專利名稱：分離鑒定純化異養(yǎng)硝化微生物的方法
發(fā)明所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種分離鑒定純化具有硝化活性的異養(yǎng)細(xì)菌的方法。
硝化作用，一般是指微生物將NH4+氧化為NO2-，繼而NO2-再氧化為NO3-，或者由于微生物作用導(dǎo)致氧化態(tài)N增多的過程。它是自然界氮素循環(huán)的重要組成部分，在陸地包括農(nóng)田、水域、沉積物等生態(tài)系統(tǒng)中均可廣泛的發(fā)生，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護等都具有重要意義。如農(nóng)田N素去向的調(diào)控、水體富營養(yǎng)化的生物防治、污水污泥的生物處理等。除了傳統(tǒng)上認(rèn)為的自養(yǎng)硝化細(xì)菌以外，目前已發(fā)現(xiàn)大量異養(yǎng)微生物如真菌、細(xì)菌和放線菌等也可以進行硝化作用。為了有效的調(diào)控，監(jiān)測和評價硝化作用，對參與硝化作用的異養(yǎng)微生物的種類、數(shù)量進行確認(rèn)，并進行代表菌株的分離活性鑒別顯得十分重要和必要，具有重要的理論和應(yīng)用價值。
Winogradsky認(rèn)為硝化作用不能在肉湯中發(fā)生，硝化細(xì)菌特別是銨鹽氧化細(xì)菌只能在無機鹽中運用特異性的化能自養(yǎng)方式生活。根本不能在營養(yǎng)明膠或營養(yǎng)瓊脂平板上生長。據(jù)此柯赫發(fā)明的營養(yǎng)平板技術(shù)僅僅成為檢驗“自養(yǎng)硝化細(xì)菌”純度的輔助工具，而從不用以分離硝化細(xì)菌。對于自養(yǎng)硝化細(xì)菌的計數(shù)MPN法是過去和目前應(yīng)用最為普遍的計數(shù)方法。優(yōu)點是容易應(yīng)用，簡單，對檢測樣品中不同的屬都有效。缺點表現(xiàn)在1)測定結(jié)果常常偏低，原因是培養(yǎng)基或生長條件未能使硝化細(xì)菌生長到足以檢測的數(shù)量，或稀釋過程中沒有充分分散；2)培養(yǎng)基本身的選擇性；3)固有的統(tǒng)計缺陷，精確性低；4)培養(yǎng)時間長。上世紀(jì)70年代以來，研究者運用血清學(xué)方法并結(jié)合顯微示蹤開發(fā)了熒光抗體(FA，F(xiàn)luorescent Antibody)技術(shù)。但硝化細(xì)菌純培養(yǎng)分離的困難和抗體的高度專一性是這項技術(shù)面臨的最大制約。與FA技術(shù)相比，近年來開發(fā)的利用PCR技術(shù)進行硝化細(xì)菌的計數(shù)具有一定的優(yōu)越性。但從現(xiàn)有結(jié)果看，單獨運用PCR，對人為混進在滅菌土中的純株檢出率低于FA和MPN，與MPN聯(lián)用(PCR-MPN)后檢出率才有所提高(Degrange，Appl.Environ.Microbiol.，1995，198201-208)，這項技術(shù)的完善和廣泛應(yīng)用尚需時日。因此，開發(fā)一種簡單、高效、檢出率高的計數(shù)分離方法顯得十分重要。
Quastel和Scholefield等對傳統(tǒng)的硝化作用自養(yǎng)細(xì)菌發(fā)生說提出了質(zhì)疑，并以丙酮酸肟為唯一碳氮源，采用土柱滲濾進行選擇性加富培養(yǎng)，獲得了具有產(chǎn)生NO2-能力的異養(yǎng)菌株(Quastel等，Nature(London)，1950，166940-942；Quastel等，Biochem.J.，1952，51278-284)。后來的研究者多采用相似的方法進行異養(yǎng)硝化活性菌株的分離。目前常用的培養(yǎng)基質(zhì)有丙酮酸肟(Jensen，J.Gen.Microbiol.，1951，5360-368；Doxtader和Alexander，Soil Sci.Soc.Amer.Proc.，1966，30351-355)、乙酰胺(Verstraete等，J.Bacteriol.，1972，110955-961；Rho，Can.J.Microbiol.，1985，32243-247)、β-丙氨酸(Stroo等，Appl.Environ.Microbiol.，1986，521107-1111；Brierley，Soil Biol.Biochem.，2001，331403-1409)及其它一些有機物如肟、吡啶(Uma，Can.J.Microbiol.，1997，43595-598)等。這種分離方法的缺點是樣品前處理比較繁瑣，耗時費力；重復(fù)性差，分離的菌株單一且缺乏代表性，不能再現(xiàn)土壤或分離樣本的微生物原位狀況。
