以IL-18為導(dǎo)向分子、以綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38為毒素分子，具有特異攻擊并殺傷活化的TH1細胞的特性。IL-18是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型細胞因子，在免疫應(yīng)答的過程中，活化的T細胞將表達多種受體，如細胞因子IL-2、IL-12、IL-18的受體以及多種化學(xué)趨化因子CCR-5，CXCR-3等的受體。這些T細胞的膜受體中，現(xiàn)已證實IL-18受體的表達僅限于活化的TH1細胞，而TH2細胞沒有表達，并且這種膜受體的表達是穩(wěn)定和持續(xù)的(參見Okamura H，et al.Nature.1995，37888；Chan WL，et al.J.Immunol.2001，1671238；Nakanishi K，et al.Annu.Rev.Immunol.2001，19423)，因此，IL-18受體不僅可以作為識別TH1細胞和TH2細胞的標(biāo)志，也為相關(guān)的免疫治療提供了一個理想的靶位。本發(fā)明選用IL-18為導(dǎo)向分子，綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38為毒素分子，制備IL-18-PE38重組免疫毒素，特異攻擊并殺傷活化的TH1細胞，誘導(dǎo)自身免疫耐受，從而解決了原有免疫毒素特異性欠佳的問題，實現(xiàn)有效治療自身免疫性疾病的目的。
重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法依次包括以下步驟1、將動物的IL-18基因用RT-PCR擴增；2、將上述擴增的IL-18基因片段按TA克隆法實現(xiàn)與質(zhì)粒載體重組，再轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細菌中進行擴增，然后篩選出含有正確插入片段的克隆；3、限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進行DNA序列分析，以保證重組質(zhì)粒中IL-18插入片段的正確性；4、限制性內(nèi)切酶分別消化正確序列的IL-18及PE38的質(zhì)粒DNA，純化DNA片段，將IL-18和PE38片段連入質(zhì)粒載體中，即構(gòu)建成重組質(zhì)粒；5、用TNT體外翻譯試劑盒測定重組質(zhì)粒的表達活性。
構(gòu)建重組質(zhì)?？蛇x用的質(zhì)粒載體有pET27、PRKL459K、PGEX-2T。
重組免疫毒素IL-18-PE38的制備方法依次包括以下步驟1、上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的工程菌的制備；2、免疫毒素的表達與純化。
上述各步驟的具體操作如下1、制備重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的工程菌(1)制備感受態(tài)細菌；(2)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌的細胞中；(3)通過蛋白合成抑制實驗測定工程菌的表達活性。
2、免疫毒素的表達與純化(1)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的工程菌接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(2)收集高效表達的工程菌菌液并進行破菌處理，獲取免疫毒素IL-18-PE38的粗提物；(3)用Glutahione Sepharose4B或親和層析柱對免疫毒素IL-18-PE38粗提物進行純化處理；
(4)通過蛋白合成抑制實驗測定免疫毒素的表達活性。
制備重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的工程菌可選用的感受態(tài)細菌有E.coli.BL21、DH5α、JM109。
本發(fā)明所涉及的新型免疫毒素及其制備方法具有以下優(yōu)點和積極效果1、選擇新型細胞因子IL-18為導(dǎo)向分子，由于IL-18受體只表達在活化的TH1細胞表面，TH2細胞表面沒有表達，因而由IL-18導(dǎo)向的重組免疫毒素只針對TH1細胞，從而使導(dǎo)向攻擊更特異、更有效，減少臨床應(yīng)用的毒副作用。
2、毒素分子選用的是綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38，從而避免了血液中普遍存在的抗白喉外毒素抗體對免疫毒素生物活性的干擾。
3、PE38為綠膿桿菌外毒素的活性片段，較PE40進一步去除了PE分子的細胞結(jié)合區(qū)和一個二硫鍵，可進一步減少非特異性結(jié)合和降低不良反應(yīng)。
4、免疫毒素IL-18-PE38是通過DNA重組技術(shù)來獲得的重組免疫毒素制劑，它避免了原來化學(xué)偶聯(lián)免疫毒素復(fù)雜的制備工藝和難以標(biāo)化的缺點，使其更易產(chǎn)業(yè)化。
5、免疫毒素IL-18-PE38可通過多途徑給藥。①直接利用IL-18-PE38蛋白制劑；②利用IL-18-PE38 DNA制劑，即采用IL-18-PE38表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染活體肌肉細胞的方法，將IL-18-PE38表達質(zhì)粒直接導(dǎo)入動物肌肉，使IL-18-PE38在骨骼肌內(nèi)高效表達而起到治療作用。
6、免疫毒素IL-18-PE38亦可用于移植排斥反應(yīng)及某些腫瘤的防治。
四

圖1是IL-18cDNA的堿基序列；圖2是PE38cDNA的堿基序列。
五具體實施例方式