Eylar和Schmidt(Eylar等，J.Gen.Microbiol.，1959，20473-481)以葡萄糖—酵母膏—蛋白胨瓊脂平板對12種具有硝化能力和10種具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的土壤進行異養(yǎng)硝化微生物的分離，并以液體純培養(yǎng)下的氨氧化能力，即以亞硝酸鹽和硝酸鹽積累量為指標(biāo)，對平板上所分離的菌株進行硝化活性的鑒別，NO2-濃度高于0.2mg NL-1的僅占總分離物7％，NO2-濃度高于0.5mg NL-1的僅占總分離物2％。該方法的缺陷是沒有考慮培養(yǎng)基質(zhì)對菌株硝化活性的影響，采用了不適宜的葡萄糖作為碳源導(dǎo)致異養(yǎng)硝化微生物陽性檢出率偏低。其后很少有研究者采用該方法進行異養(yǎng)硝化微生物的分離、計數(shù)。
Papen等總結(jié)了上述各項技術(shù)在分離計數(shù)中存在的缺陷；首次提出了一種可以對具有異養(yǎng)硝化能力的細(xì)菌進行計數(shù)的MPN法(Papen等，Plant and soil，1998，199123-130)。Papen將這種方法應(yīng)用于德國Hglwald地區(qū)一種具有硝化潛勢的酸性針葉林土壤，對區(qū)域的異養(yǎng)硝化微生物進行了計數(shù)，并結(jié)合牛肉膏蛋白胨瓊脂平板法分離獲得了具有硝化活性的異養(yǎng)菌株。但遺憾的是至今尚未見到該方法應(yīng)用于其它類型土壤如農(nóng)田土壤的研究報告，可能該方法存在地域性的局限。而且該方法較傳統(tǒng)的MPN法手續(xù)未見明顯簡便，檢測周期偏長。
發(fā)明技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種分離鑒定純化具有硝化活性的異養(yǎng)微生物的方法，采用本發(fā)明的方法分離鑒定純化具有硝化活性的異養(yǎng)細(xì)菌重復(fù)性好，分離的菌株多樣性強且具有代表性。
一種分離鑒定純化具有硝化活性的異養(yǎng)微生物的方法，它包括的步驟是①將待檢樣品涂布于PM平板；②挑取單菌落到PM平板劃線純化；③點滴格利斯試劑到平板菌落上；④在一定顯色時間內(nèi)，格利斯試劑顯紅色者為待查陽性菌落；⑤挑取待查陽性菌落重復(fù)步驟②③④再次格利斯試劑顯紅色者為陽性菌落；在本發(fā)明中，待檢的樣品涂布到平板上采用稀釋法，最常采用的是10倍稀釋法。
在本發(fā)明的一個具體實例中，PM固體培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，組分是牛肉浸膏 3克蛋白胨5克瓊脂 20克蒸餾水1000毫升用1N氫氧化鈉調(diào)培養(yǎng)基pH至7.0-7.2。分裝在三角瓶中，滅菌，培養(yǎng)基冷卻至56℃左右時倒平板。這種PM培養(yǎng)基經(jīng)高壓液相色譜分析，表明其中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量均為跡量亞硝酸鹽未檢出，硝酸鹽含量低于0.2mg NL-1，這樣不會對結(jié)果構(gòu)成正干擾。
本發(fā)明中所用的格利斯試劑包括分別配制存放的對氨基苯磺酸試劑和α-萘胺試劑。在本發(fā)明的具體實例中，對氨基苯磺酸試劑的配制是0.5克對氨基苯磺酸(Sulfanilic acid)溶于150毫升20％的稀醋酸溶液中形成；α-萘胺試劑的配制是0.5克α-萘胺(α-naphthylamine)加到20毫升蒸餾水和150毫升20％的稀醋酸溶液中形成。
在本發(fā)明中，向待檢菌落點滴格利斯試劑后的顯色時間對結(jié)果的判斷至關(guān)重要，通常顯色時間在4分鐘內(nèi)，較好的在3分鐘內(nèi)，最好的在1分鐘內(nèi)。
采用本發(fā)明提供的分離鑒定純化具有硝化活性的異養(yǎng)微生物的方法與現(xiàn)在所使用的方法相比，本發(fā)明的方法具有簡便性，重復(fù)性好，分離的菌株多樣性強且具有代表性。與Eylar方法相比，本發(fā)明提供的方法獲得的硝化活性陽性菌數(shù)最高提高61.6％，最少也有24.2％。本方法較Papen等的方法更為簡便，可同時完成硝化活性菌株的計數(shù)和分離，可較采用Papen等的方法時間縮短5-7天。參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第九版，經(jīng)鑒定，這些菌株分屬于節(jié)桿菌屬、歐文氏菌屬、棒狀桿菌屬、小單孢菌屬、芽孢桿菌屬、動膠菌屬、紅球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等多個屬種。
在本發(fā)明中使用的各種單位，有國家標(biāo)準(zhǔn)的一律采用國家標(biāo)準(zhǔn)，無國家標(biāo)準(zhǔn)的采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。亞硝酸鹽濃度為60.0mg NO2-NL-1，表示每升溶液中含60毫克亞硝態(tài)氮，硝酸鹽含量為0.18mg NL-1表示每升溶液中含0.18毫克硝態(tài)氮。
下面結(jié)合具體實施例。進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如土壤微生物研究會〖日〗編，葉維青等譯，科學(xué)出版社，1983，土壤微生物實驗法；許光輝等編，北京農(nóng)業(yè)出版社，1986，土壤微生物分析方法手冊；以及中國科學(xué)院南京土壤研究所微生物室編，科學(xué)出版社，1985，土壤微生物研究法等書中所述的條件，或接照制造廠商所建議的條件。實施例1.培養(yǎng)基和試劑的配制1.1PM液體培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)配制稱3克牛肉浸膏，5克蛋白胨，溶解于1000毫升蒸餾水中形成PM液體培養(yǎng)基，在上述未滅菌的液體PM培養(yǎng)基中加入20克瓊脂，形成PM固體培養(yǎng)基。
用1N氫氧化鈉調(diào)培養(yǎng)基pH至7.1。分裝在三角瓶中，滅菌，培養(yǎng)基冷卻至56℃時倒平板。PM液體培養(yǎng)基經(jīng)高壓液相色譜分析，結(jié)果是亞硝酸鹽和硝酸鹽含量均為跡量，亞硝酸鹽未檢出，硝酸鹽含量為0.18mgNL-1。1.2格利斯試劑的配制1.2.1對氨基苯磺酸試劑(A液)0.5克對氨基苯磺酸(Sulfanilic acid)溶于150毫升20％的稀醋酸溶液中，貯于棕色瓶，冷藏備用。1.2.2α-萘胺試劑(B液)0.5克α-萘胺(α-naphthylamine)加到20毫升蒸餾水和150毫升20％的稀醋酸溶液中，貯于棕色瓶，冷藏備用。1.3NB液體培養(yǎng)基的配制1.3.1無機鹽溶液的配制稱取(NH4)2SO42.0克，NaH2PO40.25克，K2HPO40.75克，MgSO4·7H2O 0.03克，MnSO4·H2O 0.01克，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01克，溶解于1000毫升蒸餾水中，用1M NaOH調(diào)培養(yǎng)基的pH值為7.1，分裝在三角瓶中，滅菌。
1.3.2有機碳溶液的配制1.3.2.1乙酸鈉溶液的配制稱取27.2克三水乙酸鈉溶解于1000毫升蒸餾水中形成0.20M的乙酸鈉溶液，滅菌。
1.3.2.2檸檬酸鈉溶液的配制稱取51.6克檸檬酸鈉溶解于1000毫升蒸餾水中形成0.20M的檸檬酸鈉溶液，滅菌。使用時取無機鹽溶液90份(體積比)與有機碳溶液10份混合，形成NB培養(yǎng)基。實施例2從華北潮土土壤中分離異養(yǎng)硝化菌2.1以華北潮土為供試土樣進行了異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離、鑒別。
采樣地點河南省封丘縣趙崗鄉(xiāng)；分類名稱中壤質(zhì)黃潮土；來源耕層土壤，淤土；土樣處理風(fēng)干、研磨過20目篩；2.2稱取1.0克風(fēng)干土于含有50毫升無菌蒸餾水的250毫升三角瓶中，90r/min搖床振蕩4小時。2.3土懸液10倍梯度稀釋后涂布于PM平板，每個稀釋度三個重復(fù)。28℃培養(yǎng)7天后，挑取單菌落到PM平板，劃線純化。鏡檢，證明純度。2.4活性菌的鑒別將獲得的經(jīng)分離純化后的異養(yǎng)菌株接種于PM平板，28℃培養(yǎng)10天，格利斯試劑直接點滴到平板，進行硝化活性確認(rèn)，并以不接菌的平板作空白對照。1分鐘內(nèi)，格利斯試劑顯色呈紅色，表明有亞硝酸鹽生成。重復(fù)驗證，顯色反應(yīng)仍呈陽性，初步確認(rèn)為硝化活性菌。PM培養(yǎng)基經(jīng)高壓液相色譜分析，表明其中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量均為跡量其中亞硝酸鹽未檢出，硝酸鹽含量低于0.2mgNL-1，不會對結(jié)果構(gòu)成正干擾。