實施例1構(gòu)建制備重組免疫毒素IL-18-PE38的原核表達質(zhì)粒IL-18cDNA的堿基序列如圖1所示，PE38cDNA的堿基序列如圖2所示，載體選用pET27。具體步驟如下1、小鼠IL-18基因用RT-PCR擴增(1)異硫氰酸胍一步法提取激活巨噬細胞的總RNA，取10μg Oligo(dT)混合，行反轉(zhuǎn)錄。
(2)PCR擴增的引物為上游5′-CGGAATTCATAACTTTGCCGACTTCAGTGTAC下游5′-CGGAATTCACTAACTTTGATGTAAGTTAGTGAGAG(3)PCR反應(yīng)條件94℃0.5分鐘、56℃0.5分鐘、72℃1分鐘，30個循環(huán)后72℃延伸10分鐘。
(4)擴增產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。
2、將上述擴增的IL-18基因片斷按TA克隆法實現(xiàn)與質(zhì)粒載體pET27重組，再轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細菌中進行擴增，篩選出含有正確插入片段的克隆。
3、限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進行DNA序列分析，以保證重組質(zhì)粒中IL-18插入片段的正確性。
4、限制性內(nèi)切酶分別消化正確序列的IL-18及PE38的質(zhì)粒DNA，純化DNA片段，將IL-18及PE38片段分別連入pET27表達質(zhì)粒載體中，構(gòu)成IL-18-PE38的原核表達質(zhì)粒pET27-IL-18-PE38。
5、IL-18-PE38原核表達質(zhì)粒的活性測定，用TNT體外翻譯試劑盒，以pET27-IL-18-PE38質(zhì)粒DNA作模板翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，再用ConA刺激小鼠脾臟細胞，活化其中的T細胞，這些活化的T細胞將作為靶細胞檢定IL-18-PE38原核表達質(zhì)粒的活性。
實施例2制備重組免疫毒素IL-18-PE38工藝步驟依次如下1、制備原核表達質(zhì)粒pET27-IL-18-PE38轉(zhuǎn)染的工程菌(1)制備感受態(tài)細菌A.將大腸桿菌E.coli BL21在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線接種，37℃培養(yǎng)12-16小時。
B.從平板中取出2-3mm大小的單菌落，移至含3mlLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日取菌液1ml接種至含有100mlLB培養(yǎng)基的的三角瓶中，37℃300rpm強烈振蕩培養(yǎng)3小時，使細胞濃度達到5×107個細胞/ml，此時，細菌的OD600一般在0.4左右。
C.將培養(yǎng)的細菌在冰上放置10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到無菌處理過的用冰預(yù)冷的50ml離心管中。
D.4℃離心，4000g×10分鐘，棄去上清液，回收細胞。
E.用冰預(yù)冷的0.1mol CaCl210ml重懸菌體，置冰浴30分鐘。
F.4℃離心，4000g×10分鐘，棄去上清液。再加4ml冰預(yù)冷的0.1mol CaCl2重懸菌體，此即感受態(tài)細菌。
(2)將實施例1制備的原核表達質(zhì)粒pET27-IL-18-PE38轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌的細胞中A.無菌狀態(tài)下取新鮮感受態(tài)細菌100μl置于無菌試管中，加入10ngpET27-IL-18-PE38質(zhì)粒DNA，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻內(nèi)容物，在冰上放置30分鐘。
B.42℃熱休克90秒鐘，不要搖動試管，迅速放回冰中，將細胞冷卻1-2分鐘后，加入1000μlSOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘。
C.取80μl轉(zhuǎn)化混合物，用L型玻棒鋪于含適當(dāng)濃度抗生素的LB瓊脂平板上，室溫下放置20分鐘，待溶液被瓊脂吸收后，倒置37℃培養(yǎng)16-20小時；待菌落長出后，無菌挑取單菌落進行擴大培養(yǎng)。
(3)通過蛋白合成抑制實驗測定工程菌的表達活性將ConA活化的T細胞接種于96孔細胞板培養(yǎng)(約5×104個細胞/孔)，加入不含亮氨酸的RPMI1640培養(yǎng)基和工程菌培養(yǎng)上清20μl，混勻后共同孵育20小時(37℃，5％CO2)，再加入H3亮氨酸(4.5μci/ml)10μl，4小時后收集細胞，測定并計算蛋白合成抑制百分率，確定工程菌的表達活性。
2、重組免疫毒素IL-18-PE38的表達與純化(1)將帶pET27-IL-18-PE38質(zhì)粒的工程菌接種于含一定濃度抗生素的LB培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)至OD600達0.5，轉(zhuǎn)至42℃繼續(xù)培養(yǎng)5小時。
(2)收集培養(yǎng)的高效表達的工程菌菌液，4℃離心5000rpm，15分鐘，棄上清。
(3)每克濕菌加3mlTE緩沖液，高強度超聲(20kHz)進行破菌處理。
(4)離心10000g，30分鐘，收集上清液。
(5)取10μl上清與10μl2×SDS樣品緩沖液混勻，于沸水中煮5分鐘，然后上樣進行10％SDS-PAGE電泳(200V，50-60分鐘)，凝膠用考馬斯亮藍染色。
(6)將IL-18-PE38蛋白粗提物用50％Glutahione Sepharose 4B或親和層析柱進行純化，純化后的重組免疫毒素再通過SDS-PAGE電泳和Western blot做進一步的鑒定分析。