2.5液體純培養(yǎng)的硝化活性驗證選取初篩時活性較強的代表性菌株進行。刮取生長于PM平板的純菌菌苔入30毫升無菌水，使其充分分散均勻制成菌懸液。分別接種1毫升菌懸液入含不同有機物為碳源的50毫升NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，每組三個重復(fù)。并以不接種的培養(yǎng)基作空白對照。28℃靜止培養(yǎng)42天后，培養(yǎng)液4℃下5000g離心15分鐘，格利斯試劑法比色測定上清液中的亞硝酸鹽濃度。結(jié)果判斷菌種樣品培養(yǎng)上清比色值減空白對照上清比色值的差值大于0.3mgNL-時判為具有明顯的硝化活性(表1)。結(jié)果表明供試菌株均具有較好的硝化活性。證實上述方法所分離獲得陽性菌株在液體純培養(yǎng)時同樣具有硝化活性，證明上述方法所獲結(jié)果的可靠性。
表1各菌株的比色值(以亞硝酸鹽表示，NO2--NmgL-1)菌株號 碳源 檸檬酸鈉 乙酸鈉XY-3 0.4 1.0WY-2 0.0 1.7WY-19 0.7 0.3WY-20 0.0 0.4WY-21 0.7 0.8WR-2 0.6 8.2WT-1 0.3 1.9WH-1 0.0 0.4CK 0.0 0.12.6菌種鑒定所獲得活性菌株參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第九版進行菌種鑒定，結(jié)果見表2。
表2華北潮土分離的部分活性菌株的分類種(屬)名代表菌株節(jié)桿菌屬(Arthrobacter) WY-1，WR-2歐文氏菌屬(Erwinia) WT-1，XY-3棒狀桿菌屬(Corynebacterium) WY-19小單孢菌屬(Micromonospora) WH-1芽孢桿菌屬(Bacillus)短小芽孢桿菌(Bacillus brevis) WY-2，WY-21地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)WX-2環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)WR-8堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus) WR-9實施例3 不同地區(qū)不同類型土壤樣本的異養(yǎng)硝化活性菌株的分離計數(shù)3.1通過實施例2相同的程序和方法從我國4個地區(qū)9種不同類型的土壤樣本中(表3)，分離鑒別了大量具有代表性的異養(yǎng)硝化活性菌株，其中硝化活性陽性菌數(shù)約占所分離培養(yǎng)物總數(shù)的22.2％-80.8％(表4)。而采用Eylar等的方法，硝化活性陽性菌數(shù)僅約占所分離培養(yǎng)物總數(shù)的3.3％-19.2％。
表3各土壤樣本的來源編號 采樣地點 分類名稱 來源 pH1 陜西楊凌 紅油土 旱地，耕層土壤 8.042 河南封丘 華北潮土旱地，耕層土壤 8.483 河南封丘 華北潮土水田，耕層土壤 8.244 江西鷹潭 第四紀(jì)紅色粘土 旱地，耕層土壤 5.465 江西鷹潭 第四紀(jì)紅色粘土 水田，耕層土壤 6.136 江西鷹潭 第四紀(jì)紅色粘土 荒坡地，表層土壤 4.887 江蘇常熟 烏柵土 水田，耕層土壤 7.418 江蘇常熟 烏柵土 旱地，耕層土壤 6.419 江蘇連云港 黃泥土 水田，耕層土壤 6.32表4各土壤樣本的硝化活性菌數(shù)統(tǒng)計編號 土壤樣本 陽性菌比例(本發(fā)明) 陽性菌比例(Eylar的方法)1 紅油土，旱地 40.0％ 8.3％2 華北潮土，旱地 78.6％ 17.2％3 華北潮土，水田 62.5％ 14.8％4 第四紀(jì)紅色粘土，旱地 22.2％ 3.3％5 第四紀(jì)紅色粘土，水田 45.5％ 9.1％6 第四紀(jì)紅色粘土，荒坡地 53.3％ 10.5％7 烏柵土，水田 80.8％ 19.2％8 烏柵土，旱地 33.3％ 5.0％9 黃泥土，水田 28.2％ 4.0％3.2參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第九版，經(jīng)鑒定這些活性菌株分屬于節(jié)桿菌屬、歐文氏菌屬、棒狀桿菌屬、小單孢菌屬、芽孢桿菌屬、動膠菌屬、紅球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等多個屬種。以芽孢桿菌屬為例，有多個種的菌株具有硝化活性(表5)，并已送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏目錄見表6。充分印證了本發(fā)明具有普適性，重復(fù)性好的優(yōu)點，分離的菌株多樣性強且具有代表性，且較Eylar等的方法具有明顯的優(yōu)越性陽性檢出率高；較Papen等的方法更為簡便并可同時完成活性菌的分離計數(shù)。
表5芽孢桿菌屬部分菌株的分類種(屬)名代表菌株芽孢桿菌屬(Bacillus)巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) B422，B217，B188短芽孢桿菌(Bacillus brevis) B319，B455，B606地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)B072，B078，B189環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)B295，B347，B508堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus) B324，B403，B563凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)B247，B205，B337遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus) B204，B118，B631臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) B135，B305，B449短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) B112，B278，B557圓孢芽孢桿菌(Bacillus globisporus) B046，B534，B604球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus) B015，B025，B614栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius) B609，B617，B463蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides) B019，B059，B391表6菌保目錄菌株號B422CGMCC NO.0554 Bacillus megaterium NBB-422巨大芽孢桿菌B324CGMCC NO.0555 Bacillus firmus NBB-324堅強芽孢桿菌B319CGMCC NO.0556 Bacillus brevis NBB-319 短芽孢桿菌B295CGMCC NO.0557 Bacillus circulans NBB-295 環(huán)狀芽孢桿菌B247CGMCC NO.0558 Bacillus coagulans NBB-247 凝結(jié)芽孢桿菌B204CGMCC NO.0559 Bacillus lentus NBB-204遲緩芽孢桿菌B135CGMCC NO.0560 Bacillus cereus NBB-135 臘狀芽孢桿菌B112CGMCC NO.056l Bacillus pumilus NBB-112短小芽孢桿菌B072CGMCC NO.0562 Bacillus licheniformis NBB-072 地衣芽孢桿菌B046CGMCC NO.0563 Bacillus globisporus NBB-046圓孢芽孢桿菌B015CGMCC NO.0564 Bacillus sphaericus NBB-015 球形芽孢桿菌B58-3 CGMCC NO.0565 Bacillus badius NBB-58-3栗褐芽孢桿菌B609CGMCC NO.0566 Bacillus subtilis NBB-609 枯草芽孢桿菌B019CGMCC NO.0586 Bacillus mycoides NBB-019 蕈狀芽孢桿菌實施例4隨硝化進程的異養(yǎng)硝化活性菌株分離計數(shù)4.1供試土樣烏柵土 采樣地點江蘇省常熟市新莊鎮(zhèn)；來源水田，耕層土壤； 土樣處理新鮮土；4.2稱取1.0克風(fēng)干土于含有50毫升無機銨鹽培養(yǎng)基(配方同1.3.1)的250毫升三角瓶中，100r/min搖床振蕩30分鐘。后靜止培養(yǎng)。于培養(yǎng)0天，24天取樣進行異養(yǎng)硝化活性菌株的分離計數(shù)。