(7)重組免疫毒素IL-18-PE38生物活性的測定重組免疫毒素IL-18-PE38生物活性的測定采用蛋白合成抑制試驗進行，即通過將ConA活化的T細胞接種子96孔細胞板培養(yǎng)(約5×104個細胞/孔)，加入不含亮氨酸的RPMI1640培養(yǎng)基和系列稀釋的IL-18-PE38重組蛋白樣品10μl(對照組為IL-18受體陰性的無關(guān)細胞)，混勻后共同孵育20小時(37℃，5％CO2)，再加入H3亮氨酸(4.5μci/ml)10μl，4小時后收集細胞，于Beckman閃爍計數(shù)儀上測定放射活性，計算蛋白合成抑制百分率，以確定IL-18-PE38重組免疫毒素的生物活性。
權(quán)利要求
1.一種制備重組免疫毒素的質(zhì)粒，其特征在于它具有附圖1所述的IL-18cDNA堿基序列和附圖2所述的綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38cDNA堿基序列連接而成。
2.一種高度特異性的重組免疫毒素，其特征在于該重組免疫毒素由權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒表達、純化形成，具有特異攻擊并殺傷活化的TH1細胞的特性。
3.一種權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于依次包括以下步驟(1)將動物的IL-18基因用RT-PCR擴增，(2)將上述擴增的IL-18基因片段按TA克隆法實現(xiàn)與質(zhì)粒載體重組，再轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細菌中進行擴增，然后篩選出含有正確插入片段的克隆，(3)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析重組質(zhì)粒，并進行DNA序列分析，以保證重組質(zhì)粒中IL-18插入片段的正確性，(4)限制性內(nèi)切酶分別消化正確序列的IL-18及PE38的質(zhì)粒DNA，純化DNA片段，將IL-18和PE38片段連入質(zhì)粒載體中，即構(gòu)建成重組質(zhì)粒，(5)用TNT體外翻譯試劑盒測定重組質(zhì)粒的表達活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建重組質(zhì)粒可選用的質(zhì)粒載體有pET27、PRKL459K、PGEX-2T。
5.一種權(quán)利要求2所述的高度特異性的重組免疫毒素的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟(1)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的工程菌的制備，(2)免疫毒素的表達與純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高度特異性的重組免疫毒素的制備方法，其特征在于(1)制備重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的工程菌的具體步驟A.制備感受態(tài)細菌，B.將權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌的細胞中，C.通過蛋白合成抑制實驗測定工程菌的表達活性，(2)免疫毒素表達與純化的具體步驟A.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的工程菌接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，B.收集高效表達的工程菌菌液并進行破菌處理，獲取免疫毒素的粗提物，C.用Glutahione Sepharose4B或親和層析柱對免疫毒素的粗提物進行純化處理，D.通過蛋白合成抑制實驗測定免疫毒素的表達活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高度特異性的重組免疫毒素的制備方法，其特征在于蛋白合成抑制實驗測定免疫毒素的表達活性是通過將ConA活化的T細胞接種于細胞板培養(yǎng)，加入不含亮氨酸的RPMI1640培養(yǎng)基和系列稀釋的免疫毒素重組蛋白樣品，混勻后在37℃、5％CO2共同孵育16～20小時，再加入3～4.5μci/ml的H3亮氨酸，2～4小時后收集細胞，于Beckman閃爍計數(shù)儀上測定放射活性，計算蛋白合成抑制百分率。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的高度特異性的重組免疫毒素的制備方法，其特征在于制備重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的工程菌可選用的感受態(tài)細菌有E.coli.BL21、DH5α、JM109。
全文摘要
一種高度特異性的重組免疫毒素，以IL－18為導(dǎo)向分子、以綠膿桿菌外毒素的活性片段PE38為毒素分子，通過基因重組構(gòu)建而成。該免疫毒素的制備方法包括重組質(zhì)粒的構(gòu)建、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的工程菌的制備、免疫毒素IL－18－PE38的表達與純化等步驟。該免疫毒素具有嚴格的靶向性，即通過IL－18的導(dǎo)向作用特異攻擊活化的TH1細胞，誘導(dǎo)特異性免疫耐受，從而避免了無選擇性地殺傷所有T細胞，特別適合于自身免疫性疾病和器官移植排斥反應(yīng)的防治，亦可應(yīng)用于某些腫瘤的治療。
文檔編號C12N15/31GK1431305SQ03117130
公開日2003年7月23日 申請日期2003年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月10日
發(fā)明者張 林, 李虹, 李明遠, 胡懷忠, 蔣忠華 申請人:四川大學(xué)