4.3土懸液10×梯度稀釋后涂布于PM平板，每個稀釋度三個重復(fù)。28℃培養(yǎng)7天后，挑取單菌落到PM平板，劃線純化。鏡檢，證明純度。4.4活性菌的鑒別將獲得的經(jīng)分離純化后的異養(yǎng)菌株接種于PM平板，28℃培養(yǎng)10天，格利斯試劑直接點滴到平板，進行硝化活性確認(rèn)，并以不接菌的平板作空白對照。1分鐘內(nèi)，格利斯試劑顯色呈紅色，表明有亞硝酸鹽生成。重復(fù)驗證，顯色反應(yīng)仍呈陽性，初步確認(rèn)為硝化活性菌。PM培養(yǎng)基經(jīng)高壓液相色譜分析，表明其中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量均為跡量其中亞硝酸鹽未檢出，硝酸鹽含量低于0.2mg NL-1，不會對結(jié)果構(gòu)成正干擾。4.5結(jié)果見表7，同樣獲得了大量具有硝化活性的異養(yǎng)微生物。再次證明了本發(fā)明具有普適性，重復(fù)性好的優(yōu)點。
表7 隨硝化進程的硝化活性菌株分離計數(shù)(供試土樣烏柵土)培養(yǎng)時間 陽性菌比例陽性菌組成(芽孢桿菌為例)0天 33.3％ 巨大芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌24天 50％ 巨大芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌、短芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、4.6本發(fā)明計數(shù)方法與傳統(tǒng)的MPN計數(shù)的比較，以烏柵土水田、紅壤水田和華北潮土水田為例。結(jié)果見表8。
表8與傳統(tǒng)的MPN計數(shù)的比較
權(quán)利要求
1.一種分離鑒定純化具有硝化活性的異養(yǎng)微生物的方法，它包括的步驟是①將待檢樣品涂布于PM平板；②挑取單菌落到PM平板劃線純化；③點滴格利斯試劑到平板菌落上；④在一定顯色時間內(nèi)，格利斯試劑顯紅色者為待查陽性菌落；⑤挑取待查陽性菌落重復(fù)步驟②③④再次格利斯試劑顯紅色者為陽性菌落；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是待檢樣品10倍梯度稀釋后涂布于PM平板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中PM培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，組分是牛肉浸膏 3克蛋白胨 5克瓊脂 20克蒸餾水 1000毫升pH7.0-7.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中格利斯試劑包括分別配制存放的對氨基苯磺酸試劑和α-萘胺試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離鑒定純化具有硝化活性的異養(yǎng)細(xì)菌的方法，其特征是對氨基苯磺酸試劑的配制是0.5克對氨基苯磺酸溶于150毫升20％的稀醋酸溶液中形成；α-萘胺試劑的配制是0.5克α-萘胺加到20毫升蒸餾水和150毫升20％的稀醋酸溶液中形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是格利斯試劑顯色時間在3分鐘內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是格利斯試劑顯色時間在1分鐘內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從不同土壤及經(jīng)自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)過程中分離鑒定純化具有硝化活性的異養(yǎng)微生物的方法，該方法通過營養(yǎng)瓊脂平板分離和格利斯試劑顯色等步驟可從環(huán)境中分離鑒定純化大量異養(yǎng)硝化微生物，該方法重復(fù)性好，分離的菌株代表性強，并能再現(xiàn)土壤或分離樣本的微生物原位狀況。
文檔編號C12N1/20GK1434118SQ03118598
公開日2003年8月6日 申請日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月14日
發(fā)明者彭光浩, 尹瑞齡, 張桂英 申請人:中國科學(xué)院南京土壤研究所